特表 2021-526544 抗腫瘍の漢方薬組成物及びその揮発性油エキス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-526544(P2021-526544A)

(43)【公表日】2021年10月7日

(54)【発明の名称】抗腫瘍の漢方薬組成物及びその揮発性油エキス

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/185 20060101AFI20210910BHJP

   A61K 36/61 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 36/9064 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 36/54 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 36/67 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 36/289 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 36/9068 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 31/085 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 31/222 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 31/015 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 31/215 20060101ALI20210910BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/185

   A61K36/61

   A61K36/9064

   A61K36/54

   A61K36/67

   A61K36/289

   A61K36/9068

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   A61P1/16

   A61P1/04

   A61P1/18

   A61P11/00

   A61K31/085

   A61K31/222

   A61K31/015

   A61K31/215

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2020-570032(P2020-570032)

(86)(22)【出願日】2019年7月10日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月10日

(86)【国際出願番号】CN2019095410

(87)【国際公開番号】WO2020147275

(87)【国際公開日】20200723

(31)【優先権主張番号】201910045120.6

(32)【優先日】2019年1月17日

(33)【優先権主張国】CN

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】520488517

【氏名又は名称】上海中華薬業有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＺＨＯＮＧＨＵＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】金家▲ファ▼

(72)【発明者】

【氏名】丁礼琴

(72)【発明者】

【氏名】曹無介

(72)【発明者】

【氏名】朱暁萍

【テーマコード（参考）】

4C088

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C088AB12

4C088AB26

4C088AB33

4C088AB36

4C088AB57

4C088AB81

4C088AC01

4C088BA08

4C088BA18

4C088CA03

4C088CA15

4C088MA07

4C088MA16

4C088NA14

4C088ZA59

4C088ZA66

4C088ZA75

4C088ZB26

4C088ZC41

4C206AA01

4C206AA02

4C206BA04

4C206CA27

4C206DB04

4C206DB56

4C206DB57

4C206KA01

4C206KA04

4C206KA08

4C206MA03

4C206MA04

4C206MA36

4C206NA14

4C206ZA59

4C206ZA66

4C206ZA75

4C206ZB26

4C206ZC41

(57)【要約】

本発明は、漢方薬組成物及びその揮発性油エキスの、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現腫瘍を抑制する薬物への使用に関し、該漢方薬複方は、チョウジ、シュクシャ、トウシキミ、ニッケイ、シロコショウ、モッコウ、ショウキョウから構成される。該漢方薬組成物及びその揮発性油エキスは、ｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓプロトオンコジーンが過剰表現したカエノラブディティス・エレガンスの腫瘍様多重陰門の表現型を有意に抑制し、その多重陰門の表現型を正常な陰門を有する野生型の表現型に変換させる。上記の結果は、本発明で提供される漢方薬組成物及びその揮発性油エキスが、ｒａｓ遺伝子の過剰表現による腫瘍を治療する効果を有し、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現を抑制する抗腫瘍薬の調製に使用され得ることが示される。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

チョウジ５部、シュクシャ５部、トウシキミ３部、ニッケイ８部、シロコショウ３部、モッコウ３部、ショウキョウ５部の重量部の原料から調製されることを特徴とする漢方薬組成物。

【請求項2】

チョウジ５部、シュクシャ５部、トウシキミ３部、ニッケイ８部、シロコショウ３部、モッコウ３部、ショウキョウ５部から調製される漢方薬の揮発性油エキスであって、該漢方薬の揮発性油エキスの調製方法は、前記した割合のチョウジ、シュクシャ、トウシキミ、ニッケイ、シロコショウ、モッコウ、ショウキョウを取り、蒸留水を加え、水蒸気蒸留法により抽出し、揮発性油エキスの粗製品を得、前記の揮発性油エキス粗製品を有機溶剤で抽出し、得られた有機相を溶剤揮発させ、脱水・乾燥することにより、漢方薬の揮発性油エキスを得ることを特徴とする漢方薬の揮発性油エキス。

【請求項3】

前記の漢方薬の揮発性油エキスの特徴的な化学成分は、オイゲノール４２．４３〜５９．１９％、オイゲノールアセテート１３．０５〜１５．２８％、アネトール１０．０２〜１３．１１％、カリオフィレン２．０７〜２．８８％、ボルニルアセテート１．３〜１．７１％を含むことを特徴とする請求項２に記載の漢方薬の揮発性油エキス。

【請求項4】

前記の漢方薬の揮発性油エキスの密度は、１．０〜１．１ｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項３に記載の漢方薬の揮発性油エキス。

