特表 2021-525756 抗グロボＨ又は抗ＳＳＥＡ−４抗体を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と共に使用することによる組合せ療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-525756(P2021-525756A)

(43)【公表日】2021年9月27日

(54)【発明の名称】抗グロボＨ又は抗ＳＳＥＡ−４抗体を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と共に使用することによる組合せ療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20210830BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210830BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20210830BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20210830BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210830BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210830BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20210830BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   A61K39/395 D

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P43/00 121

   A61P43/00 111

   A61K38/02

   A61K31/713

   A61K48/00

   C07K16/28

   C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】155

(21)【出願番号】特願2020-566890(P2020-566890)

(86)(22)【出願日】2019年6月3日

(85)【翻訳文提出日】2021年1月27日

(86)【国際出願番号】US2019035168

(87)【国際公開番号】WO2019232519

(87)【国際公開日】20191205

(31)【優先権主張番号】62/679,510

(32)【優先日】2018年6月1日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516080655

【氏名又は名称】オービーアイ ファーマ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ユイ，チュヨン−ダー・トニー

(72)【発明者】

【氏名】ツァイ，イー−チーエン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ジョー−ファン

(72)【発明者】

【氏名】ライ，ジエン−シーン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084AA19

4C084BA03

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE03

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086NA05

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC41

4C086ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と組み合わせた、抗グロボ系列抗原（グロボＨ及びＳＳＥＡ−４）抗体による、がん患者の処置であって、阻害されたＴ細胞活性をレスキューする処置に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象へと、抗グロボ系列抗原抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と組み合わせて投与するステップを含む方法。

【請求項2】

グロボ系列抗原が、段階特異的胚抗原４（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）又はグロボＨ（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

免疫チェックポイント抗原分子が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗原、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＬＡＧ−３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ３）、ＴＩＧＩＴ（Ｔ−ｃｅｌｌ ＩｍｍｕｎｏＧｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎ）、Ｃｅａｃａｍ １（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）、ＬＡＩＲ−１（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）又はＴＩＭ−３（Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ−３）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

抗グロボ系列抗原抗体が、ＯＢＩ−８８８又はＯＢＩ−８９８である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

抗ネガティブ免疫チェックポイント剤が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体が、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）及び／又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

がんが、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆管がん、肝がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、胃がん、結腸がん、鼻咽頭がん、腎がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

１つの抗グロボ系列抗原抗体又はこの断片と、１つの抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体又はこの断片とを投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

抗グロボ系列抗体及び／又は少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤が、マウス抗体、組換え抗体、ヒト化抗体若しくは完全ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、特に、二特異性抗体又はこれらの断片から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤が、抗体、タンパク質、低分子及び／又はｓｉ−ＲＮＡである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

抗グロボ系列抗原抗体又はこの断片が、表１〜２に明示された配列番号１〜１０８を含むヒト化抗体又は表６〜９に明示された配列番号１０９〜１８２を含む抗ＳＳＥＡ４抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

免疫チェックポイント阻害剤が、請求項３に記載の抗原（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、Ｃｅａｃａｍ １、ＬＡＩＲ−１又はＴＩＭ−３）に結合する抗体又はこの断片である、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

抗グロボ系列抗原抗体又はこの断片と、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤とが、同時に、別個に、又は逐次的に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

抗ネガティブ免疫チェックポイントの遮断と組み合わせた、グロボ系列抗原のターゲティング（抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体による）が、協同的に、相加的に、及び／又は相乗的に作用して、Ｔ細胞の不活化をレスキューし、治療有効性を改善する、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

治療有効性が、Ｔ細胞の不活化のレスキューにより増強される、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

がんの増殖又は進行が、阻害され及び／又は減少する、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

腫瘍体積が、減少する、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

Ｔ細胞の不活化をレスキューするための方法であって、それを必要とする対象へと、抗グロボ系列抗原抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と組み合わせて投与するステップを含む方法。

【請求項20】

がんの増殖／進行を減少させ及び／又は阻害するための方法であって、それを必要とする対象へと、抗グロボ系列抗原抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と組み合わせて投与するステップを含む方法。

【請求項21】

抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体阻害剤が、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ）及び／又はＯｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）から選択される抗ＰＤ−１抗体と、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）及び／又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）から選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項22】

グロボ系列抗原が、段階特異的胚抗原４（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）又はグロボＨ（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）である、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項23】

抗グロボ系列抗原抗体が、ＯＢＩ−８８８又はＯＢＩ−８９８である、請求項１９又は２０に記載の方法。

【請求項24】

二重ネガティブ免疫チェックポイント分子ターゲティングを伴う医薬組成物であって、抗グロボ系列抗原抗体と、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体との組合せと；薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。

【請求項25】

２つ以上の免疫チェックポイント分子にさらに結合する、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗原、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＬＡＧ−３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ３）、ＴＩＧＩＴ（Ｔ−ｃｅｌｌ ＩｍｍｕｎｏＧｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎ）、Ｃｅａｃａｍ １（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）、ＬＡＩＲ−１（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）又はＴＩＭ−３（Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ−３）からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

グロボ系列抗原が、段階特異的胚抗原４（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）又はグロボＨ（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項28】

抗グロボ系列抗原抗体が、ＯＢＩ−８８８又はＯＢＩ−８９８である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項29】

抗グロボ系列抗原抗体又はこの断片が、表１〜２に明示された配列番号１〜１０８を含む抗グロボＨ抗体又は表６〜９に明示された配列番号１０９〜１８２を含む抗ＳＳＥＡ４抗体である、請求項２４に記載の方法。

【請求項30】

請求項２４に記載の医薬組成物と、その使用のための指示書とを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１日に出願された、米国特許出願第６２／６７９，５１０号の利益を主張する。

【0002】

本発明は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされた、抗グロボＨ炭水化抗体又は抗ＳＳＥＡ−４炭水化物抗体に関する。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされた、抗グロボＨ炭水化抗体又は抗ＳＳＥＡ−４炭水化物抗体を共投与して、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより誘導されたＴ細胞の不活化を、相乗的にレスキューすることの根拠についての結果が提示される。本開示は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされた、抗グロボＨ炭水化抗体又は抗ＳＳＥＡ−４炭水化物抗体を使用して、がんを処置するための方法を提示する。

【背景技術】

【0003】

悪性腫瘍細胞において、多数の表面炭水化物が発現される。例えば、炭水化物抗原である、グロボＨ（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）は、最初に、セラミド連結型糖脂質として単離され、１９８４年に、乳がんＭＣＦ−７細胞から同定された（Ｂｒｅｍｅｒ Ｅ Ｇら（１９８４）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５９：１４７７３〜１４７７７）。かつての研究により、グロボＨ及び段階特異的胚抗原３（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）（ＳＳＥＡ−３、また、Ｇｂ５とも呼ばれる、）が、乳がん細胞及び乳がん幹細胞において観察されたことも示された（ＷＷ Ｃｈａｎｇら（２００８）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０５（３３）：１１６６７〜１１６７２）。加えて、ＳＳＥＡ−４（段階特異的胚抗原４）（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）も、多能性のヒト胚性幹細胞についての細胞表面マーカーとして、一般に使用されており、間葉系幹細胞を単離し、神経前駆細胞をエンリッチするのに使用されている（Ｋａｎｎａｇｉ Ｒら（１９８３）、ＥＭＢＯ Ｊ、２：２３５５〜２３６１）。これらの知見は、グロボ系列の抗原（グロボＨ、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４）が、がん治療のための、固有の標的であり、治療剤を、標的がん細胞へと、効果的に方向付けるのに使用されうることを支援する。

【0004】

プログラム死１（ＰＤ−１）とは、Ｔ細胞上、Ｂ細胞上又は単球上において発現された、阻害性受容体である（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１１：３８８７〜２８９５；Ａｇａｔａら（１９９６）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：７６５〜７７２）。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞の活性化及びサイトカイン分泌を下方調節することが同定されている、ＰＤ−１に対するリガンドである（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９２：１０２７〜３４；Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２：２６１〜８）。ＰＤ−１の、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２とのエンゲージメントは、免疫応答の下方調節をもたらす。よって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断は、がんに対する、中枢性免疫応答及び末梢性免疫応答の下方調節を弱めることが提起されている。ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１による経路のターゲティングは、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、膀胱癌及びホジキンリンパ腫を含む、１５種類を超えるがんにおいて、臨床有効性を示している（Ｓｈａｒｍａら（２０１５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８（６２３０）：５６〜６１）。しかし、多くの患者は、依然として奏効せず、一部の患者は、初期応答を示したが、時間経過と共に、耐性を獲得する。したがって、組合せ療法に対する耐性機構を同定することが、火急に必要とされている。

【0005】

グロボＨセラミドは、腫瘍微小環境へとシェディングされることが同定されている。グロボＨセラミドの、免疫細胞による取込みは、細胞の増殖及びサイトカインの産生を阻害することが報告されたことから、グロボＨセラミドは、免疫による監視から逃避するための、免疫チェックポイントとして作用することが示唆される（ＹＣ Ｔｓａｉら（２０１３）、Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ Ｔｈｅｒ、５：２６４〜２７０）。Ｔ細胞の活性化を、負に調節する、広域スペクトルの共受容体、例えば、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ及びＴＩＭ３が、Ｔ細胞により発現されている（Ｓｌｅｄｚｉｎｓｋａら（２０１５）、Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１２月、９（１０）：１９３６〜６５）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｂｒｅｍｅｒ Ｅ Ｇら（１９８４）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５９：１４７７３〜１４７７７

【非特許文献2】ＷＷ Ｃｈａｎｇら（２００８）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０５（３３）： １１６６７〜１１６７２

【非特許文献3】Ｋａｎｎａｇｉ Ｒら（１９８３）、ＥＭＢＯ Ｊ、２：２３５５〜２３６１

【非特許文献4】Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１１：３８８７〜２８９５

【非特許文献5】Ａｇａｔａら（１９９６）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：７６５〜７７２

【非特許文献6】Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９２：１０２７〜３４

【非特許文献7】Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２：２６１〜８

【非特許文献8】Ｓｈａｒｍａら（２０１５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８（６２３０）：５６〜６１

【非特許文献9】ＹＣ Ｔｓａｉら（２０１３）、Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ Ｔｈｅｒ、５：２６４〜２７０

【非特許文献10】Ｓｌｅｄｚｉｎｓｋａら（２０１５）、Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１２月、９（１０）：１９３６〜６５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

（発明の要旨）
したがって、ネガティブ免疫チェックポイントの遮断と組み合わされた、抗グロボＨ抗体によるグロボＨセラミドの枯渇は、免疫抑制の克服において、効果的でありうる。本発明者らの知見は、ネガティブ免疫チェックポイントの遮断を伴う、グロボ系列抗原（グロボＨ又はＳＳＥＡ−４による）のターゲティングが、Ｔ細胞の不活化をレスキューするように、協同的に作用することを支援する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

したがって、本発明の第１の実施形態は、抗グロボＨ抗体及び／若しくは抗ＳＳＥＡ−４抗体又はこれらの断片、並びに少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む組合せに関する。ある特定の具体的な実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体である。

【0009】

好ましい実施形態において、本発明の組合せは、１つの抗グロボＨ抗体及び／若しくは抗ＳＳＥＡ−４抗体又はこれらの断片、並びに１つの抗ＰＤ−１抗体又はこの断片とを含む。

【0010】

好ましくは、グロボＨ抗体又はＳＳＥＡ−４抗体による組合せ療法に適する前記抗体は、Ｋｅｙｔｒｕｄａ及び／又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑから選択される。

【0011】

１つの非限定的な実施形態において、Ｋｅｙｔｒｕｄａ及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑは、

【0012】

【表1】

から供給される。

【0013】

本発明の目的のために、抗体は、好ましくは、マウス抗体、組換え抗体、ヒト化抗体若しくは完全ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、特に、二特異性抗体又はこれらの断片からなる群から選択される。

【0014】

さらなる実施形態において、抗グロボＨ又は抗ＳＳＥＡ−４抗体又はこの断片、及び少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤である、本発明の組合せの有効成分は、同時に投与される場合もあり、別個に投与される場合もあり、逐次的に投与される場合もあり、また、各有効成分について、異なる投与経路に従い投与される場合もある。

【0015】

本発明のさらなる実施形態に従い、組合せの有効成分は、同じ投与経路又は異なる投与経路を介して、併せて投与される場合もあり、同じ投与経路又は異なる投与経路を介して、別個に投与される場合もある。

【0016】

本発明の好ましい態様において、抗グロボＨ又は抗ＳＳＥＡ−４抗体又はこの断片が、注射用形態、経口形態、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、顆粒及び油性カプセルの形態において製剤化されうるのに対し、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、例えば水性緩衝液又は油性懸濁液など、非経口的に製剤化される。

【0017】

本発明の好ましい実施形態に従い、抗グロボＨ抗体若しくはＳＳＥＡ−４抗体又はこの断片を含有する製剤が、毎週１回又は毎週数回投与されるのに対し、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含有する製剤は、非経口経路を介して、好ましくは、毎週１回〜毎週数回にわたり投与される。

【0018】

したがって、本開示は、がん上のグロボ系列抗原が、微小環境へとシェディングされ、Ｔ細胞へと組み込まれるという発見に基づく。Ｔ細胞の活性化は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの組込みの後において阻害された。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの、Ｔ細胞への組込みを阻害するための、抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体の添加は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドにより誘導される免疫抑制を阻害しうる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントは、ＴＣＲによるシグナル伝達経路を抑制した。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの、Ｔ細胞への添加は、ＴＣＲによるシグナル伝達をさらに阻害する。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの組込みは、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントによる抑制（すなわち、免疫チェックポイント作用）を遮断する結果である、ＴＣＲによるシグナル伝達の波及効果を低減した。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を伴う、抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体の添加は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより抑制された、ＴＣＲによるシグナル伝達を相乗的に反転させる。グロボＨ抗原又はＳＳＥＡ−４抗原を発現するがんは、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、神経膠芽腫、肺がん、乳がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、膀胱がん、膵がん、腸がん、結腸直腸がん、腎がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、精巣がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、口腔咽頭がん、喉頭がん及び前立腺がんを含むがこれらに限定されない。

【0019】

一態様において、本開示は、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象へと、抗グロボ系列抗原抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と組み合わせて投与するステップを含む方法を提示する。

【0020】

一実施形態において、グロボ系列抗原は、段階特異的胚抗原４（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）、段階特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ−３；Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）又はグロボＨ（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）である。

【0021】

一実施形態において、免疫チェックポイント抗原分子は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗原、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＬＡＧ−３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ３）、ＴＩＧＩＴ（Ｔ−ｃｅｌｌ ＩｍｍｕｎｏＧｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎ）、Ｃｅａｃａｍ １（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）、ＬＡＩＲ−１（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）又はＴＩＭ−３（Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ−３）からなる群から選択される。

【0022】

一実施形態において、抗グロボ系列抗原抗体は、ＯＢＩ−８８８又はＯＢＩ−８９８である。

【0023】

一実施形態において、抗ネガティブ免疫チェックポイント剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストである。

【0024】

一実施形態において、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）及び／又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）である。

【0025】

一実施形態において、がんは、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆管がん、肝がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、胃がん、結腸がん、鼻咽頭がん、腎がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍からなる群から選択される。

【0026】

一実施形態において、方法は、１つの抗グロボ系列抗原抗体又はこの断片と、１つの抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体又はこの断片とを投与するステップを含む。

【0027】

一実施形態において、抗グロボ系列抗原抗体及び／又は少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、マウス抗体、組換え抗体、ヒト化抗体若しくは完全ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、特に、二特異性抗体又はこれらのから選択されるモノクローナル抗体である。

【0028】

一実施形態において、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、タンパク質、低分子及び／又はｓｉ−ＲＮＡである。

【0029】

一実施形態において、抗グロボ系列抗原抗体又はこの断片は、表１〜２に明示された配列番号１〜１０８を含む抗グロボＨ抗体、又は表６〜９に明示された配列番号１０９〜１８２を含む抗ＳＳＥＡ４抗体である。

【0030】

一実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗原（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、Ｃｅａｃａｍ １、ＬＡＩＲ−１又はＴＩＭ−３）に結合する抗体又はこれらの断片である。

【0031】

一実施形態において、抗グロボ系列抗原抗体又はこの断片と、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤とは、同時に、別個に、又は逐次的に投与される。

【0032】

一実施形態において、対象は、ヒトである。

【0033】

一実施形態において、ネガティブ免疫チェックポイントの遮断と組み合わせた、グロボ系列抗原のターゲティング（グロボＨ又はＳＳＥＡ−４による）は、協同的に、相加的に、及び／又は相乗的に作用して、Ｔ細胞の不活化をレスキューし、治療有効性を改善する。

【0034】

一実施形態において、治療有効性は、Ｔ細胞の不活化のレスキューにより増強される。

【0035】

一実施形態において、がんの増殖又は進行は、阻害され及び／又は減少する。

【0036】

一実施形態において、腫瘍体積が、減少する。

【0037】

一態様において、本開示は、Ｔ細胞の不活化をレスキューするための方法であって、それを必要とする対象へと、抗グロボ系列抗原抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と組み合わせて投与するステップを含む方法を提示する。

【0038】

一態様において、本開示は、がんの増殖／進行を減少させ及び／又は阻害するための方法であって、それを必要とする対象へと、抗グロボ系列抗原抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体と組み合わせて投与するステップを含む方法を提示する。

【0039】

一実施形態において、前記抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体は、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ）及び／又はＯｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）から選択される抗ＰＤ−１抗体、並びにＢａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）及び／又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）から選択される前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。

【0040】

一態様において、本開示は、抗グロボ系列抗原抗体及び抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提示する。

【0041】

一態様において、本開示は、医薬組成物と、その使用のための指示書とを含むキットを提示する。

【0042】

本発明についての、より完全な理解は、付属の図面の参照により、後続の詳述な記載と共に検討される場合に得られうる。図面において例示される実施形態は、本発明を例示することだけが意図されるものであり、本発明を、例示された実施形態へと限定するものと解釈されるべきでない。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】多様ながん細胞から、ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞への、グロボＨ又はＳＳＥＡ−４のシェディングを示す図である。

【図2】グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドによる、Ｔ細胞活性化の抑制を示す図である。

【図3】抗グロボＨ抗体による、グロボＨセラミドにより誘導されたＴ細胞不活化の反転を示す図である。

【図4】抗ＳＳＥＡ−４抗体による、ＳＳＥＡ−４セラミドにより誘導されたＴ細胞不活化の反転を示す図である。

【図5】ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントに伴い、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドが、ＴＣＲによるシグナル伝達に対する阻害を増強したことを示す図である。

【図6】グロボＨセラミドにより阻害されたＴＣＲによるシグナル伝達の、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントを、低減したＫｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑが解放すること示す図である。

【図7】ＳＳＥＡ−４セラミドにより阻害されたＴＣＲによるシグナル伝達の、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントを、低減したＫｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑが解放すること示す図である。

【図8】グロボＨセラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害されたＴＣＲによるシグナル伝達の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑと組み合わされた、抗グロボＨ抗体による解放を示す図である。

【図9】ＳＳＥＡ−４セラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害されたＴＣＲによるシグナル伝達の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑと組み合わされた、抗ＳＳＥＡ−４抗体による解放を示す図である。

【図10】ネガティブ免疫チェックポイントのエンゲージメントを伴い、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドがＴ細胞活性を抑制する作用機構についての概略を示す図である。

【図11】抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体を伴う抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体が、Ｔ細胞活性をレスキューする作用機構についての概略を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本開示は、がん患者を処置するための、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされた、抗グロボＨ抗原抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗原抗体に関する。

【0045】

したがって、本開示は、がん上のグロボ系列抗原が、微小環境へとシェディングされ、Ｔ細胞へと組み込まれるという発見に基づく。Ｔ細胞の活性化は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの組込みの後において阻害された。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの、Ｔ細胞への組込みを阻害するための、抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体の添加は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドにより誘導される免疫抑制を阻害しうる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントは、ＴＣＲによるシグナル伝達経路を抑制した。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの、Ｔ細胞への添加は、ＴＣＲによるシグナル伝達をさらに阻害する。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの組込みは、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントによる抑制（すなわち、免疫チェックポイント作用）を遮断する結果である、ＴＣＲによるシグナル伝達の波及効果を低減した。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を伴う、抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体の添加は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより抑制された、ＴＣＲによるシグナル伝達を相乗的に反転させる。グロボＨ抗原又はＳＳＥＡ−４抗原を発現するがんは、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、神経膠芽腫、肺がん、乳がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、膀胱がん、膵がん、腸がん、結腸直腸がん、腎がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、精巣がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、口腔咽頭がん、喉頭がん及び前立腺がんを含むがこれらに限定されない。

【0046】

＜定義＞
本明細書において使用された「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することが可能な、任意の物質として規定される。

【0047】

本明細書において使用された「免疫原性」という用語は、免疫原、抗原又はワクチンが、免疫応答を刺激する能力を指す。

【0048】

本明細書において使用された「エピトープ」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体の抗原結合性部位に接触する、抗原分子の部分として規定される。

【0049】

本明細書において使用された、「ワクチン」という用語は、全病原生物（死滅させられた、又は弱毒化された）又はこのような生物の構成要素であって、それら生物が引き起こす疾患に対する免疫を付与するのに使用される、タンパク質、ペプチド又は多糖などの構成要素からなる抗原を含有する調製物を指す。ワクチン調製物は、天然調製物、合成調製物又は組換えにより由来する調製物のうちのいずれか１つを含みうる、又は除外しうる。組換えにより由来する調製物は、例えば、組換えＤＮＡ技術により得られうる。

【0050】

本明細書において使用された「抗原特異的」という用語は、特定の抗原又は抗原の断片の供給が、特異的な細胞増殖を結果としてもたらすような、細胞集団の特性を指す。

【0051】

本明細書において使用された、「ＣＤ１ｄ」という用語は、多様なヒト抗原提示細胞の表面上に発現された糖タンパク質の、ＣＤ１（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）ファミリーのメンバーを指す。ＣＤ１ｄが提示された脂質抗原は、ナチュラルキラーＴ細胞を活性化させる。ＣＤ１ｄは、糖脂質抗原が結合する、深い抗原結合溝を有する。樹状細胞上に発現されたＣＤ１ｄ分子は、Ｃ３４などのＧａｌＣｅｒ類似体を含む糖脂質に結合し、これらを提示しうる。

【0052】

本明細書において使用された、「グリカン」という用語は、多糖又はオリゴ糖を指す。本明細書において、グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖又はプロテオグリカンなど、複合糖質の炭水化物部分を指すのにも使用される。グリカンは通例、単糖間のＯ−グリコシド連結だけからなる。例えば、セルロースとは、β−１，４連結されたＤ−グルコースから構成されるグリカン（又は、より詳細に、グルカン）であり、キチンとは、β−１，４連結されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーの場合もあり、ヘテロポリマーの場合もあり、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もある。グリカンは、糖タンパク質及びプロテオグリカンにおける場合と同様に、タンパク質に接合されて見出される場合もある。グリカンは、一般に、細胞の外部表面において見出される。Ｏ結合型グリカン及びＮ結合型グリカンは、真核生物において、極めて一般的であるが、また、原核生物においても、それほど一般的でないが、見出されうる。Ｎ結合型グリカンは、シークォンにおけるアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に接合されて見出される。シークォンとは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ配列又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列［配列中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である］である。

【0053】

本明細書において使用された「〜に特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体及び抗原）の間の相互作用を指す。多様な場合において、「〜に特異的に結合すること」は、１リットル当たり約１０^−６モル、１リットル当たり約１０^−７モル若しくは１リットル当たり約１０^−８モル又はこれ未満のアフィニティー定数により実現されうる。

【0054】

本明細書において使用された、「フローサイトメトリー」又は「ＦＡＣＳ」という用語は、流体の流れの中に懸濁された粒子又は細胞の物理的特性及び化学的特性を、光学的検出デバイス及び電子的検出デバイスを介して検討するための技法を意味する。

【0055】

本明細書において使用された、糖酵素という用語は、少なくとも、部分的に、グロボ系列の生合成経路内の酵素を指し；例示的な糖酵素は、アルファ−４ＧａｌＴ酵素；ベータ−４ＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ酵素又はベータ−３ＧａｌＴ−Ｖ酵素を含む。

【0056】

「単離」抗体とは、その天然環境の構成要素から同定及び分離並びに／又は回収された抗体である。この天然環境の夾雑構成要素は、抗体の研究的使用、診断的使用又は治療的使用に干渉する材料であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性溶質又は非タンパク質性溶質を含みうる。一実施形態において、抗体は、（１）例えば、ローリー法により決定される通り、抗体の重量により、９５％超まで精製され、一部の実施形態において、重量により、９９％超まで精製され、（２）例えば、スピニングカップ型シークェネーターを使用することにより、Ｎ末端のアミノ酸配列若しくは内部アミノ酸配列のうちの、少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製される、又は（３）例えば、クーマシーブルー若しくは銀染色を使用して、還元条件下若しくは非還元条件下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均質になるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離抗体は、組換え細胞内の抗体をインサイチューで含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。

【0057】

本明細書により、互換的に使用された、「支持体」又は「基質」という用語は、１つ以上の分子が、直接的に、又は間接的に、結合された、接合された、合成された、連結された、又は他の形で会合させられた、１つ以上の構成要素を含む、材料又は材料の群を指す。支持体は、生物学的材料、非生物学的材料、無機材料、有機材料又はこれらの組合せから構築されうる。支持体は、特定の実施形態内の、その使用に基づき、任意の適切なサイズ又は立体配置でありうる。

【0058】

本明細書で使用された、「標的」という用語は、アッセイ内の、目的の種を指す。標的は、天然に存在する場合もあり、合成の場合もあり、これらの組合せ場合もある。標的は、変更されていない（例えば、生物内において、又はこの試料中において、直接利用される）場合もあり、アッセイに適切な形で変更されている（例えば、精製、増幅、濾過されている）場合もある。標的は、適切な手段を介して、ある特定のアッセイ内の結合メンバーに結合されうる。標的の非限定例は、特異的な抗原決定基（ウイルス上、細胞上又は他の材料上の抗原決定基など）と反応性の、抗体又はこの断片、細胞膜受容体、モノクローナル抗体及び抗血清、薬物、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、糖、レクチン、多糖、細胞、細胞膜及び細胞小器官を含むがこれらに限定されない。標的は、アッセイに応じて、任意の適切なサイズでありうる。

【0059】

本明細書において使用された「実質的に同様な」、「実質的に同じ」、「同等な」、又は「実質的に同等な」という語句は、当業者が、２つの値の間の差違を、前記値（例えば、Ｋｄ値、抗ウイルス効果など）により測定される生物学的特徴の文脈内において、生物学的有意性及び／又は統計学的有意性をほとんど有さない、又は有さないと考えるほどに、２つの数値（例えば、分子と関連する、一方の数値及び参照／比較対照分子と関連する、他方の数値）の間の、十分に高度の類似性を表す。前記２つの値の間の差違は、例えば、参照／比較対照分子についての値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満及び／又は約１０％未満である。

【0060】

したがって、本発明の抗がん抗体は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域と組み合わされて、本発明の抗体へと組み込まれうる、非マウス由来、好ましくは、ヒト由来の、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域、フレームワーク領域又はこれらの任意の部分を含む。

【0061】

本発明の抗体は、インビトロにおいて、インサイチューにおいて、かつ／又はインビボにおいて活性である、少なくとも１つのグロボＨ及び／又はＳＳＥＡ−４を発現するがん細胞を、モジュレートする、減少させる、アンタゴナイズする、和らげる、緩和する、遮断する、阻害する、失効化させる、かつ／又はこれらに干渉することが可能である。

【0062】

本発明の抗体は、本明細書において記載された、２Ｃ２（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１１３８下において寄託された）と名指されたハイブリドーマ、３Ｄ７（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１３１０下において寄託された）と名指されたハイブリドーマ、７Ａ１１（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１３１１下において寄託された）と名指されたハイブリドーマ、２Ｆ８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１１３７下において寄託された）と名指されたハイブリドーマ又は１Ｅ１（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１３１２下において寄託された）と名指されたハイブリドーマにより産生された抗体に由来する、重鎖若しくは軽鎖の、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はこのリガンド結合性部分を含む、任意のタンパク質又はペプチドを含む。抗体は、抗体断片、抗体変異体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び組換え抗体などを含む。抗体は、マウスにおいて発生させる場合もあり、ウサギにおいて発生させる場合もあり、ヒトにおいて発生させる場合もある。

【0063】

「抗体」という用語は、抗体、消化断片、抗体模倣体を含む、又は各々が、本発明の抗がん抗体に由来する、少なくとも１つのＣＤＲを含有する、単鎖抗体及びこの断片を含む、抗がん抗体又は指定されたこの断片若しくは部分の構造及び／又は機能を模倣する、抗体の部分を含む、指定された部分及びこの変異体を包含することが、さらに意図される。

【0064】

例えば、機能的断片は、グロボＨを発現するがん細胞に結合する抗原結合性断片を含む。例えば、グロボＨ発現がん細胞又はこの部分に結合することが可能な抗体断片であって、Ｆａｂ断片（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’断片（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）及びＦ（ａｂ’）_２断片（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ断片（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’断片（例えば、ペプシン消化又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再凝集による）、Ｆｖ断片又はｓｃＦｖ断片（例えば、分子的生物学法による）を含むがこれらに限定されない抗体断片が、本発明により包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、前出を参照されたい。）。

【0065】

抗体の抗原結合性部分は、炭水化物抗原（例えば、グロボＨ、ＳＳＥＡ−４）に特異的に結合する、抗体の部分を含みうる。

【0066】

本発明のヒト化抗体は、抗体が、その元の結合能を保持しながら、ヒト抗体により近似するように、非抗原結合性領域（及び／又は抗原結合性領域）内のアミノ酸配列が変更された、非ヒト種に由来する抗体である。

【0067】

ヒト化抗体は、抗原への結合に、直接関与しない可変領域の配列を、ヒト可変領域に由来する同等な配列により置換えることにより作出されうる。これらの方法は、重鎖又は軽鎖のうちの少なくとも１つに由来する可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を、単離するステップと、これらを操作するステップと、これらを発現させるステップとを含む。このような核酸の供給源は、当業者に周知である。次いで、ヒト化抗体又はこの断片をコードする組換えＤＮＡが、適切な発現ベクターへとクローニングされうる。

【0068】

本発明のヒト化抗体は、当技術分野において周知の方法により作製されうる。例えば、非ヒト（例えば、マウス）抗体が得られたら、可変領域がシーケンシングされ、ＣＤＲ残基及びフレームワーク残基の位置が決定される（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７）。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡは、任意選択的に、対応する定常領域へとライゲーションされる場合があり、次いで、適切な発現ベクターへとサブクローニングされうる。ＣＤＲグラフト抗体分子は、ＣＤＲグラフティングにより作製される場合もあり、ＣＤＲ置換により作製される場合もある。免疫グロブリン鎖の、１つ、２つ、又は全てのＣＤＲが置換えられうる。例えば、特定の抗体のＣＤＲの全てが、非ヒト動物（例えば、マウスなど）ＣＤＲの、少なくとも一部に由来する場合もあり、ＣＤＲのうちの一部だけが、置換えられる場合もある。抗体の、所定の炭水化物抗原（例えば、グロボＨ）への結合に要求されたＣＤＲを保持することだけが必要である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４；米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；同第５，６９３，７６１号及び同第５，６９３，７６２号；ＥＰ５１９５９６；Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：４０５３〜４０６０）。

【0069】

本明細書で開示された、１つ又は２つの可変領域を、ヒト、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、両生類、爬虫類及び他の動物を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの、異なる種に由来する配列により置換えられた、他の領域と共に含む、抗体又はこの抗原結合性部分もまた、本発明により包含される。

【0070】

キメラ抗体は、異なる部分が、異なる動物種に由来する分子である。例えば、抗体は、マウスｍＡｂに由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを含有しうる。キメラ抗体は、組換えＤＮＡ法により作製されうる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。例えば、マウス（又は他の種）の抗体分子をコードする遺伝子を、制限酵素により消化し、マウスＦｃをコードする領域を除去する。次いで、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等な部分が、組換えＤＮＡ分子へと代入される。キメラ抗体はまた、マウスＶ領域をコードするＤＮＡが、ヒト定常領域をコードするＤＮＡへとライゲーションされうる、組換えＤＮＡ法によっても創出されうる（Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ、１９８７８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８７、１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら、ＰＮＡＳ、１９８７、８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、１９８７、４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５、３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、１９８８、８０：１５５３〜１５５９；国際特許公開第ＷＯ１９８７００２６７１号及び同第ＷＯ８６号／０１５３３；欧州特許出願第１８４，１８７号；同第１７１，４９６号；同第１２５，０２３号及び同第１７３，４９４号；米国特許第４，８１６，５６７号）。

【0071】

例えば、抗体は、全長の場合もあり、抗体断片から形成された、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ−ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６（１９８９））、単離ＣＤＲ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子及び多特異性抗体を含むがこれらに限定されない、抗原結合性部分を有する、抗体の１つの断片（又は複数の断片）を含む場合もある。組換え法又は合成リンカーを使用して、抗体断片を接続することにより作製された単鎖抗体もまた、本発明により包含される（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８、８５：５８７９〜５８８３）。

【0072】

本発明の抗体又はこの抗原結合性部分は、単一特異性の場合もあり、二特異性の場合もあり、多特異性の場合もある。多特異性抗体若しくは二特異性抗体又はこれらの断片は、１つの標的炭水化物（例えば、グロボＨ）の、異なるエピトープに特異的な場合もあり、１つを超える標的炭水化物に特異的な抗原結合性ドメイン（例えば、グロボＨ及びＳＳＥＡ−４に特異的な抗原結合性ドメイン）を含有する場合もある。一実施形態において、多特異性抗体又はこの抗原結合性部分は、少なくとも２つの、異なる可変ドメインを含み、この場合、各可変ドメインは、別個の炭水化物抗原又は同じ炭水化物抗原上の、異なるエピトープに特異的に結合することが可能である（Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：６０〜６９；Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：２３８〜２４４）。本抗体は、別の機能的な分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質へと連結される場合もあり、これらと共に共発現される場合もある。例えば、抗体又はこの断片は、第２の結合特異性を伴う、二特異性抗体又は多特異性抗体を作製するように、別の抗体又は抗体断片など、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又は他の方式により）１つ以上の他の分子的実体へと、機能的に連結されうる。多特異性抗体若しくは二特異性抗体又はこれらの断片は、１つの標的炭水化物（例えば、グロボＨ）の、異なるエピトープに特異的な場合もあり、１つを超える標的炭水化物に特異的な抗原結合性ドメイン（例えば、グロボＨ及びＳＳＥＡ−４に特異的な抗原結合性ドメイン）を含有する場合もある。一実施形態において、多特異性抗体又はこの抗原結合性部分は、少なくとも２つの、異なる可変ドメインを含み、この場合、各可変ドメインは、別個の炭水化物抗原又は同じ炭水化物抗原上の、異なるエピトープに特異的に結合することが可能である（Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：６０〜６９；Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：２３８〜２４４）。本発明の抗体は、別の機能的な分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質へと連結される場合もあり、これらと共に共発現される場合もある。例えば、抗体又はこの断片は、第２の結合特異性を伴う、二特異性抗体又は多特異性抗体を作製するように、別の抗体又は抗体断片など、１つ以上の他の分子的実体へと、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合又は他の方式により）機能的に連結されうる。

【0073】

抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、３つの、相補性決定領域又はＣＤＲと称された、超可変領域により中断された、フレームワーク領域（ＦＷ）を含む。本発明の１つ態様に従い、抗体又はこの抗原結合性部分は、以下の構造：
リーダー配列−ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３−
［配列中、本発明の、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、開示されている］
を有しうる。

【0074】

特異的なアミノ酸が、置換された、欠失させられた、又は添加された、抗体又はこの抗原結合性部分もまた、本発明の範囲内にある。例示的な実施形態において、これらの変更（すなわち、保存的置換、保存的欠失又は保存的付加）は、エフェクター機能又は結合アフィニティーなど、ペプチドの生物学的特性に、実質的な影響を及ぼさない。アミノ酸の変更を、保存的変更又は非保存的変更として分類する目的のために、アミノ酸は、以下：疎水性、中性、酸性及び塩基性の通りに群分けされうる。保存的置換は、同じ群内のアミノ酸の間の置換を伴う。非保存的置換は、これらの群のうちの１つのメンバーの、別の群のメンバーとの交換を構成する。Ｎｇら（「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２００６、７：６１〜８０）は、当業者が、タンパク質の機能を変化させないアミノ酸置換を予測し、選択することを可能とする、多様なアミノ酸置換（ＡＡＳ）の予測法についての概観を提示している。

