特表 2021-526837 抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-526837(P2021-526837A)

(43)【公表日】2021年10月11日

(54)【発明の名称】抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210913BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20210913BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210913BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210913BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20210913BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20210913BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20210913BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210913BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210913BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210913BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210913BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20210913BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210913BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210913BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210913BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20210913BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210913BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20210913BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13

   C12N15/113 ZZNA

   C12N15/62 Z

   C07K16/28

   C07K16/30

   C07K16/46

   C07K1/16

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   A61K47/68

   A61K31/7105

   A61K39/395 L

   A61K39/395 N

   A61P43/00 105

   A61P35/00

   C12N15/63 Z

   C12P21/08

   C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】152

(21)【出願番号】特願2020-569176(P2020-569176)

(86)(22)【出願日】2019年6月12日

(85)【翻訳文提出日】2021年2月10日

(86)【国際出願番号】US2019036836

(87)【国際公開番号】WO2019241430

(87)【国際公開日】20191219

(31)【優先権主張番号】62/684,131

(32)【優先日】2018年6月12日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

３．Ｐｌｕｒｏｎｉｃ

(71)【出願人】

【識別番号】520069899

【氏名又は名称】アンジーエックス・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】ジャミネット，ポール・エイ

(72)【発明者】

【氏名】ジャミネット，ショウ−チン・エス

(72)【発明者】

【氏名】ハ，エドワード

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AA90X

4B065AA91X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC50

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA50

4H045FA74

4H045GA22

(57)【要約】

標的化タンパク質、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体もしくは抗原またはそれらの結合フラグメントを含むコンジュゲートが提供される。前記コンジュゲートの製造および使用方法も記載される。
【選択図】図２６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項2】

ＲＮＡが、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項3】

ＲＮＡが、ｐ５３の阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項4】

ＲＮＡが、免疫チェックポイントタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項5】

ＲＮＡが、ＤＮＡ修復の不活性化に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項6】

ＲＮＡが、シアル酸生成の抑制に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項7】

ＲＮＡが、ナンセンス変異依存分解に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項8】

ＲＮＡが、共刺激シグナルを促進することが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項9】

ＲＮＡ分子が、白血球の血管外遊出を抑制することが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項10】

ＲＮＡ分子が、細胞分裂にとって重要な分子を抑制することが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項11】

ＲＮＡ分子が、血管新生を促進することが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項12】

ＲＮＡ分子が、血管新生を阻害することが可能である、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項13】

ＲＮＡ分子が、トリヌクレオチドリピートを含むｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項14】

ｓｉＲＮＡが、ＣＡＧ／ＣＵＧトリヌクレオチドリピートベースのｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項15】

ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（抗ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項16】

ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡを含む、請求項１５に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項17】

ｓｉＲＮＡが、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項18】

ｓｉＲＮＡが、ＢＣＬ−Ｘ_Ｌ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ−Ｂ、もしくはＢＣＬ２、またはそれらの機能性ドメインの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項19】

ｓｉＲＮＡが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ−４７／ＩＡＰ、ＳＮＡＩ１、ＺＥＢ１、Ｂ７−Ｈ３、ＩＤＯ、ＬＳＥＣｔｉｎ、ガレクチン−９、Ｃｅａｃａｍ−１、ＨＭＧＢ−１、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、もしくはそれらの機能性ドメインの少なくとも１つ、またはそれらの任意の組合せをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項20】

ｓｉＲＮＡが、ＭＤＭ２またはＭＤＭ４を抑制することが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項21】

ｓｉＲＮＡが、ＵＰＦ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項22】

ｓｉＲＮＡが、ＭＬＨ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項23】

ｓｉＲＮＡが、ＣＭＡＳをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項24】

ｓｉＲＮＡが、白血球の血管外遊出の抑制に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項25】

ｓｉＲＮＡが、キナーゼをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項26】

キナーゼが、サイクリン依存性キナーゼを含む、請求項２５に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項27】

サイクリン依存性キナーゼが、ＣＤＫＬ１、ＣＤＫＬ２、ＣＤＫＬ３、ＣＤＫＬ４、ＣＤＫＬ５、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、ＣＤＫ１０、ＣＤＫ１１Ａ、ＣＤＫ１１Ｂ、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ１３、ＣＤＫ１４、ＣＤＫ１５、ＣＤＫ１６、ＣＤＫ１７、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、もしくはＣＤＫ２０、もしくはそれらの機能性ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項２６に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項28】

サイクリン依存性キナーゼが、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６を含む、請求項２７に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項29】

前記キナーゼが、ｐｏｌｏ様キナーゼを含み、ｐｏｌｏ様キナーゼは、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、もしくはＰＬＫ４、もしくはそれらの機能性ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項２８に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項30】

前記キナーゼが、オーロラ様キナーゼを含み、オーロラ様キナーゼは、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、もしくはＡＵＲＫＣ、もしくはそれらの機能性ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項２８に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項31】

ｓｉＲＮＡが、ＭＡＤＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、末梢リンパ節アドレシン（ＰＮＡｄ）、ＩＣＡＭ−２、ＰＥＣＡＭ−１、ＪＡＭ−Ａ、ＪＡＭ−Ｂ、ＪＡＭ−Ｃ、ガレクチン−１、ガレクチン−３、およびガレクチン−９の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項32】

ｓｉＲＮＡが、ＴＭ４ＳＦ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項33】

ｓｉＲＮＡが、腫瘍遺伝子の発現を阻害することことが可能である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項34】

腫瘍遺伝子が、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＴＦ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＤＸ２、ＣＴＮＮＢ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＥＧＦＲ、ＥＬＫ４、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ４、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＵＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＲＡＳ、ＩＲＦ４、ＪＵＮ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＭＯ２、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＭＬ２、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＰＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＣＯＡ４、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＵＰ２１４、ＰＡＸ８、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＦ１、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＳＳ１８、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＴ２、ＴＦＧ、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＴＰＲ、またはＵＳＰ６を含む、請求項３３に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項35】

ＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項36】

ｍｉＲＮＡが、共刺激シグナルを促進することが可能である、請求項３５に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項37】

ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１４６ａである、請求項３６に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項38】

ｍｉＲ−１４６ａが、表Ｉに列挙した遺伝子から選択される１つまたは複数の標的遺伝子の発現を抑制することが可能である、請求項３７に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項39】

ｍｉＲＮＡが、血管新生を促進することが可能である、請求項３５に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項40】

ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−２６ａである、請求項３９に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項41】

ｍｉＲＮＡが、ＡＰＴＸ、ＣＮＢＰ、ＡＲＬ８Ａから選択される１つまたは複数の標的遺伝子の発現を抑制することが可能である、請求項４０に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項42】

ｍｉＲＮＡが、白血球の血管外遊出を抑制することが可能である、請求項３５に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項43】

ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１８ｂである、請求項４２に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項44】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子が、共有結合で、または非共有結合でコンジュゲートされている、請求項１から４３のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項45】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子が、遺伝学的なコンジュゲーション、酵素的なコンジュゲーション、化学的なコンジュゲーション、またはそれらの任意の組合せによってコンジュゲートされている、請求項１から４３のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項46】

酵素的なコンジュゲーションが、微生物トランスグルタミナーゼ、ホスファターゼ、もしくはソルターゼＡ、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項４５に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項47】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子が、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント中の１つまたは複数の操作されたシステイン残基または１つまたは複数の非天然アミノ酸を介してコンジュゲートされている、請求項１から４３のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項48】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子が、単一または多工程のプロトコールでリンカーによってコンジュゲートされている、請求項１から４３のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項49】

リンカーが、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、負荷前のリンカー、またはジカルボン酸ベースのリンカーを含む、請求項４８に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項50】

リンカーが、切断可能な共有結合または非共有結合のリンカーを含む、請求項４９に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項51】

リンカーが、切断不可能な共有結合または非共有結合のリンカーを含む、請求項４９に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項52】

切断可能なリンカーが、酸不安定性のリンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光不安定性のリンカー、またはジスルフィド含有リンカーを含む、請求項５０に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項53】

リンカーが、システインリンカーまたは非システインリンカーを含む、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項54】

リンカーが、リジンリンカーを含む、請求項５３に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項55】

リンカーが、ＭＣ（６−マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ−ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、ｖａｌ−ａｌａ（バリン−アラニン）、ａｌａ−ｐｈｅ（アラニン−フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘキサノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−メチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘキサノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−メチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘプタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−エチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘプタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロプロピル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロブチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロペンチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロヘキシル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、またはＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）を含む、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項56】

リンカーが、架橋試薬から誘導され、架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−シクロプロピル−３−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−シクロブチル−３−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）プロパノエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロプロピル−４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロブチル−４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロプロピル−４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロブチル−４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）を含む、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項57】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、重鎖に導入されたシステイン残基を含む、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＲＮＡ分子が、化学的に安定化されたＲＮＡを含み、リンカーは、還元可能な、または還元不可能なＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）リンカーを含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項58】

化学的に安定化されたＲＮＡが、３’または５’タグを有するｓｉＲＮＡを含む、請求項５７に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項59】

化学的に安定化されたＲＮＡが、３’−アミンタグを有するｓｉＲＮＡを含む、請求項５７または５８に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項60】

還元可能なＮＨＳリンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）を含む、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項61】

還元不可能なＮＨＳリンカーが、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）を含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項62】

３’−アミンタグを有するｓｉＲＮＡおよび操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、チオエステル結合を介して共有結合で連結される、請求項５９から６１のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項63】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号６〜８、１２〜１５、１８〜２０、２４〜２６、３０〜３２、３６〜３８、４２〜４４、４８〜５０、５４〜５６、６０〜６２、６６〜６８、７２〜７４、７８〜８０、８４〜８６、および９４〜９９から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む、請求項１から６２のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項64】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１、３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、および９２から選択される配列を含む重鎖、ならびに配列番号２、１０、２１、３３、４５、５７、６９、８１、および９３から選択される配列を含む軽鎖を含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項65】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ’フラグメントである、請求項１から６３のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項66】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合で連結されたｓｉＲＮＡを含むコンジュゲート。

【請求項67】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号６〜８、１２〜１５、１８〜２０、２４〜２６、３０〜３２、３６〜３８、４２〜４４、４８〜５０、５４〜５６、６０〜６２、６６〜６８、７２〜７４、７８〜８０、８４〜８６、および９４〜９９から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む、請求項６６に記載のコンジュゲート。

【請求項68】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１、３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、および９２から選択される配列を含む重鎖、ならびに配列番号２、１０、２１、３３、４５、５７、６９、８１、および９３から選択される配列を含む軽鎖を含む、請求項６６または６７に記載のコンジュゲート。

【請求項69】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ’フラグメントである、請求項６６から６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項70】

ｓｉＲＮＡが、アポトーシス阻害剤、ｐ５３の阻害剤、免疫チェックポイントタンパク質、ＤＮＡ修復の不活性化に関与するタンパク質、シアル酸生成の抑制に関与するタンパク質、ナンセンス変異依存分解に関与するタンパク質を標的化することが可能である、請求項６６から６９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項71】

ｓｉＲＮＡが、共刺激シグナルを促進すること、白血球の血管外遊出を抑制すること、細胞分裂にとって重要な分子を抑制すること、血管新生を阻害または促進することが可能である、請求項６６から７０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項72】

ＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントを含む抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートであって、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（抗ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含む、抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項73】

ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡを含む、請求項７２に記載の抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項74】

（ｉ）マレイミドで改変された、または（２−ピリジルジチオ）ペンタノエートで改変されたｓｉＲＮＡを生成するステップ、（ｉｉ）抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントをシステアミンで還元して、２つのチオール基を含む操作された抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントを生成するステップ；および（ｉｉｉ）マレイミドで改変された、または（２−ピリジルジチオ）ペンタノエートで改変されたｓｉＲＮＡを、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントと共にインキュベートして、抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを産生するステップを含むプロセスによって産生される、請求項７３に記載の抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲート。

【請求項75】

請求項１から６３のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート、請求項６６から７１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項７２から７４のいずれか一項に記載の抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、抗体−薬物コンジュゲートと組み合わせて含む組成物。

【請求項76】

抗体−薬物コンジュゲートが、がんの処置のための細胞傷害性ペイロードを含む、請求項７５に記載の組成物。

【請求項77】

抗体−薬物コンジュゲートが、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項７５または７６に記載の組成物。

【請求項78】

細胞傷害性ペイロードが、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、核輸送タンパク質ＣＲＭ１の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ傷害剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＨＦＲ阻害剤、核酸、またはＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、請求項７６に記載の組成物。

【請求項79】

前記ペイロードが、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、またはネモルビシン誘導体を含む、請求項７５から７８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項80】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１〜５４から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む、請求項７５から７９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項81】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号４９〜５９に記載の配列を含む重鎖、および配列番号５７〜６７に記載の配列を含む軽鎖を含む、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項82】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ’フラグメントである、請求項７５から８１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項83】

ｓｉＲＮＡを、抗ＴＭ４ＳＦ１またはその抗原結合フラグメントとコンジュゲートするステップを含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを合成するためのプロセス。

【請求項84】

抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖にシステイン残基を導入して、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するステップを含む、請求項８３に記載のプロセス。

【請求項85】

３’−アミンを付加することによりｓｉＲＮＡを改変して、化学的に安定化された３’アミンタグを有するｓｉＲＮＡを生成するステップを含む、請求項８４に記載のプロセス。

【請求項86】

化学的に安定化された３’アミンタグを有するｓｉＲＮＡをＮＨＳリンカーと反応させて、チオール反応性ｓｉＲＮＡ−リンカー付加物を生成するステップを含む、請求項８５に記載のプロセス。

【請求項87】

チオール反応性ｓｉＲＮＡ−リンカー付加物を、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント上のチオール基と反応させ、それにより抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを生成するステップを含む、請求項８３に記載のプロセス。

【請求項88】

クロマトグラフィー手順を使用して、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを精製するステップをさらに含む、請求項８３から８７のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項89】

ＮＨＳリンカーが、還元可能な、または還元不可能なＮＨＳリンカーを含む、請求項８６から８８のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項90】

還元可能なリンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）を含む、請求項８９に記載のプロセス。

【請求項91】

還元不可能なリンカーが、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）を含む、請求項８９に記載のプロセス。

【請求項92】

クロマトグラフィー手順が、サイズ排除クロマトグラフィーを含む、請求項８８から９１のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項93】

治療有効量の請求項１から６５のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法。

【請求項94】

治療有効量の請求項１から６５のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて対象に投与するステップを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

治療有効量の請求項１から６５のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて対象に投与するステップを含む、請求項９３または９４に記載の方法。

【請求項96】

さらなる療法が、化学療法、放射線、追加のウイルスでの腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節剤での処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗がん剤、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

治療有効量の請求項１から６５のいずれか一項に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて対象に投与するステップを含み、抗体−ＲＮＡコンジュゲート、組成物、もしくはさらなる療法、またはそれらの任意の組合せは、液体剤形、固体剤形、吸入可能剤形、鼻腔内剤形、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せで投与される、請求項９３から９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

治療有効量の請求項６６から７１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法。

【請求項99】

治療有効量の請求項６６から７１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて対象に投与するステップを含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

治療有効量の請求項６６から７１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて対象に投与するステップを含む、請求項９８または９９に記載の方法。

【請求項101】

さらなる療法が、化学療法、放射線、追加のウイルスでの腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節剤での処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗がん剤、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

治療有効量の請求項６６から７１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて対象に投与するステップを含み、コンジュゲート、組成物、もしくはさらなる療法、またはそれらの任意の組合せは、液体剤形、固体剤形、吸入可能剤形、鼻腔内剤形、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せで投与される、請求項９８から１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

治療有効量の請求項７２から７４のいずれか一項に記載の抗体フラグメントＲＮＡコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法。

【請求項104】

治療有効量の請求項７２から７４のいずれか一項に記載の抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて対象に投与するステップを含む、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

治療有効量の請求項７２から７４のいずれか一項に記載の抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて対象に投与するステップを含む、請求項１０３または１０４に記載の方法。

【請求項106】

さらなる療法が、化学療法、放射線、追加のウイルスでの腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節剤での処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗がん剤、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

治療有効量の請求項７２から７４のいずれか一項に記載の抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて対象に投与するステップを含み、コンジュゲート、組成物、もしくはさらなる療法、またはそれらの任意の組合せは、液体剤形、固体剤形、吸入可能剤形、鼻腔内剤形、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せで投与される、請求項１０３から１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

がんが、黒色腫、肝細胞癌、乳がん、肺がん、腹膜がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、腎臓癌、膵臓がん、上皮癌、胃がん、結腸癌、十二指腸がん、膵臓腺癌、中皮腫、多形膠芽細胞腫、星細胞腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、肝細胞癌、胆管肉腫、膵臓腺癌、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸がん、腸型胃腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄増殖性新生物、または肉腫を含む、請求項９３から１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート。

【請求項110】

オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ分子を含む、請求項１０９に記載のコンジュゲート。

【請求項111】

オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０９または１１０に記載のコンジュゲート。

【請求項112】

オリゴヌクレオチドが、改変されたＤＮＡ、三重らせんＤＮＡ、スーパーコイルＤＮＡ、Ｚ−ＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１０９に記載のコンジュゲート。

【請求項113】

治療有効量の請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載のコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法。

【請求項114】

治療有効量の、請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む組成物を対象に投与するステップを含む、請求項１１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
[0001]本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／６４８，１３１号の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

[0002]治療用ＲＮＡ分子開発の成功に対する主要な障害は、エンドソーム脱出の問題、すなわち、細胞への内在化は、エンドソームおよびリソソームを通って進み、大きい電荷を有する親水性分子であるＲＮＡは、エンドソームまたはリソソームを避けることができないという事実である。外因性ＲＮＡのエンドソーム−リソソームの内在化およびスクリーニングは、細胞へのウイルスの侵入を阻害する哺乳類細胞の進化した特徴である。様々な研究が、ＲＮＡ治療剤開発の状況におけるエンドソーム脱出の困難さを指摘している：「ＲＮＡｉ治療剤の腫瘍への効率的な送達、〜次いで、エンドソームから細胞質への脱出などの、ｓｉＲＮＡ送達に提示されるいくつかの問題がある。（There are several challenges presented to siRNA delivery such as efficient delivery of RNAi therapeutics to tumors ・・・and then escape from the endosome into the cytoplasm.）」Ｔａｔｉｐａｒｔｉら、Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ （Ｂａｓｅｌ）．２０１７年４月；７（４）：７７。「エンドソーム脱出は、ｓｉＲＮＡ送達のために克服すべき重大な生物学的障害である。（Endosomal escape is a critical biological barrier to be overcome for siRNA delivery.）」Ｍａ，Ｄ Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．２０１４年６月２１日；６（１２）：６４１５〜２５。「エンドサイトーシス経路は、細胞およびあらゆる生物学的物質、例えばＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびタンパク質の主要な取り込みメカニズムである。これらの物質は、エンドソーム中に閉じ込められた状態になり、〜。したがって、有効な生物製剤ベースの療法の達成を制限する段階は、エンドソーム脱出を容易にし、治療剤のサイトゾル送達を確実にすることである。（The endocytic pathway is the major uptake mechanism of cells and any biological agents, such as DNA, siRNA and proteins. These agents become entrapped in endosomes・・・. Thus, a limiting step in achieving an effective biological based therapy is to facilitate the endosomal escape and ensure cytosolic delivery of the therapeutics.）」Ｖａｒｋｏｕｈｉら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１１年５月１０日；１５１（３）：２２０〜８。

【0003】

[0003]これまでの抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを介した治療用ＲＮＡの送達をもたらす努力は、エンドソーム脱出を達成できないことにより失敗してきた。例えば、抗体−ＲＮＡコンジュゲートを開発するこれまでの努力は、「内在化するＡＲＣの全てが、標的化された方式でｓｉＲＮＡを細胞に送達したことから、問題は、細胞へのｓｉＲＮＡの送達だけでなく、エンドソーム区画からＲＩＳＣを取り込むための生産性のある細胞内の場所へのｓｉＲＮＡの送達におけるサイレンシングの休止と考えられる。ＡＲＣ送達メカニズムを継続的に解明することが、エンドソームから出ていくこととＲＩＳＣへの接近を容易にするようにコンジュゲートを改変する方法を明らかにすることになるだろう。（All of the internalizing ARCs delivered siRNA into cells in a targeted manner, and so it seems the challenge to silencing rests in delivering the siRNA not just into cells but also out of endosomal compartments, to the productive intracellular locale for RISC engagement. Continued elucidation of ARC delivery mechanisms will likely illuminate ways to modify the conjugates to facilitate endosomal egress and access to the RISC.）」Ｃｕｅｌｌａｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５年１月３０日；４３（２）：１１８９〜１２０３と結論付けられている。したがって、当技術分野において、治療用ＲＮＡ分子の改善された送達の必要が未だある。

【0004】

[0004]ＴＭ４ＳＦ１は、タンパク質を核に輸送することによって血管新生を維持する、内皮細胞、間葉幹細胞、および腫瘍細胞中で発現されるタンパク質である。以前の研究は、インビトロの培養された内皮細胞およびインビボの血管新生内皮細胞において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、微小管ネットワークに沿ってサイトゾルを通過し、核に到達することを示している。Ｓｃｕｉｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５年９月２５日；４６５（３）：３３８〜４３を参照されたい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

[0005]本発明者らによれば、いかなる特定の理論に縛られることはないが、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体オリゴヌクレオチドは、エンドソーム脱出の問題を回避するか、またはエンドソーム脱出の制限をサイトゾル放出または核の脱出のうちより扱いやすい方で代用することを可能にし、したがって、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用は、ＴＭ４ＳＦ１のリソソーム内在化に基づかずに、腫瘍細胞および血管新生内皮細胞の治療上の重要な細胞型にオリゴヌクレオチドを効果的に送達し、それによってエンドソーム脱出の必要性を回避することが可能になることが予期される。

【課題を解決するための手段】

【0006】

[0006]一実施形態は、ＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、抗体−ＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ｐ５３の阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、免疫チェックポイントタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ＤＮＡ修復の不活性化に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、シアル酸生成の抑制に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ナンセンス変異依存分解（nonsense mediated decay）に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、共刺激シグナルを促進することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、白血球の血管外遊出を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、細胞分裂にとって重要な分子を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、血管新生を促進することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、血管新生を阻害することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、トリヌクレオチドリピートを含むｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＡＧ／ＣＵＧトリヌクレオチドリピートベースのｓｉＲＮＡである。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）（抗ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＢＣＬ−Ｘ_Ｌ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ−Ｂ、もしくはＢＣＬ２、またはそれらの機能性ドメインの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ−４７／ＩＡＰ、ＳＮＡＩ１、ＺＥＢ１、Ｂ７−Ｈ３、ＩＤＯ、ＬＳＥＣｔｉｎ、ガレクチン−９、Ｃｅａｃａｍ−１、ＨＭＧＢ−１、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、もしくはそれらの機能性ドメインの少なくとも１つ、またはそれらの任意の組合せをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＤＭ２またはＭＤＭ４を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＵＰＦ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＬＨ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＭＡＳをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、白血球の血管外遊出の抑制に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、キナーゼをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、キナーゼは、サイクリン依存性キナーゼを含む。一部の実施形態において、サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫＬ１、ＣＤＫＬ２、ＣＤＫＬ３、ＣＤＫＬ４、ＣＤＫＬ５、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、ＣＤＫ１０、ＣＤＫ１１Ａ、ＣＤＫ１１Ｂ、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ１３、ＣＤＫ１４、ＣＤＫ１５、ＣＤＫ１６、ＣＤＫ１７、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、もしくはＣＤＫ２０、もしくはそれらの機能性ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６を含む。一部の実施形態において、キナーゼは、ｐｏｌｏ様キナーゼを含み、ｐｏｌｏ様キナーゼは、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、もしくはＰＬＫ４、もしくはそれらの機能性ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、キナーゼは、オーロラ様キナーゼを含み、オーロラ様キナーゼは、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、もしくはＡＵＲＫＣ、もしくはそれらの機能性ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＡＤＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、末梢リンパ節アドレシン（ＰＮＡｄ）、ＩＣＡＭ−２、ＰＥＣＡＭ−１、ＪＡＭ−Ａ、ＪＡＭ−Ｂ、ＪＡＭ−Ｃ、ガレクチン−１、ガレクチン−３、およびガレクチン−９の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＴＭ４ＳＦ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、腫瘍遺伝子の発現を阻害することが可能である。一部の実施形態において、腫瘍遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＴＦ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＤＸ２、ＣＴＮＮＢ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＥＧＦＲ、ＥＬＫ４、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ４、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＵＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＲＡＳ、ＩＲＦ４、ＪＵＮ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＭＯ２、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＭＬ２、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＰＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＣＯＡ４、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＵＰ２１４、ＰＡＸ８、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＦ１、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＳＳ１８、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＴ２、ＴＦＧ、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＴＰＲ、またはＵＳＰ６を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、共刺激シグナルを促進することが可能である。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４６ａである。一部の実施形態において、ｍｉＲ−１４６ａは、表Ｉに列挙した遺伝子から選択される１つまたは複数の標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、血管新生を促進することが可能である。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２６ａである。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ＡＰＴＸ、ＣＮＢＰ、ＡＲＬ８Ａから選択される１つまたは複数の標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、白血球の血管外遊出を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１８ｂである。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子は、共有結合または非共有結合によってコンジュゲートされる。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子は、遺伝学的なコンジュゲーション、酵素的なコンジュゲーション、化学的なコンジュゲーション、またはそれらの任意の組合せによってコンジュゲートされる。一部の実施形態において、酵素的なコンジュゲーションは、微生物トランスグルタミナーゼ、ホスファターゼ、もしくはソルターゼＡ、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント中の１つまたは複数の操作されたシステイン残基または１つまたは複数の非天然アミノ酸を介してコンジュゲートされる。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子は、単一または多工程のプロトコールでリンカーによってコンジュゲートされる。一部の実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、負荷前の（ｐｒｏ−ｃｈａｒｇｅｄ）リンカー、またはジカルボン酸ベースのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、切断可能な共有結合または非共有結合のリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、切断不可能な共有結合または非共有結合のリンカーを含む。一部の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸不安定性のリンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光不安定性のリンカー、またはジスルフィド含有リンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、システインリンカーまたは非システインリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、リジンリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＭＣ（６−マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ−ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、ｖａｌ−ａｌａ（バリン−アラニン）、ａｌａ−ｐｈｅ（アラニン−フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘキサノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−メチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘキサノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−メチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘプタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−エチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ヘプタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロプロピル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロブチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロペンチル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロヘキシル−４−（ピリジン−２−イルチオ）ブタノエート、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、またはＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）を含む。一部の実施形態において、リンカーは、架橋試薬から誘導され、架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−シクロプロピル−３−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−シクロブチル−３−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）プロパノエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロプロピル−４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロブチル−４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロプロピル−

４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−シクロブチル−４−（ピリジン−２−イルジスルファンイル）ブタノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖に導入されたシステイン残基を含む、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＲＮＡ分子が、化学的に安定化されたＲＮＡを含み、リンカーは、還元可能な、または還元不可能なＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）リンカーを含む。一部の実施形態において、化学的に安定化されたＲＮＡは、３’または５’タグを有するｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、化学的に安定化されたＲＮＡは、３’−アミンタグを有するｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、還元可能なＮＨＳリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）を含む。一部の実施形態において、還元不可能なＮＨＳリンカーは、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）を含む。一部の実施形態において、３’−アミンタグを有するｓｉＲＮＡおよび操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、チオエステル結合を介して共有結合で連結される。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６〜８、１２〜１５、１８〜２０、２４〜２６、３０〜３２、３６〜３８、４２〜４４、４８〜５０、５４〜５６、６０〜６２、６６〜６８、７２〜７４、７８〜８０、８４〜８６、および９４〜９９から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、および９２から選択される配列を含む重鎖、ならびに配列番号２、１０、２１、３３、４５、５７、６９、８１、および９３から選択される配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントである。

【0007】

[0007]一実施形態は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合で連結されたｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６〜８、１２〜１５、１８〜２０、２４〜２６、３０〜３２、３６〜３８、４２〜４４、４８〜５０、５４〜５６、６０〜６２、６６〜６８、７２〜７４、７８〜８０、８４〜８６、および９４〜９９から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、および９２から選択される配列を含む重鎖、ならびに配列番号２、１０、２１、３３、４５、５７、６９、８１、および９３から選択される配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、アポトーシス阻害剤、ｐ５３の阻害剤、免疫チェックポイントタンパク質、ＤＮＡ修復の不活性化に関与するタンパク質、シアル酸生成の抑制に関与するタンパク質、ナンセンス変異依存分解に関与するタンパク質を標的化することが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、共刺激シグナルを促進すること、白血球の血管外遊出を抑制すること、細胞分裂にとって重要な分子を抑制すること、血管新生を阻害または促進することが可能である。

【0008】

[0008]一実施形態は、ＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントを含む抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートであって、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（抗ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含む、抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートは、（ｉ）マレイミドで改変された、または（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ｐｅｎｔａｎａｔｅ）で改変されたｓｉＲＮＡを生成するステップ、（ｉｉ）抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントをシステアミンで還元して、２つのチオール基を含む操作された抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントを生成するステップ；および（ｉｉｉ）マレイミドで改変された、または（２−ピリジルジチオ）ペンタノエートで改変されたｓｉＲＮＡを、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１のＦａｂ’フラグメントと共にインキュベートして、抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを産生するステップを含むプロセスによって産生される。

【0009】

[0009]一実施形態は、本明細書に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート、本開示によるコンジュゲート、または本開示による抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、抗体−薬物コンジュゲートと組み合わせて含む組成物を提供する。一部の実施形態において、抗体−薬物コンジュゲートは、がんの処置のための細胞傷害性ペイロードを含む。一部の実施形態において、抗体−薬物コンジュゲートは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、細胞傷害性ペイロードは、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、核輸送タンパク質ＣＲＭ１の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ傷害剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＨＦＲ阻害剤、核酸、またはＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。一部の実施形態において、ペイロードは、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、またはネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）誘導体を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１〜５４から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４９〜５９に記載の配列を含む重鎖、および配列番号５７〜６７に記載の配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントである。

【0010】

[0010]一実施形態は、ｓｉＲＮＡを、抗ＴＭ４ＳＦ１またはその抗原結合フラグメントとコンジュゲートするステップを含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを合成するためのプロセスを提供する。一部の実施形態において、プロセスは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖にシステイン残基を導入して、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するステップを含む。一部の実施形態において、プロセスは、３’−アミンを付加することによりｓｉＲＮＡを改変して、化学的に安定化された３’アミンタグを有するｓｉＲＮＡを生成するステップを含む。一部の実施形態において、プロセスは、化学的に安定化された３’アミンタグを有するｓｉＲＮＡをＮＨＳリンカーと反応させて、チオール反応性ｓｉＲＮＡ−リンカー付加物を生成するステップを含む。一部の実施形態において、プロセスは、チオール反応性ｓｉＲＮＡ−リンカー付加物を、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント上のチオール基と反応させ、それにより抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを生成するステップを含む。一部の実施形態において、プロセスは、クロマトグラフィー手順を使用して、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを精製するステップをさらに含む。一部の実施形態において、ＮＨＳリンカーは、還元可能な、または還元不可能なＮＨＳリンカーを含む。一部の実施形態において、還元可能なリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）を含む。一部の実施形態において、還元不可能なリンカーは、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）を含む。一部の実施形態において、クロマトグラフィー手順は、サイズ排除クロマトグラフィーを含む。

【0011】

[0011]一実施形態は、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｌｃｏｅｔｉｄｅ）にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、改変されたＤＮＡ、三重らせんＤＮＡ、スーパーコイルＤＮＡ、Ｚ−ＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含む。一実施形態は、治療有効量の本開示によるコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、治療有効量の本開示によるコンジュゲートまたは本開示によるコンジュゲートを含む組成物を対象に投与するステップを含む。

【0012】

[0012]一実施形態は、本開示による治療有効量の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、本開示による治療有効量の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、本開示による治療有効量の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて、対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、さらなる療法は、化学療法、放射線、追加のウイルスでの腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節剤での処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗がん剤、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、本方法は、本開示による治療有効量の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて、対象に投与するステップを含み、抗体−ＲＮＡコンジュゲート、組成物、もしくはさらなる療法、またはそれらの任意の組合せは、液体剤形、固体剤形、吸入可能剤形、鼻腔内剤形、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せで投与される。

【0013】

[0013]一実施形態は、治療有効量の本開示によるコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、治療有効量の本開示によるコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、治療有効量の本開示によるコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、さらなる療法は、化学療法、放射線、追加のウイルスでの腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節剤での処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗がん剤、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、本方法は、治療有効量の本開示によるコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて、対象に投与するステップを含み、コンジュゲート、組成物、もしくはさらなる療法、またはそれらの任意の組合せは、液体剤形、固体剤形、吸入可能剤形、鼻腔内剤形、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せで投与される。

【0014】

[0014]一実施形態は、治療有効量の本開示による抗体フラグメントＲＮＡコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、治療有効量の本開示による抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、方法は、治療有効量の本開示による抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて、対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、さらなる療法は、化学療法、放射線、追加のウイルスでの腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節剤での処置、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、抗がん剤、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、方法は、治療有効量の本開示による抗体フラグメント−ＲＮＡコンジュゲートを、本開示による組成物と組み合わせて、またはさらなる療法とさらに組み合わせて、対象に投与するステップを含み、コンジュゲート、組成物、もしくはさらなる療法、またはそれらの任意の組合せは、液体剤形、固体剤形、吸入可能剤形、鼻腔内剤形、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せで投与される。一部の実施形態において、がんは、黒色腫、肝細胞癌、乳がん、肺がん、腹膜がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、腎臓癌、膵臓がん、上皮癌、胃がん、結腸癌、十二指腸がん、膵臓腺癌、中皮腫、多形膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｒｎｅ）、星細胞腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、肝細胞癌、胆管肉腫、膵臓腺癌、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸がん、腸型胃腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄増殖性新生物、または肉腫を含む。

【0015】

[0015]本明細書に記載される全ての公報、特許、および特許出願は、それぞれ個々の公報、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0016】

[0016]本開示の新規の特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明を参照することによって得られ、ここでは本開示の原理が利用され、その添付の図面は以下の通りである：

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】[0017]図１は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびｓｉＲＮＡをコンジュゲートするステップの例示的な方法を示す図である。

【図2】[0018]図２は、操作された抗体の例示的な図解を示す図である。

【図3】[0019]図３は、本明細書に記載の抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関する調製のための例示的なフローチャートを示す図である。

【図4】[0020]図４は、裸のオリゴ（Ｈｕ Ｓ）の代表的なＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）の結果を示す図である。

【図5】[0021]図５は、リンカーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの代表的なＬＣ−ＭＳの結果を示す図である。

【図6】[0022]図６は、リンカーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの代表的なＬＣ−ＭＳの結果を示す図である。

【図7】[0023]図７は、本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いて行われた分析ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）の代表的な結果を示す図である。

【図8】[0024]図８は、ＢＣＬ２Ｌ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２２０ｎｍにおける）を示す図である。

【図9】[0025]図９は、ＢＣＬ２Ｌ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２６０ｎｍにおける）を示す図である。

【図10】[0026]図１０は、ＢＣＬ２Ｌ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（６４７ｎｍにおける）を示す図である。

【図11】[0027]図１１は、ＭＣＬ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２２０ｎｍにおける）を示す図である。

【図12】[0028]図１２は、ＭＣＬ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２６０ｎｍにおける）を示す図である。

【図13】[0029]図１３は、ＭＣＬ１１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（６４７ｎｍにおける）を示す図である。

【図14】[0030]図１４は、ＣＴｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）を含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２２０ｎｍにおける）を示す図である。

【図15】[0031]図１５は、ＣＴｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）を含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２６０ｎｍにおける）を示す図である。

【図16】[0032]図１６は、ＣＴｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）を含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（６４７ｎｍにおける）を示す図である。

【図17】[0033]図１７は、ＴＭ４ＳＦ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２２０ｎｍにおける）を示す図である。

【図18】[0034]図１８は、ＴＭ４ＳＦ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（２６０ｎｍにおける）を示す図である。

【図19】[0035]図１９は、ＴＭ４ＳＦ１ｓｉＲＮＡを含有する本明細書に記載の例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートの吸光度スペクトル（６４７ｎｍにおける）を示す図である。

【図20】[0036]図２０Ａ〜２０Ｄは、様々な抗体およびコンジュゲートのＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。図２０Ａは、Ｎ２９７Ｃ突然変異を含む裸のヒトＡＧＸ−Ａ０７抗体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図２０Ｂは、裸のＳＰＤＰ−ＴＭ４ＳＦ１−ＨｕｓｉのＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図２０Ｃは、Ｎ２９７Ｃ−Ｓ−Ｓ−ＴＭ４ＳＦ−１−Ｈｕｓｉを含むヒトＡＧＸ−Ａ０７の粗製コンジュゲートを示す；図２０Ｄは、例示的な精製されたＡＲＣを示す。

【図21】[0037]図２１は、試薬ＳＰＤＰを利用して、抗体をリンカーオリゴヌクレオチドコンジュゲートにコンジュゲートするステップの例示的なプロトコールを示す図である。

【図22】[0038]図２２は、本明細書に記載の抗体−ＲＮＡコンジュゲート（ＡＲＣ）の考えられる作用機序を示す図である。

【図23】[0039]図２３Ａ〜２３Ｅは、対照ｓｉＲＮＡ（図２３Ａ）；ＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡ（図２３Ｂ）；ＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡ（図２３Ｃ）；安定化されたＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡ（図２３Ｄ）；および安定化されたＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡ（図２３Ｅ）を使用したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるノックダウンアッセイからの結果を示す。