【請求項5】

請求項１に記載の漢方薬組成物の、抗腫瘍薬を調製するための使用。

【請求項6】

前記の腫瘍は、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現によるものであることを特徴とする請求項５に記載の漢方薬組成物の抗腫瘍薬を調製するための使用。

【請求項7】

前記の腫瘍は、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、及び結腸がんであることを特徴とする請求項６に記載の漢方薬組成物の抗腫瘍薬を調製するための使用。

【請求項8】

請求項２に記載の漢方薬の揮発性油エキスの、抗腫瘍薬を調製するための使用。

【請求項9】

前記の腫瘍は、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現によるものであることを特徴とする請求項８に記載の漢方薬の揮発性油エキスの抗腫瘍薬を調製するための使用。

【請求項10】

前記の腫瘍は、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、及び結腸がんであることを特徴とする請求項９に記載の漢方薬の揮発性油エキスの抗腫瘍薬を調製するための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、漢方薬組成物及びその揮発性油エキスの、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現を抑制する抗腫瘍薬への使用に関し、抗腫瘍薬の分野に属する。

【背景技術】

【0002】

現在、悪性腫瘍は、人間の死因第１位の疾患となっており、人間の健康を深刻に害している。世界保健機関のデータによると、毎年世界中の腫瘍の発生人数は１０００万人、死亡人数は約７００万人であり、毎年中国での新たな症例数は２００万件、がんによる死亡者数は約１４０万人である。中国の居住者では、５人の死者の中で１人ががんによることである（王明政、２０１７）。

【0003】

ヒト腫瘍の約３０％は、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後のＲＡＳタンパクの過剰活性化に引き起こされる。ヒト腫瘍の３０％にはｒａｓ遺伝子の突然変異とＲＡＳタンパクの過剰活性化があり、その中で膵臓がんの約９０％、結腸がんの５０％程度、及び急性白血病の２０％程度にはｒａｓ遺伝子の突然変異がある（ＨａｒａａｎｄＨａｎ、１９９５）。遺伝性の非ポリポーシス大腸がんの４０％にはＫＲＡＳ突然変異が検出され、通常の濾泡性甲状腺がんの４９％にはＲＡＳ突然変異があり、Ｈｕｒｔｈｌｅ細胞甲状腺腫瘍の４８％にはＲＡＳ突然変異がある。膵臓がんの８３％と胆管がんの８５％にはＫＲＡＳコドン１２の突然変異が発生する。なお、肺がん、胃がん、乳がん、膀胱がん、及び黒色腫などのがんは、ｒａｓ遺伝子の突然変異と密接に関わっている（楊麒巍ら、２０１８）。Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達経路の異常は、肝臓がんの進行に関与している。Ｒａｓシグナル経路をターゲットとする抗腫瘍治療も腫瘍治療学の研究の焦点となっているため、ｒａｓは関わる悪性がん薬物をスクリーニングするための標的となった（劉雪梅ら、２００８）。Ｒａｓシグナル経路は、線虫からヒトまで高度に保存されており、カエノラブディティス・エレガンスでは、ｌｅｔ−６０遺伝子は、保存されたＲＡＳタンパクをコードしており、ヒトＲＡＳタンパクと８３％の相同性がある。ｒａｓ遺伝子が突然変異すると、カエノラブディティス・エレガンスでは線虫が多重陰門の生成を引き起し、ヒトでは細胞の悪性増殖を引き起すことにより、腫瘍が生ずる（李蕊ら、２０１６）。従って、モデル生物であるカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル経路過剰活性化型の突然変異体は、Ｒａｓ経路の過剰活性化を抑制する抗腫瘍薬をスクリーニングするための腫瘍モデルとして幅広く使用されている（Ｈａｒａ ａｎｄ Ｈａｎ、１９９５。王ホウ、２００５。劉雪梅ら、２００８）。本発明では、カエノラブディティス・エレガンスをスクリーニングツールとして使用し、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル経路の過剰活性化を下方制御する抗腫瘍薬の候補をスクリーニングする。