【0075】

別の例示的な実施形態において、抗体は、抗体の、抗原に対する結合アフィニティーを改善するなどのために、ＣＤＲ内に、アミノ酸置換を有しうる。さらに別の例示的な実施形態において、選択された、少数の、アクセプターフレームワーク残基は、対応するドナーアミノ酸により置換えられうる。ドナーフレームワークは、成熟ヒト抗体のフレームワーク配列若しくはコンセンサス配列、又はヒト生殖細胞系列抗体のフレームワーク配列若しくはコンセンサス配列でありうる。表現型的にサイレントのアミノ酸置換をどのようにして施すのかについての指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４３：３０７〜３１（１９９４）；Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１４４３〜、４５（１９９２）において提示されている。

【0076】

本発明の１つ態様に従い、本明細書において記載されたアミノ酸置換は、Ｋａｂａｔによる番号付けスキームに対応する位置においてなされる（例えば、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。

【0077】

本明細書において使用された、「正常レベル」とは、例えば、正常患者又は正常患者の集団に由来する試料中のＴＡＣＡに結合した抗体のレベルの測定値に基づく、参照値又は参照範囲でありうる。「正常レベル」とはまた、例えば、正常患者又は正常患者の集団に由来する試料中のＴＡＣＡの測定値に基づく、参照値又は参照範囲でもありうる。

【0078】

本明細書において使用された、「対象」とは、哺乳動物である。このような哺乳動物は、家畜、農場動物、実験において使用される動物、動物園動物を含む。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。

【0079】

「グロボ系列関連障害」という用語は、典型的に、経路の異常な機能又は提示により特徴づけられた、又は寄与された障害を指す、又はこれについて記載する。このような障害の例は、がんを含む、過剰増殖性疾患を含むがこれらに限定されない。過剰増殖性疾患及び／又は過剰増殖性状態の例は、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、膵がん、結腸がん、腎がん、子宮頸がん、卵巣がん及び前立腺がんを含むがこれらに限定されない、新生物／過形成及びがんを含む。一部の実施形態において、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん又は膵がんである。他の実施形態において、過剰増殖性の疾患状態は、乳房、卵巣、肺、膵臓、胃、結腸及び直腸、前立腺、肝臓、子宮頸部、食道、脳、口腔及び腎臓と関連する。

【0080】

一実施形態において、本開示は、それを必要とする対象の処置における、抗新生物剤の治療有効性を決定するための方法であって、（ａ）対象に由来する試料を用意するステップ；（ｂ）対象から回収された試料を接触させるステップ；（ｃ）腫瘍関連抗原（ＴＡＣＡ）又は抗体のうちの１つ以上の結合についてアッセイするステップ及び（ｄ）新生物に対する処置における、抗新生物剤の治療効果を、グリカンの検出についてのアッセイ値に基づき決定するステップを含む方法を提示する。本開示は、がんの検出における、リンカー−糖コンジュゲート（例えば、グロボＨ）の組合せ使用における、驚くべき相加的有効性及び／又は相乗的有効性並びに有用性の証拠を提示する。これは、本明細書のリンカー及びコンジュゲートが、グロボ系列糖タンパク質と関連する、決定基及び分子をターゲティングする、任意の治療剤のための、コンパニオンの診断用組成物及び診断法として有用であることの基礎を提示する。コンパニオンの診断法及び診断使用としての本開示（例えば、ＯＢＩ−８２２、ＯＢＩ−８３３及びＯＢＩ−８８８）と組み合わせた使用に適する抗新生物剤を含む、例示的な治療法及び治療用組成物については、例えば、それらの各々の内容が、参照により本明細書に組み込まれた、特許公開第ＷＯ２０１５１５９１１８号、同第ＷＯ２０１４１０７６５２号及び同第ＷＯ２０１５１５７６２９号の開示において記載されている。

【0081】

本明細書において使用された、「〜に特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体及び抗原）の間の相互作用を指す。多様な場合において、「〜に特異的に結合すること」は、１リットル当たり約１０^−６モル、１リットル当たり約１０^−７モル若しくは１リットル当たり約１０^−８モル又はこれ未満のアフィニティー定数により実現されうる。

【0082】

本明細書において使用された、「実質的に低減された」又は「実質的に異なる」という語句は、当業者が、２つの値の間の差違を、前記値（例えば、Ｋｄ値）により測定された、生物学的特徴の文脈内において、統計学的有意性を有すると考えるような、２つの数値（一般に、分子と関連する一方の数値、及び参照／比較対照分子と関連する、他方の数値）の間の、十分に高度の差違を表す。２つの値の間の差違は、例えば、参照／比較対照分子についての値の関数として、約１０％を超える、約２０％を超える、約３０％を超える、約４０％を超える、及び／又は約５０％を超える。

【0083】

本明細書において使用された、「結合アフィニティー」とは、一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合性部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との、非共有結合的相互作用の全合計の強度を指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書において使用された、「結合アフィニティー」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）の間の、１：１の相互作用を反映する、内因性の結合アフィニティーを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対するアフィニティーは、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表されうる。アフィニティーは、本明細書において記載された方法を含む、当技術分野において公知の、一般的な方法により測定されうる。低アフィニティー抗体は、一般に、抗原への結合が緩徐であり、たやすく解離する傾向があるのに対し、高アフィニティー抗体は、一般に、抗原への結合が迅速であり、結合を長く維持する傾向がある。当技術分野において、結合アフィニティーを測定する、様々な方法が公知であり、これらの方法のうちのいずれかが、本発明の目的のために使用されうる。以下において、具体的な、例示的実施形態が記載される。

【0084】

ある特定の実施形態において、本発明に従う「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイに記載される通りに、目的の抗体のＦａｂ形及びその抗原により実施される、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。Ｆａｂの、抗原に対する、溶液中の結合アフィニティーは、Ｆａｂを、非標識抗原の滴定系列の存在下、最小濃度の^１２５Ｉ標識抗原で平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体によりコーティングされたプレートにより捕捉する（Ｃｈｅｎら（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３：８６５〜８８１）ことにより測定される。アッセイのための条件を確立するために、マイクロ滴定プレート（Ｄｙｎｅｘ）を、一晩にわたり、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）によりコーティングし、その後、ＰＢＳ中に２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンにより、室温（約２３℃）において、２〜５時間にわたりブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ；カタログ＃２６９６２０）内において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの^１２５Ｉ抗原を、目的のＦａｂの系列希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７：４５９３〜４５９９における、抗ＶＥＧＦ抗体である、Ｆａｂ−１２についての評価と符合する）。次いで、目的のＦａｂを、一晩にわたりインキュベートするが、インキュベーションを長時間（例えば、６５時間）にわたり持続させて、平衡への到達を確保することもできる。その後、室温におけるインキュベーション（例えば、１時間にわたる）のために、混合物を、捕捉用プレートへと移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中に０．１％のＴｗｅｅｎ−２０により、８回にわたり洗浄する。プレートを乾燥させたら、ウェル１つ当たり１５０μｌのシンチレーション剤（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上において、１０分間にわたりカウントする。最大結合の２０％以下の結合をもたらす、各Ｆａｂ濃度を、競合的結合アッセイにおける使用のために選択する。別の実施形態に従い、Ｋｄ又はＫｄ値は、２５℃、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化して、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定される。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボキシイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化させる。５μｌ／分の流量における注入の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８により、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）へと希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成した。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。各実験において、タンパク質を固定化させずに１つのスポットを活性化させ、エタノールアミンによりブロッキングして、参照を減算するために使用した。反応速度の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳ中、２５℃、約２５μｌ／分の流量において注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比である、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．ら（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３：８６５〜８８１を参照されたい。オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０^６Ｍ^−１秒^−１を超える場合、オン速度は、濃度を増大させる抗原の存在下、２５℃において、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大又は減少であって、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、又は攪拌式キュベットを伴う、８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定される増大又は減少を測定する、蛍光クェンチング法を使用することにより決定されうる。

【0085】

また、本発明に従う「オン速度」又は「会合速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」又は「会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」又は「ｋｏｎ」も、供給元の指示書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボキシイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）において、２５℃で、固定化抗原ＣＭ５チップを用いてＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、上記において記載された同じ表面プラズモン共鳴法により決定されうる。５μｌ／分の流量における注入の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８により、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）へと希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成した。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳ中、２５℃、２５μｌ／分の流量において注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比である、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．ら（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３：８６５〜８８１を参照されたい。しかし、オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる、１０^６Ｍ^−１秒^−１を超える場合、オン速度は、濃度を増大させる抗原の存在下、２５℃において、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大又は減少であって、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、又は攪拌式キュベットを伴う８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定される増大又は減少を測定する、蛍光クェンチング法を使用することにより決定されうる。

【0086】

本明細書において使用された、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を運ぶことが可能な核酸分子を指すことを意図される。１つの種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。別の種類のベクターは、ファージベクターである。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムへとライゲーションされうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製されうる。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結される遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書において、このようなベクターは、「組換え発現ベクター」（又は、単に、「組換えベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、最も一般に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、互換的に使用されうる。

【0087】

本明細書において互換的に使用された、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは修飾塩基及び／又はそれらの類似体の場合もあり、ＤＮＡポリメラーゼ若しくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーへと組み込まれうる、任意の基質の場合もあり、合成反応を介するヌクレオチドの場合もある。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前に施すこともでき、アセンブリーの後施すこともできる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断されうる。

【0088】

本明細書において使用された、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一本鎖であり、典型的には、約２００ヌクレオチド未満の長さであるが必ずしもそうでない、合成のポリヌクレオチドを一般に指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に除外的でない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドにも同等かつ十分に適用可能である。

【0089】

本明細書において使用された、「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が、特異的抗原に対する結合特異性を呈するのに対し、免疫グロブリンは、抗体、及び一般に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により、低レベルにおいて産生され、骨髄腫により、高レベルにおいて産生される。

【0090】

本明細書において使用された、「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味において、互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、全長モノクローナル抗体又は無傷モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を呈する限りにおける、二特異性抗体）を含み、また、本明細書において、詳細に記載された、ある特定の抗体断片も含みうる。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及び／又はアフィニティー成熟抗体でありうる。

【0091】

本明細書において使用された、抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは、一般に、抗体の、最も可変的な部分であり、抗原結合性部位を含有する。

【0092】

本明細書において使用された、「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が、抗体間の配列において大幅に異なり、各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通して、均等に配分されているわけでない。可変性は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる、３つのセグメントに集約されている。可変ドメインのうちの、より高度に保存的な部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、大部分が、ベータシート構造を接続し、場合によって、ベータシート構造の部分を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続された、ベータシートの立体構成を採用する、４つずつのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域により一体に近接して保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与せず、抗体の、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用への参与など、多様なエフェクター機能を呈する。

【0093】

抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、２つの同一な抗原結合性断片であって、各々が、単一の抗原結合性（ｂｉｎｄｉｎｇ）部位、及びたやすく結晶化する能力を反映する呼称である残りの「Ｆｃ」断片を伴う、抗原結合性（ｂｉｎｄｉｎｇ）断片をもたらす（ｐｒｏｄｕｃｅｓ）。ペプシン処理は、２つの抗原結合性（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位を有し、抗原を架橋することがやはり可能な、Ｆ（ａｂ’）_２断片をもたらす（ｙｉｅｌｄ）。

【0094】

「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位及び抗原結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。二本鎖Ｆｖ分子種において、この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ分子種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が、二本鎖Ｆｖ分子種における構造と類似の「二量体」構造において会合しうるように、可撓性のペプチドリンカーにより、共有結合的に連結されうる。各可変ドメインの３つずつのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上において、抗原結合性部位を規定するのは、この立体構成においてである。併せて、６つのＣＤＲは、抗原結合特異性を、抗体に付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）であってもなお、結合性部位全体より小さなアフィニティーにおいであるが、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有する。

【0095】

「Ｆａｂ」断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における、抗体のヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む少数の残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が、遊離チオール基を保有する、Ｆａｂ’のための、本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元は、それらの間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として作製された。また、抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。

【0096】

任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」とは、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つの顕著に異なる種類のうちの１つへと割り当てられうる。

【0097】

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスへと割り当てられうる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのクラスのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２へとさらに分けられうる。ブリンと称される免疫グロブリンの異なるクラスに対応する、重鎖定常ドメインは、異なるクラスに割り当てられる。免疫グロブリンの異なるクラスの、５つの三次元構成が周知であり、例えば、Ａｂｂａｓら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、４版（２０００）において、一般に記載されている。抗体は、抗体の、１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合的会合又は非共有結合的会合により形成される、より大型の融合分子の部分でありうる。

【0098】

「全長抗体」、「無傷抗体」及び「全抗体」という用語は、下記において規定される抗体断片でなく、その実質的な無傷形態にある抗体を指すように、本明細書において互換的に使用される。用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を伴う抗体を指す。

【0099】

本明細書において使用された、「抗体断片」は、無傷抗体の部分だけを含み、この場合、部分は、無傷抗体に存在する場合に、この部分と通常関連する機能のうちの、少なくとも１つであり、かつ、これらの大半又は全部に及ぶ機能を保持する。一実施形態において、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合性部位を含み、これにより、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態において、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体断片は、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能及び補体への結合など、無傷抗体に存在する場合に、Ｆｃ領域と通常関連する生体機能のうちの少なくとも１つを保持する。一実施形態において、抗体断片は、インビボ半減期が、無傷抗体と実質的に同様である、一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボにおける安定性を断片に付与することが可能なＦｃ配列へと連結された、抗原結合性アームを含みうる。

【0100】

本明細書において使用された「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、少量において存在しうる、可能な天然に存在する突然変異を除き、同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物でないものとしての抗体の特性を指し示す。このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的結合性ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの、単一の標的結合性ポリペプチド配列の選択を含む工程により得られたものであることが典型的である。ある特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、天然配列を除外しうる。一部の態様において、選択工程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールなど、複数のクローンから固有のクローンを選択することでありうる。選択された標的結合性配列は、例えば、標的に対するアフィニティーを改善し、標的結合性配列をヒト化し、細胞培養物中のその産生を改善し、インビボにおけるその免疫原性を低減し、多特異性抗体を創出するなどするように、さらに変更される場合があり、変更された標的結合性配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。典型的には、異なる決定基（例えばエピトープ）に対して方向付けられた、異なる抗体を含むことが典型的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における、単一の決定基に対して方向付けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、他の免疫グロブリンにより夾雑されていないという点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られたものとしての抗体の特性を指し示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製を要求するとはみなされないものとする。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）及びＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４（１〜２）：１１９〜１３２（２００４）を参照されたい）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全部を有する動物において、ヒト抗体又はヒト様抗体を作製するための技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｌｏｎｏｇｙ、１０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：８４５〜８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：８２６（１９９６）並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）を参照されたい。）を含む、様々な技法により作製されうる。

【0101】

本明細書のモノクローナル抗体は、より詳細に、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体のほか、所望の生体活性を呈する限りにおいて、このような抗体の断片（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４））も含む。

【0102】

本発明の抗体はまた、本発明の抗体から作出された、キメラ化モノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体も含む。

【0103】

抗体は、全長の場合もあり、抗体断片から形成された、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ−ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６（１９８９））、ＣＤＲ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子及び多特異性抗体を含むがこれらに限定されない、抗原結合性部分を有する、抗体の１つの断片（又は複数の断片）を含む場合もある。組換え法又は合成リンカーを使用して、抗体断片を接続することにより作製される単鎖抗体もまた、本発明により包含される（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８、８５：５８７９〜５８８３）。

【0104】

本発明の抗体又はこの抗原結合性部分は、単一特異性の場合もあり、二特異性の場合もあり、多特異性の場合もある。

【0105】

ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ_ｌ、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ_ｌ、ＩｇＡ_２）、ＩｇＤ又はＩｇＥ（全てのクラス及びサブクラスが、本発明に包含される）を含む、全ての抗体アイソタイプが、本発明に包含される。抗体又はこの抗原結合性部分は、哺乳動物（例えば、マウス、ヒト）抗体又はこの抗原結合性部分でありうる。抗体の軽鎖は、カッパ型の軽鎖の場合もあり、ラムダ型の軽鎖の場合もある。

【0106】

参照抗体により作製される抗体の、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％（又は上記において列挙された値のうちの２つの間の範囲の任意の数）が相同である、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う抗体はまた、炭水化物抗原（例えば、グロボＨ、ＳＳＥＡ−４）にも結合しうる。相同性は、アミノ酸配列のレベルにおいて存在する場合もあり、ヌクレオチド配列のレベルにおいて存在する場合もある。一部の態様において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に対する、列挙された相同性を有する抗体の配列は、天然に存在する抗体配列を除外する。一部の態様において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に対する、列挙された相同性を有する抗体の配列は、天然に存在する抗体配列を含む。

【0107】

ある特定の実施形態において、ＣＤＲは、配列の変異を有する。例えば、ＣＤＲ内の全残基のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ若しくは８つの残基又は２０％未満、３０％未満若しくは約４０％未満が置換された、又は欠失させられたＣＤＲが、炭水化物抗原に結合する抗体（又はこの抗原結合性部分）内に存在しうる。

【0108】

抗体又は抗原結合性部分は、ペプチドでありうる。このようなペプチドは、生物学的活性、例えば、炭水化物抗原への結合を呈するペプチドの、変異体、類似体、オーソログ、相同体及び誘導体を含みうる。ペプチドは、１つ以上のアミノ酸の類似体（例えば、天然に存在しないアミノ酸、非類縁の生物学的系だけにおいて天然に存在するアミノ酸、哺乳動物系に由来する修飾アミノ酸などを含む）、置換された連結のほか、当技術分野において公知の、他の修飾を伴うペプチドを含有しうる。

【0109】

特異的アミノ酸が置換された、欠失させられた、又は付加された、抗体又はこの抗原結合性部分もまた、本発明の範囲内にある。例示的な実施形態において、これらの変更は、結合アフィニティーなどの、ペプチドの生物学的特性に対して、実質的な効果を及ぼさない。別の例示的な実施形態において、抗体は、抗体の、抗原に対する結合アフィニティーを改善するなどのために、フレームワーク領域にアミノ酸置換を有しうる。さらに別の例示的な実施形態において、選択された、少数の、アクセプターフレームワーク残基は、対応するドナーアミノ酸により置換えられうる。ドナーフレームワークは、成熟ヒト抗体のフレームワーク配列若しくはコンセンサス配列、又はヒト生殖細胞系列抗体のフレームワーク配列若しくはコンセンサス配列でありうる。表現型的にサイレントのアミノ酸置換をどのようにして施すのかについての指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４３：３０７〜３１（１９９４）；Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１４４３〜、４５（１９９２）において提示されている。

【0110】

抗体又はこの抗原結合性部分は、誘導体化される場合もあり、別の機能的分子へと、連結される場合もある。例えば、抗体は、別の抗体、検出用薬剤、細胞傷害剤、医薬剤、別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介しうる、タンパク質若しくはペプチド、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性担体、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ及びブドウ球菌のプロテインＡなど、タンパク質の精製において有用なリガンドなど、１つ以上の他の分子的実体へと、（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的相互作用などにより）機能的に連結されうる。１つの種類の誘導体化タンパク質は、（同じ種類又は異なる種類の）２つ以上のタンパク質を架橋することにより作製される。適切な架橋剤は、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）により隔てられた、２つの顕著に異なる反応性基を有する、ヘテロ二官能性の架橋剤を含む。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから市販されている。タンパク質が誘導体化されうる（又は標識されうる）のに有用な検出用薬剤は、蛍光化合物、多様な酵素、補欠分子群、発光材料、生物発光材料及び放射性材料を含む。非限定的な、例示的蛍光検出用薬剤は、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン及びフィコエリトリンを含む。タンパク質又は抗体はまた、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出用酵素によっても誘導体化されうる。タンパク質はまた、補欠分子群（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン）によっても誘導体化されうる。

【0111】

本抗体又はこの抗原結合性部分の、機能的に活性の変異体をコードする核酸もまた、本発明に包含される。これらの核酸分子は、中程度の厳密性条件、高度の厳密性条件又は極めて高度の厳密性下において、本抗体又はこの抗原結合性部分のうちのいずれかをコードする核酸とハイブリダイズしうる。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、参照により本明細書に組み込まれた、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１〜６．３．６、１９８９において見出されうる。本明細書において言及される、具体的なハイブリダイゼーション条件は、以下の通り：１）中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件：約４５℃における、６倍濃度のＳＳＣに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６０℃における、１回以上の洗浄；２）高度の厳密性のハイブリダイゼーション条件：約４５℃における、６倍濃度のＳＳＣに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃における、１回以上の洗浄；３）極めて高度の厳密性のハイブリダイゼーション条件：６５℃における、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳに続く、０．２倍濃度のＳＳＣ、１％のＳＤＳ中、６５℃における、１回以上の洗浄である。

【0112】

本抗体又はこの抗原結合性部分をコードする核酸は、適切な発現系において発現されうる発現ベクターへと導入されるのに続き、発現された抗体又はこの抗原結合性部分の単離又は精製が行われうる。任意選択的に、本抗体又はこの抗原結合性部分をコードする核酸は、無細胞翻訳系において翻訳されうる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６：１００２９〜１００３３（１９８９））。

【0113】

本抗体又はこの抗原結合性部分は、所望の抗体の軽鎖及び重鎖（又はこれらの部分）をコードするＤＮＡにより形質転換された宿主細胞により作製されうる。抗体は、標準的な技法を使用して、これらの培養物上清及び／又は細胞から、単離及び精製されうる。例えば、宿主細胞は、抗体の軽鎖、重鎖又はこれらの両方をコードするＤＮＡにより形質転換されうる。組換えＤＮＡ技術はまた、結合に必要でない（例えば、定常領域）軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの、一部又は全部を除去するのにも使用されうる。

【0114】

本核酸は、原核細胞及び真核細胞、例えば、細菌細胞、（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む、多様な、適切な細胞において発現されうる。当技術分野において、多数の哺乳動物細胞系が公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系を含む。細胞の非限定例は、サル腎臓細胞（ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７）、ＨＥＫ２９３、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ、例えば、ＢＨＫ２１）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ＰｅｒＣ６、ＢＳＣ−１、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）、骨髄腫細胞及びリンパ腫細胞の親細胞、派生体及び／又は操作された変異体を含むがこれらに限定されない、哺乳動物由来である、又は哺乳動物様の特徴を有する、全ての細胞系を含む。操作された変異体は、例えば、グリカンプロファイル修飾誘導体及び／又は部位特異的組込み部位誘導体を含む。

【0115】

本発明はまた、本明細書において記載された核酸を含む細胞も提供する。細胞は、ハイブリドーマの場合もあり、トランスフェクタントの場合もある。

【0116】

代替的に、本抗体又はこの抗原結合性部分は、当技術分野において周知の固相プロシージャにより合成されうる（「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＲＬ刊（１９８９）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３５巻：「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ及びＢ．Ｍ．Ｄｕｎｎ編）、７章、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ（１９８４）；Ｇ．Ｂａｒａｎｙ及びＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、１巻及び２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）、３〜２５４頁；Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４））。

【0117】

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、アフィニティー及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長動物など、非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基により置換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基により置換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の効能をさらに精緻化するようになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つであり、典型的に、２つの可変ドメインであって、超可変ループのうちの、全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちの全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）のうちの少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンのＦｃのうちの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。また、以下の総説論文：Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ及びＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５：４２８〜４３３（１９９４）並びにこれらの中において引用されている参考文献も参照されたい。

【0118】

本明細書において使用される場合の、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」という用語は、配列が超可変的である、抗体可変ドメインの領域、及び／又は構造的に規定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域：ＶＨにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多数の超可変領域の描示が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔによる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般に使用されている（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。これとは別に、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７））。

【0119】

「フレームワーク」残基又は「ＦＷ」残基とは、本明細書において規定された、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0120】

「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基の番号付け」又は「Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置の番号付け」という用語、及びこれらの変化形は、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）における抗体の集成のうちの、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて使用されている番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮又はこれらへの挿入に対応する、より少数のアミノ酸又はさらなるアミノ酸を含有する場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後における、単一のアミノ酸の挿入（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）及び重鎖ＦＲの残基８２の後における残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含みうる。Ｋａｂａｔによる残基の番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列相同性領域における、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアライメントにより決定されうる。

【0121】

本明細書において使用された、「単鎖Ｆｖ」抗体断片又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーであって、ｓｃＦｖが、抗原への結合に所望の構造を形成することを可能とするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照されたい。

【0122】

本明細書において使用された、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合性部位を伴う、小型の抗体断片であって、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）へと接続された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む断片を指す。同じ鎖における２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合し、２つの抗原結合性部位を創出するように強いられる。ダイアボディについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）においてより十全に記載されている。

【0123】

本明細書において使用された、「ヒト抗体」とは、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を所有し、及び／又は本明細書において開示された、ヒト抗体を作るための技法のうちのいずれかを使用して作られた抗体である。詳細に述べると、ヒト抗体についてのこの定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を除外する。

【0124】

本明細書において使用された、「アフィニティー成熟抗体」とは、その１つ以上のＨＶＲにおける、１つ以上の変更であって、これらの変更を所有しない親抗体と比較して、抗体の抗原に対するアフィニティーの改善を結果としてもたらす変更を伴う抗体である。一実施形態において、アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位、なお又はピコモル単位のアフィニティーを有する。アフィニティー成熟抗体は、当技術分野において公知の手順により作製される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３（１９９２）は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのシャッフリングによるアフィニティー成熟について記載している。ＣＤＲ残基及び／又はフレームワーク残基に対するランダム突然変異誘発については、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９（１９９５）及びＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６（１９９２）により記載されている。

【0125】

本明細書において使用された、「遮断抗体」又は「アンタゴニスト抗体」とは、それが結合する抗原の生物学的活性を、阻害又は低減する抗体である。ある特定の遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的又は完全に阻害する。

【0126】

本明細書において使用された、「アゴニスト抗体」とは、目的のポリペプチドの機能的活性のうちの、少なくとも１つを模倣する抗体である。

【0127】

本明細書において使用された、「障害」とは、本発明の抗体による処置から利益を得る、任意の状態である。「障害」は、哺乳動物に、問題の障害への素因を与える病理学的状態を含む、慢性障害及び急性障害又は慢性疾患及び急性疾患を含む。本明細書において処置される障害の非限定的な例は、がんを含む。

【0128】

本明細書において使用された、「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、何らかの程度の、異常な細胞増殖と関連する障害を指す。一実施形態において、細胞増殖性障害は、がんである。

【0129】

本明細書において使用された、「腫瘍」とは、悪性であれ、良性であれ、全ての新生物性細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ及びｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を指し、全ての前がん性細胞及び前がん性組織並びにがん性細胞及びがん性組織を指す。本明細書において言及される通り、「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」という用語は、相互に除外的でない。

【0130】

本明細書において使用された、「がん」及び「がん性」という用語は、哺乳動物における生理学的状態であって、典型的に、調節不能の細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ／ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）により特徴づけられた生理学的状態を指す、又はこれについて記載する。がんの例は、癌、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含むがこれらに限定されない。このようながんのより特定の例は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病及び他のリンパ増殖性障害並びに多様な種類の頭頸部がんを含む。

【0131】

本明細書において使用された、「処置」とは、処置される個体又は細胞の、天然の経過を変更しようとする試みにおける、臨床的介入を指し、予防のために実施される場合もあり、臨床病態の経過中に実施される場合もある。処置の所望の効果は、疾患の発症又は再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減弱、炎症及び／又は組織／器官損傷の防止又は減少、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）又は軽減、及び寛解又は予後の改善（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、疾患又は障害の発症を遅延させるのに使用される。

【0132】

本明細書において使用された、「抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」とは、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌由来、真菌由来、植物由来、若しくは動物由来の、酵素的に活性の毒素、又はこれらの断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤へとコンジュゲートされた抗体を指す。

【0133】

本明細書において使用された、「Ｔ細胞表面抗原」とは、ＭＨＣ関連ペプチド抗原の特異的認識のためにＴ細胞により使用された、全てのＴ細胞の主要な規定的マーカーである、Ｔ細胞抗原受容体（ＴｃＲ）を含む、当技術分野において公知の、代表的Ｔ細胞表面マーカーを含みうる抗原を指す。ＴｃＲと関連する例は、ＴｃＲの、そのコグネイトのＭＨＣ／抗原複合体への結合の後における、細胞内シグナルの伝達に参与する、ＣＤ３として公知のタンパク質複合体である。Ｔ細胞表面抗原の、他の例は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＣＤ４４を含みうる（又はこれらを除外しうる）。

【0134】

本明細書において使用された、「個体」又は「対象」とは、脊椎動物である。ある特定の実施形態において、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物は、農場動物（ウシなど）、競技動物、愛玩動物（ネコ、イヌ、及びウマなど）、霊長動物、マウス及びラットを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、脊椎動物は、ヒトである。

【0135】

本明細書において使用された、処置を目的とする「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される、任意の動物であって、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、家畜及び農場動物並びに動物園動物、競技動物又は愛玩動物を含む。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。

【0136】

本明細書において使用された、「有効量」とは、投与時において、かつ必要な時間にわたり、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量を指す。

【0137】

本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重並びに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従い変動しうる。治療有効量はまた、物質／分子の、任意の毒性作用又は有害作用が、治療的に有益な効果により凌駕される場合の量でもある。「予防有効量」とは、投与時において、かつ必要な時間にわたり、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。予防用量は、対象において、疾患の前又はその早期に使用されるので、予防有効量は、治療有効量未満となることが典型的であるが、必ずしもそうでない。

【0138】

本明細書において使用された「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは防止し、かつ／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ−２１１、Ｉ−１３１、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｓｍ−１５３、Ｂｉ−２１２、Ｐ−３２、Ｐｂ−２１２及びＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤）、核酸溶解性酵素などの酵素及びこの断片、抗生剤並びに細菌由来、真菌由来、植物由来又は動物由来の低分子毒素又は酵素活性毒素などの毒素であって、これらの断片及び／又は変異体を含む毒素並びに下記において開示された、多様な抗腫瘍剤又は抗がん剤を含むことが意図される。他の細胞傷害剤については、下記において記載される。腫瘍殺滅剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。

【0139】

本明細書において使用された、「化学療法剤」とは、がんの処置において有用な化合物である。化学療法剤の例は、チオテパ及びシクロホスファミドであるＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチオールメラミンを含めたエチレンイミン及びメチルメラミン；アセトゲニン（とりわけ、ブラクタシン及びブラクタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、マリノール（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（このアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体である、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生剤（例えば、カリケアミシン、とりわけ、カリケアミシンガンマＩＩ及びカリケアミシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６（１９９４）を参照されたい。）；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシンのほか；ネオカルチノスタチン発色団及び関連の色素タンパク質である、エンジイン抗生剤発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシンであるＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生剤；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎皮質抗体；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；ｐｈｅｎａｍｅｔ；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルであるＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有アルブミン操作ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）及びドセタキセルであるＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のうちのいずれかの、薬学的に許容される塩、酸又は誘導体のほか；シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンによる組合せ療法の略号であるＣＨＯＰ並びにオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））が、５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わされた処置レジメンの略号であるＦＯＬＦＯＸなど、上記のうちの、２つ以上の組合せを含む。

【0140】

＜医薬組成物＞
一部の実施形態において、本発明は、本明細書において記載された、抗体又はこの抗原結合性部分、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性のある、任意の溶媒及び全ての溶媒、任意の分散媒及び全ての分散媒、任意の等張剤及び全ての等張剤並びに任意の吸収遅延剤及び全ての吸収遅延剤などを含む。一実施形態において、医薬組成物は、対象におけるがん細胞を阻害するのに効果的である。一部の実施形態において、製剤は、２つ以上の治療剤を含有する、組合せ製剤である。

【0141】

＜投与経路＞
本医薬組成物の投与経路は、静脈内投与、筋内投与、鼻腔内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、経口投与、局所投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、皮内投与、経皮投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）投与、非経口投与、直腸内投与、脊髄投与又は表皮投与を含むがこれらに限定されない。

【0142】

＜製剤＞
本組合せ療法の医薬組成物は、個別の単剤療法として調製される場合もあり、又は注射の前に先立ち、溶液若しくは懸濁液としての注射剤、又は液体媒体中の、溶解若しくは懸濁に適する固体形態としての注射剤として、共製剤化される場合もある。医薬組成物はまた、固体形態においても調製される場合もあり、乳化される場合もあり、有効成分が、持続送達のために使用される、リポソーム媒体中又は他の粒子状担体中に封入される場合もある。例えば、医薬組成物は、油エマルジョン、油中水エマルジョン、水中油中水エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長時間貯留型エマルジョン、粘着性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子並びに酢酸エチレンビニルコポリマー及びＨｙｔｒｅｌ（登録商標）コポリマーなど、非吸収性の不透過性ポリマー、ハイドロゲルなどの膨潤性ポリマー又はコラーゲンなどの吸収性ポリマー並びに医薬組成物の持続放出を可能とする、吸収性縫合糸を作るのに使用されたものなど、ある特定のポリ酸又はポリエステルなど、多様な、天然ポリマー又は合成ポリマーの形態でありうる。

【0143】

当然ながら、インビボ投与のために使用される医薬組成物は、無菌でなければならず、無菌化は、従来の技法、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過により達成されうる。抗体の濃度を、いわゆる高濃度液体製剤（ＨＣＬＦ）に至るように上昇させることは、有用な場合があり、このようなＨＣＬＦを作出するための、多様な方式が記載されされている。

【0144】

医薬組成物は、組合せとして共投与される場合もあり、かつ／又はさらに別の治療剤と混合される場合もある。組合せ生成物は、２つ以上の成分の混合物の場合もあり、共有結合的に接合される場合もある。ある特定の実施形態において、抗体はまた、がんワクチン、例えば、ジフテリア毒素アジュバント及びサポニンアジュバントとコンジュゲートされた、グロボＨとの組合せにおいても投与されうる。さらなる治療剤は、任意選択的に、同じ医薬調製物の構成要素と同時に投与される場合もあり、本発明の、特許請求された抗体の投与の前又は後に投与される場合もある。このような剤形を調製する、実際の方法は公知である、又は当業者により改変される。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、２１版を参照されたい。

【0145】

＜投与及び剤形＞
医薬組成物は、対象の年齢、体重及び状態、使用された特定の組成物及び投与経路、医薬組成物が、予防的目的のために使用されるのか、治癒的目的のために使用されるのかなどに対して適切な、スケジュール及び適切な期間にわたり、単回投与による処置において投与される場合もあり、複数回投与による処置において投与される場合もある。例えば、一実施形態において、本発明に従う医薬組成物は、毎月１回、毎月２回、毎月３回、隔週（ｑｏｗ）、毎週１回（ｑｗ）、毎週２回（ｂｉｗ）、毎週３回（ｔｉｗ）、毎週４回、毎週５回、毎週６回、隔日（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、毎日２回（ｑｉｄ）又は毎日３回（ｔｉｄ）投与される。

【0146】

本発明に従う、抗体の組合せ療法の投与の持続期間、例えば、医薬組成物が投与される期間は、例えば、対象の応答など、様々な因子のうちのいずれかに応じて変動しうる。例えば、医薬組成物は、約１秒間以上〜１時間以上、１日間〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１カ月間〜約２カ月間、約２カ月間〜約４カ月間、約４カ月間〜約６カ月間、約６カ月間〜約８カ月間、約８カ月間〜約１年間、約１年間〜約２年間又は約２年間〜約４年間以上の範囲の期間にわたり投与されうる。

【0147】

投与の容易さ及び投与量の均一性のために、単位剤形にある、経口組成物又は非経口医薬組成物が使用されうる。本明細書において使用された、単位剤形とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位であって、各単位が、要求された医薬担体と会合して、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する単位を指す。

【0148】

細胞培養物アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための、投与量の範囲を処方するのに使用されうる。一実施形態において、このような化合物の投与量は、毒性を、ほとんど、又は全く伴わない、ＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられた剤形及び利用された投与経路に応じて、この範囲内において変動しうる。別の実施形態において、治療有効用量は、まず、細胞培養物アッセイから推定されうる。用量は、細胞培養物中において決定された、ＩＣ_５０（すなわち、症状の、最大半量の阻害を達成する、被験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方されうる（Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏａｔｈｏｌ．、２５：３５〜４５、２００３；Ｎｉｋｕｌａら、Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、４（１２）：１２３〜５３、２０００）。

【0149】

本発明の抗体又は抗原結合性部分の、治療有効量又は予防有効量のための、例示的な、非限定的な範囲は、体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約６０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約３０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約２５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．５〜約２５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１〜約２０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０〜約２０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．７５〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約２〜約９ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１〜約２ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約３〜約８ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約４〜約７ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５〜約６ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約８〜約１３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約８．３〜約１２．５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約４〜約６ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約４．２〜約６．３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１．６〜約２．５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約２〜約３ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇである。