【図24】[0040]図２４は、がん細胞株およびＨＵＶＥＣにおけるｓｉＲＮＡの代表的なノックダウンデータを示す図である。

【図25】[0041]図２５は、本明細書に記載の例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す図である。

【図26】[0042]図２６は、本明細書に記載の例示的なＡＲＣでのノックダウン後のＴＭ４ＳＦ１のｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。

【図27】[0043]図２７は、がん細胞株およびＨＵＶＥＣにおける本明細書に記載の例示的なＡＲＣの代表的なノックダウンデータを示す図である。

【図28-1】[0044]図２８Ａ〜２８Ｄは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＨＵＶＥＣにおけるノックダウン研究からの結果を示す。図２８Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図２８Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す；図２８Ｃは、ＢＣＬ２Ｌ１タンパク質の発現レベル（ウェスタンブロット）を示す；図２８Ｄは、代表的な免疫染色の結果を示す。

【図28-2】[0044]図２８Ａ〜２８Ｄは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＨＵＶＥＣにおけるノックダウン研究からの結果を示す。図２８Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図２８Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す；図２８Ｃは、ＢＣＬ２Ｌ１タンパク質の発現レベル（ウェスタンブロット）を示す；図２８Ｄは、代表的な免疫染色の結果を示す。

【図29-1】[0045]図２９Ａ〜２９Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＡ５４９細胞におけるノックダウン研究からの結果を示す。図２９Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図２９Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図29-2】[0045]図２９Ａ〜２９Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＡ５４９細胞におけるノックダウン研究からの結果を示す。図２９Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図２９Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図30-1】[0046]図３０Ａ〜３０Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＭｉａＰａｃａ２細胞におけるノックダウン研究からの結果を示す。図３０Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図３０Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図30-2】[0046]図３０Ａ〜３０Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＭｉａＰａｃａ２細胞におけるノックダウン研究からの結果を示す。図３０Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図３０Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図31-1】[0047]図３１Ａ〜３１Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＳＫＯＶ３細胞におけるノックダウン研究からの結果を示す。図３１Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図３１Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図31-2】[0047]図３１Ａ〜３１Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＳＫＯＶ３細胞におけるノックダウン研究からの結果を示す。図３１Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図３１Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＢＣＬ２Ｌ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図32-1】[0048]図３２Ａ〜３２Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＨＵＶＥＣにおけるノックダウン研究からの結果を示す。図３２Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図３２Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＭＣＬ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図32-2】[0048]図３２Ａ〜３２Ｂは、本明細書に記載の例示的なＡＲＣを使用したＨＵＶＥＣにおけるノックダウン研究からの結果を示す。図３２Ａは、例示的なＡＲＣに曝露された細胞の代表的な画像を示す；図３２Ｂは、例示的なＡＲＣへの曝露後のＭＣＬ１ ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

Ｉ．定義
[0049]本明細書において別段の定義がない限り、本発明の開示と関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。用語の意味および範囲は明確であるべきであるが、何らかの潜在的なあいまいさがある場合、本明細書で提供される定義が、いずれの辞書または非本質的な定義よりも優先される。さらに、文脈上別段の要求がなされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願において、「または」の使用は、別段の指定がない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、加えて他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、非限定的である。

【0019】

[0050]一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される学術名、およびその技術は、周知であり、当技術分野において一般的に使用されるものである。本発明の開示の方法および技術は、一般的に、別段の指定がない限り、当技術分野において周知の従来の方法に従って、さらに、本明細書中で引用および考察される様々な一般的な参考文献やより詳細な参考文献に記載されるように実行される。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成される通り、または本明細書に記載される通り、製造元の詳細な説明に従って実行される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬および製薬化学と関連して使用される学術名、ならびにそれらの実験手順および技術は、周知であり、当技術分野において一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、配合、および送達、ならびに患者の処置に関して、標準的な技術が使用される。

【0020】

[0051]本発明の開示がより容易に理解できるように、選択される用語は、以下で定義される。用語「膜貫通−４Ｌ６ファミリーメンバー−１」または「ＴＭ４ＳＦ１」は、本明細書で使用される場合、腫瘍血管系内皮細胞（ＥＣ）、腫瘍細胞（ＴＣ）、網膜血管系および血管新生の血管を発達させるＥＣ上で高度に発現される膜貫通４スーパーファミリー／テトラスパニンファミリーのポリペプチドを指す。ＴＭ４ＳＦ１は、４つの膜貫通ドメイン（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４）によって分離される２つの細胞外ループ（ＥＣＬ１およびＥＣＬ２）、ＮおよびＣ末端、ならびに細胞内ループ（ＩＣＬ）を有する。ＥＣＬ２は、２つのＮ−グリコシル化部位を含有する。ヒトＴＭ４ＳＦ１（ｈＴＭ４ＳＦ１）のアミノ酸配列は、配列番号９０に記載される（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５０３５．１も参照）。

【0021】

[0052]用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、特定の抗原（例えば、ＴＭ４ＳＦ１）に特異的に結合するかまたはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むあらゆる抗原結合分子を意味する。用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、加えて、それらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変性を有する領域にさらに細かく分類でき、この領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより高度に保存された領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される。本開示の異なる実施形態において、抗ＴＭＳ４Ｆ１抗体（またはその抗原結合部位）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列に同一であってもよいし、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれより多くのＣＤＲの並行分析に基づき定義することができる。

【0022】

[0053]用語「無傷の抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互連結した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む抗体を指す。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、無傷の抗体である。一実施形態において、無傷の抗体は、無傷のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである。ある特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプである。

【0023】

[0054]本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」などの用語は、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、あらゆる天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解消化、または抗体の可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術などのあらゆる好適な標準的技術を使用して、無傷の抗体分子から得ることができる。このようなＤＮＡは公知であり、および／または例えば、商業的な供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーなど）から容易に入手可能であり、または合成することができる。ＤＮＡは、シーケンシングし、化学的に、または分子生物学的技術を使用することによって操作して、例えば、１つまたは複数の可変および／または定常ドメインを好適な配置に配列する、またはコドンを導入する、システイン残基を作り出す、アミノ酸の改変、付加もしくは欠失などをもたらすことができる。

【0024】

[0055]抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の高度可変領域（例えば、単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）、または拘束性ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを模擬するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられ得る。

【0025】

[0056]抗体またはそのフラグメントの「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。本開示で使用される方法によれば、ＣＤＲおよびＦＲに割り振られたアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７および１９９１））に従って定義することができる。抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸の番号付けも、Ｋａｂａｔの番号付けに従う。

【0026】

[0057]用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれの３つのＣＤＲがあり、これらは、可変領域のそれぞれにつきＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と指定される。用語「ＣＤＲセット」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合が可能な単一の可変領域中に生じる３つのＣＤＲのグループを指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔによって説明されるシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ． （１９８７）および（１９９１）））は、抗体のあらゆる可変領域に適用可能な疑いのない残基の番号付けシステムを提供することに加えて、３つのＣＤＲを定義する正確な残基の境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称する場合もある。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定の下位部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチドバックボーンコンフォメーションをとることを見出した。これらの下位部分を、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と指定した。ここで「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖領域を指示する。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称する場合もあり、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップする境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３〜１３９（１９９５））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２（５）：７３２〜４５（１９９６））によって説明されている。さらに他のＣＤＲの境界の定義は、上記のシステムのどちらかに厳密に従っていない場合があるが、それでもＫａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップすると予想され、それにもかかわらず、それらは、特定の残基もしくは残基の群が、またはＣＤＲ全体も、抗原結合に顕著な影響を与えないという予測または実験的発見の観点で、短くしたりまたは長くしたりすることができる。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用することができるが、好ましい実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。

【0027】

[0058]用語「フレームワーク領域」（以下ＦＲ）は、本明細書で使用される場合、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として同定された４つのＦＲを有する。抗体またはその機能的なフラグメントの可変領域のうち共通の構造的特徴は当技術分野において周知である。特定の抗体をコードするＤＮＡ配列は、一般的に、周知の方法、例えば、参考文献として本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら、１９８７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤに記載される方法に従って見出すことができる。加えて、抗体から機能的な可変領域をクローニングするための一般的な方法は、参考文献として本明細書に組み込まれるＣｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ら、１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６に見出すことができる。

【0028】

[0059]本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用され、例えば、天然配列のＦｃ領域、組換えＦｃ領域、およびバリアントＦｃ領域が含まれる。抗体重鎖のＦｃ領域の境界は変わる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端への伸長部分と定義されることが多い。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムに従って残基４４７）は、例えば、抗体の産生または精製中に除去してもよいし、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去してもよい。したがって、無傷の抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を有するおよび有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでいてもよい。

【0029】

[0060]用語「ヒト化抗体」は、本明細書で使用される場合、目的の抗原（例えば、ヒトＴＭ４ＳＦ１）に免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体またはそのバリアント、誘導体、類似体もしくはフラグメントを指す。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むと予想される。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦｃの少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体ヒト化方法は、当技術分野において公知である。例えば、全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜７；Ｑｕｅｅｎらの、米国特許第５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６１号；５，６９３，７６２号；および６，１８０，３７０号；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５〜８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９〜９７３；ならびに米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。

【0030】

[0061]用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能性のある突然変異、例えば少量で存在する可能性がある天然に存在する突然変異を除いて、同一である。したがって、修飾句「モノクローナル」は、分離した抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。特定の実施形態において、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的と結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローンからの、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールからの固有なクローンの選択であってもよい。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して向けられる。

【0031】

[0062]用語「キメラ抗体」は、本明細書で使用される場合、所望の生物学的活性を示す限り、特定の種由来の、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同な重鎖および／または軽鎖の部分を有し、それと同時に、鎖の残部が、別の種由来の、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、加えてこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一または相同である抗体（免疫グロブリン）を指す（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。

【0032】

[0063]用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域中の特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が、１つより多くのエピトープを有する場合もある。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する場合もあるし、異なる生物学的作用を有する場合もある。エピトープは、構造的または機能的と定義される場合もある。機能的エピトープは、一般的に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に寄与する残基を有する。またエピトープは、配座エピトープであってもよく、すなわち非線形アミノ酸で構成されていてもよい。特定の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面の分子群である決定基を含む場合もあり、特定の実施形態において、特定の３次元構造特徴、および／または特定の電荷の特徴を有していてもよい。

【0033】

[0064]「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体などの結合タンパク質）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合による全体の相互作用の強度を指す。結合分子Ｘ（例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体）のその結合パートナーＹ（例えば、ヒトＴＭ４ＳＦ１）に対する親和性は、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって表することができる。親和性は、本明細書に記載されるものなどの当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般的に、ゆっくり抗原と結合し、容易に解離する傾向があり、それに対して高親和性抗体は、一般的に、より速く抗原と結合し、より長く結合したままの状態である傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野において公知であり、それらのいずれかは、本発明の開示の目的のために使用することができる。特定の例示的な実施形態は、以下を含む。一実施形態において、「ＫＤ」または「ＫＤ値」は、当技術分野において公知のアッセイによって、例えば結合アッセイによって測定することができる。ＫＤは、ＲＩＡで測定することができ、これは例えば、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実行される（Ｃｈｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５〜８１）。ＫＤはまた、ＦＡＣＳ、またはＢＩＡＣＯＲＥによる、例えばＢＩＡＣＯＲＥ２０００もしくはＢＩＡＣＯＲＥ３０００を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって、または例えばＯＣＴＥＴ ＱＫ３８４システムを使用するバイオレイヤー干渉法によっても測定できる。特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体のＫＤは、ＨＵＶＥＣ細胞を用いる標準的なフローサイトメトリーアッセイを使用して決定される。また、「オンレート」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」および「オフレート」または「解離の速度」または「解離速度」または「ｋｏｆｆ」も、例えばＢＩＡＣＯＲＥ２０００もしくはＢＩＡＣＯＲＥ３０００、またはＯＣＴＥＴ ＱＫ３８４システムを使用する、上述した同じ表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法技術で決定することができる。

【0034】

[0065]用語「ｋｏｎ」は、本明細書で用いられる場合、当技術分野において公知のように、抗体／抗原複合体を形成するための抗体の抗原への会合に関するオンレート定数を指すことが意図される。

【0035】

[0066]用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書で用いられる場合、当技術分野において公知のように、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関するオフレート定数を指すことが意図される。

【0036】

[0067]用語「阻害」または「阻害する」は、本明細書で使用される場合、部分的な（例えば、１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％の）または完全な（すなわち、１００％の）阻害を指す。

【0037】

[0068]用語「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子と同じ細胞中にある場合、標的遺伝子の発現を低減または阻害することが可能な（すなわち、干渉ＲＮＡの配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することによって）二本鎖ＲＮＡ（すなわち、二重鎖ＲＮＡ）を指す。したがって干渉ＲＮＡは、２つの相補鎖によって、または単一の自己相補鎖によって形成された二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子との実質的な、または完全な同一性を有していてもよいし、またはミスマッチ（すなわち、ミスマッチモチーフ）の領域を含んでいてもよい。干渉ＲＮＡの配列は、全長標的遺伝子に対応するものでもよいし、またはその部分配列に対応するものでもよい。

【0038】

[0069]用語「がん」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物における典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする生理学的状態を指すかまたは記載する。
[0070]用語「高い転移リスクを伴うがん」は、本明細書で使用される場合、がんを有する対象が転移がんを発症させるリスクを増加させることがわかっている少なくとも１つの因子に関連するがんを指す。転移リスクの増加に関連する因子の例としては、これらに限定されないが、対象が最初のがん診断時に有するがん性のリンパ節の数、腫瘍のサイズ、組織学的な格付け、および最初の診断時のがんの段階が挙げられる。

【0039】

[0071]用語「血行性転移」は、本明細書で使用される場合、がん細胞が血管壁に侵入し、その後、血流（循環腫瘍細胞）を介して体内の他の部位および組織に循環できる能力を指す。

【0040】

[0072]用語「リンパ転移」は、本明細書で使用される場合、がん細胞がリンパ管に侵入し、血管に排出する能力を指す。
[0073]本開示に関して、用語「処置する」または「処置」は、本明細書で使用される場合、このような用語が適用される障害もしくは状態、またはこのような障害もしくは状態の１つまたは複数の症状を、回復させること、軽減すること、その進行を阻害すること、または防止することを意味する。用語「がんを処置する」は、本明細書で使用される場合、がん細胞の増殖および／または増殖の阻害を意味する。一実施形態において、本明細書に記載される組成物および方法は、転移がんを有する対象における転移を処置するのに使用される。

【0041】

[0074]用語「がんを防止する」または「がんの防止」は、発癌または腫瘍形成の発生が証明されていないが、例えば遺伝学的スクリーニングによって決定したかまたはそれ以外の方法によるかにかかわらず、がんの素因が同定されている哺乳動物におけるがんの発病を、遅らせること、阻害すること、または防止することを指す。この用語はまた、悪性になる前の状態を有する哺乳動物を処置して、悪性になる前の状態から悪性状態への進行を止める、またはそのような進行を逆行させることも包含する。悪性になる前の状態の例としては、過形成、形成異常、および異形成が挙げられる。一部の実施形態において、がんの防止は、がんからの寛解にある対象に関して使用される。

【0042】

[0075]悪性もしくは良性のおよび／または原発性もしくは続発性などの様々ながんが、本開示による方法で処置または防止することができる。このようながんの例は、当業者に公知であり、Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｍｅｒｃｋにより出版）などの標準的な教本に列挙される。

【0043】

[0076]用語「対象」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。
[0077]用語「投与する」は、本明細書で使用される場合、抗体またはそのフラグメント、または組成物（例えば、医薬組成物）の投薬量を対象に与える方法を指す。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される結合タンパク質または医薬組成物、および処置される状態、疾患、または障害の重症度）に応じて変更することができる。

【0044】

[0078]用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、所望の転帰をもたらすのに十分な、本明細書で提供される抗体または医薬組成物の量を指す。
[0079]用語「約」および「およそ」は、所与の値または範囲の、２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ未満を意味する。

【0045】

[0080]用語「同一性」、または「相同性」は、本明細書では置き換え可能に使用され、最適な比較目的で配列をアライメントすること（例えば、第１の配列の配列中にギャップを導入してもよい）によって決定できる２つまたはそれより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の「同一性」、「相同性」、または「パーセント相同性」の計算値であり得る。次いで対応する位置のヌクレオチドを比較することができ、２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共通する同一の位置の数の関数であり得る（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／位置の合計数×１００）。例えば、第１の配列における位置は、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドで占められていてもよく、その場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント相同性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列が共通する同一の位置の数の関数であり得る。一部の実施形態において、比較目的でアライメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９５％であり得る。ＢＬＡＳＴ（登録商標）検索は、２つの配列間の相同性を決定することができる。２つの配列は、遺伝子、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、ペプチド配列、アミノ酸配列、またはそのフラグメントであり得る。２つの配列の実際の比較は、周知の方法によって、例えば数学的なアルゴリズムを使用して達成することができる。このような数学的なアルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０−５８７３−５８７７（１９９３）に記載され得る。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７）に記載されるように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている場合もある。ＢＬＡＳＴおよびギャップ有りＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のあらゆる関連パラメーターを使用することができる。例えば、配列比較に関するパラメーターは、スコア＝１００、ワード長さ＝１２に設定してもよいし、または変更してもよい（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、Ｍｙｅｒｓおよびミラー、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズム、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ、およびＦＡＳＴＡが挙げられる。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）中のＧＡＰプログラムを使用して達成することができる。

【0046】

[0081]一部の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体にコンジュゲートした核酸を含む抗体−核酸コンジュゲート（本明細書では抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートとも称される）が提供される。核酸は、細胞内部に、または特定の実施形態において細胞の核に輸送されることが望まれる実質的にあらゆる核酸であり得る。用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、天然に存在する、または化学的に合成された、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、改変されたＤＮＡ、改変されたＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含む。核酸は、どのような数の塩基対を有していてもよく、例えば目的の遺伝子の全長までの塩基対を有していてもよい。例えば、核酸は、約１００から１０，０００塩基対の長さを有する直鎖状または環状二本鎖ＤＮＡ分子であってもよいが、それより長い、およびそれより短い核酸のどちらも使用できる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、直鎖状または環状であってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、三重らせん、スーパーコイル、Ｚ−ＤＮＡ、および他の通常と異なるＤＮＡの形態、ポリヌクレオチド類似体、アンチセンスＤＮＡ、治療用タンパク質などのタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現コンストラクト、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを含む転写可能なコンストラクト、ウイルスゲノムフラグメント、例えばウイルスＤＮＡ、プラスミド、コスミド、生物のゲノムの一部をコードするＤＮＡ、遺伝子フラグメントなどを含む。一部の場合において改変された核酸は、例えば、蛍光色素で改変された核酸、ビオチン化された核酸、またはそれらの組合せである。他の改変された核酸としては、例えば、２’−Ｏ−メチル改変、２’−フルオロ改変、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）改変が挙げられる。

【0047】

[0082]核酸はまた、ＲＮＡであってもよい。例えば、アンチセンスＲＮＡ、触媒性ＲＮＡ、触媒性ＲＮＡ／タンパク質複合体（「リボザイム」）、直接翻訳されてタンパク質生成物を生成できる、または逆転写され、転写または転写と翻訳のいずれかにより、それぞれＲＮＡまたはタンパク質生成物を生成できる、ＲＮＡを含む発現コンストラクト、逆転写によるＤＮＡの生成を可能にするのに必要なあらゆるプロモーター／調節配列を有するＲＮＡを含む転写可能なコンストラクト、ウイルスゲノムフラグメント、例えばウイルスＲＮＡ、治療用タンパク質などのタンパク質をコードするＲＮＡなど。核酸は、その核酸が標的細胞の内部またはその核に送達されたときに示すと予想される、公知の、予想された、または予想される生物学的活性に基づき選択することができる。核酸は、核酸を調製または単離するために典型的に使用されるあらゆる従来の手段によって調製または単離することができる。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、例えば、Ｇａｉｔにより、１９８５、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）に記載される方法によって、商業的に入手可能な試薬および合成装置を使用して化学的に合成することができる。ＲＮＡ分子はまた、インビトロの転写方法を介して、Ｐｒｏｍｅｇａ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）より入手可能なＳＰ６５などのプラスミドを使用して、高い収量で産生することもできる。核酸は、任意の好適な手段によって精製することができる。例えば、核酸は、逆相またはイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、またはゲル電気泳動によって精製することができる。当然ながら、当業者は、精製方法は、精製しようとするＤＮＡのサイズに一部依存することになることを認識しているであろう。核酸はまた、公知の、または今後開発される多数の組換え方法のいずれを使用しても調製できる。

【0048】

[0083]改変されたヌクレオシド間の連結を有する核酸も、本明細書に記載のコンジュゲートに使用することができる。例えば、増加したヌクレアーゼ安定性を示す改変されたヌクレオシド間の連結を含有する核酸を使用することができる。このような核酸としては、例えば、１つまたは複数のホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、メトキシエチルホスホロアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−硫化物（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−）、ジメチレン−スルホキシド（−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−）、ジメチレン−スルホン（−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−）、２’−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ−２’−フルオロ−ホスホロチオエートであるヌクレオシド間の連結を含有するものが挙げられる。

【0049】

[0084]核酸は、治療剤、例えば、ｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスＤＮＡ分子であってもよい。代わりに、核酸は、治療剤、例えば、核酸を含有する組成物が送達される標的細胞によって発現されると、細胞に対して好都合な治療作用を有する転写または翻訳生成物をコードしていてもよい。治療用転写生成物の例としては、タンパク質（例えば、抗体、酵素、受容体結合リガンド、創傷治癒タンパク質、抗再狭窄性タンパク質、抗発がん性（ａｎｔｉ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）タンパク質、および転写または翻訳調節タンパク質）、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ウイルスゲノムフラグメントなどが挙げられる。核酸は、同様に、組成物を使用して形質転換された細胞のためのマーカーとして有用な生成物をコードしていてもよい。マーカーの例としては、容易に同定可能な分光特性（例えば、緑色蛍光タンパク質；ＧＦＰ）を有するタンパク質、および細胞表面で発現される（すなわち、標的細胞を、タンパク質と特異的に結合する薬剤と接触させることによって検出できる）タンパク質が挙げられる。

【0050】

[0085]一例として、核酸は、発がん性タンパク質および抗発がん性アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸から選択することができる。発がん性タンパク質の例としては、以下の遺伝子：ａｂｌ、ａｋｔ２、ａｐｃ、ｂｃｌ２−アルファ、ｂｃｌ２−ベータ、ｂｃｌ３、ｂｃｒ、ｂｒｃａｌ、ｂｒｃａ２、ｃｂｌ、ｃｃｎｄｌ、ｃｄｋ４、ｃｒｋ−ＩＩ、ｃｓｆｌｒ／ｆｉｎｓ、ｄｂｌ、ｄｃｃ、ｄｐｃ４／ｓｍａｄ４、ｅ−ｃａｄ、ｅ２ｆｌ／ｒｂａｐ、ｅｇｆｒ／ｅｒｂｂ−ｌ、ｅｌｋ］、ｅｌｋ３、ｅｐｈ、ｅｒｇ、ｅｔｓ１、ｅｔｓ２、ｆｅｒ、ｆｇｒ／ｓｒｃ２、ｆｌｉｌ／ｅｒｇｂ２、ｆｏｓ、ｆｐｓ／ｆｅｓ、ｆｒａｌ、ｆｒａ２、ｆｙｎ、ｈｃｋ、ｈｅｋ、ｈｅｒ２／ｅｒｂｂ−２／ｎｅｕ、ｈｅｒ３／ｅｒｂｂ−３、ｈｅｒ４／ｅｒｂｂ−４、ｈｒａｓｌ、ｈｓｔ２、ｈｓｔｆｌ、ｉｎｋ４ａ、ｉｎｋ４ｂ、ｉｎｔ２／ｆｇｆ３、ｊｕｎ、ｊｕｎｂ、ｊｕｎｄ、ｋｉｐ２、ｋｉｔ、ｋｒａｓ２ａ、ｋｒａｓ２ｂ、ｃｋ、ｌｙｎ、ｍａｓ、ｍａｘ、ｍｃｃ、ｍｅｔ、ｍｌｈｌ、ｍｏｓ、ｍｓｈ２、ｍｓｈ３、ｍｓｈ６、ｍｙｂ、ｍｙｂａ、ｍｙｂｂ、ｍｙｃ、ｍｙｃｌ１、ｍｙｃｎ、ｎｆｌ、ｎｆ２、ｎｒａｓ、ｐ５３、ｐｄｇｆｂ、ｐｉｍ１、ｐｍｓ１、ｐｍｓ２、ｐｔｃ、ｐｔｅｎ、ｒａｆｔ、ｒｂｌ、ｒｅｌ、ｒｅｔ、ｒｏｓ１、ｓｋｉ、ｓｒｃ１、ｔａｌｌ、ｔｇｌｂｒ２、ｔｈｒａｌ、ｔｈｒｂ、ｔｉａｍ１、ｔｒｋ、ｖａｖ、ｖｈｌ、ｗａｆ１、ｗｎｔ１、ｗｎｔ２、ｗｔ１、およびｙｅｓ１によってコードされたものが挙げられる。これらの遺伝子のうち１つの発現を阻害するオリゴヌクレオチドを、抗発がん性アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用することができる。

【0051】

[0086]本明細書に記載の核酸は、本明細書に記載の組成物を調製するためのラージスケールでの核酸の複製をもたらす様々な公知の宿主ベクター系に、組換え操作することができる。これらのベクターは、公知の方法を使用して、核酸が送達される細胞において核酸の転写、翻訳またはその両方を指示するに必要なエレメントが含有されるように設計することができる。適切な転写／翻訳制御シグナルと作動可能に連結したタンパク質コード配列を有する発現コンストラクトを構築するために、当業者公知の方法を使用することができる。これらの方法としては、インビトロの組換えＤＮＡ技術および合成技術が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９７、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

【0052】

[0087]目的の１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸は、様々なプロモーター／調節因子の配列に作動可能に会合していてもよい。プロモーター／調節因子の配列としては、構成的または誘導性プロモーターを挙げることができ、目的の遺伝子の高いレベルの、または調節された発現を指示するのに適切な条件下で使用することができる。使用することができるプロモーター／調節領域の特定の例としては、サイトメガロウイルスのプロモーター／調節領域、およびＳＶ４０早期遺伝子またはＳＶ４０後期遺伝子に関連するプロモーター／調節領域が挙げられる。好ましくは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のプロモーターが本発明で使用される。しかしながら、目的の遺伝子の高いレベルの、または調節された発現を指示する実質的に全てのプロモーター／調節領域を使用することができる。

【0053】

[0088]本明細書に記載の核酸は、１つまたは複数のプロモーターの制御下で単一の遺伝学的コンストラクト上で組み合わされた、複数のタンパク質をコードする領域を含有していてもよい。２つまたはそれより多くのタンパク質をコードする領域が、単一のプロモーターの転写制御下にあってもよいし、核酸の転写物は、タンパク質をコードする領域の間に挿入された、１つまたは複数の内部リボソーム進入部位を含んでいてもよい。したがって、異なる遺伝子と遺伝学的コンストラクトのほぼ無限の組合せが、採用され得る。

【0054】

ＩＩ．標的化タンパク質およびＲＮＡ分子を含むコンジュゲート
[0089]本開示の一実施形態は、標的化タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合フラグメント、およびオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、作用部位へのＲＮＡ分子の標的化された送達、例えば、腫瘍へのｓｉＲＮＡの標的化された送達を可能にし、さらにＲＮＡベースの治療作用も改善し、例えば、ｓｉＲＮＡ媒介サイレンシングを改善する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、天然に発現される遺伝子のノックダウンの有意なレベルを達成する。

【0055】

[0090]一部の実施形態において、本発明の開示は、ノックダウンに１００ｎＭから１０００ｎＭまでの濃度を使用した先行の抗体−ＲＮＡコンジュゲートと比較して、高い速度のノックダウンを達成することにおいて、１０ｎＭもの低い濃度で有効である改善された抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ｓｉＲＮＡを含む改善された抗体−ＲＮＡコンジュゲート）を提供する。Ｃｕｅｌｌａｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５、４３巻、２号、１１８９〜１２０３を参照されたい。さらに、本発明の開示で提供されるアプローチは、高い速度のノックダウンを達成するために、高いレベルの標的が発現されるように細胞を操作することを必要とせず、それによって、高い抗原発現の場合のみに高いサイレンシング効率が観察されたこれまでの抗体−ＲＮＡコンジュゲートの開発努力を超える改善がもたらされる。同文書の１２０２頁を参照されたい。一部の例において、本開示の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えばＡＲＣは、抗体の標的抗原（例えばＴＭ４ＳＦ１）をちょうど飽和させる程度の投薬量または濃度で、１回または２回投与され、それにより、より多くの量のＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のより効率的な送達が可能になる。より高いＯＡＲ（オリゴヌクレオチドの抗体に対する比率）またはリピートの内在化は、一部の例において、ノックダウンの速度を増加させるのに利用することができる。例えば、抗原が、ｓｉＲＮＡがプロセシングされるより速く内在化される場合、所定用量のｓｉＲＮＡが細胞の内部に蓄積する可能性があり、利用可能な抗原より多くの量のコンジュゲート（例えばＡＲＣ）を添加することは、ノックダウンのレベルを増加させる可能性がある。

【0056】

[0091]一部の場合、高い特異性で抗原と結合する標的化タンパク質の能力は、有利には、共有結合によるカップリングおよび抗原発現に依存するサイレンシングを誘導するために、細胞へのｓｉＲＮＡ分子の送達を改善することができる。コンジュゲート分子のさらなる利点としては、これらに限定されないが、（ｉ）抗体−抗原受容体媒介エンドサイトーシスによって媒介される、オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡの、細胞質への改善された送達、（ｉｉ）抗原提示細胞（ＡＰＣｙ樹状細胞（ＤＣ）による腫瘍または病原体抗原または抗原決定基の取り込みおよび交差提示を誘導するかまたは増大させるコンジュゲートの能力；（ｉｉ）樹状細胞（ＤＣ）の成熟を促進する能力；（ｉｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の、ＣＤ８＋Ｔ細胞記憶および腫瘍または病原体に対する抗体の生成を助ける能力；（ｉｖ）標的化された腫瘍細胞を、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）およびＴ細胞媒介死に感作する能力が挙げられる。一部の実施形態において、コンジュゲート分子は、新生物疾患、感染性疾患、内皮細胞と白血球との相互作用（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、心臓血管／血管新生の徴候、および他の疾患の標的化された免疫療法または免疫防御のために使用することができる。

【0057】

[0092]一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡベースの治療剤の近年の進歩は、様々なヒト疾患のための治療標的の範囲を広げてきた。現在、いくつかのＲＮＡベースの治療剤が、遺伝的障害からＨＩＶ感染や様々ながんに至る様々な疾患に関して臨床調査中である。これらの新興の薬物、例えば治療用リボザイム、アプタマー、および短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などは、かつてないＲＮＡの多機能性を実証し始めている。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、アポトーシス阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｐ５３の阻害剤をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイントタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＤＮＡ修復の不活性化に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、シアル酸生成の抑制に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ナンセンス変異依存分解に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、共刺激シグナルを促進することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、白血球の血管外遊出を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、細胞分裂にとって重要な分子を抑制することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、血管新生を促進することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、血管新生を阻害することが可能である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、腫瘍遺伝子、例えばＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＴＦ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＤＸ２、ＣＴＮＮＢ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＥＧＦＲ、ＥＬＫ４、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ４、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＵＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＲＡＳ、ＩＲＦ４、ＪＵＮ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＭＯ２、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＭＬ２、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＰＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＣＯＡ４、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＵＰ２１４、ＰＡＸ８、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＦ１、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＳＳ１８、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＴ２、ＴＦＧ、ＭＬＬ、ＴＬＸ１、ＴＰＲ、またはＵＳＰ６を抑制することが可能である。

【0058】

[0093]一般的に、ＲＮＡベースの治療剤は、それらの作用機序に基づいていくつかのカテゴリーに分類することができる。このようなカテゴリーの非限定的な例としては、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤（アンチセンス）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の作用剤、触媒活性ＲＮＡ分子（リボザイム）、およびタンパク質および他の分子リガンドと結合するＲＮＡ（アプタマー）が挙げられる。したがって、本開示の一部の実施形態において、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、治療剤であるＲＮＡ分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ干渉の作用剤、触媒活性ＲＮＡ分子、またはタンパク質および他の分子リガンドと結合するＲＮＡ（アプタマー）を含む。一部の例において、ＲＮＡ干渉のための作用剤としては、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が挙げられる。一部の例において、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。一部の例において、オリゴヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。一部の例において、オリゴヌクレオチドは、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一部の例において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスｍｉＲＮＡである。一部の例において、オリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒ（抗ｍｉＲＮＡ）である。一部の実施形態において、本開示のＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。一部の場合、ＲＮＡ分子は、ホスホロチオエートバックボーンの改変、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）糖の置換などの改変を含む改変されたＲＮＡ分子；ロックド核酸（ＬＮＡ）として公知の２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレンで連結された二環式リボヌクレオチド；またはシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）としても公知のＬ−ＲＮＡ（これは、天然ＲＮＡの鏡像異性体である）オリゴヌクレオチドである。いかなる具体的な理論にも縛られるつもりはないが、糖環の２’位における改変、例えば２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−ＭＯＥ、およびＬＮＡ−などは、オリゴヌクレオチドに、ＲＮＡのエネルギー的に最も有利なコンフォメーションであるＲＮＡ様のＣ３’エンド（Ｎ型）の糖パッカー（ｐｕｃｋｅｒ）を採用させる能力を有することが予期される。

【0059】

[0094]一部の例において、改変されたＲＮＡ分子にカップリングしているコンジュゲートが提供され、このようなコンジュゲートは、いくつかの有利な特性、例えば、核酸分解に対する耐性の改善、アンチセンス用途のための標的ｍＲＮＡのＲＮアーゼ−Ｈ媒介切断、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートの腎クリアランスを妨げるための血漿タンパク質の親和性の増加を示す。一部の実施形態において、コンジュゲートは、上記で例示されたような化学的置換またはＬＮＡ改変を含む改変されたＲＮＡ分子を含み、化学的置換またはＬＮＡ改変の結果として全体的に改善された効力、安定性、薬物動態学的および薬力学的な特性を有する。

【0060】

[0095]本開示の一実施形態は、抗体−ＲＮＡｉ作用剤コンジュゲートを形成するための、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートおよびＲＮＡｉのための作用剤を提供する。ＲＮＡｉは、遺伝子発現をサイレンシングするための天然のメカニズムである。ＲＮＡｉのプロセスの間、細胞内に導入された二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれる短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ二重鎖（１９〜２１塩基対）に切断され、ＲＩＳＣは、２本のｓｉＲＮＡ鎖をほどいて、１本の鎖をｍＲＮＡの認識と配列特異的な分解が可能な状態に保持する。（例えば、Ｓｌｅｄｚ ＣＡ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＢＲ（２００５）ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ １０６：７８７〜７９４を参照）。一部の例において、ＲＮＡｉ作用剤、例えば正規の二本鎖ｓｉＲＮＡは、抗体−ＲＮＡｉ作用剤コンジュゲートの一部である。さらに他の例において、他のクラスのｓｉＲＮＡ、例えば、自己アニールｓｉＲＮＡは、抗体−ＲＮＡｉ作用剤コンジュゲートの一部である。

【0061】

[0096]一部の実施形態において、抗体−ＲＮＡｉ作用剤は、がんなどの適応症に関する１つまたは複数の経路を標的化する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉ作用剤は、ｓｉＲＮＡである。

【0062】

[0097]干渉ＲＮＡとしては、「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、約１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、より典型的には、約１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３（二重鎖）ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡが挙げられる（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列が、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３ヌクレオチドの長さであり、二本鎖ｓｉＲＮＡが、約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５塩基対の長さ、好ましくは約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３塩基対の長さである）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１から約４ヌクレオチドまたは約２から約３ヌクレオチドの３’オーバーハング、および５’リン酸末端を含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡの例としては、これらに限定されないが、１つの鎖がセンス鎖であり、他方が相補アンチセンス鎖である２つの別個に存在する分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子であって、センスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結されるもの；自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン２次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；および２つまたはそれより多くのループ構造ならびに自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子であって、環状ポリヌクレオチドがインビボまたはインビトロでプロセシングされて、活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる、環状一本鎖ポリヌクレオチド分子が挙げられる。

【0063】

[0098]一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、化学的に合成される。またｓｉＲＮＡは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＩＩＩまたはダイサーでのより長いｄｓＲＮＡ（例えば、長さが約２５ヌクレオチドより大きいｄｓＲＮＡ）の切断によっても生成できる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡを生物学的に活性なｓｉＲＮＡにプロセシングする（例えば、Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：９９４２〜９９４７（２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１４２３６（２００２）；Ｂｙｒｏｍら、Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ、１０（１）：４〜６（２００３）；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：９８１〜９８７（２００３）；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：２２６９〜２２７１（２００１）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３：８２（１９６８）を参照）。一部の実施形態において、切断されてｓｉＲＮＡを生成するｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチドから、約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さである。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチドもの長さであってもよいし、またはそれより長くてもよい。ｄｓＲＮＡは、遺伝子全体の転写物または部分的な遺伝子の転写物をコードしていてもよい。特定の場合において、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによってコードされていてもよい（例えば、自動的にヘアピンループを有する二重鎖にフォールディングする配列として転写される）。

【0064】

[0099]一部の実施形態において、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、目的の遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方調節またはサイレンシングするために使用される。目的の遺伝子としては、これらに限定されないが、ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子、代謝性疾患および障害（例えば、肝臓の疾患および障害）に関連する遺伝子、腫瘍形成および細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、イムノモジュレーター遺伝子、例えば炎症および自己免疫応答に関連するもの、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害に関連する遺伝子が挙げられる。

