特表 2021-525073 ＦｃイプシロンＣＡＲ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-525073(P2021-525073A)

(43)【公表日】2021年9月24日

(54)【発明の名称】ＦｃイプシロンＣＡＲ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20210827BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210827BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20210827BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20210827BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20210827BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210827BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20210827BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210827BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20210827BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210827BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210827BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20210827BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20210827BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20210827BHJP

   C07K 14/55 20060101ALN20210827BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20210827BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20210827BHJP

   C07K 14/52 20060101ALN20210827BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 Z

   C12N5/10ZNA

   C12N15/12

   C12N15/19

   C12N15/26

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P43/00 121

   A61P31/12

   A61K45/00

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   A61K35/17 Z

   C12N5/0783

   C07K14/54

   C07K14/55

   C07K14/705

   C07K19/00

   C07K14/52

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

【全頁数】62

(21)【出願番号】特願2020-565289(P2020-565289)

(86)(22)【出願日】2019年5月21日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月3日

(86)【国際出願番号】US2019033407

(87)【国際公開番号】WO2019226708

(87)【国際公開日】20191128

(31)【優先権主張番号】62/674,936

(32)【優先日】2018年5月22日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】520393015

【氏名又は名称】ナントケーウエスト，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100105153

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 悟

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】ボイセル，ローラン エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】クリンゲマン，ハンス ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ダンダパット，アブヒジット

(72)【発明者】

【氏名】チンナペン，ヒマニ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZC751

4C085AA03

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085CC21

4C085CC23

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB33

4C087ZC75

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA04

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

組換えＮＫ細胞とりわけ組換えＮＫ−９２細胞は、ＦｃεＲＩγの細胞内ドメインを有するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する。注目すべきこととして、ＦｃεＲＩγの細胞内ドメインを有するＣＡＲ構築物は、実質的に延長された発現継続時間及び経時的に有意に長期にわたる細胞傷害性を有していた。ＣＡＲは、好ましくは、ＣＤ１６とオートクリン成長支援を付与するサイトカインとをさらにコードするトリシストロニック構築物として、ＲＮＡ及びＤＮＡから発現されうる。有利なことに、かかる構築物はまた、高レベルのトランスフェクション及び組換えタンパク質発現を可能にするとともに、組換えＮＫ／ＮＫ−９２細胞の迅速生成を促進する便利な選択マーカーを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換え発現サイトカインと、
組換え発現ＣＤ１６と、
細胞外結合ドメインとヒンジドメインと膜貫通ドメインとＦｃεＲＩγシグナリングドメインとを単一ポリペプチド鎖中に含む膜結合組換え発現キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）と、
を含む遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項2】

前記ＮＫ細胞がＮＫ−９２細胞である、請求項１に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項3】

前記組換え発現サイトカインがＩＬ−２又はＩＬ−１５を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項4】

前記組換え発現サイトカインが内質保持配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項5】

前記組換え発現ＣＤ１６が、１５８Ｖ突然変異を有する高親和性ＣＤ１６変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項6】

前記細胞外結合ドメインがｓｃＦｖを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項7】

前記細胞外結合ドメインが、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、又は患者及び腫瘍特異的抗原に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項8】

前記腫瘍特異的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＳ１、ＧＤ２、ＣＤ１３８、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ−２、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＧＰＡ７、ＣＤ２４４、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、Ｂ７−Ｈ４、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＭＵＣ５ＡＣ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＷＴ−１、ＰＳＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＣＳＰＧ−４、ＩＧＦ１−Ｒ、Ｆｌｔ−３、ＣＤ２７６、ＣＤ１２３、ＰＤ−Ｌ１、ＢＣＭＡ、又はＣＤ３３である、請求項７に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項9】

前記細胞外結合ドメインがウイルス特異的抗原に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項10】

前記ウイルス特異的抗原が、ＨＩＶウイルス、ＨＰＶウイルス、ＲＳＶウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、又はＨＣＶウイルスの抗原である、請求項９に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項11】

前記ＦｃεＲＩγシグナリングドメインが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項12】

前記組換え発現サイトカイン、前記組換え発現ＣＤ１６、及び前記組換え発現ＣＡＲが、トリシストロニック組換え核酸から発現される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項13】

前記組換え発現サイトカイン及び／又は前記組換え発現ＣＤ１６が、前記ＮＫ細胞のゲノムにインテグレートされた組換え核酸から発現される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞。

【請求項14】

サイトカインをコードする第１の配列部分と、
ＣＤ１６をコードする第２の配列部分と、
細胞外結合ドメインとヒンジドメインと膜貫通ドメインとＦｃεＲＩγシグナリングドメインとを単一ポリペプチド鎖中に含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする第３の配列部分と、
を含み、
前記第１、前記第２、及び前記第３の配列部分が同一核酸上にある、組換え核酸。

【請求項15】

前記核酸がトリシストロニックＲＮＡである、請求項１４に記載の組換え核酸。

【請求項16】

前記核酸がトリシストロニックＤＮＡである、請求項１４に記載の組換え核酸。

【請求項17】

前記サイトカインがＩＬ−２又はＩＬ１５である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項18】

前記サイトカインが内質保持配列を含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項19】

前記ＣＤ１６が、１５８Ｖ突然変異を有する高親和性ＣＤ１６変異体である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項20】

前記細胞外結合ドメインがｓｃＦｖを含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項21】

前記細胞外結合ドメインが、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、又は患者及び腫瘍特異的抗原に特異的に結合する、請求項２０に記載の組換え核酸。

【請求項22】

前記細胞外結合ドメインがウイルス特異的抗原に特異的に結合する、請求項２０に記載の組換え核酸。

【請求項23】

前記ヒンジドメイン及び／又は前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ヒンジドメイン及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項24】

前記ＦｃεＲＩγシグナリングドメインが配列番号２の核酸配列を有する、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の組換え核酸。

【請求項25】

請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の組換え核酸を含む組換え細胞。

【請求項26】

前記細胞が細菌細胞である、請求項２５に記載の組換え細胞。

【請求項27】

前記細胞が自家ＮＫ細胞である、請求項２５に記載の組換え細胞。

【請求項28】

前記ＮＫ細胞が、任意選択的に遺伝子改変されたＮＫ−９２細胞である、請求項２７に記載の組換え細胞。

【請求項29】

治療有効量の請求項１〜１３に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞のいずれか１つを患者に投与することにより癌を治療することを含む、必要とする患者における癌の治療方法。

【請求項30】

ウイルス癌ワクチン、細菌癌ワクチン、酵母癌ワクチン、Ｎ−８０３、抗体、幹細胞移植片、及び腫瘍標的化サイトカインからなる群から選択させる少なくとも１つの追加の治療エンティティーを投与する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記癌が、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、たとえば、限定されるものではないが肉腫及び癌腫、たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫から選択される、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

治療有効量の請求項１〜６又は９〜１２に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞のいずれか１つをを患者に投与することによりウイルス感染症を治療することを含む、必要とする患者におけるウイルス感染症の治療方法。

【請求項33】

抗ウイルス薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

約１×１０^８〜約１×１０^１１細胞／ｍ^２患者体表面積が前記患者に投与される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

癌又はウイルス感染症の治療における、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１８年５月２２日に出願されたシリアル番号６２／６７４，９３６の米国特許出願に基づく優先権の利益を主張する。

【0002】

配列リスト
１０６ｋｂのサイズで２０１９年５月２１日に作成され本願と共にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子申請された１０４０７７．０００４ＰＣＴ＿ＳＴ２５と称される配列リストのＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、その全体が参照により組み込まれる。

【0003】

本発明の分野は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞を生成するための組換え核酸及びそれを含有する細胞、とくにＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲＩγ）シグナリングドメインを有するＣＡＲを発現する改変ＮＫ及びＮＫ−９２細胞である。

【背景技術】

【0004】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の有意な成分を構成する細胞傷害性リンパ球である。ほとんどの場合、ＮＫ細胞は、循環リンパ球の約１０〜１５％を占め、ウイルス感染細胞及び多くの悪性細胞をはじめとする標的細胞に結合し死滅させる。ＮＫ細胞による死滅は、特定抗原に対して非特異的であり、先行免疫感作なしで起こりうる。標的細胞の死滅は、典型的には、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシンをはじめとする細胞溶解性タンパク質により媒介される。

【0005】

自家ＮＫ細胞は、治療エンティティーとして使用されてきた。その目的では、ＮＫ細胞は、全血の末梢血リンパ球画分から単離され、十分な数の細胞を得るために細胞培養で拡大され、次いで被験者に再注入される。自家ＮＫ細胞は、少なくともいくつかの場合には、ｅｘ ｖｉｖｏ療法及びｉｎ ｖｉｖｏ治療の両方で中程度の有効性が示されている。しかしながら、自家ＮＫ細胞の単離及び成長には、多くの時間とコストがかかる。そのうえ、自家ＮＫ細胞療法は、すべてのＮＫ細胞が細胞溶解性であるとは限らないという事実によりさらに制限される。

【0006】

これらの困難の少なくともいくつかは、非ホジキンリンパ腫に罹患している被験者の血液中で発見された後ｉｎ ｖｉｔｒｏで不死化された細胞溶解性癌細胞系であるＮＫ−９２細胞の使用により克服可能である（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：６５２−６５８（１９９４））。ＮＫ−９２細胞はＮＫ細胞派生物であるが、ＮＫ−９２細胞は、正常ＮＫ細胞であれば提示される阻害レセプターの大半を欠如し、且つ活性化レセプターの大部分を保持する。しかしながら、ＮＫ−９２細胞は、正常細胞を攻撃したり、ヒトにおいて許容できない免疫拒絶反応を誘発したりしない。これらの望ましい特性に起因して、ＮＫ−９２細胞は、たとえば国際公開第１９９８／０４９２６８号パンフレット又は米国特許出願公開第２００２／０６８０４４号明細書に記載されるように、詳細に特徴付けられ、且つある特定の癌の治療で治療剤として探究された。

【0007】

同一組織に由来する腫瘍細胞から正常細胞を識別する表現型変化は、多くの場合、特異的遺伝子産物の発現の１つ以上の変化、たとえば、正常細胞表面成分の損失又は他の成分（すなわち、対応する正常非癌性組織で検出不能な抗原）の獲得に関連する。新生物細胞若しくは腫瘍細胞では発現されるが正常細胞では発現されない抗原、又は正常細胞に見いだされるレベルを実質的に超えるレベルで新生物細胞で発現される抗原は、「腫瘍特異的抗原」又は「腫瘍関連抗原」と称されている。かかる腫瘍特異的抗原は、腫瘍表現型のマーカーとして機能しうる。腫瘍特異的抗原としては、癌／精巣特異的抗原（たとえば、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、及びＮＹ−ＥＳＯ−１）、メラノサイト分化抗原（たとえば、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１、及びＴＲＰ−２）、突然変異又は異常発現抗原（たとえば、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、β−カテニン、ｇｐ１００−ｉｎ４、ｐ１５、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ）、並びに腫瘍でより高レベルで発現される抗原（たとえば、ＣＤ１９及びＣＤ２０）が挙げられる。

【0008】

腫瘍特異的抗原は、癌免疫療法の標的として使用されてきた。かかる療法の１つは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をはじめとする免疫細胞の表面上に発現されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を利用して癌細胞に対する細胞傷害性を改善する。ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナリングドメインに結合された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、標的細胞（たとえば癌細胞）上の抗原を認識し結合してエフェクター細胞活性化をトリガーする。シグナリングドメインは、レセプターによる細胞内シグナリングに重要な免疫レセプターチロシンベース活性化ドメイン（ＩＴＡＭ）を含有する。

【0009】

Ｔ細胞で使用されるＣＡＲの第１世代は、１つの細胞質シグナリングドメインを含有していた。たとえば、Ｔ細胞の第１世代ＣＡＲの一形態は、１つのＩＴＡＭを含有するＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲＩγ）由来のシグナリングドメインを含み、一方、他の一形態は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζ由来のシグナリングドメインを含有していた。ＣＤ３ζＣＡＲＴ細胞は、ＦｃεＲＩγＣＡＲＴ細胞よりも腫瘍根絶効率が良いことがｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で示された（たとえば、Ｈａｙｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６：１８２−１８７、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９５６３０４）。その後、かかる組換えＴ細胞の十分な活性化及び増殖にはある特定の共刺激シグナルが必要とされることが追加の研究で明らかにされ、第２及び第３世代ＣＡＲでは、組換えＣＡＲＴ細胞の効能を増強するために複数のシグナリングドメインを組み合わせて単一ＣＡＲとした。試験されたＴ細胞のそうした文献学上の効果がそれほど望ましいものではなかったため、第１世代ＣＡＲ及びＦｃεＲＩγシグナリングドメインは大幅に廃棄され、１つ以上の追加のシグナリングドメインとの組合せでＣＤ３ζを使用する新たなより効率の良いＣＡＲが優先された（たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ ２０１５，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６，Ａｒｔｉｃｌｅ １９５）。

【0010】

より最近では、選択されたＣＡＲはＮＫ細胞でも発現されている。たとえば、ＣＡＲ改変ＮＫ−９２細胞は、ＣＤ３ζ細胞内シグナリングドメインのみを有する第１世代ＣＡＲを使用している。いくつかの抗原は、Ｂ細胞リンパ腫のＣＤ１９及びＣＤ２０、乳癌、卵巣癌、及び扁平上皮細胞癌のＥｒｂＢ２、神経芽細胞腫のＧＤ２、及び多発性骨髄腫のＣＤ１３８を含めて、こうした第１世代ＣＡＲ−ＮＫ細胞により標的とされている。ＮＫ−９２系由来の第２世代ＣＡＲ−ＮＫ細胞もまた、複数の癌腫のＥｐＣＡＭ、エプスタイン・バーウイルスのＨＬＡ−Ａ２ＥＢＮＡ３複合体、多発性骨髄腫のＣＳ１、及びＨＥＲ２陽性上皮癌のＥｒｂＢ２を含めて、いくつかの抗原に対して生成されている。第２世代ＮＫ−９２ＣＡＲでＣＤ３ζと共に使用される最も一般的な細胞内共刺激ドメインはＣＤ２８である。しかしながら、ＮＫ細胞はＣＤ２８を天然で発現しないので、ＣＤ２８ドメインの潜在的効果は不明である。そのほかの第２世代ＣＡＲは、ＮＫ細胞持続性を改善するためにＣＤ３ζと共に４−１ＢＢ細胞内シグナリングドメインを組み込んでいる。他の者は、ＣＤ３ζ単独、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ、又は４−１ＢＢ及びＣＤ３ζと融合されたＥｒｂＢ２ｓｃＦｖを用いてさまざまな細胞内ドメインの機能を乳癌細胞に対して試験し比較した。第２世代構築物はいずれも、第１世代ＣＡＲと比較して死滅を改善し、ＣＤ２８及びＣＤ３ζは６５％標的溶解を有し、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζは６２％溶解し、そしてＣＤ３ζ単独は標的の５１％を死滅させることを見いだした。４−１ＢＢ及びＣＤ２８細胞内ドメインはまた、Ｂ細胞悪性病変に対してＮＫ−９２細胞上に発現される抗ＣＤ１９ＣＡＲを用いて最近の研究で比較された。ＣＤ３ζ／４−１ＢＢ構築物は、細胞死滅及びサイトカイン産生でＣＤ３ζ／ＣＤ２８ほど有効でないことがさらに他の者により見いだされ、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ共刺激ドメインの示差的効果が注目された。