【0150】

医薬組成物は、有効量の、本抗体又はこの抗原結合性部分を含有するように製剤化され、この場合、量は、処置される動物及び処置される状態に依存する。一実施形態において、本抗体又はこの抗原結合性部分は、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．１ｍｇ〜約９ｇ、約１ｍｇ〜約８ｇ、約２ｍｇ〜約７ｇ、約３ｍｇ〜約６ｇ、約１０ｍｇ〜約５ｇ、約２０ｍｇ〜約１ｇ、約５０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０１μｇ〜約１０ｇ、約０．０５μｇ〜約１．５ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇのタンパク質、約３０μｇ〜約５００μｇ、約４０μｇ〜約３００μｇ、約０．１μｇ〜約２００μｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇの範囲の用量において投与される。任意の特定の対象のための、具体的な用量レベルは、特異的なペプチドの活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食餌、投与回数、投与経路及び排出速度、薬物の組合せ並びに治療を受ける、特定の疾患の重症度を含む、様々な因子に依存し、不要な実験を伴わずに、当業者により決定されうる。

【0151】

本明細書において使用された、「ワクチン」という用語は、全病原生物（死滅させられた、又は弱毒化された）又はこのような生物の構成要素であって、生物が引き起こす疾患に対する免疫を付与するのに使用される、タンパク質、ペプチド又は多糖などの構成要素からなる抗原を含有する調製物を指す。ワクチン調製物は、天然の場合もあり、合成の場合もあり、組換えＤＮＡ技術により導出される場合もある。

【0152】

本明細書において使用された、「〜に特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体及び抗原）の間の相互作用を指す。多様な場合において、「〜に特異的に結合すること」は、１リットル当たり約１０^−６モル、１リットル当たり約１０^−７モル若しくは１リットル当たり約１０^−８モル又はこれ未満のアフィニティー定数により実現されうる。

【0153】

本明細書において使用された、糖酵素という用語は、少なくとも、部分的に、グロボ系列の生合成経路内の酵素を指し；例示的な糖酵素は、アルファ−４ＧａｌＴ酵素；ベータ−４ＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ酵素又はベータ−３ＧａｌＴ−Ｖ酵素を含む。

【0154】

＜組合せに適する、ＯＢＩ−８８８（グロボＨ抗体）の例についての記載＞
ある特定の実施形態において、抗体は、ＯＢＩ−８８８（抗グロボＨモノクローナル抗体）である。例示的なＯＢＩ−８８８は、それらの内容が、参照によりその全体において組み込まれた、ＰＣＴ特許公開（ＷＯ２０１５１５７６２９Ａ２及びＷＯ２０１７０６２７９２Ａ１）、特許出願において記載されている通りである。

【0155】

本発明は、当技術分野において公知の技術と組み合わせた、本明細書に記載され、可能とされる、炭水化物抗原に結合する可変ドメインを含む、グロボＨ抗体又はこの抗原結合性部分、これらの抗体のコンジュゲート形、これらと関連する、コード核酸又は相補性核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、デバイス、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、及びこれらを作る方法並びに使用する方法を提供する。抗体又はこの抗原結合性部分は、約１０^−７Ｍ以下、約１０^−８Ｍ以下、約１０^−９Ｍ以下、約１０^−１０Ｍ以下、約１０^−１１Ｍ以下又は約１０^−１２Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有しうる。抗体又はこの抗原結合性部分は、ヒト化抗体又はこの抗原結合性部分の場合もあり、キメラ抗体又はこの抗原結合性部分の場合もある。

【0156】

一実施形態において、本発明は、配列番号３において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0157】

別の実施形態において、本発明は、配列番号４において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0158】

さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号３において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、及び配列番号４において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0159】

第４の実施形態において、本発明は、重鎖領域を含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号５、６及び７に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。例示的な実施形態において、重鎖は、リーダー配列と、前記ＣＤＲ１との間に、配列番号８７と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークをさらに含む。別の実施形態において、重鎖は、前記ＣＤＲ２と、前記ＣＤＲ３との間に、配列番号８９と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークをさらに含む。さらに別の例示的な実施形態において、重鎖は、重鎖の、前記ＣＤＲ１と、前記ＣＤＲ２との間に、配列番号１１と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークをさらに含み、この場合、フレームワークは、９位にグリシンを含有し、抗体又はこの抗原結合性部分は、グロボＨなどの炭水化物抗原に結合する。

【0160】

第５の実施形態において、本発明は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号８、９及び１０に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。例示的な実施形態において、軽鎖は、リーダー配列と、前記ＣＤＲ１との間に、配列番号８８と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークをさらに含む。別の例示的な実施形態において、軽鎖は、軽鎖の、前記ＣＤＲ２と、前記ＣＤＲ３との間に、配列番号９０と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークをさらに含む。さらに別の例示的な実施形態において、軽鎖は、軽鎖の、前記ＣＤＲ１と、前記ＣＤＲ２との間に、配列番号１２と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークをさらに含み、この場合、フレームワークは、１２位にプロリンを含有し、抗体又はこの抗原結合性部分は、グロボＨに結合する。さらに別の例示的な実施形態において、軽鎖は、軽鎖の、前記ＣＤＲ１と、前記ＣＤＲ２との間に、配列番号１２と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークをさらに含み、この場合、フレームワークは、１３位にトリプトファンを含有し、抗体又はこの抗原結合性部分は、グロボＨなどの炭水化物抗原に結合する。

【0161】

第６の実施形態において、本発明は、重鎖領域と、軽鎖領域とを含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号５、６及び７に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号８、９及び１０に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0162】

一部の実施形態において、重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号５、６又は７から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。他の実施形態において、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号８、９又は１０から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。

【0163】

本発明はまた、配列番号１３において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分へも方向付けられる。

【0164】

本発明はまた、配列番号１４において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分へも方向付けられる。

【0165】

本発明はまた、配列番号１３において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン及び配列番号１４において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分へも方向付けられる。

【0166】

例示的な実施形態は、重鎖領域を含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号１５、１６及び１７に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。別の例示的な実施形態は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号１８、１９及び２０に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0167】

別の例示的な実施形態は、重鎖領域と、軽鎖領域とを含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号１５、１６及び１７に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号１８、１９及び２０に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0168】

一部の実施形態において、重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号１５、１６又は１７から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。他の実施形態において、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号１８、１９又は２０から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。

【0169】

本発明の１つの実施形態は、配列番号２１において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分である。

【0170】

本発明の別の実施形態は、配列番号２２において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分である。

【0171】

本発明のさらに別の実施形態は、配列番号２１において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、及び配列番号２２において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分である。

【0172】

例示的な実施形態は、重鎖領域を含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号２３、２４及び２５に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。別の例示的な実施形態は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号２６、２７及び２８に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0173】

別の例示的な実施形態は、重鎖領域と軽鎖領域とを含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号２３、２４及び２５に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号２６、２７及び２８に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0174】

一部の実施形態において、重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号２３、２４又は２５から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、ＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。他の実施形態において、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号２６、２７又は２８から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、ＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。

【0175】

本発明はまた、配列番号２９において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分も開示する。

【0176】

本発明はまた、配列番号３０において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分も開示する。

【0177】

本発明はまた、配列番号２９において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、及び配列番号３０において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分も開示する。

【0178】

例示的な実施形態は、重鎖領域を含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号３１、３２及び３３に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。別の例示的な実施形態は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号３４、３５及び３６に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0179】

別の例示的な実施形態は、重鎖領域と軽鎖領域とを含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号３１、３２及び３３に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号３４、３５及び３６に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0180】

一部の実施形態において、重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号３１、３２又は３３から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。他の実施形態において、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号３４、３５又は３６から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、ＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。

【0181】

本発明の１つの実施形態は、配列番号３７において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0182】

本発明の別の実施形態は、配列番号３８において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0183】

本発明の別の実施形態は、配列番号３７において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン及び配列番号３８において示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0184】

例示的な実施形態は、重鎖領域を含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号３９、４０及び４１に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。別の例示的な実施形態は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号４２、４３及び４４に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を開示する。

【0185】

別の例示的な実施形態は、重鎖領域と軽鎖領域とを含み、重鎖領域が、それぞれ、配列番号３９、４０及び４１に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、軽鎖領域が、それぞれ、配列番号４２、４３及び４４に明示されたアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、抗体又はこの抗原結合性部分を提供する。

【0186】

一部の実施形態において、重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号３９、４０又は４１から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。他の実施形態において、軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号４２、４３又は４４から選択されるアミノ酸配列と、約８０％〜約１００％相同であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、抗体又はこの抗原結合性部分が提供される。

【0187】

本発明は、本明細書において記載された、抗体又はこの抗原結合性部分と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0188】

本発明はまた、グロボＨを発現するがん細胞を阻害する方法であって、それを必要とする対象へと、本明細書において記載された、抗体又はこの抗原結合性部分の有効量を投与するステップを含み、グロボＨを発現するがん細胞が阻害される方法も提供する。

【0189】

本発明はまた、２Ｃ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受託番号：ＰＴＡ−１２１１３８下において寄託された）、３Ｄ７（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１３１０下において寄託された）、７Ａ１１（ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ−１２１３１１下において寄託された）、２Ｆ８（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１１３７下において寄託された）及び１Ｅ１（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２１３１２下において寄託された）と名指されたハイブリドーマクローン並びにこれらから産生された抗体又は抗原結合性部分も提供する。

【0190】

本抗体又はこの抗原結合性部分は、グロボＨに、約１０^−７Ｍ未満、約１０^−８Ｍ未満、約１０^−９Ｍ未満、約１０^−１０Ｍ未満、約１０^−１１Ｍ未満又は約１０^−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）により、特異的に結合する。一実施形態において、抗体又はこの抗原結合性部分は、１〜１０×１０^−９以下の解離定数（ＫＤ）を有する。別の実施形態において、Ｋｄは、表面プラズモン共鳴により決定される。

【0191】

クローン２Ｃ２により産生される抗体の、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％相同である、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う抗体はまた、炭水化物抗原（例えば、グロボＨ）にも結合する。相同性は、アミノ酸配列のレベルにおいて存在する場合もあり、ヌクレオチド配列のレベルにおいて存在する場合もある。

【0192】

一部の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性部分は、例えば、ハイブリドーマである２Ｃ２、ハイブリドーマである３Ｄ７、ハイブリドーマである７Ａ１１、ハイブリドーマである２Ｆ８及びハイブリドーマである１Ｅ１により産生された、抗体の、可変重鎖及び／又は可変軽鎖を含み、表１に示される。

【0193】

関連する実施形態において、抗体又はこの抗原結合性部分は、例えば、ハイブリドーマである２Ｃ２、ハイブリドーマである３Ｄ７、ハイブリドーマである７Ａ１１、ハイブリドーマである２Ｆ８及びハイブリドーマである１Ｅ１から産生された、抗体の、可変重鎖のＣＤＲ及び／又は可変軽鎖のＣＤＲを含む。これらのハイブリドーマクローンに由来する、可変重鎖及び可変軽鎖の、ＣＤＲ及びフレームワークは、表１に示される。

【0194】

【表2】

【0195】

本発明はまた、炭水化物抗原に特異的に結合する、本抗体又はこの抗原結合性部分をコードする核酸も包含する。一実施形態において、炭水化物抗原はグロボＨである。

【0196】

さらに別の実施形態において、炭水化物抗原はＳＳＥＡ−４である。核酸は、本抗体又はこの抗原結合性部分を産生する細胞において発現されうる。

【0197】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性部分は、以下：
配列番号３（ハイブリドーマである２Ｃ２）；配列番号１３（ハイブリドーマである３Ｄ７）；配列番号２１（ハイブリドーマである７Ａ１１）；配列番号２９（ハイブリドーマである２Ｆ８）又は配列番号３７（ハイブリドーマである１Ｅ１）
のうちのいずれかと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、可変重鎖領域を含む。

【0198】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性部分は、以下：
配列番号４（ハイブリドーマである２Ｃ２）；配列番号１４（ハイブリドーマである３Ｄ７）；配列番号２２（ハイブリドーマである７Ａ１１）；配列番号３０（ハイブリドーマである２Ｆ８）又は配列番号３８（ハイブリドーマである１Ｅ１）
のうちのいずれかと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を含む、可変軽鎖領域を含む。

【0199】

本発明の一態様において、非修飾抗体又はこの抗原結合性部分は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号９１、９２及び９３に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。

【0200】

一部の実施形態において、非修飾抗体又はこの抗原結合性部分の重鎖可変領域は、（ｉ）重鎖の、リーダー配列と前記ＣＤＲ１との間に、配列番号９４と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワーク、（ｉｉ）重鎖の、前記ＣＤＲ１と前記ＣＤＲ２との間に、配列番号９５と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワーク又は（ｉｉｉ）重鎖の、前記ＣＤＲ２と前記ＣＤＲ３との間に、配列番号９６と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークから選択される、少なくとも１つのフレームワークをさらに含む。

【0201】

他の実施形態において、重鎖可変領域（配列番号９５）のフレームワーク２内のアミノ酸残基４６（又はフレームワーク２のＣ末端から６番目のアミノ酸残基）は、グリシンであり、置換されていない。配列番号９５のアミノ酸残基の位置は、下記において例示される。

【0202】

【表3】

【0203】

本発明の別の態様において、非修飾抗体又はこの抗原結合性部分は、軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号９７、９８及び９９に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。

【0204】

一部の実施形態において、非修飾抗体又はこの抗原結合性部分の軽鎖可変領域は、（ａ）軽鎖の、リーダー配列と前記ＣＤＲ１との間に、配列番号１００と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワーク、（ｂ）重鎖の、前記ＣＤＲ１と前記ＣＤＲ２との間に、配列番号１０１と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワーク又は（ｃ）軽鎖の、前記ＣＤＲ２と前記ＣＤＲ３との間に、配列番号１０２と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有するフレームワークから選択される、少なくとも１つのフレームワークをさらに含む。他の実施形態において、アミノ酸残基４５及び／又はアミノ酸残基４６が置換されていない条件下において、軽鎖（配列番号１０１）のフレームワーク２内のアミノ酸残基４５（又はフレームワーク２のＣ末端から４番目のアミノ酸残基）は、プロリンであり、かつ／又は軽鎖のフレームワーク２内のアミノ酸残基４６（又はフレームワーク２のＣ末端から３番目のアミノ酸残基）は、トリプトファンである。配列番号１０１のアミノ酸の位置は、下記において例示される。

【0205】

【表4】

【0206】

本発明の非修飾抗体はまた、腫瘍の炭水化物又はこの断片に結合するヒト化抗体も含む。一実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号１０３と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％若しくは約１００％相同であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は配列番号１０４と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％若しくは約１００％相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0207】

本発明の非修飾抗体はまた、腫瘍の炭水化物又はこの断片に結合するキメラ抗体も含む。一実施形態において、キメラ抗体は、配列番号１０５と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％若しくは約１００％相同であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は配列番号１０６と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％若しくは約１００％相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0208】

表２は、非修飾抗体の、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ及びＦＷのアミノ酸配列並びに修飾抗体の、１つの例示的な実施形態を示す。

【0209】

【表5】

【0210】

本記載及び当技術分野の教示に従い、一部の実施形態において、本発明の修飾抗体が、例えば、１つ以上のＣＤＲ内に、野生型の対応抗体と比較して、１つ以上の変更を含みうることが想定される。修飾抗体は、それらの非修飾野生型対応物と比較して、治療有用性に要求された実質的に同じ特徴を保持する。しかし、本明細書において記載された位置における、ある特定のアミノ酸残基の変更は、それが作出された非修飾野生型抗体と比較して、腫瘍関連炭水化物に対する結合アフィニティーが、改善又は最適化された修飾抗体を結果としてもたらすことが考えられる。一実施形態において、本発明の修飾抗体は、「アフィニティー成熟」抗体である。

【0211】

変更の、１つの種類は、野生型／非修飾抗体のＣＤＲの、１つ以上のアミノ酸残基を置換して、修飾抗体を作出することを伴う。このような修飾抗体は、ファージディスプレイベースのアフィニティー成熟法を使用して、簡便に作出されうる。略述すると、各部位において、全ての可能なアミノ酸置換を作出するように、いくつかの超可変領域部位（例えば、６つ〜７つの部位）に突然変異が導入される。このようにして作出された抗体は、線維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされた、ファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の、第ＩＩＩ遺伝子の産物）の、少なくとも一部の融合体として提示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、それらの生物学的活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる超可変領域部位を同定するために、抗原への結合に、著明に寄与する超可変領域残基を同定するように、走査突然変異誘発（例えば、アラニン走査）が実施されうる。代替的に、又は加えて、抗体と抗原との接触点を同定するように、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析することも有益でありうる。このような接触残基及び近傍残基は、本明細書において詳説された技法を含む、当技術分野において公知の技法に従う置換のための候補である。このような修飾抗体が作出されたら、変異体のパネルが、本明細書において記載された技法を含む、当技術分野において公知の技法を使用するスクリーニングにかけられ、１つ以上の、妥当なアッセイにおいて、優れた特性を伴う修飾抗体が、さらなる開発のために選択されうる。

【0212】

修飾抗体はまた、例えば、Ｍａｒｋｓら、１９９２（可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）のドメインシャッフリングによるアフィニティー成熟）又はＢａｒｂａｓら、１９９４；Ｓｈｉｅｒら、１９９５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５及びＨａｗｋｉｎｓら、１９９２（ＣＤＲ残基及び／又はフレームワーク残基の、ランダム突然変異誘発）により記載された方法によっても作製されうる。

【0213】

本発明の一態様において、本発明の修飾抗体又はこの抗原結合性部分は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号９１、９２及び９３に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；この場合、アミノ酸残基２８、３１、５７、６３又は１０５から選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基が、非修飾抗体内に存在するアミノ酸と異なる、別のアミノ酸により置換されており、これにより、非修飾抗体の結合アフィニティーを、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％又は約７００％増大させる。

【0214】

一実施形態において、修飾抗体の重鎖可変領域は、以下のアミノ酸置換：
（ａ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２８（セリン）が、中性アミノ酸が、セリン若しくは疎水性アミノ酸でないという条件下において、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、
（ｂ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３１（トレオニン）が、塩基性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、
（ｃ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５７（アスパラギン酸）が、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸若しくは疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、
（ｄ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基６３（プロリン）が、疎水性アミノ酸が、プロリンでないという条件下において、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸若しくは疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、又は
（ｅ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基１０５（アスパラギン酸）が、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸若しくは中性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換
のうちの少なくとも１つを含む。

【0215】

２０のアミノ酸は、その側鎖に従い、４つのクラス（塩基性、中性、疎水性及び酸性）へと分けられる。表３は、アミノ酸の４つのクラスを一覧する。

【0216】

【表6】

【0217】

実施形態は、重鎖領域内に、以下のアミノ酸置換：（ａ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２８（又はＣＤＲ１のＮ末端から３番目のアミノ酸残基）が、塩基性アミノ酸、セリン、グリシン若しくはグルタミン以外の中性アミノ酸、又はイソロイシン、ロイシン、メチオニン若しくはトリプトファン以外の疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、（ｂ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３１（又はＣＤＲ１のＮ末端から６番目のアミノ酸残基）が、ヒスチジン以外の塩基性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、（ｃ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５７（又はＣＤＲ２のＮ末端から６番目のアミノ酸残基）が、中性アミノ酸アスパラギン若しくはトレオニン以外の、塩基性アミノ酸又はイソロイシン、プロリン若しくはバリン以外の疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、（ｄ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基６３（又はＣＤＲ２のＣ末端から５番目のアミノ酸残基）が、アスパラギン、グルタミン若しくはトレオニン以外の中性アミノ酸、塩基性アミノ酸又はプロリン若しくはメチオニン以外の疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換又は（ｅ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基１０５（又はＣＤＲ３のＮ末端から６番目のアミノ酸残基）が、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸又はロイシン以外の疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを伴う、修飾抗体を含む。

【0218】

表４は、修飾抗体の、重鎖可変領域のアミノ酸置換の例を提示する。各置換について、第１の文字は、非修飾抗体のアミノ酸を指し示し、数は、Ｋａｂａｔによる番号付けスキームに従う位置を指し示し、第２の文字は、修飾抗体のアミノ酸を指し示す。例えば、アミノ酸残基２８におけるセリンは、リシン（Ｓ０２８Ｋ）又はアルギニン（Ｓ０２８Ｒ）、チロシン（Ｓ０２８Ｙ）、フェニルアラニン（Ｓ０２８Ｆ）により置換され、アミノ酸残基３１におけるトレオニンは、リシン（Ｔ０３１Ｋ）又はアルギニン（Ｔ０３１Ｒ）により置換され、アミノ酸残基５７におけるアスパラギン酸は、グリシン（Ｄ０５７Ｇ）、セリン（Ｄ５７Ｓ）、グルタミン（Ｄ０５７Ｑ）、ヒスチジン（Ｄ０５７Ｈ）又はトリプトファン（Ｄ５７Ｗ）により置換され、アミノ酸残基６３におけるプロリンは、ヒスチジン（Ｐ０６３Ｈ）、アルギニン（Ｐ０６３Ｒ）、チロシン（Ｐ０６３Ｙ）、アラニン（Ｐ０６３Ａ）、ロイシン（Ｐ０６３Ｌ）又はバリン（Ｐ０６３Ｖ）により置換され、アミノ酸残基１０５におけるアスパラギン酸は、アルギニン（Ｄ１０５Ｒ）、グリシン（Ｄ１０５Ｇ）、トレオニン（Ｄ１０５Ｔ）、メチオニン（Ｄ１０５Ｍ）、アラニン（Ｄ１０５Ａ）、イソロイシン（Ｄ１０５Ｉ）、リシン（Ｄ１０５Ｋ）又はバリン（Ｄ１０５Ｖ）により置換されている。

【0219】

【表7】

【0220】

本発明の別の態様において、本発明の修飾抗体又はこの抗原結合性部分は、軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号９７、９８及び９９に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；この場合、アミノ酸残基２４、３２、４９、５３又は９３から選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基が、非修飾抗体内に存在するアミノ酸と異なる、別のアミノ酸により置換されており、これにより、非修飾抗体の結合アフィニティーを、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％又は約７００％増大させる。

【0221】

一実施形態において、修飾抗体の軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸置換：
（ａ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２４（アルギニン）（又はＣＤＲ１のＮ末端から１番目のアミノ酸残基）が、中性アミノ酸若しくは疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、
（ｂ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３２（メチオニン）（又はＣＤＲ１のＣ末端から２番目のアミノ酸残基）が、疎水性アミノ酸がメチオニンでないという条件下において、中性アミノ酸若しくは疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、
（ｃ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基４９（アラニン）（又はＣＤＲ２のＮ末端から１番目のアミノ酸残基）が、中性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、
（ｄ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５３（ロイシン）（又はＣＤＲ２のＮ末端から５番目のアミノ酸残基）が、中性アミノ酸若しくは塩基性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、又は
（ｅ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基９３（アスパラギン）（又はＣＤＲ３のＮ末端から６番目のアミノ酸残基）が、中性アミノ酸が、アスパラギン、塩基性アミノ酸若しくは疎水性アミノ酸でないという条件下において、中性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換
のうちの少なくとも１つを含む。

【0222】

実施形態は、軽鎖領域内に、以下のアミノ酸置換：（ａ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２４が、トレオニン以外の中性アミノ酸又はメチオニン、プロリン若しくはバリン以外の疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、（ｂ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３２が、セリン若しくはトレオニン以外の中性アミノ酸又はメチオニン、ロイシン若しくはトリプトファン以外の疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、（ｃ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基４９が、それが、アスパラギン又はトレオニンでないという条件下において、中性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換、（ｄ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５３が、アスパラギン若しくはセリン以外の中性アミノ酸又はアルギニン以外の塩基性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換又は（ｅ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基９３が、中性アミノ酸がアスパラギンでないという条件下において、中性アミノ酸により、又は疎水性アミノ酸がバリンでないという条件下において、塩基性アミノ酸若しくは疎水性アミノ酸により置換された、アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを伴う、修飾抗体を含む。

【0223】

表５は、修飾抗体の、軽鎖可変領域のアミノ酸置換の例を提示する。例えば、Ｋａｂａｔによる番号付けスキームを使用すると、２４位におけるアミノ酸残基は、グリシン（Ｒ０２４Ｇ）、セリン（Ｒ０２４Ｓ）又はトリプトファン（Ｒ０２４Ｗ）により置換され、３２位におけるアミノ酸残基は、グリシン（Ｍ０３２Ｇ）、グルタミン（Ｍ０３２Ｑ）又はバリン（Ｍ０３２Ｖ）により置換され、４９位におけるアミノ酸残基は、グリシン（Ａ０４９Ｇ）により置換され、５３位におけるアミノ酸残基は、リシン（Ｌ０５３Ｋ）、グルタミン（Ｌ０５３Ｇ）又はトレオニン（Ｌ０５３Ｔ）により置換され、９３位におけるアミノ酸残基は、アルギニン（Ｎ０９３Ｒ）、グルタミン（Ｎ０９３Ｑ）、セリン（Ｎ０９３Ｓ）、トレオニン（Ｎ０９３Ｔ）、フェニルアラニン（Ｎ０９３Ｆ）、ロイシン（Ｎ０９３Ｌ）、メチオニン（Ｎ０９３Ｍ）により置換されている。

【0224】

【表8】

【0225】

一実施形態において、修飾抗体は、
（ａ）それぞれ、配列番号９１、９２及び９３に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、以下のアミノ酸置換：
（ｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２８が、リシン（Ｓ０２８Ｋ）、アルギニン（Ｓ０２８Ｒ）、チロシン（Ｓ０２８Ｙ）若しくはフェニルアラニン（Ｓ０２８Ｆ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３１が、リシン（Ｔ０３１Ｋ）若しくはアルギニン（Ｔ０３１Ｒ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５７が、ヒスチジン（Ｄ０５７Ｈ）、グリシン（Ｄ０５７Ｇ）、セリン（Ｄ０５７Ｓ）、グルタミン（Ｄ０５７Ｑ）若しくはトリプトファン（Ｄ０５７Ｗ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｖ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基６３が、ヒスチジン（Ｐ０６３Ｈ）、アルギニン（Ｐ０６３Ｒ）、チロシン（Ｐ０６３Ｙ）、アラニン（Ｐ０６３Ａ）、ロイシン（Ｐ０６３Ｌ）若しくはバリン（Ｐ０６３Ｖ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｖ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基１０５が、アルギニン（Ｄ１０５Ｒ）、グリシン（Ｄ１０５Ｇ）、トレオニン（Ｄ１０５Ｔ）、メチオニン（Ｄ１０５Ｍ）、アラニン（Ｄ１０５Ａ）、イソロイシン（Ｄ１０５Ｉ）、リシン（Ｄ１０５Ｋ）若しくはバリン（Ｄ１０５Ｖ）により置換された、アミノ酸置換
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域並びに／又は
（ｂ）それぞれ、配列番号９７、９８及び９９に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、以下のアミノ酸置換：
（ｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２４が、グリシン（Ｒ０２４Ｇ）、セリン（Ｒ０２４Ｓ）若しくはトリプトファン（Ｒ０２４Ｗ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３２が、グリシン（Ｍ０３２Ｇ）、グルタミン（Ｍ０３２Ｑ）若しくはバリン（Ｍ０３２Ｖ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基４９が、グリシン（Ａ０４９Ｇ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｖ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５３が、リシン（Ｌ０５３Ｋ）、グルタミン（Ｌ０５３Ｇ）又はトレオニン（Ｌ０５３Ｔ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｖ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基９３が、アルギニン（Ｎ０９３Ｒ）、グルタミン（Ｎ０９３Ｑ）、セリン（Ｎ０９３Ｓ）、トレオニン（Ｎ０９３Ｔ）、フェニルアラニン（Ｎ０９３Ｆ）、ロイシン（Ｎ０９３Ｌ）若しくはメチオニン（Ｎ０９３Ｍ）により置換された、アミノ酸置換
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。

【0226】

別の実施形態において、修飾抗体は、
（ａ）それぞれ、配列番号９１、９２及び９３に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、以下のアミノ酸置換：
（ｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２８が、アルギニン（Ｓ０２８Ｒ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３１が、アルギニン（Ｔ０３１Ｒ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５７が、グリシン（Ｄ０５７Ｇ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｖ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基６３が、チロシン（Ｐ０６３Ｙ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｖ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基１０５が、アルギニン（Ｄ１０５Ｒ）により置換された、アミノ酸置換
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域並びに／又は
（ｂ）それぞれ、配列番号９７、９８及び９９に明示されたアミノ酸配列と、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％相同であるアミノ酸配列を有する、３つのＣＤＲである、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、以下のアミノ酸置換：
（ｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基２４が、トリプトファン（Ｒ０２４Ｗ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉ）ＣＤＲ１内のアミノ酸残基３２が、グルタミン（Ｍ０３２Ｑ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基４９が、グリシン（Ａ０４９Ｇ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｉｖ）ＣＤＲ２内のアミノ酸残基５３が、リシン（Ｌ０５３Ｋ）により置換された、アミノ酸置換、
（ｖ）ＣＤＲ３内のアミノ酸残基９３が、アルギニン（Ｎ０９３Ｒ）により置換された、アミノ酸置換
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。

【0227】

＜組合せに適する、ＯＢＩ−８９８（ＳＳＥＡ−４抗体）の例についての記載＞
組合せについての、ある特定の実施形態において、抗体は、ＯＢＩ−８９８（抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体）である。例示的なＯＢＩ−８９８は、それらの内容が、参照によりその全体において組み込まれた、ＰＣＴ特許公開（ＷＯ２０１７１７２９９０Ａ１）、米国特許公開（ＵＳ２０１８３３９０６１Ａ１）、特許出願において記載されている通りである。

【0228】

広域スペクトルにわたるがんの診断及び処置における使用のためのマーカーへと方向付けられた、抗体法及び抗体組成物が提供される。抗ＳＳＥＡ−４抗体が開発され、本明細書において開示された。使用法は、限定せずに述べると、がん治療及び診断法を含む。本明細書において記載された抗体は、広域スペクトルにわたる、ＳＳＥＡ−４発現がん細胞に結合することが可能であり、これにより、がんの診断及び処置を容易とする。抗体によりターゲティングされうる細胞は、皮膚、血液、リンパ節、脳、肺、乳、口腔、食道、胃、肝臓、胆管、膵臓、結腸、腎臓、子宮頸部、卵巣、前立腺などにおける癌などの癌を含む。

【0229】

本開示の、例示的なＳＳＥＡ−４抗体及び結合性断片は、段階特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ−４）が、広域スペクトルにわたるがんにおいて多く発現されるが、正常細胞上においては発現されないという発見に基づく。ＳＳＥＡ−４を発現するがんは、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆管がん、肝がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、胃がん、結腸がん、鼻咽頭がん、腎がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍を含むがこれらに限定されない。

【0230】

一態様において、本開示は、ＳＳＥＡ−４に特異的な、抗体又はこの結合性断片を特色とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１に結合する。

【0231】

ある特定の態様において、本開示は、（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受託番号：ＰＴＡ−１２２６７９下において寄託された）１Ｊ１、（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７８下において寄託された）１Ｇ１、（ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ−１２２６７６下において寄託された）２Ｆ２０と名指されたハイブリドーマクローン並びにこれらから産生された抗体又は抗原結合性断片を提示する。

【0232】

一態様において、本開示は、配列番号１１１において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号１１２において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又は抗原結合性断片を提示する。一部の態様において、配列番号１１１において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。一部の態様において、配列番号１１２において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。

【0233】

ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、それぞれ、明示される通りの（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号１２１から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１２３から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１２５から選択されるＨ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３をさらに含み、それぞれ、（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号１１４から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号１１６から選択されるＬ−ＣＤＲ２及び
（ｖｉ）配列番号１１８から選択されるＬ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３を含む。

【0234】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、重鎖領域を含み、重鎖領域は、配列番号１２１、１２３又は１２５から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域は、配列番号１１４、１１６又は１１８から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、天然に存在する配列を除外する。ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、天然に存在する配列を含む。

【0235】

ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、それぞれ、明示される通りの（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号１２０から選択されるＨ−ＦＷ１；
（ｉｉ）配列番号１２２から選択されるＨ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１２４から選択されるＨ−ＦＷ３、
（ｉｖ）配列番号１２６から選択されるＨ−ＦＷ４
から選択される、Ｈ−ＦＷ１、Ｈ−ＦＷ２、Ｈ−ＦＷ３及びＨ−ＦＷ４をさらに含み、それぞれ、（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
（ｖ）配列番号１１３から選択されるＬ−ＦＷ１；
（ｖｉ）配列番号１１５から選択されるＬ−ＦＷ２；
（ｖｉｉ）配列番号１１７から選択されるＬ−ＦＷ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号１１９から選択されるＬ−ＦＷ４
から選択される、Ｌ−ＦＷ１、Ｌ−ＦＷ２、Ｌ−ＦＷ３及びＬ−ＦＷ４を含む。

【0236】

一態様において、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７９下において寄託された、１Ｊ１と名指されたハイブリドーマによって産生された抗体又はこの抗原結合性断片を提示する。

【0237】

一態様において、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７９下において寄託された、１Ｊ１と名指されたハイブリドーマを提示する。

【0238】

ある特定の態様において、本開示は、配列番号１２９において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号１３０において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又は抗原結合性断片を提示する。一部の態様において、配列番号１２９において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。一部の態様において、配列番号１３０において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された、軽鎖可変ドメイン（ＬＨ）のアミノ酸配列は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。

【0239】

ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、それぞれ、明示される通りの（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号１３９から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１４１から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１４３から選択されるＨ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３をさらに含み、それぞれ、（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号１３２から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号１３４から選択されるＬ−ＣＤＲ２及び
（ｖｉ）配列番号１３６から選択されるＬ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３を含む。

【0240】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、重鎖領域を含み、重鎖領域は、配列番号１３９、１４１又は１４３から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域は、配列番号１３２、１３４又は１３６から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。

【0241】

ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、それぞれ、明示される通りの（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号１３８から選択されるＨ−ＦＷ１；
（ｉｉ）配列番号１４０から選択されるＨ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１４２から選択されるＨ−ＦＷ３、
（ｉｖ）配列番号１４４から選択されるＨ−ＦＷ４
から選択される、Ｈ−ＦＷ１、Ｈ−ＦＷ２、Ｈ−ＦＷ３及びＨ−ＦＷ４をさらに含み、それぞれ、（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
（ｖ）配列番号１３１から選択されるＬ−ＦＷ１；
（ｖｉ）配列番号１３３から選択されるＬ−ＦＷ２；
（ｖｉｉ）配列番号１３５から選択されるＬ−ＦＷ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号１３７から選択されるＬ−ＦＷ４
から選択される、Ｌ−ＦＷ１、Ｌ−ＦＷ２、Ｌ−ＦＷ３及びＬ−ＦＷ４を含む。

【0242】

一態様において、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７８下において寄託された、１Ｇ１と名指されたハイブリドーマによって産生された抗体又はこの抗原結合性断片を提示する。

【0243】

一態様において、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７８下において寄託された、１Ｇ１と名指されたハイブリドーマを提示する。

【0244】

ある特定の態様において、本開示は、配列番号１４７において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号１４８において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又はこの抗原結合性断片を提示する。一部の態様において、配列番号１４７において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。一部の態様において、配列番号１４８において明示されたアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から構成された、軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。

【0245】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、それぞれ、明示される通りの（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号１５７から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５９から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６１から選択されるＨ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３をさらに含み、それぞれ、（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号１５０から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号１５２から選択されるＬ−ＣＤＲ２及び
（ｖｉ）配列番号１５４から選択されるＬ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、重鎖領域を含み、重鎖領域は、配列番号１５７、１５９又は１６１から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域は、配列番号１５０、１５２又は１５４から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。

【0246】

ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、それぞれ、明示される通りの（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）配列番号１５６から選択されるＨ−ＦＷ１；
（ｉｉ）配列番号１５８から選択されるＨ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６０から選択されるＨ−ＦＷ３、
（ｉｖ）配列番号１６２から選択されるＨ−ＦＷ４
から選択される、Ｈ−ＦＷ１、Ｈ−ＦＷ２、Ｈ−ＦＷ３及びＨ−ＦＷ４をさらに含み、それぞれ、（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）：
（ｖ）配列番号１４９から選択されるＬ−ＦＷ１；
（ｖｉ）配列番号１５１から選択されるＬ−ＦＷ２；
（ｖｉｉ）配列番号１５３から選択されるＬ−ＦＷ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号１５５から選択されるＬ−ＦＷ４
から選択される、Ｌ−ＦＷ１、Ｌ−ＦＷ２、Ｌ−ＦＷ３及びＬ−ＦＷ４を含む。

【0247】

一態様において、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７６下において寄託された、２Ｆ２０と名指されたハイブリドーマによって産生された抗体又はこの抗原結合性断片を提示する。

【0248】

一態様において、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７６下において寄託された、２Ｆ２０と名指されたハイブリドーマを提示する。

【0249】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、それぞれ、明示される通りの（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号１７５から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１７６から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１７７から選択されるＨ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３をさらに含み、それぞれ、（ｉｖ）〜（ｖｉ）：
（ｉｖ）配列番号１８０から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号１８１から選択されるＬ−ＣＤＲ２及び
（ｖｉ）配列番号１８２から選択されるＬ−ＣＤＲ３
から選択される、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、重鎖領域を含み、重鎖領域は、配列番号１７５、１７６又は１７７から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、軽鎖領域を含み、軽鎖領域は、配列番号１８０、１８１又は１８２から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも約８０％の相同性を有する、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体又は抗原結合性断片は、天然に存在する配列を含む、又はこれを除外する。