【0065】

[0100]ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子としては、細胞への結合、侵入、および複製のためにウイルスによって発現されるものが挙げられる。なかでも特に重要なものは、慢性ウイルス性疾患に関連するウイルス配列である。特に興味深いウイルス配列としては、フィロウイルス、例えばエボラウイルスおよびマールブルグウイルス；アレナウイルス、例えばラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、およびサビアウイルス；インフルエンザウイルス、例えばＡ、Ｂ、およびＣ型インフルエンザウイルスの配列が挙げられる。サイレンシングされ得る例示的なフィロウイルス核酸配列としては、これらに限定されないが、構造タンパク質（例えば、ＶＰ３０、ＶＰ３５、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ−ｐｏｌ））および膜結合型タンパク質（例えば、ＶＰ４０、糖タンパク質（ＧＰ）、ＶＰ２４）をコードする核酸配列が挙げられる。エボラウイルスの完全ゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００２５４９；ＡＹ７６９３６２；ＮＣ−００６４３２；ＮＣ−００４１６１；ＡＹ７２９６５４；ＡＹ３５４４５８；ＡＹ１４２９６０；ＡＢ０５０９３６；ＡＦ５２２８７４；ＡＦ４９９１０１；ＡＦ２７２００１；およびＡＦ０８６８３３に記載される。エボラウイルスＶＰ２４配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ７７３８５およびＡＹ０５８８９７に記載される。エボラウイルスＬ−ｐｏｌ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６７１１０に記載される。エボラウイルスＶＰ４０配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９６に記載される。エボラウイルスＮＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９５に記載される。エボラウイルスＧＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９８に記載される。追加のエボラウイルス配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１１３６５およびＸ６１２７４に記載される。マールブルグウイルスの完全ゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００１６０８；ＡＹ４３０３６５；ＡＹ４３０３６６；およびＡＹ３５８０２５に記載される。マールブルグウイルスＧＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００５７３４；ＡＦ００５７３３；およびＡＦ００５７３２に記載される。マールブルグウイルスＶＰ３５配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００５７３１およびＡＦ００５７３０に記載される。追加のマールブルグウイルス配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６４４０６；Ｚ２９３３７；ＡＦ００５７３５；およびＺ１２１３２に記載される。サイレンシングされ得る例示的なインフルエンザウイルス核酸配列としては、これらに限定されないが、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、およびヘマグルチニン（ＨＡ）をコードする核酸配列が挙げられる。Ａ型インフルエンザのＮＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００４５２２；ＡＹ８１８１３８；ＡＢ１６６８６３；ＡＢ１８８８１７；ＡＢ１８９０４６；ＡＢ１８９０５４；ＡＢ１８９０６２；ＡＹ６４６１６９；ＡＹ６４６１７７；ＡＹ６５１４８６；ＡＹ６５１４９３；ＡＹ６５１４９４；ＡＹ６５１４９５；ＡＹ６５１４９６；ＡＹ６５１４９７；ＡＹ６５１４９８；ＡＹ６５１４９９；ＡＹ６５１５００；ＡＹ６５１５０１；ＡＹ６５１５０２；ＡＹ６５１５０３；ＡＹ６５１５０４；ＡＹ６５１５０５；ＡＹ６５１５０６；ＡＹ６５１５０７；ＡＹ６５１５０９；ＡＹ６５１５２８；ＡＹ７７０９９６；ＡＹ７９０３０８；ＡＹ８１８１３８；およびＡＹ８１８１４０に記載される。Ａ型インフルエンザのＰＡ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ８１８１３２；ＡＹ７９０２８０；ＡＹ６４６１７１；ＡＹ８１８１３２；ＡＹ８１８１３３；ＡＹ６４６１７９；ＡＹ８１８１３４；ＡＹ５５１９３４；ＡＹ６５１６１３；ＡＹ６５１６１０；ＡＹ６５１６２０；ＡＹ６５１６１７；ＡＹ６５１６００；ＡＹ６５１６１１；ＡＹ６５１６０６；ＡＹ６５１６１８；ＡＹ６５１６０８；ＡＹ６５１６０７；ＡＹ６５１６０５；ＡＹ６５１６０９；ＡＹ６５１６１５；ＡＹ６５１６１６；ＡＹ６５１６４０；ＡＹ６５１６１４；ＡＹ６５１６１２；ＡＹ６５１６２１；ＡＹ６５１６１９；ＡＹ７７０９９５；およびＡＹ７２４７８６に記載される。サイレンシングされ得る例示的な肝炎ウイルス核酸配列としては、これらに限定されないが、転写および翻訳に関与する核酸配列（例えば、Ｅｎ１、Ｅｎ２、Ｘ、Ｐ）、および構造タンパク質（例えば、ＣおよびＣ−関連タンパク質を含むコアタンパク質、Ｓ、Ｍ、および／もしくはＬタンパク質を含むキャプシドおよびエンベロープタンパク質、またはそれらのフラグメント）をコードする核酸配列が挙げられる。サイレンシングされ得る例示的なＣ型肝炎核酸配列としては、これらに限定されないが、セリンプロテアーゼ（例えば、ＮＳ３／ＮＳ４）、ヘリカーゼ（例えばＮＳ３）、ポリメラーゼ（例えば、ＮＳ５Ｂ）、およびエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７）が挙げられる。Ａ型肝炎核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００１４８９に記載される；Ｂ型肝炎核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００３９７７に記載される；Ｃ型肝炎核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００４１０２に記載される；Ｄ型肝炎核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００１６５３に記載される；Ｅ型肝炎核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００１４３４に記載される；Ｇ型肝炎核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ−００１７１０に記載される。本開示の抗体−ＲＮＡｉコンジュゲートを使用するウイルスの感染および生存に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、一部の実施形態において、ウイルスに関する状態を処置するのに使用される従来の薬剤の投与との併用において行うことができる。

【0066】

[0101]代謝性疾患および障害（例えば、肝臓が標的である障害ならびに肝臓の疾患および障害）に関連する遺伝子としては、例えば、脂質代謝異常（例えば、肝臓Ｘ受容体、例えばＬＸＲαおよびＬＸＲβ（Ｇｅｎｂａｃｋ受託番号ＮＭ−００７１２１）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ−００５１２３）、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、サイト１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧ補酵素Ａレダクターゼ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＢ）、およびアポリポタンパク質（ＡｐｏＥ））；および糖尿病（例えば、グルコース６−ホスファターゼ）で発現される遺伝子が挙げられる。一部の実施形態において、代謝性疾患および障害（例えば、肝臓が標的である疾患および障害ならびに肝臓の疾患および障害）に関連する遺伝子としては、肝臓それ自体で発現される遺伝子に加えて、他の臓器および組織で発現される遺伝子も挙げられる。代謝性疾患および障害に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、その疾患または障害を処置するのに使用される従来の薬剤の投与と都合よく併用することができる。腫瘍形成および細胞形質転換に関連する遺伝子配列の例としては、Ｅｇ５などの有糸分裂キネシン；ＭＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１、ＴＬＳ−ＦＵＳ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＢＣＬ−２、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、およびＡＭＬ１−ＭＴＧ８などの転移配列；多剤耐性遺伝子、サイクリン、ベータ−カテニン、テロメラーゼ遺伝子、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＢＣＬ−２、ＥＲＢＢ１、およびＥＲＢＢ２などの過剰発現される配列；ならびにＲＡＳなどの突然変異した配列が挙げられる。ＤＮＡ修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法剤の投与との併用で利用される。また、腫瘍の移動に関連するタンパク質、例えば、インテグリン、セレクチン、およびメタロプロテイナーゼをコードする遺伝子も目的の標的配列である。前述の例は、非限定的である。腫瘍形成または細胞形質転換、腫瘍増殖、または腫瘍の移動を容易にするかまたは促進する全体のまたは部分的な遺伝子配列のいずれが、テンプレート配列として含まれていてもよい。血管新生遺伝子は、新しい血管の形成を促進することができる。なかでも特に興味深いものは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはＶＥＧＦｒである。一部の例において、抗血管新生遺伝子は、新血管形成を阻害することができる。これらの遺伝子は、血管新生が疾患の病的な発達において役割を果たすがんを処置するのに特に有用である。抗血管新生遺伝子の例としては、これらに限定されないが、エンドスタチン、アンジオスタチン、およびＶＥＧＦ−Ｒ２が挙げられる。

【0067】

[0102]イムノモジュレーター遺伝子は、１つまたは複数の免疫応答をモジュレートする遺伝子である。イムノモジュレーター遺伝子の例としては、これらに限定されないが、増殖因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦなど）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど）およびＴＮＦなどのサイトカインが挙げられる。また、ＦａｓおよびＦａｓリガンド遺伝子も、目的のイムノモジュレーター標的配列である。Ｔｅｃファミリーキナーゼ、例えばブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）などの造血細胞およびリンパ系細胞における二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子も本発明に含まれる。

【0068】

[0103]細胞受容体リガンドとしては、細胞表面受容体（例えば、インスリン受容体、ＥＰＯ受容体、Ｇタンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体など）に結合することができるリガンド、受容体が関与する生理学的な経路（例えば、グルコースレベルのモジュレーション、血液細胞の発達、有糸分裂誘発など）をモジュレートする（例えば、阻害する、活性化するなど）ことができるリガンドが挙げられる。細胞受容体リガンドの例としては、これらに限定されないが、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インスリン、グルカゴン、Ｇタンパク質共役受容体リガンドなどが挙げられる。

【0069】

[0104]ゲノムにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）拡張は、多数の消耗性疾患の原因であり、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）におけるＣＡＧ；フリードライヒ運動失調症におけるＧＡＡ；脆弱Ｘ振戦失調症候群（ＦＸＴＡＳ）におけるＣＧＧ；および脆弱ＸＥ精神遅滞（ＦＲＡＸＥ）で見出されるＣＣＧのトリヌクレオチド拡張（ｅｘｐｌａｎｓｉｏｎ）が挙げられる。ＴＮＲ領域から生成したＲＮＡは、小さいｓｉＲＮＡサイズのリピートフラグメントを含む。ＨＤ患者に関して、ＨＴＴにおけるリピートの長さとがんの発生率との逆相関が報告されている。ここで本発明者らは、ＣＡＧ ＴＮＲベースのｓｉＲＮＡは、それらのオープンリーディングフレームに長い逆相補的ＴＮＲを含有する遺伝子を標的化することによって、がん細胞に対して毒性であることを示す。様々なＴＮＲベースのｓｉＲＮＡのなかでも、関連するＴＮＲのＣＡＧ／ＣＵＧファミリーにおける６つのメンバーが、ヒトおよびマウスがん細胞の両方に対して最も毒性が高い。ｓｉＣＡＧ／ＣＵＧ ＴＮＲベースのｓｉＲＮＡは、全ての試験されたがん細胞株においてインビトロで細胞死を誘発し、卵巣がんの前臨床マウスモデルにおいて、マウスに対する毒性の徴候を示すことなく腫瘍増殖をスローダウンさせる。本発明者らは、新規の抗がん試薬の形態として、ＴＮＲベースのｓｉＲＮＡを調査することを提唱する。トリヌクレオチドリピート（例えば、ＣＡＧリピート）の拡張をコードするテンプレートは、トリヌクレオチドリピートの拡張が原因の神経変性障害、例えば球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂｕｌａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）およびハンチントン病において、病原性配列をサイレンシングすることにおいて利用される。したがって、一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、トリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）配列、例えばＣＡＧ／ＣＵＧ ＴＮＲ配列を含む。一部の実施形態において、ＣＡＧ／ＣＵＧ配列を含むｓｉＲＮＡは、約０．０１ｎＭから約１０．０ｎＭのＩＣ５０を含む。一部の実施形態において、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＣＡＧリピート配列を含む。一部の実施形態において、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＣＵＧリピート配列を含む。一部の実施形態において、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＣＡＧおよびＣＵＧリピート配列を含む。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、トリヌクレオチド配列を含む抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＡＧリピート配列を含む抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＵＧリピート配列を含む抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＡＧおよびＣＵＧリピート配列を含む抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0070】

[0105]治療目的で上述した遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングすることにおけるその有用性に加えて、本明細書に記載のｓｉＲＮＡはまた、抗体−ＲＮＡｉコンジュゲートの場合、調査および開発での適用、加えて診断、予防、予後、臨床での適用、および他のヘルスケアでの適用においても有用である。非限定的な例として、本開示のｓｉＲＮＡ分子は、目的の遺伝子が治療標的になる可能性のあるかどうかを試験することを目的とした標的の検証研究に使用することができる。本開示のｓｉＲＮＡ分子はまた、見込みのある治療標的としての遺伝子を発見することを目的とした標的の同定研究にも使用することができる。

【0071】

[0106]ｓｉＲＮＡの標的のさらなる例としては、これらに限定されないが、ＭＣＬ１、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４７／ＩＡＰ、ＵＰＦ１、ＭＬＨ１、ＣＭＡＳ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＬＫ１、ＰＬＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＡＵＲＫＡ、ＭＡＤＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、およびＴＭ４ＳＦ１が挙げられる。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＴＭ４ＳＦ１、ＣＡＧ／ＣＵＧ、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、末梢リンパ節アドレシン（ＰＮＡｄ）、ＩＣＡＭ−２、ＰＥＣＡＭ−１、ＪＡＭ−Ａ、ＪＡＭ−Ｂ、ＪＡＭ−Ｃ、ガレクチン−１、ガレクチン−３、およびガレクチン−９、ＰＤ−Ｌ２、ＳＮＡＩ１、ＺＥＢ１、Ｂ７−Ｈ３、ＩＤＯ、ＬＳＥＣｔｉｎ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＨＭＧＢ−１、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＴＭ４ＳＦ１を標的化し、センス鎖配列、例えば、配列番号１００に記載の配列を含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、センス鎖配列、例えば、配列番号１０１に記載の配列を含む、ＣＡＧおよびＣＵＧトリヌクレオチドリピート由来のｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＡＧ／ＣＵＧ）である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ４７／ＩＡＰを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＣＬ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ１を標的化する。

【0072】

[0107]誘導された骨髄性（ｍｙｅｏｌｏｉｄ）白血病細胞分化タンパク質（ＭＣＬ１）は、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するＭＣＬ１遺伝子によってコードされたタンパク質である。ＭＣＬ１発現は、乳がんなどのがんで上昇していることがよくある。アポトーシスの回避は、腫瘍発達を促進し、がん療法によって誘導された細胞死に対するバリアとしても作用する。ミトコンドリア依存性アポトーシスは、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーによって制御され、すなわちこれらのタンパク質は、ミトコンドリアの完全性を調節することによって細胞運命を制御する。アポトーシスの間、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２メンバーの上方調節が、抗アポトーシス性のＢｃｌ−２の機能に打ち勝ち、結果としてミトコンドリア外膜の透過化および細胞死を引き起こす。抗アポトーシス性のＢｃｌ−２タンパク質、例えばＢＣＬ−２、ＭＣＬ−１、またはＢＣＬ−ＸＬのレベルにおける異常な増加は、アポトーシスを妨げ、それによりがんを促進し、がん療法によって誘導された細胞死に対する耐性を許容する。それゆえに、ＭＣＬ−１またはＢＣＬ−ＸＬの発現または不活性化を低減することが、がんを処置する、および／またはがんの進行を遅延させる方法を提供する。したがって、本開示の一実施形態は、ＭＣＬ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＣＬ−１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＣＬ−１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＭＣＬ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示の別の実施形態は、ＢＣＬ−ＸＬを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＢＣＬ−ＸＬをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＢＣＬ−ＸＬの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、および／または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＢＣＬ−ＸＬを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0073】

[0108]マウス二重微小染色体２相同体（Ｍｄｍ２）は、ＭＤＭ２遺伝子によってコードされるヒト発がん性タンパク質である。Ｍｄｍ２は、腫瘍抑制因子ｐ５３タンパク質の転写活性を抑えるｐ５３応答性タンパク質として同定されている（すなわち、Ｍｄｍ２は、ｐ５３のアンタゴニストである）。Ｍｄｍ２は、ｐ５３のＮ末端トランス活性化ドメインに結合し、ブロックすることによってｐ５３を抑える。Ｍｄｍ２の転写は、ｐ５３によって活性化される。多数のがん、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および一部の固形腫瘍が、Ｍｄｍ２の異常な活性によるｐ５３の機能不全を有する。Ｍｄｍ２のｐ５３との相互作用をブロックすることは、がん性細胞および／またはＭｄｍ２を過剰発現する細胞においてアポトーシスを誘導する。したがって、Ｍｄｍ２の発現を低減させること、またはＭｄｍ２を不活性化することは、がんを処置するおよび／またはその進行を遅延させる方法を提供する。したがって、本開示の一実施形態は、Ｍｄｍ２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｍｄｍ２を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｍｄｍ２をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｍｄｍ２の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、Ｍｄｍ２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0074】

[0109]マウス二重微小染色体４相同体（Ｍｄｍ４）は、ＭＤＭ４遺伝子によってコードされたヒト発がん性タンパク質である。Ｍｄｍ２と同様に、Ｍｄｍ４は、ｐ５３の阻害剤として同定されており、Ｍｄｍ２と構造的な類似性を有する。Ｍｄｍ４もまた、その転写活性化ドメインに結合するによってｐ５３を阻害する。加えて、Ｍｄｍ４は、ＲＩＮＧフィンガードメインを介してＭｄｍ２と相互作用し、後者の分解を阻害することが示されている。Ｍｄｍ４は、ｐ５３のアポトーシス促進機能を拮抗させることによって、がん性細胞、例えば黒色腫細胞の生存を促進する。Ｍｄｍ４のｐ５３との相互作用の阻害は、ｐ５３の機能を回復させ、がん性細胞におけるアポトーシスおよび／またはがんを標的化する治療剤に対する感受性の増加をもたらす。したがって、Ｍｄｍ４の発現を低減させることまたはＭｄｍ４を不活性化することは、がんを処置するおよび／またはその進行を遅延させる方法を提供する。したがって、本開示の一実施形態は、Ｍｄｍ４を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｍｄｍ４をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｍｄｍ４を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｍｄｍ４の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、Ｍｄｍ４を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0075】

[0110]プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされたヒトタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、特定の事象の間に、例えばがんおよび自己免疫疾患において、免疫系を抑制することにおいて主要な役割を果たす。ＰＤ−Ｌ１が、ＰＤ−１またはＢ７−１に結合すると、それが阻害シグナルのきっかけとなり、抗原特異的なＴ細胞の増殖を低減し、抗炎症性Ｔ細胞においてアポトーシスを低減する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、内因性免疫抗腫瘍活性に応答してがん性細胞によってもたらされる適応免疫耐性メカニズムである。ＰＤ−Ｌ１は、一般的に、腫瘍細胞において、過剰発現される。ＰＤ−Ｌ１は、活性化されたＴ細胞上のＰＤ−１受容体に結合し、それにより、さもなくば腫瘍細胞を標的化するであろう細胞傷害性Ｔ細胞の阻害が起こる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の阻害は、天然の細胞傷害性Ｔ細胞が、がん性細胞を標的化し、それを消滅させることを可能にする。結果として、ＰＤ−Ｌ１の発現を低減させることまたはＰＤ−Ｌ１を不活性化することは、がんを処置するおよび／またはその進行を遅延させる方法を提供する。したがって、本開示の一実施形態は、ＰＤ−Ｌ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＰＤ−Ｌ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0076】

[0111]ＰＤ−Ｌ１に加えて、ＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１の別のリガンドである。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２経路の阻害は、腫瘍細胞による免疫回避を可能にする。したがって、本開示の一実施形態は、ＰＤ−Ｌ２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ２を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ２をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ２の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＰＤ−Ｌ２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0077】

[0112]表面抗原分類４７は、インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７／ＩＡＰ）としても公知であり、ＣＤ４７遺伝子によってコードされたヒト膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する広く発現される細胞膜受容体である。ＣＤ４７は、これらに限定されないが、細胞移動、細胞増殖、アポトーシス、および細胞接着などのいくつかの生理学的なプロセスへの関与が示されている。加えて、ＣＤ４７は、食細胞（例えば、マクロファージ）で発現されるシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ−α）のライゲーションを介して、貪食の阻害剤として機能する。ＣＤ４７は、腫瘍増殖の阻害および転移の防止において役割を果たす。例えば、ＣＤ４７をブロックすることは、がん細胞が天然のマクロファージによる貪食から逃れることを可能にするＣＤ４７−ＳＩＲＰα経路を途中妨害する。加えて、ＣＤ４７のライゲーションは、がん細胞のアポトーシスを誘導する。さらに、ＣＤ４７を標的化することは、腫瘍微小環境を改善する。したがって、本開示の一実施形態は、ＣＤ４７を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ４７を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ４７の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＤ４７を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0078】

[0113]アップフレームシフト（Ｕｐｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ）１（ＵＰＦ１）は、ＲＮＡヘリカーゼであり、活発にｍＲＮＡを分解する細胞プロセスであるナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）において重要な役割を果たす。ＵＰＦ１は、ｍＲＮＡ核輸送とｍＲＮＡ監視の両方に関与するスプライシング後の多タンパク質複合体の一部である。本開示の一実施形態は、ＵＰＦ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ＵＰＦ１は、新抗原の提示を促進する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＵＰＦ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＵＰＦ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＵＰＦ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＵＰＦ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）は、未成熟翻訳終止コドン（ＰＴＣ）を含有する異常なｍＲＮＡを分解するｍＲＮＡ品質管理メカニズムである。ＮＭＤに必須のタンパク質としては、プロテインキナーゼであるＳＭＧ−１、およびＲＮＡヘリカーゼ活性を有するＳＭＧ−１の基質であるＵＰＦ１が挙げられる。ＵＰＦ１は、早期終結コドンを内包する異常なｍＲＮＡを消滅させ、正常な生理学的なｍＲＮＡの定常状態レベルを調節する。ＵＰＦ１のノックダウンは、異常なｍＲＮＡの生存、および体内の他所では起こらない異常なタンパク質へのその翻訳を引き起こす。これらの異常なタンパク質は、Ｂ細胞に外来として認識される可能性がある。したがって、本発明の開示の一実施形態は、ＵＰＦ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＵＰＦ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ＵＰＦ１は、新抗原の提示を促進する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＵＰＦ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0079】

[0114]ＭｕｔＬ（大腸菌）相同体１（結腸がん、非ポリポーシス２型）は、ＭＬＨ１としても公知であり、ＤＮＡ複製後のミスマッチ修復プロセスに関与するタンパク質である。一部の実施形態において、ＭＬＨ１の一時的なノックダウンは、新抗原を生成し、ＰＤ−１に対する感受性をもたらすミスマッチ修復を下方調節する。したがって、本開示の一実施形態は、ＭＬＨ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＬＨ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＬＨ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＬＨ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＭＬＨ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0080】

[0115]Ｎ−アシルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＣＭＡＳ）は、ヒトにおいてＣＭＡＳ遺伝子によってコードされる酵素である。ＣＭＡＳは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）をシチジン５’−一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ）に変換する。このプロセスは、シアル化糖タンパク質およびグリコリピドの形成において重要である。この改変は、細胞間コミュニケーションおよび免疫応答において役割を果たす。ＣＭＡＳの過剰発現は、シアル酸レベルの増加をもたらし、順にそれが、乳がんなどのがん細胞の病原性に関与する遺伝子の発現において豊富な転写署名を維持する。ＣＭＡＳのノックダウンを介して細胞のシアル化を低減させることは、転写再プログラミングおよび乳がん病原性の低減をもたらす。したがって、本開示の一実施形態は、ＣＭＡＳを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＭＡＳをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＭＡＳを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＭＡＳの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＭＡＳを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0081】

[0116]サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）は、細胞分裂プロテインキナーゼ４としても公知であり、ＣＤＫ６は、どちらも、サイクリン依存性キナーゼファミリーの一部である酵素である。ＣＤＫ４およびＣＤＫ６は、哺乳類細胞の増殖において重要な役割を果たす。ＣＤＫ４（ＩＮＫ４）−網膜芽細胞腫（Ｒｂ）経路のサイクリンＤ−ＣＤＫ４／ＣＤＫ６−阻害剤は、Ｇ１（ＤＮＡ合成前）からＳ（ＤＮＡ合成）に至る細胞周期チェックポイントを制御することによって細胞増殖を調節する。サイクリンＤ−ＣＤＫ４／ＣＤＫ６−ＩＮＫ４−Ｒｂ経路の調節異常は、がんにおいて頻繁に観察され、細胞周期の進行および成長の継続に寄与する。ＣＤＫ４およびＣＤＫ６は、Ｄ型サイクリンと会合し、Ｒｂのリン酸化状態を調節することによって、Ｇ１期からＳ期への移行を媒介する。非リン酸化Ｒｂは、Ｅ２ファミリー（Ｅ２Ｆ）転写因子と結合し、その機能を抑える；リン酸化されると、Ｒｂは、Ｅ２Ｆ転写因子から解離し、それを自由にすることでＤＮＡ複製および細胞分裂に参加できるようにする。増加したサイクリンＣＤＫ４およびＣＤＫ６活性は、Ｒｂのリン酸化を促進するものであり、これは、Ｄ型サイクリンの過剰発現、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６遺伝子の突然変異または増幅、またはサイクリンＣＤＫ４およびＣＤＫ６の負の調節因子、例えばｐ１６ＩＮＫ４Ａの喪失を含むいくつかのメカニズムを介して起こる可能性がある。最終的に、増加したＣＤＫ４およびＣＤＫ６活性は、がん細胞の成長をもたらす。したがって、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６を阻害することは、進行中のがんを有する患者に新規の治療アプローチを提供する。したがって、本開示の一実施形態は、ＣＤＫ４を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤＫ４を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤＫ４をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤＫ４の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＤＫ４を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示のさらに別の実施形態は、ＣＤＫ６を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤＫ６を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤＫ６をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤＫ６の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＤＫ６を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0082】

[0117]セリン／スレオニン−プロテインキナーゼ（ＰＬＫ１）は、ｐｏｌｏ様キナーゼ１、またはセリン／スレオニン−プロテインキナーゼ１３（ＳＴＰＫ１３）としても公知であり、セリン／スレオニン−プロテインキナーゼ（ＰＬＫ４）はまた、ｐｏｌｏ様キナーゼ４としても公知であり、どちらもセリン／スレオニンプロテインキナーゼのｐｏｌｏファミリーの一部である酵素である。ＰＬＫ１は、細胞周期のＭ期にわたり、中心体の成熟および紡錘体集合の調節、染色体腕からのコヒーシンの除去、後期促進複合体／サイクロソーム（ＡＰＣ／Ｃ）阻害剤の不活性化、ならびに有糸分裂終了および細胞質分裂の調節を含むいくつかの重要な機能を実行する。ＰＬＫ１の機能不全は、がん性の形質転換を促進し、その進行を駆り立てる。ＰＬＫ１の過剰発現は、様々なヒトがんに見出され、がんにおける予後不良に関連する。ＰＬＫ１の阻害は、有糸分裂の複数の段階を妨害することによってがん細胞の致死を引き起こす。したがって、ＰＬＫ１は、がん療法のための魅力的な標的である。したがって、本開示の一実施形態は、ＰＬＫ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＰＬＫ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0083】

[0118]ＰＬＫ４は、細胞周期の間の中心小体の複製を調節する；すなわち、ＰＬＫ４は、中心体の複製に必須である。ＰＬＫ４の過剰発現は、有糸分裂の忠実度の変更を引き起こし、腫瘍形成のきっかけとなる。したがって、ＰＬＫ４の阻害は、がんに対する抗新生物作用を有する。したがって、本開示のさらに別の実施形態は、ＰＬＫ４を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ４を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ４をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＬＫ４の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＰＬＫ４を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0084】

[0119]オーロラＢキナーゼ（ＡＵＲＫＢ）およびオーロラＡキナーゼ（ＡＵＲＫＡ）は、有糸分裂を調節するオーロラキナーゼファミリーのメンバーであるタンパク質である。オーロラキナーゼは、染色体の移動と分離の間に微小管と会合する。オーロラキナーゼＢは、動原体に近い微小管に、具体的にはＫ繊維と呼ばれる特殊化された微小管に局在し、オーロラキナーゼＡは、中心体に局在する。ＡＵＲＫＢおよびＡＵＲＫＡは、様々なヒト腫瘍で過剰発現される。ＡＵＲＫＢおよびＡＵＲＫＡの過剰発現は、異常な細胞分裂を誘導し、結果として、細胞において中心体の増幅および多重核形成を引き起こす。ＡＵＲＫＢおよびＡＵＲＫＡ阻害は、別個のメカニズムを介してがん性細胞のアポトーシスを誘導する。ＡＵＲＫＡ阻害は、有糸分裂紡錘体集合の欠損を誘導し、その結果、一時的な紡錘体チェックポイント依存性の有糸分裂停止を引き起こす。この細胞周期の停止は、維持されず、その後、ＡＵＲＫＡが阻害された細胞は有糸分裂から出て、Ｇ１停止の誘導とそれに続くアポトーシス、またはｐ５３とは無関係のメカニズムのいずれかによってアポトーシスを引き起こす。対照的に、ＡＵＲＫＢの阻害は、有糸分裂中の正常な染色体の整列にも干渉し、有糸分裂紡錘体チェックポイントを無視し、倍数性、細胞質分裂の失敗、および核内倍加とそれに続く細胞死を引き起こす。したがって、本開示の一実施形態は、ＡＵＲＫＢを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＡＵＲＫＢを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＡＵＲＫＢをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＡＵＲＫＢの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＡＵＲＫＢを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示の別の実施形態は、ＡＵＲＫＡを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＡＵＲＫＡを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＡＵＲＫＡをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＡＵＲＫＡの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＡＵＲＫＡを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0085】

[0120]がん転移は、腫瘍細胞と遠位の組織における内皮との細胞間相互作用によって促進される。２つの主要な細胞接着分子ファミリー、セレクチンおよびインテグリンが転移に参加する。血管内で、循環腫瘍細胞が最終的に内皮と相互作用することにより、腫瘍細胞の拘束と血管外遊出を引き起こす。腫瘍微小環境への白血球の動員の間に、免疫細胞はまず「ローリング」を受け、これは、内皮Ｐ／Ｅ−セレクチン、末梢リンパ節アドレシン（ＰＮＡｄ）、および粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ−１）、加えて白血球Ｌ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、およびＥ−セレクチンリガンド間の相互作用によって開始される。この工程は、堅い接着が起こらない限り、可逆的である。堅い接着は、内皮細胞間細胞接着分子１／２（ＩＣＡＭ−１／２）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）、ＭＡＤＣＡＭ−１の、白血球のα４β７インテグリン、α４β１インテグリン（ＶＬＡ４）、およびαＬβ２インテグリン（ＬＦＡ−１）との相互作用によって媒介される。αＭβ２インテグリン（Ｍａｃ−１）は、内皮に沿った先端の白血球の平坦化とクローリング（ｃｒａｗｌｉｎｇ）のきっかけとなる。遊出は、内皮血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）およびジャンクション接着分子−Ａ／Ｂ／Ｃ（ＪＡＭ−Ａ／Ｂ／Ｃ）が、白血球のＰＥＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４、およびＭａｃ−１と相互作用することによって調節される最終工程である。腫瘍細胞−内皮の接触は、炎症および／または白血球の腫瘍微小環境への動員の間に、平行なこれらの白血球−内皮細胞相互作用を形成する。確かに腫瘍細胞接着のメカニズムは炎症部位への白血球動員とは異なるが、腫瘍細胞の内皮との接触形成に関与する細胞接着分子は同じである。

【0086】

[0121]セレクチンおよびインテグリンは、様々ながんのタイプのがん、例えば、結腸癌および肺癌ならびに黒色腫の進行において重要な役割を有する。セレクチンによって媒介される腫瘍細胞の拘束と接着が転移に寄与する一方で、腫瘍細胞と周囲環境の両方からのインテグリンによって媒介される相互作用はさらに、がんの進行に寄与する。セレクチンは、血液循環内で白血球および血小板および内皮の接着性相互作用に関与する血管細胞接着分子である。セレクチンファミリーには、３つのメンバー、すなわちＰ−、Ｅ−、およびＬ−セレクチンが存在する。Ｐ−セレクチンは、血小板の貯蔵顆粒（α顆粒）および内皮細胞（ワイベル−パラーデ小体）中に存在し、したがって活性化時の細胞表面上の急速な転移を可能にする。それとは逆に、Ｅ−セレクチンの内皮発現はデノボ転写を必要とし、刺激の数時間後に活性化された内皮細胞表面での発現をもたらす。Ｌ−セレクチンは、ほとんど全ての白血球亜集団の細胞表面上で構成的に発現される。Ｌ−セレクチンは、内皮上における白血球の迅速なローリングを媒介し、Ｐ−およびＥ−セレクチンは、より低速でローリングを支持する。内皮上への白血球のテザリングおよびローリングにおける最初の工程は、セレクチンとその炭水化物リガンドとの急速で可逆的な相互作用によって支持される。

【0087】

[0122]Ｐ−、Ｌ−、またはＥ−セレクチンは、脈管構造内の腫瘍細胞との接触を媒介する。例えば、Ｐ−セレクチンの発現を介した血小板−腫瘍細胞の血栓の形成は、宿主反応の回避を助け、それによって転移に寄与する。さらに、Ｅ−セレクチン発現は、肝臓などの特定の組織の転移性の定着の間に検出される。Ｅ−セレクチン発現の阻害は、転移の減弱を引き起こす。したがって、本開示の一実施形態は、Ｐ−セレクチンを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｐ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｐ−セレクチンを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｐ−セレクチンの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、Ｐ−セレクチンを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本発明の開示のさらに別の実施形態は、Ｅ−セレクチンを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｅ−セレクチンを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｅ−セレクチンの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、Ｅ−セレクチンを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0088】

[0123]セレクチンに加えて、細胞接着分子およびインテグリンは、がん転移において役割を果たす。血管のインテグリンの腫瘍微小環境中のＥＣＭ成分への結合は、内皮細胞の浸潤および移動に寄与する。例えば、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の、内皮上のインテグリンα４β１（ＶＬＡ−４）への結合は、黒色腫などの特定のがんにおける腫瘍細胞接着および経内皮遊走に必要である。β１インテグリンのサイレンシング、したがってＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１結合の喪失は、転移を強く低減させた。したがって、本開示の一実施形態は、ＶＣＡＭ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＶＣＡＭ−１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＶＣＡＭ−１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＶＣＡＭ−１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＶＣＡＭ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。さらに、粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ１）は、アドレシンとしても公知であり、インテグリンα４β７のリガンドであり、がん転移に参加する。したがって、本開示の一実施形態は、ＭＡＤＣＡＭ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＡＤＣＡＭ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＡＤＣＡＭ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＭＡＤＣＡＭ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＭＡＤＣＡＭ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0089】

[0124]本開示の一実施形態は、ＩＣＡＭ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＩＣＡＭ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示のさらに別の実施形態は、ＩＣＡＭ−２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−２を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−２をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ−２の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＩＣＡＭ−２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0090】

[0125]本開示の一実施形態は、ＰＮＡｄを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＮＡｄを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＮＡｄをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＮＡｄの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＰＮＡｄを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示のさらに別の実施形態は、ＰＥＣＡＭ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＥＣＡＭ−１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＥＣＡＭ−１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰＥＣＡＭ−１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＰＥＣＡＭ−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0091】

[0126]本開示の別の実施形態は、ＪＡＭ−Ａを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ａを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ａをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ａの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＪＡＭ−Ａを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示の別の実施形態は、ＪＡＭ−Ｂを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ｂを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ｂをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ｂの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＪＡＭ−Ｂを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示の別の実施形態は、ＪＡＭ−Ｃを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ｃを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ｃをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＪＡＭ−Ｃの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＪＡＭ−Ｃを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0092】

[0127]癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）（ＣＥＡＣＡＭ１）は、ＣＤ６６ａ（表面抗原分類６６ａ）としても公知であり、ヒト糖タンパク質であり、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）細胞接着分子ファミリーのメンバーである。ＣＥＡＣＡＭ１は、がん細胞で発現され、がん転移も促進する。したがって、本開示の一実施形態は、ＣＥＡＣＡＭ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＥＡＣＡＭ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＥＡＣＡＭ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＥＡＣＡＭ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＥＡＣＡＭ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0093】

[0128]共阻害性受容体、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、Ｌａｇ−３、Ｔｉｍ−３、およびＴＩＧＩＴなどは、Ｔ細胞で発現される。これらの受容体は、エフェクターＴ細胞応答の適度な縮小を制御し、Ｔｒｅｇ細胞の適度な機能を保証する。これらの受容体の標的化は、がん性細胞に対する抗腫瘍のＴ細胞応答を改善する。リンパ球活性化遺伝子−３（Ｌａｇ−３）は、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のサブセットで上方調節される。ＬＳＥＣｔｉｎは、Ｌａｇ−３のリガンドである。肝臓およびリンパ節の類洞内皮細胞のＣ型レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）は、細胞接着機能を示し、がん転移の様々な工程に寄与する細胞表面のＣ型レクチンである。したがって、本開示の一実施形態は、ＬＳＥＣｔｉｎを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＬＳＥＣｔｉｎを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＬＳＥＣｔｉｎをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＬＳＥＣｔｉｎの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＬＳＥＣｔｉｎを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0094】