【0011】

第３世代ＮＫ−９２ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び４−１ＢＢ細胞内シグナリングドメインを有する抗ＣＤ５ｓｃＦｖで構築され、さまざまなＴ細胞白血病及びリンパ腫細胞系及び原発腫瘍細胞に対する特異的且つ強力な抗腫瘍活性を実証した。かかる細胞はまた、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞系さらには原発腫瘍細胞の異種移植マウスモデルで疾患進行を阻害可能であった（Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ．２０１７ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１８７：３２−４３）。さらなる例では、国際公開第２０１６／２０１３０４号パンフレット及び国際公開第２０１８／０７６３９１号パンフレットは、ＮＫ細胞及びＮＫ−９２細胞で発現される第３世代ＣＤ３ζＣＡＲの使用を教示する。

【0012】

自家ＮＫ細胞及びＮＫ−９２細胞は、生存因子及び細胞傷害能エンハンサーとして外因性ＩＬ−２を必要とする。残念ながら、ＩＬ−２の全身投与は、多くの場合、顕著な望ましくない副作用及び毒性を伴う。かかる課題を克服するために、患者への投与前にｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の培養及び拡大が可能である。ＩＬ−２は、十分量のＮＫ細胞又はＮＫ−９２細胞の生成を可能するであろうが、ＮＫ細胞の大規模生産における外因性ＩＬ−２の使用は、典型的にはコスト上の制約を受ける。外因性ＩＬ−２に対する要件は、レトロウイルスベクターからのＩＬ−２の組換え発現を小胞体に閉じ込めることにより解決された（Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００５ Ｆｅｂ；３３（２）：１５９−６４を参照されたい）。かかるアプローチは、外因性ＩＬ−２に対する要件を排除した。しかしながら、レトロウイルストランスフェクション効率は、多くの場合それほど望ましくなく、複数の組換え遺伝子を発現させる場合さらに効率が悪くなるであろう。

【0013】

そのほか、ＮＫ細胞とくにＮＫ−９２細胞は、Ｆｃレセプターを発現するようにＮＫ−９２細胞を工学操作することに多数回失敗したことにより実証されるように、多くの場合、遺伝子改変が困難である。異種発現のために複数の組換え遺伝子又は相対的に大きな組換え核酸ペイロードでＮＫ−９２細胞をトランスフェクトする場合、かかる困難はさらに複雑化する。そのほか、ＮＫ−９２細胞はまた、外因性タンパク質（たとえばＣＤ１６）の組換え発現に関して予測度の顕著な欠如を呈する。機能レベル上、すべてではないにしてもほとんどのＣＡＲＮＫ−９２細胞は、おそらくＣＡＲ構築物の相対的に低い発現に起因して、相対的に高いエフェクター細胞対標的細胞比を必要とする。さらに、かかるＣＡＲＮＫ−９２細胞はまた、経時的に細胞傷害性の急速な低下を経験することにより、かかる細胞の臨床的魅力を低減させるであろう。

【0014】

したがって、多くの組換えＮＫ−９２細胞が当技術分野で公知であるとはいえ、それらのすべて又はほとんどすべては各種困難を抱えている。そのため、付随する持続的細胞傷害性を有して有意量で高活性ＣＡＲを発現するとともに単純且つ効果的な形で容易に培養されるＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞の必要性が残っている。

【発明の概要】

【0015】

本発明者らは、ＦｃεＲＩγ含有ＣＡＲを発現するようにＮＫ−９２細胞を組換え核酸で効率的にトランスフェクト可能であることを発見した。予想外なことに、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲは、ＣＡＲの発現レベルを有意に増加させるとともに、さらに経時的に長期にわたる細胞傷害性を伝達する。ＣＡＲをコードする企図される組換え核酸は、好ましくは、ＣＤ１６若しくはＣＤ１６変異体及び／又はＩＬ−２若しくはＩＬ−２変異体をコードする配列部分も含むトリシストロニック配置である。有利なことに、かかる組換え核酸は、トランスフェクト細胞を選択する効率的な方法を提供するだけでなく（ＩＬ−２は、オートクリン成長刺激を付与するだけでなく、共発現タンパク質の選択マーカーとしても作用するため）、優れた細胞溶解活性（たとえば、他の構築物と比較して相対的に低いエフェクター細胞対標的細胞比で）とＣＤ１６及びＦｃεＲＩγ含有ＣＡＲの高い発現レベルとを有するＣＡＲＮＫ細胞ももたらす。

【0016】

したがって、本発明の主題の一態様では、本発明者らは、サイトカインと、ＣＤ１６と、膜結合キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）と、を組換え発現する遺伝子改変ＮＫ細胞を企図する。ＣＡＲは、典型的には、（ｉ）細胞外結合ドメインと、（ｉｉ）ヒンジドメインと、（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｖ）ＦｃεＲＩγシグナリングドメインと、を単一ポリペプチド鎖中に含むであろう（たとえば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）。

【0017】

多くの実施形態では、ＮＫ細胞はＮＫ−９２細胞であり、且つ／又は組換え発現サイトカインはＩＬ−２若しくはＩＬ−１５であるか若しくはそれらを含む（内質保持配列をさらに含みうる）。さらなる実施形態では、ＣＤ１６は高親和性ＣＤ１６変異体（たとえばＣＤ１６_１５８Ｖ）でありうる。

【0018】

必ずというわけではないが、好ましくは、細胞外結合ドメインは、腫瘍特異的抗原（たとえば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＳ１、ＧＤ２、ＣＤ１３８、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ−２、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＧＰＡ７、ＣＤ２４４、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＭＵＣ５ＡＣ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＷＴ−１、ＰＳＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＣＳＰＧ−４、ＩＧＦ１−Ｒ、Ｆｌｔ−３、ＣＤ２７６、ＣＤ１２３、ＰＤ−Ｌ１、ＢＣＭＡ、若しくはＣＤ３３）、腫瘍関連抗原、又は患者及び腫瘍特異的抗原に特異的に結合しうるｓｃＦｖ、或いはウイルス特異的抗原（たとえば、ＨＩＶウイルス、ＨＰＶウイルス、ＲＳＶウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、又はＨＣＶウイルスの抗原）に特異的に結合しうるｓｃＦｖを含むであろう。

【0019】

いくつかの実施形態では、サイトカイン、ＣＤ１６、及びＣＡＲは、トリシストロニック組換え核酸から発現され、一方、他の実施形態では、サイトカイン及び／又はＣＤ１６は、ＮＫ細胞のゲノムにインテグレートされた組換え核酸から発現される。

【0020】

したがって、本発明者らはまた、サイトカインをコードする第１の配列部分と、ＣＤ１６をコードする第２の配列部分と、単一ポリペプチド鎖中に細胞外結合ドメインとヒンジドメインと膜貫通ドメインとＦｃεＲＩγシグナリングドメインとを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする第３の配列部分と、を含む組換え核酸を企図する。最も典型的には、第１、第２、及び第３の配列部分は、同一核酸上にある。

【0021】

いくつかの実施形態では、核酸はトリシストロニックＲＮＡであるが、他の実施形態では、核酸はトリシストロニックＤＮＡである。

【0022】

さらに、典型的には、サイトカインはＩＬ−２若しくはＩＬ１５であり（内質保持配列を含んでいても含んでいなくてもよい）、ＣＤ１６は１５８Ｖ突然変異を有する高親和性ＣＤ１６変異体であり、且つ／又は細胞外結合ドメインはｓｃＦｖを含むことが好ましい。以上に述べたように、細胞外結合ドメインは、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、若しくは患者及び腫瘍特異的抗原に特異的に結合しうるか、又は細胞外結合ドメインは、ウイルス特異的抗原に特異的に結合しうる。

【0023】

さらなる企図される態様では、ヒンジドメイン及び／又は膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジドメイン及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含み、一方、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインは、配列番号２の核酸配列を有しうる。

【0024】

本発明の主題のそのほかのさらなる態様では、本発明者らはまた、本明細書の以上に記載の組換え核酸を含む組換え細胞を企図する。核酸を調製及び／又は増幅する場合、組換え細胞は細菌細胞でありうる。他方、組換え核酸を発現させる場合、細胞は典型的には自家ＮＫ細胞又はＮＫ細胞であろう（任意選択的に遺伝子改変されたＮＫ−９２細胞であってもよい）。

【0025】

そのため、本発明者らはまた、必要とする患者における癌の治療方法を企図する。かかる方法では、治療有効量の遺伝子改変ＮＫ細胞のいずれか１つを患者に投与することにより癌を治療する。そのほか所望により、企図される方法は、ウイルス癌ワクチン、細菌癌ワクチン、酵母癌ワクチン、Ｎ−８０３、抗体、幹細胞移植片、及び腫瘍標的化サイトカインからなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療エンティティーを投与するさらなる工程を含みうる。

【0026】

癌の中でもとくに企図される癌としては、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、たとえば、限定されるものではないが肉腫及び癌腫、たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられる。

【0027】

同様に、本発明者らはまた、必要とする患者におけるウイルス感染症の治療方法を企図する。かかる方法では、治療有効量の遺伝子改変ＮＫ細胞のいずれか１つを患者に投与することによりウイルス感染症を治療する。所望又は所要により、抗ウイルス薬剤もまた投与しうる。

【0028】

治療のタイプにかかわらず、一般に、１×１０^８〜約１×１０^１１細胞／ｍ２患者体表面積で患者に投与することが企図される。さまざまな観点から見て、本明細書に提示される遺伝子改変ＮＫ細胞の使用は、癌又はウイルス感染症の治療が企図される。

【0029】

本発明の主題の各種目的、特徴、態様、及び利点は、添付の図面と併せて好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。図中、同じ数字は同じ構成要素を表す。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】試験された模範的ＣＤ１９−ＣＡＲの模式図である。ＣＤ１９−ＣＡＲ変異体はすべて、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ領域（αＣＤ１９−ｓｃＦｖ）とＣＤ８由来のヒンジ領域（ＣＤ８ヒンジ）とを含む細胞外ドメインと、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ＴＭ）と、を含有していた。ＣＤ１９ＣＡＲの細胞内ドメインは、指定された通りに異ならせた。

【図2A】ｅＦ６６０で標識された抗ｓｃＦｖ抗体を用いてフローサイトメトリーにより決定したときのＣＤ１９−ＣＡＲｍＲＮＡのトランスフェクション後の図１のＣＤ１９−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞のパーセントの模範的結果である。

【図2B】ｅＦ６６０で標識された抗ｓｃＦｖ抗体で標識されたＣＤ１９−ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）−バックグラウンドの模範的結果である。

【図3A】５：１〜０．３：１のエフェクター：標的比でＣＤ１９ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞（エフェクター）により死滅されたＮＫ−９２細胞感受性標的癌細胞（Ｋ５６２）のパーセントの模範的結果を示す。

【図3B】５：１〜０．３：１のエフェクター：標的比でＣＤ１９ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞（エフェクター）により死滅されたＮＫ−９２細胞耐性ＣＤ１９陽性標的癌細胞（ＳＵＰ−Ｂ１５）のパーセントの模範的結果を示す。

【図4】２：１〜０．２５：１のエフェクター：標的比でＳＵＰ−Ｂ１５標的細胞を用いた脱顆粒アッセイにおける抗ＣＤ１０７ａ抗体で標識されたＣＤ１９−ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞（エフェクター）のＭＦＩの模範的結果を示す。

【図5】各種時点におけるＣＤ１９ＣＡＲｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたｈａＮＫ細胞上のＣＤ１９ＣＡＲの表面発現の模範的結果を示す。試験されたＣＡＲ構築物はすべて、使用条件下で７２時間まで検出可能発現を示し、ＣＤ１９／ＣＤ２８−Ｆｃ−イプシロンＣＡＲが最長発現継続時間を有していた。

【図6】ＳＵＰＢ１５ＣＤ１９＋細胞（ａＮＫ耐性細胞系）に対するＣＤ１９．ｔａＮＫの細胞傷害性の模範的結果を示す。試験されたＣＡＲ構築物はすべて、２４ｈでは同程度（最大）の細胞傷害性を示す。しかしながら、４８ｈでは、ＣＤ１９／ＣＤ３ゼータは、細胞傷害性の際立った減少を示し、一方、ＦｃイプシロンベースＣＡＲは、エレクトロポレーションの４８時間後にごくわずかな減少を示すにすぎない。

【図7】組換えトリシストロニックＤＮＡ構築物及び対応するタンパク質産物の模範的模式図である。

【図8】図８に示されるプラスミドの模範的線状化形態を示す。

【図9A】ＣＤ３３陽性（ＣＤ３３＋）ＴＨＰ−１細胞が対照ＮＫ−９２（ａＮＫ）細胞による細胞傷害性（特異的溶解）に対しては相対的に耐性であるが、ＣＤ３３に特異的に結合するＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞（ＣＤ３３−ＣＡＲ／ＮＫ−９２細胞）と共にＴＨＰ−１細胞を培養したときは高パーセントの特異的溶解が存在することを示すｉｎ ｖｉｔｒｏデータの模範的結果を示す。

【図9B】Ｋ５６２細胞が対照ａＮＫ細胞及びＣＤ３３−ＣＡＲ／ＮＫ−９２細胞の両方により死滅されることを示すｉｎ ｖｉｔｒｏデータの模範的結果を示す。

【図10】ＢＴ−４７４細胞に対するＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図11】ＴＨＰ−１細胞に対するＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図12】ＳＵＰ−Ｂ１５．ＰＤ−Ｌ１^＋細胞に対するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図13】Ｕ２５１細胞に対するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図14】Ａ−５４９細胞に対するＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図15】Ｋ５６２細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図16】ＳＵＰ−Ｂ１５細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図17】ＳＫＢｒ３細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図18】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＩＧＦ１Ｒ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図19】さまざまな癌細胞に対するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図20】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的比較結果を示す。