【0004】

中国伝統の化学療法と手術、放射線療法などの併用は、多種の悪性腫瘍の治療成功率を高めることに成功したが、強い副作用と薬剤耐性のため、新たな腫瘍治療法を見つける研究が急務となった（張秀雲、２０１２）。がんの治療において、中国の漢方薬は、多方向的、多標的、薬剤耐性が生じにくいなどのメリットがあり、多因子や多段階というがんの疾患メカニズムに合うものである。漢方薬は、抗腫瘍の効果的な部位、有効成分、及び作用機序に対する研究が国内外の研究の焦点となっており、臨床腫瘍治療において一定の効果を挙げっており、且つ毒性が低いため、腫瘍の予防と治療に新たな道を切り開いた。近年、漢方薬及びその有効成分の抗腫瘍研究において一連の成果が得られ、一部の成果は臨床現場で広く使用されている抗腫瘍薬に転換されている（尹龍ら、２００６。張秀雲、２０１２。朱元章ら、２０１７）。

【0005】

龍虎人丹は、もともと中国の古方「諸葛行軍散」であり、いくつかの改良がなされて、既存の処方を得た。龍虎人丹は、主にメントール、ボルネオール、チョウジ、シュクシャ、トウシキミ、ニッケイ、コショウ、モッコウ、ショウキョウ、カテキン、カンゾウから構成され、醒脳開竅（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ）、消暑化濁（ｄｉｓｐｅｌ ｓｕｍｍｅｒｈｅａｔ ａｎｄ ｒｅｓｏｌｖｅ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）、和中止嘔（ｈａｒｍｏｎｉｚｅ ｔｈｅ ｍｉｄｄｌｅ ｔｏ ｃｈｅｃｋ ｖｏｍｉｔｉｎｇ）することができ、主に熱中症による目まい、悪心・嘔吐、下痢、及び乗り物酔い・船酔いに用いられている。今まで、龍虎人丹では、抗腫瘍の活性があると報道される文献はない。

【0006】

本発明は、龍虎人丹に基づいて改良を行って、ｒａｓ遺伝子の過剰活性化を抑制する漢方薬組成物及びその揮発性油エキスを見出し、該漢方薬組成物及びその揮発性油エキスは、ｒａｓプロトオンコジーンが過剰活性化した腫瘍を治療することに使用され得る。龍虎人丹に比べて、該漢方薬組成物及びその揮発性油エキスは、ｒａｓプロトオンコジーンが過剰活性化した腫瘍を治療することに使用され得る。

【0007】

本発明で提供される漢方薬組成物及びその揮発性油エキスは、いずれか一種の薬学上許容される補助剤と混合して様々な剤形とすることができ、ｒａｓプロトオンコジーンが過剰活性化した腫瘍を治療することに使用され得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

王明政、中国での悪性腫瘍の予防と制御策略に対する探索［Ｊ］．中医薬管理雑志、２０１７、２５（０６）：８−９

【0009】

劉雪梅、トウ平ら、Ｒａｓシグナル伝達経路に基づく薬剤標的に対する研究の進展［Ｊ］、薬学進展、２００８、３２（１１）：４８１−４８５

【0010】

王ホウ（２００５）、線虫をモデル生物として使用して、がん遺伝子ｒａｓの活性を抑制できる薬物をスクリーニングする、復旦大学ポスドク研究報告、

【0011】

Ｈａｒａ Ｍ、Ｈａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｒａｓ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、［Ｊ］、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、９２（４）：３３３３−３３３７

【0012】

張秀雲ら、抗腫瘍漢方薬の有効な部位と化学成分に対する研究の進展［Ｊ］、科技視界、２０１２、７（３）：１７７−１７８

【0013】

尹龍、徐亮ら、抗腫瘍漢方薬及びその有効成分の作用に対する研究の現状［Ｊ］、動物医学進展、２００６、２７（１）：３９−４３

【0014】

朱元章、張貴彪ら、漢方薬の揮発性油の抗腫瘍メカニズムに対する研究の進展［Ｊ］、中国実験方剤学雑志、１６（８）：２２７−２３４

【0015】

楊麒巍、隋玉傑、杜珍武、張桂珍、実体腫におけるＲＡＳ遺伝子ファミリーの突然変異率に対する研究の進展［Ｊ］、中国立体鏡学と画像解析、２０１８（０３）：３０３−３１０．

【0016】

李蕊、宋威江、張少鵬、姚樹坤、肝臓がんの発病メカニズムにおけるＲａｓ−ＭＡＰＫ経路の作用［Ｊ］、中日友好病院学報、２０１６、３０（０１）：４７−４９＋５４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