[0129]Ｌａｇ−３に加えて、Ｔｉｍ−３およびＴＩＧＩＴもまた、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞において一時的に上方調節される。Ｔ細胞免疫グロブリン−３（Ｔｉｍ−３）は、末梢血単球、マクロファージ、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で発現される。Ｔｉｍ−３は、腫瘍に対するＴ細胞応答の阻害にとって重要な阻害性受容体である。Ｔｉｍ−３はまた、内皮細胞でも発現され、転移を促進する。Ｔｉｍ−３リガンドは、ガレクチン−９、高移動度グループボックス１タンパク質（ＨＭＧＢ１）、およびＣＥＡＣＡＭ１などが挙げられ、これは、腫瘍細胞において上方調節される。Ｔｉｍ−３およびガレクチン−９、ＨＭＧＢ１、およびＣＥＡＣＡＭ１経路は、Ｔ細胞媒介性免疫応答にとって負の調節因子とみなされる。言い換えれば、腫瘍細胞における免疫抑制性Ｔｉｍ−３リガンドが上方調節されると、腫瘍細胞の免疫監視の回避が起こり、腫瘍の進行が可能になる。したがって、本開示の一実施形態は、ガレクチン−９を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−９を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−９をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−９の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｔｉｍ−３−ガレクチン−９経路をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、または阻害する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ガレクチン−９を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本発明の開示の別の実施形態は、ＨＭＧＢ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＨＭＧＢ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＨＭＧＢ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＨＭＧＢ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｔｉｍ−３−ＨＭＧＢ１経路をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、または阻害する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＨＭＧＢ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0095】

[0130]Ｉｇおよび免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）を含むＴ細胞免疫受容体は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞およびＮＫ細胞の約３分の１で発現され、組織炎症部位におけるＴｒｅｇ細胞で高度に上方調節される。Ｔｉｍ−３と同様に、ＴＩＧＩＴも、がん免疫性を生じる工程の多くにおいて役割を果たす。ＣＤ１５５およびＣＤ１１２などのＴＩＧＩＴリガンドは、腫瘍細胞で過剰発現される。ＣＤ１５５およびＣＤ１１２などのＴＩＧＩＴリガンドの阻害は、単独で、または他の阻害性受容体の阻害と組み合わせて、腫瘍の進行および／または転移を抑制する。したがって、本開示の一実施形態は、ＣＤ１５５を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ１５５を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ１５５をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ１５５の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＴＩＧＩＴ−ＣＤ１５５経路をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、または阻害する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＤ１５５を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。本開示の別の実施形態は、ＣＤ１１２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ１１２を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ１１２をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＣＤ１１２の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＴＩＧＩＴ−ＣＤ１１２経路をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、または阻害する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＣＤ１１２を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0096】

[0131]ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＬａｇ−３に類似して、Ｂ７Ｈ３は、別個の分子メカニズムを介してではあるが、Ｔ細胞の機能を負に調節する。Ｂ７−Ｈ３は、多様な固形がんで過剰発現される免疫チェックポイント分子であり、しばしば患者における予後不良および負の臨床転帰と相関する。したがって、本開示の一実施形態は、Ｂ７−Ｈ３を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｂ７−Ｈ３をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｂ７−Ｈ３を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｂ７−Ｈ３の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｂ７−Ｈ３経路をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、または阻害する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、Ｂ７−Ｈ３を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0097】

[0132]ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、ＴＩＧＩＴ、Ｌａｇ−３、およびＢ７Ｈ３に類似して、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ）は、腫瘍増殖を支持する免疫抑制性の腫瘍微小環境を生成することに関与するチェックポイントタンパク質である。ＩＤＯは、腫瘍細胞および腫瘍微小環境を取り囲む細胞で過剰発現される。ＩＤＯは、免疫系のエフェクターＴ細胞を阻害することによってその免疫調節作用を発揮する。次いで、増加したＩＤＯタンパク質レベルが、病原体および腫瘍細胞を破壊する免疫系の能力を媒介するエフェクターＴ細胞の成長の停止およびアポトーシスを駆動させる。ＩＤＯ過剰発現は、エフェクターＴ細胞の数を低減させることによって、免疫系によるがん細胞の効果的な破壊を妨げる。したがって、本開示の一実施形態は、ＩＤＯを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＤＯを標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＤＯをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＤＯの発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＩＤＯ経路をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、または阻害する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＩＤＯを標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0098】

[0133]ガレクチンは、体全体で豊富であり、広く分布するβ−ガラクトシド糖に特異的に結合するタンパク質のクラスである。ガレクチン−３、ガレクチン−１、およびガレクチン−９は、がんに関連がある。例えば、ガレクチン−３は、悪性形態への形質転換、転移、および増加した侵襲などの腫瘍形成における役割を果たす。したがって、本開示の一実施形態は、ガレクチン−３を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−３を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−３をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−３の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ガレクチン−３を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。さらに、ガレクチン−１は、がん進行において過剰発現される。ガレクチン−１は、細胞の接着、移動および浸潤、腫瘍によって誘導される血管新生、ならびにアポトーシスなどの様々なプロセスに関与する。したがって、本開示の一実施形態は、ガレクチン−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ガレクチン−１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ガレクチン−１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0099】

[0134]ジンクフィンガータンパク質ＳＮＡＩ１は、Ｓｎａｉｌとしても公知であり、これは、接着分子であるＥ−カドヘリンの抑制を促進する転写因子ファミリーの一部であるヒト転写因子である。ＳＮＡＩ１は、浸潤性腫瘍の上皮および内皮細胞で過剰発現される。ＳＮＡＩ１の発現は、転移、腫瘍再発、および予後不良に関連する。したがって、本開示の一実施形態は、ＳＮＡＩ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＳＮＡＩ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＳＮＡＫＩ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＳＮＡＩ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＳＮＡＩ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0100】

[0135]ジンクフィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１）は、がんの侵襲および転移の発展に寄与するヒトタンパク質である。ＺＥＢ１は、上皮遺伝子、例えばＥ−カドヘリンおよびマイクロＲＮＡのｍｉＲ−２００ファミリーの下方調節におけるその重要な役割のために、上皮間葉転換（ＥＭＴ）およびがん進行の駆動体として作用する。したがって、本開示の一実施形態は、ＺＥＢ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＺＥＢ１を標的化する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＺＥＢ１をコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＺＥＢ１の発現をサイレンシングする、不活性化する、下方調節する、阻害する、または低減する。一部の実施形態において、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法は、ＺＥＢ１を標的化する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与するステップを含む。

【0101】

[0136]本開示の一実施形態は、抗体またはその抗原結合フラグメントおよびｍｉＲＮＡを含むコンジュゲートを提供する。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、真核生物の様々な種にわたり高度に保存された内因性の小さい非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、主として配列特異的な方式でそれらの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的化することによって、無数のタンパク質をコードする転写物の細胞での翻訳および安定性を抑える。このｍｉＲＮＡによる遺伝子発現の選択的なサイレンシングは、ヒトの健康および疾患に深い影響を有することが予想される。ヒトにおいて、２５００種を超えるｍｉＲＮＡが公知である。（例えば、ｍｉＲＢａｓｅを参照：ディープシーケンシングデータを使用して高信頼度のマイクロＲＮＡに注釈を付ける）。ｍｉＲＮＡ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって一次ｍｉＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ）として優勢に転写され、これは、核中で、マイクロプロセッサー複合体（ドローシャおよびＤＧＣＲ８（ディジョージ症候群重要領域８）で構成される）によって前駆ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）にプロセシングされる。その後、プレｍｉＲＮＡは、エクスポーチン−５−Ｒａｎ−ＧＴＰ複合体によって細胞質に運び出され、そこでダイサー１は、プレｍｉＲＮＡのヘアピンループを切断し、ＴＡＲＢＰ２（ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質２）は、アルゴノートタンパク質ＡＧＯ２上へのＲＮＡ二重鎖のローディングを容易にする。アンチセンス鎖（成熟）がＡＧＯ２によって保持され、センス鎖が分解されることによって、サイレンシング複合体が形成される。さらなる研究において、非正規のｍｉＲＮＡ生物発生も報告されている。（例えば、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｈａ Ｍ．Ｋｉｍ ＶＮ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４年８月；１５（８）：５０９〜２４．を参照）。

【0102】

[0137]ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子が転写されて、プレｍｉＲＮＡとして公知のｍｉＲＮＡ前駆体の産生をもたらすことができる。プレｍｉＲＮＡは、複数のプレｍｉＲＮＡを含む多シストロン性ＲＮＡの一部であってもよい。プレｍｉＲＮＡは、ステムおよびループを有するヘアピンを形成することができる。プレｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼであるドローシャによって認識することができる。ドローシャは、プレｍｉＲＮＡ中の末端ループを認識し、およそ２つのヘリカルターンをステムに切断して、プレｍｉＲＮＡとして公知の６０〜７０ｎｔの前駆体を産生することができる。ドローシャは、ＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的な互い違いの切断でプリｍｉＲＮＡを切断して、５’リン酸と約２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有するプレｍｉＲＮＡステムループを生じさせることができる。ドローシャ切断部位を超えて伸長するステムのおよそ１つのヘリカルターン（約１０ヌクレオチド）は、効率的なプロセシングに必須であり得る。次いでプレｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび輸送受容体であるエクスポーチン（Ｅｘ−ｐｏｒｔｉｎ）−５によって、核から細胞質に活発に輸送され得る。プレｍｉＲＮＡは、同様にＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼであるダイサーによって認識される場合もある。ダイサーは、プレｍｉＲＮＡの二本鎖ステムを認識することができる。またダイサーは、ステムループの塩基における５’リン酸および３’オーバーハングも認識することができる。ダイサーは、ステムループの塩基から末端ループである２つのヘリカルターンを切り離して、追加の５’リン酸および約２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを残すことができる。得られたｓｉＲＮＡ様の二重鎖は、ミスマッチを含む可能性があり、成熟ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^＊として公知の類似のサイズを有するフラグメントを含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^＊は、プレｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡの対立するアーム由来であってもよい。ｍｉＲＮＡ^＊配列は、クローニングしたｍｉＲＮＡのライブラリーで見出すことができるが、典型的にはｍｉＲＮＡより低い頻度である。ｍｉＲＮＡは、最初のうちはｍｉＲＮＡ^＊との二本鎖種として存在するが、最終的にはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のリボ核タンパク質複合体に一本鎖ＲＮＡとして取り込まれることになり得る。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、それにより、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑えるまたは活性化する）、およびｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のどの鎖をＲＩＳＣにローディングするのかということに可変性をもたらすことができる。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣにローディングされる場合、ｍｉＲＮＡ^＊は、除去され分解されてもよい。ＲＩＳＣにローディングされるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖の鎖は、その５’末端がそれほど強く対合していない鎖であり得る。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊の両方の末端が概ね等しい５’対合を有する場合において、両方のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^＊が、遺伝子サイレンシング活性を有する可能性がある。

【0103】

[0138]ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高いレベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡの２〜８ヌクレオチドにより、標的核酸を同定することができる。多数の研究が、翻訳の効率的な阻害を達成するための、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対合の必要条件を調べてきた。哺乳類細胞において、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要であり得る。しかしながら、マイクロＲＮＡの他の部分も、ｍＲＮＡ結合に参加している可能性がある。さらに、３’における十分な塩基対合は、５’における不十分な対合を補うことができる。全ゲノムにおけるｍｉＲＮＡ結合を分析するコンピューター使用の研究は、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’における塩基２〜７に関する具体的な役割を示唆しているが、通常「Ａ」であることが見出されている第１のヌクレオチドが役割を有することも認められた。ｍＲＮＡにおける標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域中に存在し得る。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが、同じまたは複数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節する可能性がある。ほとんどの遺伝学的に同定された標的における複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在が、複数のＲＩＳＣの協同的な作用が、最も効率的な翻訳阻害を提供することを示し得る。

【0104】

[0139]ｍｉＲＮＡは、２つのメカニズム：ｍＲＮＡ切断または翻訳抑制のいずれかによって遺伝子発現を下方調節するようにＲＩＳＣに指示することができる。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して特定の程度の相補性を有する場合、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断を指定することができる。ｍｉＲＮＡが切断をガイドする場合、ｍｉＲＮＡの残基１０および１１に対合するヌクレオチドの間で切断がなされ得る。代わりに、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有さない場合、ｍｉＲＮＡは、翻訳を抑えることができる。翻訳抑制は、動物でより普及している場合があり、これは、動物が、ｍｉＲＮＡと結合部位との間における比較的低い程度の相補性を有し得るためである。

【0105】

[0140]ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^＊のあらゆる対の５’および３’末端において可変性が存在し得ることに留意されたい。この可変性は、切断部位に関するドローシャおよびダイサーの酵素的なプロセシングにおける可変性に起因する可能性がある。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^＊の５’および３’末端における可変性はまた、プリｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因する可能性もある。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団を生じる可能性がある。またステム構造における可変性は、ドローシャおよびダイサーによる切断生成物における可変性を生じる可能性もある。

【0106】

[0141]一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は、１３〜３３、１８〜２４または２１〜２３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、成熟ｍｉＲＮＡの配列は、プレｍｉＲＮＡの１３〜３３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡの配列は、プレｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３ヌクレオチドを含む。

【0107】

[0142]一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は、例えば、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ^＊に結合することによって（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡサイレンシング）、または標的結合部位に結合することによってｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ^＊の活性をブロックすることが可能な抗ｍｉＲＮＡである。抗ｍｉＲＮＡは、合計５〜１００または１０〜６０ヌクレオチドを含んでいてもよい。抗ｍｉＲＮＡはまた、合計少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドを含んでいてもよい。抗ｍｉＲＮＡの配列は、（ａ）ｍｉＲＮＡに結合し、その活性を抑える目的のために、ｍｉＲＮＡの５’に実質的に相補的な少なくとも５ヌクレオチド、およびｍｉＲＮＡの５’末端からの標的部位の隣接領域に実質的に同一な少なくとも５〜１２ヌクレオチド；または（ｂ）ｍｉＲＮＡのその標的に結合する能力を阻害する目的のために、ｍｉＲＮＡの３’に実質的に同一な少なくとも５〜１２ヌクレオチド、およびｍｉＲＮＡの３’末端からの標的部位の隣接領域に実質的に相補的な少なくとも５ヌクレオチドを含んでいてもよい。

【0108】

[0143]核酸はまた、標的ｍｉＲＮＡ結合部位の配列またはそのバリアントを含んでいてもよい。標的部位の配列は、合計５〜１００または１０〜６０ヌクレオチドを含んでいてもよい。標的部位の配列はまた、合計少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２または６３ヌクレオチドを含んでいてもよい。がんとの関与が示されており、本開示の一部の実施形態において抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる例示的なｍｉＲＮＡを、以下の表１にその標的と共に列挙する。

【0109】

[0144]

【0110】

【表1-1】

【0111】

【表1-2】

【0112】

[0145]本開示の一部の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントおよびｍＲＮＡを含むコンジュゲートが提供される。近年、インビトロで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは、遺伝情報を送達するための見込みのある新しい薬物クラスとして注目を集めている。このような合成ｍＲＮＡは、構造的に似た天然ｍＲＮＡによってタンパク質を一時的に発現するように操作されていてもよい。ｍＲＮＡベースのがん免疫療法および感染性疾患ワクチンは、臨床開発に入っている。新興の新規アプローチとしては、タンパク質を置き換えるかまたは補充するためのＩＶＴ ｍＲＮＡのインビボでの送達、多能性幹細胞のＩＶＴ ｍＲＮＡベースの生成、およびＩＶＴ ｍＲＮＡによってコードされたデザイナーヌクレアーゼを使用するゲノム工学が挙げられる。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、一部の実施形態において、がん疾患の処置または防止（予防）のための、療法または接種、例えばワクチン接種のために使用される。ワクチン接種は、一部の例において、腫瘍の抗原（または数種の抗原）を、抗原をコードするｍＲＮＡの形態で生物に導入することに基づく。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、（腫瘍）抗原に翻訳され、改変されたｍＲＮＡによってコードされたポリペプチドまたは抗原性ペプチドが発現され、その結果として、ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドに対して向けられた免疫応答が刺激される。一部の実施形態において、このようながん抗原をコードするｍＲＮＡをコンジュゲート内で使用することは、免疫応答を惹起する。この手段によって、がん抗原は生物中で発現され、その結果として、効果的にがん細胞に対して向けられた免疫応答が引き起こされる。腫瘍抗原の非限定的な例は、とりわけ、７０７−ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２およびＷＴ１である。

【0113】

[0146]一部の実施形態において、コンジュゲートは、例示的な経路を標的化する。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、個別化されたがんワクチンである。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、少なくとも１つの患者に特異的な新抗原に翻訳される。一部の実施形態において、少なくとも１つの患者に特異的な新抗原は、患者の特異的な腫瘍中に存在する。一部の実施形態において、少なくとも１つの患者に特異的な新抗原は、腫瘍エキソームを分析することによって同定される。一部の実施形態において、患者に特異的な新抗原は、腫瘍細胞をよりよく標的化し消滅させるために、患者の免疫系を活性化する。

【0114】

[0147]一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、免疫系を活性化する、ブーストする、および／または強化するがんワクチンである。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、Ｔ細胞の機能および／または生存を強化するがんワクチンである。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、インビボでＴ細胞の数を増加させるがんワクチンである。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）に翻訳される。ＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞の分裂および生存を促進する。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＩＬ−１２に翻訳される。ＩＬ−１２は、抗原性の刺激に応答して、樹状細胞、マクロファージ、および好中球によって産生されるサイトカインである。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞の成長および機能を刺激するＴ細胞刺激因子である。ＩＬ−１２はまた、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化にも関与する。他の共刺激分子としては、これらに限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２５、ＣＤ８３、およびｐ５５が挙げられる。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＣＤ２８に翻訳される。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＣＤ５８に翻訳される。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＣＤ５４に翻訳される。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＣＤ８０に翻訳される。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＣＤ８６に翻訳される。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＣＤ２５に翻訳される。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ＣＤ８３に翻訳される。一部の実施形態において、コンジュゲートのｍＲＮＡは、ｐ５５に翻訳される。

【0115】

[0148]一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、細胞療法で、またはそれと組み合わせて使用される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、患者由来の免疫細胞、例えば、これに限定されないが樹状細胞の、インビトロにおけるトランスフェクションで使用される。一部の実施形態において、操作された患者由来の細胞は、患者に注入し戻される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、腫瘍関連抗原に翻訳され、患者由来の免疫細胞（例えば、患者由来の樹状細胞）によって発現される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートの患者由来の細胞への投与は、患者由来の樹状細胞上へのＴＡＡ由来ペプチドの提示をもたらす。一部の実施形態において、操作された患者由来の細胞が一旦患者に注入され戻されたら、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートの患者由来の細胞への投与は、インビボにおける抗原特異的なＴ細胞の活性化をもたらす。一部の実施形態において、患者由来の免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、インビトロにおける患者由来のＴ細胞のトランスフェクションで使用される。一部の実施形態において、患者由来のＴ細胞は、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートでの処置の後、腫瘍上で発現される特異的な抗原を直接認識することができる。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、患者由来のＴ細胞上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に翻訳される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むコンジュゲートは、ＣＡＲ−Ｔ細胞と組み合わせて使用される。

【0116】

[0149]本明細書で提供される抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば抗体−ＲＮＡコンジュゲート、抗体−ＤＮＡコンジュゲート、抗体−アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート）は、一部の場合、少なくとも約４０％から約１００％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％のノックダウン率を達成することができる。

【0117】

ＩＩＩ．標的化タンパク質およびオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲート
[0150]一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含むコンジュゲートを提供する。本発明の開示の状況において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの様々な特徴が本明細書に記載される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの機能特性を説明する場合、このような特性も、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含むコンジュゲートを説明するのに使用できることに留意されたい。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの機能的または構造的な特性のあらゆる説明は、特定の実施形態において、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含む、本開示のアンチセンスコンジュゲートを説明するのに使用される。

【0118】

[0151]一部の例において、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートも含めて、ＤＮＡにハイブリダイズする。一部の例において、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートも含めて、ＲＮＡにハイブリダイズする。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド（コンジュゲートの一部として存在する場合も含めて）は、ＲＮＡ転写物の３’ＵＴＲ、例えば３’ＵＴＲにおける１つまたは複数のＣＵＧリピートにハイブリダイズする。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド（コンジュゲートの一部として存在する場合も含めて）は、転写物のコード配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写物に、例えば、転写物の３’ＵＴＲに選択的に結合する。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、拡張されたＣＵＧリピート（＞５０のＣＵＧリピート）を有する転写物に選択的に結合する。

【0119】

[0152]理論に縛られることはないが、アンチセンス分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の、ＲＮＡ分子、例えばＣＵＧ拡張ＲＮＡ分子との特異的なハイブリダイゼーションは、ＲＮＡのプロセシングを変更するか、またはＲＮＡと別のタンパク質または核酸分子との物理的および／または化学的な相互作用を変更する可能性がある。例えば、本発明の開示のアンチセンス分子のＣＵＧ拡張ＲＮＡとの特異的なハイブリダイゼーションは、ＲＮＡの分解、例えば、ＲＮアーゼＨによって媒介される分解による、ＲＮＡのスプライシングパターンなどを変更する可能性があり、またはタンパク質または核酸がＲＮＡに結合することを防ぐ可能性があり、またはＣＵＧ拡張ＲＮＡに結合した核酸またはタンパク質を解放する可能性がある。

【0120】

[0153]一部の実施形態において、アンチセンス分子は、開始コドン（ＲＮＡではＡＵＧおよびＤＮＡではＡＴＧ）または停止コドン（ＲＮＡではＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡ、ならびにＤＮＡではＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ）を含む領域を標的化する。一部の実施形態において、アンチセンス分子は、開始または停止コドンの５０ヌクレオチド以内の領域を標的化する。一部の実施形態において、アンチセンス分子は、ＣＵＧ拡張ＤＮＡまたはＲＮＡのＯＲＦなどの、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部を含む領域を標的化する。ＯＲＦは、開始コドンと停止コドンとの間のＲＮＡの領域を含む。一部の実施形態において、アンチセンス分子は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのコード領域（すなわち、エクソン）および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡの非コード領域（すなわち、イントロン）に結合する。一部の実施形態において、アンチセンス分子は、スプライシングシグナルに、例えばイントロン−エクソンジャンクションに結合する。前述のもののいずれかの特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型および／またはＣＵＧ拡張されたＲＮＡにハイブリダイズする。

【0121】

[0154]一部の実施形態において、アンチセンス分子は、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含むＲＮＡの領域を標的化する。５’ＵＴＲは、非翻訳配列を含み、非翻訳配列としては、例えば、調節配列（例えば、鉄応答エレメント配列、イントロンまたはリボスイッチ）、５’メチルグアニル酸キャップ、またはそれらの組合せが挙げられる。３’ＵＴＲは、ポリアデニル化シグナル、タンパク質のための結合配列（例えばＳＥＣＩＳエレメントまたはＡＵリッチエレメント）、またはｍｉＲＮＡのための結合配列などの配列を含み得る。

【0122】

[0155]一部の実施形態において、アンチセンス分子は、アンチセンス分子がＲＮＡの別のタンパク質に結合することを防ぐようにして、ＲＮＡ、例えばＣＵＧ拡張ＲＮＡにハイブリダイズする。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡがタンパク質に結合できないようにして、ＲＮＡにハイブリダイズすることができる。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ分子上の同じ結合部位について、例えば、「ＹＧＣＹ」モチーフ（式中、「Ｙ」はピリミジンである）について、タンパク質と競合してもよい（Ｇｏｅｒｓ，Ｅ Ｓ、２０１０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３８（７）：２４６７〜８４）。

【0123】

[0156]特定の実施形態において、アンチセンス分子は、過量（＞５０）のＣＵＧまたはＣＣＵＧリピートを有するＲＮＡ分子にハイブリダイズする。例えば、アンチセンス分子は、過量のＣＵＧまたはＣＣＵＧリピートを有するＣＵＧ拡張された（例えば、突然変異）ＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態において、アンチセンス分子は、ＣＵＧリピート、ＣＡＧリピート、ＣＣＵＧ、ＣＣＧまたはＣＧＧリピートの１つまたは複数にハイブリダイズする。

【0124】

[0157]本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の１つまたは複数の領域を介してＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズする。「相補的」は、２つのヌクレオチド間、例えば、アデニンとチミンとの間、アデニンとウラシルとの間、およびグアニンとシトシンとの間で特異的に対合する能力である。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子とハイブリダイズするために、必ずしもその標的核酸のオリゴヌクレオチドに１００％相補的でなくてもよい。アンチセンス化合物は、そのＤＮＡ分子の転写に干渉する程度に標的分子に結合する場合、標的ＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが可能である。アンチセンス化合物は、細胞におけるＲＮＡ分子の既存の状態を変更する程度にＲＮＡ分子に結合する場合、標的ＲＮＡ分子、例えば突然変異ＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である。例えば、アンチセンス化合物は、ＲＮアーゼＨなどの酵素によってＲＮＡ分子の分解を引き起こす程度に、もしくはＲＮＡ分子のスプライシングを変更する（すなわち、誘導または阻害する）程度にＲＮＡ分子に結合するか、またはタンパク質または核酸のＲＮＡ分子への結合を防ぐように、ＲＮＡ分子と相互作用するか、またはそれまでＲＮＡ分子に結合していたタンパク質を解放するように、ＲＮＡ分子と相互作用する場合、標的ＲＮＡ分子、例えば、突然変異ＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である。

【0125】

[0158]一部の実施形態において、アンチセンス分子（例えば、アンチセンスコンジュゲートのアンチセンスオリゴヌクレオチド部分）は、８〜５０ヌクレオチドの長さである。他の実施形態において、アンチセンス分子は、１２〜３５ヌクレオチドの長さである。他の実施形態において、アンチセンス分子は、１２〜３０ヌクレオチドの長さである。他の実施形態において、アンチセンス分子は、１４〜２５ヌクレオチドの長さである。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜３０、１４〜２５、１４〜２０、１４〜１８、１４〜１７、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、１５〜１８、１６〜３０、１６〜２５、１６〜２０、１６〜１８、１７〜３０、１７〜２５、１７〜２０、または１７〜１８ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、６５℃での少なくとも約０．２×ＳＳＣのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ転写物（コードまたは非コード領域）にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

【0126】

[0159]一部の実施形態において、本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド、は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはそれらの模倣体、または前述のもののいずれかの組合せのオリゴマーまたはポリマーである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合のヌクレオシド間の（バックボーン）連結で構成されるオリゴヌクレオチドに加えて、天然に存在しない核酸塩基、糖および共有結合のヌクレオシド間の（バックボーン）連結を有するオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。アンチセンス分子の天然に存在しない部分は、一部の場合、これらの部分は、アンチセンス分子に、例えば核酸標的に対する強化された親和性およびヌクレアーゼの存在下における増加した安定性などの所望の特性を与えることができるために使用される。

【0127】

[0160]一部の場合、本開示の核酸／アンチセンスオリゴヌクレオチド、改変された核酸／改変されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。ヌクレオシドは、例えば、塩基−糖の組合せである。一部の場合、ヌクレオシドの塩基部分は、複素環塩基、例えば、プリンまたはピリミジン塩基である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル成分のいずれかに連結され得る。オリゴヌクレオチドを形成することにおいて、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合で連結して、直鎖状のポリマー性化合物を形成する。順にこの直鎖状ポリマー性構造のそれぞれの末端がさらに合体して、環状構造を形成することができる。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間のバックボーンを形成すると言及される。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な連結またはバックボーンは、３’から５’のホスホジエステル結合である。

【0128】

[0161]一部の実施形態において、本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変されたバックボーンまたは非天然のヌクレオシド間の連結を含有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、改変されたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドとしては、バックボーン中にリン原子を保持するものが挙げられる。他の実施形態において、改変されたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドとしては、バックボーン中にリン原子を有さないものが挙げられる。

【0129】

[0162]一部の実施形態において、リン原子を含まない改変されたオリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間の連結、混成のヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間の連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間の連結によって形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ連結（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサンバックボーン；硫化物、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケンを含有するバックボーン；スルファミン酸バックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホン酸およびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；ならびに混成のＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。

【0130】

[0163]本発明の開示の一部の実施形態において、核酸のオリゴヌクレオチドバックボーン、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドバックボーンは、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のホスホン酸アルキル、例えば、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、正常な３’−５’連結を有する、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’連結された類似体、ならびに１つまたは複数のインターヌクレオチド結合が３’から３’、５’から５’または２’から２’の連結である、逆転した極性を有するものを含む。

【0131】

[0164]一部の実施形態において、改変されたオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間の連結の両方、すなわちバックボーンは、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物は、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体であり、これは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンが、アミドを含有するバックボーン、特定にはアミノエチルグリシンバックボーンで置き換えられる。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。

【0132】

[0165]本発明の開示の一部の実施形態において、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチド、ならびにヘテロ原子バックボーン、例えば−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして公知］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、天然のリン酸ジエステルバックボーンは、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および好適なアミドバックボーン、またはモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオシドを含むコンジュゲートが提供される。

【0133】

[0166]改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換された糖成分を含有していてもよい。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’位に、以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’位に、以下：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的な特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基のうち１つを含む。一部の実施形態としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥまたは２’−ジメチルアミノエトキシエトキシとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（当技術分野では２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２を含むアンチセンス分子が挙げられる。

【0134】

[0167]一部の実施形態において、本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アルコキシアルコキシ基、例えば、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知）を含む（例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４を参照）。一実施形態において、本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−ＭＯＥを含む。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１〜１０個のＭＯＥヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２〜７個のＭＯＥヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３〜６個のＭＯＥヌクレオチドを含む。

【0135】

[0168]一部の実施形態において、本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、制限されたフラノース環コンフォメーションを有するヌクレオチド類似体、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡにおいて、２’−ヒドロキシル基は、糖環の３’または４’炭素原子に連結され、それによって二環式糖成分が形成される。一部の実施形態において、ＬＮＡにおける連結は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（ｍｅｔｈｅｌｙｎｅ）（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中ｎは、１または２である。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１〜１０個のＬＮＡヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンス分子は、２〜７個のＬＮＡヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンス分子は、３〜６個のＬＮＡヌクレオチドを含む。

【0136】

[0169]本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の実施形態において、アンチセンス分子への改変としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−改変は、アラビノ（上）の位置またはリボ（下）の位置にあってもよい。２’−アラビノ改変の例は、２’−Ｆである。類似の改変はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置になされてもよく、特定には、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位に、または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中に、５’末端ヌクレオチドの５’位になされてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、糖模倣体を有していてもよく、例えばペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル成分を有していてもよい。

【0137】

[0170]本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）の改変または置換を含んでいてもよい。「改変されていない」または「天然」核酸塩基としては、本明細書で使用される場合、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。改変された核酸塩基としては、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよびアデニン、ならびにグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニン、ならびにグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる改変された核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。改変された核酸塩基としてはまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられたもの、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも挙げることができる。一部の例において、核酸塩基としては、例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンなどが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸の二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている。

【0138】

[0171]ＤＮＡおよびＡＳＯをコンジュゲートするためのプロトコールは、一部の実施形態において、配列内において３’／５’以外で終結する核酸塩基を含むことを除いて、二本鎖オリゴヌクレオチドと同様である。あらゆる核酸塩基のリン酸基は、ホモまたはヘテロ官能性のリンカー／スペーサーでの官能化に好適なコンジュゲーションハンドルで改変されていてもよい。一般的な安定化は、ホスフェートからホスホチオエートへのホスホチオエート化（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ）を介してなされ得る。チオエーテルは、活性化されたエステル、アジド、アルキンまたは付加環化基などの、末端コンジュゲーショングループを取り付けるのに好適な官能性を有し得る。環状オリゴヌクレオチドは、環状オリゴヌクレオチド上の環化点に取り付けられたコンジュゲーションハンドルと共に含まれていてもよい。官能化および目的のタンパク質へのコンジュゲーションは、本明細書に記載の他のリンカー−オリゴヌクレオチドの場合と同じであってもよい。

【0139】

[0172]必ずしも所与の化合物における全ての位置で均一に改変されていなくてもよく、実際には、前述の改変の１つより多くが、単一の化合物中に取り込まれていてもよいし、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに取り込まれていてもよい。本発明の開示はまた、キメラ化合物であるアンチセンスオリゴヌクレオチドも含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本開示の状況において、それぞれ、少なくとも１つの単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合ではヌクレオチドで構成されている、２またはそれより多くの化学的に別個の領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞内取り込み、および／または標的核酸に対する増加した結合親和性がオリゴヌクレオチドに付与されるように、オリゴヌクレオチドが改変されている少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素の基質として役立つ可能性がある。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。それゆえにＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく強化する。結果として、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、より短いオリゴヌクレオチドを用いて、しばしば同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して同等の結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要に応じて当技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出することができる。

【0140】

[0173]本開示のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述したような、２つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成することができる。このような化合物は、ハイブリッドまたはギャップマーとも称される。

【0141】

[0174]「ギャップマー」は、一部の場合において、オリゴマー化合物であり、一般的に、非デオキシオリゴヌクレオチドセグメントが隣接する２’−デオキシオリゴヌクレオチド領域を有するオリゴヌクレオチドである。中央の領域は、「ギャップ」と称される。隣接するセグメントは、「ウィング」と称される。理論に拘束されることは望まないが、ギャップマーのギャップは、ＲＮＡ標的に結合すると、ＲＮアーゼＨによって認識できる基質を呈示し、それに対してウィングはこのような基質を提供しないが、二重鎖安定性または有利な薬物動態学的作用に寄与する特性などの他の特性を付与することができる。各ウィングは、１つまたは複数の非デオキシオリゴヌクレオチド単量体であってもよい（ウィングの１つが、ゼロ個の非デオキシオリゴヌクレオチド単量体を有する場合、「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）」が記載される）。一実施形態において、ギャップマーは、５個の非デオキシリボヌクレオチドウィングが隣接する１０個のデオキシリボヌクレオチドギャップである。これは、５−１０−５ギャップマーと称される。他の実施形態において、ギャップマーは、３個の非デオキシリボヌクレオチドウィングが隣接する８個のデオキシリボヌクレオチドギャップである。これは、３−８−３ギャップマーと称される。他の実施形態において、ギャップマーは、３個の非デオキシリボヌクレオチドウィングが隣接する１０個のデオキシリボヌクレオチドギャップである。これは、３−１０−３ギャップマーと称される。他の立体配置、例えば３−７−３ギャップマーなどは、当業者により容易に認識される。

【0142】

[0175]一部の実施形態において、上述したギャップマーは、ＬＮＡおよびＭＯＥヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ギャップマーは、１〜１０個のＬＮＡおよび／またはＭＯＥヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ギャップマーは、２〜７個のＬＮＡおよび／またはＭＯＥヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ギャップマーは、３〜６個のＭＯＥおよび／またはＬＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、リボヌクレオチドの隣接するブロックは、ＬＮＡおよび／またはＭＯＥヌクレオチドを含む。

【0143】

[0176]一部の実施形態において、上述されるギャップマーは、標的ＲＮＡヌクレオチド、例えば、突然変異ＤＭＰＫ ＲＮＡ分子のＲＮアーゼＨ分解を誘導する。他の実施形態において、ギャップマーは、ＲＮアーゼＨとは無関係の経路によって、標的ＲＮＡヌクレオチド、例えば、突然変異ＤＭＰＫ ＲＮＡ分子の分解を誘導する。一部の実施形態において、ギャップマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列への、例えば突然変異ＲＮＡへのタンパク質の結合を防止する。一部の実施形態において、ギャップマーは、標的ＲＮＡ分子、例えば、突然変異ＲＮＡの分解を誘導し、さらに、空間配置的に、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ配列への、例えば突然変異ＲＮＡへのタンパク質の結合も阻害する。

【0144】

[0177]一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子中の拡張されたＣＵＧリピートに結合するギャップマーである。一部の実施形態において、ギャップマーは、突然変異ＲＮＡ配列中のＣＵＧリピートに結合する。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、空間配置的にタンパク質または核酸の標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列への結合をブロックするモルホリノ分子である。一部の実施形態において、モルホリノもまた、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の分解のきっかけとなる。一部の実施形態において、モルホリノ分子は、突然変異ＲＮＡに結合し、タンパク質のＲＮＡ分子への結合を防止する。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子への結合が防止されるタンパク質は、他のＲＮＡ分子基質への結合は自由である。一部の実施形態において、モルホリノ分子は、２０〜３０個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、モルホリノ分子は、２３〜２７個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、モルホリノ分子は、２５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、モルホリノは、ＲＮＡ分子中のＣＵＧリピートと結合する。一部の実施形態において、モルホリノは、突然変異ＲＮＡ配列中のＣＵＧリピートに結合する。

【0145】

[0178]一部の実施形態において、本発明の開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）および／またはホスホロチオエート改変を含む分子であって、ＲＮＡ分子、例えば、突然変異ＲＮＡの分解を特異的に開始させる分子である。一部の実施形態において、これらの分子は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）およびホスホロチオエート改変を含む。一部の実施形態において、これらの分子は、ＲＮアーゼＨによって媒介される分解の手段によってまたはＲＮアーゼＨ分解以外の手段によって、標的ＲＮＡ配列、例えば、突然変異ＲＮＡの分解を誘導する。

【0146】

[0179]前述したことの全てに関して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的へのハイブリダイゼーション後のＲＮアーゼＨによって媒介される分解を促進することが理解されるものとする。しかしながら、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドにとってさえも、このような能力は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが機能する唯一のメカニズムであることを意味しないかまたは示唆しない。