【0250】

ある特定の実施形態において、例示的な抗体又はこの抗原結合性断片は、１つ以上の炭水化物抗原に結合することが可能な可変ドメインを含む。

【0251】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、炭水化物抗原である、ＳＳＥＡ−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）（六糖であるＳＳＥＡ−４）をターゲティングする。

【0252】

ある特定の実施形態において、抗体又はこの抗原結合性断片は、
（ａ）全免疫グロブリン分子；
（ｂ）ｓｃＦｖ；
（ｃ）Ｆａｂ断片；
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）_２又は
（ｅ）ジスルフィド連結されたＦｖ
から選択される。

【0253】

ある特定の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。

【0254】

ある特定の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭである。

【0255】

一態様において、本開示は、抗体又は抗原結合性断片と；少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提示する。

【0256】

ある特定の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの、さらなる治療剤をさらに含む。

【0257】

一態様において、本開示は、がん細胞の増殖を阻害するための方法であって、有効量の、例示的な医薬組成物を、それを必要とする対象へと投与するステップを含み、がん細胞の増殖が阻害される方法を提示する。

【0258】

ある特定の実施形態において、本開示は、対象におけるがんを処置する方法を提示する。方法は、それを必要とする対象へと、本明細書において記載された、有効量の、例示的な抗体を投与するステップを含む。

【0259】

ある特定の実施形態において、がんは、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆管がん、肝がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、胃がん、結腸がん、鼻咽頭がん、腎がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍からなる群から選択される。

【0260】

一態様において、本開示は、対象におけるがんを病期分類するための方法であって、
（ａ）ＳＳＥＡ−４の発現を検出する１つ以上の抗体を、対象から得られた、細胞試料又は組織試料へと適用するステップ；
（ｂ）１つ以上の抗体の、細胞試料又は組織試料への結合についてアッセイするステップ；
（ｃ）結合を正常対照と比較して、対象におけるがんの存在を決定するステップ；及び
（ｄ）対応する抗体結合の、正常のベースライン指標と比較した相対レベルに基づき、病期を分類するステップ
を含む方法を提示する。

【0261】

＜ＳＳＥＡ−４をターゲティングする抗体＞
本開示の１つの態様は、ＳＳＥＡ−４関連抗原をターゲティングする、新たな抗体を特色とする。

【0262】

ｍＡｂである、１Ｊ１（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７９）とは、ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７９）により産生されたモノクローナル抗体である。本明細書において記載された抗体は、抗体である１Ｊ１と同じ、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含有しうる。１Ｊ１と同じエピトープに結合する抗体もまた、本開示の範囲内にある。

【0263】

例及びそれらのアミノ酸並びに核酸の構造／配列が、下記に提示される。

【0264】

【表9】

【0265】

ｍＡｂである、１Ｇ１（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７８）とは、ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７８）により産生された、マウスモノクローナル抗体である。本明細書において記載された抗体は、抗体である１Ｇ１と同じ、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含有しうる。１Ｇ１と同じエピトープに結合する抗体もまた、本開示の範囲内にある。

【0266】

例及びそれらのアミノ酸並びに核酸の構造／配列が、下記に提示される。

【0267】

【表10】

【0268】

ｍＡｂである、２Ｆ２０（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７６）とは、ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＰＴＡ−１２２６７６）により産生されたモノクローナル抗体である。本明細書において記載された抗体は、抗体である２Ｆ２０と同じ、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含有しうる。２Ｆ２０と同じエピトープに結合する抗体もまた、本開示の範囲内にある。

【0269】

例及びそれらのアミノ酸並びに核酸の構造／配列が、下記に提示される。

【0270】

【表11】

【0271】

ＳＳＥＡ−４ ８９８ヒト化クローンの例及びそれらのアミノ酸配列が、下記に提示される。

【0272】

【表12】

【0273】

本開示の１つの態様は、ＳＳＥＡ−４に特異的な、新たな抗体を特色とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（六糖であるＳＳＥＡ−４）に結合する。

【0274】

＜宿主動物の免疫化及びハイブリドーマ技術＞
一実施形態において、本明細書において記載された抗体のうちのいずれも、全長抗体の場合もあり、この抗原結合性断片の場合もある。一部の例において、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片又は単鎖Ｆｖ断片である。一部の例において、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片又は単鎖Ｆｖ断片である。一部の例において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は単鎖抗体である。

【0275】

本明細書において記載された抗体のうちのいずれも、（ａ）組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、二特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、ＩｇＧ_１抗体、ＩｇＧ_２抗体又は抗体の誘導体であること；（ｂ）ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、抗体の抗原結合性断片又は抗体の誘導体であること；（ｃ）単鎖抗体断片、マルチボディ、Ｆａｂ断片並びに／又はＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ及び／若しくはこれらのサブクラスの免疫グロブリンであること；（ｄ）以下の特徴：（ｉ）がん細胞のＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣを媒介すること；（ｉｉ）がん細胞のアポトーシスを誘導及び／若しくは促進すること；（ｉｉｉ）がん細胞の標的細胞の増殖を阻害すること；（ｉｖ）がん細胞の食作用を誘導及び／若しくは促進すること並びに／又は（ｖ）細胞傷害剤の放出を誘導及び／若しくは促進することのうちの１つ以上を有すること；（ｅ）腫瘍特異的炭水化物抗原である、腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合すること；（ｆ）非がん細胞上、非腫瘍細胞上、良性がん細胞上及び／又は良性腫瘍細胞上において発現される抗原に結合しないこと並びに／又は（ｇ）がん幹細胞上及び通常のがん細胞上において発現される腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合することのうちの１つ以上の特徴を有する。

【0276】

好ましくは、抗体の、それらのそれぞれの抗原への結合は、特異的である。「特異的」という用語は、一般に、結合対の、１つのメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子への著明な結合を示さず、例えば、本明細書において指定された分子以外の、他の任意の分子との交差反応性が、約３０％未満、好ましくは、２０％、１０％又は１％である状況を指すのに使用される。

【0277】

抗体は、その標的エピトープに、高アフィニティー（低ＫＤ値）により結合するのに適し、好ましくは、ＫＤは、ナノモル単位の範囲以下である。アフィニティーは、例えば、表面プラズモン共鳴など、当技術分野において公知の方法により測定されうる。

【0278】

＜例示的な抗体調製物＞
本明細書において記載された、グロボＨエピトープ及びＳＳＥＡ−４エピトープに結合することが可能な、例示的抗体は、当技術分野において公知である、任意の方法により作られうる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明は、炭水化物抗原（例えば、グロボＨ）に特異的に結合する抗体を発現するハイブリドーマを作るための方法を提供する。方法は、以下のステップ：動物を、炭水化物抗原（例えば、グロボＨ）を含む組成物により免疫化するステップ；脾臓細胞を、動物から単離するステップ；ハイブリドーマを、脾臓細胞から作出するステップ及びグロボＨに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するステップを含有する（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８）。

【0279】

一実施形態において、炭水化物抗原は、マウスを皮下免疫化するのに使用される。１回以上の追加投与が施される場合もあり、施されない場合もある。血漿中の抗体の力価は、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）又はフローサイトメトリーによりモニタリングされうる。十分な力価の抗炭水化物抗原抗体を伴うマウスは、融合のために使用される。マウスは、屠殺及び脾臓の摘出の３日前に、抗原を追加投与される場合もあり、されない場合もある。マウス脾臓細胞が単離され、ＰＥＧにより、マウス骨髄腫細胞系へと融合される。次いで、結果として得られるハイブリドーマが、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングされる。細胞が播種され、次いで、選択用培地中において、インキュベートされる。次いで、個々のウェルに由来する上清が、ＥＬＩＳＡにより、ヒト抗炭水化物抗原モノクローナル抗体についてスクリーニングされる。抗体を分泌するハイブリドーマが、再度繰り返してスクリーニングされ、抗炭水化物抗原抗体についてなおも陽性である場合、限界希釈によりサブクローニングされる。

【0280】

アジュバントは、炭水化物抗原のうちの１つ以上の免疫原性を増大させるのに使用されうる。アジュバントの非限定例は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．５％ｗ／ｖのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、＜０．５％ｗ／ｖのトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））、ＣｐＧ含有核酸、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、−ガラクトシル−セラミド又はこれらの合成類似体（例えば、Ｃ３４；ＵＳ８，２６８，９６９を参照されたい。）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．、６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４；Ｗ０９６／１１７１１；ＷＯ００／４８６３０；Ｗ０９８／３６７７２；ＷＯ００／４１７２０；ＷＯ０６／１３４４２３及びＷＯ０７／０２６１９０を参照されたい。）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子、ＱｕｉｌＡ、インターロイキン、フロイントアジュバント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰと称された、ＣＧＰ１１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと称された、ＣＧＰ１９８３５Ａ）及び、＜２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０エマルジョン中に、細菌から抽出された、３つの構成要素である、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸、細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する、ＲＩＢＩを含む。

【0281】

抗ＳＳＥＡ−４抗体に対する、例示的なポリクローナル抗体は、従来の任意の方法により、血清中の所望の抗体の増大について検討される免疫化哺乳動物から、血液を回収し、血液から、血清を分離することにより調製されうる。ポリクローナル抗体は、ポリクローナル抗体を含有する血清を含むほか、ポリクローナル抗体を含有する画分は、血清から単離されうる。

【0282】

ポリクローナル抗体は、一般に、宿主動物（例えば、ウサギ、マウス、ウマ又はヤギ）において、対象とする抗原及びアジュバントの、複数回にわたる皮下（ｓｃ）注射又は腹腔内（ｉｐ）注射により惹起される。二官能性薬剤又は誘導剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介するコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２などを使用して、対象とする抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤へとコンジュゲートすることは、有用でありうる。

【0283】

任意の哺乳動物が、所望の抗体を作製するための抗原により免疫化されうる。一般に、ロデンティア（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）目、ラゴモルファ（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）目又はプリマテス（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）目の動物が使用されうる。ロデンティア（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）目の動物は、例えば、マウス、ラット及びハムスターを含む。ラゴモルファ（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）目の動物は、例えば、ウサギを含む。プリマテス（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）目の動物は、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、ヒヒ及びチンパンジーなど、カタリニ（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）目のサル（旧世界ザル）を含む。

【0284】

当技術分野において、動物を抗原により免疫化するための方法が公知である。抗原の腹腔内注射又は皮下注射は、哺乳動物の免疫化のための標準的な方法である。より具体的に述べると、抗原を、適量のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中、生理食塩液中などにおいて希釈し、懸濁させることができる。所望の場合、抗原懸濁液は、フロイント完全アジュバントなど、適量の標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンへと作り、次いで、哺乳動物へと投与しうる。１ｍｇ又は１μｇのペプチド又はコンジュゲート（それぞれ、ウサギ用又はマウス用）を、３容量のフロイント不完全アジュバントと組み合わせることにより、動物を、抗原、免疫原性コンジュゲート又は免疫原性誘導体に対して免疫化する。

【0285】

力価がプラトーに達するまで、適量の、フロイント不完全アジュバントと混合された抗原を、４〜２１日ごと、複数回にわたり投与することにより、動物に追加投与しうる。フロイント完全アジュバント中に、元の量の５分の１〜１０分の１のペプチド又はコンジュゲートを、複数の部位における皮下注射することにより、動物に追加投与する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を、抗体力価についてアッセイする。免疫化のために、適切な担体もまた使用しうる。上記の通りの免疫化の後、血清を、標準的な方法により、所望の抗体量の増大について検討する。好ましくは、動物に、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質へと、かつ／又は異なる架橋試薬を介してコンジュゲートされたコンジュゲートを追加投与する。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養物中において、タンパク質融合体としても作ることができる。また、アラムなどの凝集剤も、免疫応答を増強するのに使用すると適切である。

【0286】

過去２０〜３０年間にわたり、ヒトへの、インビボにおける治療適用のためのキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を調製するための、多数の方法が開発されている。最もよく使用され、実績のある方法は、ハイブリドーマ法を使用して、マウスｍＡｂを調製し、次いで、ｍＡｂの、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのフレームワーク領域並びに定常ドメインを、ヒトの、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの、最も相同なヒトフレームワーク領域並びに所望のヒト免疫グロブリンのγアイソタイプ及びサブクラスの定常領域へと転換することにより、ｍＡｂをヒト化することである。臨床において使用されるＸｏｌａｉｒなど、多くのｍＡｂは、ヒトγ１サブクラス及びヒトκアイソタイプによる、ヒト化ｍＡｂであり、この方法を使用して調製される。

【0287】

ある特定の実施形態において、抗体は、従来のハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））により作製されうる。ハイブリドーマ法において、マウス又は、ハムスター若しくはウサギなど、他の適切な宿主動物は、本明細書の上記において記載された通りに、免疫化のために使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、又はこれらを産生することが可能なリンパ球を誘発するように免疫化される。代替的に、リンパ球は、インビトロにおいても免疫化されうる。

【0288】

モノクローナル抗体を調製するために、抗原により免疫化された哺乳動物から、免疫細胞が回収され、上記において記載された通り、血清中の、所望の抗体のレベルの上昇について点検され、細胞融合にかけられる。細胞融合のために使用される免疫細胞は、好ましくは、脾臓から得られる。上記の免疫細胞と融合される、他の好ましい親細胞は、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは、薬物による融合細胞の選択のために獲得された特性を有する骨髄腫細胞を含む。

【0289】

好ましい骨髄腫細胞は、融合が効率的であり、選択された抗体産生細胞による、安定的、かつ、高レベルの、抗体の産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性の骨髄腫細胞である。これらの中において、好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能な、ＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍並びにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、ＵＳＡから入手可能な、ＳＰ−２細胞に由来するマウス骨髄腫細胞系などのマウス骨髄腫細胞系である。また、ヒト骨髄腫細胞系及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の作製について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７））。

【0290】

上記の免疫細胞及び骨髄腫細胞は、公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎらによる方法（Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：３〜４６、１９８１）に従い融合されうる。ポリエチレングリコールなど適切な融合剤を使用して、リンパ球が骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。細胞融合により結果として得られたハイブリドーマは、それらを、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地）など、標準的な選択培地中において培養することにより選択されうる。細胞の培養は、典型的に、ＨＡＴ培地中において、数日間〜数週間にわたり持続され、所望のハイブリドーマ（非融合細胞）を除き、他の全ての細胞が死滅するのに十分な時間である。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニング及びクローニングするように、標準的な限界希釈が実施される。

【0291】

このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する、１つ以上の物質を、好ましくは含有する、適切な培養培地中に播種され、増殖させられる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素である、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。

【0292】

ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地が、抗原を指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイにより決定される。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び／又は免疫蛍光法における吸光度の測定は、本発明の抗体の抗原結合活性を測定するのに使用されうる。ＥＬＩＳＡにおいて、本発明の抗体を、プレート上に固定化し、本発明のタンパク質を、プレートへと適用し、次いで、抗体産生細胞の培養物上清又は精製抗体など、所望の抗体を含有する試料を適用する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄の後、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を、プレートへと添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。この方法において、Ｃ末端断片又はＮ末端断片など、タンパク質の断片が使用されうる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、本発明に従う抗体の活性を評価するのに使用されうる。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード解析により決定されうる。

【0293】

上記において記載された方法を含む従来の方法のうちのいずれかを適用して、本明細書において記載されたエピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が、さらなる特徴づけのために同定及び選択されうる。

【0294】

所望の特異性、アフィニティー及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ、標準法により増殖させられうる（Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。この目的に適する培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水又は血清から適切に分離される。

【0295】

加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍として、インビボにおいて増殖させられる場合もある。例えば、得られたハイブリドーマは、その後、マウスの腹腔へと移植される場合があり、腹水が採取される。

【0296】

得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡカラム若しくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー又は本発明のタンパク質がカップリングされたアフィニティーカラムにより精製されうる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質を精製及び検出するためだけでなく、また、本発明のタンパク質のアゴニスト及びアンタゴニストのための候補物質としても使用されうる。加えて、この抗体は、本発明のタンパク質と関連する疾患のための、抗体による処置へも適用されうる。

【0297】

＜組換え技術＞
このようにして得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子操作法を使用して、組換えにより調製される場合もある（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ Ｃ．Ａ．Ｋ．及びＬａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＬＴＤ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ刊、１９９０を参照されたい。）。抗体をコードするＤＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマ又は免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングされ、適切なベクターへと挿入され、組換え抗体を調製するように、宿主細胞へと導入されうる。本発明はまた、上記において記載された通りに調製された、組換え抗体物も提供する。

【0298】

得られた抗体が、ヒト体内へと投与される場合（抗体による処置）、免疫原性を低減するために、ヒト抗体又はヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物は、タンパク質、タンパク質発現細胞又はこれらの溶解物から選択される抗原により免疫化されうる。次いで、抗体産生細胞が、動物から回収され、骨髄腫細胞と融合され、タンパク質に対するヒト抗体が調製されうるハイブリドーマを得る。代替的に、抗体を産生する免疫化リンパ球などの免疫細胞は、がん遺伝子により不死化され、モノクローナル抗体を調製するために使用されうる。

【0299】

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離及びシーケンシングされうる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの、好ましい供給源として用いられる。単離されたら、ＤＮＡは、発現ベクター内へと入れられ、次いで、組換え宿主細胞内の、モノクローナル抗体の合成を得るように、Ｅ．コリ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はこれ以外に、免疫グロブリンタンパク質を産生しない、骨髄腫細胞などの宿主細胞へとトランスフェクトされる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：２５６〜２６２（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ、１３０：１５１〜１８８（１９９２）を含む。

【0300】

上記において記載されたハイブリドーマ細胞により産生される抗体をコードするＤＮＡは、遺伝子操作抗体を産生するように、常套的な技術を介して遺伝子改変されうる。ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体及び二特異性抗体などの遺伝子操作抗体は、例えば、従来の組換え技術を介して作製されうる。次いで、例えば、ヒト重鎖定常ドメイン及びヒト軽鎖定常ドメインをコードする配列により、相同なマウス配列を置換すること（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１）により、ＤＮＡが修飾される場合もあり、免疫グロブリンのコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部又は一部へと共有結合的に接合することにより修飾される場合もある。このようにして、標的抗原への結合特異性を有する、「キメラ」抗体又は「ハイブリッド」抗体などの遺伝子操作抗体が調製されうる。

【0301】

当技術分野において、「キメラ抗体」の作製のために開発された技法が周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、６０４及びＴａｋｅｄａら（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２を参照されたい。

【0302】

典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドが、抗体の定常ドメインにより置換され、又は抗体の１つの抗原結合性部位の可変ドメインにより置換され、別の抗原に対する特異性を有する、１つの抗原結合性部位及びそれとは異なる抗原結合性部位に対する特異性を有する、１つの抗原結合性部位を含むキメラ二価抗体が創出される。

【0303】

キメラ抗体又はハイブリッド抗体はまた、合成タンパク質化学において公知の方法であって、架橋剤を伴う方法を含む方法を使用して、インビトロにおいて調製されうる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して構築される場合もあり、チオエーテル結合を形成することにより構築される場合もある。この目的に適する試薬の例は、イミノチオレート（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｔｅ）及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートを含む。

【0304】

当技術分野において、非ヒト抗体をヒト化するための方法が周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された、１つ以上のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、これは、典型的に、「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒらによる方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従い、齧歯動物ＣＤＲ又は齧歯動物ＣＤＲ配列により、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより、本質的に実施されうる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来した、対応する配列により置換されている、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際、ヒト化抗体は、典型的に、一部のＣＤＲ残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の、類似の部位に由来する残基により置換されている、ヒト抗体である。

【0305】

ヒト化抗体を作るのに使用される、軽鎖及び重鎖両方の、ヒト可変ドメインの選出も、抗原性を低減するのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに照らしてスクリーニングされる。次いで、齧歯動物の配列に最も近接するヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定の亜群についての、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用されうる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））。

【0306】

抗原に対する高アフィニティー及び他の好適な生物学的特性を保持しつつ、抗体がヒト化されることは、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従い、親配列及びヒト化配列についての三次元モデルを使用する、親配列及び多様な概念上のヒト化産物についての解析工程により、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された、候補免疫グロブリン配列についての、蓋然的な三次元コンフォメーション構造を例示及び提示する、コンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示についての精査は、候補免疫グロブリン配列の機能化において可能性の高い、残基の役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析を可能とする。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基は、レシピエント配列及び移入配列から選択され、組み合わされうる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。

【0307】

代替的に、免疫化時に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することもできる。例えば、キメラ／生殖細胞系列突然変異マウスにおける、抗体重鎖接合領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合性の欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害を結果としてもたらすことについて記載されている。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの導入は、抗原投与時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーからも導出されうる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１））。

【0308】

また、本明細書において記載された、抗ＳＳＥＡ−４抗体（重鎖、軽鎖、又はこれらの両方を含む）をコードする核酸、核酸のうちの１つ以上を含む発現ベクターなどのベクター及びベクターのうちの１つ以上を含む宿主細胞のうちのいずれも、本開示の範囲内にある。一部の例において、ベクターは、本明細書において記載された、抗グロボＨ抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸を含む。一部の例において、ベクターは、本明細書において記載された、抗ＳＳＥＡ−４抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の例において、ベクターは、それらの発現が、単一のプロモーターにより制御される場合もあり、２つの個別のプロモーターにより制御される場合もある、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方をコードする、ヌクレオチド配列を含む。本明細書においてまた、例えば、本明細書において記載された、組換え技術を介して、本明細書において記載された、抗グロボＨ抗体及び抗ＳＳＥＡ−４抗体のうちのいずれかを作製するための方法も提示される。

【0309】

抗体を調製するための他の技術
ある特定の実施形態において、完全ヒト抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された、市販のマウスを使用することにより得られうる。また、より所望される免疫応答（例えば、完全ヒト抗体）又はよりロバストな免疫応答をもたらすようにデザインされたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体又はヒト抗体の作出のために使用されうる。このような技術の例は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）並びにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）及びＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。代替的に、抗体は、ファージディスプレイ技術を介して、組換えにより作製できる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号及び同第６，２６５，１５０号並びにＷｉｎｔｅｒら（１９９４）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５を参照されたい。代替的に、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３）は、インビトロにおいて、ヒト抗体及びヒト抗体断片を、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからもたらすのにも使用されうる。

【0310】

無傷抗体（すなわち全長抗体）の抗原結合性断片は、常套的な方法を介して調製されうる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、抗体分子のペプシン消化により作製される場合があり、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）_２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作出されうる。

【0311】

代替的に、本明細書において記載された、抗グロボＨ抗体及び抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）において記載されている技法を使用して作出された、抗体ファージライブラリー（例えば、単鎖抗体ファージライブラリー）からも単離されうる。その後の刊行物は、鎖シャッフリングによる高アフィニティー（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３（１９９２））のほか、極めて大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としての、コンビナトリアル感染及びインビボにおける組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２１：２２６５〜２２６６（１９９３））について記載している。こうして、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する、実行可能な代替法である。

【0312】

本明細書において記載された通りに得られた抗体は、均質となるまで精製されうる。例えば、抗体の分離及び精製は、一般のタンパク質のために使用される分離法及び精製法に従い実施されうる。例えば、抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動及び他の分離法及び精製法（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）であるがこれらに限定されない分離法及び精製法の、適切に選択され、組み合わされた使用により、分離及び単離されうる。上記の通りに得られた抗体の濃度は、吸光度の測定、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などにより決定されうる。アフィニティークロマトグラフィーを除く、例示的なクロマトグラフィーは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなど（「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６）を含む。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーにより実行されうる。

【0313】

抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して特徴づけられうる。例えば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること又は「エピトープマッピング」である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９の１１章において記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の分解、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ及び合成ペプチドベースのアッセイを含めて、エピトープの、タンパク質上の位置をマッピングし、特徴づけるための多くの方法が当技術分野において公知である。加えて、エピトープマッピングは、抗体が結合する配列を決定するのに使用されうる。エピトープは、直鎖状エピトープ（例えば、アミノ酸の単一の連なりの中に含有される直鎖状エピトープ）の場合もあり、単一の連なり（一次構造の直鎖状配列）の中に必ずしも含有されない可能性がある、アミノ酸の三次元的相互作用により形成される、コンフォメーショナルエピトープの場合もある。長さが変動するペプチド（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）が、単離又は合成され（例えば、組換えにより）、抗体を伴う結合アッセイのために使用されうる。別の例において、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することによる、体系的スクリーニングにおいて決定されうる。遺伝子断片発現アッセイに従い、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームが、ランダムに、又は特異的遺伝子構築により断片化され、発現された抗原の断片の、被験抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲにより作製され、次いで、放射性アミノ酸の存在下、インビトロにおいて、タンパク質へと転写及び翻訳されうる。次いで、抗体の、放射性標識された抗原断片への結合が、免疫沈降及びゲル電気泳動により決定される。ある特定のエピトープはまた、ファージ粒子の表面上において提示された、ランダムなペプチド配列の、大規模ライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによっても同定されうる。代替的に、重複ペプチド断片の規定されたライブラリーは、単純な結合アッセイにおいても、被験抗体への結合について調べられうる。

【0314】

さらなる例において、エピトープの結合に要求され、十分であり、かつ／又は必要な残基を同定するように、抗原結合性ドメインに対する突然変異誘発、ドメインスワッピング実験及びアラニン走査突然変異誘発が実施されうる。例えば、ドメインスワッピング実験は、標的抗原の突然変異体であって、候補抗体に対する結合エピトープ内の多様な残基が、近縁であるが、抗原的に顕著に異なるタンパク質（ニュートロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバーなど）に由来する配列により置換えられた（スワッピングされた）突然変異体を使用して実施されうる。抗体の、突然変異体の標的タンパク質への結合を評価することにより、特定の抗原断片の、抗体の結合に対する重要性が評価されうる。

【0315】

代替的に、抗体（例えば、本明細書において記載されたＭＣ４５抗体）が、他の抗体と同じエピトープに結合するのかどうかを決定するように、同じ抗原に結合することが公知である、他の抗体を使用しても、競合アッセイが実施されうる。競合アッセイは、当業者に周知である。

【0316】

例示的であり、適切な、一般的抗体作製法についてのさらなる態様
当技術分野において、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びにこれらの断片を、動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ又はウマ）において作る方法が周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）及びｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４）など、これらの断片を含む。

【0317】

本明細書において開示された組成物は、本開示を読んだ当業者に同定可能な、さらなる活性薬剤、担体、媒体、賦形剤又は補助剤と併せて、医薬組成物中に組み入れられうる。

【0318】

医薬組成物は、好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。このような医薬組成物中において、本明細書において開示された組成物は、「活性薬剤」ともまた称された、「活性化合物」を形成する。本明細書において使用された、「薬学的に許容される担体」という表現は、医薬の投与と適合性の、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。また、補助的な活性化合物も、組成物へと組み込まれうる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性となるように製剤化される。投与経路の例は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与及び直腸内投与を含む。非経口適用、皮内適用又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸又はリン酸などの緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースなど、張性を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基により調整されうる。非経口調製物は、アンプル内、ディスポーザブルのシリンジ内又はガラス製若しくはプラスチック製の、複数回投与用のバイアル内に封入されうる。

【0319】

少なくとも１つの抗ＳＳＥＡ−４抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体をコードする配列を含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある特定の実施形態において、組成物は、医薬組成物でありうる。本明細書において使用された組成物は、１つ以上のＳＳＥＡ−４に結合する１つ以上の抗体及び／又は１つ以上のＳＳＥＡ−４に結合する１つ以上の抗体をコードする配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野において周知の緩衝剤を含む、薬学的に許容される賦形剤など、適切な担体もさらに含みうる。

【0320】

一実施形態において、抗ＳＳＥＡ−４抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態において、抗ＳＳＥＡ−４抗体の断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片及びＦ（ａｂ’）_２断片）が提供される。これらの抗体断片は、酵素による消化など、従来の手段により創出される場合もあり、組換え技術により作出される場合もある。このような抗体断片は、キメラ抗体断片の場合もあり、ヒト化抗体断片の場合もあり、ヒト抗体断片の場合もある。これらの断片は、下記に示される診断目的及び治療目的に有用である。

【0321】

当技術分野において、目的の抗体が得られうる、ファージディスプレイライブラリーを作出するための、様々な方法が公知である。目的の抗体を作出する、１つの方法は、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４）、３４０（５）：１０７３〜９３において記載されている、ファージ抗体ライブラリーの使用を介する。

【0322】

本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つ以上の、所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製できる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質へと融合された、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）を提示するファージを含有する、ファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングされる。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現するクローンを、抗原へと吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを、抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに濃縮することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体のうちのいずれかは、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択するのに続き、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１）、１〜３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ−４抗体クローンを構築することにより得られうる。

【0323】

抗体の抗原結合性ドメインは、約１１０アミノ酸の、２つの可変（Ｖ）領域であって、１つずつが、軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖に由来し、いずれもが、３つの超可変ループ又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する、Ｖ領域から形成される。可変ドメインは、ＶＨとＶＬとが、短い可撓性ペプチドを介して共有結合的に連結された、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、ファージ上に機能的に提示される場合もあり、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）において記載される通り、それらが各々、定常ドメインへと融合され、非共有結合的に相互作用する、Ｆａｂ断片として、ファージ上に機能的に提示される場合もある。本明細書において使用された、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、まとめて、「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と称される。

【0324】

ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、個別にクローニングされ、ファージライブラリー内において、ランダムに組み換えられ、次いで、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）において記載されている通り、抗原結合性クローンについて検索されうる。免疫化供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要求せずに、免疫原に対する、高アフィニティー抗体を提示する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５〜７３４（１９９３）により記載される通り、免疫化を伴わずに、広範にわたる、非自己抗原に対するヒト抗体と、また自己抗原に対するヒト抗体とによる、単一の供給源をもたらすように、ナイーブレパートリーもクローニングされうる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１〜３８８（１９９２）により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロにおける再配列を達成することを介して、合成によっても作製できる。

【0325】

マイナーコートタンパク質である、ｐＩＩＩへの融合により、抗体断片を提示するのに、繊維状ファージが使用される。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）により記載されている通り、ＶＨドメインとＶＬドメインとが、同じポリペプチド鎖上において、可撓性のポリペプチドスペーサーにより接続された、単鎖Ｆｖ断片として提示される場合もあり、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１３３〜４１３７（１９９１）において記載されている通り、一方の鎖が、ｐＩＩＩへと融合され、他方の鎖が、細菌宿主細胞のペリプラズムへと分泌され、ここで、Ｆａｂ−コートタンパク質構造のアセンブリーが、野生型コートタンパク質の一部を置換することにより、ファージ表面上に提示される、Ｆａｂ断片として提示される場合もある。

【0326】

一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から採取された免疫細胞から得られる。抗ＳＳＥＡ−４クローンに好適なバイアスのかかったライブラリーが所望される場合、抗体応答を発生させ、脾臓細胞及び／若しくは循環Ｂ細胞又は他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、ライブラリー構築のために回収されるように、対象が、ＳＳＥＡ−４により免疫化される。一実施形態において、抗ヒトＳＳＥＡ−４クローンに好適なバイアスのかかったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、ＳＳＥＡ−４による免疫化が、ＳＳＥＡ−４に対するヒト抗体を産生するＢ細胞をもたらすように、機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを保有する（保有し、かつ、機能的な内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて、抗ヒトＳＳＥＡ−４抗体応答を発生させることにより得られる。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの作出については、下記に記載される。

【0327】

抗ＳＳＥＡ−４反応性細胞集団についてのさらなる濃縮は、ＳＳＥＡ−４特異的抗体を発現するＢ細胞を単離するのに適するスクリーニング手順であって、例えば、ＳＳＥＡ−４アフィニティークロマトグラフィーによる細胞の分離又は蛍光色素標識されたＳＳＥＡ−４への細胞の吸着に続く、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を介する手順を使用することにより得られうる。

【0328】

代替的に、非免疫化ドナーに由来する、脾臓細胞及び／若しくはＢ細胞又は他のＰＢＬの使用は、可能な抗体レパートリーの、より良好な表示をもたらし、また、ＳＳＥＡ−４が抗原性でない、任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を使用する、抗体ライブラリーの構築も可能とする。インビトロにおける抗体遺伝子の構築を組み込むライブラリーのために、再配列されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸をもたらすように、幹細胞が対象から採取される。目的の免疫細胞は、ヒト種、マウス種、ラット種、ウサギ目動物種、オオカミ科動物種、イヌ科動物種、ネコ科動物種、ブタ科動物種、ウシ科動物種、ウマ科動物種及び鳥類種など、様々な動物種から得られうる。

【0329】

抗体の可変遺伝子セグメント（ＶＨセグメント及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、目的の細胞から回収され、増幅される。再配列されたＶＨ遺伝子ライブラリー及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：３８３３〜３８３７（１９８９）において記載される通り、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを、リンパ球から単離するのに続き、再配列されたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子の５’端及び３’端にマッチするプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、これにより、発現のための、多様なＶ遺伝子レパートリーを作ることにより得られうる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）及びＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６（１９８９）において記載されている通り、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’端におけるバックプライマーと、Ｊセグメントに基づくフォワードプライマーとにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅されうる。しかしまた、ｃＤＮＡから増幅するために、バックプライマーが、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９：８８〜８９（１９９１）において記載されている通り、リーダーエクソンに基づき、フォワードプライマーが、Ｓａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：５７２８〜５７３２（１９８９）において記載されている通り、定常領域に基づく場合もある。相補性を最大化するため、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）又はＳａｓｔｒｙら（１９８９）において記載されている通り、プライマー内に縮重が組み込まれうる。ある特定の実施形態において、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）による方法において記載されている通り、又はＯｒｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：４４９１〜４４９８（１９９３）による方法において記載されている通り、免疫細胞の核酸試料中に存在する、全ての利用可能なＶＨ及びＶＬ構成を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーへとターゲティングされたＰＣＲプライマーを使用することにより、ライブラリーの多様性が最大化される。増幅されたＤＮＡを、発現ベクターへとクローニングするために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９）において記載されている通り、稀少な制限部位が、ＰＣＲプライマー内に、一方の端部におけるタグとして導入される場合もあり、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）において記載されている通り、タグ付けされたプライマーを伴う、さらなるＰＣＲ増幅により導入される場合もある。

【0330】

合成により再配列されたＶ遺伝子のレパートリーは、インビトロにおいて、Ｖ遺伝子セグメントから導出されうる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大半は、クローニング及びシーケンシングされ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８（１９９２）において報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｇｅｎｅｔ．、３：８８〜９４（１９９３）において報告されている）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１〜３８８（１９９２）において記載されている通り、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１ループ及びＨ２ループの全ての主要なコンフォメーションを含む）は、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーにより、多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作出するのに使用されうる。また、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７〜４４６１（１９９２）において記載される通り、単一の長さの、長いＨ３ループに焦点を当てた、全ての配列多様性を伴うＶＨレパートリーも作製できる。ヒトＶκセグメント及びヒトＶλセグメントは、クローニング及びシーケンシングされており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：１４５６〜１４６１（１９９３）において報告されている）、合成軽鎖レパートリーを作るのに使用されうる。ＶＨ及びＶＬのフォールドの範囲並びにＬ３及びＨ３の長さに基づく、合成によるＶ遺伝子レパートリーは、大幅な構造的多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅に続き、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１〜３８８（１９９２）による方法に従い、インビトロにおいて、生殖細胞系列のＶ遺伝子セグメントが再配列されうる。

【0331】

抗体断片のレパートリーは、ＶＨ遺伝子レパートリーと、ＶＬ遺伝子レパートリーとを、いくつかの方式により、一体に組み合わせることにより構築されうる。各レパートリーは、異なるベクター内において創出される場合があり、ベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｇｅｎｅ、１２８：１１９〜１２６（１９９３）において記載されている通り、インビトロにおいて組み換えられる場合もあり、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：２２６５〜２２６６（１９９３）において記載されている通り、インビボにおいて、コンビナトリアル感染、例えば、ｌｏｘＰ系により組み換えられる場合もある。インビボにおける組換え法は、Ｆａｂ断片の２本鎖としての性質を利用して、Ｅ．コリの形質転換効率により付与される、ライブラリーサイズに対する制限を克服する。ナイーブＶＨレパートリーと、ナイーブＶＬレパートリーとは、一方はファージミドへ、他方はファージベクターへと、個別にクローニングされる。次いで、各細胞が、異なる組合せを含有し、ライブラリーサイズが、存在する細胞の数（クローン約１０^１２個）だけにより制限されるように、２つのライブラリーが、ファージミド含有細菌へのファージ感染により組み合わされる。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子が、単一のレプリコンへと組み換えられ、ファージビリオンへと共パッケージングされるように、いずれのベクターも、インビボにおける組換えシグナルを含有する。これらの巨大ライブラリーは、アフィニティーの良好な、多数の、多様な抗体を提供する。