本発明の目的は、チョウジ、シュクシャ、トウシキミ、ニッケイ、シロコショウ、モッコウ、ショウキョウから構成される漢方薬組成物を提供し、水蒸気蒸留法により抽出し、該漢方薬組成物の揮発性油エキスの粗製品を得、有機溶剤で抽出し、得られた有機相を溶剤揮発させ、脱水・乾燥することにより、該漢方薬の揮発性油エキスを得る。本発明は、該漢方薬組成物及びその揮発性油エキスの、ｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現を抑制するための使用を提供するものであり、治療される具体的な腫瘍は、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、及び結腸がんである。

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明は、次の態様で実施できる。

【0019】

本発明の目的は、漢方薬組成物を提供することであり、該漢方薬組成物は、チョウジ５部、シュクシャ５部、トウシキミ３部、ニッケイ８部、シロコショウ３部、モッコウ３部、ショウキョウ５部の重量部の原料から調製される。

【0020】

本発明のもう一つの目的は、漢方薬の揮発性油エキスを提供することであり、該漢方薬の揮発性油エキスは、チョウジ５部、シュクシャ５部、トウシキミ３部、ニッケイ８部、シロコショウ３部、モッコウ３部、ショウキョウ５部から調製され、その調製方法は、前記した割合のチョウジ、シュクシャ、トウシキミ、ニッケイ、シロコショウ、モッコウ、ショウキョウを取り、蒸留水を加え、水蒸気蒸留法により抽出し、揮発性油エキスの粗製品を得、前記の揮発性油エキスの粗製品を有機溶剤で抽出し、得られた有機相を溶剤揮発させ、脱水・乾燥することにより、漢方薬の揮発性油エキスを得る。

【0021】

該漢方薬の揮発性油エキスの特徴的な化学成分は、オイゲノール４２．４３〜５９．１９％、オイゲノールアセテート１３．０５〜１５．２８％、アネトール１０．０２〜１３．１１％、カリオフィレン２．０７〜２．８８％、ボルニルアセテート１．３〜１．７１％を含む。

【0022】

該漢方薬の揮発性油エキスの密度は、１．０〜１．１ｇ／ｍＬである。

【0023】

本発明のもう一つの目的は、前記の漢方薬組成物及びその漢方薬の揮発性油エキスの、抗腫瘍薬を調製するための使用を提供することにある。

【0024】

前記の腫瘍は、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現によるものである。

【0025】

具体的に係る腫瘍は、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、及び結腸がんである。

【0026】

Ｒａｓシグナル経路は、線虫からヒトまで高度に保存されているため、カエノラブディティス・エレガンスでは、ｌｅｔ−６０遺伝子は、保存されたＲＡＳタンパクをコードし、ヒトＲＡＳタンパクと８３％の相同性がある。ｒａｓが突然変異すると、カエノラブディティス・エレガンスでは線虫が多重陰門の表現型を引き起こし、ヒトでは細胞の悪性増殖を引き起こすことにより、腫瘍が生ずる。従って、モデル生物であるカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）のＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル経路の過剰活性化型の突然変異体は、Ｒａｓ経路過剰活性化を抑制する抗腫瘍薬をスクリーニングするための腫瘍モデルとして幅広く使用されている。

【0027】

従って、本発明は、カエノラブディティス・エレガンスの突然変異体をｒａｓプロトオンコジーン経路の過剰活性化を抑制する薬物を評価するためのモデルとして使用し、該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスはｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現を有意に下方制御する作用があり、ｒａｓプロトオンコジーン経路の過剰活性化を抑制すると結論つけた。また、該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、ｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓの過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞にのみ作用し、ｌｉｎ−１５欠失の突然変異による野生型ｒａｓの過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞に作用しなく、適用が安全であり、すなわち、がん細胞にのみ作用し、正常な細胞に作用しなく、ｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現を有意に下方制御し、遺伝子の突然変異を引き起こすことがなく、催奇形性がない。従って、該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、ｒａｓプロトオンコジーンが過剰表現した腫瘍を治療する薬物の調製に使用され得る。

【0028】

【発明の効果】

【0029】

本発明の漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現を特異的に下方制御し、ｒａｓプロトオンコジーンが突然変異した後の過剰表現による悪性腫瘍を治療する薬物の調製のために使用され得、具体的に係る腫瘍は、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、及び結腸がんである。該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、ｒａｓ遺伝子が過剰表現した腫瘍に対する治療作用が幅広い細胞毒性に依存することではなく、ｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現を特異的に下方制御することである。該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、ｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞にのみ作用し、ｌｉｎ−１５欠失の突然変異による野生型のｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞に作用しなく、すなわち、該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、がん細胞にのみ作用し、正常な細胞に作用しなく、催奇形性がなく、適用が安全である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下、具体的な実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の特許請求の範囲と明細書の保護範囲は、これらの実施例に制限されない。

