特表 2021-525897 リガンドおよびそのようなリガンドの結合標的を選択する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-525897(P2021-525897A)

(43)【公表日】2021年9月27日

(54)【発明の名称】リガンドおよびそのようなリガンドの結合標的を選択する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20210830BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20210830BHJP

   C07K 1/00 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20210830BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210830BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20210830BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20210830BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20210830BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20210830BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/50 Z

   C12P21/00 C

   C07K1/00

   A61P29/00

   A61P37/08

   A61P35/00

   A61P31/12

   A61P31/04

   A61P37/02

   A61K38/02

   A61K47/64

   G01N33/15 Z

   G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2021-517519(P2021-517519)

(86)(22)【出願日】2019年5月29日

(85)【翻訳文提出日】2021年1月25日

(86)【国際出願番号】EP2019064094

(87)【国際公開番号】WO2019229182

(87)【国際公開日】20191205

(31)【優先権主張番号】1808835.1

(32)【優先日】2018年5月30日

(33)【優先権主張国】GB

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】520468324

【氏名又は名称】バイスクルアールディー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＣＹＣＬＥＲＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100170379

【弁理士】

【氏名又は名称】徳本 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(72)【発明者】

【氏名】チェン，リウホン

(72)【発明者】

【氏名】ボニー，クリストフ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B064

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA20

2G045DA36

2G045FB03

4B064AG01

4B064CC24

4B064DA01

4C076AA95

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC32

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA03

4C084BA25

4C084BA31

4C084CA59

4C084DC50

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB131

4C084ZB132

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045EA20

4H045FA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、リガンドの標的を選択する方法であって、前記リガンドが、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含み、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、方法を提供する。本発明はまた、前記標的、前記リガンド、ならびにそのような標的およびリガンドを使用する方法および製造する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する方法であって、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
という特徴を備えるポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングするステップと、
（ｂ）（ａ）に定義されたポケットを少なくとも１つ有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップと
を含む方法。

【請求項2】

（ａ）に定義されたポケットが、（１０〜３０）×（１０〜３０）×（５〜３０）Åの内部寸法をさらに備える、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドを選択する方法であって、
（ａ）請求項１または請求項２に定義されたポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングし、少なくとも１つのそのようなポケットを有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つのタンパク質を前記リガンドのうちの１つまたは複数と接触させ、前記タンパク質に結合する少なくとも１つのリガンドを選択するステップと
を含む方法。

【請求項4】

少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドを調製する方法であって、
（ａ）請求項２に従って選択されたリガンドの、ポリペプチド成分のアミノ酸配列を決定するステップと、
（ｂ）（ａ）において決定された配列を有するポリペプチドを合成するステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドを分子足場と反応させて、前記リガンドを生成させるステップと
を含む方法。

【請求項5】

ポケットが、さらなるタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメイン中に位置するかどうかを、決定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

標的タンパク質を請求項１に定義されたリガンドのライブラリーに暴露し、前記標的タンパク質に結合する１つまたは複数のリガンドを選択することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

分子足場が、前記分子足場をポリペプチドに付着させる共有結合の数と対応する分子対称性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

分子足場が、３回対称の分子対称性を有し、分子足場が、３つの共有結合によってポリペプチドに付着される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

分子足場が構造的に強固な化学基を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

分子足場が、トリス−（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）、１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）−トリス（２−ブロモアセトアミド）（ＴＢＡＢ）、および／またはＮ，Ｎ’，Ｎ”−ベンゼン−１，３，５−トリイルトリスプロパ−２−エナミド（ＴＡＡＢ）を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ポリペプチドがシステイン残基を含み、前記ポリペプチドへの前記分子足場の付着のための前記３つの共有結合のうちの少なくとも１つが、前記システイン残基への結合を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成し、前記リガンドが、請求項１（ａ）に定義されたポケットを有するがカリクレイン、ＭＤＭ２、カテプシンＧから選択されるポリペプチドではない標的に結合する、リガンド。

【請求項13】

少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成し、前記リガンドが、
アルファ−２−マクログロブリン；ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー６；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン３３；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン９；アディポネクチン、Ｃ１Ｑおよびコラーゲンドメイン含有；アデノシンＡ（３）受容体；ベータ３アドレナリン受容体；アグーチ関連タンパク質ホモログ（マウス）；アンギオテンシンＩＩ受容体、１型；活性化白血球細胞接着分子；アポリポタンパク質Ｅ；アポリポタンパク質Ｈ（ベータ２グリコプロテインＩ）；アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質；アクアポリン４；アクアポリン５；アミロイド前駆体タンパク質ベータサイト切断酵素１；殺菌性透過性増強タンパク質；補体第１成分、ｑ亜成分、Ｂ鎖；補体第１成分、ｑ亜成分、Ｃ鎖；補体第１成分、ｒ亜成分；補体第１成分、ｓ亜成分；補体第２成分；補体第６成分；補体第７成分；補体第８成分、ベータポリペプチド；炭酸脱水酵素ＸＩＩ；炭酸脱水酵素ＩＶ；炭酸脱水酵素ＶＩ；ＣＡＲＴプレプロペプチド；コレシストキニンＢ受容体；ケモカインＣＣＬ１１；ＣＤ３ｅ分子、イプシロン（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）；ＣＤ３ｇ分子、ガンマ（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）；ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５；ＣＤ８ａ分子；シチジンデアミナーセ；カドヘリン１３、Ｈ−カドヘリン（心臓）；カドヘリン関連２３；補体因子Ｂ；補体因子Ｄ（アディプシン）；補体因子Ｈ；絨毛性ゴナドトロピン、ベータポリペプチド；チキナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９）；チキナーゼ、酸性；チキナーゼ１（キトトリオシダーゼ）；キマーゼ１、マスト細胞；カルノシンジペプチダーゼ１（メタロペプチダーゼＭ２０ファミリー）；コンタクチン１；カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ；カルボキシペプチダーゼＡ４；カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿）；セルロプラスミン（フェロキシダーゼ）；カルボキシペプチダーゼＮ、ポリペプチド１；補体成分（３ｄ／エプスタイン・バーウイルス）受容体２；カテプシンＢ；カテプシンＤ；ケモカインＣＸＣ受容体４；上皮増殖因子受容体；エラスターゼ、好中球が発現；ＥＰＨ受容体Ａ２；ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、神経／神経膠芽細胞種由来癌遺伝子ホモログ（トリ）；ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３（トリ）；ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４（トリ）；凝固第Ｘ因子；凝固第ＸＩ因子；凝固第ＸＩＩＩ因子、Ａ１ポリペプチド；凝固第ＩＩ因子（トロンビン）；凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体；凝固第ＩＩＩ因子（トロンボプラスチン、組織因子）；凝固第ＶＩＩ因子（血清プロトロンビン転換促進因子）；凝固第ＶＩＩＩ因子、凝血促進成分；凝固第ＩＸ因子；ＩｇＥのＦｃフラグメント、低親和性ＩＩ、（ＣＤ２３）の受容体；ＩｇＧのＦｃフラグメント、高親和性Ｉａ、受容体（ＣＤ６４）；ＩｇＧのＦｃフラグメント、受容体、トランスポーター、アルファ；フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有レクチン）２（フコリン）；フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有）３（ハカタ抗原）；葉酸ヒドロラーゼ（前立腺特異膜抗原）１；濾胞刺激ホルモン、ベータポリペプチド；ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ受容体、２；ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）；増殖停止特異的６；群特異成分（ビタミンＤ結合タンパク質）；ガンマ−グルタミルヒドロラーゼ（コンジュガーゼ、ホリルポリ−ガンマ−グルタミルヒドロラーゼ）；成長ホルモン１；成長ホルモン受容体；グレリン／オベスタチンプレプロペプチド；胃内因子（ビタミンＢ合成）；胃抑制ポリペプチド受容体；ギャップ結合タンパク質、ベータ２、２６ｋＤａ；糖タンパク質Ｉｂ（血小板）、アルファポリペプチド；糖タンパク質Ｉｂ（血小板）、ベータポリペプチド；糖タンパク質ＶＩ（血小板）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型、カイニン酸１；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型、カイニン酸２；グルタミン酸受容体、代謝型１；グルタミン酸受容体、代謝型３；グルタミン酸受容体、代謝型５；グルタミン酸受容体、代謝型７；ゲルゾリン；ヘモクロマトーシス；肝細胞増殖因子（ヘパポイエチンＡ；散乱係数）；ヘッジホッグ相互作用タンパク質；主要組織適合性複合体、クラスＩ、Ｇ；ヘパラン硫酸プロテオグリカン２；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１；ヒアルロノグルコサミニダーゼ１；インスリン分解酵素；インターフェロン（アルファ、ベータ、およびオメガ）受容体１；インターフェロン（アルファ、ベータ、およびオメガ）受容体２；インターフェロン、ガンマ；インターフェロンガンマ受容体１；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様成長因子１受容体；インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ）；インスリン様成長因子２受容体；インスリン様成長因子結合タンパク質１；免疫グロブリン重鎖定常部アルファ１；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ１（Ｇ１ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ２（Ｇ２ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ４（Ｇ４ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ミュー；免疫グロブリンカッパ定常部；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１；インディアンヘッジホッグ；インターロイキン１０；インターロイキン１０受容体、アルファ；インターロイキン１２Ａ（ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１、ｐ３５）；インターロイキン１２Ｂ（ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２、ｐ４０）；インターロイキン１７Ａ；インターロイキン１７Ｆ；インターロイキン１７受容体Ａ；インターロイキン１受容体、Ｉ型；インターロイキン１受容体アンタゴニスト；インターロイキン２１受容体；インターロイキン２受容体、アルファ；インターロイキン２受容体、ガンマ；インターロイキン３（コロニー刺激因子、マルチ）；インターロイキン４受容体；インターロイキン６受容体；インターロイキン７受容体；インテグリン結合キナーゼ；インスリン受容体；ｉｔｃｈｙ Ｅ３ユビキチン・タンパク質リガーゼ；インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の血小板糖タンパク質ＩＩｂ、抗原ＣＤ４１）；インテグリン、アルファ４（抗原ＣＤ４９Ｄ、ＶＬＡ−４受容体のアルファ４サブユニット）；インテグリン、ベータ３（血小板糖タンパク質ＩＩＩａ、抗原ＣＤ６１）；ｊａｇｇｅｄ １；リジル−ｔＲＮＡ合成酵素；キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＩＩＩ型受容体型チロシンキナーゼ）；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、１；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、２；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、３；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質側末端、１；ｋｉｎ ｏｆ ＩＲＲＥ ｌｉｋｅ ３（ショウジョウバエ）；ＫＩＴリガンド；ｖ−キットハーディ・ズッカーマン４ネコ肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ；カリクレイン関連ペプチダーゼ３；ＫＲＩＴ１、アンキリンリピート含有；低密度リポタンパク質受容体；レプチン受容体；白血病抑制因子；白血病抑制因子受容体アルファ；レクチン、マンノース結合、１；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６；マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ）；マトリックスメタロペプチダーゼ１３（コラゲナーゼ３）；マトリックスメタロペプチダーゼ１４（膜挿入型）；マトリックスメタロペプチダーゼ１（間質コラゲナーゼ）；マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮）；マトリックスメタロペプチダーゼ８（好中球コラゲナーゼ）；ミエロペルオキシダーゼ；ニューロンナビゲーター２；細胞傷害誘発受容体３；ニューロリギン４、Ｘ連鎖；ノギン；副甲状腺ホルモン１受容体；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体型、Ｄ；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体型、Ｆ；ポリオウイルス受容体；レニン；リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡファミリー、３；レナラーゼ、ＦＡＤ依存性アミンオキシダーゼ；セマフォリン７Ａ、ＧＰＩ膜アンカー（Ｊｏｈｎ Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｇｅｎ血液型）；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー１０；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＦ（アルファ−２抗プラスミン、色素上皮由来因子）、メンバー１；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＩ（ニューロセルピン）、メンバー１；スーパーオキシドジスムターゼ３、細胞外；ソルビトールデヒドロゲナーゼ；ソマトスタチン； ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４（結腸癌）；シナプシンＩＩＩ；トランスコバラミンＩ（ビタミンＢ１２結合タンパク質、Ｒバインダーファミリー）；トランスコバラミンＩＩ；ＴＥＫチロシンキナーゼ、内皮；トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１）；トランスフェリン；形質転換増殖因子、ベータ１；形質転換増殖因子、ベータ２；形質転換増殖因子、ベータ３；形質転換増殖因子、ベータ受容体１；形質転換増殖因子、ベータ受容体ＩＩ（７０／８０ｋＤａ）；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子１；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子２；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子３；トロイド様１；Ｔｏｌｌ様受容体１；Ｔｏｌｌ様受容体２；Ｔｏｌｌ様受容体３；Ｔｏｌｌ様受容体４；Ｔｏｌｌ様受容体５；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１０ｂ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１３Ｃ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４；腫瘍壊死因子；トリプターゼベータ２（遺伝子／偽遺伝子）；甲状腺刺激ホルモン受容体；トランスサイレチン；タビーホモログ（マウス）；タビー様タンパク質１；血管細胞接着分子１；血管作動性腸ペプチド受容体２；プレＢ細胞１；Ｖセットおよび免疫グロブリンドメイン含有４；キサンチンデヒドロゲナーゼ；ならびにチロシル−ｔＲＮＡ合成酵素
からなる群から選択される標的に結合する、リガンド。