【図21】ＣＤ１６及びＣＤ１９．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図22】Ｋ５６２細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図23】ＳＵＰ−Ｂ１５細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図24】ＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図25】ＣＤ１６及びＣＤ２０．ＣＡＲの発現の模範的比較結果を示す。

【図26】ＣＤ２０．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図27】ＣＤ１６及びＣＤ３３．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図28】Ｋ５６２細胞に対するＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図29】ＴＨＰ−１細胞に対するＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図30】ＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図31】ＣＤ１６及びＥＧＦＲ．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図32】Ｋ５６２細胞に対するＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図33】Ａ５４９細胞に対するＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図34】ＨＣＴ１１６細胞に対するＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図35】ＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図36】ＣＤ１６及びＨＥＲ２．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図37】Ｋ５６２細胞に対するＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図38】ＳＫＢＲ−３細胞に対するＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図39】ＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図40】ＣＤ１６及びＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図41】Ｋ５６２細胞に対するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図42】ＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図43】ＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図44】ＣＤ１２３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図45】ＣＤ１２３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図46】ＣＤ１６及びＣＤ３０．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図47】Ｋ５６２細胞に対するＣＤ３０．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図48】ＴＨＰ−１細胞に対するＣＤ３０．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図49】ＣＤ３０．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図50】ＣＤ１６及びＢＣＭＡ．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図51】ＢＣＭＡ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図52】ＢＣＭＡ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図53】ＣＤ１６及びｇｐ１２０．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図54】ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＧＰ１２０結合の模範的結果を示す。

【図55】Ｋ５６２細胞に対するＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図56】ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的結果を示す。

【図57】ＣＤ１６及びＦＡＰ．ＣＡＲの発現の模範的結果を示す。

【図58】ＦＡＰ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図59】ＣＳＰＧ４．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞におけるＣＳＰＧ４発現の模範的結果を示す。

【図60】ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に対するＣＳＰＧ４．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果を示す。

【図61】ＩＧＦ１Ｒ−ＣＡＲとＣＤ１６とＩＬ−２^ＥＲとをコードする模範的トリシストロニック構築物を表す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下でより詳細に記載されるように、組換えＣＡＲがＦｃεＲＩγシグナリングドメインを含む場合、組換えＮＫ細胞（たとえばＮＫ−９２細胞）におけるＣＡＲ媒介細胞傷害性及びＣＡＲ発現が実質的に増加することを、予期せずして本発明者らは発見した。Ｔ細胞におけるかかるＣＡＲは、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、又はＣＤ２８シグナリングドメインと、任意選択的に第２及び第３世代ＣＡＲに通常見いだされる追加のシグナリングドメインと、を有するＣＡＲと比較して、相対的に不十分な性能を示すので、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲがＮＫ細胞において優れた性質を有するという知見は、とりわけ予想外である。

【0032】

したがって、いくつかの実施形態では、必ずというわけではないが好ましくはＣＤ１６若しくはＣＤ１６変異体及び／又はＩＬ−２若しくはＩＬ−２変異体をコードする配列部分も含むトリシストロニック配置で、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲをコードする組換え核酸が企図される。本発明の主題のそのほかのさらなる有利な態様では、かかる組換え核酸は、トランスフェクト細胞を選択する効率的な方法を提供するだけでなく（ＩＬ−２はオートクリン成長刺激を付与するだけでないため）、共発現タンパク質の選択マーカーとしても作用する。

【0033】

そのため、本発明の主題は、細胞表面上にキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変ＮＫ細胞、ＮＫ−９２細胞、及びそれらの派生物に関する。ただし、ＣＡＲは、好ましくは、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲＩγ）由来の細胞内シグナリングドメインを含む。たとえば、ＦｃεＲＩγの細胞質内ドメインは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有しうるか、又は配列番号１に記載の配列を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、若しくはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＦｃεＲＩγの細胞質内ドメインは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。企図される組換え細胞は、１つ以上のサイトカイン及びＣＤ１６をはじめとする各種他のタンパク質をさらに発現しうる。容易に分かるであろうが、ＣＡＲ及び／又は他のタンパク質は、組換え細胞により一過的に発現されうるか又は安定的に発現されうる。

【0034】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８由来のヒンジ領域を含み、且つ／又はいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６のアミノ酸配列（配列番号７の核酸によりコードされる）を有するＣＤ２８由来の膜貫通ドメインを含む。ＣＤ２８の全長アミノ酸配列は配列番号２３に示される。さらなる実施形態では、組換え細胞は、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合されたＣＤ８ヒンジ領域を含む配列番号８の配列を有するハイブリッドタンパク質をコードする配列番号９の配列を有する核酸で遺伝子改変される。分かるであろうが、結合ドメインをヒンジ領域に付加すると機能性ＣＡＲが形成されるであろう。たとえば、結合ドメインは、腫瘍関連抗原を標的とするか又はそれに特異的に結合しうる。また、好適な抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＳ１、ＧＤ２、ＣＤ１３８、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ−２、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＧＰＡ７、ＣＤ２４４、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＭＵＣ５ＡＣ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＷＴ−１、ＰＳＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＣＳＰＧ−４、ＩＧＦ１−Ｒ、Ｆｌｔ−３、ＣＤ２７６、ＣＤ１２３、ＰＤ−Ｌ１、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３３が挙げられる。

【0035】

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、核酸配列の転写を促進する（誘導性）プロモーターをさらに含む。必ずというわけではないが好ましくは、核酸構築物は、核酸配列から転写されたｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にする１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むマルチシストロニックベクター又はＲＮＡである。代替的又は追加的に、核酸構築物は、同一ｍＲＮＡによりコードされる等モルレベルのポリペプチドを生成するために、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、又はＦ２Ａペプチドなどの２Ａペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ｓｃＦｖ又はコドン最適化ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、腫瘍細胞により発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の一部である。さらなる実施形態では、構築物は、小胞体に標的化しうるＩＬ−２やＩＬ−１５などのサイトカインをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ−９２細胞又は細胞系はまた、細胞表面上にＣＤ１６を発現するように遺伝子改変される。一実施形態では、ＮＫ−９２細胞又は細胞系は、細胞表面上に高親和性ＣＤ１６（Ｆ１５８Ｖ）を発現するように遺伝子改変される。

【0036】

好適なＮＫ細胞に関して、ＮＫ細胞はすべて、本明細書に記載の使用に好適であるとみなされるので、初代ＮＫ細胞（保存、拡大、及び／又はフレッシュ細胞）、不死化された二次ＮＫ細胞、自家又は異種ＮＫ細胞（バンク、保存、フレッシュなど）、並びにより詳細に以下に記載される改変ＮＫ細胞を含むことに留意すべきである。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞はＮＫ−９２細胞であることが好ましい。ＮＫ−９２細胞系は、インターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下で増殖することが発見されたユニークな細胞系である（たとえば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：６５２−６５８（１９９４）を参照されたい）。ＮＫ−９２細胞は、好適な培養培地での拡大後、広範な抗腫瘍細胞傷害性及び予測可能な収率を有する癌性ＮＫ細胞である。有利なことに、ＮＫ−９２細胞は、さまざまな癌に対する高い細胞溶解活性を有する。

【0037】

元のＮＫ−９２細胞系は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５、及びＣＤ５４表面マーカーを発現し、且つＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、及びＣＤ３４マーカーを提示しなかった。培養下でのかかるＮＫ−９２細胞の成長は、１ＩＵ／ｍＬ程度の低用量でも増殖を維持するのに十分なインターロイキン２（たとえばｒＩＬ−２）の存在に依存する。ＩＬ−７及びＩＬ−１２は長期成長を支援せず、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子α、インターフェロンα、及びインターフェロンγをはじめとする試験された各種他のサイトカインも同様である。初代ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ−９２は、典型的には、相対的に低いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（たとえば１：１）でさえも高い細胞傷害性を有する。代表的なＮＫ−９２細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）にＣＲＬ−２４０７という名称で寄託されている。

【0038】

したがって、好適なＮＫ細胞は、たとえばＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を低減又は消失するように突然変異された１つ以上の改変ＫＩＲを有しうる。当然ながら、１つ以上のＫＩＲも同様に欠失させうるか又は発現を抑制しうることに留意すべきである（たとえば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを介して）。最も典型的には、１つ超のＫＩＲが突然変異、欠失、又はサイレンスされ、とりわけ企図されるＫＩＲとしては、短い又は長い細胞質内テールを備えて２つ又は３つのドメインを有するものが挙げられる。さまざまな観点から見て、改変、サイレンス、又は欠失されるＫＩＲとしては、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、及びＫＩＲ３ＤＳ１が挙げられよう。かかる改変細胞は、当技術分野で周知のプロトコルを用いて調製しうる。代替的に、かかる細胞はまた、ａＮＫ細胞（活性化ナチュラルキラー細胞）としてＮａｎｔＫｗｅｓｔ（ＵＲＬｗｗｗ．ｎａｎｔｋｗｅｓｔ．ｃｏｍを参照されたい）から市販品としても入手しうる。次いで、かかる細胞は、以下でより詳細にさらに記載されるように追加的に遺伝子改変しＣＡＲとしうる。

【0039】

本発明の主題の他の一態様では、遺伝子工学操作ＮＫ細胞はまた、高親和性Ｆｃγレセプター（ＣＤ１６）を発現するように改変されたＮＫ−９２派生物でありうる。Ｆｃγレセプターの高親和性変異体の配列は、当技術分野で周知であり（たとえば、Ｂｌｏｏｄ ２００９ １１３：３７１６−３７２５を参照されたい）、生成及び発現の方法はすべて、本明細書に記載の使用に好適であるとみなされる。かかるレセプターの発現は、患者の腫瘍細胞（たとえばネオエピトープ）、特定腫瘍型（たとえば、ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡなど）、又は癌関連のもの（たとえばＣＥＡ−ＣＡＭ）に特異的な抗体を用いた腫瘍細胞の特異的標的化を可能にすると考えられる。有利なことに、かかる抗体は市販されており、細胞と組み合わせて使用可能である（たとえば、Ｆｃγレセプターに結合させて）。代替的に、かかる細胞はまた、ｈａＮＫ細胞としてＮａｎｔＫｗｅｓｔから市販品としても入手しうる。次いで、かかる細胞は、以下でより詳細にさらに記載されるように追加的に遺伝子改変しＣＡＲとしうる。

【0040】

本明細書で企図されるＮＫ細胞の遺伝子改変は、多くの方法で実施可能であり、公知の方式はすべて、本明細書における使用に好適であるとみなされる。さらに、ＮＫ細胞は、ＤＮＡ又はＲＮＡでトランスフェクト可能であり、且つトランスフェクションの特定的選択は、少なくとも部分的には所望の組換え細胞型及びトランスフェクション効率に依存するであろうことを認識すべきである。たとえば、ＮＫ細胞を安定的にトランスフェクトすることが望まれる場合、ゲノムへのインテグレーションのために線状化ＤＮＡを細胞に導入しうる。他方、一過性トランスフェクションが望まれる場合、環状ＤＮＡ又は線状ＲＮＡ（たとえば、ポリＡ＋テールを有するｍＲＮＡ）を使用しうる。

【0041】

たとえば、ＮＫ細胞が自家ＮＫ細胞又はＮＫ−９２細胞である場合、組換え核酸は、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを含むＣＡＲをコードするセグメントと、好ましくは、オートクリン成長刺激を提供するサイトカイン（たとえば、ＩＬ−２、ＥＲ保持配列で改変されたＩＬ−２、ＩＬ−１５、又はＥＲ保持配列で改変されたＩＬ−１５）をコードするセグメント及び／又はＣＤ１６若しくは高親和性ＣＤ１６^１５８Ｖをコードするセグメントと、を含むであろうことが企図される。容易に分かるであろうが、オートクリン成長刺激を提供するサイトカインの組込みは、外因性サイトカイン添加に依存しない改変組換え体を与えるであろうことから、かかる細胞の大規模生産が経済的に実現可能になるであろう。同様に、改変組換え体がＣＤ１６又は高親和性ＣＤ１６^１５８Ｖを発現する場合、かかる細胞は、さらに増強されたＡＤＣＣ特性を有するとともに、それにより改善された標的化細胞傷害性を有するであろう。

【0042】

当然ながら、サイトカイン及び／又はＣＤ１６若しくは高親和性ＣＤ１６^１５８Ｖをコードする組換え核酸は、ＮＫ細胞のゲノムにインテグレート可能であるか、又は染色体外ユニット（ウイルス送達された又は化学的、機械的、若しくは電気的トランスフェクションを介して送達された線状若しくは環状ＤＮＡ又は線状ＲＮＡでありうる）として供給可能であることを認識すべきである。たとえば、ＩＬ−２ＥＲとＣＤ１６１５８Ｖとを発現する組換えＮＫ−９２細胞は、ｈａＮＫ細胞として公知であり（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６ Ｄｅｃ ２７；７（５２）：８６３５９−８６３７３）、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを含むＣＡＲをコードするセグメントを含む組換え核酸でトランスフェクト可能である。もう一度述べるが、かかる組換え核酸は、追加の免疫療法タンパク質、たとえば、Ｎ−８０３、ＴｘＭ型化合物、ＩＬ−８トラップ、ＴＧＦ−βトラップなどをコードしうるさらなるセグメントを含みうる。同様に、ＮＫ−９２細胞は、ＩＬ−２をコードするｃＤＮＡですでにトランスフェクトされたものでありうる（たとえば、ＮＫ−９２ＭＩ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４０８）。次いで、かかる細胞は、ＣＤ１６又は高親和性ＣＤ１６^１５８Ｖをコードするセグメントと共に、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを含むＣＡＲをコードするセグメントを含む組換え核酸でさらにトランスフェクト可能である。