【0031】

実施例１ 漢方薬の揮発性油エキスの調製

【0032】

原料薬：チョウジ、シュクシャ、トウシキミ、ニッケイ、シロコショウ、モッコウ、ショウキョウ

【0033】

チョウジ７．５ｇ、シュクシャ７．５ｇ、トウシキミ４．５ｇ、ニッケイ１２ｇ、シロコショウ４．５ｇ、モッコウ４．５ｇ、ショウキョウ７．５ｇ。

【0034】

前記の原料薬を粉砕し、水を１０倍量加え、水蒸気蒸留法により３時間抽出し、漢方薬の揮発性油エキス粗製品を得た。

【0035】

漢方薬の揮発性油エキスの粗製品をジエチルエーテルで２回抽出し、得られた有機相を合わせ、ジエチルエーテルを揮発させ、漢方薬の揮発性油エキスを得た。得られた漢方薬の揮発性油エキスは、薄黄色の油状物質である。

【0036】

揮発性油の成分解析：ＧＣ−ＭＳにより揮発性油エキスの化学成分を解析し、４２．４３〜５９．１９％のオイゲノール、１１．８５〜１５．２８％のオイゲノールアセテート、１０．０２〜１３．１１％のアネトール、２．０７〜２．８８％のカリオフィレン、１．３〜１．７１％のボルニルアセテートである。

【0037】

【表1】

【0038】

実施例２ 漢方薬の揮発性油エキスのカエノラブディティス・エレガンスＭＴ２１２４（ｌｅｔ−６０突然変異）に対する作用

【0039】

ｒａｓの過剰活性化については、線虫では線虫が多重陰門を生成することを引き起こし、ヒトでは細胞の悪性増殖を引き起こす。受検薬物が受検線虫の多重陰門の表現型の生成を抑制し、野生型への発達を促進できれば、薬物がＲａｓ経路に作用し、該経路の過剰活性化を下方制御しており、抗腫瘍活性があることを意味する。ＭＴ２１２４は、ｌｅｔ−６０／ｒａｓ過剰活性化のカエノラブディティス・エレガンスであり、この株の線虫は多重陰門の表現型で、ヒトｒａｓプロトオンコジーンの突然変異の難治性腫瘍に罹患してしたことに相当する。受検薬物によりカエノラブディティス・エレガンスＭＴ２１２４を処置し、受検薬物が受検線虫の多重陰門の表現型の生成を抑制し、野生型への発達を促進できれば、薬物は、Ｒａｓ経路に作用し、該経路の過剰活性化を下方制御して、抗腫瘍活性があることを意味する。受検線虫群れにおける野生型の線虫が占める割合が高いほど、受検薬物の作用効果がよいことを意味する。

【0040】

実験材料：カエノラブディティス・エレガンスＭＴ２１２４、遺伝子型：ｌｅｔ−６０（ｎ１０４６ｓｄ、ｇｆ）ＩＶ、ＣＧＣから購入；大腸菌ＯＰ５０、ウラシル漏出の突然変異株、カエノラブディティス・エレガンスの食物としてＣＧＣから購入。

【0041】

Ｓ基礎液：塩化ナトリウム２．９２５ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、蒸留水５００ｍＬを振蕩して溶解させ、１２１℃で２０ｍｉｎ殺菌した。

【0042】

１Ｍのクエン酸緩衝液：クエン酸２ｇ、クエン酸カリウム２９．３５ｇ、蒸留水１００ｍＬを振蕩して溶解させ、１２１℃で２０ｍｉｎ殺菌した。

【0043】

微量溶液：ＥＤＴＡ ０．１８６ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０６ｇ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．００２５ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０２９ｇ、蒸留水１００ｍＬを振蕩して溶解させ、１２１℃で２０ｍｉｎ殺菌した。

【0044】

１Ｍの硫酸マグネシウム溶液：ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２４．６４７ｇ、蒸留水１００ｍＬを振蕩して溶解させ、１２１℃で２０ｍｉｎ殺菌した。

【0045】

１Ｍの塩化カルシウム溶液：ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ １４．７０２ｇ、蒸留水１００ｍＬを振蕩して溶解させ、１２１℃で２０ｍｉｎ殺菌した。