【0332】

代替的に、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８〜７９８２（１９９１）において記載されている通り、同じベクターへと逐次的にクローニングされる場合もあり、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）において記載されている通り、ＰＣＲにより一体にアセンブルされ、次いで、クローニングされる場合もある。ＰＣＲアセンブリーはまた、ＶＨ ＤＮＡと、ＶＬ ＤＮＡとを、可撓性のペプチドスペーサーをコードするＤＮＡにより接合して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するのにも使用されうる。さらに別の技法において、Ｅｍｂｌｅｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：３８３１〜３８３７（１９９２）において記載されている通り、「細胞内ＰＣＲアセンブリー」も、ＶＨ遺伝子と、ＶＬ遺伝子とを、リンパ球内において、ＰＣＲにより組み合わせ、次いで、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングするのに使用される。

【0333】

ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野において公知の、任意の技法により達成されうる。例えば、ＳＳＥＡ−４標的は、吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートへと固定された宿主細胞上において発現させるのに使用される場合もあり、細胞分取において使用される場合もあり、ストレプトアビジンコーティングビーズによる捕捉のために、ビオチンへとコンジュゲートされる場合もあり、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための、当技術分野において公知の、他の任意の方法において使用される場合もある。

【0334】

ファージライブラリー試料は、ファージ粒子のうちの少なくとも一部の、吸着材との結合に適する条件下において、固定化されたＳＳＥＡ−４と接触される。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合したファージは、洗浄され、次いで、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８〜７９８２（１９９１）において記載されている通り、酸により溶出させる、又は、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）において記載されている通り、アルカリにより溶出させる、又は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）による抗原競合法と類似の手順における、ＳＳＥＡ−４３／抗原の競合により溶出される。ファージは、単一ラウンドの選択において、２０〜１，０００倍に濃縮されうる。さらに、濃縮されたファージは、細菌培養物中において増殖させられ、さらなるラウンドの選択にかけられうる。

【0335】

選択の効率は、洗浄時における解離反応速度及び単一のファージ上の複数の抗体断片が、同時に、抗原とエンゲージメントしうるのかどうかを含む、多くの因子に依存する。解離反応速度が大きな（かつ、結合アフィニティーが小さな）抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相内の抗原の、高コーティング密度を使用することにより保持されうる。高密度は、多価相互作用を介してファージを安定化させるだけでなく、解離したファージの再結合に好適でもある。解離反応速度が小さな（かつ、結合アフィニティーが良好な）抗体の選択は、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：３０９〜３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０において記載されている、長い洗浄及び一価ファージディスプレイ並びにＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９〜７８３（１９９２）において記載されている、抗原の、低コーティング密度を使用することにより促進されうる。

【0336】

ＳＳＥＡ−４に対するアフィニティーがわずかに異なっていてもなお、アフィニティーの異なるファージ抗体の間において選択することが可能である。しかし、選択された抗体のランダム突然変異（例えば、上記において記載されたアフィニティー成熟法の一部において実施される）は、多くの突然変異体であって、大半が抗原に結合し、少数が高アフィニティーにより結合する突然変異体をもたらす可能性が高い。ＳＳＥＡ−４が限定量の場合、最高度のアフィニティーのファージも、競合に耐えない場合がある。全ての高アフィニティー突然変異体を保持するため、ファージは、過剰量のビオチニル化ＳＳＥＡ−４と共にインキュベートされうるが、ＳＳＥＡ−４の、目標となるモルアフィニティー定数より低いモル濃度のビオチニル化ＳＳＥＡ−４と共にインキュベートされる場合もある。次いで、高アフィニティーの結合性ファージは、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズにより捕捉されうる。このような「平衡捕捉」は、それらの結合アフィニティーに従い、アフィニティーがわずか２倍の、突然変異体クローンの、低アフィニティーであり、極過剰量のファージからの単離を可能とする感度により、抗体を選択することを可能とする。また、固相に結合したファージの洗浄において使用される条件も、解離反応速度に基づき区別するように操作されうる。

【0337】

抗ＳＳＥＡ−４クローンは、選択されうる。一実施形態において、本発明は、ＳＳＥＡ−４リガンドと、ＳＳＥＡ−４との結合は遮断するが、ＳＳＥＡ−４リガンドと、第２のタンパク質との結合は遮断しない、抗ＳＳＥＡ−４抗体を提供する。このような抗ＳＳＥＡ−４抗体に対応するＦｖクローンは、（１）抗ＳＳＥＡ−４クローンを、上記のＢ（Ｉ）（２）節において記載されたファージライブラリーから単離し、集団を、適切な細菌宿主内において増殖させることを介して、単離されたファージクローン集団を、任意選択的に増幅し；（２）それらに対する遮断活性及び非遮断活性のそれぞれが所望される、ＳＳＥＡ−４及び第２のタンパク質を選択し；（３）抗ＳＳＥＡ−４ファージクローンを、固定化されたＳＳＥＡ−４へと吸着させ；（４）過剰量の第２のタンパク質を使用して、任意の所望されないクローンであって、第２のタンパク質の結合決定基と重複する、又は共有される、ＳＳＥＡ−４の結合決定基を認識するクローンを溶出させ；（５）ステップ（４）に続き、吸着を維持したクローンを溶出させることにより選択されうる。任意選択的に、本明細書において記載された選択手順を、１回以上にわたり繰り返すことにより、所望の遮断／非遮断特性を伴うクローンが、さらに濃縮されうる。

【0338】

本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型から、重鎖及び軽鎖の、目的のコード領域を特異的に増幅するようにデザインされた、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）、たやすく単離及びシーケンシングされる。単離されたら、ＤＮＡは、発現ベクター内に入れられ、次いで、組換え宿主細胞内の、所望のモノクローナル抗体の合成を得るように、Ｅ．コリ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は、これ以外に、免疫グロブリンタンパク質を産生しない、骨髄腫細胞などの宿主細胞へとトランスフェクトされる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：２５６（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ、１３０：１５１（１９９２）を含む。

【0339】

本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、全長重鎖及び／若しくは全長軽鎖又は部分長重鎖及び／若しくは部分長軽鎖をコードするクローンを形成するように、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をコードする、公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列は、Ｋａｂａｔら、前出から得られうる）と組み合わされうる。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域及びＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域が、この目的のために使用される場合があり、このような定常領域が、任意のヒト種又は動物種から得られうることが理解される。１つの動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡに由来し、次いで、「ハイブリッド」の全長重鎖及び／又は全長軽鎖のためのコード配列を形成するように、別の動物種の定常領域ＤＮＡへと融合されたＦｖクローンは、本明細書において使用された、「キメラ」抗体及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。一実施形態において、全てのヒト全長重鎖及び／若しくはヒト全長軽鎖又はヒト部分長重鎖及び／若しくはヒト部分長軽鎖のコード配列を形成するように、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンが、ヒト定常領域ＤＮＡへと融合される。

【0340】

ナイーブライブラリーによりもたらされた抗体（天然又は合成）は、中程度のアフィニティーの抗体でありうるが、また、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、前出において記載されている通り、アフィニティー成熟も、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することにより、インビトロにおいて模倣されうる。一部の態様において、抗体は、天然に存在する抗体配列を除外しうる。一部の態様において、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１：１１〜１５（１９８９）において報告されている）を、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６（１９９２）による方法又はＧｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３５７６〜３５８０（１９９２）による方法において使用することにより、突然変異は、インビトロにおいて、ランダムに導入されうる。加えて、アフィニティー成熟は、例えば、目的のＣＤＲにわたり、ランダムな配列を保有するプライマーを伴うＰＣＲを、選択された個別のＦｖクローン内において使用して、１つ以上のＣＤＲにランダムに突然変異を導入し、高アフィニティークローンについてスクリーニングすることによっても実施されうる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日に公開された）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域内において突然変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の効果的な手法は、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９〜７８３（１９９２）において記載されている通り、非免疫化ドナーから得られた、天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーを伴うファージディスプレイにより選択されたＶＨドメイン又はＶＬドメインを組み換え、数ラウンドにわたる鎖リシャッフリングにおいて、高アフィニティーについてスクリーニングすることである。この技法は、アフィニティーが１０^−９Ｍの範囲の抗体及び抗体断片の作製を可能とする。

【0341】

抗ＳＳＥＡ−４抗体を作出する、他の方法
当技術分野において、抗体のアフィニティーを発生させ、評価する、他の方法が周知であり、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）；米国特許第４，８１６，５６７号；Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）；Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）；Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８：７１６〜７３４（１９８９）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：３９０１（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４４（１９７６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）において記載されている。

【0342】

一般的な方法
一般に、本発明は、アフィニティー成熟ＳＳＥＡ−４抗体を提供する。これらの抗体は、ＳＳＥＡ−４に対するアフィニティー及び特異性を増大させている。このアフィニティー及び感受性の増大は、本発明の分子が、（ａ）本発明の分子の感受性の増大及び／又は（ｂ）本発明の分子による、ＳＳＥＡ−４への緊密な結合により利益を与えられる適用及び方法のために使用されることを可能とする。

【0343】

一実施形態において、ＳＳＥＡ−４抗体は、１つ以上のＳＳＥＡ−４活性の部分的又は全面的な遮断が所望される、ＳＳＥＡ−４媒介性障害の処置に有用である。一実施形態において、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、がんを処置するのに使用される。

【0344】

本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、質量分析又は遺伝子操作を必要とせずに、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ又は免疫顕微鏡法など、簡略かつ常套的な生体分子アッセイにおける、エピトープの、高感度かつ特異的な検出を可能とする。次に、これは、これらの経路の正常な機能の観察及び解明、経路の機能が異常な場合の検出のいずれにおいても、著明な利点を提供する。

【0345】

本発明のＳＳＥＡ−４抗体はまた、疾患の発症及び発症機序における役割を決定するのにも使用されうる。例えば、上記において記載された通り、本発明のＳＳＥＡ−４抗体を使用して、１つ以上の疾患状態と相関させることができるＴＡＣＡが、、正常において、一過性に発現されるのかどうかを決定するのに使用されうる。

【0346】

本発明のＳＳＥＡ−４抗体は、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体が特異的ではない、ＳＳＥＡ−４の正常な活性には干渉せずに、１つ以上のＳＳＥＡ−４の調節が異常である、又は機能が異常である疾患を処置するのに、さらに使用されうる。

【0347】

別の態様において、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、多様な細胞型内及び組織内のがん状態を検出するための試薬としても有用である。

【0348】

さらに別の態様において、本抗ＳＳＥＡ−４抗体は、活性遮断パターンが、本発明の対象の抗体の活性遮断パターンと類似する、ＳＳＥＡ−４アンタゴニストを開発するのに有用である。例えば、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、同じ、ＳＳＥＡ−４への結合特徴及び／又はＳＳＥＡ−４経路の遮断能を有する、他の抗体を決定及び同定するのに使用されうる。

【0349】

さらなる例として述べると、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、本明細書において例示された抗体と実質的に同じ、ＳＳＥＡ−４の抗原決定基であって、直鎖状エピトープ及びコンフォメーションエピトープを含む抗原決定基に結合する、他の抗ＳＳＥＡ−４抗体を同定するのに使用されうる。

【0350】

本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ＳＳＥＡ−４が関与する生理学的経路に基づくアッセイであって、１つ以上の結合パートナーの、ＳＳＥＡ−４への結合を遮断するのに、抗体と同様の薬理学的効果を呈する、ＳＳＥＡ−４の低分子アンタゴニストについてスクリーニングするアッセイにおいて使用されうる。

【0351】

抗体の作出は、当技術分野における、常套的な技術であって、ハイブリドーマ法及び結合剤分子についてのファージディスプレイライブラリーのスクリーニングなど、本明細書において記載された技術を含む技術を使用して達成されうる。当技術分野において、これらの方法は、十分に確立されている。

【0352】

略述すると、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つ以上の所望の活性を伴う、合成の抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製できる。原則として、合成の抗体クローンは、ファージコートタンパク質へと融合された、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）を提示するファージを含有する、ファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングされる。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現するクローンを、抗原へと吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを、抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに濃縮することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体のうちのいずれかは、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択するのに続き、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１）、１〜３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ−４抗体クローンを構築することにより得られうる。

【0353】

一実施形態において、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、モノクローナル抗体である。また、本発明の範囲内に、本明細書において提示された、抗ＳＳＥＡ−４抗体の抗体断片であって、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片及びＦ（ａｂ’）_２断片並びにこれらの変化形などの抗体断片も包含される。これらの抗体断片は、酵素による消化など、従来の手段により創出される場合もあり、組換え技術により作出される場合もある。このような抗体断片は、キメラ抗体断片の場合もあり、ヒト抗体断片の場合もあり、ヒト化抗体断片の場合もある。これらの断片は、本明細書に明示された、実験目的、診断目的及び治療目的に有用である。

【0354】

モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られうる、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量において存在しうる、可能な天然に存在する突然変異を除き、同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物でないものとしての、抗体の特性を指し示す。

【0355】

本発明の抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の様々な方法であって、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により初めて記載されたハイブリドーマ法を含む方法を使用して作製される場合もあり、代替的に、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）により作製される場合もある。

【0356】

ベクター、宿主細胞及び組換え技術
本発明の抗体の、組換えによる作製のために、本発明の抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクターへと挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離及びシーケンシングされる。多くのベクターが、利用可能である。ベクターの選出しは、使用される宿主細胞に部分的に依存する。宿主細胞は、原核生物由来の細胞又は真核生物（一般に、哺乳動物）由来の細胞を含むがこれらに限定されない。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域及びＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域が、この目的のために使用される場合があり、このような定常領域が、任意のヒト種又は動物種から得られうることが理解される。

【0357】

原核宿主細胞を使用する抗体の作出
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得られうる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離及びシーケンシングされうる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器又はＰＣＲ法を使用しても合成されうる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列は、原核宿主内において異種ポリヌクレオチドを複製し、発現させることが可能な、組換えベクターへと挿入される。当技術分野において利用可能であり、公知である、多くのベクターは、本発明の目的のために使用されうる。適切なベクターの選択は、ベクターへと挿入される核酸のサイズ及びベクターにより形質転換される、特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現又はこれらの両方）及びそれが宿る、特定の宿主細胞に対するその適合性に応じて、多様な構成要素を含有する。ベクターの構成要素は、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート及び転写終結配列を含むがこれらに限定されない。

【0358】

一般に、レプリコンと、宿主細胞に適合性の種に由来する制御配列とを含有するプラスミドベクターは、これらの宿主との関係において使用されうる。ベクターは通常、複製部位のほか、形質転換細胞内の、表現型による選択をもたらすことが可能な、マーキング配列も保有する。例えば、Ｅ．コリは、典型的に、Ｅ．コリ種に由来するプラスミドである、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、これにより、形質転換細胞を同定するための、容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物性プラスミド若しくはバクテリオファージはまた、微生物により、内因性タンパク質を発現させるために使用されうるプロモーターを含有する場合もあり、これを含有するように修飾される場合もある。特定の抗体を発現させるために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例については、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２３７号において詳細に記載されている。

【0359】

加えて、レプリコンと、宿主微生物に適合性の制御配列とを含有するファージベクターも、形質転換ベクターとして、これらの宿主との関係において使用されうる。例えば、λＧＥＭ（商標）１１などのバクテリオファージは、Ｅ．コリＬＥ３９２など、易感染性の宿主細胞を形質転換するのに使用されうる、組換えベクターを作るのに利用されうる。

【0360】

本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする、２つ以上のプロモーター−シストロン対を含みうる。プロモーターとは、その発現をモジュレートするように、シストロンに対して上流（５’側）に位置させた、非翻訳の調節配列である。原核生物のプロモーターは、典型的に、誘導可能なプロモーター及び構成的プロモーターの、２つのクラスへと分けられる。誘導可能なプロモーターとは、培養条件の変化、例えば、栄養物質の存在若しくは非存在又は温度の変化に応答して、シストロンの転写レベルの上昇を、その制御下において誘発するプロモーターである。

【0361】

様々な潜在的宿主細胞により認識される、多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素による消化を介して、供給源ＤＮＡから、プロモーターを取り出し、単離されたプロモーター配列を、本発明のベクターへと挿入することにより、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結されうる。天然のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方が、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を方向付けるのに使用されうる。ある特定の実施形態において、異種プロモーターは、一般に、天然の標的ポリペプチドのプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子の転写の増大及び収率の上昇を可能とするので利用される。

【0362】

原核宿主を伴う使用に適するプロモーターは、しかし、細菌内におけるＰｈｏＡプロモーター（他の公知の細菌プロモーター又はファージプロモーターなど）も同様に適する。それらのヌクレオチド配列は公表されており、これにより、当業者が、要求された、任意の制限部位をもたらす、リンカー又はアダプターを使用して、それらを、標的軽鎖及び標的重鎖をコードするシストロンへと、作動可能にライゲーションすることを可能とする（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０）、Ｃｅｌｌ、２０：２６９）。

【0363】

本発明の一態様において、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの、膜を隔てた移行を方向付ける、分泌シグナル配列の構成要素を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素の場合もあり、ベクターへと挿入された標的ポリペプチドＤＮＡの部分の場合もある。本発明の目的のために選択されたシグナル配列は、宿主細胞により認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）シグナル配列であるものとする。異種ポリペプチドに対して、天然のシグナル配列を認識及びプロセシングしない、原核宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物のシグナル配列により置換される。本発明の一実施形態において、発現系の、両方のシストロンにおいて使用されたシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列又はこの変異体である。

【0364】

本発明に従う免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質内において生じることが可能であり、したがって、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を要求しない。この点において、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、細胞質内において、機能的な免疫グロブリンを形成するように、発現され、フォールディングされ、アセンブルされる。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．コリｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合の形成に好適な細胞質条件を提供し、これにより、発現されたタンパク質サブユニットの、適正なフォールディング及びアセンブリーを可能とする（Ｐｒｏｂａ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｇｅｎｅ、１５９：２０３（１９９５））。

【0365】

本発明の抗体はまた、分泌され、適正にアセンブルされた、本発明の抗体の収率を最大化するために、発現されるポリペプチド構成要素の定量比がモジュレートされうる発現系を使用することによっても作製されうる。このようなモジュレーションは、ポリペプチド構成要素について、翻訳強度を同時にモジュレートすることにより、少なくとも部分的に達成される。

【0366】

翻訳強度をモジュレートするための１つの技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において開示されている。この技法は、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲについて、翻訳強度が、ある範囲にある、一連のアミノ酸配列変異体又は核酸配列変異体が創出され、これにより、特異的な鎖の所望の発現レベルについて、この因子を調整するための、簡便な手段をもたらしうる。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を変更しうる、コドン変化を結果としてもたらす、従来の突然変異誘発法により作出されうる。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列の変化は、サイレントである。ＴＩＲ内の変更は、例えば、シグナル配列の変更と共に、シャイン−ダルガーノ配列の数又は間隔の変更を含みうる。突然変異体のシグナル配列を作出するための１つの方法は、コード配列の起始部における「コドンバンク」であって、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）「コドンバンク」の作出である。これは、各コドンの３番目のヌクレオチド位置を変化させることにより達成されうるが；加えて、ロイシン、セリン及びアルギニンなど、一部のアミノ酸は、複数の、第１の位置及び第２の位置を有し、これが、バンクを作るのに複雑性を付加しうる。突然変異誘発のこの方法については、Ｙａｎｓｕｒａら（１９９２年）、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４：１５１〜１５８において詳細に記載されている。

【0367】

一実施形態において、その中の各シストロンのＴＩＲ強度が、ある範囲にあるベクターのセットが作出される。この限定的なセットは、各鎖の発現レベルについての比較のほか、多様なＴＩＲ強度の組合せの下における、所望の抗体産物の収率についての比較も提供する。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において詳細に記載されている通り、レポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定されうる。翻訳強度の比較に基づき、所望の個々のＴＩＲは、本発明の発現ベクター構築物内において組み合わされるように選択される。

【0368】

本発明の抗体を発現させるのに適する原核宿主細胞は、古細菌及びグラム陰性菌又はグラム陽性菌などの真正細菌を含む。有用な細菌の例は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、Ｅ．コリ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｂ．スブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）属種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））種、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、リゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）属、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）属、又はパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属を含む。一実施形態において、グラム陰性菌細胞が使用される。一実施形態において、Ｅ．コリ細胞が、本発明のための宿主として使用される。Ｅ．コリ株の例は、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７）、１１９０〜１２１９頁；ＡＴＣＣ受託番号：２７，３２５）及び、遺伝子型Ｗ３１１０を有する３３Ｄ３株を含むその派生株を含む。Ｅ．コリ２９４（ＡＴＣＣ：３１，４４６）、Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＲＶ３０８（ＡＴＣＣ：３１，６０８）などもまた適する。これらの例は、限定的なものでなく、例示的なものである。当技術分野において、上述の細菌のうちのいずれかの派生株であって、規定された遺伝子型を有する派生株を構築するための方法が公知であり、例えば、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：３０９〜３１４（１９９０）において記載されている。一般に、細菌による、細胞内のレプリコンの複製能力を検討して、適切な細菌を選択することが必要である。例えば、Ｅ．コリ、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属種又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属種は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０など、周知のプラスミドがレプリコンをもたらすのに使用される場合に、宿主として使用されるのに適しうる。典型的に、宿主細胞は、最小量のタンパク分解酵素を分泌するものとし、さらなるプロテアーゼ阻害剤が、細胞培養物中に組み込まれうることが所望される。

【0369】

抗体の作製
宿主細胞は、上記において記載された発現ベクターにより形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換細胞を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養物質培地中において培養される。

【0370】

形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外エレメントとして、又は染色体への組込みにより複製可能となるように、ＤＮＡを、原核宿主へと導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に適切な標準的技法を使用してなされる。細胞壁による実質的な障壁を含有する細菌細胞のために、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、一般に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用される、さらに別の技法は、電気穿孔である。

【0371】

本発明のポリペプチドを作製するのに使用される原核細胞は、当技術分野において公知であり、選択された宿主細胞の培養に適する、培地中において増殖させられる。適切な培地（ｍｅｄｉａ）の例は、必要な栄養補充物質を加えた、ルリア培地（ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）を含む。ある特定の実施形態において、培地（ｍｅｄｉａ）はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を、選択的に可能とするように、発現ベクターの構築に基づき選び出される、選択用薬剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を増殖させるために、アンピシリンが、培地へと添加される。

【0372】

炭素供給源、窒素供給源及び無機リン酸供給源のほかに、また、任意の必要な補充物質も、適切な濃度において、単独で、又は複合窒素供給源など、別の補充物質又は培地との混合物として導入する形で含まれる。任意選択的に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される、１つ以上の還元剤を含有しうる。

【0373】

原核宿主細胞は、適切な温度において培養される。Ｅ．コリを増殖させるために、例えば、増殖は、約２０℃〜約３９℃、約２５℃〜約３７℃及び約３０℃を含むがこれらに限定されない温度範囲においてなされる。培地のｐＨは、主に、宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の、任意のｐＨでありうる。Ｅ．コリにおいて、ｐＨは、約６．８〜約７．４又は約７．０でありうる。

【0374】

誘導可能なプロモーターが、本発明の発現ベクター内において使用される場合、タンパク質の発現は、プロモーターの活性化に適する条件下において誘導される。本発明の一態様において、ＰｈｏＡプロモーターが、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のための、リン酸限界培地中において培養する。一実施形態において、リン酸限界培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）、２６３：１３３〜１４７を参照されたい。）。当技術分野において公知の通り、用いられるベクター構築物に従い、他の様々な誘導剤も使用されうる。

【0375】

一実施形態において、発現された、本発明のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムへと分泌され、ここから回収される。タンパク質の回収は、一般に、浸透圧ショック、超音波処理又は溶解などの手段による、微生物の破壊を伴うことが典型的である。細胞が破壊されたら、細胞破砕物又は全細胞は、遠心分離又は濾過により除去されうる。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより、さらに精製されうる。代替的に、タンパク質は、培養培地へと移され、その中において単離される場合もある。細胞は、培養物から除去され、培養物上清は、さらなる精製のために、濾過及び濃縮されうる。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイなど、一般に公知の方法を使用して、さらに単離及び同定されうる。

【0376】

本発明の一態様において、抗体の作製は、発酵工程により大量に行われる。組換えタンパク質の作製のために、多様な大スケールの、流加発酵手順が利用可能である。大スケールの発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、例えば、約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、攪拌用インペラーを使用して、酸素及び栄養物質、とりわけ、グルコース（一般的な炭素／エネルギー源）を分配する。小スケールの発酵とは、一般に、容積が約１００リットルを超えず、約１リットル〜約１００リットルの範囲にわたりうる発酵槽内の発酵を指す。

【0377】

発酵工程において、タンパク質発現の誘導は、典型的に、細胞が、適切な条件下において、細胞が早期定常相にある（例えば、ＯＤ５５０を、約１８０〜２２０とする）、所望の密度まで増殖させられた後に開始される。当技術分野において公知であり、上記においても記載された通り、用いられるベクター構築物に従い、様々な誘導剤が使用されうる。細胞は、誘導前に、短時間にわたり増殖させられうる。細胞は通例、約１２〜５０時間にわたり誘導されるが、これより長い誘導時間が使用される場合もあり、これより短い誘導時間が使用される場合もある。

【0378】

本発明のポリペプチドの作製収率及び作製品質を改善するために、多様な発酵条件が改変されうる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの、適正なアセンブリー及びフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴う、ペプチジルプロピルｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−イソメラーゼ）など、シャペロンタンパク質を過剰発現させる、さらなるベクターが、宿主原核細胞を共形質転換するのに使用されうる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞内において産生される異種タンパク質の、適正なフォールディング及び可溶性を容易とすることが裏付けられている（Ｃｈｅｎら（１９９９）、Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ、２７４：１９６０１〜１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：１７１００〜１７１０５；Ｒａｍｍ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：１７１０６〜１７１１３；Ａｒｉｅら（２００１）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３９：１９９〜２１０）。

【0379】

発現された異種タンパク質（とりわけ、タンパク質分解に感受性の異種タンパク質）のタンパク質分解を最小化するため、タンパク分解酵素について欠損する、ある特定の宿主株が、本発明のために使用されうる。例えば、宿主細胞株は、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｍｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｖ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＶＩ及びこれらの組合せなど、公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内に、遺伝子突然変異を施すように改変されうる。いくつかのＥ．コリプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙら（１９９８年）、前出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２：６３〜７２（１９９６）において記載されている。

【0380】

一実施形態において、タンパク分解酵素について欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現させるプラスミドにより形質転換されたＥ．コリ株が、本発明の発現系内の宿主細胞として使用される。

【0381】

抗体の精製
一実施形態において、本発明において作製された抗体タンパク質は、さらなるアッセイのための、実質的に均質な調製物を得るように、さらに精製され、使用される。当技術分野において公知の、標準的なタンパク質精製法が用いられうる。以下の手順：免疫アフィニティーカラム上又はイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上又はＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿及び、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル濾過は、適切な精製手順を例示する。

【0382】

一態様において、固相上に固定化されたプロテインＡが、本発明の抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用される。プロテインＡとは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する、４１ｋＤの細胞壁タンパク質であって、抗体のＦｃ領域に、高アフィニティーにより結合する細胞壁タンパク質である（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２：１〜１３）。プロテインＡが固定化される固相は、ガラス表面若しくはシリカ表面を含むカラム又はＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）カラム若しくはケイ酸カラムでありうる。一部の適用において、夾雑物の非特異的付着を防止する可能性が高まるように、カラムが、グリセロールなどの試薬によりコーティングされる。

【0383】

精製の第１ステップとして、上記において記載された細胞培養物に由来する調製物を、プロテインＡが固定化された固相へと適用して、目的の抗体の、プロテインＡへの特異的結合を可能とすることができる。次いで、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に、目的の抗体を、固相から、溶出により回収する。

【0384】

真核宿主細胞を使用する、抗体の作出
ベクターの構成要素は、一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない。

【0385】

（ｉ）シグナル配列構成要素
真核宿主細胞における使用のためのベクターはまた、シグナル配列又は、目的の成熟タンパク質若しくは成熟ポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有する、他のポリペプチドも含有しうる。選択された異種シグナル配列は、一般に、宿主細胞により認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）異種シグナル配列である。哺乳動物細胞の発現において、哺乳動物シグナル配列のほか、ウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルも利用可能である。

【0386】

このような前駆体領域のＤＮＡが、リーディングフレーム内において、抗体をコードするＤＮＡへとライゲーションされる。

【0387】

（ｉｉ）複製起点
一般に、複製起点構成要素は、哺乳動物の発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０の起点は、初期プロモーターを含有するためだけに使用されうることが典型的である。

【0388】

（ｉｉｉ）選択遺伝子構成要素
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択用マーカーともまた称される、選択遺伝子を含有しうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生剤又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）該当する場合、栄養要求性欠損を相補する、又は（ｃ）複合培地から得られない、死活的な栄養物質を供給するタンパク質をコードする。

【0389】

選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を止める薬物を利用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、これにより、選択レジメンを経て存続する。このような優性選択の例は、薬物である、ネオマイシン、ミコフェノール酸及びヒグロマイシンを使用する。

【0390】

哺乳動物細胞に適する選択用マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ（例えば、霊長動物メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、抗体核酸を取り込む、コンピテント細胞の同定を可能とする、選択用マーカーである。

【0391】

例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞はまず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストである、メトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中において、形質転換細胞の全てを培養することにより同定されうる。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適切な宿主細胞は、例えば、ＤＨＦＲ活性を欠損させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９０９６）を含む。

【0392】

代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質及び、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）など、別の選択用マーカーをコードするＤＮＡ配列により形質転換又は共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生剤、例えば、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８など、選択用マーカーのための選択用薬剤を含有する培地中の細胞増殖により選択されうる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。

【0393】

（ｉｖ）プロモーター構成要素
発現ベクター及びクローニングベクターは通例、宿主生物により認識され、目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結された、プロモーターを含有する。プロモーター配列は、真核生物について公知である。事実上全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝子の転写の始点から７０〜８０塩基上流に見出される、別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドでありうる］である。大半の真核遺伝子の３’端に、ポリＡテールの、コード配列の３’端への付加のためのシグナルでありうる、ＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全ては、真核発現ベクターへと適切に挿入される。

【0394】

哺乳動物宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、このようなプロモーターが、宿主細胞系に適合性であるという条件において、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２など）、ウシパピローマウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）など、ウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーターから得られたプロモーター又は熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御されうる。

【0395】

ＳＶ４０ウイルスの、初期プロモーター及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含有する、ＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主内において、ＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号において開示されている。この系の改変については、米国特許第４，６０１，９７８号において記載されている。また、単純ヘルペスウイルスに由来する、チミジンキナーゼプロモーターの制御下、マウス細胞内の、ヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現についての、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：５９８〜６０１（１９８２）も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列も、プロモーターとして使用されうる。

【0396】

（ｖ）エンハンサーエレメント構成要素
高等真核生物による、本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列を、ベクターへと挿入することにより増大させられうることが多い。今や、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）に由来する、多くのエンハンサー配列が公知である。しかし、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用することが典型的である。例は、複製起点の後期側（１００〜２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを含む。また、真核プロモーターの活性化のための増強エレメントについて、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７：１７〜１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、ベクターの、抗体ポリペプチドコード配列の５’側の位置へとスプライスされる場合もあり、３’側の位置へとスプライスされる場合もあるが、一般に、プロモーターの５’側の部位に位置させる。

【0397】

（ｖｉ）転写終結構成要素
真核宿主細胞内において使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有することが典型的である。このような配列は、一般に、真核生物ＤＮＡ若しくは真核生物ｃＤＮＡ又はウイルスＤＮＡ若しくはウイルスｃＤＮＡの、５’側非翻訳領域から得られるが、場合によって、３’側非翻訳領域からも得られる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写される、ヌクレオチドセグメントを含有する。１つの、有用な、転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びその中において開示されている発現ベクターを参照されたい。

【0398】

（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書のベクター内において、ＤＮＡをクローニングする、又は発現させるのに適する宿主細胞は、本明細書において記載された、高等真核細胞であって、脊椎動物宿主細胞を含む、高等真核細胞を含む。培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の繁殖は、常套的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換された、サル腎臓ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ−７；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚由来腎臓細胞系（２９３細胞又は懸濁培養物中において増殖させるためにサブクローニングされた２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ−（ＣＨＯ；Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７０）；アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞及びヒトヘパトーマ細胞系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

【0399】

宿主細胞は、抗体の作製のための、上記において記載された発現ベクター又はクローニングベクターにより形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換細胞を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養物質培地中において培養される。

【0400】

（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を作製するのに使用された宿主細胞は、様々な培地中において培養されうる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）など、市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号若しくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５又は米国特許再交付第３０，９８５号において記載されている培地のうちのいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用されうる。これらの培地のうちのいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン又は上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（通例マイクロモル範囲の最終濃度において存在する無機化合物として規定される）並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充されうる。また、他の任意の必要な補充物質も、当業者に公知の適切な濃度において組み入れられうる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に対して既に使用された培養条件であり、当業者に明らかである。

【0401】

（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内において産生される場合もあり、培地へと直接分泌される場合もある。抗体が、細胞内において産生される場合、最初のステップとして、宿主細胞又は溶解された断片である粒子状破砕物は、一般に、例えば、遠心分離又は限外濾過により除去される。抗体が、培地へと分泌される場合、このような発現系に由来する上清は、一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニット又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮される。タンパク質分解を阻害するように、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が、前出のステップのうちのいずれかに組み入れられる場合があり、偶発性の夾雑物の増殖を防止するように、抗生剤が組み入れられうる。

【0402】

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されうるが、アフィニティークロマトグラフィーが、一般に、許容可能な精製法である。プロテインＡなどのアフィニティー試薬の、アフィニティーリガンドとしての適性は、抗体内に存在する、任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖又はヒトγ４重鎖に基づく抗体を精製するのに使用されうる。（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２：１〜１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３のために推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：１５６７〜１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが接合されるマトリックスは、アガロースであることが極めて多いが、他のマトリックスも利用可能である。ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど、力学的に安定なマトリックスは、アガロースにより達成されうる流量より大きな流量及びアガロースにより達成されうる加工時間より短い加工時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。また、イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂上又はカチオン交換樹脂上（ポリアスパラギン酸カラムなど）のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。

【0403】

任意の予備的精製ステップに続き、目的の抗体と夾雑物とを含む混合物は、必要に応じて、例えば、ｐＨを約２．５〜４．５の間とする溶出緩衝液を使用し、一般に、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）において実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを介する、さらなる精製ステップにかけられうる。

【0404】

当技術分野において、研究、検査及び臨床使用における使用のための抗体を調製するための、一般的な技法及び方法が十分に確立され、上記とも符合し、かつ／又は目的の特定の抗体に適切であると、当業者にみなされていることに留意されたい。

【0405】

活性アッセイ
本発明の抗体は、それらの物理的特性／化学的特性及び生物学的機能について、当技術分野において公知の、多様なアッセイにより特徴づけられうる。

【0406】

本開示の抗体又は抗原結合性断片、これらの変異体又は誘導体はまた、抗原に対する、これらの結合アフィニティーとの関係においても、記載又は指定されうる。抗体の、炭水化物抗原に対するアフィニティーは、任意の適切な方法（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９２）及び本明細書において記載された方法を参照されたい。）を使用して、実験により決定されうる。特定の抗体−炭水化物抗原間相互作用について測定されたアフィニティーは、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下において測定される場合、変動しうる。したがって、アフィニティー及び他の抗原結合性パラメータ（例えば、Ｋ_Ｄ、Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液並びに標準化緩衝液によりなされる。

【0407】

本抗体又はこの抗原結合性部分は、インビトロ及びインビボにおける、治療的、予防的及び／又は診断的な有用性を有する。例えば、これらの抗体は、例えば、がんを処置し、阻害し、がんの再発を防し、かつ／又はがんを診断するように、インビトロ又はエクスビボにおいて、培養物中の細胞へと投与される場合もあり、例えば、インビボにおいて、対象へと投与される場合もある。

【0408】

精製された抗体は、Ｎ末端シーケンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ除外高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含むがこれらに限定されない、一連のアッセイによりさらに特徴づけられうる。

【0409】

必要な場合、抗体は、それらの生体活性について解析される。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、それらの抗原結合活性について調べられる。当技術分野において公知であり、本発明において使用されうる、抗原結合アッセイは、限定せずに述べると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、ナノ粒子イムノアッセイ、アプタマーイムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイなどの技法を使用する、任意の直接的結合アッセイ又は競合的結合アッセイを含む。

【0410】

抗体断片
本発明は、抗体断片を包含する。ある特定の状況において、全抗体でなく、抗体断片を使用することが有利である。小サイズの断片は、急速なクリアランスを可能とし、充実性腫瘍への接近の改善をもたらしうる。