【0043】

他方、（自家、フレッシュ、培養、又は事前フリーズ）ＮＫ細胞又はＮＫ−９２細胞はまた、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲをコードするセグメントと、オートクリン成長刺激を提供するサイトカイン（たとえば、ＩＬ−２、ＥＲ保持配列で改変されたＩＬ−２、ＩＬ−１５、又はＥＲ保持配列で改変されたＩＬ−１５）をコードするセグメントと、ＣＤ１６（配列番号３４）又は高親和性ＣＤ１６^１５８Ｖ（配列番号３６によりコードされる配列番号３５）をコードするセグメントと、を含む組換え核酸でトランスフェクトしうる。最も典型的には、かかる組換え核酸は、トリシストロニック構築物として配置されるであろう。以上に述べたように、かかる構築物は、染色体外環状プラスミド、線状ＤＮＡ（ＮＫ細胞のゲノムにインテグレートしうる）、又は線状ＲＮＡでありうる。かかる核酸は、典型的には、当技術分野で周知の方法（たとえば、エレクトロポレーション、リポフェクション、バリスティック遺伝子移入など）により細胞にトランスフェクトされるであろう。同様に、核酸は、組換えウイルスを介して細胞に送達しうる。したがって、本明細書に記載の使用に好適なＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞（ＣＡＲと、ＣＤ１６又はその変異体と、サイトカイン又はその変異体と、をコードするトリシストロニック構築物でトランスフェクトしうる）、ＣＤ１６若しくはその変異体又はサイトカイン若しくはその変異体を発現する遺伝子改変ＮＫ細胞又はＮＫ−９２細胞（ＣＡＲと、ＣＤ１６若しくはその変異体又はサイトカイン若しくはその変異体と、をコードする核酸でトランスフェクトしうる）、及びＣＤ１６又はその変異体と、サイトカイン又はその変異体と、を発現する遺伝子改変ＮＫ細胞又はＮＫ−９２細胞（ＣＡＲをコードする核酸でトランスフェクトしうる）を含む。

【0044】

したがって、好ましい実施形態では、遺伝子改変ＮＫ細胞（とりわけ、細胞がＣＡＲとＣＤ１６又はその変異体とを発現する場合）は、３つの識別可能なモードの細胞死滅、すなわち、レセプター（たとえばＮＫＧ２Ｄレセプター）の活性化により媒介される一般的細胞傷害性、標的細胞に結合された抗体により媒介されるＡＤＣＣ、及びＣＡＲ媒介細胞傷害性を呈するであろうことに留意すべきである。

【0045】

そのため、トランスフェクションの方法は、少なくとも部分的には利用される核酸のタイプに依存するであろうことが認識されるべきである。したがって、ウイルストランスフェクション、化学的トランスフェクション、機械的トランスフェクションの方法はすべて、本明細書に記載の使用に好適であるとみなされる。たとえば、一実施形態では、本明細書に記載のベクターは一過的発現ベクターである。かかるベクターを用いて導入される外因性トランスジーンは、細胞の核ゲノムにインテグレートされないので、ベクター複製の不在下では、外来トランスジーンは経時的に劣化又は希釈されるであろう。

【0046】

他の一実施形態では、本明細書に記載のベクターは、細胞の安定なトランスフェクションを可能にする。一実施形態では、ベクターは、細胞のゲノムへのトランスジーンの取込みを可能にする。好ましくは、かかるベクターはポジティブ選択マーカーを有し、好適なポジティブ選択マーカーは、遺伝子を発現しない細胞を死滅させうる条件下で細胞の成長を可能にするいずれかの遺伝子を含む。例としては、限定されるものではないが、抗生物質耐性たとえばジェネティシン（Ｔｎ５由来のＮｅｏ遺伝子）が挙げられる。

【0047】

代替的又は追加的に、ベクターはプラスミドベクターである。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。当業者であれば理解されるであろうが、いずれの好適なベクターも使用可能であり、好適なベクターは当技術分野で周知である。

【0048】

さらに他の実施形態では、細胞は、対象タンパク質（たとえばＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされる。ｍＲＮＡのトランスフェクションは、タンパク質の一過的発現をもたらす。一実施形態では、ＮＫ−９２細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションは、細胞の投与の直前に実施される。一実施形態では、細胞への投与の「直前」とは、投与の約１５分前〜約４８時間前を意味する。好ましくは、ｍＲＮＡのトランスフェクションは、投与の約５時間前〜約２４時間前に実施される。より詳細に以下に記載されるように少なくともいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによるＮＫ細胞トランスフェクションは、高分率のトランスフェクト細胞でＣＡＲの予想外に一貫した強い発現をもたらした。さらに、かかるトランスフェクト細胞はまた、比較的低いエフェクター細胞対標的細胞比で高い特異的細胞傷害性を呈した。

【0049】

企図されるＣＡＲに関して、ＮＫ又はＮＫ−９２細胞は、シグナリングドメインを細胞内空間に維持しつつ、ＣＡＲの一部分を細胞表面上に露出させて膜結合タンパク質としてＣＡＲを発現するように、遺伝子改変されるであろうことに留意されたい。最も典型的には、ＣＡＲは、少なくとも次のエレメント、すなわち、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及びＦｃεＲＩγシグナリングドメインを（順に）含むであろう。

【0050】

好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞質内ドメインは、ＦｃεＲＩγのシグナリングドメインを含むか又はそれからなる。注目すべきこととして、より詳細に以下に記載されるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインは、経時的に有意に長期にわたる細胞傷害性と同時に、ＣＡＲの実質的に増加した発現レベルを提供する。たとえば、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＦｃεＲＩγ細胞質内ドメインは、唯一のシグナリングドメインである。しかしながら、追加のエレメント、たとえば、他のシグナリングドメイン（たとえば、ＣＤ２８シグナリングドメイン、ＣＤ３ζシグナリングドメイン、４−１ＢＢシグナリングドメインなど）も含みうることを認識すべきである。これらの追加のシグナリングドメインは、ＦｃεＲＩγ細胞質内ドメインの下流及び／又はＦｃεＲＩγ細胞質内ドメインの上流に位置しうる。

【0051】

いくつかの実施形態では、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。

【0052】

代替実施形態では、ＣＡＲの細胞質内ドメインはまた、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）のシグナリングドメインを含みうる。一実施形態では、ＣＡＲの細胞質内ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナリングドメインからなる。一実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。

【0053】

ＣＡＲは、いずれかの好適な膜貫通ドメインを含みうる。一態様では、ＣＡＲは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列（配列番号７を有する核酸によりコードされる）を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、４−１ＢＢ膜貫通ドメインであってもよい。

【0054】

ＣＡＲは、いずれかの好適なヒンジ領域を含みうる。一態様では、ＣＡＲはＣＤ８のヒンジ領域を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。かかる領域は、配列番号５の配列を有する核酸によりコードされうる。

【0055】

したがって、企図されるＣＡＲは、シグナリングドメインに結合された膜貫通ドメインに結合されたヒンジドメインに結合された所望の抗原結合ドメインの一般構造を含むであろう。別の観点から見て、企図されるＣＡＲは、所望の結合ドメインを有しうるとともに、次いで、これは、シグナリングドメインに結合された膜貫通ドメインに結合されたヒンジドメインを含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になるハイブリッドタンパク質に結合される。たとえば、かかるハイブリッドタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列（核酸配列の配列番号９によりコードされる）に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有しうる。

【0056】

必ずというわけではないが最も典型的には、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、対象抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ又は他の天然若しくは合成の結合部分であろう。とくに好適な結合部分としては、単一、二重、若しくは多重標的特異性を有する小さな抗体フラグメント、βバレルメイン結合剤、ファージディスプレイ融合タンパク質などが挙げられる。好適な細胞外結合ドメインの中でもとくに好ましいドメインは、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、又は患者及び腫瘍特異的抗原に特異的に結合するであろう。腫瘍特異的抗原としては、限定されるものではないが、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＳ１、ＧＤ２、ＣＤ１３８、ＥｐＣＡＭ、ＥＢＮＡ３Ｃ、ＧＰＡ７、ＣＤ２４４、ＣＡ−１２５、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＰＡＧＥ、ＮＹ−ＳＥＯ−１、ＧＡＧＥ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＭＵＣ５ＡＣ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＷＴ−１、ＰＳＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＴＡＧ１Ｂ、及びＣＤ３３が挙げられる。限定されるものではないが追加の腫瘍関連抗原及びそれに関連する悪性病変は、表１に見いだしうる。そのほかのさらなる腫瘍特異的抗原は、限定されるものではないが、たとえば、米国特許出願公開第２０１３／０１８９２６８号明細書、国際公開第１９９９０２４５６６Ａ１号パンフレット、米国特許第７０９８００８号明細書、及び国際公開第２００００２０４６０号パンフレット（各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。同様に、他の好ましいドメインは、（病原性）ウイルス特異的抗原、たとえば、ＨＩＶウイルス（たとえばｇｐ１２０）、ＨＰＶウイルス、ＲＳＶウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、又はＨＣＶウイルスの抗原に特異的に結合するであろう。

【0057】

【表1】

【0058】

【表2】

【0059】

【表3】

【0060】

【表4】

【0061】

たとえば、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９細胞外ドメインを含みうる。一実施形態では、抗ＣＤ１９細胞外ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一実施形態では、抗ＣＤ１９細胞外ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又はそれから本質的になる。

【0062】

そのため、企図されるＣＡＲは、特異的癌型に関連する抗原を標的とするであろう。たとえば、標的癌としては、白血病（急性白血病（たとえば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（前骨髄球性、骨髄芽球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病を含む）を含む）及び慢性白血病（たとえば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（たとえば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、たとえば、限定されるものではないが肉腫及び癌腫、たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられる。

【0063】

したがって、企図されるＣＡＲは、一般に、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに（直接）結合された膜貫通ドメインに（直接）結合されたヒンジドメインに（直接）結合された細胞外結合ドメインの構造を有するであろう。そのほかのさらなる企図される態様では、企図されるＣＡＲはまた、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに加えて又はその代わりに１つ以上のシグナリングドメインを含みうるとともに、とりわけ企図されるシグナリングドメインは、ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢシグナリングドメインと、ＣＤ２８シグナリングドメインと、を含む。したがって、たとえば、企図されるＣＡＲは、ヒンジドメイン（たとえば、配列番号５によりコードされる配列番号３又は配列番号４のＣＤ８ヒンジ）に結合されたいずれかの結合ドメイン（たとえば、配列番号１１を有する）を含みうるとともに、このヒンジドメインは、続いて、シグナリングドメイン（たとえば、配列番号１によりコードされる配列番号１のＦｃεＲＩγシグナリングドメイン、又は配列番号１３のＣＤ２８シグナリングドメイン、又は配列番号１４の４−１ＢＢシグナリングドメイン、又は配列番号１５のＣＤ３ζシグナリングドメイン）に結合された膜貫通ドメイン（たとえば、配列番号７によりコードされる配列番号６のＣＤ２８ＴＭ）に結合される。

【0064】

企図されるＣＡＲの構築に関して、たとえば、国際公開第２０１４／０３９５２３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０２４２７０１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０２７４９０９号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２８０２８５号明細書、及び国際公開第２０１４／０９９６７１号パンフレット（各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される多くの方法によりＣＡＲを工学操作可能であることを認識すべきである。

【0065】

そのほかのさらなる企図される態様では、以上に述べたように、ＮＫ細胞は、サイトカイン及びＣＡＲが同一組換え核酸上にコードされた形で１つ以上のサイトカインを発現させて選択マーカーを提供するように、及び／又は外因性ＩＬ−２に依存しない組換え細胞を与えるように、さらに遺伝子改変しうる。したがって、本発明の主題のいくつかの態様では、ＮＫ−９２細胞は、少なくとも１つのサイトカインを発現するように改変される。特定的には、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、又はそれらの変異体である。好ましい実施形態では、サイトカインはＩＬ−２又はその変異体であり、とりわけ好ましい変異体は内質保持シグナルを含む（たとえば、配列番号２１のヒトＩＬ−２、又は配列番号２２、配列番号３０、若しくは配列番号３３のＥＲ保持シグナルを有するもの）。たとえば、ＩＬ−２遺伝子は、ＩＬ−２を小胞体に方向付けるシグナル配列と共にクローニングされ発現される。これはＩＬ−２を細胞外に放出することなくオートクリン活性化に十分なレベルのＩＬ−２の発現を可能にする（たとえば、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００５ Ｆｅｂ；３３（２）：１５９−６４）。代替的に、組換え細胞にオートクリン成長シグナルを提供するだけでなく、発現されたＩＬ−１５の少なくともいくつかを細胞から放出させて免疫刺激シグナルも提供するのに十分な量でサイトカインが発現されるように、サイトカイン（とりわけＩＬ−１５）の発現を行いうる。たとえば、かかる発現は、シグナルペプチドと内質保持配列との両方を含むヒトＩＬ−１５配列を用いて達成しうる。内質保持ＩＬ−１５に対する模範的ＤＮＡ配列及びタンパク質配列は、それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０に示される。

【0066】

所望により、企図される細胞は自殺遺伝子も発現しうる。「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞のネガティブ選択を可能にするトランスジーンを意味する。自殺遺伝子は、安全系として使用され、選択剤の導入により遺伝子を発現する細胞の死滅を可能にする。これは、組換え遺伝子が突然変異を起こして無制御な細胞成長をもたらすか又は細胞自体がかかる成長を行いうる場合に望ましい。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子をはじめとするいくつかの自殺遺伝子系が同定されている。典型的には、自殺遺伝子は、細胞に悪影響を及ぼさないが特異的化合物の存在下では細胞を死滅させるタンパク質をコードする。そのため、自殺遺伝子は典型的には系の一部である。

【0067】

一実施形態では、自殺遺伝子はＮＫ−９２細胞で活性である。一実施形態では、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。ＴＫ遺伝子は、野生型又は突然変異ＴＫ遺伝子（たとえば、ｔｋ３０、ｔｋ７５、ｓｒ３９ｔｋ）でありうる。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを用いて死滅させうる。他の一実施形態では、自殺遺伝子は、５−フルオロシトシンの存在下で細胞に対して毒性であるシトシンデアミナーゼである。Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．“Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ １ ｍｉｌｌｉｏｎ−ｆｏｌｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｕｒｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ．１９９８ Ｊｕｌ １５；９２（２）：６７２−８２。さらなる実施形態では、自殺遺伝子は、イホスファミド又はシクロホスファミドの存在下で毒性であるシトクロムＰ４５０である。たとえば、Ｔｏｕａｔｉ ｅｔ ａｌ．“Ａ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４；１４（３）：２３６−４６を参照されたい。さらに他の一実施形態では、自殺遺伝子はｉＣａｓｐ９である。Ｄｉ Ｓｔａｓｉ，（２０１１）“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓ ａ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：１６７３−１６８３。Ｍｏｒｇａｎ，“Ｌｉｖｅ ａｎｄ Ｌｅｔ Ｄｉｅ：Ａ Ｎｅｗ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｏｖｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）；２０：１１−１３も参照されたい。ｉＣａｓｐ９は、低分子ＡＰ１９０３の存在下でアポトーシスを誘発する。ＡＰ１９０３は、耐容性が良好であることが臨床試験で示されているとともに養子細胞療法の状況で使用されている生物学的イナート低分子である。