【0147】

ＩＶ．標的化タンパク質としてのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質
[0180]一部の実施形態において、コンジュゲートは、標的化タンパク質、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲートとして、ＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質を含む。ＴＭ４ＳＦ１は、テトラスパニン形態を有するが相同性を有さない小さい原形質膜糖タンパク質である（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５０３５．１）（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：１５９４〜１６００、２０００）。これは、原形質膜上にＴＭ４ＳＦ１濃縮ドメイン（ＴＭＥＤ）を形成し、この場合、真のテトラスパニンのように、機能的に関連する膜およびサイトゾル分子を補充する分子促進剤として役立ち（Ｓｈｉｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９：３２７２〜３２７７、２００９；Ｚｕｋａｕｓｋａｓら、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．１４：３４５〜３５４、２０１１）、がん細胞増殖（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：３９１７〜３９２３、１９８６）、運動性（Ｃｈａｎｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１１６：２４３〜２５２、２００５）、および転移（Ｒｉｃｈｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９１６ｓ〜５９２０ｓ、１９９５）において重要な役割を果たす。ヒトＴＭ４ＳＦ１タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５０３５．１）は、以下に配列番号９１として示される。
ＭＣＹＧＫＣＡＲＣＩ ＧＨＳＬＶＧＬＡＬＬ ＣＩＡＡＮＩＬＬＹＦ ＰＮＧＥＴＫＹＡＳＥ ＮＨＬＳＲＦＶＷＦＦ ＳＧＩＶＧＧＧＬＬＭ ＬＬＰＡＦＶＦＩＧＬ ＥＱＤＤＣＣＧＣＣＧ ＨＥＮＣＧＫＲＣＡＭ ＬＳＳＶＬＡＡＬＩＧ ＩＡＧＳＧＹＣＶＩＶ ＡＡＬＧＬＡＥＧＰＬＣＬＤＳＬＧＱＷＮＹＴＦＡＳＴＥＧＱＹＬＬＤＴＳＴＷＳＥＣＴＥＰＫＨＩＶＥＷＮＶＳＬＦＳＩＬＬＡＬＧ ＧＩＥＦＩＬＣＬＩＱＶＩＮＧＶＬＧＧＩＣ ＧＦＣＣＳＨＱＱＱＹ ＤＣ（配列番号９１）
[0181]本開示の一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ドメインに特異的である。ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ドメインのアミノ酸配列は、ＥＧＰＬＣＬＤＳＬＧＱＷＮＹＴＦＡＳＴＥＧＱＹＬＬＤＴＳＴＷＳＥＣＴＥＰＫＨＩＶＥＷＮＶＳＬＦＳ（配列番号９２）である。

【0148】

[0182]以下の表３に記載されるように、ＴＭ４ＳＦ１に特異的な抗体を含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。表３に記載される抗体は、モノクローナルマウス抗体８Ｇ４、ＡＧＸ−Ａ０３、ＡＧＸ−Ａ０４、ＡＧＸ−Ａ０５、ＡＧＸ−Ａ０７、ＡＧＸ−Ａ０８、ＡＧＸ−Ａ０９、およびＡＧＸ−Ａ１１であり、これらのそれぞれは、ＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２領域と結合することができる。

【0149】

[0183]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８７または８８に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号７３または７４に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むＩｇＧ重鎖定常領域を含む。

【0150】

[0184]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号８９に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0151】

[0185]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、または９２に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、または９２に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0152】

[0186]別の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、または９３に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、または９３に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の、または１００％同一の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。

【0153】

[0187]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６、１８、３０、４２、５４、６６、７８、または９４に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７、１９、３１、４３、５５、６７、７９、または９５に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８、２０、３２、４４、５６、６８、８０、または９６に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。

【0154】

[0188]一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４または９７に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３、２５、３７、４９、６１、７３、８５、または９８に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１４、２６、３８、５０、６２、７４、８６、または９９に、少なくとも約８０％から少なくとも約８５％、少なくとも約８５％から少なくとも約９０％、少なくとも約９０％から少なくとも約９１％、少なくとも約９１％から少なくとも約９２％、少なくとも約９２％から少なくとも約９３％、少なくとも約９３％から少なくとも約９４％、少なくとも約９４％から少なくとも約９５％、少なくとも約９５％から少なくとも約９６％、少なくとも約９６％から少なくとも約９７％、少なくとも約９７％から少なくとも約９８％、少なくとも約９８％から少なくとも約９９％、または少なくとも約９９％から１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0155】

[0189]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ−Ａ０３のアミノ酸配列は、表２に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号６、７、および８（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号１２、１３、および１４（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号６、７、および８のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１２、１３、および１４のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。ＡＧＸ−Ａ０３のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ−Ａ０３の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および９に記載される。

【0156】

[0190]マウスモノクローナル抗ＴＭ４ＳＦ１抗体ＡＧＸ−Ａ０４のアミノ酸配列は、表２に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号１８、１９、および２０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２４、２５、および２６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号１８、１９、および２０のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号２４、２５、および２６のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。ＡＧＸ−Ａ０４のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ−Ａ０４の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５および２１に記載される。

【0157】

[0191]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ−Ａ０５のアミノ酸配列は、表２に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号３０、３１、および３２（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号３６、３７、および３８（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号３０、３１、および３２のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号３６、３７、および３８のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。ＡＧＸ−Ａ０５のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ−Ａ０５の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７および３３に記載される。

【0158】

[0192]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ−Ａ０７のアミノ酸配列は、表２に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号４２、４３、および４４（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号４８、４９、および５０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号４２、４３、および４４のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号４８、４９、および５０のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。ＡＧＸ−Ａ０７のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ−Ａ０７の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３９および４５に記載される。

【0159】

[0193]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ−Ａ０８のアミノ酸配列は、表３に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号５４、５５、および５６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号６０、６１、および６２（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号５４、５５、および５６のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号６０、６１、および６２のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。ＡＧＸ−Ａ０８のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ−Ａ０８の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１および５７に記載される。

【0160】

[0194]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ−Ａ０９のアミノ酸配列は、表２に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号６６、６７、および６８（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号７２、７３、および７４（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号６６、６７、および６８のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号７２、７３、および７４のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。ＡＧＸ−Ａ０９のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ−Ａ０９の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６３および６９に記載される。

【0161】

[0195]マウスモノクローナル抗体ＡＧＸ−Ａ１１のアミノ酸配列は、表２に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号７８、７９、および８０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号８４、８５、および８６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号７８、７９、および８０のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む重鎖可変領域、および／または配列番号８４、８５、および８６２のアミノ酸配列に記載のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。ＡＧＸ−Ａ１１のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。さらに、ＡＧＸ−Ａ１１の重鎖可変アミノ酸配列および軽鎖可変アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７５および８１に記載される。

【0162】

[0196]モノクローナル抗体８Ｇ４のアミノ酸配列は、表３に記載される。具体的には、重鎖ＣＤＲ配列は、配列番号９４、９５、および９６（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載され、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号９７、９８、および９９（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に記載される。配列番号９４、９５、および９６のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号９７、９８、および９９のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。８Ｇ４のＣＤＲを含むヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、本開示に含まれる。

【0163】

[0197]一実施形態において、本開示は、配列番号３に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号９に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号２１に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号２７に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号３３に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号３９に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号４５に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号５１に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号５７に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号６３に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号６９に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号７５に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号８１に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号９２に記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメイン、および配列番号９３に記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。

【0164】

[0198]一実施形態において、本発明の開示は、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、または配列番号７５から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の重鎖可変ドメイン配列を有し；配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、または配列番号８１から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％同一の、少なくとも９７％同一の、少なくとも９８％同一の、少なくとも９９％同一の、または１００％同一の軽鎖可変ドメイン配列を有する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。

【0165】

[0199]一実施形態において、本開示は、ＩｇＧであり、それぞれ重鎖可変ドメインならびに重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む２つの重鎖と、それぞれ軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む２つの軽鎖とを包含する４つのポリペプチド鎖を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含むコンジュゲートを含む。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４である。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１である。他の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２である。重鎖および軽鎖可変ドメイン配列は、表２に記載のＣＤＲを含有していてもよい。

【0166】

[0200]相補性決定領域（ＣＤＲ）は、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において高度可変領域として公知である。それより高度に保存された可変ドメインの部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。所与の抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔら、上記；Ｌｅｆｒａｎｃら、上記および／またはＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、上記により説明されたシステムを使用して同定することができる。また、Ｋａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１〜３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｖａ．）に記載される番号付けシステムも当業者によく知られている。これに関して、Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能なＣＤＲの同定を含む可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。

【0167】

[0201]１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合または非共有結合のいずれかで分子に取り込むことで、それを抗原結合タンパク質にすることもできる。
[0202]抗原結合タンパク質は、ＣＤＲをより大きいポリペプチド鎖の一部として取り込んでいてもよいし、共有結合でＣＤＲが別のポリペプチド鎖に連結されていてもよいし、または非共有結合でＣＤＲを取り込んでいてもよい。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原に特異的に結合することを許容する。特にＣＤＲ３は、抗体または抗体フラグメントの抗原結合において重要な役割を果たすことがわかっている。

【0168】

[0203]一実施形態において、本開示は、配列番号８、配列番号２０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号５６、配列番号６８、配列番号８０、または配列番号９６のいずれか１つに記載のＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含み、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、配列番号７５、または配列番号９２のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１４、配列番号２６、配列番号３８、配列番号５０、配列番号６２、配列番号７４、配列番号８６、または配列番号９９のいずれか１つに記載のＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、または配列番号９３のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。したがって、特定の実施形態において、ＣＤＲ３ドメインは一定に保ちつつ、重鎖および／または軽鎖の残存するＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に可変性が導入されてもよく、一方で抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１に結合する能力を保持し、親の機能的特徴、例えば結合親和性を保持する。

【0169】

[0204]一実施形態において、本開示は、配列番号７、配列番号１９、配列番号３１、配列番号４３、配列番号５５、配列番号６７、配列番号７９、または配列番号９５のいずれか１つに記載のＣＤＲ２ドメインを含み、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、配列番号７５、または配列番号９２のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む重鎖を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１３、配列番号２５、配列番号３７、配列番号４９、配列番号６１、配列番号７３、配列番号８５、または配列番号９８のいずれか１つに記載のＣＤＲ２ドメインを含み、配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、または配列番号９３のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する軽鎖を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。したがって、特定の実施形態において、ＣＤＲ２ドメインは、一定を保ちながらも、可変性が、重鎖および／または軽鎖の残りのＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に導入されてもよく、同時に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１に結合する能力を保持し、親の機能的な特徴、例えば結合親和性を保持する。

【0170】

[0205]一実施形態において、本開示は、配列番号６、配列番号１８、配列番号３０、配列番号４２、配列番号５４、配列番号６６、配列番号７８、または配列番号９４のいずれか１つに記載のＣＤＲ１ドメインを含み、配列番号３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号３９、配列番号５１、配列番号６３、配列番号７５、または配列番号９２のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む重鎖を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６、配列番号４８、配列番号６０、配列番号７２、配列番号８４、または配列番号９７のいずれか１つに記載のＣＤＲ１ドメインを含み、配列番号９、配列番号２１、配列番号３３、配列番号４５、配列番号５７、配列番号６９、配列番号８１、または配列番号９３のいずれか１つに記載の配列に、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する軽鎖を含む抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。したがって、特定の実施形態において、ＣＤＲ１ドメインは一定に保ちつつ、重鎖および／または軽鎖の残存するＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に可変性が導入されてもよく、一方で抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１に結合する能力を保持し、親の機能的特徴、例えば結合親和性を保持する。

【0171】

[0206]また表２に記載される抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびフラグメントは、ヒト化されていてもよい。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当技術分野において公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト源からそれに導入される１つまたは複数のアミノ酸残基を有していてもよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と称されることが多く、これは、典型的には「インポート」可変ドメインから得られる。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜２７；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜３６の方法に従って、高度可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって実行することができる。

【0172】

[0207]一部の場合において、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティングによって構築され、この場合、親非ヒト抗体（例えば、げっ歯類）の６つのＣＤＲのアミノ酸配列が、ヒト抗体フレームワーク上にグラフト化される。例えば、Ｐａｄｌａｎらは、ＣＤＲ中の残基の約３分の１のみが実際に抗原と接触することを決定し、これらを「特異性決定残基」、またはＳＤＲと名付けた（Ｐａｄｌａｎら、１９９５、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３〜３９）。ＳＤＲグラフティングの技術において、ＳＤＲ残基のみが、ヒト抗体フレームワーク上にグラフト化される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５〜３４を参照）。

【0173】

[0208]ヒト化抗体の作製において使用される、ヒト可変ドメイン、軽鎖および重鎖の両方の選択は、抗原性を低減するのに重要であり得る。例えば、いわゆる「ベストフィット」方法に従って、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして選択され得る（Ｓｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６〜３０８；およびＣｈｏｔｈｉａら、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に使用される可能性がある（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５〜８９；およびＰｒｅｓｔａら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３〜３２）。一部の場合において、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスであるＶＬ６サブグループＩ（ＶＬ６Ｉ）およびＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列由来である。別の方法において、ヒト生殖細胞系遺伝子は、フレームワーク領域の源として使用される。

【0174】

[0209]さらに、一般的に、抗体が、その抗原に対する親和性や他の好都合な生物学的特性を保持しながらヒト化されることが望ましい。この目標を達成するために、１つの方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化された配列の３次元モデルを使用した親配列および様々な概念のヒト化生成物の分析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性がある３次元立体配座構造を例示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。そのようなものとしては、例えば、ＷＡＭ（ＷｈｉｔｅｌｅｇｇおよびＲｅｅｓ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：８１９〜２４）、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（ＳａｌｉおよびＢｌｕｎｄｅｌｌ、１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９〜８１５）、およびＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ、１９９７、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４〜２３）が挙げられる。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の可能性がある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を許容する。この方法では、ＦＲ残基は、所望の抗体の特徴、例えば標的抗原への親和性の増加が達成されるように、レシピエントおよびインポート配列から選択し組み合わせることができる。一般的に、高度可変領域残基は、直接的に、ほぼ実質的に、抗原結合への影響に関与する。

【0175】

[0210]ヒト化に使用可能なヒトフレームワーク領域としては、これらに限定されないが、「ベストフィット」方法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）２２９６を参照）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９（１９９２）４２８５；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１（１９９３）２６２３を参照）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ、およびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９〜１６３３を参照）；およびＦＲライブラリーをスクリーニングすることによって得られたフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）１０６７８〜１０６８４およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６）２２６１１〜２２６１８を参照）が挙げられる。

【0176】

[0211]ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ、およびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９〜１６３３で総論され、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３〜３２９；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９〜１００３３；米国特許第５，８２１，３３７号、７，５２７，７９１号、６，９８２，３２１号、および７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）２５〜３４（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを説明する）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１９９１）４８９〜４９８（「リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を説明する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）４３〜６０（「ＦＲシャッフリング」を説明する）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）６１〜６８およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３（２０００）２５２〜２６０（ＦＲシャッフリングへの「ガイド選択」アプローチを説明する）で説明される。

【0177】

[0212]一実施形態において、コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１×１０^−６Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＴＭ４ＳＦ１に結合する。
[0213]特定の実施形態において、コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定した場合、約５×１０^−８Ｍ以下のＫＤで、ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループ上のエピトープに結合する。

【0178】

[0214]特定の実施形態において、コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０^−８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。

【0179】

[0215]特定の実施形態において、コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１×１０^−３Ｍから約１×１０^−４Ｍ、約１ｘ１０^−４Ｍから約１ｘ１０^−５Ｍ、約１ｘ１０^−５Ｍから約１ｘ１０^−６Ｍ、約１ｘ１０^−６から約１ｘ１０^−７Ｍ、約１ｘ１０^−７から約１ｘ１０^−８Ｍ、約１ｘ１０^−８Ｍから約１ｘ１０^−９Ｍ、約１ｘ１０^−９Ｍから約１ｘ１０^−１０Ｍ、約１ｘ１０^−１０Ｍから約１ｘ１０^−１１Ｍ、約１ｘ１０^−１１Ｍから約１ｘ１０^−１２Ｍ、約２ｘ１０^−３Ｍから約２ｘ１０^−４Ｍ、約２ｘ１０^−４Ｍから約２ｘ１０^−５Ｍ、約２ｘ１０^−５Ｍから約２ｘ１０^−６Ｍ、約２ｘ１０^−６から約２ｘ１０^−７Ｍ、約２ｘ１０^−７から約２ｘ１０^−８Ｍ、約２ｘ１０^−８Ｍから約２ｘ１０^−９Ｍ、約２ｘ１０^−９Ｍから約２ｘ１０^−１０Ｍ、約２ｘ１０^−１０Ｍから約２ｘ１０^−１１Ｍ、約２ｘ１０^−１１Ｍから約２ｘ１０^−１２Ｍ、約３ｘ１０^−３Ｍから約３ｘ１０^−４Ｍ、約３ｘ１０^−４Ｍから約３ｘ１０^−５Ｍ、約３ｘ１０^−５Ｍから約３ｘ１０^−６Ｍ、約３ｘ１０^−６から約３ｘ１０^−７Ｍ、約３ｘ１０^−７から約３ｘ１０^−８Ｍ、約３ｘ１０^−８Ｍから約３ｘ１０^−９Ｍ、約３ｘ１０^−９Ｍから約３ｘ１０^−１０Ｍ、約３ｘ１０^−１０Ｍから約３ｘ１０^−１１Ｍ、約３ｘ１０^−１１Ｍから約３ｘ１０^−１２Ｍ、約４ｘ１０^−３Ｍから約４ｘ１０^−４Ｍ、約４ｘ１０^−４Ｍから約４ｘ１０^−５Ｍ、約４ｘ１０^−５Ｍから約４ｘ１０^−６Ｍ、約４ｘ１０^−６から約４ｘ１０^−７Ｍ、約４ｘ１０^−７から約４ｘ１０^−８Ｍ、約４ｘ１０^−８Ｍから約４ｘ１０^−９Ｍ、約４ｘ１０^−９Ｍから約４ｘ１０^−１０Ｍ、約４ｘ１０^−１０Ｍから約４ｘ１０^−１１Ｍ、約４ｘ１０^−１１Ｍから約４ｘ１０^−１２Ｍ、約５ｘ１０^−３Ｍから約５ｘ１０^−４Ｍ、約５ｘ１０^−４Ｍから約５ｘ１０^−５Ｍ、約５ｘ１０^−５Ｍから約５ｘ１０^−６Ｍ、約５ｘ１０^−６から約５ｘ１０^−７Ｍ、約５ｘ１０^−７から約５ｘ１０^−８Ｍ、約５ｘ１０^−８Ｍから約５ｘ１０^−９Ｍ、約５ｘ１０^−９Ｍから約５ｘ１０^−１０Ｍ、約５ｘ１０^−１０Ｍから約５ｘ１０^−１１Ｍ、約５ｘ１０^−１１Ｍから約５ｘ１０^−１２Ｍ、約５ｘ１０^−７Ｍから約５ｘ１０^−１１Ｍ、約５×１０^−７Ｍ、約１×１０^−７Ｍ、約５×１０^−８Ｍ、約１×１０^−８Ｍ、約５×１０^−９Ｍ、約１×１０^−９Ｍ、約５×１０^−１０Ｍ、約１×１０^−１０Ｍ、約５×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１１ＭのＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。一部の実施形態において、ＫＤは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定される。

【0180】

[0216]特定の実施形態において、コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約５×１０^−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。

【0181】

[0217]特定の実施形態において、コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＥＫ２９３過剰発現細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０^−６Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＴＭ４ＳＦ１に結合する。一実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、カニクイザルＴＭ４ＳＦ１を発現するようにトランスフェクトされている。さらなる実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、１０^６コピーの１８Ｓ ｒＲＮＡ当たり約６００のｍＲＮＡコピーで、カニクイザルＴＭ４ＳＦ１を発現する。

【0182】

[0218]抗体または抗体フラグメントのＫＤを決定する方法は、例えば、（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を、約１０反応単位（ＲＵ）での固定化した抗原またはＦｃ受容体ＣＭ５チップと共に、２５℃で使用して）抗原に対する抗体のＫＤを決定するのに使用することができる表面プラズモン共鳴が、あり得る。特定の実施形態において、ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーは、ＫＤを決定するのに使用され、ＴＭ４ＳＦ１を発現する細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＨＵＶＥＣ細胞は、抗体またはフラグメントに結合させて、標準的な方法に従ってＫＤを測定するのに使用される。フローサイトメトリーを使用する抗体の親和性決定は、例えば、Ｇｅｕｉｊｅｎら（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０２（１〜２）：６８〜７７に記載される。特定の実施形態において、ＦＡＣＳは、抗体の親和性を決定するのに使用される。

【0183】

[0219]一実施形態において、本開示は、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、表３に記載のＣＤＲアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一の（または少なくとも９６％同一の、または少なくとも９７％同一の、または少なくとも９８％同一の、または少なくとも９９％同一の）ＣＤＲのアミノ酸配列を含むような保存的アミノ酸置換を有する、本明細書に記載のＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換される置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないものである。２つまたはそれより多くのアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質のために補正されるように上方調整される場合がある。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１を参照されたい。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；（３）アミドを含有する側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄を含有する側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。

【0184】

[0220]本開示は、さらに、一部の実施形態において、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定した場合、約５×１０−８Ｍまたはそれ未満のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループ上のエピトープに結合する、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートであって、ヒトＩｇＧフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域を含み、ヒトＩｇＧフレームワーク領域を含む重鎖可変領域を含む、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、カニクイザルＴＭ４ＳＦ１と交差反応する。

【0185】

[0221]本開示の別の態様において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定した場合、約５×１０^−８Ｍ以下のＫＤで、ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループ上のエピトープに結合する、ヒト化された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントである。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＥＫ２９３過剰発現細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０^−６Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＴＭ４ＳＦ１に結合する。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約１×１０^−８Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、１ｘ１０^−３Ｍから約１ｘ１０^−４Ｍ、約１ｘ１０^−４Ｍから約１ｘ１０^−５Ｍ、約１ｘ１０^−５Ｍから約１ｘ１０^−６Ｍ、約１ｘ１０^−６から約１ｘ１０^−７Ｍ、約１ｘ１０^−７から約１ｘ１０^−８Ｍ、約１ｘ１０^−８Ｍから約１ｘ１０^−９Ｍ、約１ｘ１０^−９Ｍから約１ｘ１０^−１０Ｍ、約１ｘ１０^−１０Ｍから約１ｘ１０^−１１Ｍ、約１ｘ１０^−１１Ｍから約１ｘ１０^−１２Ｍ、約２ｘ１０^−３Ｍから約２ｘ１０^−４Ｍ、約２ｘ１０^−４Ｍから約２ｘ１０^−５Ｍ、約２ｘ１０^−５Ｍから約２ｘ１０^−６Ｍ、約２ｘ１０^−６から約２ｘ１０^−７Ｍ、約２ｘ１０^−７から約２ｘ１０^−８Ｍ、約２ｘ１０^−８Ｍから約２ｘ１０^−９Ｍ、約２ｘ１０^−９Ｍから約２ｘ１０^−１０Ｍ、約２ｘ１０^−１０Ｍから約２ｘ１０^−１１Ｍ、約２ｘ１０^−１１Ｍから約２ｘ１０^−１２Ｍ、約３ｘ１０^−３Ｍから約３ｘ１０^−４Ｍ、約３ｘ１０^−４Ｍから約３ｘ１０^−５Ｍ、約３ｘ１０^−５Ｍから約３ｘ１０^−６Ｍ、約３ｘ１０^−６から約３ｘ１０^−７Ｍ、約３ｘ１０^−７から約３ｘ１０^−８Ｍ、約３ｘ１０^−８Ｍから約３ｘ１０^−９Ｍ、約３ｘ１０^−９Ｍから約３ｘ１０^−１０Ｍ、約３ｘ１０^−１０Ｍから約３ｘ１０^−１１Ｍ、約３ｘ１０^−１１Ｍから約３ｘ１０^−１２Ｍ、約４ｘ１０^−３Ｍから約４ｘ１０^−４Ｍ、約４ｘ１０^−４Ｍから約４ｘ１０^−５Ｍ、約４ｘ１０^−５Ｍから約４ｘ１０^−６Ｍ、約４ｘ１０^−６から約４ｘ１０^−７Ｍ、約４ｘ１０^−７から約４ｘ１０^−８Ｍ、約４ｘ１０^−８Ｍから約４ｘ１０^−９Ｍ、約４ｘ１０^−９Ｍから約４ｘ１０^−１０Ｍ、約４ｘ１０^−１０Ｍから約４ｘ１０^−１１Ｍ、約４ｘ１０^−１１Ｍから約４ｘ１０^−１２Ｍ、約５ｘ１０^−３Ｍから約５ｘ１０^−４Ｍ、約５ｘ１０^−４Ｍから約５ｘ１０^−５Ｍ、約５ｘ１０^−５Ｍから約５ｘ１０^−６Ｍ、約５ｘ１０^−６から約５ｘ１０^−７Ｍ、約５ｘ１０^−７から約５ｘ１０^−８Ｍ、約５ｘ１０^−８Ｍから約５ｘ１０^−９Ｍ、約５ｘ１０^−９Ｍから約５ｘ１０^−１０Ｍ、約５ｘ１０^−１０Ｍから約５ｘ１０^−１１Ｍ、約５ｘ１０^−１１Ｍから約５ｘ１０^−１２Ｍ、約５ｘ１０^−７Ｍから約５ｘ１０^−１１Ｍ、約５×１０^−７Ｍ、約１×１０^−７Ｍ、約５×１０^−８Ｍ、約１×１０^−８Ｍ、約５×１０^−９Ｍ、約１×１０^−９Ｍ、約５×１０^−１０Ｍ、約１×１０^−１０Ｍ、約５×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１１ＭのＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。一部の実施形態において、ＫＤは、ＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで決定される。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＭ４ＳＦ１を発現するＨＵＶＥＣ細胞を使用する標準的なフローサイトメトリーアッセイで、約５×１０^−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＴＭ４ＳＦ１に結合する。

【0186】

[0222]一実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗原結合フラグメントのヒトＴＭ４ＳＦ１への結合は、ヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループのグリコシル化に依存的でなく、すなわち、抗体の結合は、ＥＣＬ２ループ（配列番号７７）内のＴＭ４ＳＦ１のグリコシル化から独立している。

【0187】

[0223]コンジュゲートの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、いずれかのアイソタイプ（例えば、これらに限定されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）のいずれかであり得る。特定の実施形態において、コンジュゲートの抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプである。具体的な実施形態において、コンジュゲートの抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプ由来である。特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４アイソタイプである。

【0188】

[0224]ＩｇＧ２は、天然において、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が最も低い（Ａｎら、ＭＡｂｓ．２００９年１１月〜１２月；１（６）：５７２〜５７９）。したがって、特定の実施形態において、ＩｇＧ２は、有利に使用される。しかしながら、ＩｇＧ２は、２つの余分なシステイン（４つのヒンジ間ジスルフィド結合を生じる）を有し、それにより抗体間ジスルフィド結合の形成を介した凝集が起こりやすくなる。関連する実施形態において、凝集を減少させるために、ＩｇＧ２システインへの突然変異が作製される。

【0189】

[0225]本発明の開示は、ＴＭ４ＳＦ１に結合する抗体フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。特定の環境において、全抗体よりも抗体フラグメントを使用するほうが利点がある。フラグメントのサイズが小さいほど迅速なクリアランスが可能になり、それにより細胞、組織、または臓器への改善された接近をもたらすことができる。特定の抗体フラグメントの総論に関して、Ｈｕｄｓｏｎら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１２９〜３４を参照されたい。

【0190】

[0226]抗体フラグメントを産生するための様々な技術が開発されてきた。従来、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク質分解消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７〜１７；およびＢｒｅｎｎａｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１〜８３を参照）。しかしながら、現在これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ抗体フラグメントは全て、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母細胞で発現および分泌させることができ、したがって大量のこれらのフラグメントの容易な産生が可能である。抗体フラグメントは、上記で論じられた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替として、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。インビボでの半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む。抗体フラグメントを産生するための他の技術は、熟練した専門家には明らかであると予想される。特定の実施形態において、抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠く無傷の結合部位を有する。したがってそれらは、インビボでの使用中における非特異的な結合の低減に適している可能性がある。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、上記を参照）。抗体フラグメントはまた、「線状抗体」であってもよく、例えば、上記で引用された参考文献に記載されたものである。このような線状抗体は、単一特異性または多重特異性、例えば二重特異性であってもよい。特定の実施形態において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖからなる群から選択することができる。

【0191】

[0227]例えばヒトＴＭ４ＳＦ１に高親和性を有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体（およびフラグメント）は、当技術分野において公知のスクリーニング技術を使用して同定することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜９７により最初に説明されたハイブリドーマ方法を使用して作製してもよいし、または組換えＤＮＡ方法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。

【0192】

[0228]ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターは、例えばヒトＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループまたはＴＭ４ＳＦ１を発現する細胞を使用することにより免疫化されて（それによってＥＣＬ２ループが細胞表面上に発現される）、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合すると予想される抗体を産生するかまたは産生することが可能なリンパ球を惹起する。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫化されてもよい。免疫化後、リンパ球を単離し、次いで好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを使用して骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。

【0193】

[0229]このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好適な培養培地中にシーディングされ、増殖させ、このような培養培地は、特定の実施形態において、融合していない親の骨髄腫細胞（融合パートナーとも称される）の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を喪失している場合、ハイブリドーマに選択的な培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むと予想され（ＨＡＴ培地）、これは、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止するものである。

【0194】

[0230]例示的な融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定して高レベルの抗体産生を維持し、融合していない親細胞を選択する選択的な培地に感受性を有するものである。例示的な骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばＳＰ−２および誘導体、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）より入手可能なＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞、ならびにＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）より入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のものである。またヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１〜０５；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１〜６３（１９８７））。

【0195】

[0231]ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロでの結合アッセイ、例えばＲＩＡもしくはＥＬＩＳＡによって決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、１９８０、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０〜３９に記載されるスキャッチャード分析によって決定することができる。

【0196】

[0232]所望の特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させる（Ｇｏｄｉｎｇ、上記）。この目的のために好適な培養培地としては、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍として、例えばマウスへの細胞のｉ．ｐ．注射によって、インビボで増殖させることができる。

【0197】

[0233]サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、好適には、培養培地、腹水、または血清から、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ−セファロースを使用するもの）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの従来の抗体精製手順によって分離される。

【0198】

[0234]モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離およびシーケンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの源として役立つ可能性がある。ＤＮＡは、単離されたら、発現ベクターに入れてもよく、次いで発現ベクターは、トランスフェクトされなければ抗体タンパク質を産生しない宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が達成される。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総論としては、Ｓｋｅｒｒａら、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６〜６２およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１〜８８が挙げられる。

【0199】

[0235]さらなる実施形態において、モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＡｉｔｋｅｎ編、２００２）に記載される技術を使用して生成した抗体ファージライブラリーから単離することができる。原則的に、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々なフラグメントを提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対してスクリーニングされる。所望の抗原に結合することが可能なＦｖフラグメントを発現するクローンは抗原に吸着されるため、ライブラリー中の非結合クローンから分離される。次いで結合クローンは抗原から溶出され、さらに、抗原吸着／溶出の追加のサイクルによって濃縮することができる。

【0200】

[0236]可変ドメインは、例えばＷｉｎｔｅｒら、１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜５５に記載されるように、ＶＨとＶＬとが短いフレキシブルなペプチドを介して共有結合で連結されている単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、またはそれぞれ定常ドメインに融合しており、非共有結合によって相互作用するＦａｂフラグメントとしてのいずれかで、ファージ上に機能的に提示させることが可能である。

【0201】

[0237]ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ＰＣＲによって別々にクローニングし、ファージライブラリー中でランダムに組み換えることができ、これは次いで、Ｗｉｎｔｅｒら、上記に記載されるように、抗原結合クローンに関して検索することができる。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要とせずに、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代替として、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５〜３４で記載されるように、ナイーブレパートリーをクローニングして、免疫化をまったく行わなくても、多様な非自己に対する、さらには自己抗原にも対するヒト抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１〜８８によって記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ−遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することによって、合成的に作製することもできる。

【0202】

[0238]ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野において公知の様々な技術によって達成することができる。例えば、ＴＭ４ＳＦ１（例えば、ＥＣＬ２ループまたは前記ループを発現する細胞の可溶性形態）を使用して、吸着プレートのウェルをコーティングする、吸着プレートに付着させた宿主細胞上で発現させる、またはセルソーティングで使用する、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを捕獲するためにビオチンにコンジュゲートする、またはディスプレイライブラリーをパニングするための他のあらゆる方法で使用することができる。遅い解離速度論（例えば、優れた結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓら、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８：３０９〜１４およびＷＯ９２／０９６９０に記載されるように、長い洗浄および１価ファージディスプレイの使用によって、さらに、Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜８３に記載されるように抗原の低いコーティング密度の使用によって向上させることができる。

【0203】

[0239]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、目的のファージクローンを選択するのに好適な抗原スクリーニング手順を設計し、それに続き、目的のファージクローンからの、ＶＨおよび／もしくはＶＬ配列（例えば、Ｆｖ配列）、またはＶＨおよびＶＬ配列からの様々なＣＤＲ配列、ならびにＫａｂａｔら、上記に記載される好適な定常領域（例えば、Ｆｃ）配列を使用して全長抗ＴＭ４ＳＦ１抗体クローンを構築することにより得ることができる。

【0204】

[0240]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体のスクリーニングは、抗体がＴＭ４ＳＦ１のＥＣＬ２ループに治療的な親和性を有するかどうかを決定するために、当技術分野において公知の、および本明細書に記載される結合アッセイを使用して実行することができる。転移性の細胞活性を阻害したりまたは減少させたりする抗体の能力は、当技術分野における標準的なアッセイや、本明細書に記載される標準的なアッセイを使用して測定することができる。前臨床アッセイは、一般的に以下の３つのタイプのうち１つの転移の動物モデルの使用を必要とする：（ｉ）転移性マウス腫瘍細胞、例えばＢ１６Ｆ１０黒色腫ＴＣを、一般的に、肺転移を生成するために尾静脈注射を介して、肝臓転移を生成するために門脈または脾臓内注射を介して、または骨および他の転移を生成するために心臓の左心室への注射を介してマウスに注射すること；（ｉｉ）転移性腫瘍細胞または無傷の腫瘍フラグメントを、マウスに同所移植することであり、この方法はしばしば、原発性腫瘍増殖に関連する罹患率を抑えるために後の原発性腫瘍の外科的切除を必要とするもの；および（ｉｉｉ）遺伝子操作された自然転移のマウスモデルであり、そのうち最も一般的なものは、ＭＭＴＶ−Ｐｙｔ（マウス乳がんウイルス−ポリオーマウイルス中型Ｔ抗原）マウス乳癌モデルであり、これは、ヒトがん転移の極めてリアルなマウスモデルを提供し、半接合ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ雌の８５％より多くが、８〜１６週齢で肺に転移する触診可能な乳がんを自然に発症するもの。生きた動物を画像化するか、またはＴＭ４ＳＦ１免疫遮断（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｃｋａｄｅ）の程度の関数として致死させた動物の肺における転移性小結節を直接計数するかのいずれかによって肺における転移性の負荷量を定量化して、治療的なレベル、例えば肺転移の少なくとも５０％の低減が達成されることが、治療抗体が例えば本開示の方法で使用できることの指標となると予想される。さらに、異種間反応性アッセイは、当技術分野において公知である。使用できるアッセイの例は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＫｈａｎｎａおよびＨｕｎｔｅｒ（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００５年３月；２６（３）：５１３〜２３）ならびにＳａｘｅｎａおよびＣｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ（Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１３年４月；７（２）：２８３〜９６）に記載される。

【0205】

[0241]本開示の一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはフラグメントのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を低減するまたは消失させる突然変異を含有する。用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」は、本明細書で使用される場合、細胞傷害性顆粒の内容物の放出を特徴とする非食細胞プロセスを介した細胞傷害性エフェクター細胞によって、または細胞死誘導分子の発現によって、抗体被覆標的細胞を致死させることを指す。ＡＤＣＣは、標的結合抗体（ＩｇＧまたはＩｇＡまたはＩｇＥクラスに属する）と、特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、すなわち免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域に結合するエフェクター細胞表面上に存在する糖タンパク質との相互作用を介して開始される。ＡＤＣＣを媒介するエフェクター細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球および樹状細胞が挙げられる。ＡＤＣＣは、迅速なエフェクターメカニズムであり、その効能は、多数のパラメーター（標的細胞の表面上の抗原の密度および安定性；抗体親和性ならびにＦｃＲ結合親和性）に依存する。ＰＢＭＣベースのＡＤＣＣアッセイおよびナチュラルキラー細胞ベースのＡＤＣＣアッセイは、ＡＤＣＣを検出するのに使用することができる。これらのアッセイにおける読み出しは、終点駆動型（標的細胞溶解）である。

【0206】

[0242]「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、相補物の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の要素（Ｃ１ｑ）が、その同族抗原に結合する抗体（適切なサブクラスに属するもの）に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３を参照）を実行してもよい。変更されたＦｃ領域アミノ酸配列（バリアントＦｃ領域を有するポリペプチド）および増加または減少したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチドバリアントが記載されている（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号；ＷＯ１９９９／５１６４２；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜８４を参照）。ＣＤＣ活性をほとんど有さない抗体（またはフラグメント）も使用のために選択され得る。

【0207】

[0243]用語「エフェクター機能」は、本明細書で使用される場合、ＩｇＧのＦｃエフェクタードメイン（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）が寄与する機能を指す。このような機能は、例えば、Ｆｃエフェクタードメインが、食細胞または溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体に結合することによって、またはＦｃエフェクタードメインが補体系の要素に結合することによって達成することができる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食（ＡＤＣＰ）；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化が挙げられる。

【0208】

[0244]用語「低減する」または「消失させる」は、本明細書で使用される場合、全体で、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多くの減少を引き起こす能力を指す。低減または消失は、処置される障害（例えば、がん）の症状、転移の存在もしくはサイズまたは原発性腫瘍のサイズを指す場合もある。

【0209】

[0245]用語「低減したＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能」は、本明細書で使用される場合、対照（例えば突然変異を含まないＦｃ領域を有する抗体）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも、少なくとも約９０％またはそれより多くの、特異的なエフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの低減を指す。

【0210】

[0246]したがって、特定の実施形態において、本開示の突然変異した抗体は、本開示の抗体と同じアミノ酸配列を有するがＦｃ領域への少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含まない抗体（本明細書では「改変されていない抗体」とも称される）と比較して、エフェクター機能を促進することに関与するＦｃリガンドへの親和性が低減または消失している。

【0211】

[0247]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を低減するまたは消失させる少なくとも２つの突然変異を含むＦｃ領域を含む。さらなる実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を低減するまたは消失させる、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個またはそれより多くの突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0212】