【請求項14】

請求項３に記載の方法によって調製される場合の、請求項１２または１３に記載のリガンド。

【請求項15】

疾患、好ましくは、炎症状態、アレルギー性過敏症、がん、細菌性もしくはウイルス感染、または自己免疫障害の治療における、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のリガンドの使用。

【請求項16】

標的に結合することができる請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のリガンドを、同定する方法であって、
（ｉ）複数の請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のリガンドを用意するステップと、
（ｉｉ）前記複数のリガンドを、標的と接触させるステップと、および
（ｉｉｉ）前記標的に結合するこれらのリガンドを選択するステップと
を含む方法。

【請求項17】

前記リガンドのポリペプチド成分の配列決定することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記標的に結合することができるものとして単離されたリガンドを大量に製造するステップをさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

請求項１４または請求項１５の方法に従って単離された、または同定されたポリペプチド−分子足場コンジュゲートリガンドを大量に製造するステップをさらに含み、前記製造が分子足場をポリペプチドに付着させることを含み、前記ポリペプチドが遺伝子組換えによって発現される、または化学的に合成される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数においてポリペプチドを伸長させるステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ポリペプチド−分子足場コンジュゲートリガンドをさらなるポリペプチドにコンジュゲートさせるステップをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

前記コンジュゲーションが、
（ｉ）ポリペプチドに、分子足場への結合の後、さらなるシステインを付加するステップと、および
（ｉｉ）前記ポリペプチドを、前記さらなるシステインへのジスルフィド結合を介して前記さらなるポリペプチドにコンジュゲートするステップと
によって実行される、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する、コンピューターにより実現される方法であって、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、および
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
によって定義される、少なくとも１つのポケットを含むタンパク質を同定するために、ポリペプチド構造のデータベースを調べるステップと、
（ｂ）前記データベースにおいて、少なくとも１つの、（ａ）に定義されたポケットを含むタンパク質の第１のセットを同定するステップと、
（ｃ）タンパク質の前記第１のセットを、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインのデータベースと比較するステップと、
（ｄ）タンパク質の前記第１のセットにおいて、別のタンパク質との相互作用に寄与すると推定されているドメイン中に位置する少なくとも１つのポケットを含む１つまたは複数のタンパク質を同定するステップと
を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリペプチドリガンド、そのようなリガンドを選択する方法、およびそのようなリガンドの結合標的を選択する方法の分野に関する。特に、本発明は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基と；分子足場とを含むポリペプチドリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、ポリペプチドリガンドの結合標的を選択することに関する。

【背景技術】

【0002】

環状ペプチドは、アミノ末端とカルボキシル末端、アミノ末端と側鎖、カルボキシル末端と側鎖、または側鎖と側鎖とが、環を生成する共有結合によって結合しているポリペプチドである。

【0003】

環状ペプチドは、高い親和性および標的特異性を有してタンパク質標的に結合することができ、したがって治療法の開発のために魅力的な分子類である。実際に、幾つかの環状ペプチド、例えば抗菌ペプチドバンコマイシン、免疫抑制剤シクロスポリン、または抗がん剤オクレオチドなどは、臨床における使用に成功している（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００８，７（７），６０８−２４）。良好な結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きな相互作用表面および環状構造の構造的柔軟性の低さに起因する。典型的には、大環状分子は、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å^２；Ｗｕ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０（６００７），１０６６−７１）、インテグリンαＶβ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å^２）（Ｘｉｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６（５５６５），１５１−５）、またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン−１（ｕｐａｉｎ−１）（６０３Å^２；Ｚｈａｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，２００７，１６０（１），１−１０）のように、数百平方オングストロームの面に結合する。

【0004】

ペプチド大環状分子は、環状構成であるため、線状ペプチドに比べて柔軟性が低く、これにより、標的への結合に関するエントロピーの損失がより小さくなり、より高い結合親和性がもたらされる。柔軟性の低さはまた、標的特異的立体構造を固定し、線状ペプチドと比較して結合特異性を高める。この作用は、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力で選択的な阻害剤が、その環が開かれると、他のＭＭＰと比べてその選択性を失ったことによって実証されている（Ｃｈｅｒｎｅｙ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９８，４１（１１），１７４９−５１）。大環状化によって獲得された好ましい結合特性は、例えばバンコマイシン、ナイシン、またはアクチノマイシンのような、複数のペプチド環を有する多環ペプチドではよりいっそう顕著である。

【0005】

様々な研究チームが、既に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋げている（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＮａｍａｒａ，Ｐ．Ｅ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，１９８５；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００５）。Ｍｅｌｏｅｎと共同研究者らは、タンパク質表面の構造的模倣のために、トリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用して、多重ペプチドループを合成足場上へ迅速かつ定量的に環状化した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００５）。システイン含有ポリペプチドを例えばトリス（ブロモメチル）ベンゼンのような分子足場に結合させることによる、候補薬剤化合物の生成方法が、ＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１に開示されている。

【0006】

ＷＯ２００４／０７７０６２は、候補薬剤化合物を選択する方法を開示している。詳細には、この文書では、第１および第２の反応性基を含む様々な足場分子、および前記足場をさらなる分子と接触させて、カップリング反応において前記足場とさらなる分子との間に少なくとも２つの結合を形成することが開示されている。