【0068】

当然ながら、組換えタンパク質はすべて、個別組換え配列から発現可能であることに留意すべきである。しかしながら、多重組換え配列を発現させる場合（たとえば、ＣＡＲ、ＣＤ１６、サイトカイン）、組換えタンパク質をコードする少なくとも２つ又は少なくとも３つのコード領域を有するポリシストロニックユニットでコード領域を配置しうることが一般に好ましい。たとえば、トリシストロニックＤＮＡ又はＲＮＡ構築物（たとえば、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインと、ＣＤ１６^１５８Ｖと、ＩＬ−２^ＥＲ又はＩＬ１５^ＥＲと、を有するＣＡＲをコードする）は、ＮＫ又はＮＫ−９２細胞にトランスフェクトしうる。したがって、トランスジーンは、当業者に公知のいずれかの機序により工学操作を行って発現ベクターに導入可能である。複数のトランスジーンを細胞に挿入する場合、トランスジーンは、同一発現ベクター又は異なる発現ベクターに工学操作により導入しうる。いくつかの実施形態では、細胞は、発現されるトランスジェニックタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞は、発現されるトランスジェニックタンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトされる。トランスジーンのｍＲＮＡ及びＤＮＡは、当技術分野で公知のいずれかのトランスフェクション法を用いて、たとえば、限定されるものではないが、感染、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、又は「遺伝子銃」により、ＮＫ−９２細胞に導入可能である。

【0069】

自明なことであろうが、企図される遺伝子改変細胞は、各種疾患、とりわけ、疾患細胞が疾患特異的抗原又は疾患関連抗原を提示する各種癌及びウイルス感染症の治療に使用可能である。そのため、本発明者らは、本明細書に記載の改変ＮＫ又はＮＫ−９２細胞により患者を治療する方法を企図する。一実施形態では、患者は、癌（たとえば腫瘍）に罹患しており、且つ改変ＮＫ−９２細胞又は細胞系は、癌又は腫瘍の細胞表面上に発現される抗原に特異的なＣＡＲを発現する。一実施形態では、患者は、ウイルス感染症に罹患しており、且つ改変ＮＫ−９２細胞又は細胞系は、ウイルスが感染した細胞の表面上に発現される抗原に特異的なＣＡＲを発現する。一実施形態では、患者は、細菌感染症に罹患しており、且つ改変ＮＫ−９２細胞又は細胞系は、感染症を引き起こす細菌細胞の表面上に発現される抗原に特異的なＣＡＲを発現する。

【0070】

企図される改変ＮＫ又はＮＫ−９２細胞は、細胞の絶対数により個体に投与可能である。たとえば、約１０００細胞／注射〜約１００億細胞／注射、たとえば、約、少なくとも約、若しくは多くとも約１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３（など）改変ＮＫ−９２細胞／注射、又は端点を含めてこれらのいずれか２つの数の間のいずれかの範囲で、個体に投与可能である。他の実施形態では、改変ＮＫ−９２細胞は、細胞の相対数により個体に投与可能であり、たとえば、約１０００細胞〜約１００億細胞／キログラム個体、たとえば、約、少なくとも約、又は多くとも約１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３（など）改変ＮＫ−９２細胞／キログラム個体、又は端点を含めてこれらのいずれか２つの数の間のいずれかの範囲で、前記個体に投与可能である。他の実施形態では、全用量は、ｍ^２体表面積、たとえば、約１×１０^１１、１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８、１×１０^７／ｍ^２、又は端点を含めてこれらのいずれか２つの数の間のいずれかの範囲により計算しうる。平均的な人は、約１．６〜約１．８ｍ^２である。好ましい実施形態では、約１０億〜約３０億ＮＫ−９２細胞が患者に投与される。

【0071】

改変ＮＫ−９２細胞及び任意選択的に他の抗癌剤又は抗ウイルス剤は、癌患者又はウイルス感染患者に１回投与可能であるか、或いは複数回、たとえば、治療期間中、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間に１回、又は１、２、３、４、５、６、若しくは７日間に１回、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間、若しくはそれ以上に１回、又は端点を含めてこれらのいずれか２つの数の間のいずれかの範囲で投与可能である。

【0072】

一実施形態では、改変ＮＫ−９２細胞が自殺遺伝子を発現する場合、改変ＮＫ−９２細胞死をトリガーする作用剤が患者に投与される。一実施形態では、作用剤は、ＮＫ−９２細胞による標的細胞の死滅に十分な改変ＮＫ−９２細胞の投与後、ある時点で投与される。

【0073】

一実施形態では、改変ＮＫ−９２細胞は患者への投与前に照射される。ＮＫ−９２細胞への照射は、たとえば、米国特許第８，０３４，３３２号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一実施形態では、自殺遺伝子を発現するように工学操作されていない改変ＮＫ−９２細胞に照射される。

【0074】

さらに、企図される治療はまた、他の免疫療法エンティティーの投与を含むであろうことを認識すべきであり、とりわけ好ましい免疫療法エンティティーとしては、ウイルス癌ワクチン（たとえば、癌特異的抗原をコードするアデノウイルスベクター）、細菌癌ワクチン（たとえば、１つ以上の癌特異的抗原を発現する非発熱性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母癌ワクチン、Ｎ−８０３（ＡＬＴＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製ＡＬＴ−８０３としても知られる）、抗体（たとえば、腫瘍関連抗原又は患者特異的腫瘍ネオ抗原に結合するもの）、幹細胞移植片（たとえば、同種又は自家）、及び腫瘍標的化サイトカイン（たとえば、腫瘍標的化抗体に結合されたＩＬ−１２であるＮＨＳ−ＩＬ１２又はそのフラグメント）が挙げられる。

【実施例】

【0075】

以下の実施例は、単に例示を目的としたものにすぎず、特許請求された本発明を限定するものと解釈すべきではない。意図される発明を成功裏に同様に実施可能にしうる当業者の利用可能なさまざまな代替技術及び手順が存在する。

【0076】

実施例１：ＣＡＲｍＲＮＡの調製
図１に模式的に表されるＣＤ１９ＣＡＲの各変異体をコードするＤＮＡ配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計し、ｄｅ ｎｏｖｏで合成し、ｍＲＮＡ発現ベクターｐＸＴ７（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングした。ＳａｌＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による消化により１０マイクログラム（μｇ）のプラスミドを線状化し、製造業者の説明書に従ってＱＩＡｇｅｎゲル精製キット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて精製した。

【0077】

製造業者の説明書に従ってＴ７ ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｕｌｔｒａ転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の鋳型として線状化ＤＮＡを使用した。このキットは、ｍＲＮＡのポリＡテールの長さを増加させるポリアデニル化伸長工程を含むので、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を増強する。

【0078】

陰性対照として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡを調製するとともに、６つのＣＤ１９ＣＡＲ変異体のｍＲＮＡを調製した。ＣＤ１９ＣＡＲ変異体はすべて、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ領域（αＣＤ１９−ｓｃＦｖ）（配列番号１１）とＣＤ８由来のヒンジ領域（配列番号３又は４）とを含む細胞外ドメインと、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン（配列番号７によりコードされる配列番号６）と、を含有していた。ＣＤ１９ＣＡＲの細胞内ドメインは、以下の通りであり、図１に模式的に示される。すなわち、ＣＡＲ３ｚは、ＣＤ３ζシグナリングドメインを含有し、ＣＡＲＦｃＲｅは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメイン（配列番号１）を含有し、ＣＡＲ２８＿３ｚは、ＣＤ３ζシグナリングドメインに融合されたＣＤ２８シグナリングドメインを含有し、ＣＡＲＢＢ＿３ｚは、ＣＤ３ζシグナリングドメインに融合された４−１ＢＢシグナリングドメインを含有し、ＣＡＲ２８＿ＢＢ＿３ｚは、ＣＤ３ζシグナリングドメインに融合された４−１ＢＢシグナリングドメインに融合されたＣＤ２８シグナリングドメインを含有し、ＣＡＲＢＢ＿３ｚ＿２８は、ＣＤ２８シグナリングドメインに融合されたＣＤ３ζシグナリングドメインに融合された４−１ＢＢシグナリングドメインを含有していた。

【0079】

より特定的には、図１のＣＤ３ζシグナリングドメインを有する第一世代ＣＡＲは、配列番号１６（ヒト）の核酸配列を有していた。ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第一世代ＣＡＲは、配列番号１２の核酸配列及び配列番号１０のアミノ酸配列を有していた。ＣＤ２８／ＣＤ３ζシグナリングドメインを有する第二世代ＣＡＲは、配列番号１７の核酸配列を有し、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナリングドメインを有する第二世代ＣＡＲは、配列番号１８の核酸配列を有していた。ＣＤ２８／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナリングドメインを有する第３世代ＣＡＲは、配列番号１９の核酸配列を有し、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ／ＣＤ２８シグナリングドメインを有する第３世代ＣＡＲは、配列番号２０の核酸配列を有していた。ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するさらなる第一世代ＣＡＲは、配列番号２５のアミノ酸配列を有していた。

【0080】

実施例２：ＮＫ−９２細胞へのＣＤ１９ＣＡＲｍＲＮＡのエレクトロポレーション
５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）と、５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２（Ｐｒｏｓｐｅｃ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）と、が補足されたＸ−Ｖｉｖｏ１０培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中でＮＫ−９２細胞を成長させた。ＮＫ−９２細胞に対する製造業者のパラメーター（１２５０Ｖ、１０ｍｓ、３パルス）に従ってＮｅｏｎ（商標）エレクトロポレーションデバイス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、且つ１００μｌの体積中で５μｇのｍＲＮＡ／１０^６細胞を用いて、細胞にｍＲＮＡをエレクトロポレートした。エレクトロポレートされた細胞を培地（上記のものと同一）中に２０時間（ｈ）維持した。

【0081】

ｅＦ６６０で標識された抗ｓｃＦｖ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーにより、ＮＫ−９２細胞表面上のＣＤ１９ＣＡＲ発現を決定した。図２Ａは、ＮＫ−９２細胞集団における指定のＣＤ１９ＣＡＲの％発現を示す。図２Ｂは、指定のＣＤ１９ＣＡＲがエレクトロポレートされた細胞のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ、−バックグラウンド）を示す。図２Ａ及び２Ｂから分かるように、ＣＡＲＦｃＲｅは、予想外なことに、細胞表面にＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞のパーセント（７５．２％）が最高であるとともにさらに最高のＭＦＩ（組換え細胞上に発現されたＣＡＲの量）を有し、２８＿３ｚがそれに続いた（６１．７％）。

【0082】

実施例３：癌細胞系に対するＣＤ１９ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞の細胞傷害性
エレクトロポレーションの２０時間後、フローベースｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的癌細胞に対するＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞の効能を試験した。９６ウェルプレート中でさまざまなエフェクター対標的比（５：１〜０．３：１）で、エフェクター細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ又はＧＦＰを発現するＮＫ−９２）と、ＰＫＨＧＬ６７標識（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）標的細胞（Ｋ５６２、又はＳＵＰＢ１５、Ｂ−ＡＬＬ、ＣＤ１９^＋）と、を混合し、３７℃で４ｈインキュベートした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を細胞に添加し、２ｈ以内にＡｔｔｕｎｅフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてサンプルを解析した。細胞傷害性は、ＰＫＨ陽性標的集団内のＰＩ陽性細胞の％により決定した。

【0083】

模範的結果は、図３Ａ及び３Ｂに提供される。図３Ａから分かるように、ＮＫ−９２細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲ発現にかかわらずＫ５６２細胞を死滅させるのに有効である。そのため、組換え細胞は、細胞傷害性を失わないであろうことに留意すべきである。これとは対照的に、ＧＦＰ発現ＮＫ−９２細胞は、癌細胞系ＳＵＰ−Ｂ１５を死滅させる効率が悪かった。ＳＵＰ−Ｂ１５は、ＣＤ１９陽性の急性リンパ芽球性白血病細胞系であり、ＮＫ−９２媒介細胞傷害性に対して耐性である。図３Ｂから容易に分かるように、試験されたいずれのＣＤ１９ＣＡＲの発現も、対照（ＧＦＰ発現ＮＫ−９２細胞）と比較してＳＵＰ−Ｂ１５細胞株に対する細胞傷害活性の増加をもたらす。驚くべきことに、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲは、第２及び第３世代ＣＡＲに類似したさらにはそれよりも優れた細胞傷害性を呈した。ＦｃεＲＩγシグナリングドメインは、他のシグナリングドメインとの組合せではなく単一ユニットとして存在したにすぎないので、かかる所見はとくに予想外である。かかる配置は、ＣＡＲＴ細胞で使用したとき、望ましい標的化細胞傷害性の提供に失敗した。

【0084】

脱顆粒は、ＮＫ−９２細胞の分泌顆粒からの溶解性タンパク質（たとえばパーフォリン及びグランザイム）の放出に必要とされるクリティカルな工程である。脱顆粒は、ＮＫ−９２による標的細胞の認識により開始される。構築物の脱顆粒を試験するために、９６ウェルプレート中でさまざまなエフェクター対標的比（５：１〜０．３：１）でエフェクター細胞（ＮＫ−９２）と非標識標的細胞（ＳＵＰ−Ｂ１５）とを混合し、抗ＣＤ１０７ａ（ＦＩＴＣコンジュゲート、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を各ウェルに添加した。ＣＯ_２インキュベーター中３７℃でプレートをインキュベートし、１時間後、モネンシン（Ｇｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ）をウェルに添加した。３７℃でプレートをさらに３ｈインキュベートし、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によりサンプルを解析した。エフェクター＋標的サンプルの％ＣＤ１０７ａ陽性からＮＫ−９２細胞単独の％ＣＤ１０７ａ陽性を減算することによりパーセント脱顆粒を決定した。模範的結果は、図４に提供される。