【0046】

５ｍｇ／ｍＬのコレステロール溶液：コレステロール０．０５ｇ、無水エタノール１０ｍＬを振蕩して溶解させ、４℃で保存して予備した。

【0047】

Ｓ液培地：Ｓ基礎液１００ｍＬ、１Ｍのクエン酸緩衝液１ｍＬ、微量溶液１ｍＬ、１Ｍの硫酸マグネシウム溶液０．３ｍＬ、１Ｍの塩化カルシウム溶液０．３ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬのコレステロール溶液０．１ｍＬを均一に混合させてよい。

【0048】

Ｍ９緩衝液：塩化ナトリウム２．４８６ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．９８２ｇ、リン酸二水素カリウム１．４９６ｇ、硫酸マグネシウム０．０６ｇ、蒸留水５００ｍＬを振蕩して溶解させ、１２１℃で２０ｍｉｎ殺菌した。

【0049】

具体的な実験手順：

【0050】

線虫の培養：線虫を大腸菌ＯＰ５０が塗布された固形ＮＧＭプレート上に接して、２０℃の培養器に入れて培養し、線虫が成虫に発達していた、かつプレート上に卵と線虫の幼虫がある時に、線虫の同調化を行う。

【0051】

線虫の同調化：フラットプレート上の線虫をＭ９緩衝液で洗い流し、洗液を遠心管に吸い込む。４０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心し、上清を除去してから、大腸菌を洗浄するために、Ｍ９緩衝液を加えて遠心することを数回繰り返す。溶解液（最終濃度：３．２％ＮａＣｌＯと１ＭのＮａＯＨ）を加える。ボルテックスで７ｍｉｎ振蕩し、線虫を破砕させ、卵を得る。４０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心し、上清を除去し、沈殿物を集めて多数の線虫卵を得る。Ｍ９緩衝液で２回洗い流し、Ｍ９緩衝液１ｍＬを加え、２０℃の培養器に置いて４８時間孵化した。

【0052】

薬液の配合：漢方薬の揮発性油エキスを次の濃度に希釈する：

【0053】

Ｌ：１２．５μｇ／ｍＬ、Ｍ：２５μｇ／ｍＬ、Ｈ：５０μｇ／ｍＬ、ＨＨ：１００μｇ／ｍＬ

【0054】

薬物の作用：同調化された線虫を８０隻／２０μＬ程度に希釈し、前記の線虫液２０μＬ、Ｓ液１２０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬの大腸菌ＯＰ５０ ２０μＬ、５ｍｇ／ｍＬのコレステロール２０μＬ、薬液２０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、各濃度は５つのパラレルに設定する。ブランクコントロール群は、薬液を加えず、薬液を等体積のＳ液に換える。線虫を２０℃の恒温で成熟に培養し、顕微鏡で線虫における野生型の割合を検出する（すなわち、正常な陰門が1つしかない線虫の割合）。ブランクコントロール群に比べて、野生型の割合が高いほど、薬物がｒａｓ活性化を抑制する作用が強いことを意味する。その結果は下表に示される：

【0055】

【表2】

【0056】

＊はブランク群との比較Ｐ＜０．０５

【0057】

表２によると、漢方薬の揮発性油エキスは、カエノラブディティス・エレガンスＭＴ２１２４の野生型の割合を有意に増加させ、濃度依存的な関係を現すことがわかり、漢方薬の揮発性油エキスはＲａｓ経路に作用し、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路の過剰活性化を有意に下方制御する作用があり、突然変異体を野生型にすることを意味する。従って、本漢方薬の揮発性油エキスは、Ｒａｓ経路に作用でき、該経路の過剰活性化を下方制御し、抗腫瘍活性があり、ｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現腫瘍を治療する薬物の調製に使用され得る。

【0058】

実施例３ 漢方薬の揮発性油エキスの、カエノラブディティス・エレガンスＭＴ８１８９（ｌｉｎ−１５突然変異）に対する作用

【0059】

ｌｉｎ−１５は、ｒａｓの上流に位置し、ｒａｓの阻害遺伝子であり、ｌｉｎ−１５欠失の突然変異後、ｒａｓに対する抑制作用がなくなり、線虫が多重陰門の表現型を現す。ＭＴ８１８９（ｌｉｎ−１５）線虫には、野生型ｌｅｔ６０／ｒａｓコピーが含まれ、本発明の漢方薬の揮発性油エキスがカエノラブディティス・エレガンスＭＴ２１２４（ｌｅｔ−６０）の野生型の割合を有意に増加させることができ、ＭＴ８１８９（ｌｉｎ−１５）線虫の多重陰門の表現型を抑制できない場合、本発明の漢方薬の揮発性油エキスはｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞にのみ作用し、ｌｉｎ−１５欠失の突然変異による野生型のｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞に作用しないことを意味する。従って、本発明の漢方薬の揮発性油エキスは、ｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞にのみ作用し、正常な細胞に作用しないことが証明された。