【0007】

ＷＯ２００６／０７８１６１は、結合化合物、免疫原性化合物、およびペプチド模倣薬を開示している。この文献では、存在するタンパク質から得たペプチドの様々なコレクションの人工合成が開示されている。これらのペプチドは、次いで、コンビナトリアルライブラリーを作製するために、導入された幾つかのアミノ酸変化を有する定常部合成ペプチドと組み合わされる。化学結合を介してこの多様性を導入して、様々なアミノ酸変化を特徴とするペプチドを分離することによって、望ましい結合活性を発見できる機会を増やすことができる。ここで開示された構築物は、典型的にはシステイン残基を含む−ＳＨ基をもつペプチド、および典型的には足場上のビス−またはトリス−ブロモフェニルベンゼンなどのベンジリックハロゲン置換基を含む複素環式芳香族基に、典型的には依存している。そのような基は、反応して、ペプチドと足場との間にチオエーテル結合を形成する。

【0008】

Ｈｅｉｎｉｓらが、最近、ファージディスプレイをベースとしたコンビナトリアル手法を開発して、目的の標的に対して二環ペプチドの大規模なライブラリーを作製し、スクリーニングした（Ｈｅｉｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２００９，５（７），５０２−７；国際特許出願ＷＯ２００９／０９８４５０もまた参照されたい）。簡潔に述べると、３つのシステイン残基およびランダムな６アミノ酸の２つの領域を含有する線状ペプチド（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）_６−Ｃｙｓ）のコンビナトリアルライブラリーを、ファージ上にディスプレイさせ、システイン側鎖を低分子（トリス−（ブロモメチル）ベンゼン）に共有結合させることによって環化させた。ヒトプロテアーゼカテプシンＧおよび血漿カリクレイン（ＰＫ）に対する親和性の選択において単離された二環性ペプチドは、ナノモルの阻害定数を有していた。最良の阻害剤であるＰＫ１５は、３ｎＭのＫ_ｉでヒトＰＫ（ｈＰＫ）を阻害する。幾つかの単離された二環性ペプチドのアミノ酸配列における類似性は、両方のペプチドループが結合に寄与することを示唆していた。ＰＫ１５は、試験した最高濃度において（１０ｍＭ）、ラットＰＫ（８１％配列同一性）、相同なヒトセリンプロテアーゼ第ＸＩ因子ａ（ｈｆＸＩａ；６９％配列同一性）、またはトロンビン（３６％配列同一性）のいずれも阻害しなかった（Ｈｅｉｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２００９，５（７），５０２−７）。この知見は、二環性阻害剤が、その標的に対する高い親和性を有しており、特異性が高いことを示唆するものである。

【0009】

新たな用途を特定するために、ペプチドリガンドの、特に環状ペプチドの標的を同定する改良された方法が必要である。具体的には、リガンドの特異的標的への結合によって、前記リガンドを好適な薬物様分子とみなすことができる。特異的リガンドの標的を、速く、安価に、かつ／またはより効率的に同定する能力によって、薬物創製の流れが速まり、医療用に好適な分子のより迅速な認可が可能となるはずである。前記リガンドはまた、それらの使用の容易さおよび適合性を高める、可変性のプロテアーゼ安定性および溶解度プロファイルを有し得る。ポリペプチドリガンドは、注射、吸入、経鼻、点眼、経口、または局所投与のために使用することもできる。ポリペプチドリガンド、特に環状ペプチドまたはＢｉｃｙｃｌｅ（登録商標）ペプチドの使用は、安価に生産でき使用しやすいため、さらに好都合である。

【発明の概要】

【0010】

したがって、一態様において、本発明は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する方法であって、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、および
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
の特徴を備えるポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングするステップと、ならびに
（ｂ）（ａ）に定義されたポケットを少なくとも１つ有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップと
を含む方法を提供する。

【0011】

好ましくは、（ａ）に定義されたポケットはまた、（１０〜３０）×（１０〜３０）×（５〜３０）Åの内部寸法を備える。

【0012】

好ましくは、ポリペプチドリガンドは、環状ペプチドであり、最も好ましくは二環性ペプチドである。

【0013】

ポケットの溶媒露出面積は、好ましくは、二環の面積に少なくとも等しく、すなわち、少なくとも９００〜１３００Å^２である。

【0014】

ポケットの溶媒露出末端は、好ましくは、タンパク質の開口部を介して、少なくとも５Å幅で露出している。

【0015】

一実施形態において、リガンドは、標的の阻害剤として作用する。さらなる実施形態において、リガンドは、標的のアゴニストとして作用する。別の実施形態において、リガンドは、標的に対して中立的な（活性の変化がない）作用を有する。

【0016】

第２の態様において、本発明は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドを選択する方法であって、
（ａ）上記の本発明の第１の態様に従って、ポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングし、少なくとも１つのそのようなポケットを有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つのタンパク質を前記リガンドのうちの１つまたは複数と接触させ、前記タンパク質に結合する少なくとも１つのリガンドを選択するステップと
を含む方法を提供する。

【0017】

第３の態様において、本発明はまた、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドを調製する方法であって、
（ａ）上記の第２の態様に記載された方法に従って選択されたリガンドの、ポリペプチド成分のアミノ酸配列を決定するステップと、
（ｂ）（ａ）において決定された配列を有するポリペプチドを合成するステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドを分子足場と反応させて、前記リガンドを生成させるステップと
を含む方法を提供する。

【0018】

本発明の方法はまた、ポケットが、さらなるタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメイン中に位置するかどうかを、決定するステップをさらに含んでもよい。

【0019】

本発明の方法はまた、標的タンパク質を請求項１に定義されたリガンドのライブラリーに暴露し、標的タンパク質に結合する１つまたは複数のリガンドを選択するステップをさらに含んでもよい。

【0020】

本発明の方法において、分子足場は、好ましくは、分子足場をポリペプチドに付着させる共有結合の数と対応する分子対称性を有する。一部の実施形態において、分子足場は、３回対称の分子対称性を有し、分子足場は、３つの共有結合によってポリペプチドに付着している。

【0021】

本発明の方法において、分子足場は、構造的に強固な化学基を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、分子足場は、トリス−（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）、１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）−トリス（２−ブロモアセトアミド）（ＴＢＡＢ）、および／またはＮ，Ｎ’，Ｎ”−ベンゼン−１，３，５−トリイルトリスプロパ−２−エナミド（ＴＡＡＢ）を含む。

【0022】

本発明の幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、システイン残基を含み、前記分子足場がポリペプチドに付着するための前記３つの共有結合のうちの少なくとも１つは、前記システイン残基への結合を含む。

【0023】

さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成し、前記リガンドが、前記請求項１（ａ）に定義されたポケットを有するがカリクレイン、ＭＤＭ２、カテプシンＧから選択されるポリペプチドではない標的に結合する、リガンドを含む。