【0085】

実施例４．ＣＤ１９ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞の表面発現及び癌細胞系に対する細胞傷害性．
本発明者らは、各種ＣＡＲ構築物の発現レベルを定量し、経時的に発現の耐久性を調べた。図５の結果から分かるように、さまざまなＣＤ１９ＣＡＲ構築物でトランスフェクトされたＮＫ−９２細胞は、７２時間までそれぞれのＣＡＲを検出可能レベルで細胞表面上に発現した。予想外なことに、図５から容易に分かるように、Ｆｃイプシロン細胞質シグナリングドメインを含むＣＡＲ構築物は、実質的により長い継続時間の発現を有していた。また注目すべきこととして、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインのほかに１つ以上のシグナリングドメイン（たとえば、本明細書に提示された例ではＣＤ２８シグナリングドメイン）を追加しても、発現の継続時間に悪影響を及ぼさないことが観測された。実際に、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインとＣＤ２８シグナリングドメインとを有するＣＡＲでは、発現の継続時間は経時的にさらに増加するが、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを有するＣＡＲ構築物は、７２時間の時点で及びそれ以前でさえも発現の劇的な低減を有していた。

【0086】

さらに、図５の結果から同様に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲ構築物の発現量はまた、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを有する対応する構築物よりも初期に有意に高かった。

【0087】

本発明者らは、次いで、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲ構築物の長期にわたるより強い発現が、より高い細胞傷害率に結び付くかの試験を開始した。２４時間及び４８時間でのＳＵＰＢ１５ＣＤ１９^＋細胞の模範的試験結果は、図６に表される。結果から分かるように、試験されたＣＡＲ構築物はすべて、２４時間でほぼ同程度の（最大）細胞傷害性を示した。しかしながら、４８時間では、ＣＤ１９／ＣＤ３ゼータは、細胞傷害性の際立った減少を示した。注目すべき点として、ＦｃイプシロンベースＣＡＲは、エレクトロポレーションの４８時間後、細胞傷害活性のごくわずかな減少を示したにすぎず、図５の長期にわたる発現結果に対応した。そのため、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲ構築物は、実質的な臨床効果があると考えられる長期にわたる細胞傷害性を呈したことを認識すべきである。

【0088】

有利なことに、トリシストロニックＲＮＡ構築物は、優れた機能活性を有する実質的量の所望のＣＡＲを生成可能であった。かかる構築物は、ＣＡＲ発現が一過性であるべき場合にとりわけ有益である。これとは対照的に、標的化ＣＡＲ構築物の以下の実施例及び関連する機能データは、線状化ＤＮＡベクター構築物からのものであり、トランスフェクト細胞によるゲノムへの線状化ＤＮＡのインテグレーションを可能にして特異的ＣＡＲの非一過的発現の手段を提供する。

【0089】

実施例５．トリシストロニック発現カセットのマップ。
図７は、代表的なトリシストロニック発現カセットにより生成されるＤＮＡ及びタンパク質産物を図式的に示す。図８は、発現カセットを有するプラスミドの線状化形態を示す。

【0090】

配列番号２８は、図８に類似した構築物であるｐＮＥＵＫｖ１＿ＣＤ１９ＣＡＲ＿ＣＤ１６（１５８Ｖ）＿ＥＲＩＬ−２ベクターの一部の模範的核酸配列である。配列番号２９は、ＣＤ１９ＣＡＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１６（１５８Ｖ）タンパク質を表す模範的トリシストロニックタンパク質（図７に類似する）である。同様に、配列番号３１は、コドン最適化ＣＤ３３ＳｃｆＶ−Ｐ２Ａ−ＣＤ１６−ＩＲＥＳ−ｅｒＩＬ２トリシストロニック配列の模範的核酸配列であり、一方、配列番号３２は、ＣＤ３３ＣＡＲ−Ｐ２Ａ−ＣＤ１６ペプチドを示す。

【0091】

作製されたそのほかのさらなる構築物として、配列番号２４は、ＣＤ１９Ｋ＿膜貫通及びシグナリングドメインの模範的アミノ酸配列であり、配列番号２６は、１５ＡＤ２３ＨＣ＿１８０５８４３＿ＣＤ１９Ｋ＿Ｅｐｓ（８７９〜１３１９）の模範的核酸配列であり、且つ配列番号２７は、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含まなかった１５ＡＤ２３ＨＣ＿１８０５８４３＿ＣＤ１９Ｋ＿Ｅｐｓの模範的核酸配列である。

【0092】

実施例６．癌細胞系に対するＣＤ３３−ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞の細胞傷害性
以下の実施例は、対照（非改変）ＮＫ−９２細胞による特異的溶解（細胞傷害性）に対して耐性である細胞をＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞により効率的に死滅させることが可能であることを実証するために提供される。本実施例では、細胞は、ＣＤ３３を発現するＴＨＰ−１細胞であった。ＮＫ−９２細胞は、図８及び９に示されるように、ＣＤ３３に特異的に結合する細胞外結合ドメインと、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインと、を有するＣＡＲを発現するように改変された。

【0093】

図９Ａは、ＣＤ３３陽性（ＣＤ３３＋）ＴＨＰ−１細胞が対照ＮＫ−９２（ａＮＫ）細胞による細胞傷害性（特異的溶解）に対しては相対的に耐性であるが、ＣＤ３３に特異的に結合するＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞（ＣＤ３３−ＣＡＲ／ＮＫ−９２細胞）と共にＴＨＰ−１細胞を培養したときは高パーセントの特異的溶解が存在することを示すｉｎ ｖｉｔｒｏデータを提供する。さらに、ＣＡＲを発現する改変ＮＫ−９２細胞が相対的に低いエフェクター：標的比で死滅を呈したことに留意すべきである。図９Ｂは、Ｋ５６２細胞が対照ａＮＫ細胞及びＣＤ３３−ＣＡＲ／ＮＫ−９２細胞の両方により効率的に死滅されることを示すｉｎ ｖｉｔｒｏデータを提供する。

【0094】

実施例７：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＨＥＲ２−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＨＥＲ２−ＣＡＲは、配列番号３７の核酸配列を有していた。

【0095】

そのように構築されたＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の機能について、標準的カルセインＡＭベース細胞傷害性アッセイを用いてＢＴ−４７４細胞に対して試験した。模範的結果は図１０に示される。データから容易に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、ＢＴ−４７４標的細胞に対して有意な細胞傷害性を呈した。

【0096】

さらなる実験では、本発明者は、図３６に例示されるようにＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞でのＨＥＲ２．ＣＡＲの発現を実証した。ＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性は図３７の結果に示され、一方、ＣＡＲ媒介細胞傷害性の結果は図３８に示される。ＨＥＲ２．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的データは図３９のグラフに示される。

【0097】

実施例８：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＤ３０−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＣＤ３０ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＣＤ３０−ＣＡＲは、配列番号３８の核酸配列を有していた。

【0098】

ＣＤ３０−ＣＡＲの発現は図４６の結果で実証され、一方、組換え細胞のナチュラル細胞傷害性の結果は図４７に示される。ＣＡＲ媒介細胞傷害性は図４８の結果で実証され、一方、ＡＤＣＣの模範的結果は図４９のデータに示される。

【0099】

実施例９：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＥＧＦＲ−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＥＧＦＲｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＥＧＦＲ−ＣＡＲは、配列番号３９の核酸配列を有した。

【0100】

そのように構築されたＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の機能について、標準的細胞傷害性アッセイを用いてＡ−５４９細胞に対して試験した。模範的結果は図１４に示される。データから容易に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、Ａ−５４９標的細胞に対して有意な細胞傷害性を呈した。ＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞でのＥＧＦＲ−ＣＡＲの発現は図３１に示され、一方、ナチュラル細胞傷害性の結果は図３２に示される。ＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介細胞傷害性の模範的結果は図３３及び図３４に示され、一方、ＥＧＦＲ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの結果は図３５に示される。

【0101】

実施例１０：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＩＧＦ１Ｒ−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＩＧＦ１ＲｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＩＧＦ１Ｒ−ＣＡＲは配列番号４０の核酸配列を有し、ＩＧＦ１Ｒ−ＣＡＲとＣＤ１６とＩＬ−２^ＥＲとをコードするトリシストロニック構築物は、図６１にも模式的に例示される配列番号５３の核酸配列を有していた。

【0102】

そのように構築されたＩＧＦ１Ｒ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の機能について、第２世代ＣＡＲ（ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ）と比較して標準的細胞傷害性アッセイを用いてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して試験した。模範的結果は図１８に示される。データから容易に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＩＧＦ１Ｒ．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１標的細胞に対して第２世代ＣＡＲの細胞傷害性に匹敵する有意な標的特異的細胞傷害性を呈した。

【0103】

実施例１１：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＤ１２３−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＣＤ１２３−ＣＡＲは、配列番号４１の核酸配列を有していた。組換えＮＫ細胞を発現するＣＤ１２３−ＣＡＲのＣＡＲ媒介細胞傷害性のデータは図４４に示され、図４５は、組換えＮＫ細胞を発現するＣＤ１２３−ＣＡＲのＡＤＣＣの模範的データを示す。

【0104】

実施例１２：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＰＤ−Ｌ１−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＰＤ−Ｌ１−ＣＡＲは、配列番号４２の核酸配列を有していた。

【0105】

そのように構築されたＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の機能について、標準的細胞傷害性アッセイを用いてＳＵＰ−Ｂ１５．ＰＤ−Ｌ１^＋細胞に対して試験した。模範的結果は図１２に示される。データから容易に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、ＳＵＰ−Ｂ１５．ＰＤ−Ｌ１^＋標的細胞に対して有意な細胞傷害性を呈した。

【0106】

そのように構築されたＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の機能について、標準的細胞傷害性アッセイを用いてＵ２５１細胞に対してさらに試験した。模範的結果は、非トランスフェクトｈａＮＫ細胞と共に図１３に示される。データから容易に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、Ｕ２５１標的細胞に対して標的特異的且つ有意な細胞傷害性を呈したが、ｈａＮＫ対照細胞は、同一Ｕ２５１細胞に対して実質的にまったく細胞傷害性を有していなかった。

【0107】

ＰＤ−Ｌ１に対する標的細胞特異性に関するそのほかのさらなる実験では、本発明者らは、一般的細胞傷害性の対照としてのｈａＮＫ細胞と共にＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞を用いていくつかのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞系を試験した。図１９から容易に分かるように、ＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、多種多様な腫瘍細胞（肺、乳房、泌尿生殖器の腫瘍細胞、及びそのほか頭頸部小細胞癌、脊索腫）にわたり優れた細胞傷害性を有していた。注目すべきこととして、ＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、細胞の大多数（＞８５％）を死滅させるのに４時間未満を必要とし、対照ｈａＮＫ細胞は１２時間超を必要とした。

【0108】

図２０は、各種他の対照細胞（指定のｈａＮＫ細胞）と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性をさらに例示する。データから分かるように、５：１のＥ：Ｔ比で、ＰＤ−Ｌ１．ｔｈａＮＫによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１溶解はセツキシマブにより改善され、且つｈａＮＫ活性はセツキシマブ及びａ−ＰＤ−Ｌ１の添加により改善された。プレーンＰＤ−Ｌ１．ｔｈａｎｋは、ｈａＮＫ及びｈａＮＫ＋セツキシマブと比較して細胞傷害活性を改善し、プレーンＰＤ−Ｌ１．ｔｈａｎｋによる死滅は、ｈａＮＫ＋ＰＤ−Ｌ１抗体と同程度であったが、ＰＤ−Ｌ１．ｔｈａｎｋ＋セツキシマブは、ｈａＮＫ＋セツキシマブ及びｈａＮＫ＋ＰＤ−Ｌ１よりも性能が優れていた。１：１のＥ：Ｔ比では、ＰＤ−Ｌ１．ｔｈａＮＫ活性は、セツキシマブの有無によらず同一であり、且つＰＤ−Ｌ１．ｔｈａＮＫは、ｈａｎｋによる内因性及びＡＤＣＣ媒介性死滅よりも性能が有意に優れていた。ｈａＮＫ活性は、セツキシマブ及びａ−ＰＤ−Ｌ１の添加により改善された。

【0109】

さらなる実験では、本発明者らは、図４０に例示されるようにＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞でのＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲの発現を実証した。ＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性は図４１の結果に示され、一方、ＣＡＲ媒介細胞傷害性の結果は図４２に示される。ＰＤ−Ｌ１．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的データは図４３のグラフに示される。

【0110】

実施例１３：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＤ３３−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＣＤ３３−ＣＡＲは、配列番号４３の核酸配列を有していた。

【0111】

そのように構築されたＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の機能について、標準的細胞傷害性アッセイを用いてＴＨＰ−１細胞に対して試験した。模範的結果は図１１に示される。データから容易に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、ＴＨＰ−１標的細胞に対する有意な細胞傷害性を呈した。ＮＫ−９２細胞でのＣＤ３３ＣＡＲの強い発現を表すさらなるデータは、図２７に提示される。Ｋ５６２細胞に対するＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性は図２８に示され、図２９はＴＨＰ−１細胞に対するＣＡＲ媒介細胞傷害性の結果を表す。図３０は、リツキシマブを併用してＳＵＰ−Ｂ１５ＣＤ１９^ＫＯ／ＣＤ２０^＋に対するＣＤ３３．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣのさらなる結果を示す。

【0112】

実施例１４：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するｇｐ１２０−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ｇｐ１２０ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたｇｐ１２０−ＣＡＲは、配列番号４４の核酸配列を有していた。

【0113】

本発明者らは、そのように生成された細胞が図５３から分かるように有意量のＣＤ１６及びｇｐ１２０ＣＡＲを発現することをさらに実証した。ｇｐ１２０ＣＡＲへのＧＰ１２０の結合は、対陰性対照としての非組換えａＮＫ細胞と対比して図５４で実証される通り示された。対応している間、そのように生成された細胞のナチュラル細胞傷害性は図５５に示され、一方、対応するＡＤＣＣデータは図５６に示される。

【0114】

実施例１５：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＢ７−Ｈ４−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗Ｂ７−Ｈ４ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＢ７−Ｈ４−ＣＡＲは、配列番号４５の核酸配列を有していた。

【0115】

実施例１６：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＢＣＭＡ−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＢＣＭＡｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＢＣＭＡ−ＣＡＲは、配列番号４６の核酸配列を有していた。

【0116】

ＢＣＭＡ発現は、図５０の模範的結果に示されるように確認され、且つＣＡＲ媒介細胞傷害性は、図５１に示されるように標的細胞に対して実証された。同様に、図５２の結果から分かるように、組換え細胞は、標的細胞に対する抗体としてリツキシマブを用いて有意なＡＤＣＣを有していた。