[0248]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６デルタ（欠失）、Ｇ２３７Ａ、Ｖ２６３Ｌ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｋ３２２Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１ＡおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0213】

[0249]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｇ２３７Ａ突然変異と共に、またはＧ２３７Ａ突然変異なしで、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含むＦｃ領域を含む。一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0214】

[0250]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0215】

[0251]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの低減した結合、および低減したＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を提供するＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／デルタＧ２３６（欠失）突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0216】

[0252]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｎ２９７ｘ突然変異（式中、ｘ＝Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｑ）を含むＦｃ領域を含む。

【0217】

[0253]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0218】

[0254]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｃ１ｑへの低減した結合を提供するＫ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ、およびＰ３３１Ａの１つまたは複数に突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0219】

[0255]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＦｃγＲＩＩＢへの強化された結合および強化されたＡＤＣＣを提供するＶ２６３Ｌ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0220】

[0256]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡまたはＬ２３５Ｅ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0221】

[0257]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥまたはＰ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0222】

[0258]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプであり、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８ＡまたはＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0223】

[0259]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプであり、Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0260]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプであり、Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１ＳまたはＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0224】

[0261]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６デルタ（欠失）、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｒからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0225】

[0262]特定の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、低減したＦａｂ−アーム交換および低減した凝集を提供するＳ２２８Ｐ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0226】

[0263]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ突然変異を含むＦｃ領域を含む。
[0264]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｅ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／デルタＧ２３６（欠失）突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0227】

[0265]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｎ２９７ｘ突然変異（式中、ｘ＝Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｑ）を含むＦｃ領域を含む。

【0228】

[0266]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0229】

[0267]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの低減した結合および低減したＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター活性を提供するＬ２３５Ｅ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0230】

[0268]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡまたはＥ２３３Ｐ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６デルタ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0231】

[0269]一実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、少なくともＳ２２８Ｐ突然変異を含むＦｃ領域を含む。Ａｎｇａｌら（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年１月；３０（１）：１０５〜８）は、残基２４１におけるセリンの存在（ＥＵ番号付けシステムに従って、ここではＫａｂａｔ番号付けにおける残基２２８に対応する）が、分泌されたヒトＩｇＧ４の所定の割合において、ヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋の不均質性の原因であることを決定するための、ヒトＩｇＧ４重鎖のヒンジ配列の分析を記載する。Ｓｉｌｖａら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１５年２月２７日；２９０（９）：５４６２〜９）は、インビボおよびインビトロにおけるＩｇＧ４ Ｆａｂ−アーム交換を防止するヒトＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ突然変異を記載する。

【0232】

[0270]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｌ２３５ＥまたはＳ２２８Ｐ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0233】

[0271]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＮ２９７Ｇ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0234】

[0272]他の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１アイソタイプであり、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｒ突然変異を含むＦｃ領域を含む。

【0235】

[0273]例示的な実施形態の一つにおいて、いずれかのＩｇＧアイソタイプの突然変異したＦｃ領域が、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２９７位、３１８位、３２０位、３２２位に１つまたは複数の突然変異を含む。

【0236】

[0274]インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害性アッセイは、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減または消失を確認するのに実行することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を喪失しているが（したがってＡＤＣＣ活性を喪失している可能性がある）、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、それに対して単球は、ＦｃγＲＩ、ＲＩＩおよびＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６）７０５９〜７０６３を参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１９８５）１４９９〜１５０２；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１〜１３６１を参照）に記載される。代替として、非放射性アッセイ方法が採用される場合がある（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を参照されたい。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替として、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、例えばＣｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１９９８）６５２〜６５６で開示された動物モデルで、評価することができる。またＣ１ｑ結合アッセイを行って、抗体が、Ｃ１ｑに結合できないこと、したがってＣＤＣ活性を喪失していることを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２に記載のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実行することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２（１９９６）１６３；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０１（２００３）１０４５〜１０５２；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．、およびＧｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．、Ｂｌｏｏｄ １０３（２００４）２７３８〜２７４３を参照）。またＦｃＲｎ結合およびインビボにおけるクリアランス／半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使用して実行することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）（２００６）１７５９〜１７６９を参照）。

【0237】

[0275]一実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、改変されていない抗体と比較して、低減または消失したＡＤＣＣエフェクター機能を示す。別の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、改変されていない抗体のＡＤＣＣエフェクター機能の、２分の１以下、または３分の１以下、または５分の１以下、または１０分の１以下、または５０分の１以下、または１００分の１以下に低減したＡＤＣＣエフェクター機能を示す。さらに別の実施形態において、本開示の抗体は、改変されていない抗体と比べて、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％低減したＡＤＣＣエフェクター機能を示す。本開示のさらなる態様において、本発明の開示の抗体またはその抗原結合フラグメントにより誘発されたＡＤＣＣエフェクター機能の低減または下方調節は、改変されていない抗体によるＡＤＣＣの誘発について観察された値の０、２．５、５、１０、２０、５０または７５％の低減である。特定の実施形態において、ＡＤＣＣ活性の低減および／または消失は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントのＦｃリガンドおよび／または受容体に対する低減した親和性に起因する可能性がある。

【0238】

Ｖ．リンカー
[0276]コンジュゲートの構成要素、すなわち標的化タンパク質（例えば、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント）およびオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）は、様々なアプローチ、例えば遺伝学的なコンジュゲーション、酵素的なコンジュゲーション、化学的なコンジュゲーション、またはそれらの任意の組合せを使用してコンジュゲートすることができる。様々な例において、リンカーの特性、例えばリンカーの長さまたは切断の位置（リンカーが切断可能な場合）が改変される。

【0239】

[0277]一部の実施形態において、コンジュゲート内のＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、哺乳類または細菌のトランスグルタミナーゼ酵素の使用を含む酵素的な部位特異的コンジュゲーション方法を使用して標的化タンパク質にコンジュゲートすることができる。微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）は、現代の調査および生物工学において用途が多いツールである。大量の比較的純粋な酵素の利用可能性、使いやすさ、ならびにカルシウムおよびグアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）による調節の欠如のために、ｍＴＧは、食品産業と生物工学の両方で使用される主要な架橋酵素に推し進められてきた。現在、ｍＴＧは、小分子、ポリマー、表面、ＤＮＡ、同様に他のタンパク質にタンパク質およびペプチドを取り付けるための多くの用途で使用される。例えば、Ｐａｖｅｌ Ｓｔｒｐ、Ｖｅｒａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２５、５、８５５〜８６２を参照されたい。

【0240】

[0278]一部の実施形態において、コンジュゲート内のＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、リンカーの方式で、直接の共有結合または非共有結合による相互作用で、標的化タンパク質にコンジュゲートされていてもよい。リンカーは、アミノ酸またはペプチドベースリンカー、または化学的連結剤、例えばホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤であってもよく、これらは、多くの商業的な供給源より入手可能である。架橋に利用可能な領域は、本開示の結合タンパク質（例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体）上に見出すことができる。リンカーは、フレキシブルなアームを含んでいてもよく、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の炭素原子を含んでいてもよい。例示的なリンカーとしては、切断不可能な共有結合または非共有結合のリンカーが挙げられる。一部の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸不安定性のリンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、光不安定性のリンカー、またはジスルフィド含有リンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、システインリンカーまたは非システインリンカー、例えばリジンリンカーを含む。一部の実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、天然にはないアミノ酸を含み、抗体または抗体フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、天然にはないアミノ酸を介して連結／コンジュゲートされる。一部の実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、天然アミノ酸を含み、抗体または抗体フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、天然アミノ酸を介して連結／コンジュゲートされる。

【0241】

[0279]一部の実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、天然にはないアミノ酸を含み、抗体または抗体フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、天然にはないアミノ酸を介して連結／コンジュゲートされる。天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメント中の２つの天然に存在するアミノ酸の間に挿入されてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメント中の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸を置き換えていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントのＮ末端に取り込まれていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントのＣ末端に取り込まれていてもよい。天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの結合領域の遠位に取り込まれていてもよい。天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの結合領域の近くに取り込まれていてもよい。天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの結合領域中に取り込まれていてもよい。

【0242】

[0280]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸のうちの１つをコードしないコドンによってコードされていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、ナンセンスコドン（停止コドン）によってコードされていてもよい。停止コドンは、アンバー（ａｍｂｅｒ）コドンであってもよい。アンバー（ａｍｂｅｒ）コドンは、ＵＡＧ配列を含んでいてもよい。停止コドンは、オーカーコドンであってもよい。オーカーコドンは、ＵＡＡ配列を含んでいてもよい。停止コドンは、オパールまたはアンバー（ｕｍｂｅｒ）コドンであってもよい。オパールまたはアンバー（ｕｍｂｅｒ）コドンは、ＵＧＡ配列を含んでいてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、４塩基コドンによってコードされていてもよい。

【0243】

[0281]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦまたはｐＡｃＰｈｅ）であってもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、セレノシステインであってもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、ｐ−フルオロフェニルアラニン（ｐＦＰｈｅ）であってもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ｐ−アジドメチルフェニルアラニン（ｐＡｚＣＨ２Ｆ）、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＦ）、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｒＦ）、ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩＦ）、ｐ−シアノフェニルアラニン（ｐＣＮＦ）、ｐ−カルボキシルメチルフェニルアラニン（ｐＣｍＦ）、３−（２−ナフチル）アラニン（ＮａｐＡ）、ｐ−ボロノフェニルアラニン（ｐＢｏＦ）、ｏ−ニトロフェニルアラニン（ｏＮｉＦ）、（８−ヒドロキシキノリン−３−イル）アラニン（ＨＱＡ）、セレノシステイン、および（２，２’−ビピリジン−５−イル）アラニン（ＢｉｐｙＡ）を含む群から選択され得る。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、４−（６−メチル−ｓ−テトラジン−３−イル）アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅｙｎｌａｌａｎｉｎｅ）であってもよい。

【0244】

[0282]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、β−アミノ酸（β３およびβ２）、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖状コアアミノ酸、ジアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、またはそれらの組合せであってもよい。

【0245】

[0283]天然にはないアミノ酸のさらなる例としては、これらに限定されないが、１）様々な置換チロシンおよびフェニルアラニン類似体、例えばＯ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびｐ−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン；２）光架橋されていてもよいアリールアジドおよびベンゾフェノン基を有するアミノ酸；３）固有な化学的反応性を有するアミノ酸、例えば、アセチル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−（２−プロピニル）−Ｌ−チロシン、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンなど；４）Ｘ線結晶学における位相のための重原子を含有するアミノ酸、例えばｐ−ヨードおよびｐ−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニンなど；５）酸化還元活性アミノ酸、ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン；６）グリコシル化アミノ酸、例えばｂ−Ｎ−アセチルグルコサミン−Ｏ−セリンおよびａ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｏ−スレオニンなど；７）ナフチル、ダンシル、および７−アミノクマリン側鎖を有する蛍光性アミノ酸；８）アゾベンゼンおよびニトロベンジルＣｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒ側鎖を有する、光切断可能な、および光異性化可能なアミノ酸；９）ホスホチロシン模倣体、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン；１０）グルタミンホモログ、ホモグルタミン；ならびに１１）２−アミノオクタン酸が挙げられる。天然にはないアミノ酸は、化学基が取り込まれるように改変されていてもよい。天然にはないアミノ酸は、ケトン基が取り込まれるように改変されていてもよい。

【0246】

[0284]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、少なくとも１つのオキシム、カルボニル、ジカルボニル、ヒドロキシルアミン基またはそれらの組合せを含んでいてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、少なくとも１つのカルボニル、ジカルボニル、アルコキシ−アミン、ヒドラジン、非環式アルケン、非環式アルキン、シクロオクチン、アリール／アルキルアジド、ノルボルネン、シクロプロペン、トランス−シクロオクテン、もしくはテトラジン官能基またはそれらの組合せを含んでいてもよい。

【0247】

[0285]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、当技術分野において公知の方法で抗体または抗体フラグメントに取り込むことができる。細胞ベースの系または無細胞系を使用して、抗体または抗体フラグメントの遺伝子配列を変更し、それによって１つまたは複数の天然にはないアミノ酸を有する抗体または抗体フラグメントを産生することができる。操作されたｔＲＮＡおよびシンセターゼの代わりに、栄養要求株を使用することができる。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、１つまたは複数の天然アミノ酸の選択的な反応を介して産生することができる。選択的な反応は、１つまたは複数の酵素によって媒介され得る。１つの非限定的な例において、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）との１つまたは複数のシステインの選択的な反応は、Ｒａｂｕｋａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：１０５２〜１０６７（２０１２）に記載されるように、１種または複数のホルミルグリシンを産生することができる。

【0248】

[0286]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、リンカーを形成するための化学反応に参加することができる。リンカーを形成するための化学反応は、生体直交型の反応であってもよい。リンカーを形成するための化学反応は、クリックケミストリーであってもよい。

【0249】

[0287]追加の天然にはないアミノ酸は、Ｌｉｕら、（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、７９：４１３〜４４、２０１０）、Ｗａｎｇら、（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ、４４：３４〜６６、２００５）およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９４７２号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９４６８号、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８００９号、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５８６６８号、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９１４２号、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８０１１号、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１４８５号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９３９７号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７８２２号およびＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４４６８２号に開示されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【0250】

[0288]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメント中の１つまたは複数のアミノ酸を置き換えていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメント中のあらゆる天然アミノ酸を置き換えていてもよい。

【0251】

[0289]１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの軽鎖中に取り込まれていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖中に取り込まれていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖および軽鎖中に取り込まれていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの軽鎖中のアミノ酸を置き換えていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖中のアミノ酸を置き換えていてもよい。１つまたは複数の天然にはないアミノ酸は、抗体または抗体フラグメントの重鎖および軽鎖中のアミノ酸を置き換えていてもよい。

【0252】

[0290]一部の実施形態において、抗体フラグメントおよび治療剤は、リンカーを介して連結／コンジュゲートされる。一部の実施形態において、リンカーは、小分子フラグメント、スペーサー、非共有結合のリンカー、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、リンカーは、小分子フラグメントの１つまたは複数を含む。一部の実施形態において、リンカーは、スペーサーを含む。

【0253】

[0291]一部の実施形態において、リンカーは、反応性成分の１つまたは複数を含む。一部の実施形態において、リンカーは、ミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）アクセプター成分、脱離基成分、または抗体フラグメントおよび／もしくは治療剤と共有結合を形成することが可能な成分から選択される反応性成分を含む。

【0254】

[0292]一部の実施形態において、小分子フラグメントは、反応性成分を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、ミカエルアクセプター成分、脱離基成分、またはシステイン残基のチオール基と共有結合を形成することが可能な成分から選択される反応性成分を含む。

【0255】

[0293]一部の実施形態において、ミカエルアクセプター成分は、アルケンまたはアルキン成分を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、化合物ライブラリーから得られる。一部の実施形態において、化合物ライブラリーは、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅフラグメントライブラリー、Ｐｙｒａｍｉｄ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅフラグメントライブラリー、ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎからのＦＲＧｘ、ＡｎＣｏｒｅＸからのＴＣＩ−Ｆｒａｇ、ＡＳＩＮＥＸからのＢｉｏ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒからのＢｉｏＦｏｃｕｓ ３Ｄ、Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏからのＦｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＦＯＬ）、Ｅｎａｍｉｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ、ＩＯＴＡ Ｄｉｖｅｒｓｅ １５００、ＢＩＯＮＥＴフラグメントライブラリー、Ｌｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＯＴＡＶＡフラグメントライブラリー、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋフラグメントライブラリー、Ｓｅｌｃｉａフラグメントライブラリー、ＴｉｍＴｅｃフラグメントベースのライブラリー、Ｖｉｔａｓ−Ｍ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＡｌｌｉｕｍ、またはＺｅｎｏｂｉａフラグメントライブラリーを含む。

【0256】

[0294]一部の実施形態において、小分子フラグメントは、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、ビニルスルホン、ヒドラジド、アルコキシアミン、アルキン、アジド、またはイソシアネート基を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、アルキンまたはアジド基を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、アルキン基を含む。一部の実施形態において、小分子フラグメントは、アジド基を含む。

【0257】

[0295]一部の実施形態において、小分子フラグメントは、スペーサーと共有結合で相互作用する。一部の実施形態において、スペーサーは、アミド成分、エステル成分、エーテル成分、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６アルキレン成分、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６ハロアルキレン成分、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン成分、置換または非置換のＣ３〜Ｃ８シクロアルキレン成分、置換または非置換のＣ２〜Ｃ７ヘテロシクロアルキレン成分、置換または非置換のアリーレン成分、置換または非置換のヘテロアリーレン成分またはそれらの任意の組合せを含む。

【0258】

[0296]一部の実施形態において、リンカーは、ＭＣ（６−マレイミドカプロイル）、ＭＣＣ（マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ−ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、ｖａｌ−ａｌａ（バリン−アラニン）、ａｌａ−ｐｈｅ（アラニン−フェニルアラニン）、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエートを含む。リンカーのさらなる例としては、ＢＳ３（［ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート］；ＢＳ３は、接近可能な第一アミンを標的化するホモ二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである）、ＮＨＳ／ＥＤＣ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エチル−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＮＨＳ／ＥＤＣは、第一アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする）、スルホ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド；スルホ−ＥＭＣＳは、スルフヒドリルおよびアミノ基に対して反応性を有するヘテロ二官能性反応性基（マレイミドおよびＮＨＳ−エステル）である）、ヒドラジド（ほとんどのタンパク質が、露出した炭水化物を含有し、ヒドラジドは、カルボキシル基を第一アミンに連結するための有用な試薬である）、およびＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート；ＳＡＴＡは、アミンに対して反応性を有し、保護されたスルフヒドリル基を付加する）が挙げられる。共有結合を形成するために、化学的に反応性の基は、様々な活性カルボキシル基（例えば、エステル）であり、その場合、ヒドロキシル部分は、ペプチドを改変するのに必要なレベルで生理学的に許容される。特定の薬剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、マレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド（ＭＢＳ）、ガンマ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）、マレイミドヘキサン酸（ＭＨＡ）、およびマレイミドウンデカン酸（ＭＵＡ）が挙げられる。第一アミンは、ＮＨＳエステルの主要な標的である。タンパク質のＮ末端に存在する接近可能なａ−アミノ基およびリジンのε−アミンは、ＮＨＳエステルと反応する。アミド結合は、ＮＨＳエステルのコンジュゲーション反応物が第一アミンと反応してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを放出すると形成される。これらのスクシンイミドを含有する反応性基は、本明細書ではスクシンイミジル基と称される。本開示の特定の実施形態において、タンパク質上の官能基は、チオール基と予想され、化学的に反応性の基は、マレイミドを含有する基、例えばガンマ−マレイミド−ブチリルアミド（ＧＭＢＡまたはＭＰＡ）と予想される。このようなマレイミドを含有する基は、本明細書では、マレイミド（ｍａｌｅｉｄｏ）基と称される。マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５〜７．４である場合、ペプチド上のスルフヒドリル基にとって最も選択的である。ｐＨ７．０において、マレイミド基のスルフヒドリル（例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧなどのタンパク質上のチオール基）との反応速度は、アミンより１０００倍速い。したがって、マレイミド基とスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテル結合を形成することができる。

【0259】

[0297]他の実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸を含む（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、４０、または５０アミノ酸のペプチド）。特定の実施形態において、リンカーは、単一のアミノ酸（例えば、あらゆる天然に存在するアミノ酸、例えばＣｙｓまたはＬｙｓ）である。他の実施形態において、グリシンリッチなペプチド、例えばペプチドを使用することができる。一部の場合において、リンカーは、単一のアミノ酸（例えば、あらゆるアミノ酸、例えばＧｌｙまたはＣｙｓまたはＬｙｓ）であってもよい。好適なリンカーの例は、コハク酸、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、およびＡｓｐであるか、またはＧｌｙ−Ｌｙｓなどのジペプチドである。リンカーがコハク酸である場合、その１つのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成することができ、その他のカルボキシル基は、例えば、ペプチドまたは置換基のアミノ基とアミド結合を形成することができる。リンカーがＬｙｓ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐである場合、それらのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成でき、それらのアミノ基は、例えば、置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成できる。Ｌｙｓがリンカーとして使用される場合、さらなるリンカーが、Ｌｙｓのε−アミノ基と置換基との間に挿入される場合もある。１つの特定の実施形態において、さらなるリンカーは、コハク酸であり、これは例えば、Ｌｙｓのε−アミノ基および置換基に存在するアミノ基とアミド結合を形成する。一実施形態において、さらなるリンカーは、ＧｌｕまたはＡｓｐであり（例えばこれは、Ｌｙｓのε−アミノ基とアミド結合を形成し、置換基に存在するカルボキシル基と別のアミド結合を形成する）、すなわち置換基は、ＮＥアシル化リジン残基である。一部の実施形態において、リンカーは、リジンからなる単一のアミノ酸のペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＬｙｓＬｙｓジペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーは、^＊Ｌｙｓおよび／またはＬｙｓ^＊ジペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＬｙｓＬｙｓ^＊および／または^＊ＬｙｓＬｙｓ、Ｌｙｓ^＊Ｌｙｓトリペプチドを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＬｙｓＬｙｓＬｙｓトリペプチドを含む。

【0260】

[0298]一部の実施形態において、標的化タンパク質およびＲＮＡ分子のコンジュゲーションは、環状のスレッド型の分子を産生する方式で行われる。一部の実施形態において、スペーサーは加えて、マクロサイクルを含む。一部の実施形態において、マクロサイクルは、非共有結合のマクロサイクルを含む。一部の実施形態において、マクロサイクルは、共有結合のマクロサイクルを含む。

【0261】

[0299]一部の実施形態において、マクロサイクルは、ククルビット［Ｘ］ウリルを含み、式中Ｘは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。一部の実施形態において、マクロサイクルは、ククルビット［Ｘ］ウリルを含み、式中Ｘは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態において、マクロサイクルは、ククルビット［Ｘ］ウリルを含み、式中Ｘは、５、６、７、または８である。一部の実施形態において、ククルビット［Ｘ］ウリルは、

【0262】

【化1】

【0263】

（式中、ｘは、５、６、７、または８である）によって表される構造を有する。
[0300]一部の実施形態において、ｘは、５である。一部の実施形態において、ｘは、６である。一部の実施形態において、ｘは、７である。一部の実施形態において、ｘは、８である。

【0264】

[0301]一部の実施形態において、マクロサイクルは、ククルビット［６］ウリル（ＣＢ６）を含む。一部の実施形態において、マクロサイクルは、ククルビット［７］ウリル（ＣＢ７）を含む。一部の実施形態において、ククルビット［７］ウリルは、

【0265】

【化2】

【0266】

によって表される構造を有する。
[0302]一部の実施形態において、マクロサイクルは、シクロデキストリン（ＣＤ）を含む。一部の実施形態において、シクロデキストリンは、

【0267】

【化3】

【0268】

（式中ｎは、５、６、７、または８である）によって表される構造を有する。
[0303]一部の実施形態において、マクロサイクルは、ベータ−シクロデキストリン（ｎ＝７）を含む。一部の実施形態において、マクロサイクルは、ガンマ−シクロデキストリン（ｎ＝８）を含む。一部の実施形態において、ベータ−シクロデキストリンは、

【0269】

【化4】

【0270】

によって表される構造を有する。
[0304]一部の実施形態において、マクロサイクルは、ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、

【0271】

【化5】

【0272】

（式中、
Ｒ^１は、Ｈ、Ｄ、Ｆ、−ＣＮ、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキル、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_６フルオロアルキル、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_６ヘテロアルキル、置換または非置換のＣ_３〜Ｃ_８シクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールであり；
ｍは、５、６、７、または８である）
によって表される構造を有する。

【0273】

[0305]一部の実施形態において、マクロサイクルは、シクログリシンを含む。一部の実施形態において、マクロサイクルは、シクロ（ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｇｌｙｃｙｌｌｇｌｙｃｙｌ）を含む。一部の実施形態において、マクロサイクルは、シクロ（ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌ）を含む。一部の実施形態において、シクロ（ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｙｌ）は、

【0274】

【化6】

【0275】

によって表される構造を有する。
[0306]一部の実施形態において、マクロサイクルは、クラウンエーテルを含む。一部の実施形態において、クラウンエーテルは、１５−クラウン−５、１８−クラウン−６、ジベンゾ−１８−クラウン−６、またはジアザ−１８−クラウン−６である。

【0276】

[0307]一部の実施形態において、マクロサイクルは、シクロアルカンを含む。一部の実施形態において、シクロアルカンは、シクロペンタデカン、シクロヘキサデカン、シクロヘプタデカン、またはシクロオクタデカンである。

【0277】

[0308]一部の実施形態において、マクロサイクルは、シクロビス（パラコート−ｐ−フェニレン）（ＣＢＰＱＴ^４＋）を含む。一部の実施形態において、シクロビス（パラコート−ｐ−フェニレン）（ＣＢＰＱＴ^４＋）は、

【0278】

【化7】

【0279】

によって表される構造を有する。
[0309]一部の実施形態において、リンカーは、四級窒素を含む。一部の実施形態において、リンカーは、

【0280】

【化8】

【0281】

（式中、Ｒは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）である。一部の実施形態において、リンカーは、

【0282】

【化9】

【0283】

（式中、Ｒは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）である。一部の実施形態において、リンカーは、

【0284】

【化10】

【0285】

（式中、Ｒは、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）である。
[0310]一部の実施形態において、リンカーは、

【0286】

【化11】

【0287】

である。
[0311]一部の実施形態において、コンジュゲートは、リンカーの第１の部分を、抗体またはその抗原結合フラグメントに連結し、リンカーの第２の部分を、オリゴヌクレオチドに連結することによって産生される。リンカーを抗体またはその抗原結合フラグメントまたは治療剤にコンジュゲートするステップは、リンカーと、抗体、その抗原結合フラグメントまたは治療剤との間に、イオン結合、共有結合、非共有結合またはそれらの組合せを産生することを含んでいてもよい。リンカーを抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするステップは、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜４７６（２００２）に記載されるように実行してもよい。リンカーは、二官能性リンカー、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、エチレングリコールリンカー、二官能性エチレングリコールリンカー、フレキシブルなリンカー、またはフレキシブルではないリンカーから選択してもよい。リンカーは、シクロオクチン、シクロプロペン、アリール／アルキルアジド、トランス−シクロオクテン、ノルボルネン（ｎｏｒｂｏｒｅｎｅ）、およびテトラジンから選択される化学基を含んでいてもよい。一部の実施形態において、リンカーの末端は、アルコキシ−アミンを含む。一部の実施形態において、リンカーの末端は、アジドまたはシクロオクチン基を含む。一部の実施形態において、抗体もしくは抗体フラグメントまたは治療剤は、シクロオクチン、シクロプロペン、アリール／アルキルアジド、トランス−シクロオクテン、ノルボルネン、およびテトラジンから選択される化学基によって、リンカーにカップリングされていてもよい。抗体もしくは抗体フラグメントまたはオリゴヌクレオチド（ｏｌｏｇｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をリンカーに連結することは、１つまたは複数の銅非含有の反応を実行することを含んでいてもよい。抗体もしくは抗体フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結することは、１つまたは複数の銅を含有する反応を実行することを含んでいてもよい。抗体もしくは抗体フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結することは、１つまたは複数の付加環化を含んでいてもよい。抗体もしくは抗体フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結することは、１つまたは複数のヒュスゲン付加環化を含んでいてもよい。抗体もしくは抗体フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結することは、１つまたは複数のディールスアルダー反応を含んでいてもよい。抗体もしくは抗体フラグメントまたはオリゴヌクレオチドをリンカーに連結することは、１つまたは複数のヘテロディールス・アルダー反応を含んでいてもよい。一部の実施形態において、リンカーの末端は、脱離基を含む。

【0288】

[0312]一部の実施形態において、リンカーの第１の部分は、本明細書に記載のシステインを含有する抗体またはその抗原結合フラグメントと共有結合で相互作用する。一部の実施形態において、リンカーの第１の部分は、本明細書に記載のシステインを含有するＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントと共有結合で相互作用する。一部の実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、リンカーの第２の部分と共有結合で相互作用する。一部の実施形態において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、リンカーの第２の部分と非共有結合で相互作用する。

【0289】

[0313]一部の実施形態において、ウイルスタンパク質ｐ１９ベースのｓｉＲＮＡ担体が予期され、このタンパク質は、ｓｉＲＮＡに高親和性を有することが示されている。例えば、Ｙａｎｇら、Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｂｙ ｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｓＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７年７月２７日；４５（１３）：７６０２〜７６１４を参照されたい。一部の例において、ｐ１９−ｓｉＲＮＡ複合体を生成し、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントに融合させる。追加の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメント内のＣｙｓ、Ｌｙｓ、またはアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｅ）残基を介した統計的またはランダムなコンジュゲーション方法。

【0290】

ＶＩ．抗体またはその抗原結合フラグメントおよびｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートの合成
[0314]一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメント）およびオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートは、抗体または抗原結合フラグメントおよびＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の共有結合によるコンジュゲーションにより開発される。このような例示的なプロセスの第１の工程として、操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体が生成され、この場合、システイン残基は重鎖に導入されている（それによって操作されたシステインを有する抗ＴＭ４ＳＦ１ ＨＣが産生される）。操作されたシステインを有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、一部の例において、ＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡとのカップリングのための少なくとも２つの別々の位置を提供する。例えば、１つのｓｉＲＮＡ分子は、それぞれの操作されたシステインを有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の重鎖にカップリングされていてもよい。コンジュゲーションプロセスにおける別個の、または後続の工程で、ペプチジルプロピル（ｐｅｐｔｉｄｌｙｐｒｏｌｙｌ）イソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ、シクロフィリンＢ）を標的化する配列を有するパッセンジャー鎖へのカップリングのための、３’−アミンで改変された化学的に安定化されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＴＡＢＬＥ化学を使用して合成された）が生成される。一部の実施形態において、コンジュゲーションはさらに、還元可能なＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）または還元不可能なスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）リンカーを含む。一部の実施形態において、操作されたシステインを有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を使用して、本開示による例示的なコンジュゲート分子は、少なくとも２つの一次工程：（ｉ）アミンタグを有するｓｉＲＮＡをＮＨＳ−リンカーと反応させて、チオール反応性ｓｉＲＮＡ−リンカー付加物を形成すること、および（ｉｉ）付加物を、操作されたシステインを有する抗体上のチオール基と反応させて、ｓｉＲＮＡを、チオエステル結合を介して共有結合で連結することを含む多工程プロセスで生成される。このプロセスは、図１で例示される。その後、例示的なコンジュゲート分子を、イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製して、遊離のｓｉＲＮＡを除去し、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって、カップリングされなかった抗体を除去する。次いで、さらなる技術、例えばゲル電気泳動およびエレクトロスプレーＴＯＦ質量分析を使用して、例示的なコンジュゲート分子の、例えば抗体１つ当たり１または２つの連結されたｓｉＲＮＡを有するモノマーのコンジュゲートなどの収量、同様に特徴を評価することができる。チオール反応性リンカー−ペイロードを含む例示的な操作された抗体は、図２で例示される。

【0291】

[0315]コンジュゲーションに採用することができる追加の方法は、化学的な、またはペプチドベースのリンカーの使用、化学的または酵素的なコンジュゲーション方法（例えば、哺乳類または細菌のトランスグルタミナーゼを使用する）、またはそれらの任意の組合せを含む。上述したリンカーおよび／または方法のいずれかは、コンジュゲートの抗体またはその抗原結合フラグメントとオリゴヌクレオチドとをカップリングするのに使用することができる。

【0292】

[0316]適切なカップリング方法を使用して、例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１またはそれより高いオリゴヌクレオチドと抗体または抗原結合フラグメントとの比率（ＯＡＲ）を含む本開示のコンジュゲートを生成することが可能である。例えば、抗体−ＲＮＡコンジュゲート（ＡＲＣ）における増加したＯＡＲ（オリゴヌクレオチドと抗体またはその抗原結合フラグメントとの比率）は、抗体１つ当たりのＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を増加させる。一部の例において、抗体１つ当たりのＲＮＡの数は、モノマーＡＲＣ設計を維持しながら増加する。一部の実施形態において、コンジュゲートは、１：１の抗体または抗原結合フラグメントとオリゴヌクレオチドとの比率を含む。これは、例えば、抗原結合フラグメントまたは抗体の部分、例えば、半抗体、Ｆａｂ、または操作されたシステインを含む他のフラグメントを使用することによって達成することができる。一部の例において、コンジュゲートは、分子の認識に基づきタンパク質の改変が可能になるように、多重金属タンパク質（ｍｕｌｔｉｍｅｔａｌｌｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ヘキサロジウムメタロペプチド）を利用するコンジュゲーション方法によってオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる全抗体を使用して、抗体または抗原結合フラグメントとオリゴヌクレオチドとの１：１の比率を含むように設計することができる。例えば、抗体およびオリゴヌクレオチドは、多重金属タンパク質による抗体のＦｃドメイン定常領域の分子の認識に基づいて、部位特異的な抗体官能化を使用してコンジュゲートすることができる。一部の実施形態において、多重金属タンパク質は、抗体のＦｃドメインに結合するタンパク質の特異的な部位に結合した３つのロジウム複合体を含む。結合すると、多重金属タンパク質は、オリゴヌクレオチドの抗体への部位特異的なコンジュゲーションを触媒することができる。多重金属タンパク質を使用することの利点は、例えば、コンジュゲーションの間、抗体内の残基の操作を回避することによって、抗体の破壊を最小限にすることであり得る。

【0293】

ＶＩＩ．医薬組成物
[0317]抗体またはその抗原結合フラグメントを含む本明細書で開示されるコンジュゲートの１つまたは複数を含む医薬組成物が本明細書で開示される。医薬組成物は、１つまたは複数の医薬的に許容される塩、賦形剤またはビヒクルをさらに含んでいてもよい。本発明の医薬組成物で使用するための医薬的に許容される塩、賦形剤、またはビヒクルとしては、担体、賦形剤、希釈剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤、香味料および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝液、運搬手段、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗微生物剤、および界面活性剤が挙げられる。

【0294】

[0318]例示的な適切な担体は、血清アルブミンと混合された中性緩衝食塩水または食塩水である。医薬組成物としては、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン；単糖、二糖、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を挙げることができる。また一例として、好適な張性増強剤としては、アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトールなども挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などが挙げられる。過酸化水素も、保存剤として使用することができる。好適な共溶媒としては、グリセリン、プロピレングリコール、およびＰＥＧが挙げられる。好適な錯化剤としては、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシ−プロピル−ベータ−シクロデキストリンが挙げられる。好適な界面活性剤または湿潤剤としては、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート８０、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）などが挙げられる。緩衝液は、従来の緩衝液、例えば酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、炭酸水素、またはトリス−ＨＣｌであり得る。酢酸緩衝液は、約ｐＨ４〜５．５であってもよく、トリス緩衝液は、約ｐＨ７〜８．５であってもよい。追加の医薬物質は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に記載される。

【0295】

[0319]医薬組成物は、液体形態または凍結乾燥もしくはフリーズドライした形態であってもよく、１つまたは複数の凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、賦形剤、界面活性剤、高分子量構造添加剤（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｄｄｉｔｉｖｅ）および／または増量剤（例えば、米国特許第６，６８５，９４０号、６，５６６，３２９号、および６，３７２，７１６号を参照）を含んでいてもよい。一実施形態において、凍結乾燥保護剤が含まれ、凍結乾燥保護剤は、非還元糖、例えばスクロース、ラクトースまたはトレハロースである。凍結乾燥保護剤は、一般的に、再構成したときに得られた製剤が等張になるような量で含まれるが、高張性の製剤またはわずかに低張性の製剤も好適な場合がある。加えて、凍結乾燥保護剤の量は、凍結乾燥したときにタンパク質の許容できない量の分解および／または凝集を防ぐのに十分な量と予想される。凍結乾燥前の製剤における糖（例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース）の場合の例示的な凍結乾燥保護剤濃度は、約１０ｍＭから約４００ｍＭである。別の実施形態において、界面活性剤、例えば、非イオン界面活性剤およびイオン性界面活性剤、例えばポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；ポリ（エチレングリコール）フェニルエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ）；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウレル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチル配糖体；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−サルコシン；リノレイル、ミリスチル−、またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−、または二ナトリウムメチルオフェイルタウリン酸（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｏｆｅｙｌ−ｔａｕｒａｔｅ）；およびＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）が含まれる。凍結乾燥前の製剤中に存在し得る界面活性剤の例示的な量は、約０．００１〜０．５％である。高分子量構造添加剤（例えば、フィラー、バインダー）としては、例えば、アラビアゴム、アルブミン、アルギン酸、リン酸カルシウム（二塩基性）、セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストレート、スクロース、チロース、アルファ化デンプン、硫酸カルシウム、アミロース、グリシン、ベントナイト、マルトース、ソルビトール、エチルセルロース、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロ亜硫酸二ナトリウム、ポリビニルアルコール、ゼラチン、グルコース、グアールガム、液体グルコース、圧縮糖（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｇａｒ）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルトデキストリン、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリレート、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、微結晶性セルロース、デンプン、およびゼインを挙げることができる。高分子量構造添加剤の例示的な濃度は、０．１重量％から１０重量％である。他の実施形態において、増量剤（例えば、マンニトール、グリシン）が含まれていてもよい。

【0296】

[0320]組成物は、非経口投与に適したものでもよい。例示的な組成物は、例えば関節内、皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、または病巣内経路などの熟練者にとって利用可能なあらゆる経路による動物への注射または輸注に好適である。非経口製剤は、典型的には、滅菌された、パイロジェンフリーの等張水溶液であると予想され、任意選択で医薬的に許容される保存剤を含有していてもよい。

【0297】

[0321]非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば食塩水および緩衝化媒体などが挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体および栄養素補充液、電解質補充液、例えばリンゲルデキストロースをベースとするものなどが挙げられる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在していてもよい。一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ編、１９８０を参照されたい。