【0024】

一実施形態において、本発明の前記リガンドは、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含み、前記分子足場は、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成し、前記リガンドは、
アルファ−２−マクログロブリン；ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー６；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン３３；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン９；アディポネクチン、Ｃ１Ｑおよびコラーゲンドメイン含有；アデノシンＡ（３）受容体；ベータ３アドレナリン受容体；アグーチ関連タンパク質ホモログ（マウス）；アンギオテンシンＩＩ受容体、１型；活性化白血球細胞接着分子；アポリポタンパク質Ｅ；アポリポタンパク質Ｈ（ベータ２グリコプロテインＩ）；アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質；アクアポリン４；アクアポリン５；アミロイド前駆体タンパク質ベータサイト切断酵素１；殺菌性透過性増強タンパク質；補体第１成分、ｑ亜成分、Ｂ鎖；補体第１成分、ｑ亜成分、Ｃ鎖；補体第１成分、ｒ亜成分；補体第１成分、ｓ亜成分；補体第２成分；補体第６成分；補体第７成分；補体第８成分、ベータポリペプチド；炭酸脱水酵素ＸＩＩ；炭酸脱水酵素ＩＶ；炭酸脱水酵素ＶＩ；ＣＡＲＴプレプロペプチド；コレシストキニンＢ受容体；ケモカインＣＣＬ１１；ＣＤ３ｅ分子、イプシロン（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）；ＣＤ３ｇ分子、ガンマ（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）；ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５；ＣＤ８ａ分子；シチジンデアミナーセ；カドヘリン１３、Ｈ−カドヘリン（心臓）；カドヘリン関連２３；補体因子Ｂ；補体因子Ｄ（アディプシン）；補体因子Ｈ；絨毛性ゴナドトロピン、ベータポリペプチド；チキナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９）；チキナーゼ、酸性；チキナーゼ１（キトトリオシダーゼ）；キマーゼ１、マスト細胞；カルノシンジペプチダーゼ１（メタロペプチダーゼＭ２０ファミリー）；コンタクチン１；カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ；カルボキシペプチダーゼＡ４；カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿）；セルロプラスミン（フェロキシダーゼ）；カルボキシペプチダーゼＮ、ポリペプチド１；補体成分（３ｄ／エプスタイン・バーウイルス）受容体２；カテプシンＢ；カテプシンＤ；ケモカインＣＸＣ受容体４；上皮増殖因子受容体；エラスターゼ、好中球が発現；ＥＰＨ受容体Ａ２；ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、神経／神経膠芽細胞種由来癌遺伝子ホモログ（トリ）；ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３（トリ）；ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４（トリ）；凝固第Ｘ因子；凝固第ＸＩ因子；凝固第ＸＩＩＩ因子、Ａ１ポリペプチド；凝固第ＩＩ因子（トロンビン）；凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体；凝固第ＩＩＩ因子（トロンボプラスチン、組織因子）；凝固第ＶＩＩ因子（血清プロトロンビン転換促進因子）；凝固第ＶＩＩＩ因子、凝血促進成分；凝固第ＩＸ因子；ＩｇＥのＦｃフラグメント、低親和性ＩＩ、（ＣＤ２３）の受容体；ＩｇＧのＦｃフラグメント、高親和性Ｉａ、受容体（ＣＤ６４）；ＩｇＧのＦｃフラグメント、受容体、トランスポーター、アルファ；フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有レクチン）２（フコリン（ｈｕｃｏｌｉｎ））；フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有）３（ハカタ抗原）；葉酸ヒドロラーゼ（前立腺特異膜抗原）１；濾胞刺激ホルモン、ベータポリペプチド；ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ受容体、２；ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）；増殖停止特異的６；群特異成分（ビタミンＤ結合タンパク質）；ガンマ−グルタミルヒドロラーゼ（コンジュガーゼ、ホリルポリ−ガンマ−グルタミルヒドロラーゼ）；成長ホルモン１；成長ホルモン受容体；グレリン／オベスタチンプレプロペプチド；胃内因子（ビタミンＢ合成）；胃抑制ポリペプチド受容体；ギャップ結合タンパク質、ベータ２、２６ｋＤａ；糖タンパク質Ｉｂ（血小板）、アルファポリペプチド；糖タンパク質Ｉｂ（血小板）、ベータポリペプチド；糖タンパク質ＶＩ（血小板）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型、カイニン酸１；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型、カイニン酸２；グルタミン酸受容体、代謝型１；グルタミン酸受容体、代謝型３；グルタミン酸受容体、代謝型５；グルタミン酸受容体、代謝型７；ゲルゾリン；ヘモクロマトーシス；肝細胞増殖因子（ヘパポイエチンＡ（ｈｅｐａｐｏｉｅｔｉｎ Ａ）；散乱係数）；ヘッジホッグ相互作用タンパク質（ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）；主要組織適合性複合体、クラスＩ、Ｇ；ヘパラン硫酸プロテオグリカン２；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１；ヒアルロノグルコサミニダーゼ１；インスリン分解酵素；インターフェロン（アルファ、ベータ、およびオメガ）受容体１；インターフェロン（アルファ、ベータ、およびオメガ）受容体２；インターフェロン、ガンマ；インターフェロンガンマ受容体１；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様成長因子１受容体；インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ）；インスリン様成長因子２受容体；インスリン様成長因子結合タンパク質１；免疫グロブリン重鎖定常部アルファ１；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ１（Ｇ１ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ２（Ｇ２ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ４（Ｇ４ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ミュー；免疫グロブリンカッパ定常部；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１；インディアンヘッジホッグ；インターロイキン１０；インターロイキン１０受容体、アルファ；インターロイキン１２Ａ（ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１、ｐ３５）；インターロイキン１２Ｂ（ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２、ｐ４０）；インターロイキン１７Ａ；インターロイキン１７Ｆ；インターロイキン１７受容体Ａ；インターロイキン１受容体、Ｉ型；インターロイキン１受容体アンタゴニスト；インターロイキン２１受容体；インターロイキン２受容体、アルファ；インターロイキン２受容体、ガンマ；インターロイキン３（コロニー刺激因子、マルチ）；インターロイキン４受容体；インターロイキン６受容体；インターロイキン７受容体；インテグリン結合キナーゼ；インスリン受容体；ｉｔｃｈｙ Ｅ３ユビキチン・タンパク質リガーゼ；インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の血小板糖タンパク質ＩＩｂ、抗原ＣＤ４１）；インテグリン、アルファ４（抗原ＣＤ４９Ｄ、ＶＬＡ−４受容体のアルファ４サブユニット）；インテグリン、ベータ３（血小板糖タンパク質ＩＩＩａ、抗原ＣＤ６１）；ｊａｇｇｅｄ １；リジル−ｔＲＮＡ合成酵素；キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＩＩＩ型受容体型チロシンキナーゼ）；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、１；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、２；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、３；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質側末端、１；ｋｉｎ ｏｆ ＩＲＲＥ ｌｉｋｅ ３（ショウジョウバエ）；ＫＩＴリガンド；ｖ−キットハーディ・ズッカーマン４ネコ肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ；カリクレイン関連ペプチダーゼ３；ＫＲＩＴ１、アンキリンリピート含有；低密度リポタンパク質受容体；レプチン受容体；白血病抑制因子；白血病抑制因子受容体アルファ；レクチン、マンノース結合、１；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６；マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ）；マトリックスメタロペプチダーゼ１３（コラゲナーゼ３）；マトリックスメタロペプチダーゼ１４（膜挿入型）；マトリックスメタロペプチダーゼ１（間質コラゲナーゼ）；マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮）；マトリックスメタロペプチダーゼ８（好中球コラゲナーゼ）；ミエロペルオキシダーゼ；ニューロンナビゲーター２；細胞傷害誘発受容体３；ニューロリギン４、Ｘ連鎖；ノギン；副甲状腺ホルモン１受容体；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体型、Ｄ；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体型、Ｆ；ポリオウイルス受容体；レニン；リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡファミリー、３；レナラーゼ、ＦＡＤ依存性アミンオキシダーゼ；セマフォリン７Ａ、ＧＰＩ膜アンカー（Ｊｏｈｎ Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｇｅｎ血液型）；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー１０；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＦ（アルファ−２抗プラスミン、色素上皮由来因子）、メンバー１；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＩ（ニューロセルピン）、メンバー１；スーパーオキシドジスムターゼ３、細胞外；ソルビトールデヒドロゲナーゼ；ソマトスタチン；ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４（結腸癌）；シナプシンＩＩＩ；トランスコバラミンＩ（ビタミンＢ１２結合タンパク質、Ｒバインダーファミリー）；トランスコバラミンＩＩ；ＴＥＫチロシンキナーゼ、内皮；トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１）；トランスフェリン；形質転換増殖因子、ベータ１；形質転換増殖因子、ベータ２；形質転換増殖因子、ベータ３；形質転換増殖因子、ベータ受容体１；形質転換増殖因子、ベータ受容体ＩＩ（７０／８０ｋＤａ）；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子１；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子２；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子３；トロイド様１；Ｔｏｌｌ様受容体１；Ｔｏｌｌ様受容体２；Ｔｏｌｌ様受容体３；Ｔｏｌｌ様受容体４；Ｔｏｌｌ様受容体５；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１０ｂ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１３Ｃ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４；腫瘍壊死因子；トリプターゼベータ２（遺伝子／偽遺伝子）；甲状腺刺激ホルモン受容体；トランスサイレチン；タビーホモログ（ｔｕｂｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇ）（マウス）；タビー様タンパク質１（ｔｕｂｂｙ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）；血管細胞接着分子１；血管作動性腸ペプチド受容体２；プレＢ細胞１；Ｖセットおよび免疫グロブリンドメイン含有４；キサンチンデヒドロゲナーゼ；およびチロシル−ｔＲＮＡ合成酵素
からなる群から選択される標的に結合する。

【0025】

さらなる態様において、前記リガンドは、上記の第３の態様の方法に従って調製される。

【0026】

さらなる態様において、本発明はまた、疾患、好ましくは炎症状態、アレルギー性過敏症、がん、細菌性もしくはウイルス感染、または自己免疫障害の治療における上記のリガンドの使用も企図する。

【0027】

本発明はまた、標的に結合することができる上記のようなリガンドを同定する方法であって、
（ｉ）複数の上記のようなリガンドを用意するステップと、
（ｉｉ）前記複数のリガンドを、標的と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）前記標的に結合するこれらのリガンドを選択するステップと
を含む方法を含む。

【0028】

リガンドを同定する前記方法は、前記リガンドのポリペプチド成分の配列を決定するステップをさらに含んでもよい。

【0029】

リガンドを同定する前記方法は、前記標的に結合することができるものとして単離されたリガンドを大量に製造するステップをさらに含んでもよい。上記のようなリガンドを同定する方法によって単離されたまたは同定されたポリペプチド−分子足場コンジュゲートリガンドを大量に製造するさらなるステップを追加してもよい。前記製造は、分子足場をポリペプチドに付着させるステップを含み、前記ポリペプチドは、遺伝子組換えによって発現される、または化学的に合成される。前記方法は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数においてポリペプチドを伸長させるステップをさらに含んでもよい。前記方法は、前記ポリペプチド−分子足場コンジュゲートリガンドをさらなるポリペプチドにコンジュゲートさせるステップをさらに含んでもよい。

【0030】

ポリペプチド−分子足場コンジュゲートリガンドのさらなるポリペプチドへのコンジュゲーションは、
（ｉ）ポリペプチドに、分子足場への結合の後、さらなるシステインを付加するステップと、
（ｉｉ）前記ポリペプチドを、前記さらなるシステインへのジスルフィド結合を介して、前記さらなるポリペプチドにコンジュゲートさせるステップと
によって実施してもよい。