【0117】

実施例１７：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＧＤ２−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＧＤ２ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＧＤ２−ＣＡＲは、配列番号４７の核酸配列を有していた。

【0118】

実施例１８：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＦＡＰ−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＦＡＰｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＦＡＰ−ＣＡＲは、配列番号４８の核酸配列を有していた。ＦＡＰ−ＣＡＲの発現は図５７のデータに示され、且つ標的細胞に対するＦＡＰ．ＣＡＲ細胞傷害性は図５８の結果で実証された。

【0119】

実施例１９：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＳＰＧ−４−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＣＳＰＧ−４ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＣＳＰＧ−４−ＣＡＲは、配列番号５２の核酸配列を有していた。ＣＳＰＧ−４−ＣＡＲの発現はＦＡＣＳ解析で確認され、且つ模範的結果は図５９に示される。このように構築された細胞はまた、図６０の模範的データに示されるように有意な細胞傷害性を呈した。

【0120】

実施例２０：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＤ２０−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＣＤ２０ｓｃＦｖを含み、Ｄ８ヒンジは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そのように構築されたＣＤ２０−ＣＡＲは、配列番号５１の核酸配列を有していた。

【0121】

ＮＫ−９２細胞でのＣＤ２０ＣＡＲの発現は、図２５の結果に示される。容易に分かるように、ＣＤ２０．ＣＡＲは、組換え細胞の大多数で強く発現される（以上に述べた線状化ＤＮＡのＣＤ１６と共に）。図２６は、ＣＤ２０^＋標的細胞に対するＣＤ２０．ＣＡＲＮＫ細胞の細胞傷害性の模範的結果を表す。

【0122】

実施例２１：ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＤ１９−ＣＡＲ
本実施例では、本発明者らは、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有する以上に記載の第１世代ＣＡＲを使用した。これは、ＣＤ８ヒンジに結合された抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含み、ＣＤ８ヒンジは、続いて、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインに結合されたＣＤ２８膜貫通ドメインに結合された。そして機能試験のために線状化ＤＮＡでＮＫ−９２細胞をトランスフェクトした。

【0123】

そのように構築されたＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞の機能について、標準的細胞傷害性アッセイを用いて一般的細胞傷害性を決定するためにＫ５６２細胞に対して試験した。模範的結果は図１５に示される。容易に分かるように、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、Ｋ５６２標的細胞に対する有意な細胞傷害性を呈した。さらなる実験セットでは、対照としてのａＮＫ細胞と比較してＳＵＰ−Ｂ１５細胞を用いて標的特異的細胞傷害性を決定した。模範的結果は図１６に示される。もう一度述べるが、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、有意な標的特異的細胞傷害性を呈した。そのうえさらに他の一実験セットでは、ＳＫＢｒ３細胞を使用し、抗体としてハーセプチン及びリツキサンを用いて、標的特異的ＡＤＣＣを決定した。模範的結果は図１７に示される。この場合も、ＦｃεＲＩγシグナリングドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ１９．ＣＡＲ−ｔ−ｈａＮＫ細胞は、有意な抗体及び標的特異的ＡＤＣＣを呈した。

【0124】

図２１は、対照と対比してＮＫ−９２細胞でＣＤ１６とＩＬ−２^ＥＲとをコードするセグメントを含む線状化ＤＮＡからのＣＤ１９．ＣＡＲ発現を模範的に例示する。図２５から分かるように、発現は、大多数の細胞にわたり非常に強かった。Ｋ５６２細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲｔ−ｈａＮＫ細胞のナチュラル細胞傷害性及びＳＵＰ−Ｂ１５細胞に対する標的化細胞傷害性の追加の結果は、図２２及び図２３に表される。ＳＵＰ−Ｂ１５ＣＤ１９^ＫＯ／ＣＤ２０^＋細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲｔ−ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣの模範的さらなる結果は図２４に示される。

【0125】

実施例２２：ＮＳＧマウスにおけるヒト異種移植モデルでのＰＤ−Ｌ１標的化ｔ−ｈａＮＫ細胞の抗腫瘍活性
確証されたＰＤＬ１陽性異種移植モデルとしてＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨＣＣ８２７を使用し、さまざまな製剤、投与レベル、及び投与経路（ＩＶ及びＩＴ）でＰＤＬ１ｔ−ｈａＮＫ細胞の効能を評価した。

【0126】

動物：動物型：ＮＳＧマウス（ＪＡＸ）、雌、９〜１０週齢、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデル用動物数：２４（フレッシュ細胞）、及びＨＣＣ８２７モデル用：２４（フレッシュ細胞）＋６（凍結保存細胞）。使用した腫瘍モデルは次の細胞系：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳腺癌）及びＨＣＣ８２７（ヒト肺腺癌）であり、接種経路は両方の側腹の皮下であり、治療開始時の平均腫瘍負荷はＭＤＡ−ＭＢ−２３１では約１００ｍｍ３及びＨＣＣ８２７では約７５〜８０ｍｍ３であった。

【0127】

治療品：抗ＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫは、濃度：５Ｅ７細胞／ｍＬ又は２Ｅ７細胞／ｍＬで新たに調製され照射されたものであり、媒体対照は、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０培地であり、投与方法は、記載のごとくＩＶ及びＩＴであった。ＩＶ ＮＫ投与の投与量は、２００μＬ中１Ｅ７細胞／回（新たに調製された細胞）、２００μＬ中４Ｅ６細胞／回（凍結保存細胞）であり、ＩＴ ＮＫ投与（フレッシュ細胞のみ）では、用量は５０μＬ中２．５Ｅ６細胞／腫瘍／回であった。投与頻度は、４週連続で週２回（Ｍ／Ｔｈ又はＴ／Ｆ）であり、投与の初日は１日目として定義された。

【0128】

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の試験設計は、以下の表３に記される（この試験は２７日目に終了し、その時、Ａ、Ｃ、及びＤ群の何匹かの動物は＞２０００ｍｍ３の総腫瘍体積に達した）。

【0129】

【表5】

【0130】

ＨＣＣ８２７の試験設計は、以下の表４に記される（この試験は２９日目に終了し、その時、生存動物は再目的化され、他の研究に移された）。

【0131】

【表6】

【0132】

結果：新たに調製されたＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ細胞（１Ｅ７細胞／回）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨＣＣ８２７の両方のモデルで際立った長期持続性の腫瘍成長阻害をもたらした。

【0133】

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：腫瘍静止：１６日目のＴＧＩ：８４％（ピーク）、２６日目のＴＧＩ：７９％（最終測定）。

【0134】

ＨＣＣ８２７：腫瘍退縮：１６日目のＴＧＩ：１２０％（ピーク）、２９日目のＴＧＩ：８４％（研究終了時）。

【0135】

凍結保存ＰＤＬ１ｔ−ｈａＮＫ細胞（４Ｅ６細胞／回）もまた、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０培地と比較して腫瘍成長抑制で統計的に有意な効能を示した：２６日目のＴＧＩ：６０％（ピーク）及び２９日目のＴＧＩ：４０％（研究終了時）。

【0136】

新たに調製されたＰＤＬ１ｔ−ｈａＮＫ細胞（１Ｅ７細胞／回）はまた、以下の表５に示されるようにＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルで転移疾患負荷の有意な減少をもたらした。

【0137】

【表7】

【0138】

媒体中に存在した可視肝臓小結節の数：２９±９、ＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ群中：０（対応のない両側ｔ検定によるＰ＝０．０１１６）。

【0139】

実施された実験に基づいて、１Ｅ７細胞／回の投与レベルの新たに調製されたＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ細胞の４週間にわたる週２回のＩＶ投与は、試験された皮下異種移植モデルの両方で際立った抗腫瘍効能を示した。すなわち、治療は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍保有マウスでは腫瘍静止をもたらし、１６日目のピークＴＧＩは８４％及び試験終了時のＴＧＩは７９％であり（両時点で二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ＜０．０００１であり、続いてチューキー検定による多重比較を行った）、ＨＣＣ８２７モデルでは腫瘍退縮をもたらし、１６日目のピークＴＧＩは１２０％及び試験終了時のＴＧＩは８４％であった（Ｐ＜０．０００１）。４Ｅ６細胞／回の投与レベルの凍結保存ＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ細胞の４週間にわたる週２回のＩＶ投与は、ＨＣＣ８２７腫瘍モデルで有意な治療効能をさらに示し、ピークＴＧＩは６０％（Ｐ＜０．０００１）及び試験終了のＴＧＩは４０％（Ｐ＜０．０１）に達した。２．５Ｅ６細胞／用量／腫瘍の投与レベルの新たに調製されたＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ細胞の４週間にわたる週２回のＩＴ投与は、ＨＣＣ８２７腫瘍の成長を効果的に抑制し、２０日目に７０％のピークＴＧＩ及び試験終了時に４９％（ｐ＜０．００１）のＴＧＩをもたらした。

【0140】

新たに調製されたＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ細胞のＩＶ投与（１Ｅ７細胞／回）を受けた動物で顕著な有害反応が観測された。新たに調製されたＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ細胞とは対照的に、凍結保存細胞（より低レベルの４Ｅ６細胞／回で投与した）は、ＩＶ投与後、動物に安全であることが分かった。ＰＤ−Ｌ１ｔ−ｈａＮＫ細胞は、２つの皮下腫瘍モデルで顕著な効能を実証した。より低い４Ｅ６細胞／回レベルで投与された凍結保存細胞はまた、腫瘍成長抑制に有意な効能を示し、動物に安全であることが分かった。

【0141】

当然ながら、本明細書に提供されるすべての核酸配列に対して、対応するコードタンパク質も明示的に本明細書で企図されることを認識すべきである。同様に、すべてのアミノ酸配列に対して、対応する核酸配列も本明細書で企図される（いずれかのコドン使用頻度で）。

【0142】

本明細書に引用される特許出願、刊行物、参照文献、及び配列アクセッション番号はすべて、その全体が本願をもって参照により組み込まれる。

【0143】

とくに定義がない限り、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。

【0144】

本明細書及び以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるものとするいくつかの用語を参照する。

【0145】

本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、本発明を限定することを意図したものではない。本明細書で用いられる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、とくに文脈上明確に示されてない限り、複数形も含むことが意図される。

【0146】

本明細書に記載の数値（たとえば、範囲を含めてｐＨ、温度、時間、濃度、量、及び分子量）はすべて、当業者が遭遇する測定値の通常の変動を含むものと理解される。そのため、本明細書に記載の数値は、±０．１〜１０％、たとえば、±０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の変動を含む。必ずしも明記されるわけではないが、数値表示はすべて、「約」という用語が先行しうることを理解すべきである。そのため、約という用語は、その数値の±０．１〜１０％、たとえば、±０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の変動を含む。また、必ずしも明記されるわけではないが、本明細書に記載の試薬は、単に模範的なものにすぎず、かかる等価物は当技術分野で公知であるものと理解すべきである。

【0147】

当業者であれば理解されるであろうが、あらゆる目的で、とくに記載の説明の提供に関連して、本明細書に開示された範囲はすべて、範囲の端点を含むとともに、範囲の端点間のすべての値を含む。また、本明細書に開示される範囲はすべて、いずれの可能な部分範囲及びその部分範囲の組合せもすべて包含する。いずれの列挙された範囲も、十分に記述されてその範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などされうるものとして容易に認識可能である。たとえば、限定されるものではないが、本明細書で考察される各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１に容易に分解可能である。当業者であれば同様に理解されるであろうが、「〜まで」、「少なくとも〜」などの表現はすべて、列挙された数を含み、以上で考察したように後続的に部分範囲に分解可能な範囲を意味する。最終的に、当業者であれば理解されるであろうが、範囲は各個別のメンバーを含む。そのため、たとえば、１〜３細胞を有する群は、１、２、又は３細胞を有する群を意味する。同様に、１〜５細胞を有する群は、１、２、３、４、又は５細胞を有する群を意味し、他も同様である。

【0148】

また、必ずしも明記されるわけではないが、本明細書に記載の試薬は、単に模範的なものにすぎず、かかる等価物は当技術分野で公知であるものと理解すべきである。

【0149】

「任意選択的な」又は「任意選択的に」とは、続いて記載される事象又は状況が発生可能又は発生不能でありその記載がその事象又は状況が発生する場合と発生しない場合とを含むことを意味する。

【0150】

「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という用語は、組成物及び方法が、列挙された要素を含むが、他を除外しないことを意味することが意図される。組成物及び方法の定義に用いられるときの「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（〜から本質的になる）」とは、組合せに本質的に有意な他の要素を除外することを意味するものとする。たとえば、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求された本発明の基本的且つ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない他の要素を除外しないであろう。「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（〜からなる）」とは、列挙された以外の痕跡量超の他の成分及び実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行句の各々により規定される実施形態は、本開示の範囲内にある。

【0151】

本明細書で用いられる場合、「免疫療法」とは、単独又は組合せにかかわらず標的細胞に接触したときに細胞傷害性を誘導しうる改変又は非改変のＮＫ−９２細胞、天然に存在する又は改変されたＮＫ細胞又はＴ細胞の使用を意味する。

【0152】

本明細書で用いられる場合、「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」とは、特異的抗原刺激の不在下で且つ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスによる制約を受けずに標的細胞を死滅させる免疫系の細胞のことである。標的細胞は、腫瘍細胞又はウイルス保有細胞でありうる。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の存在及びＣＤ３表面マーカーの不在により特徴付けられる。

【0153】

「内因性ＮＫ細胞」という用語は、ＮＫ−９２細胞系から識別される、ドナー（又は患者）に由来するＮＫ細胞を意味するものとして用いられる。内因性ＮＫ細胞は、一般に、ＮＫ細胞が富化された不均一細胞集団である。内因性ＮＫ細胞は、患者の自家又は同種治療が意図されうる。

【0154】

「ＮＫ−９２」という用語は、Ｇｏｎｇら（１９９４）に記載のきわめて強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を意味し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔが所有する（これ以降では「ＮＫ−９２（商標）細胞」）。不死ＮＫ細胞系は、元々は非ホジキンリンパ腫を有する患者から得られた。とくに指定がない限り、「ＮＫ−９２（商標）」という用語は、元のＮＫ−９２細胞系さらには改変されたＮＫ−９２細胞系（たとえば、外因性遺伝子の導入により）を意味することが意図される。ＮＫ−９２（商標）細胞及びそれらの模範的且つ非限定的改変体は、米国特許第７，６１８，８１７号明細書、同第８，０３４，３３２号明細書、同第８，３１３，９４３号明細書、同第９，１８１，３２２号明細書、同第９，１５０，６３６号明細書、及び米国出願第１０／００８，９５５号明細書（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、たとえば、野生型ＮＫ−９２（商標）、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６−γ、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６−ζ、ＮＫ−９２（商標）−ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ）、ＮＫ−９２（商標）ＭＩ、及びＮＫ−９２（商標）ＣＩが挙げられる。ＮＫ−９２細胞は当業者に公知であり、かかる細胞はＮａｎｔＫｗｅｓｔ，Ｉｎｃ．から容易に入手可能である。