【0060】

実験材料：カエノラブディティス・エレガンスＭＴ８１８９、多重陰門の表現型、遺伝子型：ｌｉｎ−１５（ｎ７６５ｔｓ）Ｘ、ＣＧＣから購入。大腸菌ＯＰ５０、ウラシル漏出の突然変異株、カエノラブディティス・エレガンスの食物としてＣＧＣから購入。

【0061】

具体的な実験手順：実施例２と同じ。

【0062】

【表3】

ｌｉｎ−１５（ｎ７６５）は、ｒａｓの上遊に位置し、合成多重陰門の遺伝子（ＳｙｎＭｕｖ）とする_ｏ

【0063】

表３に示すように、本発明の漢方薬の揮発性油エキスは、ｌｉｎ−１５（ｎ７６５）の多重陰門の表現型を抑制できず、遺伝的優位性の原則に基づいて、実施例２の実験結果は、本発明の漢方薬の揮発性油エキスがその下流のｌｅｔ６０／ｒａｓプロトオンコジーンの過剰活性化による多重陰門の表現型を逆転できること、すなわち、本発明の漢方薬の揮発性油エキスはｌｅｔ６０／ｒａｓ上流の遺伝子ｌｉｎ−１５（ｎ７６５）の多重陰門の表現型を抑制できないことが示される。これは、ｌｉｎ−１５（ｎ７６５）線虫には野生型のｌｅｔ６０／ｒａｓコピーが含まれており、本発明の漢方薬の揮発性油エキスはｌｅｔ−６０の突然変異によるｌｅｔ６０／ｒａｓ過剰活性化の腫瘍にのみ作用し、ｌｉｎ−１５欠失の突然変異によるｌｅｔ６０／ｒａｓ過剰活性化の腫瘍に感受性がない、すなわち、本発明の漢方薬の揮発性油エキスはｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞にのみ作用し、正常な細胞に作用しないためである。

【0064】

実施例４ 漢方薬の揮発性油エキスの、カエノラブディティス・エレガンスＣＢ１２７５（ｌｉｎ−１欠失の突然変異）に対する作用

【0065】

ｌｉｎ−１は、ｒａｓの下流の遺伝子の一つとして、ＭＡＰＫによってリン酸化され得る核内転写因子であり、かつ陰門発達の負の調節因子であり、ｌｅｔ−６０の下流にある陰門が発達するシグナル経路を調節できる。ｌｉｎ−１とｌｉｎ−３１は複合体を形成し、ｌｉｎ−１がＥＴＳファミリーメンバーをコードし、ｌｉｎ−３１が翼があるトリヘリックス転写因子をコードする。ｒａｓシグナルが非活性化である時に、ｌｉｎ−１とｌｉｎ−３１は互いに作用して複合体となり、この複合体は産卵管の機能遺伝子のプロモーター部分と結合してそれらの表現を阻害する。ｌｉｎ−１欠失の突然変異後に、複合体は形成できない。そうなると、複合体は産卵管の機能遺伝子のプロモーター部分と結合できず、産卵管遺伝子が表現し、さらに偽陰門が発達して多重陰門の表現型を生成する（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、１９８９）。

【0066】

すなわち、ｌｉｎ−１は、ｒａｓの下流の遺伝子一つとして、陰門発達の負の調節因子であり、ｌｉｎ−１欠失の突然変異後に産卵管遺伝子が表現し、線虫が多重陰門の表現型を現し、漢方薬の揮発性油エキスがｌｉｎ−１の多重陰門の表現型を抑制できない。これは、薬物の作用部位はｌｉｎ−１ではなくｌｉｎ−１の上流であること、すなわち、薬物は陰門細胞の発達を直接に抑制するではなく、ｒａｓの過剰活性化を下方制御することで作用する。

【0067】

実験材料：カエノラブディティス・エレガンスの遺伝子型：ｌｉｎ−１（ｅ１２７５）ＩＶはＣＧＣ（ＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓＧｅｎｅｔｉｃｓＣｅｎｔｅｒ）からであり、ＣＧＣから購入。大腸菌ＯＰ５０、ウラシル漏出の突然変異株、カエノラブディティス・エレガンスの食物としてＣＧＣから購入。