【0031】

本発明のさらなる態様は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する、コンピューターにより実現される方法であって、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、および
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
の特徴を備える、少なくとも１つのポケットを含むタンパク質を同定するために、ポリペプチド構造のデータベースを調べるステップと、
（ｂ）前記データベースにおいて、（ａ）に定義されたポケットを少なくとも１つ含むタンパク質の第１のセットを同定するステップと、
（ｃ）タンパク質の前記第１のセットを、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインのデータベースと比較するステップと、
（ｄ）タンパク質の前記第１のセットにおいて、別のタンパク質との相互作用に寄与すると推定されているドメイン中に位置する少なくとも１つのポケットを含む１つまたは複数のタンパク質を同定するステップと
を含む方法を含む。

【0032】

本発明はまた、上記のリガンドの標的を選択する、コンピューターにより実現される方法を実行するシステムも企図する。

【0033】

本発明はまた、製薬としての本発明のポリペプチドリガンドの使用も企図する。

【0034】

本発明はまた、治療または診断の方法における本発明のポリペプチドリガンドの使用も企図する。

【発明を実施するための形態】

【0035】

別段の定義がない限り、本明細書において使用する技術および科学用語はすべて、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学、ならびに生化学などの技術分野の技術者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学、遺伝的および生化学的方法については、参照により本明細書に組み込まれている標準的技術を使用する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， ２００１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） ４^ｔｈ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．を参照されたい）。

【0036】

本発明は、ポリペプチドリガンドの標的を選択する方法、前記標的、前記リガンド、ならびに前記標的およびリガンドの使用方法および製造方法に関する。

【0037】

最も好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する方法であって、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、および
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
の特徴を備えるポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングするステップと、
（ｂ）（ａ）に定義されたポケットを少なくとも１つ有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップと
を含む方法に関する。

【0038】

＜リガンド＞
本明細書において使用する場合、「リガンド」という用語は、任意の分子、分子の一部、イオン、原子、モチーフ、抗体、エピトープ、受容体、またはそれらの任意の部分に結合する、イオンまたは分子を指す。本発明において使用されるリガンドは、好ましくはペプチドを含み、またはペプチドからなり、ほとんどの実施形態ではポリペプチドである。

【0039】

（ポリ）ペプチド「リガンド」または（ポリ）ペプチド「コンジュゲート」（本明細書において、文脈上、単に「ペプチド」または「ポリペプチド」呼ばれることもある）は、本明細書において言及される場合、分子足場に共有結合したポリペプチドを指す。典型的には、そのようなポリペプチドは、足場への共有結合を形成することができる２つ以上の反応性基と、ペプチドが足場に結合される際にループを形成するため「ループ配列」と呼ばれる、前記反応性基間に内在する配列とを含む。本発明の場合、ポリペプチドリガンドは、少なくとも３つの反応性基を含み、足場上で少なくとも２つのループを形成する。

【0040】

本発明のポリペプチドリガンドは、天然に存在し得る。好ましくは、本発明のポリペプチドリガンドは、合成されたものであり、または天然に存在するポリペプチドリガンドから改変されたものである。

【0041】

本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、技術分野における一般的な意味をとり、誘導体化されたタンパク質、膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、および細胞質タンパク質を含む。タンパク質は、天然アミノ酸および合成アミノ酸を含む、任意の数のアミノ酸を含む。いずれのポリペプチドもまた、タンパク質に相当する。

【0042】

好ましくは、ポリペプチドリガンドは、Ｂｉｃｙｃｌｅ（登録商標）である。

【0043】

一実施形態において、本発明の方法において使用されるペプチドリガンドは、少なくとも１０００〜２５００Å^３、より好ましくは、少なくとも１２５０〜２５００Å^３、最も好ましくは、少なくとも１４００〜２２００Å^３の容積を有する標的ポケットと相互作用する。

【0044】

一実施形態において、本発明の方法において使用されるペプチドリガンドは、少なくとも７００〜１５００Å^２、最も好ましくは９００〜１３００Å^２の面積を有する。

【0045】

本明細書において使用する場合「反応性基」という用語は、分子足場と共有結合を形成することができる基を指す。典型的には、反応性基は、ペプチドリガンド上のアミノ酸側鎖上に存在する。例としては、システイン、リジン、およびセレノシステインなどのアミノ含有基がある。

【0046】

「特異性」という用語は、本明細書の文脈において、リガンドが、その同系の標的に類似する実体を除いて、該標的と結合する能力またはそうでなければ相互作用する能力を指す。例えば、特異性は、リガンドが、様々な種由来の相同な酵素ではなくヒト酵素の相互作用を阻害する能力を指すことができる。本明細書に記載の手法を使用して、リガンドが目的の標的のホモログまたはパラログとより多くまたはより少なく相互作用できるようにするように、特異性を調節する、すなわち高め、または低めることができる。特異性は、活性、親和性、または結合力と同義であるとは意図されておらず、標的に対するリガンドの作用の能力（例えば、結合親和性または阻害のレベルなど）は、必ずしもその特異性に関連しない。

【0047】

「結合活性」という用語は、本明細書において使用される場合、結合アッセイから得られた定量的な結合測定値を指す。したがって、結合活性は、所定の標的濃度で結合するペプチドリガンドの量を指す。好ましい標的結合は、主要な結合アッセイにおいて１０〜２０マイクロモル程度である。開発され親和性成熟した分子は、向上した親和性を有して結合することができる。

【0048】

結合活性またはその他の所望の活性などの活性に関するスクリーニングは、当技術分野で公知の方法、例えばファージディスプレイ技術に基づく方法に従って行われる。例えば、固相に固定化した標的を使用して、レパートリーの結合メンバーを同定し、単離することができる。スクリーニングによって、所望の特性に応じてレパートリーのメンバーを選択することが可能となる。

【0049】

ポケットの存在についてのタンパク質のスクリーニングは、まず、インシリコによって行うことができる。

【0050】

多重特異性は、２つ以上の標的に結合する能力である。典型的には、結合ペプチドは、それらの立体構造の性質によって、抗体の場合のエピトープなど、１つの標的に結合することができる。しかしながら、ペプチドは、２つ以上の標的に結合することができる、例えば二重特異性抗体として開発することができる。本発明において、ペプチドリガンドは、２つ以上の標的に結合可能であり得、したがって、多重特異性である。好ましくは、それらは、２つの標的に結合し、二重特異性である。この結合は、独立的であってもよく、これは、ペプチド上の標的への結合部位が、どちらかの標的の結合によって構造上妨害されないことを意味することになる。この場合、両標的は、独立して結合され得る。より一般的には、一方の標的の結合は、他方の結合を少なくとも部分的に妨害することが予想される。

【0051】

本明細書において使用され、さらに下記に定義される「分子足場」という用語は、本発明において使用されるようなペプチドリガンドと多数箇所で結合して、ペプチドリガンドに１つまたは複数の構造的特徴を付与することができるあらゆる分子を指す。これは、単にジスルフィド結合を置換するのみならず、ペプチドに２つ以上の付着箇所を提供するという点で、クロスリンカーではない。好ましくは、分子足場は、足場反応性基と呼ばれる、ペプチドの付着箇所を少なくとも３つ含む。これらの基は、ペプチド上の反応性基と反応して、共有結合を形成することができる。分子足場のための好ましい構造を以下に説明する。

【0052】

＜標的＞
標的−リガンド複合体は、広い範囲の分子間および分子内−Ｈ−結合を示す。β−ヘアピンおよびγ−ターンは、前記複合体に共通の構造的モチーフである。結合のためにポケットへ二環を組み込ませるために、少なくとも１つの溶媒露出末端の利用が可能である。

【0053】

本発明の標的は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドに、結合し、またはそうでなければ相互作用する。具体的には、標的は、別のリガンドに結合し、そうでなければＢｉｃｙｃｌｅ（登録商標）ペプチドと相互作用する。

【0054】

最も好ましくは、標的は、下記に定義されるポケットを有する。

【0055】

好ましくは、標的は、酵素、受容体、増殖因子、補体成分、細胞壁構成成分、ホルモン、凝固因子、抗体、エピトープ、インターロイキン、増殖因子、メタロペプチダーゼ、壊死因子もしくは壊死因子受容体、またはそれらの任意の部分である。