【0155】

「ａＮＫ」という用語は、Ｇｏｎｇら（１９９４）に記載のきわめて強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を意味し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔが所有する（これ以降では「ａＮＫ（商標）細胞」）。「ｈａＮＫ」という用語は、Ｇｏｎｇら（１９９４）に記載のきわめて強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を意味し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔが所有し、細胞表面上にＣＤ１６を発現するように改変されている（これ以降では「ＣＤ１６＋ＮＫ−９２（商標）細胞」又は「ｈａＮＫ（登録商標）細胞」）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６＋ＮＫ−９２（商標）細胞は、細胞表面上に高親和性ＣＤ１６レセプターを含む。「ｔａＮＫ」という用語は、Ｇｏｎｇら（１９９４）に記載のきわめて強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を意味し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔが所有し、キメラ抗原レセプターを発現するように改変されている（これ以降では「ＣＡＲ改変ＮＫ−９２（商標）細胞」又は「ｔａＮＫ（登録商標）細胞」）。「ｔ−ｈａＮＫ」という用語は、Ｇｏｎｇら（１９９４）に記載のきわめて強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を意味し、その権利はＮａｎｔｋＷｅｓｔが所有し、細胞表面上にＣＤ１６を発現するように且つキメラ抗原レセプターを発現するように改変されている（これ以降では「ＣＡＲ改変ＣＤ１６＋ＮＫ−９２（商標）細胞」又は「ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞」）。いくつかの実施形態では、ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、細胞表面上に高親和性ＣＤ１６レセプターを発現する。

【0156】

「改変ＮＫ−９２細胞」とは、外因性遺伝子又はタンパク質、たとえば、Ｆｃレセプター、ＣＡＲ、サイトカイン（たとえばＩＬ−２若しくはＩＬ−１５）、及び／又は自殺遺伝子を発現するＮＫ−９２細胞を意味する。いくつかの実施形態では、改変ＮＫ−９２細胞は、Ｆｃレセプター、ＣＡＲ、サイトカイン（たとえばＩＬ−２若しくはＩＬ−１５）、及び／又は自殺遺伝子などのトランスジーンをコードするベクターを含む。一実施形態では、改変ＮＫ−９２細胞は、少なくとも１つトランスジェニックタンパク質を発現する。

【0157】

本明細書で用いられる場合、「非照射ＮＫ−９２細胞」とは、照射されていないＮＫ−９２細胞のことである。照射は、細胞を成長不能及び増殖不能にする。最適な活性を保持するために照射と注入との間の時間を４時間以下にすべきであるので、ＮＫ−９２細胞は、患者の治療前に治療施設で又はどこか他の地点で照射されるであろうと想定される。代替的に、ＮＫ−９２細胞は、他の機序により増殖を防止しうる。

【0158】

本明細書で用いられる場合、ＮＫ−９２細胞の「不活性化」とは、それを成長不能にすることである。不活性化はまた、ＮＫ−９２細胞の死を意味しうる。ＮＫ−９２細胞は、治療適用で病理診断に関連する細胞のｅｘ ｖｉｖｏサンプルを効果的にパージした後、又は生体内に存在する多くの又はすべての標的細胞を効果的に死滅させるのに十分な時間で哺乳動物の体内に存在した後、不活性化しうると想定される。不活性化は、ＮＫ−９２細胞が感受性である不活性化剤を投与することによりに誘発しうるが、これらに限定されるものではない。

【0159】

本明細書で用いられる場合、「細胞傷害性」及び「細胞溶解性」という用語は、ＮＫ−９２細胞などのエフェクター細胞の活性を記述するために用いられるとき、同義であることが意図される。一般的には、細胞傷害活性とは、さまざまな生物学的、生化学的、又は生物物理学的機序のいずれかにより標的細胞を死滅させることを意味する。細胞溶解とは、より具体的には、エフェクターが標的細胞の形質膜を溶解してその物理的完全性を破壊する活性を意味する。この結果、標的細胞の死滅を生じる。理論により拘束されることを望むものではないが、ＮＫ−９２細胞の細胞傷害作用は、細胞溶解に起因するものと考えられる。

【0160】

細胞／細胞集団に対する「死滅」という用語は、その細胞／細胞集団の死をもたらし得るいずれのタイプの操作も含むことを指す。

【0161】

「Ｆｃレセプター」という用語は、Ｆｃ領域として知られる抗体の一部に結合することにより免疫細胞の保護機能に寄与するある特定の細胞（たとえばナチュラルキラー細胞）の表面上に見いだされるタンパク質を意味する。細胞のＦｃレセプター（ＦｃＲ）への抗体のＦｃ領域の結合は、抗体媒介食作用又は抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して細胞の食細胞活性又は細胞傷害活性を刺激する。ＦｃＲは、それらが認識する抗体のタイプに基づいて分類される。たとえば、Ｆｃγレセプター（ＦＣγＲ）は、抗体のＩｇＧクラスに結合する。ＦＣγＲＩＩＩ−Ａ（ＣＤ１６とも呼ばれる、配列番号３４）は、ＩｇＧ抗体に結合してＡＤＣＣを活性化する低親和性Ｆｃレセプターである。ＦＣγＲＩＩＩ−Ａは、典型的にはＮＫ細胞に見いだされる。ＮＫ−９２細胞は、ＦＣγＲＩＩＩ−Ａを発現しない。Ｆｃイプシロンレセプター（ＦｃεＲ）は、ＩｇＥ抗体のＦｃ領域に結合する。

【0162】

本明細書で用いられる場合、「キメラ抗原レセプター」（ＣＡＲ）という用語は、細胞内シグナリングドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを意味する。ＣＡＲは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞で発現されて細胞傷害性を増加させうる。一般的には、細胞外抗原結合ドメインは、対象の細胞に見いだされる抗原に特異的なｓｃＦｖである。ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞は、ｓｃＦｖドメインの特異性に基づいて、ある特定の抗原を細胞表面上に発現する細胞を標的とする。ｓｃＦｖドメインは、腫瘍特異的抗原及びウイルス特異的抗原をはじめとするいずれかの抗原を認識するように工学操作可能である。たとえば、ＣＤ１９ＣＡＲは、いくつかの癌により発現される細胞表面マーカーＣＤ１９を認識する。

【0163】

本明細書で用いられる「腫瘍特異的抗原」という用語は、癌細胞又は新生物細胞には存在するが癌細胞と同一の組織又は系統に由来する正常細胞では検出不能な抗原を意味する。本明細書で用いられる腫瘍特異的抗原はまた、腫瘍関連抗原、すなわち、癌細胞と同一の組織又は系統に由来する正常細胞と比較してより高レベルで癌細胞に発現される抗原を意味する。

【0164】

本明細書で用いられる「ウイルス特異的抗原」という用語は、ウイルス感染細胞には存在するがウイルス感染細胞と同一の組織又は系統に由来する正常細胞では検出不能な抗原を意味する。一実施形態では、ウイルス特異的抗原は、感染細胞の表面上に発現されるウイルスタンパク質である。

【0165】

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらのアナログのどれかの任意の長さのポリマー形のヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、いずれかの３次元構造を有しうるとともに、いずれかの既知又は未知の機能を発揮しうる。ポリヌクレオチドの例としては、限定されるものではないが、次のもの、すなわち、遺伝子又は遺伝子断片（たとえば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドやヌクレオチドアナログなどの改変ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリー前又はアセンブリー後に付与可能である。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分が介在可能である。ポリヌクレオチドは、標識成分のコンジュゲーションなどにより重合後にさらに改変可能である。この用語はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を意味する。とくに明記されていない限り又は必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明のいずれの実施形態も、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られている又は予測される２つの相補的部分の一本鎖形態の各々と、の両方を包含する。

【0166】

ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ポリヌクレオチドがＲＮＡであるときはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特異的配列で構成される。そのため、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。

【0167】

「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を意味する。相同性は、比較を目的としてアライメントしうる各配列中の位置を比較するにより決定可能である。比較される配列の位置が同一塩基又はアミノ酸により占領されるとき、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有されるマッチ位置又は相同位置の数の関数である。

【0168】

本明細書で用いられる場合、「パーセント同一性」とは、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列同一性を意味する。パーセント同一性は、比較を目的としてアライメントしうる各配列の位置を比較するにより決定可能である。比較された配列の位置が同一塩基又はアミノ酸により占領されるとき、分子はその位置で同一である。相同ヌクレオチド配列は、本明細書に示されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体及び突然変異をコードする配列を含む。相同ヌクレオチド配列は、ヒト以外の哺乳動物種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。相同アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含有する並びにポリペプチドが同一結合及び／又は活性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、相同アミノ酸配列は、１５以下、１０以下、５以下、又は３以下の保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、本明細書に記載の配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、若しくは少なくとも８５％、又はそれを超えるパーセント同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、本明細書に記載の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。パーセント同一性は、たとえば、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を用いるＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）によりデフォルト設定を用いて決定可能である。パーセント配列同一性の決定に好適なアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられ、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２，１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介してパブリックに利用可能である（インターネットのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３及び期待値（Ｅ）１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照されたい）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして用いる。

【0169】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、特定種における発現に対してコドン最適化され、たとえば、マウス配列は、ヒトにおける発現にコドン最適化可能である（コドン最適化核酸配列によりコードされるタンパク質の発現）。そのため、いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸配列は、本明細書に記載の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、若しくは少なくとも８５％、又はそれを超えるパーセント同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸配列は、本明細書に記載の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。

【0170】

「発現する」という用語は、遺伝子産物（たとえばタンパク質）の生成を意味する。発現を参照するときの「一過性」という用語は、ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに導入されないことを意味する。発現を参照するときの「安定な」という用語は、ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに導入されるか又はトランスジーンの発現を維持するためにポジティブ選択マーカーが利用される（すなわち、ある特定の成長条件下で利益に与る細胞により発現される外因性遺伝子）ことを意味する。

【0171】

「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」又は「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）」という用語は、免疫系の細胞に影響を及ぼす生物学的分子の一般的クラスを意味する。模範的サイトカインとしては、限定されるものではないが、インターフェロン及びインターロイキン（ＩＬ）、とくにＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、及びＩＬ−２１が挙げられる。好ましい実施形態では、サイトカインはＩＬ−２である。

【0172】

本明細書で用いられる場合、「ベクター」という用語は、たとえばトランスフォーメーションのプロセスにより許容細胞内に配置されたときにベクターが複製されうるようにインタクトレプリコンを含む非染色体核酸を意味する。ベクターは、細菌などのある細胞タイプでは複製しうるが、哺乳動物細胞などの他の細胞では複製能力が制限されるか又はまったくない。ベクターは、ウイルス又は非ウイルスでありうる。核酸を送達するための模範的非ウイルスベクターとしては、ネイキッドＤＮＡ、単独又はカチオン性ポリマーとの組合せでカチオン性脂質と複合体化されたＤＮＡ、アニオン性及びカチオン性リポソーム、不均一ポリリシン、規定長オリゴペプチド、ポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーで縮合されたＤＮＡを含むＤＮＡ−タンパク質複合体及び粒子（いくつかの場合にはリポソームに含まれる）、並びにウイルスとポリリシン−ＤＮＡとを含む三元複合体の使用が挙げられる。一実施形態では、ベクターはウイルスベクター、たとえばアデノウイルスである。ウイルスベクターは当技術分野で周知である。

【0173】

本明細書で用いられる場合、タンパク質発現を参照するときの「標的化」という用語は、限定されるものではないが、細胞内又はその外部の適切な行き先にタンパク質又はポリペプチドを方向付けることを含むことが意図される。標的化は、典型的には、ポリペプチド鎖中のアミノ酸残基のストレッチであるシグナルペプチド又は標的化ペプチドを介して達成される。これらのシグナルペプチドは、ポリペプチド配列内のいずれかの位置に配置可能であるが、多くの場合、Ｎ末端に配置される。ポリペプチドはまた、Ｃ末端にシグナルペプチドを有するように工学操作可能である。シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞外セクション位置に向けて形質膜、ゴルジ、エンドソーム、小胞体、及び他の細胞区画に方向付けることが可能である。たとえば、Ｃ末端に特定アミノ酸配列（たとえばＫＤＥＬ）を有するポリペプチドは、ＥＲ管腔内に保持されるか又はＥＲ管腔に戻るように輸送される。

【0174】

本明細書で用いられる場合、腫瘍の標的化を参照するときの「標的化する」という用語は、ＮＫ−９２細胞が腫瘍細胞（すなわち標的細胞）を認識し死滅させる能力を意味する。これとの関連で「標的化された」という用語は、たとえば、ＮＫ−９２細胞により発現されたＣＡＲが腫瘍により発現された細胞表面抗原を認識し結合するに能力を意味する。

【0175】

本明細書で用いられる場合、「トランスフェクトする」という用語は、細胞への核酸の挿入を意味する。トランスフェクションは、細胞への核酸の進入を可能にするいずれかの手段を用いて実施しうる。ＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡは、細胞にトランスフェクトしうる。好ましくは、トランスフェクト細胞は、核酸によりコードされる遺伝子産物（すなわちタンパク質）を発現する。

【0176】

「自殺遺伝子」という用語は、トランスジーンを発現する細胞のネガティブ選択を可能にするトランスジーンを意味する。自殺遺伝子は、安全系として使用され、選択剤の導入により遺伝子を発現する細胞の死滅を可能にする。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子をはじめとするいくつかの自殺遺伝子系が同定されている（たとえば、Ｙａｚａｗａ Ｋ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｗ Ｅ，Ｂｒｕｎｉｃａｒｄｉ Ｆ Ｃ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｕｒｇ．２００２ Ｊｕｌｙ；２６（７）：７８３−９も参照されたい）。一実施形態では、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。ＴＫ遺伝子は、野生型又は突然変異ＴＫ遺伝子（たとえば、ｔｋ３０、ｔｋ７５、ｓｒ３９ｔｋ）でありうる。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを用いて死滅させうる。

【図1】

【図2A-2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【手続補正書】

【提出日】2021年1月21日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【国際調査報告】