【0068】

具体的な実験手順：実施例２と同じ

【0069】

実施例２の結果は、薬物が線虫の多重陰門の表現型を抑制したことを示しているが、この結果は、薬物がｌｅｔ−６０／ｒａｓ過剰活性化を有意に下方制御する部位がｌｅｔ−６０またはその下流に位置することを示唆している。ＭＴ２１２４（ｌｅｔ−６０突然変異）の多重陰門の表現型を抑制できる薬物で、同様にカエノラブディティス・エレガンスＣＢ１２７５を処置し、その多重陰門の表現型を抑制できない場合は、薬物の作用部位がｌｉｎ−１の上流に位置することを意味する。なお、ｌｉｎ−１は、核内転写因子であるため、ｌｉｎ−３１と互いに作用して複合体となり、陰門細胞の発達過程を調節する。薬物は該遺伝子が不活化する突然変異の多重陰門の表現型に有意な抑制作用を有すれば、薬物が陰門前駆細胞の発達を直接抑制し、それらが多重陰門の表現型を生成することを阻害できること、すなわち、ｒａｓプロトオンコジーンが過剰表現する腫瘍を治療できることを意味する。

【0070】

【表4】

【0071】

表４に示すように、ＣＢ１２７５株の線虫の多重陰門の表現型が漢方薬の揮発性油エキスの影響を受けていないことは、薬物がＲａｓシグナル経路に作用し、ｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓ過剰活性化によって生成する多重陰門の表現型を抑制し、ｌｉｎ−１欠失の突然変異による多重陰門の表現型を抑制できないことを示しており、本発明の漢方薬の揮発性油エキスは、ｌｉｎ−１ではなくｒａｓに作用し、薬物が細胞の増殖分化を直接に抑制するではなくｒａｓの過剰活性化を下方制御することによって作用すること、すなわち、本発明の漢方薬の揮発性油エキスは、幅広い細胞毒性ではなくＲａｓ経路メカニズム依存的に作用することが証明される。

【0072】

実施例５ 漢方薬の揮発性油エキスと単一薬物の、カエノラブディティス・エレガンスＭＴ２１２４（ｌｅｔ−６０突然変異）に対する作用

【0073】

実験材料：実施例２と同じ。

【0074】

各単一薬物の用量は、漢方薬の揮発性油エキスと生薬量で一致する。

【0075】

【表5】

【0076】

具体的な実験手順：実施例２と同じ。

【0077】

【表6】

【0078】

【表7】

【0079】

【表8】

【0080】

【表9】

【0081】

【表10】

【0082】

【表11】

【0083】

【表12】

【0084】

表６〜１２に示すように、本発明に記載の調製方法により調製された漢方薬エキスの揮発性油は、その抗腫瘍活性が単一薬物の揮発性油の抗腫瘍活性よりも有意に高い。

【0085】

実施例５ 漢方薬の揮発性油エキス及びオイゲノールの、カエノラブディティス・エレガンスＭＴ２１２４（ｌｅｔ−６０突然変異）に対する作用

【0086】

先行技術を検索すると、オイゲノールは抗腫瘍活性があることを見出すため、本実施例は、漢方薬の揮発性油エキス及びオイゲノールのｒａｓプロトオンコジーンが過剰活性化した腫瘍を抑制する作用について比較を行った。実験の結果は次のとおりである：

【0087】

【表13】

【0088】

表１３に示すように、オイゲノールは、ｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現を抑制する効果も示したが、本発明で開示される漢方薬の揮発性油エキスは、その抗腫瘍活性がオイゲノールの抗腫瘍活性よりも有意に高い。これは、本発明における合理的な配合と抽出処理により得られた漢方薬の揮発性油エキスは、相乗効果の技術効果を実現した。

【0089】

従って、本発明は、漢方薬組成物及びその揮発性油エキスの、ｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現腫瘍を治療するための使用に関し、具体的に係る腫瘍は、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、及び結腸がんである。該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスのｒａｓ遺伝子の過剰表現腫瘍に対する治療作用は、幅広い細胞毒性に依存するではなく、ｒａｓプロトオンコジーンの過剰表現を特異的に下方制御することである。該漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、ｌｅｔ−６０の突然変異によるｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞にのみ作用し、ｌｉｎ−１５欠失の突然変異による野生型のｒａｓ過剰活性化によって引き起こされる腫瘍細胞に作用しない、すなわち、本発明の漢方薬組成物及び漢方薬の揮発性油エキスは、がん細胞にのみ作用し、正常な細胞に作用しなく、催奇形性がなく、適用が安全である。

【国際調査報告】