【0056】

最も好ましくは、標的は、
アルファ−２−マクログロブリン；ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー６；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン３３；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン９；アディポネクチン、Ｃ１Ｑおよびコラーゲンドメイン含有；アデノシンＡ（３）受容体；ベータ３アドレナリン受容体；アグーチ関連タンパク質ホモログ（マウス）；アンギオテンシンＩＩ受容体、１型；活性化白血球細胞接着分子；アポリポタンパク質Ｅ；アポリポタンパク質Ｈ（ベータ２グリコプロテインＩ）；アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質；アクアポリン４；アクアポリン５；アミロイド前駆体タンパク質ベータサイト切断酵素１；殺菌性透過性増強タンパク質；補体第１成分、ｑ亜成分、Ｂ鎖；補体第１成分、ｑ亜成分、Ｃ鎖；補体第１成分、ｒ亜成分；補体第１成分、ｓ亜成分；補体第２成分；補体第６成分；補体第７成分；補体第８成分、ベータポリペプチド；炭酸脱水酵素ＸＩＩ；炭酸脱水酵素ＩＶ；炭酸脱水酵素ＶＩ；ＣＡＲＴプレプロペプチド；コレシストキニンＢ受容体；ケモカインＣＣＬ１１；ＣＤ３ｅ分子、イプシロン（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）；ＣＤ３ｇ分子、ガンマ（ＣＤ３−ＴＣＲ複合体）；ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５；ＣＤ８ａ分子；シチジンデアミナーセ；カドヘリン１３、Ｈ−カドヘリン（心臓）；カドヘリン関連２３；補体因子Ｂ；補体因子Ｄ（アディプシン）；補体因子Ｈ；絨毛性ゴナドトロピン、ベータポリペプチド；チキナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９）；チキナーゼ、酸性；チキナーゼ１（キトトリオシダーゼ）；キマーゼ１、マスト細胞；カルノシンジペプチダーゼ１（メタロペプチダーゼＭ２０ファミリー）；コンタクチン１；カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ；カルボキシペプチダーゼＡ４；カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿）；セルロプラスミン（フェロキシダーゼ）；カルボキシペプチダーゼＮ、ポリペプチド１；補体成分（３ｄ／エプスタイン・バーウイルス）受容体２；カテプシンＢ；カテプシンＤ；ケモカインＣＸＣ受容体４；上皮増殖因子受容体；エラスターゼ、好中球が発現；ＥＰＨ受容体Ａ２；ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、神経／神経膠芽細胞種由来癌遺伝子ホモログ（トリ）；ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３（トリ）；ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４（トリ）；凝固第Ｘ因子；凝固第ＸＩ因子；凝固第ＸＩＩＩ因子、Ａ１ポリペプチド；凝固第ＩＩ因子（トロンビン）；凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体；凝固第ＩＩＩ因子（トロンボプラスチン、組織因子）；凝固第ＶＩＩ因子（血清プロトロンビン転換促進因子）；凝固第ＶＩＩＩ因子、凝血促進成分；凝固第ＩＸ因子；ＩｇＥのＦｃフラグメント、低親和性ＩＩ、（ＣＤ２３）の受容体；ＩｇＧのＦｃフラグメント、高親和性Ｉａ、受容体（ＣＤ６４）；ＩｇＧのＦｃフラグメント、受容体、トランスポーター、アルファ；フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有レクチン）２（フコリン）；フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有）３（ハカタ抗原）；葉酸ヒドロラーゼ（前立腺特異膜抗原）１；濾胞刺激ホルモン、ベータポリペプチド；ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ受容体、２；ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）；増殖停止特異的６；群特異成分（ビタミンＤ結合タンパク質）；ガンマ−グルタミルヒドロラーゼ（コンジュガーゼ、ホリルポリ−ガンマ−グルタミルヒドロラーゼ）；成長ホルモン１；成長ホルモン受容体；グレリン／オベスタチンプレプロペプチド；胃内因子（ビタミンＢ合成）；胃抑制ポリペプチド受容体；ギャップ結合タンパク質、ベータ２、２６ｋＤａ；糖タンパク質Ｉｂ（血小板）、アルファポリペプチド；糖タンパク質Ｉｂ（血小板）、ベータポリペプチド；糖タンパク質ＶＩ（血小板）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型、カイニン酸１；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型、カイニン酸２；グルタミン酸受容体、代謝型１；グルタミン酸受容体、代謝型３；グルタミン酸受容体、代謝型５；グルタミン酸受容体、代謝型７；ゲルゾリン；ヘモクロマトーシス；肝細胞増殖因子（ヘパポイエチンＡ；散乱係数）；ヘッジホッグ相互作用タンパク質；主要組織適合性複合体、クラスＩ、Ｇ；ヘパラン硫酸プロテオグリカン２；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１；ヒアルロノグルコサミニダーゼ１；インスリン分解酵素；インターフェロン（アルファ、ベータ、およびオメガ）受容体１；インターフェロン（アルファ、ベータ、およびオメガ）受容体２；インターフェロン、ガンマ；インターフェロンガンマ受容体１；インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ）；インスリン様成長因子１受容体；インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ）；インスリン様成長因子２受容体；インスリン様成長因子結合タンパク質１；免疫グロブリン重鎖定常部アルファ１；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ１（Ｇ１ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ２（Ｇ２ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ４（Ｇ４ｍマーカー）；免疫グロブリン重鎖定常部ミュー；免疫グロブリンカッパ定常部；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１；インディアンヘッジホッグ；インターロイキン１０；インターロイキン１０受容体、アルファ；インターロイキン１２Ａ（ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１、ｐ３５）；インターロイキン１２Ｂ（ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２、ｐ４０）；インターロイキン１７Ａ；インターロイキン１７Ｆ；インターロイキン１７受容体Ａ；インターロイキン１受容体、Ｉ型；インターロイキン１受容体アンタゴニスト；インターロイキン２１受容体；インターロイキン２受容体、アルファ；インターロイキン２受容体、ガンマ；インターロイキン３（コロニー刺激因子、マルチ）；インターロイキン４受容体；インターロイキン６受容体；インターロイキン７受容体；インテグリン結合キナーゼ；インスリン受容体；ｉｔｃｈｙ Ｅ３ユビキチン・タンパク質リガーゼ；インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の血小板糖タンパク質ＩＩｂ、抗原ＣＤ４１）；インテグリン、アルファ４（抗原ＣＤ４９Ｄ、ＶＬＡ−４受容体のアルファ４サブユニット）；インテグリン、ベータ３（血小板糖タンパク質ＩＩＩａ、抗原ＣＤ６１）；ｊａｇｇｅｄ １；リジル−ｔＲＮＡ合成酵素；キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＩＩＩ型受容体型チロシンキナーゼ）；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、１；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、２；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのドメイン、長い細胞質側末端、３；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質側末端、１；ｋｉｎ ｏｆ ＩＲＲＥ ｌｉｋｅ ３（ショウジョウバエ）；ＫＩＴリガンド；ｖ−キットハーディ・ズッカーマン４ネコ肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ；カリクレイン関連ペプチダーゼ３；ＫＲＩＴ１、アンキリンリピート含有；低密度リポタンパク質受容体；レプチン受容体；白血病抑制因子；白血病抑制因子受容体アルファ；レクチン、マンノース結合、１；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６；マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ）；マトリックスメタロペプチダーゼ１３（コラゲナーゼ３）；マトリックスメタロペプチダーゼ１４（膜挿入型）；マトリックスメタロペプチダーゼ１（間質コラゲナーゼ）；マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮）；マトリックスメタロペプチダーゼ８（好中球コラゲナーゼ）；ミエロペルオキシダーゼ；ニューロンナビゲーター２；細胞傷害誘発受容体３；ニューロリギン４、Ｘ連鎖；ノギン；副甲状腺ホルモン１受容体；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体型、Ｄ；プロテインチロシンホスファターゼ、受容体型、Ｆ；ポリオウイルス受容体；レニン；リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡファミリー、３；レナラーゼ、ＦＡＤ依存性アミンオキシダーゼ；セマフォリン７Ａ、ＧＰＩ膜アンカー（Ｊｏｈｎ Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｇｅｎ血液型）；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＡ（アルファ−１抗プロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー１０；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＦ（アルファ−２抗プラスミン、色素上皮由来因子）、メンバー１；セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＩ（ニューロセルピン）、メンバー１；スーパーオキシドジスムターゼ３、細胞外；ソルビトールデヒドロゲナーゼ；ソマトスタチン；ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １４（結腸癌）；シナプシンＩＩＩ；トランスコバラミンＩ（ビタミンＢ１２結合タンパク質、Ｒバインダーファミリー）；トランスコバラミンＩＩ；ＴＥＫチロシンキナーゼ、内皮；トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１）；トランスフェリン；形質転換増殖因子、ベータ１；形質転換増殖因子、ベータ２；形質転換増殖因子、ベータ３；形質転換増殖因子、ベータ受容体１；形質転換増殖因子、ベータ受容体ＩＩ（７０／８０ｋＤａ）；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子１；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子２；ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子３；トロイド様１；Ｔｏｌｌ様受容体１；Ｔｏｌｌ様受容体２；Ｔｏｌｌ様受容体３；Ｔｏｌｌ様受容体４；Ｔｏｌｌ様受容体５；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１０ｂ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１３Ｃ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ａ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４；腫瘍壊死因子；トリプターゼベータ２（遺伝子／偽遺伝子）；甲状腺刺激ホルモン受容体；トランスサイレチン；タビーホモログ（マウス）；タビー様タンパク質１；血管細胞接着分子１；血管作動性腸ペプチド受容体２；プレＢ細胞１；Ｖセットおよび免疫グロブリンドメイン含有４；キサンチンデヒドロゲナーゼ；ならびにチロシル−ｔＲＮＡ合成酵素
からなる群から選択される。

【0057】

標的は、上記のリストから選択される任意の分子の分子全体、それらの基、またはそれらの一部（活性部位またはエピトープなど）であってもよい。

【0058】

好ましくは、ペプチドリガンドは、標的の活性部位と相互作用し、最も好ましくは、前記活性部位に対して結合する。

【0059】

標的は、ポリペプチドリガンドのための複数の結合部位を有していてもよい。標的は、１つ、または複数の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上のペプチドリガンドと結合してもよい。前記複数のリガンドは、異なるものであっても、同じものであってもよい。異なるペプチドリガンドの結合は、標的への異なる影響を有していてもよく、または同じ影響を有していてもよい。標的に結合するペプチドリガンドの数を増やすことによって、標的へのペプチドリガンドの作用を高め、または低めることができる。例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト作用が、高められ、または低められ得る。