【0298】

[0322]本明細書に記載の医薬組成物は、特定の局所環境における生成物の局所濃度（例えば、ボーラス、デポー作用）および／または増加した安定性または半減期がもたらされるように、制御または持続送達のために製剤化されてもよい。組成物は、本明細書で開示される抗体薬物コンジュゲートの製剤を、活性薬剤の制御放出または持続放出をもたらす、ポリマー化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸などの微粒子調製物、加えて、生分解性マトリックス、注射可能なマイクロスフェア、マイクロカプセル粒子、マイクロカプセル、生体内分解性の粒子ビーズ、リポソーム、および埋め込み可能な送達デバイスなどの物質と共に含んでいてもよく、次いでこれは、デポー注射として送達することができる。このような持続または制御送達手段を製剤化するための技術は公知であり、様々なポリマーが薬物の制御放出および送達のために開発および使用されてきた。このようなポリマーは、典型的には生分解性および生体適合性である。ポリマーヒドロゲル、例えば鏡像異性体ポリマーまたはポリペプチドセグメントの錯化によって形成されたものなど、および温度またはｐＨ感受性特性を有するヒドロゲルは、生物活性タンパク質薬剤（例えば、極めて長いＣＤＲ３を含む抗体）のトラップに関与する穏やかな水性条件のために、薬物のデポー作用を提供することが望ましい場合がある。例えば、ＷＯ９３／１５７２２の医薬組成物の送達に関する制御放出多孔質高分子マイクロ粒子の記載を参照されたい。この目的のために好適な材料としては、ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照）、ポリ（ａ−ヒドロキシカルボン酸）のポリマー、例えばポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８Ａ）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２：５４７〜５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５：１６７〜２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２：９８〜１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。他の生分解性ポリマーとしては、ポリ（ラクトン）、ポリ（アセタール）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（オルトカーボネート）が挙げられる。また持続放出組成物は、リポソームを含んでいてもよく、これは、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができる（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８〜９２（１９８５）を参照）。担体それ自体またはその分解生成物は、標的組織において非毒性であるべきであり、状態をさらに悪化させないものであるべきである。これは、標的の障害の動物モデルでの、またはこのようなモデルが利用不可能である場合、正常な動物での慣例的なスクリーニングによって決定することができる。ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、およびＭＮ ｒｇｐ１２０を用いた持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化がうまく実行されている。Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２：７９５〜７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．、２７：１２２１〜１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．８：７５５〜７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ、「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５）、４３９〜４６２頁；ＷＯ９７／０３６９２、ＷＯ９６／４００７２、ＷＯ９６／０７３９９；および米国特許第５，６５４，０１０号。これらのタンパク質の持続放出製剤は、その生体適合性および広範な生分解特性のために、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを使用して開発された。ＰＬＧＡ、乳酸およびグリコール酸の分解生成物は、人体から迅速に排除され得る。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成物に依存し得る。Ｌｅｗｉｓ、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ」：Ｍ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ （編）、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０）、１〜４１頁。持続放出組成物のさらなる例としては、例えば、ＥＰ５８，４８１Ａ、米国特許第３，８８７，６９９号、ＥＰ１５８，２７７Ａ、カナダ特許第１１７６５６５号、Ｕ．Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２、５４７［１９８３］、Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２、９８［１９８２］、Ｓｉｎｈａら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ９０、２６１［２００３］、Ｚｈｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８、２４［２０００］、およびＤａｉら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ４１、１１７［２００５］が挙げられる。

【0299】

[0323]本発明の開示の組成物で、またはそれと共に使用するための生体接着性ポリマーも予期される。生体接着性物質は、長期にわたり生物学的な基体に接着することができる合成および天然に存在する材料である。例えば、カーボポールおよびポリカルボフィルはどちらも、ポリ（アクリル酸）の合成架橋誘導体である。天然に存在する物質をベースとする生体接着性送達系としては、例えば、ヒアルロナンとしても公知のヒアルロン酸が挙げられる。ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの残基からなる天然に存在するムコ多糖である。ヒアルロン酸は、脊椎動物の細胞外の組織基質、例えば結合組織中のものなどに見出され、同様に滑液や目の硝子体および房水にも見出される。ヒアルロン酸のエステル化誘導体は、生体適合性および生分解性の送達で使用するためのマイクロスフェアを産生するために使用されてきた（例えば、Ｃｏｒｔｉｖｏら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９１）１２：７２７〜７３０；ＥＰ５１７，５６５；ＷＯ９６／２９９９８；Ｉｌｌｕｍら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．（１９９４）２９：１３３〜１４１を参照）。

【0300】

[0324]生分解性および非生分解性ポリマーマトリックスの両方が、本発明の開示の組成物を送達するのに使用でき、このようなポリマーマトリックスは、天然または合成ポリマーを含んでいてもよい。生分解性マトリックスが好ましい。放出が起こる期間は、ポリマーの選択に基づく。典型的には、数時間から３〜１２カ月の範囲の期間にわたる放出が最も望ましい。生分解性送達系を形成するのに使用できる例示的な合成ポリマーとしては、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリ無水物、ポリウレタンおよびそのコポリマー、ポリ（酪酸（ｂｕｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレンおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。例示的な天然ポリマーとしては、アルギネートおよび他の多糖、例えばデキストランおよびセルロースなど、コラーゲン、それらの化学的な誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって慣例的になされる他の改変）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミン、ならびに疎水性タンパク質、コポリマーならびにそれらの混合物が挙げられる。一般的に、これらの材料は、インビボにおける酵素加水分解または水への曝露のいずれかによって、表面またはバルクの侵食によって分解する。ポリマーは、任意選択でヒドロゲルの形態であってもよく（例えば、ＷＯ０４／００９６６４、ＷＯ０５／０８７２０１、Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３、２６、５８１〜５８７を参照）、これは、水中でその重量の最大約９０％を吸収することができ、さらに、任意選択で多価性のイオンまたは他のポリマーで架橋されている。

【0301】

[0325]送達系としてはまた、脂質である非ポリマー系、例えば、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステルなどの、ならびに脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ−、ジ−およびトリグリセリド；ヒドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来のバインダーおよび賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合したインプラントなども挙げられる。具体的な例としては、これらに限定されないが、（ａ）生成物がマトリックス内の形態で含有される侵食系、例えば米国特許第４，４５２，７７５号、４，６７５，１８９号および５，７３６，１５２号に記載されるもの、および（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、５，１３３，９７４号および５，４０７，６８６号などに記載されたような、生成物が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系が挙げられる。生成物を含有するリポソームは、例えば（ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８〜３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０〜４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；ＪＰ８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号および４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２，３２４）などの公知の方法によって調製することができる。

【0302】

[0326]代わりに、またはそれに加えて、本明細書で開示される抗体薬物コンジュゲートが上に吸収またはカプセル化された膜、スポンジ、または他の適切な材料を罹患した領域に埋め込むことにより、組成物を局所的に投与してもよい。埋め込みデバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または臓器に埋め込んでもよく、本明細書で開示される抗体薬物コンジュゲートの送達は、デバイスを介して、ボーラスを介して、または連続的な投与を介して、または連続的な輸注を使用するカテーテルを介して、直接的になされてもよい。

【0303】

[0327]本明細書で開示される抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物は、吸入のために、例えば乾燥粉末などとして製剤化することができる。吸入用の溶液は、エアロゾル送達のために、液化した噴射剤中で製剤化することもできる。さらに別の製剤において、溶液は、霧状にされていてもよい。肺投与のための追加の医薬組成物としては、例えば、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を開示するＷＯ９４／２００６９に記載されたものが挙げられる。肺送達の場合、粒度は、遠位の肺への送達に好適な粒度であるべきである。例えば、粒度は、１μｍから５μｍであってもよいが、例えば各粒子が適正な多孔質であれば、それより大きい粒子を使用してもよい。

【0304】

[0328]本明細書で開示される抗体薬物コンジュゲートを含有する特定の製剤は、経口投与することができる。この様式で投与される製剤は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の調剤で通常使用される担体を用いて、または用いないで製剤化することができる。例えば、カプセルは、生物学的利用率が最大化される消化管中の地点で製剤の活性部分を放出し、全身吸収される前の分解が最小化されるように設計することができる。選択的な結合剤の吸収を容易にするために追加の薬剤が含まれていてもよい。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、およびバインダーが採用されてもよい。

【0305】

[0329]別の調製物は、錠剤の製造に好適な非毒性の賦形剤との混合物中に、有効量の本明細書で開示される抗体薬物コンジュゲートを含んでいてもよい。滅菌水または別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解させることによって、単位用量形態で溶液を調製することができる。好適な賦形剤としては、これらに限定されないが、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素塩、ラクトース、もしくはリン酸カルシウム；または結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴム；または滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクが挙げられる。

【0306】

[0330]好適な、および／または好ましい医薬製剤は、意図した投与経路、送達様式、および望ましい投薬量に応じて、本発明の開示と製剤技術の一般知識を考慮して決定することができる。投与方式に関係なく、有効量は、患者の体重、体表面積、または臓器のサイズに従って計算することができる。本明細書に記載の製剤のそれぞれを含む処置のための適切な投薬量を決定するための計算のさらなる改良は、当技術分野において慣例的になされており、当技術分野で慣例的に実行される作業の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を介して確認することができる。

【0307】

ＶＩＩＩ．抗体−薬物コンジュゲートとの組合せ
[0331]一部の実施形態において、本開示のコンジュゲートを、抗体−薬物コンジュゲートと組み合わせて含む組成物が提供される。一部の実施形態において、抗体−薬物コンジュゲートは、ＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質は、上記実施形態のいずれかに記載される通りでもよく、ＡＤＣは、例えば、病的血管新生に関連する障害、例えばがんの処置において、腫瘍細胞（ＴＣ）および／または腫瘍血管系内皮細胞（ＥＣ）が致死するかまたは阻害されるように、１つまたは複数の薬剤（例えば、１、２、３、もしくは４つまたはそれより多くの薬剤）、例えばＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質と相加的または相乗的に作用する治療剤を含む。治療剤は、例えば、生物学的に活性な成分であってもよく、例えば、細胞傷害性物質、化学療法剤、タンパク質、ペプチド、抗体、成長阻害剤、抗ホルモン剤、またはそれらの任意の組合せであってもよい。

【0308】

[0332]ＡＤＣのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質に直接的または間接的のいずれかでコンジュゲートされ得るチューブリン阻害剤の例としては、これらに限定されないが、重合阻害剤（例えば、チューブリンのビンカドメインに結合することができる、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンフルニン、クリプトフィシン５２、ハリコンドリン（ｈａｌｌｃｈｏｎｄｒｉｎ）、ドラスタチン、ヘミアステリン；チューブリンのコルヒチン（ｃｈｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）ドメインに結合することができる、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｎｅ）、コンブレタスタチン、２−メトキシ−エストラジオール、Ｅ７０１０；解重合阻害剤、例えば、タキサン部位に結合することができる、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロン、ディスコデルモリド）が挙げられる。

【0309】

[0333]ＡＤＣのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質に直接的または間接的のいずれかでコンジュゲートされ得る化学療法剤の例としては、これらに限定されないが、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレート剤；酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素、抗生物質、ならびに毒素、例えば小分子毒素、または細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、ならびにそれらのフラグメントおよび／またはバリアントなどが挙げられる。使用することができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。

【0310】

[0334]加えて、様々な放射性核種は、ＡＤＣのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質へのコンジュゲーションのために使用することができる。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。代わりに、ＡＤＣのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質は、また、１つまたはより小さい分子の毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン（ａｕｒｏｓｔａｔｉｎ）、トリコテシン、およびＣＣ１０６５にコンジュゲートさせることができ、またこれらの毒素の毒素活性を有する誘導体も本明細書において予期される。ＡＤＣのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質にコンジュゲートすることができる他の治療剤としては、様々な例において、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシルなどが挙げられる。

【0311】

[0335]一部の実施形態において、コンジュゲーションのための診断剤は、標識、例えば蛍光標識、クロモジェニック標識、または放射標識である。したがって、標識は、検出目的で使用してもよく、蛍光化合物、酵素、補欠分子団、発光物質、生物発光物質、または放射活性物質であり得る。放射標識は、例えば、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＴｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても公知）のためのスピン標識、例えばこの場合でもヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含んでいてもよい。

【0312】

[0336]１つまたは複数の薬剤（例えば、治療剤および／または診断剤）が、薬剤が隣接してタンパク質にコンジュゲートされるように（例えば、直接の共有結合または非共有結合による相互作用の方式で）、ＡＤＣのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質に直接コンジュゲートされていてもよい。薬剤は、例えば直接のペプチド結合によって、本開示の結合タンパク質に直接コンジュゲートされていてもよい。他の例において、直接のコンジュゲーションは、直接の非共有結合による相互作用、例えば、ＡＤＣのＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質と、ＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質に特異的に結合する薬剤（例えば、抗体剤）との相互作用の方式によってなされる。
ＩＸ．ポリヌクレオチド
[0337]また、一部の実施形態において、本明細書に記載されるＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドも提供される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡコンストラクトとして提供される。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。

【0313】

[0338]一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号４、１６、２８、４０、５２、６４、または７６のいずれか１つに記載の核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメインを含む。一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号１０、２２、３４、４６、５８、７０、または８２のいずれか１つに記載の核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む。

【0314】

[0339]一部の実施形態において、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、またはＣＨＯ細胞などの真核細胞での発現のためにコドンが最適化された核酸配列が提供される。一部の例において、核酸配列は、ＣＨＯ細胞での発現のためにコドンが最適化されている。一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号５、１７、２９、４１、５３、６５、または７７のいずれか１つに記載のコドンが最適化された核酸配列によってコードされた重鎖可変ドメインを含む。一部の例において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、配列番号１１、２３、３５、４７、５９、７１、または８３のいずれか１つに記載のコドンが最適化された核酸配列によってコードされた軽鎖可変ドメインを含む。特定の場合において、配列番号５、１７、２９、４１、５３、６５、または７７のいずれか１つの核酸配列は、ＣＨＯ細胞での発現のためにコドンが最適化された核酸配列である。特定の場合において、配列番号１１、２３、３５、４７、５９、７１、または８３のいずれか１つの核酸配列は、ＣＨＯ細胞での発現のためにコドンが最適化された核酸配列である。

【0315】

[0340]ポリヌクレオチド分子は、公知の方法によって、例えば、好適なプロモーターに、および任意選択で好適な転写ターミネーターに連結された遺伝学的コンストラクトに、結合タンパク質をコードする遺伝子を取り込ませ、それを細菌または他の適切な発現系、例えばＣＨＯ細胞などで発現することによって構築される。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む様々な好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。プロモーターは、それがそれぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を駆動するように選択される。

【0316】

[0341]一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくは発現ベクターに挿入され、これは、さらなる実施形態の一つに相当する。この組換えベクターは、公知の方法に従って構築することができる。特に興味深いベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（ｖｉｒｉｉ）（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、およびコスミドが挙げられる。

【0317】

[0342]様々な発現ベクター／宿主系が、記載されたＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有および発現するのに利用することができる。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１〜２７）であり、または哺乳類細胞での発現のためには、ｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。

【0318】

[0343]したがって、本明細書に記載されるＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質は、一部の実施形態において、上述したタンパク質をコードするベクターを宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を、タンパク質ドメインが発現される条件下で培養することによって産生され、これらは単離してもよいし、任意選択でさらに精製してもよい。
Ｘ． 処置の方法
[0344]本開示は、内皮細胞（ＥＣ）特異的であるが、例えば、ＥＣ−ＥＣ、ＥＣ−間葉幹細胞、ＥＣ−繊維芽細胞、ＥＣ−平滑筋細胞、ＥＣ−腫瘍細胞、ＥＣ−白血球、ＥＣ−脂肪細胞、およびＥＣ−神経細胞相互作用に限定されない細胞−細胞相互作用を阻害する方法をさらに提供する。特定の実施形態において、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、異常なＥＣ−細胞相互作用を特徴とする病理学を有するあらゆるヒト疾患または障害を処置するのに使用することができる。特定の実施形態において、ＥＣ−細胞相互作用は、ＥＣ−白血球相互作用であり、ＥＣ−白血球相互作用の阻害は炎症を防止するために使用される。一部の実施形態において、ＥＣ−細胞相互作用は、ＥＣ−腫瘍細胞相互作用であり、この場合、ＥＣ−腫瘍細胞相互作用の阻害は、がんを防止する、処置する、および／またはその進行を遅くするのに使用される。

【0319】

[0345]他の実施形態において、本開示は、対象における疾患または障害を処置または防止する方法に注目し、疾患または障害は、異常な内皮細胞（ＥＣ）−細胞相互作用を特徴とし、前記方法は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与するステップを含む。特定の実施形態において、ＥＣ−細胞相互作用は、ＥＣ−間葉幹細胞、ＥＣ−繊維芽細胞、ＥＣ−平滑筋細胞、ＥＣ−腫瘍細胞、ＥＣ−白血球、ＥＣ−脂肪細胞、およびＥＣ−神経細胞相互作用の１つまたは複数を含む。例示的な実施形態において、疾患は、炎症性疾患または障害であり、本開示の抗体およびフラグメントは、ＥＣ−白血球相互作用を阻害するために使用される。別の例示的な実施形態において、疾患または障害は、炎症性疾患またはがんから選択される。白血球の血管内皮への付着は、炎症工程の顕著な特徴である。したがって、一実施形態において、本発明の開示のＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、炎症性疾患を処置するのに使用され、この場合、白血球の内皮細胞への付着、または内皮を超える白血球の遊出を阻害することが、処置に役立つ（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｙｃｈｌｙら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００６；１２（２９）：３７９９〜８０６を参照）。例としては、限定はされないが、敗血症、炎症性腸疾患、乾癬、または多発性硬化症が挙げられる。

【0320】

[0346]米国だけでも、毎年およそ５０万人の患者ががんにより死亡する。腫瘍転移は、これらの死の約９０％の原因である。転移を遮断する治療は公知ではない。本発明の開示は、新規の標的であるＴＭ４ＳＦ１によって媒介される腫瘍細胞（ＴＣ）−内皮細胞（ＥＣ）相互作用の免疫遮断に基づき、がんを処置し、転移性の細胞を阻害することができる、ＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびその抗原結合フラグメントを含む抗体−ＲＮＡコンジュゲートを提供する。

【0321】

[0347]上記のように、ＴＭ４ＳＦ１は、元々は、ＴＣ浸潤および転移における役割を有するＴＣ抗原として発見された小さい、テトラスパニン様、細胞表面糖タンパク質である。ＴＭ４ＳＦ１は、ＴＣおよびＥＣによって選択的に発現される。ＴＭ４ＳＦ１は、マウスとヒトの両方において正常組織に供給する血管ＥＣに低レベルで発現される。ＴＭ４ＳＦ１は、多くのヒトがんに供給する血管の内側にある血管ＥＣに約１０〜２０倍の高レベルで発現され、培養ＥＣに同等の高レベルで発現されることが示されている。ＴＭ４ＳＦ１濃縮マイクロドメイン（ＴＭＥＤ）は細胞表面タンパク質様インテグリンを動員し、ナノポディア、細胞表面から伸びた薄膜チャネルの形成を補助し、細胞−細胞相互作用を媒介する。したがって、特定の例において、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびフラグメントは、ナノポディア媒介相互作用を干渉し、ＴＣ血管外遊出に必要であるＴＣのＥＣとの相互作用を阻害する。

【0322】

[0348]本明細書に記載のＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物のいずれか１つは、病的血管新生に関連する障害（例えば、がん、例えば乳がん、卵巣がん、腎臓がん、結腸直腸がん、肝臓がん、胃がん、黒色腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、前立腺がん、結腸がん、神経芽細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、肉腫、中皮腫、網膜芽細胞腫、甲状腺がん、膵臓がん、カルチノイド、頭頸部がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、尿路上皮がん、精巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、下垂体がん、褐色細胞腫、食道がん、および肺がん；肥満症；黄斑変性症；糖尿病性網膜症；乾癬；リウマチ様関節炎；細胞性免疫；ならびに酒さを有する対象（例えば、ヒト）を処置するために製剤化され得る。一部の実施形態において、リンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫またはバーキットリンパ腫である。一部の実施形態において、皮膚がんは、メルケル細胞皮膚がんまたはメルケル細胞癌である。一部の実施形態において、肺がんは、非小細胞肺がんまたは肺腺癌である。一部の実施形態において、肉腫は、小児横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｉｏｓａｒｃｏｍａ）、軟部組織肉腫、骨肉腫、多形肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、または滑膜肉腫である。

【0323】

[0349]ＴＭ４ＳＦ１は、ほとんどの上皮ＴＣの表面に高度に発現され、腫瘍血管の内側にあるＥＣおよび培養ＥＣにおいても高度に発現される。それは、正常血管ＥＣの表面に約１０〜２０分の１の低レベルで発現される。マウスモデルでは、肺への腫瘍転移は、ＥＣとＴＣの両方でのＴＭ４ＳＦ１発現と関連する。転移は、血管ＥＣへのＴＣの最初の接着、および肺または他の転移部位に侵入するＥＣを通るそれらのその後の遊走を必要とする。以下の実施例は、一部の場合において、本発明の開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、または抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、培養においてＴＣ−ＥＣ相互作用に干渉し、インビボでも腫瘍転移を阻害できることを示す。

【0324】

[0350]したがって、本発明の開示の抗体およびフラグメントならびにそれを含む抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、転移における最も初期の工程（図１を参照）、すなわち血管ＥＣへのＴＣ付着および／またはＥＣを通過するＴＣの遊出の一方または両方をブロックし、それによってリスクのあるがん患者における転移を防止するかまたはその数を実質的に低減するのに使用することができる。

【0325】

[0351]本開示は、転移を防止する方法をさらに提供する。ヒト腫瘍は、典型的には増殖の初期に血液およびリンパにＴＣを流す；それゆえに、原発性腫瘍の早期処置は転移がまだ起こっていないという保証を与えない。したがって、ＴＭ４ＳＦ１の免疫遮断は、血行性転移を処置もしくは防止するため、またはリンパ性転移を処置もしくは防止するために使用され得る。

【0326】

[0352]本開示の方法は、一部の実施形態において、対象における転移細胞を阻害するステップに向けられる。一実施形態において、対象は、がん、例えば転移と関連するがんまたはすでに転移したがんを有する。他の実施形態において、対象はすでにがんを処置され、寛解または部分寛解であり、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはフラグメントを投与するステップの利点は、それらが転移を防止し、寛解または部分寛解を維持するために作用することである。

【0327】

[0353]特定の実施形態において、本開示は、転移を発生させるより大きいリスクを有するヒトを処置する方法であって、本明細書に記載の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲート）およびフラグメントの投与は、転移を阻害するかまたは転移の発症を遅延させるのに使用することができる、方法を提供する。

【0328】

[0354]抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−オリゴヌクレオチド（例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲート）をそれを必要とする対象に投与することによって、腫瘍転移、特に肺への転移をブロックする方法が本開示に含まれる。一部の例において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲート）は、本明細書では抗ｈＴＭ４ＳＦ１とも称されるヒト抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含む。特定の実施形態において、方法は、有効量の抗ｈＴＭ４ＳＦ１抗体−オリゴヌクレオチド（例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲート）のそれを必要とする対象への投与を含み、有効量の抗体は、腫瘍細胞（ＴＣ）の血管内皮細胞（ＥＣ）への付着およびそれを通過する移動を防止する。

【0329】

[0355]特定の実施形態において、本開示のコンジュゲート、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、その用量および頻度が長期にわたるＴＭ４ＳＦ１免疫遮断を維持するように、がんを有する対象または転移を有するリスクがある対象に投与される。用量レジメンは、対象の正常な血管ＥＣ上で発現されるＴＭ４ＳＦ１を飽和させるのに十分な量で、コンジュゲート、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲートを対象に投与することによって、ＴＭ４ＳＦ１によって媒介される転移を最大限阻害すると予想される。

【0330】

[0356]特定の実施形態において、投与されるコンジュゲート、例えば、ＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲートまたはその抗原結合フラグメントの有効量は、循環する抗体濃度が１週間で＞１μｇ／ｍｌを達成するのに十分な量である。

【0331】

[0357]特定の実施形態において、投与されるコンジュゲート、例えば、ＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲートまたはその抗原結合フラグメントの有効量は、連続して約１カ月、１μｇ／ｍｌまたはそれを超える抗体の血清濃度を維持するのに十分な量である。

【0332】

[0358]一実施形態において、本開示は、ヒト対象における転移を処置または防止する方法であって、有効量のＲＮＡ分子にコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体コンジュゲートまたはその抗原結合フラグメントを対象に投与するステップを含み、有効量の抗体−ＲＮＡコンジュゲートまたはその抗原結合フラグメントは、１から８０ｍｇ／ｋｇの量の抗体コンジュゲートまたはその抗原結合フラグメントを含む、方法を提供する。

【0333】

[0359]本発明の開示は、さらに、有効量の本開示のコンジュゲート、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、ヒト対象における感染性疾患を処置または防止する方法を提供する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートは、感染性疾患を防止する予防ワクチンである。一部の実施形態において、天然のウイルス（ｍｉｒａｌ）感染を模擬し、免疫応答を惹起するために、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートのｍＲＮＡはウイルスタンパク質に翻訳される。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートのｍＲＮＡは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）タンパク質、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩＶ３）タンパク質、インフルエンザタンパク質、ジカウイルスタンパク質、またはチクングンヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）タンパク質に翻訳される。一部の実施形態において、インフルエンザタンパク質は、ヘマグルチニン１０（Ｈ１０）タンパク質またはＨ７タンパク質である。一部の実施形態において、感染性疾患は、ＣＭＶ、ＨＰＭＶ、ＰＩＶ３、インフルエンザ、ジカウイルス、またはチクングンヤウイルスである。

【0334】

[0360]一実施形態において、本発明の開示は、さらに、有効量の本開示のコンジュゲート、例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、ヒト対象における心臓血管疾患を処置または防止する方法を提供する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートのｍＲＮＡは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に翻訳される。一部の実施形態において、ＶＥＧＦをコードする抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡは、血管の生成を引き起こし、血液供給を改善する。

【0335】

[0361]特定の実施形態において、本発明の開示は、さらに、有効量の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、ヒト対象における嚢胞性線維症を処置または防止する方法を提供する。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートのｍＲＮＡは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質に翻訳される。嚢胞性線維症では、異常なフォールディングとその結果起こる迅速な分解を引き起こす突然変異に起因するＣＦＴＲタンパク質の欠乏がある。一部の実施形態において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｍＲＮＡコンジュゲートは、ＣＦＴＲタンパク質の機能的な発現を提供する。

【0336】

[0362]本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの治療的使用のための投与様式は、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル剤、粒子剤の形態の製剤を使用する、宿主に抗体を送達する任意の好適な経路、例えば、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内または皮下、肺、経粘膜（口腔、鼻腔内、膣内、直腸）であってもよく、さらに、シリンジ、埋め込まれたデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ；または当技術分野において周知の当業者が認識している他の手段に含有されていてもよい。部位特異的投与は、例えば、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝臓内、心臓内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、腹膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、または経皮送達によって達成され得る。

【0337】

[0363]一部の実施形態において、本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、任意の好適な経路で、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）輸注またはボーラス注射により非経口で、筋肉内または皮下または腹腔内に、対象に投与されてもよい。ｉ．ｖ．輸注は、例えば１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、もしくは２４０分にわたり、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間にわたり与えてもよい。一部の実施形態において、対象に与えられる用量は、約０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０５ｍｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、または約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇまたは約２４ｍｇ／ｋｇ、または例えば約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態において、対象に与えられる用量は、例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇである。一部の場合において、対象に与えられる本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、静脈内投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の場合において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、皮下投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇである。一部の場合において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、静脈内投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇである。一部の場合において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、皮下投与を介して約０．１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、静脈内投与を介して約０．３ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、皮下投与を介して約０．３ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、静脈内投与を介して約１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、皮下投与を介して約１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、静脈内投与を介して約３．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、皮下投与を介して約３．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、静脈内投与を介して約１０．０ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の例において、対象に与えられる本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの用量は、皮下投与を介して約１０．０ｍｇ／ｋｇである。

【0338】

[0364]特定の実施形態において、本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの固定された単位用量、例えば、５０、１００、２００、５００または１０００ｍｇが与えられるか、または用量は、患者の体表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、または１００ｍｇ／ｍ２であってもよい。一部の場合において、１から８回の間の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８回）が、患者を処置するために投与されるが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回またはそれより多くの用量が与えられる。

【0339】

[0365]本明細書に記載の開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートの投与は、一部の実施形態において、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１カ月、５週間、６週間、７週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれ以上の後に反復される。長期投与として、処置の反復コースも可能である。反復投与は、同じ用量で、または異なる用量でなされる。一部の例において、本明細書に記載の開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、静脈内輸注によって、８週間の間１週間間隔で８ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて、追加の１６週間の間２週間毎に８ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて４週間毎に８ｍｇ／ｋｇまたは１６ｍｇ／ｋｇで投与される。代わりに、一部の実施形態において、本明細書に記載の開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、１７週間の間１週間間隔で、０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの間で投与される。例えば、一部の場合、本開示の抗体は１日投与量として、２４、１２、８、６、４、または２時間毎の単回または分割用量、または任意のそれらの組合せを使用して、処置の開始後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日目の少なくとも１日、または代わりに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０週目の少なくとも１週、またはそれらの任意の組合せに、１日当たり、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇの量で提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載の開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、ＲＡ、乾癬性関節炎または乾癬などの炎症性疾患を発生させるリスクを低減する、ＲＡ、乾癬性関節炎または乾癬などの炎症性疾患の進行中における事象の出現の発症を遅延させるために、予防的に投与される。一部の例において、本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、貯蔵のために凍結乾燥されており、使用前に好適な担体中で再構成される。一部の場合、本開示のコンジュゲート、例えば本開示の抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、フリップオフキャップを備えたストッパーおよびアルミニウムシールを有するガラスバイアル中の滅菌された凍結された液体として供給される。一部の例において、各バイアルは、ｐＨ５．８の１０ｍＭヒスチジン、８．５％（ｗ／ｖ）スクロース、および０．０４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の製剤中、抗体−ＲＮＡコンジュゲートの３．３ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬ溶液（１０％の過剰量を含む）を含有する。一部の例において、バイアルは、保存剤を含有せず、単回使用用である。バイアルは、凍結貯蔵され、遮光されていてもよい。ＩＶ投与のための抗体−ＲＮＡコンジュゲートを調製するために、本開示のコンジュゲート、例えば抗体−ＲＮＡコンジュゲート製剤は、一部の例において、滅菌希釈剤で希釈する前に、０．２２ミクロンフィルターで濾過される。一部の例において、希釈された本開示のコンジュゲート、例えばおよそ１００ｍＬまでの体積に希釈された抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、インラインの０．２２ミクロンフィルターを使用して、少なくとも３０分の期間にわたり、ＩＶ輸注によって投与される。代わりに、一部の実施形態において、本開示のコンジュゲート、例えば抗体−ＲＮＡコンジュゲートは、約３．３ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬの抗体−ＲＮＡコンジュゲートの１または２回の皮下注射として投与される。皮下注射部位は、例えば腹部領域内であってもよい。

【0340】

ＸＩ．医薬組成物
[0366]本開示のＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質（例えば、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、またはその抗原結合フラグメント）および本開示の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡまたはＤＮＡコンジュゲート）またはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれか１つが、組成物（例えば、医薬組成物）中に含まれていてもよい。本開示の医薬組成物は、医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含み得る。

【0341】

[0367]本明細書で使用する用語「医薬組成物」は、医薬的に許容される担体によって製剤化される本明細書に記載のＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質を含有する組成物を指し、哺乳動物における疾患の処置のための治療レジメンの一部として政府規制機関の認可により製造または販売される。医薬組成物は、例えば、単位剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット、ゲルカップ、またはシロップ）での経口投与のため、局所投与のため（例えば、クリーム、ゲル、ローション、または軟膏として）、静脈内投与のため（例えば、粒状塞栓のない滅菌溶液としておよび静脈内使用に適した溶媒系で）、または本明細書に記載の任意の他の製剤で製剤化され得る。

【0342】

[0368]本明細書で使用する用語「医薬的に許容される担体」は、それにより投与されるタンパク質の治療特性を保持しながら処置される哺乳動物（例えば、ヒト）に生理的に許容される担体を指す。１つの例示的な医薬的に許容される担体は、生理食塩水である。他の生理的に許容される担体およびそれらの製剤は当業者に公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載される。

【0343】

[0369]上記のコンジュゲートを含むＴＭ４ＳＦ１結合タンパク質を含有する医薬組成物は、一部の実施形態において、吸入可能剤形として、鼻腔内剤形として、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せとして、溶液、グリセロール中分散液、液体ポリエチレングリコール、および油中、固体剤形中のそれらの任意の組合せとして調製される。

【0344】

[0370]医薬的に許容される賦形剤は、一部の例において、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）に記載の賦形剤である。好適な賦形剤の非限定的な例としては、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、キレート剤、分散強化剤、崩壊剤、風味剤、甘味料、着色料が挙げられる。

【0345】

[0371]一部の実施形態において、賦形剤は緩衝剤である。好適な緩衝剤の非限定的な例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素カルシウムが挙げられる。緩衝剤としては、一部の実施形態において、本開示の医薬組成物において、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｇｌｕｃｏｍａｔｅ）、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、および他のカルシウム塩またはそれらの組合せが使用される。

【0346】

[0372]一部の実施形態において、賦形剤は保存剤を含む。好適な保存剤の非限定的な例としては、抗酸化剤、例えばαトコフェロールおよびアスコルビン酸塩、ならびに抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、およびフェノールが挙げられる。一部の例において、抗酸化剤としては、限定はされないが、ＥＤＴＡ、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノールおよびＮ−アセチルシステインがさらに挙げられる。一部の例において、保存剤としては、バリダマイシンＡ、ＴＬ−３、オルトバナジウム酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、Ｎ−ａ−トシル−Ｐｈｅ−クロロメチルケトン、Ｎ−ａ−トシル−Ｌｙｓ−クロロメチルケトン、アプロチニン、フッ化フェニルメチルスルホニル、ジイソプロピルフルオロリン酸、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、グランザイム阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、脂質シグナル伝達阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、オキシダーゼ阻害剤、または他の阻害剤が挙げられる。

【0347】

[0373]一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、賦形剤として結合剤を含む。好適な結合剤の非限定的な例としては、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキサゾリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｏｘｏａｚｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴサッカリド、およびこれらの組合せが挙げられる。医薬製剤に使用される結合剤は、一部の例において、デンプン、例えばジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、コムギデンプン；糖、例えばスクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリン；天然および合成ゴム；ゼラチン；セルロース誘導体、例えば結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース；ポリビニルピロリドン（ポビドン）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；アルコール、例えばソルビトール、キシリトール、マンニトール、および水またはこれらの任意の組合せから選択される。

【0348】

[0374]一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、賦形剤として潤滑剤を含む。好適な潤滑剤の非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水添植物油、ステロテックス、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、滑石、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムおよび軽油が挙げられる。医薬製剤に使用される潤滑剤は、一部の実施形態において、ステアリン酸金属塩類（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム）、脂肪酸エステル（例えば、フマル酸ステアリルナトリウム）、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、脂肪アルコール、ベヘン酸グリセリル、鉱油、パラフィン、水添植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラウリル硫酸金属塩類（ｍｅｔａｌｌｉｃ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ）（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム）、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および滑石またはこれらの組合せから選択される。

【0349】

[0375]一部の実施形態において、医薬製剤は賦形剤として分散強化剤を含む。好適な分散剤の非限定的な例としては、一部の例において、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーゴム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート、および高ＨＬＢ乳化剤界面活性剤としての結晶セルロースが挙げられる。

【0350】

[0376]一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、賦形剤として崩壊剤を含む。一部の実施形態において、崩壊剤は非起泡性崩壊剤である。好適な非起泡性崩壊剤の非限定的な例としては、デンプン、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、これらのアルファ化および修飾デンプン、甘味料、粘土、例えばベントナイト、結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ゴム、例えばカンテン、ガウア、イナゴマメ、カラヤ、ペシチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）、およびトラガカントが挙げられる。一部の実施形態において、崩壊剤は起泡性崩壊剤である。好適な起泡性崩壊剤の非限定的な例としては、クエン酸と組み合わせた炭酸水素ナトリウムおよび酒石酸と組み合わせた炭酸水素ナトリウムが挙げられる。

【0351】

[0377]一部の実施形態において、賦形剤は風味剤を含む。外層に組み込まれる風味剤は、一部の例において、合成風味油および風味香料；天然油；植物、葉、花および果物からの抽出物ならびにこれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、風味剤は、ケイヒ油；ウインターグリーン油；ハッカ油；クローバー油；干し草油；アニス油；ユーカリ；バニラ；柑橘類の油、例えばレモン油、オレンジ油、ブドウおよびグレープフルーツ油；ならびにリンゴ、モモ、セイヨウナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップルおよびアプリコットを含む果実エキスからなる群から選択され得る。

【0352】

[0378]一部の実施形態において、賦形剤は、甘味料を含む。好適な甘味料の非限定的な例としては、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトースおよびこれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリンおよびその様々な塩、例えばナトリウム塩；ジペプチド甘味料、例えばアスパルテーム；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリジン；ステビア（Ｓｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）（ステビオシド）；スクロースのクロロ誘導体、例えばスクラロース；および糖アルコール、例えばソルビトール、マンニトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）などが挙げられる。

【0353】

[0379]一部の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、着色料を含む。好適な着色料の非限定的な例としては、食品、医薬品および化粧品色素（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品および化粧品色素（Ｄ＆Ｃ）、ならびに外用医薬品および化粧品色素（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。着色料は、染料またはこれらの対応するレーキとして使用され得る。