【0411】

抗体断片を作製するための、多様な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解性消化を介して由来する（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：１０７〜１１７（１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照されたい。）。しかし、今やこれらの断片は、組換え宿主細胞により、直接産生されうる。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片及びＳｃＦｖ抗体断片は、全て、Ｅ．コリ内において発現され、Ｅ．コリから分泌され、このため、これらの断片の、大量の作製を、容易に可能とする。抗体断片は、上記において論じられた、抗体ファージライブラリーから単離されうる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．コリから直接回収され、Ｆ（ａｂ’）_２断片を形成するように、化学的にカップリングされうる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３〜１６７（１９９２））。別の手法に従い、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離される場合もある。インビボ半減期が延長されたＦａｂ断片及びＦ（ａｂ’）_２断片であって、エピトープ残基に結合するサルベージ受容体を含む断片については、米国特許第５，８６９，０４６号において記載されている。当業者には、抗体断片を作製するための、他の技法も明らかである。他の実施形態において、選択される抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く、無傷の結合性（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位を伴う、唯一の分子種であり、このため、インビボにおける使用時に、非特異的結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）を低減するのに適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端における、エフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築されうる。「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前出を参照されたい。例えば、抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号において記載されている、「直鎖状抗体」でもありうる。このような直鎖状抗体断片は、単一特異性の場合もあり、二特異性の場合もある。

【0412】

ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。当技術分野において、非ヒト抗体をヒト化するための、多様な方法が公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された、１つ以上のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、これは、典型的に、「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒらによる方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁）に従い、超可変領域配列により、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより、本質的に実施されうる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する、対応する配列により置換されている、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際、ヒト化抗体は、典型的に、一部の超可変領域残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の、類似の部位に由来する残基により置換されている、ヒト抗体である。

【0413】

ヒト化抗体を作るのに使用される、軽鎖及び重鎖両方の、ヒト可変ドメインの選出しも、抗原性を低減するのに重要でありうる。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに照らしてスクリーニングされる。次いで、齧歯動物の配列に最も近接するヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして受容される（Ｓｉｍｓら（１９９３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定の亜群についての、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用されうる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３）。

【0414】

一般に、抗原に対する高アフィニティー及び他の好適な生物学的特性を保持しつつ、抗体がヒト化されることが、さらに所望される。この目標を達成するために、１つの方法に従い、親配列及びヒト化配列についての三次元モデルを使用する、親配列及び多様な概念上のヒト化産物についての解析工程により、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された、候補免疫グロブリン配列についての、蓋然的な三次元コンフォメーション構造を例示及び提示する、コンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示についての精査は、候補免疫グロブリン配列の機能化において可能性の高い、残基の役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析を可能とする。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基は、レシピエント配列及び移入配列から選択され、組み合わされうる。一般に、超可変領域残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。

【0415】

本発明のヒト抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択される、Ｆｖクローンの可変ドメイン配列を、上記において記載された、公知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることにより構築されうる。代替的に、本発明の抗ＳＳＥＡ−４ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によっても作製されうる。ヒトモノクローナル抗体の作製のための、ヒト骨髄腫細胞系及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系については、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）及びＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）により記載されている。

【0416】

免疫化時に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することもできる。例えば、キメラ／生殖細胞系列突然変異マウスにおける、抗体重鎖接合領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合性の欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害を結果としてもたらすことについて記載されている。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの導入は、抗原投与時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３）を参照されたい。

【0417】

遺伝子シャフリングもまた、ヒト抗体を、非ヒト抗体、例えば、齧歯動物抗体から導出するのに使用されうるが、この場合、ヒト抗体は、非ヒト出発抗体と同様のアフィニティー及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」ともまた呼ばれる、この方法に従い、上記において記載された、ファージディスプレイ法により得られた、非ヒト抗体断片の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域が、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーにより置換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖によるｓｃＦｖキメラ又はＦａｂキメラの集団を創出する。抗原による選択は、非ヒト鎖／ヒト鎖によるキメラｓｃＦｖ又はキメラＦａｂの単離を結果としてもたらし、ここで、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローン内において、対応する非ヒト鎖を除去したときに破壊された、抗原結合性部位を回復する、すなわち、エピトープが、ヒト鎖パートナーの選出しを統御する（刷り込む。）。残存する非ヒト鎖を置換えるために、工程が繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された、ＰＣＴ ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい。）。従来の、非ヒト抗体の、ＣＤＲグラフティングによるヒト化と異なり、この技法は、非ヒト由来のＦＲ残基又はＣＤＲ残基を有さない、完全ヒト抗体をもたらす。

【0418】

二特異性抗体
二特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、二特異性抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性のうちの一方は、特異的リシン連結を含む、ＳＳＥＡ−４に対するものであり、他方は、他の任意の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二特異性抗体は、２つの異なるリシン連結を有する、２つの異なるＳＳＥＡ−４に結合しうる。二特異性抗体は、全長抗体として調製される場合もあり、抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二特異性抗体）として調製される場合もある。

【0419】

当技術分野において、二特異性抗体を作るための方法が公知である。従来、二特異性抗体の、組換えによる作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、この場合、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とのランダムな取合せのために、これらのハイブリドーマ（クァドローマ）は、そのうちの１つだけが、適正な二特異性構造を有する、１０の異なる抗体分子の、潜在的な混合物をもたらす。通例、アフィニティークロマトグラフィーステップによりなされる、適正な分子の精製は、いくぶん煩瑣であり、産物の収率も低率である。同様の手順は、１９９３年５月１３日に公開された、ＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５（１９９１）において開示されている。

【0420】

異なる実施形態に従い、所望の結合（ｂｉｄｉｎｇ）特異性（抗体−抗原間結合性（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位）を伴う抗体の可変ドメインが、免疫グロブリン定常ドメイン配列へと融合される。融合は、例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域のちの少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある特定の実施形態において、軽鎖の結合に必要な部位を含有する、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合体のうちの少なくとも１つの中に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターへと挿入され、適切な宿主生物へと共トランスフェクトされる。構築において使用される、不等比の３つのポリペプチド鎖が、最適の収率を提供する実施形態において、これは、３つのポリペプチド断片の、相互の比率を調整するのに、大きな柔軟性をもたらす。しかし、少なくとも２つの、等比のポリペプチド鎖の発現が、高収率を結果としてもたらす場合、又は比が、特段の重要性を有さない場合、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖をコードする配列を、１つの発現ベクター内に挿入することも可能である。

【0421】

一実施形態において、二特異性抗体は、一方のアームにおける、第１の結合特異性を伴う、ハイブリッド体の免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおける、ハイブリッド体の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）とから構成される。免疫グロブリン軽鎖の、二特異性分子の半分だけにおける存在は、容易な分離の方式をもたらすので、この非対称性構造は、所望の二特異性化合物の、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離を、容易とすることが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０において開示されている。二特異性抗体の作出の、さらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。

【0422】

別の手法に従い、組換え細胞培養物から回収される、ヘテロ二量体の百分率を最大化するように、抗体分子対の間のインターフェースが操作されうる。インターフェースは、抗体定常ドメインのうちの、ＣＨ３ドメインの、少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子のインターフェースに由来する、１つ以上の小型のアミノ酸側鎖が、大型の側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）により置換えられる。大型のアミノ酸側鎖を、小型の側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）により置換えることにより、大型の側鎖と相補的な、同一又は同様なサイズの「空隙」が、第２の抗体分子のインターフェース上に創出される。これは、ホモ二量体など、他の望ましくない最終産物に対する、ヘテロ二量体の収率を増大させるための機構をもたらす。

【0423】

二特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体のうちの一方が、アビジンへとカップリングされ、他方が、ビオチンへとカップリングされうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞へとターゲティングする（米国特許第４，６７６，９８０号）ことが提起されており、ＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３及びＥＰ０３０８９）にも提起されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製できる。当技術分野において、適切な架橋剤が周知であり、多数の架橋法と共に、米国特許第４，６７６，９８０号において開示されている。

【0424】

また、二特異性抗体を、抗体断片から作出するための技法についても、文献に記載されている。例えば、二特異性抗体は、化学連結を使用して調製されうる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体を、タンパク質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）_２断片を作出する手順について記載している。近接のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィドの形成を防止するように、これらの断片を、ジチオール複合体化剤である、亜ヒ酸ナトリウムの存在下において還元する。次いで、作出されたＦａｂ’断片を、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体へと転換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの一方を、メルカプトエチルアミンによる還元を介して、Ｆａｂ’−チオールへと再転換し、等モル量である、他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二特異性抗体を形成する。作製された二特異性抗体は、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用されうる。

【0425】

近年の進展は、二特異性抗体を形成するように、化学的にカップリングされうる、Ｆａｂ’−ＳＨ断片の、Ｅ．コリからの直接的回収を容易としている。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、完全ヒト化二特異性抗体である、Ｆ（ａｂ’）_２分子の作製について記載している。各Ｆａｂ’断片が、Ｅ．コリから個別に分泌され、インビトロにおいて、二特異性抗体を形成するように、指向性化学的カップリングにかけられる。このようにして形成された二特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合することが可能であるほか、ヒト細胞傷害性リンパ球の、ヒト乳腺腫瘍標的に対する溶解活性を誘発することも可能であった。

【0426】

また、二特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から直接、作り、単離するための、多様な技法についても記載されている。例えば、二特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２））。Ｆｏｓタンパク質及びＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドが、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分へと、遺伝子融合により連結された。抗体のホモ二量体が、単量体を形成するように、ヒンジ領域において還元され、次いで、抗体のヘテロ二量体を形成するように、再酸化された。この方法はまた、抗体のホモ二量体を作製するためにも利用されうる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）により記載されている、「ダイアボディ」技術は、二特異性抗体断片を作るための、代替的な機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）へと接続された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、別の断片の、相補的なＶＬドメイン及びＶＨドメインと対合するように強いられ、これにより、２つの抗原結合性部位を形成する。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用を介して、二特異性抗体断片を作るための、別の戦略も、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。

【0427】

二価を超える抗体も想定されている。例えば、三特異性抗体も調製されうる（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：６０（１９９１））。

【0428】

多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体より急速に内部化（及び／又は異化）されうる。本発明の抗体は、３つ以上の抗原結合性部位を伴う多価抗体（ＩｇＭクラス以外の抗体である）（例えば、四価抗体）でありうるが、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、たやすく作製されうる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合性部位を含みうる。二量体化ドメインは、例えば、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はこれらからなる）。この状況において、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に対してアミノ末端側にある、３つ以上の抗原結合性部位とを含む。一実施形態において、多価抗体は、例えば、３つ〜約８つ又は４つの抗原結合性部位を含む（又はこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、ポリペプチド鎖は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ［配列中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは、０又は１である］を含みうる。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−可撓性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含みうる。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドもさらに含みうる。本明細書の多価抗体は、例えば、約２つ〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含みうる。本明細書において想定された、軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、ＣＬドメインをさらに含む。

【0429】

抗体変異体
ある特定の実施形態において、本明細書において記載された抗体のアミノ酸配列修飾が想定される。例えば、アミノ酸配列修飾は、抗体の結合アフィニティー及び／又は他の生物学的特性を改善するのに所望でありうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を、抗体核酸へと導入することにより、又はペプチド合成により調製される。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又はこれらへの挿入及び／又はこれらの置換を含む。最終構築物が、所望の特徴を保有するという条件において、最終的な構築物に到達するように、欠失、挿入及び置換の任意の組合せがなされうる。アミノ酸変化は、この配列が作製される時点において、対象抗体のアミノ酸配列内に導入されうる。

【0430】

突然変異誘発に好ましい位置である、抗体のある特定の残基又は領域の同定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５により記載されている通り、「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。本明細書において、標的残基の残基又は群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの帯電残基）が同定され、アミノ酸の、抗原との相互作用に影響を及ぼすように、中性アミノ酸又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換えられる。次いで、置換の部位において、又は置換の部位に代えて、さらなる変異体又は他の変異体を導入することにより、置換に対する機能的な感受性を顕示するアミノ酸位置が精緻化される。したがって、アミノ酸配列の変異を導入するための部位は、所定であるが、突然変異自体の性質は、所定である必要がない。例えば、所与の部位における突然変異の効能を解析するために、ａｌａ走査又はランダム突然変異誘発が、標的コドン又は標的領域において行われ、発現された免疫グロブリンが、所望の活性についてスクリーニングされる。

【0431】

アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基〜１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の、アミノ末端融合体及び／又はカルボキシル末端融合体のほか、単一又は複数のアミノ酸残基の、配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体又は細胞傷害性ポリペプチドへと融合された抗体を含む。抗体分子の、他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端の、酵素への融合体（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）又は抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。

【0432】

別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子内の、少なくとも１つのアミノ酸残基が、異なる残基により置換えられている。置換突然変異誘発のために、最も大きな目的の部位は、超可変領域を含むが、また、フレームワークの変更も想定される。

【0433】

抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造であって、例えば、シートコンフォメーション若しくはヘリックスコンフォメーションとしての構造の維持；（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性の維持又は（ｃ）側鎖のバルクの維持に対する、それらの効果が、著明に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２版、７３〜７５頁、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非帯電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｏ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
に従い群分けされうる。

【0434】

代替的に、天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づく群：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
へと分けられる場合もある。

【0435】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴う。また、このような置換残基は、保存的置換部位へと導入される場合もあり、残りの（非保存的）部位へと導入される場合もある。

【0436】

１つの種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の、１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、結果として得られた変異体であって、さらなる開発のために選択された変異体の生物学的特性は、それらが作出された親抗体と比べて修飾されている（例えば、改善されている）。このような置換変異体を作出するための、簡便な方式は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟を伴う。略述すると、各部位における全ての可能なアミノ酸置換を作出するように、いくつかの超可変領域部位（例えば、６つ〜７つの部位）に突然変異が導入される。このようにして作出された抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされた、ファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）のうちの、少なくとも一部との融合体として提示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体が、本明細書において開示される通り、それらの生体活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、抗原への結合に著明に寄与する、超可変領域残基を同定するように、走査突然変異誘発（例えば、アラニン走査）が実施されうる。代替的に、又は加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原との接触点を同定することも有益でありうる。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述された技法を含む、当技術分野において公知の技法に従う置換のための候補である。このような変異体が作出されたら、変異体のパネルが、本明細書において記載された技法を含む、当技術分野において公知の技法を使用するスクリーニングにかけられ、１つ以上の、妥当なアッセイにおいて、優れた特性を伴う抗体が、さらなる開発のために選択されうる。

【0437】

抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の様々な方法により調製される。これらの方法は、天然供給源（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）からの単離又はオリゴヌクレオチド媒介型（又は部位指向）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及び、抗体の、既に調製された変異体バージョン又は非変異体バージョンに対する、カセット型突然変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。一部の態様において、核酸分子は、天然に存在する配列を除外する。

【0438】

１つ以上のアミノ酸修飾を、本発明の抗体のＦｃ領域内に導入し、これにより、Ｆｃ領域変異体を作出することが所望でありうる。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインの、１つ以上のアミノ酸位置を含む、１つ以上のアミノ酸位置における、アミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、又はＩｇＧ_４のＦｃ領域）を含みうる。

【0439】

イムノコンジュゲート
別の態様において、本発明は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌由来、真菌由来、植物由来若しくは動物由来の酵素活性毒素又はこれらの断片）又は放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤へとコンジュゲートされた抗体を含む、イムノコンジュゲート又は抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。

【0440】

細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤、すなわち、がんの処置において、腫瘍細胞を死滅させる、又は阻害する薬物を局所送達するための、抗体−薬物コンジュゲートの使用（Ｓｙｒｉｇｏｓ及びＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：６０５〜６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ及びＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）、Ａｄｖ．Ｄｒｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２６：１５１〜１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）は、コンジュゲートされていない、これらの薬剤の全身投与が、許容不可能なレベルの毒性を、消失が求められている腫瘍細胞のほか、正常細胞にも結果としてもたしうる場合（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６）、Ｌａｎｃｅｔ（１９８６年３月１５日）：６０３〜０５頁；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁）に、薬物部分の、腫瘍へのターゲティング送達及び腫瘍細胞内の蓄積を可能とする。こうして、毒性を最小としながら、有効性を最大とすることが探索される。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２１：１８３〜８７）。これらの方法で使用される薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート及びビンデシンを含む（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６年）、前出）。抗体−毒素コンジュゲート内において使用される毒素は、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの低分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）、Ｊｏｕｒ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、９２（１９）：１５７３〜１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０：１０２５〜１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１３：７８６〜７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：８６１８〜８６２３）及びカリケアミシン（Ｌｏｄｅら（１９９８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３：３３３６〜３３４２）を含む。毒素は、それらの細胞傷害効果及び細胞増殖抑制効果を、チューブリンへの結合、ＤＮＡへの結合又はトポイソメラーゼの阻害を含む機構により及ぼしうる。一部の細胞傷害薬は、大型の抗体又はタンパク質受容体のリガンドへとコンジュゲートされると、不活性又は低活性となる傾向がある。

【0441】

抗体の誘導体
本発明の抗体は、当技術分野において公知であり、たやすく利用可能な、さらなる非タンパク質性部分を含有するように、さらに修飾されうる。一実施形態において、抗体の誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、（酸化ポリプロピレン／酸化エチレン）コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のこの安定性のために、製造における利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量のものであることが可能であり、分枝状の場合もあり、非分枝状の場合もある。抗体へと接合されるポリマーの数は変動する場合があり、１つを超えるポリマーが接合される場合、ポリマーは、同じ分子の場合もあり、異なる分子の場合もある。一般に、誘導体化に使用されたポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の、特定の特性又は機能、抗体の誘導体が、規定された条件下の治療において使用されるのかどうかなどを含むがこれらに限定されない検討項目に基づき決定されうる。

【0442】

別の実施形態において、抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートであって、放射線への曝露により選択的に加熱されうるコンジュゲートが提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０２：１１６００〜１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であることが可能であり、正常細胞に有害でないが、非タンパク質性部分を、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで加熱する波長を含むがこれらに限定されない。

【0443】

医薬製剤
一実施形態において、本発明は、本明細書において記載された、抗体又はこの抗原結合性部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、医薬組成物は、本抗体又はこの抗原結合性部分をコードする核酸と、薬学的に許容される担体とを含む。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性のものなど、任意の溶媒及び全ての溶媒、任意の分散媒及び全ての分散媒、任意の等張剤及び全ての等張剤並びに任意の吸収遅延剤及び全ての吸収遅延剤を含む。一実施形態において、組成物は、対象におけるがん細胞を阻害するのに効果的である。

【0444】

本医薬組成物の投与経路は、静脈内投与、筋内投与、鼻腔内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、経口投与、局所投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、皮内投与、経皮投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）投与、非経口投与、直腸内投与、脊髄投与又は表皮投与を含むがこれらに限定されない。

【0445】

本発明の医薬組成物は、溶液若しくは懸濁液として、又は注射の前における、液体媒体中の、溶解若しくは懸濁に適する固体形態としての注射剤として調製されうる。医薬組成物はまた、固体形態においても調製される場合もあり、乳化される場合もあり、有効成分が、持続送達のために使用される、リポソーム媒体中又は他の粒子状担体中に封入される場合もある。例えば、医薬組成物は、油エマルジョン、油中水エマルジョン、水中油中水エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長時間貯留型エマルジョン、粘着性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子並びに酢酸エチレンビニルコポリマー及びＨｙｔｒｅｌ（登録商標）コポリマーなど、非吸収性の不透過性ポリマー、ハイドロゲルなどの膨潤性ポリマー又はコラーゲンなどの吸収性ポリマー並びに医薬組成物の持続放出を可能とする、吸収性縫合糸を作るのに使用されたものなど、ある特定のポリ酸又はポリエステルなど、多様な、天然ポリマー又は合成ポリマーの形態でありうる。

【0446】

本抗体又はこの抗原結合性部分は、哺乳動物対象への送達のための医薬組成物へと製剤化される。医薬組成物は、単独において投与される場合もあり、かつ／又は薬学的に許容される媒体、賦形剤若しくは担体と混合される場合もある。適切な媒体は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びこれらの組合せである。加えて、媒体は、保湿剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤又はアジュバントなど、少量の補助物質を含有しうる。薬学的に許容される担体は、例えば、本発明の医薬組成物の吸収速度又はクリアランス速度を、安定化させる、又は増大若しくは減少させるように作用する、生理学的に許容される化合物を含有しうる。生理学的に許容される化合物は、例えば、グルコース、スクロース若しくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、デタージェント、リポソーム型の担体又は賦形剤又は他の安定化剤及び／若しくは緩衝剤を含みうる。他の、生理学的に許容される化合物は、保湿剤、乳化剤、分散剤又は保存剤を含む。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の２１版を参照されたい。本発明の医薬組成物はまた、薬理学的薬剤、サイトカイン又は他の生物学的応答修飾剤などの補助物質も含みうる。

【0447】

さらに、医薬組成物は、中性形態又は塩形態の医薬組成物へと製剤化されうる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含み、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデリン酸などの有機酸により形成される。遊離カルボキシル基から形成された塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄などの無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基にも由来しうる。

【0448】

このような剤形を調製する、実際の方法は、当業者に公知である、又は当業者に明らかである。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、２１版を参照されたい。

【0449】

医薬組成物は、対象の年齢、体重及び状態、使用された、特定の組成物及び投与経路、医薬組成物が、予防的目的のために使用されるのか、治癒的目的のために使用されるのかなどに適切なスケジュールにより、これらに適切な期間にわたり、単回投与による処置において投与される場合もあり、複数回投与による処置において投与される場合もある。例えば、一実施形態において、本発明に従う医薬組成物は、毎月１回、毎月２回、毎月３回、隔週（ｑｏｗ）、毎週１回（ｑｗ）、毎週２回（ｂｉｗ）、毎週３回（ｔｉｗ）、毎週４回、毎週５回、毎週６回、隔日（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、毎日２回（ｑｉｄ）又は毎日３回（ｔｉｄ）投与される。

【0450】

本発明に従う、抗体の投与の持続期間、すなわち、医薬組成物が投与される期間は、例えば、対象の応答など、様々な因子のうちのいずれかに応じて変動しうる。例えば、医薬組成物は、約１秒間以上〜１時間以上、１日間〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１カ月間〜約２カ月間、約２カ月間〜約４カ月間、約４カ月間〜約６カ月間、約６カ月間〜約８カ月間、約８カ月間〜約１年間、約１年間〜約２年間又は約２年間〜約４年間以上の範囲の期間にわたり投与されうる。

【0451】

投与の容易さ及び投与量の均一性のために、単位剤形にある、経口組成物又は非経口医薬組成物が使用されうる。本明細書において使用された、単位剤形とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位であって、各単位が、要求された医薬担体と会合して、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する単位を指す。

【0452】

細胞培養物アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための、投与量の範囲を処方するのに使用されうる。一実施形態において、このような化合物の投与量は、毒性をほとんど又は全く伴わない、ＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられた剤形及び利用された投与経路に応じて、この範囲内において変動しうる。別の実施形態において、治療有効用量は、まず、細胞培養物アッセイから推定されうる。用量は、細胞培養物中において決定された、ＩＣ_５０（すなわち、症状の、最大半量の阻害を達成する、被験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方されうる（Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、２５：３５〜４５、２００３；Ｎｉｋｕｌａら、Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、４（１２）：１２３〜５３、２０００）。

【0453】

本発明の抗体又は抗原結合性部分の、治療有効量又は予防有効量のための、例示的な、非限定的な範囲は、体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約６０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約３０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約２５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．５〜約２５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１〜約２０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１０〜約２０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．７５〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１〜約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約２〜約９ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１〜約２ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約３〜約８ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約４〜約７ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５〜約６ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約８〜約１３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約８．３〜約１２．５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約４〜約６ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約４．２〜約６．３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１．６〜約２．５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約２〜約３ｍｇ又は体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇである。

【0454】

医薬組成物は、有効量の、本抗体又はこの抗原結合性部分を含有するように製剤化され、この場合、量は、処置される動物及び処置される状態に依存する。一実施形態において、本抗体又はこの抗原結合性部分は、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．１ｍｇ〜約９ｇ、約１ｍｇ〜約８ｇ、約２ｍｇ〜約７ｇ、約３ｍｇ〜約６ｇ、約１０ｍｇ〜約５ｇ、約２０ｍｇ〜約１ｇ、約５０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０５μｇ〜約１．５ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇのタンパク質、約３０μｇ〜約５００μｇ、約４０μｇ〜約３００μｇ、約０．１μｇ〜約２００μｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇの範囲の用量において投与される。任意の特定の対象のための、具体的な用量レベルは、特異的なペプチドの活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食餌、投与回数、投与経路及び排出速度、薬物の組合せ並びに治療を受ける、特定の疾患の重症度を含む、様々な因子に依存し、不要な実験を伴わずに、当業者により決定されうる。

【0455】

本発明の抗体を含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意選択的な、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と、水溶液、凍結乾燥製剤又は他の乾燥製剤の形態で混合することにより、保管用に調製される。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、ヒスチジン及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム塩化物；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖及び、グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0456】

本明細書の製剤はまた、処置される特定の適応に対する必要に応じて、互いに対して有害な影響を及ぼし合わない、相補的活性を伴う活性化合物を含むがこれらに限定されない、１つを超える活性化合物も含有しうる。このような分子は、意図される目的に効果的な量において、組合せの中に適切に存在する。

【0457】

有効成分はまた、例えば、コアセルベーション法により、又は界面重合により調製された、マイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）内又はマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内又はゼラチンマイクロカプセル内及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内にも封入されうる。このような技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）において開示されている。

【0458】

インビボにおける投与のために使用される製剤は、滅菌製剤でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過により、たやすく達成される。

【0459】

持続放出調製物が調製されうる。持続放出調製物の、適切な例は、本発明の免疫グロブリンを含有する、固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスであって、成型品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態にあるマトリックスを含む。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）とγエチル−Ｌ−グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと、酢酸ロイプロリドとから構成される、注射用マイクロスフェア）などの、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間を超えて、分子の放出を可能とするのに対し、ある特定のハイドロゲルは、タンパク質を放出する期間が短い。封入された免疫グロブリンは、長時間にわたり体内にとどまるが、３７℃の水分へと曝露される結果として、変性又は凝集し、生体活性の喪失及び可能な免疫原性の変化を結果としてもたらす場合がある。関与する機構に応じた、安定化のための、妥当な戦略が案出されうる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介する、分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であると発見されれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成されうる。

【0460】

使用
本発明の抗体は、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法において使用されうる。本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボにおける特異的抗原活性を、部分的又は完全に遮断する、アンタゴニストとして使用されうる。さらに、本発明の抗体の少なくとも一部は、他の種に由来する抗原活性も中和しうる。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含有する細胞培養物中、ヒト対象又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する、他の哺乳動物対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス）における、特異的抗原活性を阻害するのに使用されうる。一実施形態において、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように、抗体を抗原と接触させることにより、抗原活性を阻害するために使用されうる。一実施形態において、抗原は、ヒトタンパク質分子である。

【0461】

一実施形態において、本発明の抗体は、抗原活性が有害である障害を患う対象において、抗原を阻害するための方法であって、対象における抗原活性が阻害されるように、対象へと、本発明の抗体を投与するステップを含む方法において使用されうる。一実施形態において、抗原は、ヒトタンパク質分子であり、対象は、ヒト対象である。代替的に、対象は、本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳動物でもありうる。なおさらなる対象は、抗原が導入された（例えば、抗原の投与により、又は抗原のトランス遺伝子の発現により）哺乳動物でありうる。本発明の抗体は、ヒト対象へと、治療目的のために投与されうる。さらに、本発明の抗体は、抗体が交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物（例えば、霊長動物、ブタ又はマウス）へと、獣医学的目的のために投与される場合もあり、ヒト疾患の動物モデルとして投与される場合もある。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性の評価（例えば、投与量及び投与の時間経過についての検査）に有用でありうる。本発明の抗体は、ＳＳＥＡ−４及びＳＳＥＡ−４化タンパク質の異常な発現及び／又は活性と関連する疾患、障害又は状態であって、がん、筋障害、ユビキチン経路関連の遺伝子障害、免疫／炎症性障害、神経障害及び他のユビキチン経路関連障害を含むがこれらに限定されない、疾患、障害又は状態を処置する、阻害する、これらの進行を遅延させる、これらの再発を防止する／遅延させる、これらを改善する、又は防止するのに使用されうる。

【0462】

一態様において、本発明の遮断抗体は、ＳＳＥＡ−４に特異的である。

【0463】

ある特定の実施形態において、本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートであって、細胞傷害剤とコンジュゲートされたイムノコンジュゲートが、患者へと投与される。ある特定の実施形態において、イムノコンジュゲート及び／又はそれが結合させられる抗原は、それらの細胞表面上に、ＳＳＥＡ−４と関連する、１つ以上のタンパク質を発現する細胞により内部化される結果として、それが会合する標的細胞の殺滅における、イムノコンジュゲートの治療有効性の増大をもたらす。一実施形態において、細胞傷害剤は、標的細胞内の核酸をターゲティングする、又はこれに干渉する。このような細胞傷害剤の例は、本明細書において言及される化学療法剤（メイタンシノイド又はカリケアミシンなど）、放射性同位元素、又はリボヌクレアーゼ若しくはＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちのいずれかを含む。

【0464】

本発明の抗体（及び補助療法剤）は、非経口手段、皮下手段、腹腔内手段、肺内手段及び鼻腔内手段並びに、局所処置に所望される場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段により投与されうる。非経口注入は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与を含む。加えて、抗体は、特に、抗体の用量を減じる、パルス注入により、適切に投与される。投与は、任意の適切な経路を介することが可能であり、例えば、投与が短期であるのか、長期であるのかに部分的に応じて、注射（例えば、静脈内注射又は皮下注射）を介しうる。

【0465】

抗体の調製及び投与において、本発明の抗体の結合標的の位置が検討されうる。結合標的が、細胞内分子である場合、本発明のある特定の実施形態は、結合標的が位置する細胞へと導入される、抗体又はその抗原結合性断片を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、細胞内において、イントラボディーとして発現されうる。本明細書において使用された、「イントラボディー」という用語は、Ｍａｒａｓｃｏ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４：１１〜１５（１９９７）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４：１６３〜１７０（２００４）；米国特許第６，００４，９４０号及び同第６，３２９，１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号並びにＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０７７９４５号において記載されている通り、細胞内において発現され、標的分子に選択的に結合することが可能な、抗体又はその抗原結合性部分を指す。イントラボディーの細胞内発現は、所望の抗体又はその抗原結合性部分をコードする核酸（抗体又は抗原結合性断片をコードする遺伝子と通常関連する、野生型のリーダー配列及び分泌シグナルを欠く）を、標的細胞へと導入することによりなされる。マイクロ注射、遺伝子銃注射、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム及び、目的の核酸を保有する、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びワクシニアベクターによるトランスフェクションを含むがこれらに限定されない、核酸を細胞へと導入する任意の標準的な方法が使用されうる。ＳＳＥＡ−４への細胞内結合及び１つ以上の、ＳＳＥＡ−４媒介性細胞内経路のモジュレーションが可能な、１つ以上のイントラボディーを発現させるように、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体の全部又は一部をコードする、１つ以上の核酸が、標的細胞へと送達されうる。

【0466】

別の実施形態において、内部化抗体が提供される。抗体は、抗体の、細胞への送達を増強する、ある特定の特徴を保有する場合もあり、このような特徴を保有するように修飾される場合もある。当技術分野において、これを達成するための技法が公知である。例えば、抗体のカチオン化は、その細胞への取込みを容易とすることが公知である（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照されたい。）。また、リポフェクション又はリポソームも、抗体を細胞へと送達するのに使用されうる。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する、最小の阻害性断片が、一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子がデザインされうる。このようなペプチドは、化学合成される場合もあり、かつ／又は組換えＤＮＡ技術により作製される場合もある。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７８８９〜７８９３（１９９３）を参照されたい。

【0467】

モジュレーターポリペプチドの、標的細胞への侵入は、当技術分野において公知の方法により増強されうる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔ又はＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインタンパク質に由来する配列など、ある特定の配列は、異種タンパク質の、細胞膜を隔てた効率的な取込みを方向付けることが可能である。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）、９６：４３２５〜４３２９を参照されたい。

【0468】

結合標的が脳内に位置する場合、本発明のある特定の実施形態は、血液脳関門を越える抗体又はその抗原結合性断片を提供する。ある特定の神経変性疾患は、抗体又は抗原結合性断片が、脳へとたやすく導入されうるように、血液脳関門の透過性の増大と関連する。血液脳関門が無傷を維持する場合、血液脳関門を隔てて分子を運ぶための、当技術分野において公知のいくつかの手法であって、物理的方法、脂質ベースの方法並びに受容体及びチャネルベースの方法を含むがこれらに限定されない手法が存在する。

【0469】

抗体又は抗原結合性断片を、血液脳関門を隔てて運ぶ、物理的方法は、血液脳関門を全体として迂回する方法又は血液脳関門内に開口部を創出する方法を含むがこれらに限定されない。迂回法は、脳への直接的注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、９：３９８〜４０６（２００２）を参照されたい。）、間質内注入／対流増強型送達（例えば、Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：２０７６〜２０８０（１９９４）を参照されたい。）及び送達デバイスの、脳内への植込み（例えば、Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、９：５８９〜５９５（２００３）及びＧｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒｓ（商標）、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照されたい。）を含むがこれらに限定されない。関門内に開口部を創出する方法は、超音波法（例えば、米国特許公開第２００２／００３８０８６号を参照されたい。）、浸透圧法（例えば、高張性マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ．Ａ．、「Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ」、１及び２巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）））、例えば、ブラジキニン又は透過剤Ａ−７による透過化（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、同第５，２６８，１６４号、同第５，５０６，２０６号及び同第５，６８６，４１６号を参照されたい。）及び血液脳関門を夾叉するニューロンへの、抗体又は抗原結合性断片をコードする遺伝子を含有するベクターのトランスフェクション（例えば、米国特許公開第２００３／００８３２９９号を参照されたい。）を含むがこれらに限定されない。

【0470】

抗体又は抗原結合性断片を、血液脳関門を隔てて運ぶ、脂質ベースの方法は、抗体又は抗原結合性断片を、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する、抗体又は抗原結合性断片へとカップリングされた、リポソーム内に封入する方法（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい。）及び抗体又は抗原結合性断片を、低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照されたい。）又はアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照されたい。）によりコーティングする方法を含むがこれらに限定されない。

【0471】

抗体又は抗原結合性断片を、血液脳関門を隔てて運ぶ、受容体及びチャネルベースの方法は、グルココルチコイド遮断剤を使用して、血液脳関門の透過性を増大させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号及び同第２００５／０１２４５３３号を参照されたい。）；カリウムチャネルを活性化させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照されたい。）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害する方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照されたい。）；抗体をトランスフェリンによりコーティングし、１つ以上のトランスフェリン受容体の活性をモジュレートする方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照されたい。）及び抗体をカチオン化する方法（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照されたい。）を含むがこれらに限定されない。

【0472】

本発明の抗体組成物は、「医薬品の製造及び品質管理に関する基準」に準拠する方式において、製剤化、投薬、及び投与される。この文脈において検討される因子は、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与のスケジュール指定及び医療従事者に公知の他の因子を含む。抗体は、問題の障害を防止又は処置するのに現在使用されている、１つ以上の薬剤と共に製剤化される必要はないが、任意選択的に、これらと共に製剤化される。このような、他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害又は処置の種類及び上記において論じられた、他の因子に依存する。他の薬剤は、一般に、本明細書において記載された、同じ投与量において、かつ、同じ投与経路により使用される、又は本明細書において記載された投与量の約１〜９９％により使用される、又は経験的／臨床的に適切であると決定された、任意の投与量において、かつ、任意の経路により使用される。

【0473】

疾患を防止又は処置するために、本発明の抗体の適切な投与量（単独において使用された場合の投与量又は、化学療法剤など、他の薬剤と組み合わせて使用された場合の投与量）は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的のために投与されるのか、治療目的のために投与されるのか、既往の治療、患者の臨床歴及び抗体への応答並びに主治医の判断に依存する。抗体は、患者へと一度に投与するのにも、一連の処置にわたり投与するのにも適する。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上にわたる個別投与によるのであれ、連続注入によるのであれ、患者への投与のための、初期の候補投与量でありうる。典型的な、１つの、毎日の投与量は、約１μｇ／ｋｇ〜の範囲でありうる。数日間以上にわたる場合、状態に応じて、処置は、一般に、疾患症状の、所望される抑制が生じるまで、持続される。抗体の、１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つ以上の用量（又はこれらの任意の組合せ）が、患者へと投与されうる。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が、約２〜約２０回又は、例えば、約６回にわたる抗体の投与を施されるように）投与されうる。初期の高負荷用量に続き、１回以上にわたる低用量が投与されうる。例示的な投与レジメンは、初期負荷用量約４ｍｇ／ｋｇに続き、毎週の維持用量約２ｍｇ／ｋｇの抗体を投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも、有用でありうる。この治療の進捗状況は、従来の技法及びアッセイにより、容易にモニタリングされる。