【0060】

一実施形態において、標的へのポリペプチドリガンドの結合は、アゴニスト作用を有する。別の実施形態において、前記結合は、阻害またはアンタゴニスト作用を有する。別の実施形態において、前記結合は、中立的な作用を有する。

【0061】

＜ポケット＞
本明細書において使用する場合、「ポケット」という用語は、標的分子の三次元（二次、三次、または四次）構造における切れ込み、窪み、孔、または空間を指す（Ｒｙａｎ Ｇ．Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｋｉｍ Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｍｏｄｅｌ．，２０１０，２６；５０（４）：５８９−６０３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｃｉ９００３９７ｔを参照されたい）。前記ポケットは、１つまたは複数のリガンドに対する結合親和性を有する。結合は、水素結合、共有結合、イオン結合、またはそれらの任意の組合せなどの、あらゆる種類の結合または会合を介して生じ得る。

【0062】

本発明のポケットは、特異的な物理的特徴を備えている。

【0063】

本発明のポケットは、ペプチドリガンドの幾つかの部分を包含するよう、十分に大きくなければならない。好ましくは、ポケットは、すべてまたはほとんどのペプチドリガンドを包含するよう、十分に大きい。すなわち、ペプチドリガンドは、ポケット内に、少なくとも部分的に、好ましくは完全に、適合することができる。リガンドは、標的と結合する際、ポケットに少なくとも部分的に埋め込まれる。

【0064】

一実施形態において、本発明の方法の標的のポケットは、少なくとも１０００〜２５００Å^３、より好ましくは、少なくとも１２５０〜２５００Å^３、最も好ましくは、少なくとも１４００〜２２００Å^３の容積を備える。

【0065】

一実施形態において、本発明の方法の標的のポケットは、少なくとも７００〜１５００Å^２、最も好ましくは、少なくとも９００〜１３００Å^２の面積を備える。

【0066】

一実施形態において、本発明の方法の標的のポケットは、少なくとも３０×３０×（５〜１０）Åの寸法を備える。

【0067】

一実施形態において、ポケットは、少なくとも９００Å^２、好ましくは、少なくとも１０００Å^２、好ましくは、少なくとも１３００Å^２、最も好ましくは、少なくとも１５００Å^２の溶媒露出面積を備える。

【0068】

「溶媒露出表面積（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ）」という句は、溶媒との接触が可能な、タンパク質の二次、三次、または四次構造などの分子の三次元構造の領域を指す。好ましくは、前記溶媒は、液体溶媒、最も好ましくは水性液であり、好ましくは、そのような接触は結合をもたらす。

【0069】

一実施形態において、ポケットは、少なくとも１つの溶媒露出末端を備える。一部の実施形態において、リガンドは、少なくとも１つの溶媒露出末端を備える。

【0070】

上述のように、本発明のリガンドは、本発明のポケットと相互作用する際、好ましくは、ポケット内に少なくとも部分的に埋め込まれる。好ましくは、リガンドの溶媒露出面積の１／３〜２／３がポケットに埋め込まれる。

【0071】

ポケットは、標的の様々なドメイン中に位置し得る。標的のポケットは、生物学的な関連性がある傾向がある。例えば、ポケットは、酵素活性部位またはそれらの部分、他のもしくは複数のリガンドのための結合部位またはそれらの部分、およびタンパク質−タンパク質相互作用部位またはそれらの部分を含み得る。

【0072】

本発明の一態様は、ポケットが、別のタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメイン中に位置するかどうかを、決定するステップを含む方法である。この決定は、例えばＮＭＲ、質量分析法、Ｘ線結晶学、振動分光法、電子顕微鏡法、クライオ電子顕微鏡法、もしくはバイオインフォマティクス（インシリコ）法、またはそのような方法の任意の組合せを含む、当技術分野における任意の妥当な方法によって行ってもよい。

【0073】

＜方法の説明において使用されるその他の用語＞
本明細書において使用される「接触させる」という用語は、ある分子を、好ましくは溶媒を介して、別の分子と物理的に接触させるという、当技術分野において一般的な意味をもつ。

【0074】

本発明において使用され、または創製される任意のリガンド、標的、またはその他のタンパク質の、任意のポリペプチド成分のアミノ酸配列の決定は、任意の好適な技術を使用して行うことができる。技術には、質量分析法、エドマン分解法、およびバイオインフォマティクス法が含まれる。

【0075】

本発明の任意の態様において使用され、同定され、または創製されるポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、またはその他の分子を「合成すること」は、任意の好適な技術を使用して行うことができる。ポリペプチドは、生物学的に合成してもよい。ペプチド合成は、好ましくは、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成装置を使用する、Ｆｍｏｃ化学に基づく。

【0076】

本明細書において使用される「反応する」という用語は、あらゆる化学反応を指す。好ましくは、化学反応は、化学結合、好ましくは水素または共有結合を形成する反応である。

【0077】

本明細書において使用される「製造する」という用語は、該用語が適用される品目を作製または創製することを指す。

【0078】

＜ライブラリー＞
一実施形態において、本発明は、標的タンパク質を、（好ましくは請求項１に定義された）リガンドのライブラリーに暴露し、標的タンパク質に結合する１つまたは複数のリガンドを選択するステップを含む方法を提供する。

【0079】

本明細書において使用される「ライブラリー」という用語は、異種のポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリーは、同一ではないメンバーから構成される。この程度まで、ライブラリーは、レパートリーと同義である。ライブラリーメンバー間の配列の違いが、ライブラリー中に存在する多様性を担っている。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態をとっていてもよく、または、核酸のライブラリーで形質転換された、例えば、細菌、ウイルス、動物、または植物細胞などの生物または細胞の形態であってもよい。好ましくは、個々の生物または細胞は、それぞれ、１つまたは限定された数のライブラリーメンバーだけを含有する。

【0080】

一実施形態において、核酸によってコードされているポリペプチドを発現させるために、核酸は、発現ベクターに組み込まれる。好ましい態様において、したがって、ライブラリーは、宿主生物の集団の形態をとっていてもよく、それぞれの生物は、対応するポリペプチドメンバーを産生するために発現させることができる核酸形態で、ライブラリーの１つのメンバーを含有する発現ベクターの１つまたは複数のコピーを含有している。よって、宿主生物の集団は、遺伝学的に多様なポリペプチドバリアントの大きなレパートリーをコードする潜在力を有する。

【0081】

一実施形態において、核酸のライブラリーは、ポリペプチドのレパートリーをコードする。ライブラリーの各核酸メンバーは、好ましくは、ライブラリーの１つまたは複数のその他のメンバーに関連した配列を有する。関連した配列とは、ライブラリーの少なくとも１つのその他のメンバーに対して、少なくとも５０％同一性、例えば少なくとも６０％同一性、例えば少なくとも７０％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、例えば少なくとも９０％同一性、例えば少なくとも９５％同一性、例えば少なくとも９８％同一性、例えば少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を意味する。同一性は、参照配列の、少なくとも３アミノ酸、例えば少なくとも４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸、例えば少なくとも１２アミノ酸、例えば少なくとも１４アミノ酸、例えば少なくとも１６アミノ酸、例えば少なくとも１７アミノ酸が連続した区分または全長にわたって判断され得る。

【0082】

本発明において使用されるライブラリーは、例えばＷＯ２００４／０７７０６２に記載の当技術分野において既知の技術、または本明細書に記載したようなファージベクターシステムを含む生物学的システムを使用して構築してもよい。その他のベクターシステムが当技術分野において既知であり、その他のファージ（例えば、ファージラムダ）、細菌性プラスミド発現ベクター、酵母ベクターを含む真核細胞ベースの発現ベクターなどが挙げられる。例えば、ＷＯ２００９／０９８４５０またはＨｅｉｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９，５（７），５０２−７を参照されたい。

【0083】

＜分子足場＞
分子足場は、例えば、ＷＯ２００９／０９８４５０およびその中で引用された参考文献、特にＷＯ２００４０７７０６２およびＷＯ２００６０７８１６１に記載されている。

【0084】

上述のように、「分子足場」という用語は、本発明において使用されるペプチドリガンドを複数箇所において結合させて、ペプチドリガンドに１つまたは複数の構造的特徴を付与することができるあらゆる分子を指すために、本明細書において使用される。

【0085】

分子足場は、小さな有機分子などの低分子であってもよい。

【0086】

一実施形態において、分子足場は、ヌクレオシド、糖、またはステロイドなどの天然の単量体であってもよく、またはこれらに基づいていてもよい。例えば、分子足場は、そのような実体の二量体または三量体などの短い重合体を含んでいてもよい。

【0087】

一実施形態において、分子足場は、毒性が既知である、例えば低毒性の化合物である。好適な化合物の例としては、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはテマゼパムなどの既存の薬物が挙げられる。

【0088】

一実施形態において、分子足場は、高分子であってもよい。一実施形態において、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチド、または炭水化物から構成される高分子である。

【0089】

一実施形態において、分子足場は、ポリペプチドの官能基と反応して共有結合を形成することができる反応性基を含む。

【0090】

分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル、およびハロゲン化アシルのような化学基を含んでいてもよい。

【0091】

一実施形態において、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはそれらの誘導体を含んでいてもよく、またはそれらからなっていてもよい。

【0092】

一実施形態において、分子足場は、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。これは、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンと同様であるが、ベンゼン環に付着した３つのメチル基を追加的に含有する。このことは、追加されたメチル基がポリペプチドとのさらなる接触を形成し、よってさらなる構造的制約を付与することができるという利点を有する。

【0093】

その他の分子足場としては、１，３，５−トリアクリロイル−１，３，５−トリアジナン（ＴＡＴＡ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）−トリス（２−ブロモアセトアミド）（ＴＢＡＢ）、およびＮ，Ｎ’，Ｎ”−ベンゼン−１，３，５−トリイルトリスプロパ−２−エナミド（ＴＡＡＢ）が挙げられる。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２，１３，１０３２−１０３８を参照されたい。好ましくは、分子足場は、構造的に強固な化学基を含む。

【0094】

本発明の方法において使用される分子足場は、本発明の方法において使用されるリガンドのポリペプチドの官能基が分子足場との共有結合を形成できるようにさせる、化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキル、およびハロゲン化アシルを含む幅広い範囲の官能性から選択される。

【0095】

分子足場は、好ましくは、分子足場をポリペプチドに付着させる共有結合の数と対応する分子対称性を有する。好ましくは、分子足場は３回対称の分子対称性を有し、分子足場は３つの共有結合によってポリペプチドに付着される。

【0096】

＜コンピューターによる実現＞
本発明は、コンピューターにより実現される方法を含む。好ましくは、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する、コンピューターにより実現される方法は、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、および
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
の特徴を備える、少なくとも１つの前記ポケットを含むタンパク質を同定するために、ポリペプチド構造のデータベースを調べるステップと、
（ｂ）前記データベースにおいて、（ａ）に定義された少なくとも１つのポケットを含むタンパク質の第１のセットを同定するステップと、
（ｃ）タンパク質の前記第１のセットを、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインのデータベースと比較するステップと、
（ｄ）タンパク質の前記第１のセットにおいて、別のタンパク質との相互作用に寄与すると推定されているドメイン中に位置する少なくとも１つのポケットを含む１つまたは複数のタンパク質を同定するステップと
を含む。

【0097】

本発明のその他の方法もまた、コンピューターにより実現され得る。

【0098】

＜医学的使用＞
本発明の方法は、疾患、疾患症状、および病状を、治療し、予防し、抑制し、かつ／または改善するために、また診断においても使用してもよい。

【0099】

本発明において使用されるペプチドリガンドは、典型的には、炎症状態、アレルギー性過敏症、がん、細菌性またはウイルス感染、および自己免疫障害（Ｉ型糖尿病、乾癬、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、および重症筋無力症を含むが、それらに限定されるわけではない）の予防、抑制、または治療において使用が可能となる。そのようなリガンドの標的を同定するために本発明の方法を使用することは、また、リガンドを使用して治療し、予防し、かつ／または改善され得る疾患を同定することを支援する。

【0100】

施用において、「予防」という用語は、疾患の誘発前の防御組成物の投与を含む。「抑制」とは、誘導事象の後であるが、疾患の臨床的出現の前の、該組成物の投与を指す。「治療」とは、疾患症状が現れた後の防御組成物の投与を含む。

【0101】

本発明のリガンドの標的を選択する方法、または該リガンドを選択する方法を実行した後、病状の症状を治療し、改善し、または回復させるさらなるステップ。好ましくは、これは、ヒトまたは動物の患者を該リガンドで処置することによって実行され得る。本発明のリガンドは、薬物または薬物様分子として使用してもよい。該リガンドは、注射、吸入、経鼻、点眼、経口、または局所投与用に製剤化してもよい。

【0102】

本発明は、したがって、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する方法であって、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、および
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
の特徴を備えるポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングするステップと、
（ｂ）（ａ）に定義されたポケットを少なくとも１つ有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップと、
（ｃ）医学的処置または診断の方法において、標的に結合するまたは標的と相互作用するリガンドを使用するステップと
を含む方法を含む。

【0103】

本発明の方法を、下記にてさらに考察する。前記方法は、好ましくは、インビトロで行われる。本発明の方法は、インビボで行ってもよい。

【0104】

本発明の方法は、ヒトまたは動物の患者から採取した試料に対して行ってもよい。そのような試料は、例えば、血液、粘液、皮膚、または血漿であってもよい。そのような方法は、好ましくは、診断の方法であり、好ましくは、インビトロで行われ、ヒトまたは動物の体に対して直接実施されるものではない。

【0105】

本発明はまた、医薬における、本発明の方法によって選択されたリガンドの使用も企図する。

【0106】

一般的には、ペプチドリガンドは、薬理学的に適切な担体と共に、精製された形態で利用されることとなる。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝化媒体を含む、水性もしくはアルコール性／水溶液、乳濁液、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、ならびに乳酸加リンゲル液が含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液中で保つ必要がある場合、好適な生理学的許容アジュバントは、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、およびアルギン酸などの増粘剤から選択され得る。

【0107】

静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくビヒクルなどの、液体ならびに栄養補液および電解質補液が含まれる。防腐剤、ならびに抗生物質、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどのその他の添加剤も、存在し得る（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。

【0108】

本発明のペプチドリガンドは、個々に投与される組成物として、またはその他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、抗体、抗体フラグメント、ならびにシクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシン、またはシスプラチン、および免役毒素などの様々な免疫療法薬を含み得る。医薬組成物は、本発明の選択された抗体、受容体、もしくはそれらの結合タンパク質と組み合わせた様々な細胞傷害性薬剤またはその他の薬剤の「カクテル」、または異なる標的リガンドを使用して選択されたポリペプチドなど、選択された、異なる特異性を有する本発明によるポリペプチドの組合せを、それらが投与の前にプールされているかどうかに関わりなく含み得る。

【0109】

本発明はまた、疾患、疾患症状、および病状の、治療、予防、抑制、および／または改善のための医薬の製造における本発明のリガンドの使用も企図する。

【0110】

＜方法＞
本発明の方法は、当技術分野において既知の任意の技術および／または装置を使用して行ってもよい。好ましくは、前記方法は、実験技術を使用して行われる。

【0111】

本発明の第１の方法は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドの標的を選択する方法であって、
（ａ）（ｉ）約１０００〜３０００Å^３の容積、および
（ｉｉ）少なくとも１つの溶媒露出末端
の特徴を備えるポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングするステップと、
（ｂ）（ａ）に定義されたポケットを少なくとも１つ有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップと
を含む方法である。

【0112】

また、本明細書において、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドを選択する方法であって、
（ａ）請求項１または請求項２に定義されたポケットの存在について、１つまたは複数のタンパク質をスクリーニングし、少なくとも１つのそのようなポケットを有する少なくとも１つのタンパク質を選択するステップ、および
（ｂ）前記少なくとも１つのタンパク質を前記リガンドのうちの１つまたは複数と接触させ、前記タンパク質に結合する少なくとも１つのリガンドを選択するステップ
を含む方法も企図される。

【0113】

本発明の一実施形態は、少なくとも２つのループ配列によって隔てられている少なくとも３つの反応性基を含むポリペプチドと分子足場とを含むリガンドであって、前記分子足場が、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるような、前記ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する、リガンドを調製する方法であって、
（ａ）上記の方法のうちの１つに従って選択されたリガンドの、ポリペプチド成分のアミノ酸配列を決定するステップと、
（ｂ）（ａ）において決定された配列を有するポリペプチドを合成するステップと、
（ｃ）前記ポリペプチドを分子足場と反応させて、前記リガンドを生成させるステップと
を含む方法を含む。

【0114】

標的に結合することができる、上述の方法のいずれかによるリガンドを同定する方法もまた企図される。前記方法は、
（ｉ）先の方法のいずれかに従って、複数のリガンドを用意するステップと、
（ｉｉ）前記複数のリガンドを、標的と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）前記標的に結合するこれらのリガンドを選択するステップと
を含む。

【0115】

前記方法は、本方法によって単離されたまたは同定されたポリペプチド−分子足場コンジュゲートリガンドを大量に製造するステップをさらに含んでもよく、好ましくは、前記製造は、分子足場をポリペプチドに付着させることを含み、好ましくは、前記ポリペプチドは、遺伝子組換えによって発現される、または化学的に合成される。

【0116】

リガンドを同定する前記方法は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数においてポリペプチドを伸長させるステップを、さらに含んでもよい。

【0117】

リガンドを同定する前記方法は、前記ポリペプチド−分子足場コンジュゲートリガンドをさらなるポリペプチドにコンジュゲートするステップを、さらに含んでもよい。好ましくは、前記コンジュゲーションは、
（ｉ）ポリペプチドに、分子足場への結合の後、さらなるシステインを付加するステップと、
（ｉｉ）前記ポリペプチドを、前記さらなるシステインへのジスルフィド結合を介して前記さらなるポリペプチドにコンジュゲートするステップと
によって行われる。

【0118】

本発明の方法は、好ましくは、インビトロで行われる。

【0119】

本発明の方法は、あらゆる試料に対して行うことができる。好ましくは、前記試料は、体液試料である。本発明の方法はまた（上記のような）ライブラリーから標的を選択するために使用してもよい。

【0120】

本発明の方法、または前記方法の幾つかのステップは、コンピューターによって実現され得る。

【0121】

本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、当業者には本発明の範囲から逸脱することなく明らかとなるであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求の範囲に記載の発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野における当業者には明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。

【0122】

本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。

【0123】

参考文献

【国際調査報告】