【0474】

製品
本発明の別の態様において、上記において記載された障害の処置、防止及び／又は診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器及び容器上における表示又は容器と関連するパッケージ添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、それ自体において、又は別の組成物と組み合わされた場合に、状態を処置、防止及び／又は診断するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内注射用溶液バッグの場合もあり、皮下注射用注射針により穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合もある）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。標識又はパッケージ添付文書は、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを指し示す。さらに、製品は、（ａ）組成物がその中に含有された、第１の容器であって、組成物が本発明の抗体を含む容器と；（ｂ）組成物がその中に含有された第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害剤又はこれ以外の治療剤を含む容器とを含みうる。本発明のこの実施形態における製品は、組成物が、特定の状態を処置するのに使用されうることを指し示す、パッケージ添付文書もさらに含みうる。代替的に、又は加えて、製品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩液、リンゲル液及びデキストロース溶液など、薬学的に許容可能な緩衝液を含む、第２の（又は第３の）容器もさらに含みうる。製品は、販売上の観点及び使用者の観点から所望される、他の材料であって、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針及びシリンジを含む材料もさらに含む。

【0475】

ある特定の実施形態において、処置される対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態において、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態において、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又はヤギなどの馴致動物である。ある特定の実施形態において、対象は、イヌ又はネコなどの愛玩動物である。ある特定の実施形態において、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又はヤギなどの家畜である。ある特定の実施形態において、対象は、動物園動物である。別の実施形態において、対象は、齧歯動物、イヌ又は非ヒト霊長動物などの研究用動物である。ある特定の実施形態において、対象は、トランスジェニックマウス又はトランスジェニックブタなどの非ヒトトランスジェニック動物である。

【0476】

医薬組成物及び製剤
本明細書において記載された抗体を調製した後、「あらかじめ凍結乾燥させた製剤」が作製されうる。製剤を調製するための抗体は、本質的に純粋であることが好ましく、本質的に均質である（すなわち、夾雑タンパク質などを含まない）ことが所望される。「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づき、重量により、少なくとも約９０％のタンパク質、好ましくは、重量により、少なくとも約９５％のタンパク質を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づき、重量により、少なくとも約９９％のタンパク質を含む組成物を意味する。ある特定の実施形態において、タンパク質は、抗体である。

【0477】

あらかじめ凍結乾燥させた製剤中の抗体の量は、所望の投与容量、投与方式などを考慮に入れて決定される。選択されたタンパク質が、無傷抗体（全長抗体）である場合、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは、約２０〜約３０ｍｇ／ｍＬが、例示的な出発タンパク質濃度である。タンパク質は一般に、溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、ｐＨ緩衝溶液中に、ｐＨ約４〜８において存在することが可能であり、好ましくは、約５〜７において存在しうる。例示的な緩衝剤は、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸及び他の有機酸を含む。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液及び製剤（例えば、復元製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ又は約３ｍＭ〜約１５ｍＭでありうる。下記において裏付けられる通り、ヒスチジンは、凍結乾燥保護特性を有しうるので、好ましい緩衝液は、ヒスチジンである。コハク酸は、別の有用な緩衝液であることが示された。

【0478】

凍結乾燥保護剤が、あらかじめ凍結乾燥さられた製剤へと添加される。好ましい実施形態において、凍結乾燥保護剤は、スクロース又はトレハロースなどの、非還元糖である。あらかじめ凍結乾燥させた製剤中の凍結乾燥保護剤の量は、一般に、復元されると、結果として得られる製剤が等張性となるような量である。しかしまた、高張性の復元製剤も、適切でありうる。加えて、凍結乾燥保護剤の量は、凍結乾燥時に、許容不可能な量のタンパク質の分解／凝集が生じるほどに少なすぎてはならない。凍結乾燥保護剤が、糖（スクロース又はトレハロースなど）であり、タンパク質が、抗体である場合、あらかじめ凍結乾燥させた製剤中の、例示的な凍結乾燥保護剤濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭであり、好ましくは、約３０ｍＭ〜約３００ｍＭであり、最も好ましくは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。

【0479】

タンパク質の、凍結乾燥保護剤に対する比は、タンパク質と凍結乾燥保護剤との各組合せについて選択される。タンパク質濃度が高濃度である、等張性の復元製剤を作出するための、選択されたタンパク質としての抗体及び凍結乾燥保護剤としての糖（例えば、スクロース又はトレハロース）の場合、凍結乾燥保護剤の、抗体に対するモル比は、１モルの抗体に対して、約１００〜約１５００モルの凍結乾燥保護剤であることが可能であり、好ましくは、１モルの抗体に対して、約２００〜約１０００モルの凍結乾燥保護剤、例えば、１モルの抗体に対して、約２００〜約６００モルの凍結乾燥保護剤でありうる。

【0480】

本発明の好ましい実施形態において、あらかじめ凍結乾燥さられた製剤に、界面活性剤を添加することが所望であることが見出されている。代替的に、又は加えて、界面活性剤が、凍結乾燥製剤及び／又は復元製剤へと添加される場合もある。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又は８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン又はステアリールスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン又はステアリールサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン又はセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン又はイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピルベタイン）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン又はイソステアラミドプロピルジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウム又はココイルメチルタウリン二ナトリウム並びにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などの非イオン界面活性剤を含む。添加される界面活性剤の量は、界面活性剤が、復元されるタンパク質の凝集を低減し、復元後における、粒子状物質の形成を最小化するような量である。例えば、界面活性剤は、あらかじめ凍結乾燥さられた製剤中に、約０．００１〜０．５％の量において存在することが可能であり、好ましくは、約０．００５〜０．０５％において存在しうる。

【0481】

本発明のある特定の実施形態において、凍結乾燥保護剤（スクロース又はトレハロースなど）と、増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）との混合物が、あらかじめ凍結乾燥さられた製剤の調製物中において使用される。増量剤は、その中に過剰なポケットなどを伴わずに、均一な凍結乾燥ケーキの作製を可能としうる。

【0482】

それらが、製剤の所望の特徴に有害な影響を及ぼさないという条件において、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）において記載されているものなど、他の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤も、あらかじめ凍結乾燥さられた製剤中（及び／又は凍結乾燥製剤中及び／又は復元製剤中）に組み入れられうる。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられた投与量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、さらなる緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生体分解性ポリマー並びに／又はナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。

【0483】

本明細書において記載された、医薬組成物及び製剤は、好ましくは、安定である。「安定な」製剤／組成物とは、その中の抗体が、保管時に、その物理的及び化学的な、安定性及び完全性を、本質的に保持する製剤／組成物である。当技術分野において、タンパク質の安定性を測定するための、多様な解析法が利用可能であり、「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、２４７〜３０１、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．刊（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、１０：２９〜９０（１９９３）において総説されている。安定性は、選択された温度において、選択された時間にわたり測定されうる。

【0484】

インビボにおける投与のために使用される製剤は、滅菌製剤でなければならない。これは、凍結乾燥及び復元の前に、又は凍結乾燥及び復元の後に、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達成される。代替的に、混合物全体の無菌性は、タンパク質を除く成分を、例えば、約１２０℃において、約３０分間にわたり、オートクレーブにかけることにより達成されうる。

【0485】

タンパク質、凍結乾燥保護剤及び他の任意選択の構成要素を一体に混合した後、製剤は、凍結乾燥させる。Ｈｕｌｌ５０（登録商標）（Ｈｕｌｌ、ＵＳＡ）凍結乾燥器又はＧＴ２０（登録商標）（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）凍結乾燥器など、多くの異なる凍結乾燥器が、この目的のために利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結させ、その後、一次乾燥に適する温度において、凍結させられた内容物から、氷を昇華させることにより達成される。この条件下において、生成物温度は、製剤の共晶融点又は崩壊温度を下回る。典型的に、一次乾燥のための保管温度は、典型的に、約５０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲である、適切な圧力下において、約−３０〜２５℃の範囲となる（一次乾燥時に、生成物が凍結を維持するという条件において）。製剤、サイズ及び試料を保持する容器の種類（例えば、ガラスバイアル）並びに液体の容量が、主に、乾燥に要求される時間であって、数時間〜数日間（例えば、４０〜６０時間）の範囲でありうる時間を指示する。二次乾燥段階は、主に、容器の種類及びサイズ並びに用いられるタンパク質の種類に依存して、約０℃〜約４０℃において実行されうる。しかし、本明細書において、二次乾燥ステップは、必要でない場合もあることが見出された。例えば、凍結乾燥のうちの、全水除去期を通した保管温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）でありうる。二次乾燥に要求される、時間及び圧力は、例えば、温度及び他のパラメータに依存して、適切な凍結乾燥ケーキをもたらす時間及び圧力となる。二次乾燥時間は、生成物中に所望される、残りの水分レベルにより指示され、典型的に、少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）を要する。圧力は、一次乾燥ステップ中に用いられる圧力と同じでありうる。凍結乾燥条件は、製剤及びバイアルサイズに応じて変動しうる。

【0486】

場合によって、移替えステップを回避するために、タンパク質製剤は、タンパク質の復元が実行される容器内において凍結乾燥させることが所望でありうる。この場合の容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０又は１００ｃｃのバイアルでありうる。一般的な仮定として述べると、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満であり、好ましくは、約３％未満である凍結乾燥製剤を結果としてもたらす。

【0487】

所望の段階において、典型的に、タンパク質を患者へと投与する段階において、復元製剤中のタンパク質濃度が、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、約８０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬとなり、最も好ましくは、約９０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬとなるように、凍結乾燥製剤は、希釈剤により復元される。復元製剤中の、このような高タンパク質濃度は、復元製剤の皮下送達が意図される場合に、特に有用であると考えられる。しかし、静脈内投与など、他の投与経路のために、復元製剤中の、より低濃度のタンパク質（例えば、復元製剤中に、約５〜約５０ｍｇ／ｍＬ又は約１０〜約４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質）も所望でありうる。ある特定の実施形態において、復元製剤中のタンパク質濃度は、あらかじめ凍結乾燥さられた製剤中の濃度より、著明に高濃度である。例えば、復元製剤中のタンパク質濃度は、あらかじめ凍結乾燥さられた製剤の約２〜４０倍（ｔｉｍｅｓ）、好ましくは、３〜１０倍（ｔｉｍｅｓ）であることが可能であり、最も好ましくは、３〜６倍（ｔｉｍｅｓ）（例えば、少なくとも３倍（ｆｏｌｄ）又は少なくとも４倍（ｆｏｌｄ））でありうる。

【0488】

復元は、一般に、完全な水和を確保するように、約２５℃の温度においてなされるが、所望に応じて、他の温度も用いられうる。復元に要求される時間は、例えば、希釈剤の種類、賦形剤及びタンパク質の量に依存する。例示的な希釈剤は、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）、滅菌生理食塩液、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む。希釈剤は、任意選択的に、防腐剤を含有する。例示的な防腐剤については、上記において記載されており、ベンジルアルコール又はフェノールアルコールなど、芳香族アルコールが、好ましい防腐剤である。用いられる防腐剤の量は、異なる防腐剤濃度は、タンパク質に対する適合性について評価し、防腐剤の有効性試験を行うことにより決定される。例えば、防腐剤が、芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）である場合、防腐剤は、約０．１〜２．０％、好ましくは、約０．５〜１．５％、しかし最も好ましくは、約１．０〜１．２％の量において存在しうる。好ましくは、復元製剤は、バイアル１つ当たりの粒子６０００個未満を有し、これらは、＞１０μｍのサイズである。

【0489】

治療用途
本明細書において、このような処置を必要とする対象へと、本明細書において記載された、１つ以上の抗体を含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む治療法について記載される。

【0490】

ある特定の実施形態において、処置を必要とする対象（例えば、ヒト患者）は、がんを伴う、がんを有することが疑われる、又はがんの危険性があると診断される。がんの例は、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、膵がん、結腸がん、腎がん、子宮頚がん、卵巣がん及び前立腺がんを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、がんは、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん又は膵がんである。一部の好ましい実施形態において、がんは、脳がん又は多型性神経膠芽腫（ＧＢＭ）である。

【0491】

好ましい実施形態において、抗体は、ＳＳＥＡ−４を発現するがん細胞をターゲティングすることが可能である。ある特定の実施形態において、抗体は、がん細胞上のＳＳＥＡ−４をターゲティングすることが可能である。ある特定の実施形態において、抗体は、がん内のＳＳＥＡ−４をターゲティングすることが可能である。

【0492】

処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の消失、転移の防止、再発の防止、播種性がんの軽減若しくは殺滅、生存の延長及び／又は腫瘍の、がんへの進行までの時間の延長を結果としてもたらす。

【0493】

ある特定の実施形態において、処置は、さらなる治療を、前記対象へと、抗体の前記投与の前、前記投与の間、又は前記投与の後に投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態において、さらなる治療は、化学療法剤による処置である。ある特定の実施形態において、さらなる治療は、放射線療法である。

【0494】

本発明の方法は、初期段階腫瘍を処置及び防止し、これにより、いっそうの進行段階への進行を防止する結果として、進行がんと関連する罹患率及び死亡率の低減をもたらすのに、特に有利である。本発明の方法また、例えば、原発腫瘍を除去した後に遷延する休眠腫瘍である、腫瘍の再発又は腫瘍の再増殖を防止するのにも、腫瘍の発生を低減又は防止するのにも有利である。

【0495】

本明細書において記載された方法により処置される対象は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトでありうる。哺乳動物は、農場動物、競技動物、ペット、霊長動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウス及びラットを含むがこれらに限定されない。処置を必要とするヒト対象は、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆管がん、肝がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、胃がん、結腸がん、鼻咽頭がん、腎がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍を含むがこれらに限定されないがんを有する、これらの危険性がある、又はこれらを有することが疑われるヒト患者でありうる。がんを有する対象は、常套的な医学的検査により同定されうる。

【0496】

本明細書において使用された、「有効量」とは、単独において、又は１つ以上の、他の活性薬剤と組み合わせて、対象に治療効果を付与するのに要求される、各活性薬剤の量を指す。当業者により認識されている通り、有効量は、処置される特定の状態、状態の重症度、個々の患者のパラメータであって、医療従事者の知見及び専門知識の範囲内にある、年齢、健康状態、体格、性別及び体重、処置の持続期間、存在する場合、併用療法の特性、具体的な投与経路などの因子を含むパラメータに応じて変動する。これらの因子は、当業者に周知であり、常套的な実験だけにより対処されうる。個々の成分又はこれらの組合せの最大用量、すなわち、穏当な医学的判断に従う、安全最高用量を使用することが一般に好ましい。しかし、患者が、医学的理由、心理的理由又は事実上他の任意の理由のために、低用量又は忍容可能用量を主張することが、当業者により理解される。

【0497】

半減期など、経験的な検討項目は、一般に、投与量の決定に寄与する。例えば、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系に攻撃されることを防止するように、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体など、ヒト免疫系に適合性の抗体が使用されうる。投与頻度は、治療の経過にわたり、決定及び調整される場合があり、一般に、がんの処置及び／又は抑制及び／又は改善及び／又は遅延に基づくが、必ずしもこれらに基づかない。代替的に、本明細書において記載された抗体の、持続放出製剤も、適切でありうる。当技術分野において、持続放出を達成するための、多様な製剤及びデバイスが公知である。

【0498】

一例において、本明細書において記載された抗体の投与量は、抗体の１回以上の投与を施された個体において、経験的に決定されうる。個体は、漸増させた投与量の抗体が施される。抗体の有効性を評価するために、常套的な慣行に従い、疾患（例えば、がん）の指標が追跡されうる。

【0499】

一般に、本明細書において記載された抗体のうちのいずれかを投与するための、初期候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇでありうる。本開示の目的のために、典型的な毎日の投与量は、上記において言及された因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上のうちのいずれかの範囲でありうる。数日間以上の長期にわたる繰返し投与のために、状態に応じて、症状の所望の抑制が生じるまで、又はがん若しくはその症状を緩和するのに十分な治療レベルが達成されるまで、処置が持続される。例示的な投与レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量に続いて、毎週の維持用量約１ｍｇ／ｋｇの抗体又は約２ｍｇ／ｋｇの初期用量に続いて、隔週の維持用量約１ｍｇ／ｋｇを投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも、当業者が達成したいと望む薬物動態的減衰のパターンに応じて有用でありうる。例えば、毎週１〜４回の投与が想定される。ある特定の実施形態において、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ及び約２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲の投与が使用されうる。ある特定の実施形態において、投与頻度は、毎週１回、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと若しくは１０週間ごと又は毎月１回、２カ月ごと又は３カ月以上ごとの間隔である。この治療の進捗状況は、従来の技法及びアッセイにより、容易にモニタリングされる。使用される抗体を含む、投与レジメンは、時間と共に変動しうる。

【0500】

本開示の目的のために、本明細書において記載された抗体の、適切な投与量は、用いられる特異的抗体（又はその組成物）、がんの種類及び重症度、抗体が予防目的のために投与されるのか、治療目的のために投与されるのか、既往の治療、患者の臨床歴及び抗体への応答並びに主治医の判断に依存する。本明細書において記載された抗体の投与は、あらかじめ選択された期間にわたり、本質的に持続的な場合もあり、例えば、がんの発症の前に、発症時に、又は発症の後における、間隔を置いた一連の投与の場合もある。

【0501】

本明細書において使用された、「〜を処置すること」という用語は、１つ以上の活性薬剤を含む組成物の、がん、がんの症状又はがんに対する素因を有する対象への、がん、がんの症状又はがんに対する素因を治癒させる、治す、緩和する、軽減する（ｒｅｌｉｖｅ）、変更する、修復する、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）又はこれに影響を及ぼすことを目的とする、適用又は投与を指す。

【0502】

がんを緩和することは、がんの発症若しくは進行を遅延させること又はがんの重症度を軽減すること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）を含む。がんを緩和することは、必ずしも、治癒結果を要求しない。本明細書において使用された、がんの発症「を遅延させること」とは、がんの進行を延期し、妨害し、遅らせ、妨げ、安定化させ、かつ／又は先送りすることを意味する。この遅延は、処置されるがん及び／又は個体の履歴に応じて、多様な長さの時間の遅延でありうる。がんの発症「を遅延させる」る、若しくは緩和する、又はがんの発病を遅延させる方法とは、所与の時間枠内における、がんの１つ以上の症状の発症の可能性（危険性）を、方法を使用しない場合と比較して低減し、かつ／又は所与の時間枠内における、症状の程度を、方法を使用しない場合と比較して軽減する方法である。このような比較は、典型的に、統計学的に有意な結果をもたらすのに十分な、多数の対象を使用する臨床研究に基づく。

【0503】

がんの「発症」又は「進行」とは、がんの、初期の顕在化及び／又はその後の進行を意味する。がんの発症は、検出可能な場合があり、当技術分野において周知の、標準的な臨床的技法を使用して評価されうる。しかし、発症とはまた、検出不能な進行も指す場合がある。本開示の目的のために、発症又は進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発及び発病を含む。本明細書において使用された、がんの「発病」又は「発生」は、初回の発病及び／又は再発を含む。

【0504】

医療技術分野の当業者に公知である、従来の方法は、処置される疾患の種類又は疾患の部位に応じて、医薬組成物を対象へと投与するのに使用されうる。この組成物はまた、他の従来の経路を介して、例えば、経口、非経口投与される場合もあり、吸入スプレーにより投与される場合もあり、局所、直腸内、鼻腔内、口腔内、膣内投与される場合もあり、植込み式レザバーを介して投与される場合もある。本明細書において使用された、「非経口」という用語は、皮下注射法又は皮下注入法、皮内注射法又は皮内注入法、静脈内注射法又は静脈内注入法、筋内注射法又は筋内注入法、関節内注射法又は関節内注入法、動脈内注射法又は動脈内注入法、滑膜内注射法又は滑膜内注入法、胸骨内注射法又は胸骨内注入法、髄腔内注射法又は髄腔内注入法、病変内注射法又は病変内注入法及び頭蓋内注射法又は頭蓋内注入法を含む。加えて、医薬組成物は、対象へと、１カ月、３カ月若しくは６カ月にわたるデポ注射用の材料及び方法又は生体分解性の材料及び方法などを使用する、注射用デポ投与経路を介して投与されうる。

【0505】

注射用組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール及びポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）など、多様な担体を含有しうる。静脈内注射のために、水溶性抗体は、抗体と、生理学的に許容される賦形剤とを含有する、医薬製剤が注入される、点滴法により投与される場合がある。生理学的に許容される賦形剤は、例えば、５％のデキストロース、０．９％の生理食塩液、リンゲル液又は他の適切な賦形剤を含みうる。筋内調製物、例えば、抗体の適切な可溶性塩形態による滅菌製剤は、注射用水、０．９％の生理食塩液又は５％のグルコース溶液などの医薬賦形剤中に溶解され、投与されうる。

【0506】

「化学療法剤」とは；がんの処置において有用な化合物である。化学療法剤の例は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン（ＤＭ１）、アントラサイクリン、ピロロベンゾジアゼピン、α−アマニチン、ツブリシン、ベンゾジアゼピン、エルロチニブ、ボルテゾミブ、フルベストラント、スニチニブ、レトロゾール、メシル酸イマチニブ、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパマイシン、ラパチニブ、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（登録商標）、ＳＣＨ６６３３６）、ソラファニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１、アルキル化剤；スルホン酸アルキル；アジリジン；エチレンイミン；メチルメラミン；アセトゲニン；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコチクチイン；スポンジスタチン；クロランブシル；クロルナファジン；シクロホスファミド；エストラムスチン；イホスファミド；メクロレタミン；塩酸メクロレタミンオキシド；メルファラン；ノベムビシン；フェネステリン；プレドニムスチン；トロホスファミド；ウラシルマスタード；カルムスチン；クロロゾトシン；ホテムスチン；ロムスチン；ニムスチン；ラニムスチン；カリケアミシン；ジネミシン；クロドロネート；エスペラミシン；ネオカルチノスタチン発色団；アクラシノマイシン；アクチノマイシン；アントラマイシン；アザセリン；ブレオマイシン；カクチノマイシン；カラビシン；カルミノマイシン；カルジノフィリン；クロモマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デトルビシン；６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；ドキソルビシン；エピルビシン；エソルビシン；イダルビシン；マルセロマイシン；マイトマイシン；ミコフェノール酸；ノガラマイシン；オリボマイシン；ペプロマイシン；ポトフィロマイシン；ピューロマイシン；ケラマイシン；ロドルビシン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；ツベルシジン；ウベニメクス；ジノスタチン；ゾルビシン；メトトレキサート；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；デノプテリン；プテロプテリン；トリメトレキサート；フルダラビン；６−メルカプトプリン；チアミプリン；チオグアニン；アンシタビン；アザシチジン；６−アザウリジン；カルモフール；シタラビン；ジデオキシウリジン；ドキシフルリジン；エノシタビン；フロクスウリジン；カルステロン；プロピオン酸ドロモスタノロン；エピチオスタノール；メピチオスタン；テストラクトン；アミノグルテチミド；ミトタン；トリロスタン；フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン；アンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド；パクリタキセル；ドセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン；カルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ＸＥＬＯＤＡ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド；カペシタビンを含む。

【0507】

「生物学的治療剤」とは、がんの処置において有用な、生物学的分子である。化学療法剤の例は、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡアンタゴニスト、ＣＴＬＡ抗体、インターロイキン、サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に干渉する薬剤、哺乳動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤、ヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）阻害剤、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、インテグリン遮断剤、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤又は抗グロボ系列抗原抗体を含む。

【0508】

「抗グロボ系列抗原抗体」は、抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体を含む。

【0509】

組合せに適する、ＯＢＩ−８６８（グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミド）の例についての記載
ある特定の実施形態において、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの構造は、それらの内容が、参照によりその全体において組み込まれた、特許出願である、ＰＣＴ特許出願（ＷＯ２０１７０４１０２７Ａ１）において記載されている通りである。

【0510】

グロボＨ及びＳＳＥＡ−４（炭水化物グリカンのグロボ系列）並びにシアリルルイスＡ（ＳＬｅ^ａ）、ルイスＡ（Ｌｅ^ｙ）、シアリルルイスＸ（ＳＬｅ^ｘ）及びルイスＸ（Ｌｅ^ｘ）とは、がん細胞の表面上において発現され、乳がん、膵がん、胃がん、結腸直腸がん、肺がん、口腔がん、卵巣がん及び前立腺がんを含む、広範囲にわたる、異なるがんの種類に特異的な抗原である。

【0511】

グロボＨは、多様な種類のがん、とりわけ、乳がん、前立腺がん及び肺がん上において、高度に発現された、抗原性炭水化物のファミリーのメンバーである、構造（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）を有する六糖（Ｋａｎｎａｇｉ Ｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５８：８９３４〜８９４２、１９８３；Ｚｈａｎｇ ＳＬら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、７３：４２〜４９、１９９７；Ｈａｋｏｍｏｒｉ Ｓら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、４：９７〜１０４、１９９７；Ｄｕｂｅ ＤＨら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、４：４７７〜４８８、２００５）である。グロボＨは、がん細胞表面上において、糖脂質として発現され、おそらく、糖タンパク質として発現される（Ｍｅｎａｒｄ Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、４３：１２９５〜１３００、１９８３；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ＰＯ、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ、６：３５７〜３６６、１９９５）。乳がん患者の血清は、グロボＨエピトープに対する、高レベルの抗体を含有する（Ｍｅｎａｒｄ Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、４３：１２９５〜１３００、１９８３）。

【0512】

一態様において、本開示のグロボＨセラミド及び／又はＳＳＥＡ−４セラミドは、グリカン、例えば、グロボ系列グリカン（グロボ系列スフィンゴ糖脂質抗原）及び／又は腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）の、効率的な検出及び結合を容易としうる、リンカー組成物及びその使用法に関する。

【0513】

ＴＡＣＡは、２つのクラス：糖タンパク質抗原及び糖脂質抗原へと分けられうる。糖タンパク質抗原は、例えば、（１）例えば、α−２，６−Ｎ−アセチルガラクトサミニル（Ｔｎ）抗原、トムセン−フリードライヒ（ＴＦ）抗原及びシアリル−Ｔｎ（ｓＴｎ）抗原を含みうる、又はこれらを除外しうる、ムチン並びに（２）ポリシアル酸（ＰＳＡ）を含みうる、又はこれらを除外しうる。糖脂質抗原は、例えば、（１）例えば、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３（又はＧｂ５）、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３及びＧｂ４を含みうる、又はこれらを除外しうる、グロボ系列抗原；（２）例えば、ルイスｘ（Ｌｅ^ｘ）、ルイスｙ（Ｌｅ^ｙ）、ルイスａ（Ｌｅ^ａ）、シアリルルイスｘ（ｓＬｅ^ｘ）及びシアリルルイス（ＳＬｅ^ａ）を含みうる、又はこれらを除外しうる、血液型決定基並びに（３）例えば、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、フコシル−ＧＭ１及びＮｅｕ５ＧｃＧＭ３を含みうる、又はこれらを除外しうる、ガングリオシドを含みうる、又はこれらを除外しうる。

【0514】

一態様において、本発明は、様々な適用において使用されうるリンカーを提供する。例えば、本発明のリンカーは、分子を、表面、固体表面、粒子、アレイ又はビーズを含みうる、又はこれらを除外しうる基質へと接合するのに使用されうる。一部の態様において、リンカーは、炭水化物と相互作用する、第１の部分と、表面と相互作用する、第２の部分とを含みうる。

【0515】

一部の態様において、本開示は、リンカー及びリンカー−グロボ系列グリカンコンジュゲート又はリンカー−他ＴＡＣＡコンジュゲート、リンカー−グロボ系列糖タンパク質コンジュゲートを含む、リンカー−ＴＡＣＡを含みうる、又はこれらを除外しうる、リンカーとグリカンとのコンジュゲート並びにこれらを作る方法及び使用する方法を提示する。例示的な、グロボ系列のグリカンは、ＳＳＥＡ−４及びグロボＨを含みうる、又は除外しうる。例示的な、グロボ系列の糖タンパク質は、ペプチド又はタンパク質へと接合された、ＳＳＥＡ−４及びグロボＨを含みうる、又は除外しうる。さらなるＴＡＣＡグリカンは、例えば、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ及びＳＬｅ^ｘを含みうる、又はこれらを除外しうる。ＴＡＣＡはまた、例示的なグリカンのうちのいずれかの、ｎ−ペンチルアミン官能化変異体、例えば、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、グロボＨ、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ及びＳＬｅ^ｘの、ｎ−ペンチルアミン官能化変異体も含む。

【0516】

一部の態様において、本開示は、リンカーにより基質へとコンジュゲートされたグリカンを含む、基質へとコンジュゲートされたグリカンを提示する。

【0517】

本発明の別の態様は、被検試料中の、乳がんを含むがんを検出する方法であって、（ａ）被検試料を、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ及びＳＬｅ^ｘを含むグリカンへと、共有結合的に接合されたリンカーと接触させるステップ；（ｂ）被検試料中の抗体が、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ及びＳＬｅ^ｘと関連する分子／決定基に結合するのかどうかを決定するステップを含みうる方法である。

【0518】

一部の態様において、本開示は、疾患診断、再発モニタリング及び薬物発見における使用のための、複数のビーズであって、各ビーズが、各ビーズ上又は各ビーズ内に、固有の識別子を有し、ビーズｎが、複数のＧ１−Ａ−Ｚ部分［式中、Ｇ１は、１つのＴＡＣＡである］を含み、ビーズｎが、複数のＧｎ−Ａ−Ｚ［式中、Ｇｎは、Ｇ１ ＴＡＣＡと実質的に同じである、第２のＴＡＣＡである］を含む、複数のビーズに関する。

【0519】

一態様において、本開示は、式：Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｘ（式１）［式中、Ｇは、グリカンであり；Ａは、エステル又はアミドを含む部分であり；Ｘは、基質、例えば、表面、固体表面、透明の固体、非透明の固体、選択された波長の可視光又は非可視光に対して透明の固体、粒子、アレイ、マイクロバブル又はビーズ、コーティングされた基質、コーティングされた表面、ポリマー表面、ニトロセルロースによりコーティングされた表面又はビーズ表面；基質へと接合されたスペーサー基又はリンカーを、基質へと接着させるための基を伴うスペーサー基であり；Ｚは、１つ以上の脂質鎖、脂質鎖を伴う、１つ以上のスペーサー基である］の化合物に関する。

【0520】

一態様において、本開示は、以下の式：

【0521】

【化1】

を有する化合物を特色とする。

【0522】

一態様において、本開示は、以下の式：

【0523】

【化2】

を有する化合物を特色とする。

【0524】

一態様において、本開示は、以下の式：

【0525】

【化3】

［式中、Ｑは、

【0526】

【化4】

又は水素であることが可能であり、Ｃ２は、キラル又は非キラルであることが可能であり、Ｃ３は、示される通りのキラリティーを有し、［脂質鎖］は、任意の、Ｃ４〜Ｃ１６の、直鎖状又は分枝状の、アルキル鎖又はアルコキシ鎖であることが可能であり、ｍは、１〜１０の範囲の整数値を有することが可能であり；ＴＡＣＡは、以下：グロボＨ、ＳＳＥＡ−３（又はＧｂ５）、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ若しくはＳＬｅ^ｘ及び／又はこれらのｎ−ペンチルアミン官能化変異体のうちの１つから選択される］
を有する、例示的なＧ−Ａ−Ｚ化合物を特色とする。上記において指し示された通り、この式は、例示的なＧ−Ａ−Ｚである。

【0527】

一態様において、例示的なＧ−Ａ−Ｚ化合物は、以下の式：

【0528】

【化5】

［式中、Ｃ２は、キラル又は非キラルであることが可能であり、Ｃ３は、示される通りのキラリティーを有し、［脂質鎖１］は、任意の、Ｃ４〜Ｃ１６の、直鎖状又は分枝状の、アルキル鎖又はアルコキシ鎖であることが可能であり、［脂質鎖２］は、水素又は少なくとも１つのヒドロキシ部分を含む、Ｃ４〜Ｃ１６である、任意の不飽和アルキル鎖であることが可能であり、ｍは、１〜１０の範囲の整数値を有することが可能であり；ＴＡＣＡは、以下：グロボＨ、ＳＳＥＡ−３（又はＧｂ５）、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ若しくはＳＬｅ^ｘ及び／又はこれらのｎ−ペンチルアミン官能化変異体のうちの１つから選択される］
を有する。

【0529】

一態様において、ｍは、５であることが可能であり、［脂質鎖１］は、以下の式：

【0530】

【化6】

［式中、ｎは、７を含む、１〜１０の整数であり、波線は、［脂質鎖１］へと接続された、カルボニル炭素への結合を表す］
でありうる。

【0531】

一態様において、以下の式：

【0532】

【化7】

［式中、Ｃ２は、キラル又は非キラルであることが可能であり、Ｃ３は、示される通りのキラリティーを有し、ｍは、１を含む、１〜１０の範囲の整数値を有することが可能であり；ＴＡＣＡは、以下：グロボＨ、ＳＳＥＡ−３（又はＧｂ５）、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ若しくはＳＬｅ^ｘ及び／又はこれらのｎ−ペンチルアミン官能化変異体のうちの１つから選択される］
に従う化合物が提供される。

【0533】

一態様において、以下の式：

【0534】

【化8】

［式中、本明細書においてはまた、「脂質」とも称された、［脂質鎖］は、任意の、Ｃ４〜Ｃ１６の、直鎖状又は分枝状の、アルキル鎖又はアルコキシ鎖であることが可能であり、ｍは、１〜１０の範囲の整数値を有することが可能であり；ＴＡＣＡは、以下：グロボＨ、ＳＳＥＡ−３（又はＧｂ５）、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ若しくはＳＬｅ^ｘ及び／又はこれらのｎ−ペンチルアミン官能化変異体のうちの１つから選択される］
に従う化合物が提供される。

【0535】

一態様において、以下の式：

【0536】

【化9】

［式中、
キラル炭素原子Ｃ１は、ラセミ炭素原子又はキラル炭素原子であり；
Ｒ１及びＲ２は、アルキル、アリール、ハロ、ヘテロアリール、ハロアルキル、ベンジル、フェニルであることが可能であり、Ｒ１及びＲ２が、環状結合を形成しうるように、相互連結されており；
ｎ＝７を含む、ｎ＝４〜９の範囲の整数であり；
ＴＡＣＡは、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、Ｇｂ３、Ｇｂ４、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ及びＳＬｅ^ｘ並びに／又はこれらのｎ−ペンチルアミン官能化変異体のうちの１つから選択される］
に従う化合物が提供される。

【0537】

一態様において、以下の式：

【0538】

【化10】

［式中、
キラル炭素原子Ｃ１は、ラセミ炭素原子又はキラル炭素原子であり；
ｎ＝７を含む、ｎ＝４〜９の範囲の整数であり；
ＴＡＣＡは、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３（又はＧｂ５）、Ｇｂ３、Ｇｂ４、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ若しくはＳＬｅ^ｘ及び／又はこれらのｎ−ペンチルアミン官能化変異体のうちの１つから選択される］
のうちのいずれか１つに従う化合物が提供される。

【0539】

一態様において、本明細書の化合物を調製する方法であって、アミド結合を形成するように、脂質鎖１又は脂質鎖２が、ペンチルアミン官能化グロボＨと反応させられる方法が提供される。

【0540】

一態様において、以下の式：

【0541】

【化11】

［式中、
ｍは、１〜１０の範囲の整数値を有することが可能であり；
Ｖは、酸素又は炭素であることが可能であり；
ｑは、１〜３の範囲の整数値を有することが可能であり；
ＴＡＣＡは、以下：グロボＨ、ＳＳＥＡ−３（又はＧｂ５）、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ若しくはＳＬｅ^ｘ及び／又はこれらのｎ−ペンチルアミン官能化変異体のうちの１つから選択される］
に従う化合物が提供される。

【0542】

一態様において、アレイ内の感度を改善する方法であって、本明細書で開示されたリンカーの使用を含む方法が提供される。

【0543】

一態様において、本開示は、がんの診断法であって、（ａ）がんを有することが疑われる対象に由来する、抗体を含有する試料を用意するステップ；（ｂ）試料を、１つ以上のＴＡＣＡを含むアレイと接触させるステップ；（ｃ）１つ以上のＴＡＣＡに結合した、試料中の抗体の複合体を形成するステップ；（ｄ）１つ以上のＴＡＣＡに結合した抗体の量を検出するステップ及び（ｅ）前記１つ以上のＴＡＣＡに結合した抗体の正常レベルと比較した、前記１つ以上のＴＡＣＡに結合した前記抗体の量に基づき、対象の疾患状態を決定するステップを含む診断法に関する。一部の態様において、正常レベルは、例えば、正常患者又は正常患者の集団に由来する試料中の抗体に結合したＴＡＣＡのレベルの測定値に基づく、参照値又は参照範囲でありうる。一部の態様において、検出されたＴＡＣＡ結合性抗体は、循環抗体である。一態様において、検出は、少なくとも１つのＴＡＣＡに対する、少なくとも１つの抗体の決定を含む。一部の態様において、アレイ上のＴＡＣＡは、Ｔｎ、ＴＦ、ｓＴｎ、ポリシアル酸、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｌｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ａ、ｓＬｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、フコシル−ＧＭ１又はＮｅｕ５ＧｃＧＭ３のうちの１つ以上から選択されうる。

【0544】

一態様において、試料は、体液（血清、唾液、リンパ節液、尿、膣スワブ又は口腔スワブ）である。

【0545】

一態様において、本開示は、ＴＡＣＡ結合パートナーについての、グリカン結合パートナーのスクリーニングライブラリーに関する。一部の態様において、分子又はライブラリーは、例えば、抗体、ナノボディー、抗体断片、アプタマー、レクチン、ペプチド、又はコンビナトリアルライブラリー分子を含みうる。一態様において、前記ＴＡＣＡ結合パートナーを同定するための、前記ライブラリーのスクリーニングは、本明細書で開示された、ＴＡＣＡグリカンアレイの使用を含む。

【0546】

一部の態様において、ＴＡＣＡ結合パートナーは、多様な適用において使用されうる。例えば、一態様において、本開示は、それを必要とする対象の疾患状態を決定するための方法であって、（ａ）対象に由来する試料を用意するステップ；（ｂ）試料を、１つ以上のＴＡＣＡ結合パートナーと接触させるステップ；（ｃ）ＴＡＣＡと、結合パートナーとの結合の特異性を測定するステップ及び（ｄ）発現された、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）のレベルを検出するステップを含む方法に関する。

【0547】

ＴＡＣＡ結合パートナーは、例えば、それを必要とする患者、例えば、ＴＡＣＡを発現するがん、腫瘍、新生物又は過形成を有する患者を処置するための治療剤として使用されうる。

【0548】

一態様において、検出は、ＴＡＣＡの検出を含む。一態様において、前記ＴＡＣＡの検出は、ＴＡＣＡグリカンアレイの使用を含む。

【0549】

一部の態様において、方法は、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、神経膠芽腫、肺がん、乳がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、膀胱がん、膵がん、腸がん、結腸直腸がん、腎がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、精巣がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、口腔咽頭がん、喉頭がん及び／又は前立腺がんのうちの１つ以上から選択される試料をアッセイするステップを含む。一態様において、方法は、乳がん、卵巣がん、肺がん、膵がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、脳がん、口腔（ｏｒａｌ）がん及び／又は腎がんのうちの１つ以上から選択される試料についてアッセイするステップを含む。一部の態様において、方法は、乳房、卵巣、肺、膵臓、胃、結腸及び直腸、前立腺、肝臓、子宮頸部、膀胱、食道、脳、口腔及び／又は腎臓の、がん、新生物、過形成のうちの１つ以上を検出するステップを含む。

【0550】

一態様において、疾患状態のうちの１つ以上は、Ｂ細胞リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）により特徴づけられる。

【0551】

一態様において、本開示は、それを必要とする対象の処置における、抗新生物剤の治療有効性を決定するために、本開示の新規のアレイを使用する方法であって、（ａ）対象に由来する試料を用意するステップ；（ｂ）試料を、ＴＡＣＡアレイと接触させるステップ；（ｃ）ＴＡＣＡ又は抗体のうちの１つ以上の結合についてアッセイするステップ；及び（ｄ）新生物に対する処置における、抗新生物剤の治療効果を、グリカンの検出についてのアッセイ値に基づき決定するステップを含む方法に関する。

【0552】

一態様において、それを必要とする対象の処置時における、抗新生物剤の治療有効性を決定するために、本開示の新規のアレイを使用する方法であって、（ａ）処置の前に、対象に由来する試料を用意するステップ；（ｂ）試料を、ＴＡＣＡアレイと接触させるステップ；（ｃ）処置の前に、ＴＡＣＡ結合性部分の力価についてアッセイするステップ；（ｄ）抗新生物剤の投与の後における、１つ以上の対象に由来する試料を用意するステップ；（ｅ）１つ以上の試料を、ＴＡＣＡアレイと接触させるステップ；（ｆ）１つ以上の試料中の、ＴＡＣＡ力価についてアッセイするステップ；及び（ｇ）新生物に対する処置における、抗新生物剤の治療効果を、ＴＡＣＡ力価の変化に基づき決定するステップを含む方法が提供される。一部の態様において、ＴＡＣＡ結合性部分は、抗体でありうる。

【0553】

一態様において、抗新生物剤は、ワクチンを含む。ワクチンは、担体タンパク質へとコンジュゲートされた、炭水化物抗原又は炭水化物の免疫原性断片を含みうる。一部の態様において、炭水化物抗原又は炭水化物の免疫原性断片は、グロボＨ、段階特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ−３）、段階特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ−４）、Ｔｎ、ＴＦ、ｓＴｎ、ポリシアル酸、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｌｅ^ｘ、Ｌｅ^ｙ、Ｌｅ^ａ、ｓＬｅ^ｘ、ＳＬｅ^ａ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ａ２Ｂ５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、フコシル−ＧＭ１又はＮｅｕ５ＧｃＧＭ３を含みうる。一態様において、担体タンパク質は、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＤＴ−ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素交差反応性物質１９７）、ジフテリアトキソイド又は破傷風トキソイドを含む。一態様において、ワクチンは、医薬組成物として提供される。一態様において、医薬組成物は、グロボＨ−ＫＬＨ及びさらなるアジュバントを含む。一態様において、さらなるアジュバントは、サポニン、フロイントアジュバント又はα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）アジュバントから選択される。一態様において、医薬組成物は、本明細書において記載された、ＯＢＩ−８２２／ＯＢＩ−８２１を含む。一態様において、抗新生物剤は、１つ以上の炭水化物抗原に結合することが可能な、抗体又はこの抗原結合性部分を含む。

【0554】

一態様において、それを必要とする対象は、がん、癌、新生物又は過形成のうちの１つ以上を有することが疑われる。一態様において、がんは、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、神経膠芽腫、肺がん、乳がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、膀胱がん、膵がん、腸がん、結腸直腸がん、腎がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、精巣がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、口腔咽頭がん、喉頭がん及び前立腺がんからなる群から選択される。

【0555】

本発明のアレイ上において使用されたグリカンは、２つ以上の糖単位を含みうる。本発明のグリカンは、直鎖状及び分枝状のオリゴ糖のほか、天然に存在するグリカン及び合成のグリカンを含みうる。本発明のグリカン内に、アロース、アルトロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース、グロース、フコース、果糖、イドース、リキソース、マンノース、リボース、タロース、キシロース、ノイラミン酸又は他の糖単位を含む、任意の種類の糖単位が存在しうることが想定される。このような糖単位は、様々な置換基を有しうる。例えば、糖単位上に、典型的に存在する置換基の代わりに、又はこれらに加えて存在しうる置換基は、アミノ、カルボキシイオン及びその塩（例えば、ナトリウムカルボン酸）を含むカルボキシ、チオール、アジド、Ｎ−アセチル、Ｎ−アセチルノイラミン酸、オキシ（＝Ｏ）、シアル酸、硫酸イオン及びその塩を含むスルフェート（−ＳＯ４−）、リン酸イオン及びその塩を含むホスフェート（−ＰＯ４−）、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アシル及び／又は低級アルカノイルアミノアルキルを含む。脂肪酸、脂質、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質もまた、本発明のグリカンへと接合される。一部の態様において、グリカンは、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ、ＳＬｅ^ｘ又はこれらの任意の組合せを含みうる、又はこれらを除外しうる。一部の態様において、グリカンは、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ、ＳＬｅ^ｘの、ｎ−ペンチルアミン官能化変異体又は官能化グリカン変異体及び／若しくは非官能化グリカンの任意の組合せを含む、又はこれを除外する。

【0556】

別の態様において、本発明は、固体基質及び固体支持体上の、膨大な、規定されたグリカン位置を含み、各グリカン位置が、これへと接合された、１つの種類のグリカン分子の、複数のコピーを含む、固体支持体の領域を規定し、本明細書において記載された通り、グリカンが、リンカーにより、マイクロアレイへと接合されたマイクロアレイを提供する。これらのマイクロアレイは、例えば、約１つ〜約１００，０００の間の、異なるグリカン位置又は約１つ〜約１０，０００の間の、異なるグリカン位置又は約２つ〜約１００の間の、異なるグリカン位置又は約２〜約５の間の、異なるグリカン位置を有しうる。一部の態様において、アレイへと接合されたグリカンは、グリカンプローブと称される。

【0557】

別の態様において、本発明は、被験分子又は被験物質が、本発明のアレイ上又はマイクロアレイ上に存在するグリカンに結合しうるのかどうかを同定する方法を提供する。方法は、アレイを、被験分子又は被験物質と接触させるステップと、被験分子又は被験物質が、グリカンライブラリー内又はアレイ上のグリカンに結合するのかどうかを観察するステップとを伴う。一部の態様において、本開示は、本明細書において記載された通り、ライブラリー内の被験分子又は被験物質に関する。

【0558】

別の態様において、本発明は、被験分子又は被験物質が、どのグリカンに結合しうるのかを同定する方法であって、グリカンが、本発明のアレイ上に存在する方法を提供する。方法は、アレイを、被験分子又は被験物質と接触させるステップと、被験分子又は被験物質が、どのグリカンアレイに結合しうるのかを観察するステップとを伴う。

【0559】

各グリカン位置における、グリカンの密度は、誘導体化されたグリカン位置へと適用された、様々な濃度のグリカン溶液によりモジュレートされうる。

【0560】

本発明の別の態様は、リンカー分子を介して、アレイへと接合された分子のライブラリーを含みうる、分子のアレイに関し、この場合、切断型リンカーは、以下の構造：
Ｇ−Ａ−Ｚ−Ｘ 式１
［式中、Ｇは、グリカンであり；Ａは、エステル又はアミドを含む部分であり；Ｘは、基質、例えば、表面、固体表面、透明の固体、非透明の固体、選択された波長の可視光又は非可視光に対して透明の固体、粒子、アレイ、マイクロバブル又はビーズ、コーティングされた基質、コーティングされた表面、ポリマー表面、ニトロセルロースによりコーティングされた表面又はビーズ表面；基質へと接合されたスペーサー基又はリンカーを、基質へと接着させるための基を伴うスペーサー基であり；Ｚは、１つ以上のリンカーである］
を有し、前記リンカーは、脂質鎖、脂質鎖を伴う、１つ以上のスペーサー基を含みうる。

【0561】

一部の態様において、アレイは、基質及び固体支持体上の、膨大な、規定されたグリカン位置を含み、各グリカンプローブの位置が、これへと接合された、１つの種類の、類似するグリカン分子の、複数のコピーを有する、固体支持体の領域を規定する。

【0562】

一部の態様において、ＡとＸとの相互作用は、共有結合の場合もあり、ファンデルワールス相互作用の場合もあり、水素結合の場合もあり、イオン結合の場合もあり、疎水性相互作用の場合もある。

【0563】

本発明の別の態様は、被検試料中の分子が、分子のアレイに結合しうるのかどうかを調べる方法であって、（ａ）アレイを、被検試料と接触させるステップ及び（ｂ）被検試料中の分子が、アレイへと接合された分子に結合するのかどうかを観察するステップを含みうる方法である。

【0564】

本発明の別の態様は、どの分子構造が、被検試料中の生体分子に結合するのかを決定する方法であって、分子のアレイを、被検試料と接触させるステップと、アレイを洗浄し、切断型リンカーを切断して、アレイへと接合された分子の分子構造についての、構造的解析又は機能的解析を可能とするステップとを含みうる方法である。例えば、生体分子は、抗体、受容体又はタンパク質複合体でありうる。

【0565】

本発明の別の態様は、被検試料中の、乳がんを含むがんを検出する方法であって、（ａ）被検試料を、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ及びＳＬｅ^ｘを含むグリカンへと、共有結合的に接合されたリンカーと接触させるステップ；（ｂ）被検試料中の抗体が、グロボＨ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｌｅ^ｙ、ＳＬｅ^ａ及びＳＬｅ^ｘと関連する分子／決定基に結合するのかどうかを決定するステップを含みうる方法である。

【0566】

一態様において、本開示は、以下の式：

【0567】

【化12】

を有する化合物を特色とする。

【0568】

本発明の一般的態様
したがって、本開示は、がん上のグロボ系列抗原が、微小環境へとシェディングされ、Ｔ細胞へと組み込まれるという発見に基づく。Ｔ細胞の活性化は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの組込みの後において阻害された。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの、Ｔ細胞への組込みを阻害するための、抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体の添加は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドにより誘導される免疫抑制を阻害しうる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントは、ＴＣＲによるシグナル伝達経路を抑制した。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの、Ｔ細胞への添加は、ＴＣＲによるシグナル伝達をさらに阻害する。グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミドの組込みは、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントによる抑制（すなわち、免疫チェックポイント作用）を遮断する結果である、ＴＣＲによるシグナル伝達の波及効果を低減した。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を伴う、抗グロボＨ抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体の添加は、グロボＨセラミド又はＳＳＥＡ−４セラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより抑制された、ＴＣＲによるシグナル伝達を相乗的に反転させる。グロボＨ抗原又はＳＳＥＡ−４抗原を発現するがんは、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、神経膠芽腫、肺がん、乳がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、膀胱がん、膵がん、腸がん、結腸直腸がん、腎がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、精巣がん、口腔（ｂｕｃｃａｌ）がん、口腔咽頭がん、喉頭がん及び前立腺がんを含むがこれらに限定されない。

【0569】

組合せ療法における、チェックポイント阻害剤の非限定例についての記載
免疫チェックポイント系を阻害／遮断する分子である、免疫チェックポイント阻害剤が、進行型新生物のための効果的な治療として勃興しており、これらの中には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）を遮断し、いくつかの腫瘍のために使用されている治療用抗体が存在する（Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、２０１６年５月、１６（５）：２７５〜８７）。Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーの受容体のメンバーであるＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質、ＣＤ２７９）は、それらの発現が、遺伝子機構と、後成的機構との相互関係により精細に調節されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び骨髄由来サプレッサー細胞を含む活性化白血球の細胞表面上において発現された単量体の分子である。ＰＤ−１の公知のリガンドは、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２である（Ｆａｒｋｏｎａ Ｓ．ら、ＢＭＣ Ｍｅｄ．、２０１６年５月５日、１４：７３）。

【0570】

ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死タンパク質リガンド１、Ｂ７Ｈ１、ＣＤ２７４）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞及び樹状細胞を含む造血細胞上及び非造血細胞（肺細胞、心臓細胞、内皮細胞、膵島細胞、角化細胞など）上並びに、とりわけ、がん細胞上、低レベルにおいて発現され、細胞が活性化されると、上方調節される。ＰＤ−Ｌ２（プログラム細胞死タンパク質リガンド２、Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）は、マクロファージ上、樹状細胞（ＤＣ）上、活性化ＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球上及び一部の充実性腫瘍（卵巣癌、小細胞肺がん、食道がん）上において発現される。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現はまた、正常線維芽細胞上及びがん関連線維芽細胞上においても検出されている。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のいずれも、さらなる受容体と相互作用する：ＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ２８リガンドである、ＣＤ８０と相互作用し、ＰＤ−Ｌ２は、マクロファージ上及び他の細胞型上において発現された、反発型ガイダンス分子（ＲＧＭ）ｂと相互作用する。ＰＤ−１の細胞質テールは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する。Ｔリンパ球内において、ＰＤ−１の、このリガンドとの相互作用は、ＰＤ−１の細胞内テールにおける、２つのチロシンのリン酸化；ＰＤ−１のＩＴＳＭ細胞質領域への、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ−１及び／又はＳＨＰ−２）の動員を結果としてもたらし、次いで、Ｔ細胞受容体の下流のシグナルを阻害し、これにより、Ｔ細胞の増殖及びサイトカインの産生を阻害する。ＰＤ−１はまた、Ｔ細胞に対して、他の影響も及ぼす；例えば、ＰＤ−１の誘発は、Ａｋｔ経路及びＲａｓ経路を阻害することにより、ユビキチンリガーゼの構成要素である、ＳＫＰ２の転写を抑制する：これは、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤である、ｐ２７（ｋｉｐ１）のＳＫＰ２媒介性分解を結果として損ない、これにより、細胞周期の進行の遮断を結果としてもたらす。加えて、ＰＤ−１は、１つを超える機構により、アポトーシスを促進しうる。Ｔ細胞の活性化を、直接阻害するほか、ＰＤ−Ｌ１によるＰＤ−１の誘発は、エフェクターＴ細胞を、能動的に抑制する、末梢性寛容の鍵となるメディエーターである調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発生を誘導しうる。ＰＤ−１の誘発によるＴｒｅｇの誘導は、ＰＤ−１に誘導された、ＰＴＥＮの活性により、そのレベルが、低度に保たれた、ホスホＡｋｔなど、鍵となるシグナル伝達分子のモジュレーションにより媒介される。いくつかの種類のがん細胞は、確かに、ＰＤ−Ｌ１を発現する。さらに、腫瘍微小環境内の、非新生物性細胞（内皮細胞、白血球、線維芽細胞）もまた、ＰＤ−Ｌ１を発現しうる。これは、腫瘍微小環境内の、非新生物性細胞が、腫瘍浸潤性ＰＤ−１＋ Ｔリンパ球（ＴＩＬ）に対して、寛容であり、かつ／又はＴｒｅｇの発生を誘導することを示唆し、実際、一部のがんの種類（黒色腫、腎癌腫、非小細胞肺がんなど）に罹患した患者の、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）による処置が、腫瘍の増殖を低減しうることを、ますます多くの証拠が指し示している。

【0571】

現在、１００を超える臨床試験が、様々ながんにおける、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の遮断の、臨床的有効性について探索しつつある。しかし、極めて有望な結果にもかかわらず、ａ）全ての腫瘍の種類が、抗ＰＤ−１ ｍＡｂ又は抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂに対して、著明な応答を示すわけではないこと及びｂ）応答性がんのサブセットにおいても、全ての患者が、応答性であるわけではなく、一部の応答は、極めて部分的であることが明らかである。これらの証拠の断片は、研究の現段階における、応答の耐久性についての不確実性と共に、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂと、他の経路に作用するツールとの、効果的な治療的組合せに対する必要を指し示す（Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２０１５年４月１３日；２７（４）：４５０〜６１）。

【0572】

免疫チェックポイント阻害剤は、ヒトにおいて、ある程度の抗腫瘍活性をもたらすことが公知であるが、この部分的な抗腫瘍活性は、処置された対象のうちの一部において観察されるに過ぎない。チェックポイント阻害剤は、タンパク質、アミノ酸残基を含むポリペプチド及びモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含みうる、又は除外しうる。本明細書において記載された組成物は、１つを超えるチェックポイント阻害剤を含みうる、又はこれらと共に投与されうる。一部の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４を含む、Ｔ細胞調節因子のファミリーのいずれかにおいて見出されたリガンド又はタンパク質に結合する。チェックポイント阻害剤の標的は、免疫系のエフェクター細胞上又は調節性細胞上（例えば、Ｔ細胞上）において発現された受容体又は共受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４；ＣＤ８）；抗原提示細胞の表面上において発現された（すなわち、ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を含みうる、又は除外しうる、活性化Ｔ細胞の表面上において発現された）タンパク質；代謝性酵素又は、腫瘍及び腫瘍浸潤性細胞の両方により発現された、代謝性酵素（例えば、ＩＤＯ１及びＩＤＯ２などのアイソフォームを含む、インドールアミン（ＩＤＯ））；免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質（例えば、また、ＬＡＧ３としても公知の、リンパ球活性化遺伝子３）；Ｂ７スーパーファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｂ７−Ｈ３又はこの相同体）を含みうる、又は除外しうる。Ｂ７タンパク質は、活性化抗原提示細胞上及び活性化Ｔ細胞上のいずれにおいても見出されうる。一部の実施形態において、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、組み合わされる、又は併せて対にされる。例えば、抗原提示細胞上において見出された、Ｂ７ファミリーのチェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞の表面上において発現された、ＣＤ２８阻害剤又はＣＴＬＡ−４阻害剤と、対にされて、これらの２つの種類の細胞の間の活性を減少させるように、共阻害性シグナルをもたらしうる。共受容体とは、外部のリガンドへの結合の後に、内部の細胞過程を調節しうる、同じ細胞上に配置された、２つの異なる受容体の存在を指す。共受容体は、刺激性の場合もあり、阻害性の場合もある。共受容体は、場合によって、アクセサリー受容体又は共シグナル伝達受容体とも呼ばれる。本明細書において使用された、「共阻害性」という用語は、１つを超える分子が、細胞の表面上における、これらのそれぞれの受容体に結合し、これにより、細胞内過程が生じることを、緩徐化させる、又は阻止する結果を指す。

【0573】

ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体若しくは抗ＣＴＬＡ−４抗体又はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＣＴＬＡ−４の阻害剤など、ＰＤ−１経路又はＣＴＬＡ−４経路を阻害する、阻害性受容体のアンタゴニストを含みうる。ＰＤ−１阻害剤又はＰＤ−Ｌ１阻害剤の例は、限定せずに述べると、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ、商標名：Ｋｅｙｔｒｕｄａ）又はピジリズマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ）、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、アベルマブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、デュルバルマブ）及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ、アテゾリズマブ）など、ヒトＰＤ−１を遮断するヒト化抗体のほか、ニボルマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ、商標名：Ｏｐｄｉｖｏ）などの完全ヒト抗体を含みうる。他のＰＤ−１阻害剤は、限定せずに述べると、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ又はＡＭＰ−２４４としてもまた公知の、ＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合タンパク質を含む、可溶性ＰＤ−１リガンドの提示並びに、現在、治療における使用のための探索下及び／又は開発下にある、他のＰＤ−１阻害剤を含みうる。加えて、免疫チェックポイント阻害剤は、限定せずに述べると、デュルバルマブ及びＭＩＨ１並びに現在探索下にある、他のＰＤ−Ｌ１阻害剤など、ＰＤ−Ｌ１を遮断する、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含みうる。一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態において、ＰＤ−１阻害剤又はＣＴＬＡ−４阻害剤は、限定せずに述べると、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ、商標名：Ｋｅｙｔｒｕｄａ）又はピジリズマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１ Ａｂ、商標名：Ｏｐｄｉｖｏ）、チシリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４ Ａｂ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４ Ａｂ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＡＭＰ−２２４、ＩＭＰ３２１（ＩｍｍｕＦａｃｔ）、ＭＧＡ２７１、インドキシモド及びＩＮＣＢ０２４３６０など、ヒトＰＤ−１を遮断するヒト化抗体を含む。

【0574】

組合せ療法
したがって、抗ネガティブ免疫チェックポイントの遮断と組み合わされた、抗グロボＨ抗体による、グロボＨセラミドの枯渇は、免疫抑制の克服において、効果的でありうる。本発明者らの知見は、ネガティブ免疫チェックポイントの遮断を伴う、グロボ系列抗原（グロボＨ又はＳＳＥＡ−４による）のターゲティングが、Ｔ細胞を、不活化からレスキューするように、協同的に、相加的に、かつ／又は相乗的に作用することを支援する。

【0575】

したがって、本発明の第１の実施形態は、抗グロボＨ抗体及び／若しくは抗ＳＳＥＡ−４抗体又はこれらの断片と、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤とを含む組合せに関する。ある特定の具体的な実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ネガティブ免疫チェックポイント抗体である。

【0576】

本開示は、抗腫瘍免疫処置を必要とする対象のための、組合せ療法のための方法であって、対象が、チェックポイント阻害剤のモジュレーションの増強又は増大を介した、有効性の増大又は腫瘍応答の改善を必要とする方法を提示する。

【0577】

一態様において、組合せ療法は、個別の単剤療法製剤又は組み合わされた共製剤として、同時に、又は逐次的に投与される。投与の順序は、最大の治療有効性を達成するために、時差が設けられる場合もあり、入れ子とされる場合もある。一態様において、治療剤は、ワクチンであり、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である。

【0578】

一態様において、処置の有効性は、１）Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増大、腫瘍の退縮又は腫瘍体積の減縮又は腫瘍の壊死の増大により増強される。特定の実施形態において、前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１チェックポイント阻害剤、ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤又はＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤である。

【実施例】

【0579】

［実施例１］ 多様ながん細胞から、ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞への、グロボＨ又はＳＳＥＡ−４のシェディングの裏付け
ヒトがん細胞系（全て、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入された、ＨＣＣ１４２８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ−３、ＡＣＨＮ又はＮＣＩ−Ｈ５２６）を、２４ウェルプレート内の、ＡＴＣＣが示唆した、完全増殖培地中に、個別に播種し、５％のＣＯ_２と共に、３７℃において、３日間にわたりインキュベートした。インキュベーション３日後、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を添加し、５％のＣＯ_２、３７℃において、２日間にわたり、がん細胞を伴い、又はこれを伴わずに培養した。がん細胞、がん細胞を伴い、かつ、これを伴わずに培養されたＰＢＭＣを、それぞれ、細胞表面における、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗グロボＨ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗ＳＳＥＡ−４及びＡＰＣ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．；カタログ＃：３４４８１８）による、複数回の染色のために採取した。図１における結果は、グロボＨ又はＳＳＥＡ−４が、腫瘍細胞から、ヒトＴ細胞へとシェディングされうることを示した。

【0580】

［実施例２］ グロボ系列のスフィンゴ糖脂質によるＴ細胞の活性化の抑制の裏付け
Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｒｅ Ｌｕｃ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．、カタログ＃：Ｇ７１０２）を、４８ウェル培養プレート内において、多様な濃度の、化学的に合成された、グロボＨセラミド（ＧＨＣｅｒ）又はＳＳＥＡ−４セラミド（ＳＳＥＡ４Ｃｅｒ）を伴い、又はこれを伴わずに、１８〜２４時間にわたりプレインキュベートした。細胞を回収し、６時間にわたる活性化のために、３７℃のインキュベーター内において、抗ヒトＣＤ３（ウェル１つ当たり１００ｎｇ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．；カタログ＃：３１７３２６）及び抗ヒトＣＤ２８（ウェル１つ当たり３００ｎｇ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．；カタログ＃：３０２９１４）により、一晩にわたりコーティングされた、白色平底９６ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ；カタログ＃：６５５０７３）へと移した。アッセイプレートを、インキュベーターから取り出し、１５分間にわたり、室温（２２℃〜２５℃）へと平衡化させた。７５μＬの、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．；カタログ＃：Ｇ７９４０）を添加し、プレートを、ＲＴにおいて、１５分間にわたりインキュベートした。マイクロプレートリーダーである、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＬＬＣ．）を使用して、発光を測定した。光電子増倍管（ＰＭＴ）の感度を、オートレンジとして設定し、５７０ｎｍにおいて較正した。誘導倍率を、ＲＬＵ_{ａｃｔｉｖａｔｅｄ}／ＲＬＵ_{ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ}により計算した。図２における結果は、ＧＨＣｅｒ又はＳＳＥＡ４Ｃｅｒが、抗ＣＤ３／２８による刺激に対する、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化を、用量依存的に抑制することを示した。

【0581】

［実施例３］ グロボＨセラミドにより誘導されたＴ細胞の不活化の、抗グロボＨ抗体による反転の裏付け
４０、２０及び５μＭのＧＨＣｅｒを、１０μＭの、抗グロボＨ抗体である、ＯＢＩ−８８８と共に、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃：Ａ１０４９１０１）を、０．５％の超低ＩｇＧウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ＃：ＳＨ３０８９８．０３）と共に含有するアッセイ培地中、３７℃において、３時間にわたりインキュベートした。試料を、５０００×ｇにおいて、５分間にわたり遠心分離し、上清を採取し、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｒｅ Ｌｕｃ細胞と共に１８〜２４時間にわたりインキュベートした。細胞を回収し、白色平底９６ウェルアッセイプレートへと移し、３７℃のインキュベーター内において、６時間にわたる活性化のために、抗ヒトＣＤ３（ウェル１つ当たり１００ｎｇ）及び抗ヒトＣＤ２８（ウェル１つ当たり３００ｎｇ）により、一晩にわたりコーティングした。アッセイプレートを、インキュベーターから取り出し、１５分間にわたり、室温（２２℃〜２５℃）へと平衡化させた。７５μＬの、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、プレートを、ＲＴにおいて、１５分間にわたりインキュベートした。マイクロプレートリーダーである、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌを使用して、発光を測定した。光電子増倍管（ＰＭＴ）の感度を、オートレンジとして設定し、５７０ｎｍにおいて較正した。誘導倍率を、ＲＬＵ_{ａｃｔｉｖａｔｅｄ}／ＲＬＵ_{ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ}により計算した。図３に明示された結果は、ＯＢＩ−８８８（例示的な抗グロボＨ抗体）が、抗ＣＤ３／２８により活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対する、ＧＨＣｅｒにより誘導された免疫抑制を反転させうることを示した。

【0582】

［実施例４］ ＳＳＥＡ−４セラミドにより誘導されたＴ細胞の不活化の、抗ＳＳＥＡ−４抗体による反転の裏付け
４０、２０及び１０μＭのＳＳＥＡ４Ｃｅｒを、５μＭの、抗ＳＳＥＡ−４抗体である、ＯＢＩ−８９８と共に、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃：１１８７５０９３）を、０．１％の超低ＩｇＧウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ＃：ＳＨ３０８９８．０３）と共に含有するアッセイ培地中、３７℃において、５時間にわたりインキュベートした。試料を、７０００×ｇにおいて、５分間ずつ、２回にわたり遠心分離し、上清を採取し、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ−κＢ−Ｒｅ Ｌｕｃ細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃：ＳＬ−００５０−ＮＰ）と共に、１８〜２４時間にわたりインキュベートした。細胞を回収し、白色平底９６ウェルアッセイプレートへと移し、３７℃のインキュベーター内において、６時間にわたる活性化のために、抗ヒトＣＤ３（ウェル１つ当たり１００ｎｇ）及び抗ヒトＣＤ２８（ウェル１つ当たり３００ｎｇ）により、一晩にわたりコーティングした。アッセイプレートを、インキュベーターから取り出し、１５分間にわたり、室温（２２℃〜２５℃）へと平衡化させた。７５μＬの、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、プレートを、ＲＴにおいて、１５分間にわたりインキュベートした。マイクロプレートリーダーである、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌを使用して、発光を測定した。光電子増倍管（ＰＭＴ）の感度を、オートレンジとして設定し、５７０ｎｍにおいて較正した。誘導倍率を、ＲＬＵ_{ａｃｔｉｖａｔｅｄ}／ＲＬＵ_{ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ}により計算した。図４に明示された結果は、ＯＢＩ−８９８（例示的な抗ＳＳＥＡ−４抗体）が、抗ＣＤ３／２８により活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対する、ＳＳＥＡ４Ｃｅｒにより誘導された免疫抑制を反転させうることを示した。

【0583】

［実施例５］ ＴＣＲによるシグナル伝達に対する阻害の増強における、グロボ系列スフィンゴ糖脂質の、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントとの相乗的応答の裏付け
多様な濃度の、ＧＨＣｅｒ又はＳＳＥＡ４Ｃｅｒを、ＰＤ−１エフェクター細胞（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃：Ｊ３０１１）と共にインキュベートし、次いで、３７℃において、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋標的細胞（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃：Ｊ３０１１）を、９６ウェルプレート内に播種し、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋細胞によりコーティングされたプレートに由来する増殖培地を、ＧＨＣｅｒ又はＳＳＥＡ４Ｃｅｒ／エフェクター細胞のＲｘｎにより置換え、６時間にわたりインキュベートした。プレートを、周囲温度へと、１０分間にわたり取り出した。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ルミノメーターにより読み取った。図６における結果は、ＧＨＣｅｒ又はＳＳＥＡ４Ｃｅｒが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントと共に、相乗的に作用して、ＴＣＲ活性化型シグナル伝達経路を抑制することを示した。

【0584】

［実施例６］ ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害された、ＴＣＲによるシグナル伝達の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑによる解放の、グロボＨセラミドによる低減
４０μＭのＧＨＣｅｒを、ＰＤ−１エフェクター細胞（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃：Ｊ３０１１）と共にインキュベートし、次いで、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋標的細胞を、９６ウェルプレート内に播種し、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋細胞によりコーティングされたプレートに由来する増殖培地を、２μＭの抗ＰＤ−１ ｍＡｂである、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又は２μＭの抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂである、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑを伴う、ＧＨＣｅｒ／エフェクター細胞のＲｘｎにより置換え、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、６時間にわたりインキュベートした。プレートを、周囲温度へと、１０分間にわたり取り出した。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ルミノメーターにより読み取った。図７における結果は、ＧＨＣｅｒの、エフェクター細胞への組込みが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害された、ＴＣＲによるシグナル伝達の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑによる解放を低減したことを示した。

【0585】

［実施例７］ ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害された、ＴＣＲによるシグナル伝達の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑによる解放の、ＳＳＥＡ−４セラミドによる低減
４０μＭのＳＳＥＡ４Ｃｅｒを、ＰＤ−１エフェクター細胞（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃：Ｊ３０１１）と共にインキュベートし、次いで、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋標的細胞を、９６ウェルプレート内に播種し、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋細胞によりコーティングされたプレートに由来する増殖培地を、２μＭの抗ＰＤ−１ ｍＡｂである、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又は２μＭの抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂである、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑを伴う、ＳＳＥＡ４Ｃｅｒ／エフェクター細胞のＲｘｎにより置換え、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、６時間にわたりインキュベートした。プレートを、周囲温度へと、１０分間にわたり取り出した。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ルミノメーターにより読み取った。図８における結果は、ＳＳＥＡ４Ｃｅｒの、エフェクター細胞への組込みが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害された、ＴＣＲによるシグナル伝達の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑによる解放を低減したことを示した。

【0586】

［実施例８］ グロボＨセラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントによる、ＴＣＲによるシグナル伝達の阻害の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑと組み合わされた、抗グロボＨ抗体による反転
ＧＨＣｅｒを、９９％ＲＰＭＩ １６４０／１％ＦＢＳ（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃：Ｊ３０１１）を含有するアッセイ培地中に、１０μＭのＯＢＩ−８８８と共に、３７℃において、４時間にわたりインキュベートした。試料を、８０００×ｇにおいて、５分間ずつ、２回にわたり遠心分離し、上清を採取し、ＰＤ−１エフェクター細胞と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋標的細胞を、９６ウェルプレート内に播種し、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋細胞によりコーティングされたプレートに由来する増殖培地を、２μＭのＫｅｙｔｒｕｄａ又は２μＭのＴｅｃｅｎｔｒｉｑを伴う、ＧＨＣｅｒ／エフェクター細胞のＲｘｎにより置換え、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、６時間にわたりインキュベートした。プレートを、周囲温度へと、１０分間にわたり取り出した。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ルミノメーターにより読み取った。図１０における結果は、ＯＢＩ−８８８が、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑと共に、相乗的に作用して、ＧＨＣｅｒ及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害された、ＴＣＲによるシグナル伝達をレスキューすることを示した。

【0587】

［実施例９］ ＳＳＥＡ−４セラミド及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントによる、ＴＣＲによるシグナル伝達の阻害の、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑと組み合わされた、抗ＳＳＥＡ−４抗体による反転
ＳＳＥＡ４Ｃｅｒを、アッセイ培地中に、５μＭのＯＢＩ−８９８と共に、３７℃において、４時間にわたりインキュベートした。試料を、８０００×ｇにおいて、５分間ずつ、２回にわたり遠心分離し、上清を採取し、ＰＤ−１エフェクター細胞と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋標的細胞を、９６ウェルプレート内に播種し、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、２４時間にわたりインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１＋細胞によりコーティングされたプレートに由来する増殖培地を、２μＭのＫｅｙｔｒｕｄａ又は２μＭのＴｅｃｅｎｔｒｉｑを伴う、ＳＳＥＡ４Ｃｅｒ／エフェクター細胞のＲｘｎにより置換え、３７℃において、５％ＣＯ_２と共に、６時間にわたりインキュベートした。プレートを、周囲温度へと、１０分間にわたり取り出した。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ルミノメーターにより読み取った。図１１における結果は、ＯＢＩ−８９８が、Ｋｅｙｔｒｕｄａ又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑと共に、相乗的に作用して、ＳＳＥＡ４Ｃｅｒ及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のエンゲージメントにより阻害された、ＴＣＲによるシグナル伝達をレスキューすることを示した。

【0588】

そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書において使用された、全ての技術用語及び学術用語並びに任意の頭字語は、本発明の分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記載されたものと同様又は同等である、任意の組成物、方法、キット及び情報を通信するための手段が、本発明を実施するのに使用されうるが、本明細書において、好ましい組成物、方法、キット及び情報を通信するための手段が記載される。

【0589】

本明細書において引用された、全ての参考文献は、法律の下で可能な全範囲まで、参照により本明細書に組み込まれる。これらの参考文献についての議論は、これらの著者によりなされた主張を要約することだけが意図される。参考文献（又は任意の参考文献の部分）が、関連する先行技術であるとする、いかなる容認もなされない。本出願者らは、引用された、任意の参考文献の精度及び適切性に対して、異議を申し立てる権利を保有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】