【0354】

[0380]一部の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、キレート剤を含む。一部の場合、キレート剤は殺真菌性キレート剤である。例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＤＴＡ）；ＥＤＴＡの二ナトリウム、三ナトリウム、四ナトリウム、二カリウム、三カリウム、二リチウムおよび二アンモニウム塩；ＥＤＴＡのバリウム、カルシウム、コバルト、銅、ジスプロシウム、ユーロピウム、鉄、インジウム、ランタン、マグネシウム、マンガン、ニッケル、サマリウム、ストロンチウム、または亜鉛キレート；トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸一水和物；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン；１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；１，３−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二プロピオン酸二塩酸塩；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（メチレンホスホン酸）半水和物；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸；エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（メチレンホスホン酸）；Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸；１，６−ヘキサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸；イミノ二酢酸；１，２−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；ニトリロ三酢酸；ニトリロ三プロピオン酸；ニトリロトリス（メチレンホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ））の三ナトリウム塩；７，１９，３０−トリオキサ−１，４，１０，１３，１６，２２，２７，３３−オクタアザビシクロ［１１，１１，１１］ペンタトリアコンタンヘキサヒドロブロミド；またはトリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸。

【0355】

[0381]また、本明細書で開示される抗ＴＭ４ＳＦ１抗体および１つまたは複数の他の抗菌剤または抗真菌剤、例えば、ポリエン、例えば、アンホテリシンＢ、アンホテリシンＢ脂質複合体（ＡＢＣＤ）、リポソーム型アンホテリシンＢ（Ｌ−ＡＭＢ）およびリポソーム型ナイスタチン、アゾールおよびトリアゾール、例えばボリコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール（ｐｏｚａｃｏｎａｚｏｌｅ）など；グルカンシンターゼ阻害剤、例えば、カスポファンギン、ミカファンギン（ＦＫ４６３）、およびＶ−エキノカンジン（ＬＹ３０３３６６）；グリセオフルビン；アリルアミン、例えば、テルビナフィン；フルシトシンまたは本明細書に記載されるそれらを含む他の抗真菌剤を含む組合せ製品が考えられる。さらに、ペプチドは、局所抗真菌剤、例えば、シクロピロックスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレン酸塩、局所ナイスタチン（ｎｙｓａｔｉｎ）、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィンおよび他の局所薬剤と組み合わされ得ると考えられる。一部の例において、医薬組成物は、さらなる薬剤を含む。一部の場合、さらなる薬剤は医薬組成物に治療有効量で存在する。

【0356】

[0382]貯蔵および使用の通常の条件下で、本明細書に記載の医薬組成物は、保存剤を含み、微生物の増殖を防止する。特定の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、保存剤を含まない。注射可能な使用に好適な医薬品形態は、滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。医薬組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および／または植物油、またはこれらの任意の組合せを含有する溶媒または分散培地である担体を含む。良好な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合必要な粒子サイズの維持によって、ならびに界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが含まれる。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物での使用によってもたらされ得る。

【0357】

[0383]水溶液での非経口投与のため、例えば、液体剤形は必要であれば好適に緩衝され、液体希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースによって等張にされる。液体剤形は、特に静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、および腹腔内投与に好適である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性培地は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１回の投与量は、特定の場合、１ｍＬ〜２０ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１００ｍＬ〜１０００ｍＬの液体、例えば炭酸水素ナトリウム緩衝生理食塩水に添加されるか、注入の提案された部位で注射された。

【0358】

[0384]特定の実施形態において、滅菌注射可能溶液は、免疫療法剤を、必要な場合、上記に列挙した様々な他の成分と適切な溶媒に必要な量で組み入れ、滅菌濾過することによって調製される。通常、分散液は様々な滅菌活性成分を、基本分散培地および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。本明細書で開示される組成物は、一部の例において、中性または塩形態に製剤化される。医薬的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）が挙げられ、それらは無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸など、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などによって形成される。遊離カルボキシル基によって形成された塩は、一部の場合、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムなど、または水酸化第二鉄、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどに由来する。製剤時、医薬組成物は、一部の実施形態において、投与製剤に対応した方法および治療に有効であるような量で投与される。

【0359】

[0385]特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、医薬的に許容される担体と組み合わせて本明細書で開示される有効量の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含む。本明細書で使用する「医薬的に許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しないおよび／または投与される患者に毒性ではない任意の担体を含む。好適な医薬担体の非限定的な例としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば、油／水型エマルジョン、様々な型の湿潤剤および滅菌溶液が挙げられる。医薬的に適合する担体のさらなる非限定的な例としては、ゲル、生体吸収性マトリックス材、免疫療法剤または任意の他の好適なビヒクルを含有する移植エレメント、送達または分配手段または材料が挙げられ得る。そのような担体は、例えば従来の方法によって製剤化され、有効量で対象に投与される。

【0360】

ＸＩＩ．組合せ療法
[0386]特定の実施形態において、本開示の方法は、１つまたは複数のさらなる治療に続く、先行されるまたは組み合わせる、本明細書で開示されるコンジュゲートを投与するステップを含む。さらなる治療の例としては、限定はされないが、化学療法、放射線、抗がん剤、またはこれらの任意の組合せが挙げられ得る。さらなる治療は、コンジュゲートの投与と同時にまたは順に投与され得る。特定の実施形態において、本開示の方法は、１つまたは複数の抗がん剤またはがん治療に続く、先行される、または組み合わせる本明細書で開示されるコンジュゲートを投与するステップを含む。抗がん剤としては、限定はされないが、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、抗がん抗体、および／または抗サイクリン依存性キナーゼ剤が挙げられる。特定の実施形態において、がん治療としては、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、寒冷療法、毒物療法、および／または外科手術またはこれらの組合せが挙げられる。特定の実施形態において、本開示の方法は、１つまたは複数のさらなる免疫調節剤に続く、先行される、または組み合わせる本明細書で開示されるコンジュゲートを投与するステップを含む。免疫調節剤としては、一部の例において、腫瘍またはがんと関連する抗ウイルス免疫を抑制することができる任意の化合物、分子または物質が挙げられる。さらなる免疫調節剤の非限定的な例としては、抗ＣＤ３３抗体またはこれらの可変領域、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはこれらの可変領域、ＣＯＸ２阻害剤、セレコキシブ、サイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ３およびＩＦＮγ、ならびにケモカイン、例えばＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−８が挙げられる。

【0361】

[0387]特定の例において、さらなる治療は例示的な放射線量が５，０００Ｒａｄｓ（５０Ｇｙ）〜１００，０００Ｒａｄｓ（１０００Ｇｙ）、または５０，０００Ｒａｄｓ（５００Ｇｙ）、または記載した範囲内の他の適切な線量である。代わりに、例えば上記の線量測定試験によって決定された線量により、放射線量は約３０〜６０Ｇｙ、約４０〜約５０Ｇｙ、約４０〜４８Ｇｙ、または約４４Ｇｙ、または記載した範囲内の他の適切な線量である。本明細書で使用する「Ｇｙ」は、１００Ｒａｄｓに等しい放射線の特定の吸収線量の単位を指し得る。Ｇｙは、「グレイ（Ｇｒａｙ）」の省略形である。

【0362】

[0388]特定の例において、さらなる治療は化学療法であり、例示的な化学療法剤としては、限定されないが、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード誘導体、エチレンイミン、スルホン酸アルキル、ヒドラジンおよびトリアジン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ならびに金属塩）、植物アルカロイド（例えば、ベンカアルカロイド、タキサン、ポドフィロトキシン、およびカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）類似体）、抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン、クロモマイシンなど）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸拮抗薬、ピリミジン拮抗薬、プリン拮抗薬、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤）、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、および種々の抗悪性腫瘍薬（例えば、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、副腎皮質ステロイド阻害剤、酵素、微小管阻害剤、およびレチノイド）が挙げられる。例示的な化学療法剤としては、限定はされないが、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン（ｃｏｓｍｅｇａｎ））、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン（ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキセート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラント含有ポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用の塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、イブルチニブ、イデラリシブ、およびブレンツキシマブベドチンが挙げられ得る。

【0363】

[0389]例示的なアルキル化剤としては、限定はされないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼン）：ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イフォスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスフォルアミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、およびダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））が挙げられる。さらなる例示的なアルキル化剤としては、限定はされないが、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）およびＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤとしても公知、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタードとしても公知、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）およびＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても公知、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても公知、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）およびＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）およびＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても公知、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イフォスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドニマスチン（Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ）；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチンおよび塩酸メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｍｉｎｅ）としても公知、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスファミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ）、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても公知、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；およびベンダムスチンＨＣｌ（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられる。

【0364】

[0390]例示的なアントラサイクリンとしては、限定はされないが、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（Ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン（ｄａｕｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ダウノマイシン、および塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンが挙げられ得る。

【0365】

[0391]例示的なビンカアルカロイドとしては、限定はされないが、酒石酸ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢとしても公知、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（登録商標）およびＶｅｌｂａｎ（登録商標））；およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。

【0366】

[0392]例示的なプロテオソーム阻害剤としては、限定はされないが、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（Ｓ）−４−メチル−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）；クエン酸イキサゾミブ（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；およびＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）が挙げられ得る。

【0367】

[0393]本明細書で使用する「と組み合わせて」は、コンジュゲートとさらなる治療が、処置レジメンまたは計画の一部として対象に投与されることを意味する。特定の実施形態において、組合せで使用されるステップは、コンジュゲートとさらなる治療が投与前に物理的に組み合わされるまたは同じ時間枠にわたって投与される必要がない。例えば、限定としてではなく、コンジュゲートと１つまたは複数の薬剤は、処置される対象に同時に投与される、または同時にもしくは任意の順序でもしくは異なる時点で順に投与される。

【実施例】

【0368】

[0394]以下の実施例は、例示のために提供され、ここで請求する開示に限定しない。
実施例１．固形腫瘍を有する対象における抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＴＭ４ＳＦ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの抗血管新生能および抗転移能
[0395]第１相の非盲検用量漸増研究を実行する。この研究は、進行中の固形腫瘍を有する対象における、本開示の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびＴＭ４ＳＦ１標的化ｓｉＲＮＡで構成される例示的な抗体−ＲＮＡコンジュゲートの安全性および薬物動態を評価し、推奨される第２相用量（単独療法として、または標準的な療法と組み合わせて）を決定するために設計される。研究の組み入れ基準は、外科的切除または他の承認された治療選択肢に適していない進行中の固形腫瘍を有する参加者を含む。さらに、参加者は、固形腫瘍治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）バージョン１．１に従って測定可能な疾患または腫瘍抗原のアセスメントによって評価可能な疾患を有していなければならない。さらに、参加者は、十分な骨髄、腎臓、肝臓および心臓の機能を有していなければならない。研究の除外基準の一部は、参加者が、例示的な抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＴＭ４ＳＦ１標的化ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートの第１の投与前の２１日の期間以内に抗がん療法または何らかの治験療法受けたことがあること；中枢神経系（ＣＮＳ）への制御不能な転移；未解決の有害事象；およびいずれかのオーリスタチンベースの薬剤および／またはＩｇＧを含有する薬剤に対する主要な免疫学的反応の病歴を含む。

【0369】

[0396]固形腫瘍を有し、研究の組み入れ基準を満たす３０人の参加者のグループに、ＲＮＡがＴＭ４ＳＦ１を標的化するｓｉＲＮＡである例示的な抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲートを、静脈内輸注として、２４カ月にわたり、約１００μｇ／ｋｇの用量で２８日毎に投与する。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの終末消失半減期を参加者毎に測定する。加えて、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの観察された最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）も決定する。さらに、有害事象を有する参加者の数を記録する。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ＲＮＡコンジュゲートのゼロ時間から最後の測定可能な濃度までの濃度曲線下面積（ＡＵＣ）ＡＵＣ（０−ｔ）も測定する。さらに、奏効率（ＯＲＲ）無進行生存（ＰＦＳ）および奏功期間（ＤＯＲ）を全ての参加者で測定する。ＯＲＲは、完全奏効（ＣＲ）または部分奏効（ＰＲ）を達成する参加者の比率と定義される。ＰＦＳは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの第１の用量の日から、疾患進行または死亡のうちどちらか最初に起こった方までの時間と定義される。ＤＯＲは、参加者の最初のＣＲまたはＰＲから疾患進行のときまでの時間と定義される。

【0370】

実施例２．インビトロで抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＬＳＥＣｔｉｎ ｓｉＲＮＡコンジュゲートが黒色腫細胞増殖を阻害する
[0397]インビトロにおける研究を実行して、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびＬＳＥＣｔｉｎを標的化するｓｉＲＮＡを含む例示的な抗体−ＲＮＡコンジュゲートを使用して起こり得る腫瘍細胞阻害を評価する。Ｂ１６細胞は、確立された黒色腫細胞株由来の細胞であり、これを１０％の熱不活性化ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリンが補充されたＤＭＥＭ中で培養する。５％ＣＯ_２を含む加湿したインキュベーター中で、３７℃で細胞を維持し、これを限られた数の継代数で実験に使用する。細胞のシーディング後の日、およびその後１日おきに、増殖培地を交換する。

【0371】

[0398]実験の前にＢ１６細胞を２４−ウェルプレート中にシーディングし、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地中で密集状態になるまで成長させる。２つの異なる量の抗体−ＲＮＡコンジュゲートを試験する。１および５マイクログラム（μｇ）の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＬＳＥＣｔｉｎ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを完全培地中の細胞に添加し、そのまま細胞上で、サイレンシング分析を実行する前の７２時間インキュベートする。陽性対照の場合、ＩｇＧ抗体を、高いレベルのノックダウン（例えば、＞７０％）を達成することがわかっているｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲートする。陰性対照の場合、ＩｇＧ抗体を、非特異的なｓｉＲＮＡとコンジュゲートする。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＬＳＥＣｔｉｎ ｓｉＲＮＡコンジュゲートとの７２時間のインキュベーション後、ＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡレベルを評価する。サイレンシング分析の結果は、ＬＳＥＣｔｉｎのノックダウンの成功を示す。加えて、細胞増殖アッセイを実行して、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＬＳＥＣｔｉｎ ｓｉＲＮＡコンジュゲートとのインキュベーション後のＢ１６細胞の増殖率を評価する。両方の条件（すなわち、１および５μｇの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＬＳＥＣｔｉｎ ｓｉＲＮＡコンジュゲート）で細胞死が観察された。陰性または陽性対照では、細胞死は観察されない。

【0372】

実施例３．インビボでの乳がんにおける抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＶＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの抗転移能の研究
[0399]インビボの研究を実行して、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体およびＶＣＡＭ−１標的化ｓｉＲＮＡを含む抗体−ＲＮＡコンジュゲートの抗転移能を評価する。ＶＣＡＭ−１発現は、インビトロにおけるサイトカイン刺激によって、多くの乳がん上皮細胞において誘導することができ、その上方調節は、進行中の臨床的な乳がん段階と直接的に相関する。ＮＭｕＭＧ乳房上皮細胞におけるＶＣＡＭ−１過剰発現は、インビトロにおいて、細胞の運動速度の増加およびドキソルビシンおよびシスプラチンに対する化学療法耐性の増加を引き起こす上皮間葉移行（ＥＭＴ）プログラムを制御する。

【0373】

[0400]これらのインビトロにおける結果がインビボモデルに反映されるかどうかをさらに確認するために、Ｂ６重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの両脇腹に、ｅＧＦＰ ｓｈＲＮＡ陽性対照細胞で安定してトランスフェクトされたヒト乳腺癌細胞（すなわち、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）、ならびに３つの異なる用量：１０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇでの抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＶＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを皮下注射した。２カ月後、マウスを苦痛なく致死させて解剖を行う前に対照ベクターおよび抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＶＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートでトランスフェクトされた細胞を注射したマウスにおいて、著しいグロスの腫瘍増大が見出される。予想通りに、ＶＣＡＭ−１ノックダウンＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、インビボにおいて、対照グループと比較して２〜３分の１に低減した腫瘍原性を示す。それに対し、ウェスタンブロットアッセイは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍試料において、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＶＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートがＶＣＡＭ−１発現を効果的に抑制したことを確認した。

【0374】

[0401]さらに、最小有効量および最大耐量を見出すために、腫瘍増殖を誘導するために両脇腹にヒト乳腺癌細胞（すなわち、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）が皮下注射されるＳＣＩＤマウスを含む第２の実験を実行する。マウスにおいて著しいグロスの腫瘍増大が見出されたら、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＶＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを、３つの異なる用量：１０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇで抗体−ＲＮＡコンジュゲートを受けるマウスの３つのグループに投与する。２カ月後、マウスを苦痛なく致死させて解剖を行う。インビボで、１０μｇ／ｋｇおよび５００μｇ／ｋｇのグループの両方において、対照グループと比較して腫瘍原性が低減する。したがって、最小有効量は、１０μｇ／ｋｇであると見出され、一方で最大耐量は、５００μｇ／ｋｇである。３０ｍｇ／ｋｇ用量の抗ＴＭ４ＳＦ１抗体−抗ＶＣＡＭ−１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートのみが注射されたマウスのみが、注射後１カ月生存する。

【0375】

[0402]内因性ＶＣＡＭ−１発現の相乗的なノックダウンおよびＴＭ４ＳＦ１の標的化は、インビボにおいて、腫瘍細胞増殖を低減する、ＴＧＦβ１またはＩＬ−６によって媒介される腫瘍細胞の細胞移動を阻害する、および化学感受性を増加させる。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における内因性ＶＣＡＭ−１発現のノックダウンおよびＴＭ４ＳＦ１の標的化が、ＳＣＩＤ異種移植片マウスモデルにおいて腫瘍形成を低減することが実証される。

【0376】

実施例４．本開示の例示的な抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製および特徴付け
[0403]コンジュゲーションのためのシステインが操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の調製：システインが操作された抗ＴＭ４ＳＦ１モノクローナル抗体（操作されたシステインを有する抗Ｔｍ４ＳＦ１抗体）を、以下のプロトコールに従って、オリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションのために調製した：約１４５μｇから１ｍｇの裸のシステインが操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の緩衝液を、５０ＫＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のスピンカラムを使用して１０〜１００ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）７．４〜８．０に交換した（緩衝液交換のために３回の遠心分離を行った）。新しく希釈した５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）−ＨＣｌ ｐＨ７（アンプル０．５Ｎストックからの５ｍＭのＴＣＥＰアリコートを必要になるまで凍結した）を調製した。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の４つのヒンジジスルフィドおよび２つの操作されたシステイン残基の完全な還元のために、約１０当量のＴＣＥＰを抗体溶液に添加した。混合物を、サーモミキサー中の３００ｒｐｍでのシェーカープレートで、３７℃で約２時間インキュベートした。完全に還元された抗体を約４℃で冷却し、続いて緩衝液を、５０ｋのＭＷＣＯのスピンカラム（１４ｋ ｒｐｍ、４℃で）を使用して、５ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのＰＢＳ８．０に３回交換した。緩衝液の交換後、ＰＢＳ８．０中の２５ｍＭのストック溶液の２５当量〜５０当量のデヒドロアスコルビン酸を添加した。分析用サイズ排除クロマトグラフィー（分析ＳＥＣ）を実行して、完全に還元された抗体が無傷であり、軽鎖と重鎖に断片化されていないかどうかをチェックした。抗体を所定期間（４℃で約３時間から約１８時間）にわたり再酸化した。完全に再酸化された抗体を再び分析ＳＥＣを介してチェックした。還元されたｍＡｂの分析ＳＥＣの結果および裸のｍＡｂの分析ＳＥＣの結果を比較した。還元および再酸化された操作されたシステインを有する抗ＴＭ４ＳＦ１抗体は、約０．５分超から約０．９分のＲＴ（保持時間）で右にシフトすることが予想された。

【0377】

[0404]還元および再酸化された操作されたシステインを有する抗体（小さい分子量を有する）と裸のｍＡｂとの保持時間の差から、システインから遊離のチオールへの脱キャッピングが示された。この段階で、完全に還元された、および再酸化された抗Ｔｍ４ＳＦ１ｍＡｂは、コンジュゲーションにすぐ使えるとみなされ、またはその代わりに、またはそれに加えて、調製された抗体が即座に使用されない場合、冷蔵庫で４℃で貯蔵した。

【0378】

[0405]コンジュゲーションのための操作されていない抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の調製：抗ＴＭ４ＳＦ１モノクローナル抗体（抗Ｔｍ４ＳＦ１ｍＡｂ）を、以下のプロトコールに従って、オリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションのために調製した：約１４５μｇから１ｍｇの裸の非システインが操作された抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の緩衝液を、５０ＫＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のスピンカラムを使用して１０〜１００ｍＭのＰＢＳ７．４〜８．０に交換した（緩衝液交換のために３回の遠心分離を行った）。新しく希釈した５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）−ＨＣｌ ｐＨ７（シグマ（Ｓｉｇｍａ）のアンプル０．５Ｎストックからの５ｍＭのＴＣＥＰアリコートを必要になるまで凍結した）を調製した。抗ＴＭ４ＳＦ１抗体の２つのヒンジジスルフィドの部分的な還元のために、抗体溶液に約１０当量のＴＣＥＰを添加した。混合物を、サーモミキサー中の３００ｒｐｍでのシェーカープレートで、３７℃で約２時間インキュベートした。還元された抗体を約４℃で冷却した。分析用サイズ排除クロマトグラフィー（分析ＳＥＣ）を実行して、還元された抗体が無傷であり、軽鎖と重鎖に断片化されていないかをチェックした。還元されたｍＡｂの分析ＳＥＣの結果と裸のｍＡｂ（還元を経ていない）の分析ＳＥＣの結果を比較した。還元されたｍＡｂは、裸のｍＡｂに対して右へのシフトを示すことが予想された。この段階で、還元された抗Ｔｍ４ＳＦ１ｍＡｂは、コンジュゲーションにすぐ使えるとみなされ、またはその代わりに、またはそれに加えて、調製された抗体が即座に使用されない場合、冷蔵庫で４℃で貯蔵した。

【0379】

[0406]切断可能なリンカーへのオリゴヌクレオチドペイロードのコンジュゲーション：３’または５’鎖に第一アミン−コンジュゲーションハンドルを有するオリゴヌクレオチドを、水または５０ｍＭリン酸緩衝食塩水中の１ｍＭの濃度で、２０ｎｍｏｌスケールで等分した。オリゴヌクレオチドが固体の場合、それを１ｎｍｏｌ／１μＬ濃度で希釈した。オリゴヌクレオチドを緩衝液中に溶解させたら、Ａｍｉｃｏｎの３Ｋ分子量カットオフフィルターを使用して、約７．２〜８．０の間のｐＨを有する５０〜１００ｍＭのＰＢＳに交換した。オリゴヌクレオチドに５０当量のＮＨＳ−活性化ジスルフィド（Ｓ−ピリジル基を有する）を添加し、室温で３時間、または４℃で一晩反応させた。次いで粗製コンジュゲート（体積２０μＬから１００μＬ）を、Ｇ−４５ ＳｅｐｈａｄｅｘカラムまたはＰＤ−１０カラムを使用して１００％純水に精製した。溶出した画分を一晩、固体に凍結乾燥した。約１ｍＭから約１０ｍＭのコンジュゲート濃度を有するストック溶液を、５０ｍＭ〜１００ｍＭのＰＢＳへの再構成により調製した。ＮａｎｏＤｒｏｐを２６０ｎＭで使用して濃度を定量した。

【0380】

[0407]切断不可能なリンカーへのオリゴヌクレオチドペイロードのコンジュゲーション：３’または５’鎖に第一アミン−コンジュゲーションハンドルを有するオリゴヌクレオチドを、水または５０ｍＭリン酸緩衝食塩水中の１ｍＭの濃度で、２０ｎｍｏｌスケールで等分した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたカルボン酸またはテトラフルオロフェニルで活性化された基を有するマレイミドまたはブロモ−アセトアミドヘテロ官能性リンカーの１００ｍＭのＤＭＳＯストック溶液を調製した。約５０当量から約１００当量のリンカーを、約７．４のｐＨでのＰＢＳ中の第一アミンを含有するオリゴヌクレオチドに添加し、室温で１〜２時間反応させた。粗製リンカー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、純水で平衡化したＰＤ−１０カラムを使用して精製した。例えば、ＰＤ−１０カラムは、５倍体積（約２５ｍｌ）の純水で平衡化でき、粗混合物を約２．５ｍｌ未満またはそれに等しい量でローディングし、次いで３．５ｍｌの水で溶出した。リンカー−ペイロードコンジュゲートを一晩凍結乾燥して固体を生成し、これをその後、約７．４のｐＨでのＰＢＳで希釈し、必要に応じて使用した。

【0381】

[0408]例示的なリンカー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの特徴付け：天然のオリゴヌクレオチドおよびリンカー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに対する質量分析データを、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ＸＴ Ｑ−ＴｏＦ ＬＣＭＳで、ネガティブモードで得た。各粗製または精製試料を粉末になるまで凍結乾燥した。およそ１０〜１２μｇを８０μＬの水中に再懸濁して、約１０μＭの濃度を有するストック溶液を生産した。２０μＬのストック溶液の２０μＬの水での希釈を介して、５μＭ試料をプラスチックバイアル中に作製した。全ての注射は５μＬ体積であった。勾配方法は、以下の表で示され、図４、図５、および図６はそれぞれ、裸のオリゴ（Ｈｕ Ｓ）、リンカーオリゴヌクレオチドコンジュゲート（切断不可能なＭＣＣリンカーを使用してコンジュゲートした）、およびリンカーオリゴヌクレオチドコンジュゲート（切断可能なリンカー「ＳＰＤＤまたはＤｉｓｕｌｓｉｄｅまたはＳ−Ｓ」を使用してコンジュゲートした）に関するＬＣ−ＭＳの結果を示す。

【0382】

[0409]

【0383】

【表2】

【0384】

[0410]コンジュゲーションにすぐ使える抗ＴＭ４ＳＦ１抗体（例えば上述したように生成された完全に還元された操作されたシステインを有する抗体）へのリンカー−オリゴヌクレオチドペイロードのコンジュゲーション：約１．５から２．５モル濃度過量のオリゴリンカーペイロード（例えば上述したように調製されたＭＣＣ−オリゴ）を還元されたｍＡｂに添加し、５０ｋＤａのＭＷＣＯのスピンカラムを使用して緩衝液を交換した。リンカー−オリゴヌクレオチドペイロードおよびｍＡｂを室温で約２から４時間コンジュゲートした（あるいは、そのまま反応を４℃で一晩進行させることも可能である。コンジュゲートを分析ＳＥＣによってモニターして、２８０ｎＭ（ｍＡｂから）および２６０ｎＭ（リンカー−オリゴヌクレオチドペイロードから）における吸光度のオーバーラップを同定した。半分取ＳＥＣを、Ａｇｉｌｅｎｔの、２．７ミクロン、４．６ｍｍから３００ｍｍのＳＥＣカラムを介して、１５分の期間にわたり０．３５ｍＬ／分の流速で行った。代わりに、ＩＤ７．８ｍｍのカラムを約１ｍｇから約３ｍｇのローディングで使用することも可能であった。半分取ＳＥＣの流出物から画分を収集し、約７．４のｐＨでのＰＢＳを使用して、５０ｋＤａのＭＷＣＯのスピンカラム（３回の遠心分離）を使用して濃縮した。分析ＳＥＣ、続いて、２８０ｎｍでの吸光度、ならびに２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸光度の比率（Ａ２６０／Ａ２８０）を介したＮａｎｏＤｒｏｐ定量を使用して、所望の最終生成物の特徴をチェックし、一部の場合において（使用される色素に応じて）、吸光度を５４７ｎｍで測定した。図３に、この実施例に記載されるプロセスを概説するフローチャートを示す。

【0385】

[0411]リンカー−オリゴヌクレオチドの抗体へのトランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーション：天然ＴＭ４ＳＦ−１抗体の緩衝液を、２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、約８．５のｐＨに、５０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを介して、少なくとも５０μＭの最終濃度まで交換した。約１．５〜１０当量の求核性アミンを含有するオリゴヌクレオチドを抗体に添加した。アシル−アクセプターは、硫黄以外のあらゆるヘテロ原子であり得る。最後に、触媒的な当量から化学量論的な当量の微生物トランスグルタミナーゼ（本明細書では「ｍＴＧアーゼ」または「ＴＧ」：味の素のアクティバＴ１とも称される）を、約８．５のｐＨを有する２０μＭのトリスストック溶液（またはｍＴＧアーゼの白色粉末形態からの８０ｍｇ／ｍｌ）として添加した。粗製コンジュゲーション混合物を、サーモミキサーで３７℃で１時間加熱した。次いでサーモミキサーを一定速度で４℃に昇温し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを介してモニターしながらかき混ぜる。ＰＤ−１０、５０ｋのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ、プロテインＡまたはＳＥＣ−ＨＰＬＣ技術を介して粗製反応物を精製する。ｍＴＧアーゼの除去は、最終的に回収された所望の生成物／コンジュゲートの分析ＳＥＣまたはＳＤＳ−ゲルによる確認によって除去を確認するために重要であった。図７は、ＡＲＣ（トランスグルタミナーゼベースコンジュゲーションを使用して調製された）で行われた分析ＳＥＣの結果を示す。

【0386】

[0412]ｍＴＧアーゼベースのコンジュゲーションを使用して調製されたＡＲＣを、分析ＳＥＣを使用して特徴付けた。図８〜１０に結果を示す（各図は、２２０ｎｍ（図８）、２６０ｎｍ（図９）、または６４７ｎｍ（図１０）での吸光度測定での、コンジュゲートしていないｍＡｂと、ＢＣＬ２Ｌ１ｓｉＲＮＡにＭＣＣリンカーを介してコンジュゲートしたｍＡｂとの比較を示す。ｍＴＧアーゼベースのコンジュゲーションを使用して調製された追加のＡＲＣを、分析ＳＥＣを使用して特徴付けた。図１１〜１３に結果を示す（各図は、２２０ｎｍ（図１１）、２６０ｎｍ（図１２）、または６４７ｎｍ（図１３）での吸光度測定での、コンジュゲートしていないｍＡｂと、ＭＣＬｓｉＲＮＡにＭＣＣリンカーを介してコンジュゲートしたｍＡｂとの比較を示す。さらなるＡＲＣを使用して調製されたｍＴＧアーゼベースのコンジュゲーションを、分析ＳＥＣを使用して特徴付けた。図１４〜１６に結果を示す（各図は、２２０ｎｍ（図１４）、２６０ｎｍ（図１５）、または６４７ｎｍ（図１６）での吸光度測定での、コンジュゲートしていないｍＡｂと、ＣＴｓｉＲＮＡにＭＣＣリンカーを介してコンジュゲートしたｍＡｂとの比較を示す。さらなるＡＲＣを使用して調製されたｍＴＧアーゼベースのコンジュゲーションを、分析ＳＥＣを使用して特徴付けた。図１７〜１９に結果を示す（各図は、２２０ｎｍ（図１７）、２６０ｎｍ（図１８）、または６４７ｎｍ（図１９）での吸光度測定での、コンジュゲートしていないｍＡｂと、ＴＭ４ＳＦ１ｓｉＲＮＡにＭＣＣリンカーを介してコンジュゲートしたｍＡｂとの比較を示す。

【0387】

[0413]例示的な抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート（特に、抗体−ＲＮＡコンジュゲート、本明細書ではＡＲＣとも称される）の精製：例示的なＡＲＣ（３’末端にＮＨ２−アミンリンカー／スペーサーおよび５’末端にＤｙ５４７色素を有する二本鎖ｓｉＲＮＡを含有する；例示的なｓｉＲＮＡ配列は、配列番号１０２〜２７３として提供される）を、ＡｇｉｌｅｎｔからのＢｉｏ−Ｉｎｅｒｔ １２６０ＨＰＬＣを利用して精製した。Ｃｏｒｎｉｎｇから供給された約７．４のｐＨのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、系に導入する前に、０．２２ミクロンフィルターに通過させて３回濾過した。移動相を、１泳動当たり約１ｍＬ／分で約７．５分、Ａｇｉｌｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｉｏ ＳＥＣ ３００オングストローム、孔径２．７ミクロン、７．８ｍｍ×１５０ｍｍのカラムを通して泳動した。時間ベースの画分収集物を使用してＡＲＣを回収して、コンジュゲートしていない反応物ストックからの回収および分離を最大化した。収集後、５０ｋＤａのＭＷＣＯのスピンカラムでの遠心分離を介してＡＲＣを濃縮した。滅菌を確実にするために、ＡＲＣを０．２２ミクロンフィルターに通過させて濾過した。

【0388】

[0414]ＡＲＣ濃度を分光光度法により測定した。２８０ｎｍで吸光度を測定した。オリゴヌクレオチドの場合、２６０ｎｍおよび５４７ｎｍ（オリゴヌクレオチド上にＤｙＬｉｇｈｔ５４７色素が存在する場合）で吸光度を測定することによって濃度を決定した。２８０ｎｍにおけるより大きいピークによってｓｉＲＮＡのローディングを確認し、次いで５４７ｎｍでオーバーラップする波長を確認した。

【0389】

[0415]所望の生成物であるＡＲＣを、ｐｒｅｐ−ＳＥＣ−ＨＰＬＣを介して、またはＡＲＣを１００ｋＤａのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎスピンカラムに通過させること（７回の遠心分離）によって単離し、続いて約７．４のｐＨを有するＰＢＳ中で５０ｋＤａのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎスピンカラムを使用して濃縮した。

【0390】

[0416]図２０Ａ〜２０Ｄは、様々な抗体およびコンジュゲートのＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。図２０Ａは、Ｎ２９７Ｃ突然変異を含む裸のヒトＡＧＸ−Ａ０７抗体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図２０Ｂは、裸のＳＰＤＰ−ＴＭ４ＳＦ１−ＨｕｓｉのＨＰＬＣクロマトグラムを示す；図２０Ｃは、Ｎ２９７Ｃ−Ｓ−Ｓ−ＴＭ４ＳＦ−１−Ｈｕｓｉを含むヒトＡＧＸ−Ａ０７の粗製コンジュゲートを示す；図２０Ｄは、例示的な精製されたＡＲＣを示す。図２１は、試薬ＳＰＤＰを利用して、抗体をリンカーオリゴヌクレオチドコンジュゲートにコンジュゲートするステップの例示的なプロトコールを示す（図中のＴｈｉｏｍＡｂ（商標）は、システインが操作された抗体を指す）。

【0391】

[0417]実施例５：本開示の例示的なＡＲＣの生物学的な特性
[0418]いくつかの例示的なＡＲＣを、本明細書に記載のノックダウンアッセイで研究した。簡単に言えば、細胞を培養し、約３時間後に、ＡＲＣ（表５で列挙された対照ｓｉＲＮＡ配列または試験ｓｉＲＮＡ配列のいずれかを含有する；安定化改変を含有するｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）によって合成した）を添加した。ＡＲＣを添加した細胞を一晩培養した。この工程で、細胞の１つのグループは継代培養し、別のグループは継代培養しなかった。約３時間後に細胞を画像化した、さらに約２４時間にも画像化した。試料をさらに処理して、ＲＮＡまたはタンパク質発現を測定した。図２５、２８Ａ、２９Ａ、３０Ａ、３１Ａ、および３２Ａに、インキュベーションの間に使用されたＡＲＣのモル量／濃度を示す。量が１０ｐｍｏｌと示される場合（図２５を参照）、２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ（例えば、図２５のＴＭ４ＳＦ１ ｓｉＲＮＡ）は２：１のＯＡＲでコンジュゲートされて、１０ｐｍｏｌのＡＧＸ−ＴＭ−ＴＭ４ＳＦ１ｓｉ ＡＲＣが得られた。インキュベーションの間、１ｍＬの培養培地を含有するウェルに（１２ウェルプレートで）１０ｐｍｏｌのＡＧＸ−ＴＭ４ＳＦ１ｓｉ ＡＲＣを添加した。したがってＡＲＣの濃度は１０ｎＭであった。同様に、量が５０ｐｍｏｌと示される場合（図２８Ａ、２９Ａ、３０Ａ、３１Ａ、および３２Ａを参照）、１００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ（例えば、ＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡ、ＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡ）が、１：２のＯＡＲ比率で抗ＴＭ４ＳＦ１抗体にコンジュゲートされて、５０ｐｍｏｌのＡＲＣが得られ、上記で説明したように、インキュベーションの間のＡＲＣの濃度は５０ｎＭであった。

【0392】

[0419]プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）が補充された放射免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中で細胞をホモジナイズした。ＳＤＳ緩衝液を添加し、続いて５分沸騰させることにより変性させた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に移した。０．１％トウィーン２０を含有するトリス緩衝化食塩水中の１％ＢＳＡで膜をブロックし、続いてブロッキング溶液で希釈された一次抗体で処置した。抗ＢＣＬ２Ｌ１をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。免疫複合体を、近ＩＲ色素（Ｌｉ−Ｃｏｒ９２４−３２２１１）にコンジュゲートした適切な二次抗体と反応させ、Ｌｉ−Ｃｏｒ ＣＬＸで可視化した。図２２は、ＡＲＣの考えられる作用機序を示す。

【0393】

[0420]図２３Ａ〜２３Ｅは、ＢＣＬ２Ｌ１およびＭＣＬ１標的化ｓｉＲＮＡを使用したＨＵＶＥＣ細胞におけるノックダウンを示す。対照と比較して（図２３Ａ）：（ｉ）９５％より多くのＨＵＶＥＣ細胞が、ＢＣＬ２Ｌ１ノックダウンの７２時間後に致死した（図２３Ｂ）；（ｉｉ）安定化されたＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡで類似のノックダウン活性が見られた（図２３Ｃ）；（ｉｉｉ）ＭＣＬ１で約９０％の細胞死が見られた（図２３Ｄ）；および（ｉｖ）ＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡの安定化がＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡ活性に強く影響を与え、わずか約４０％の細胞死を示した（図２３Ｅ）。

【0394】

[0421]ＭＣＬ１、ＢＣＬ２Ｌ１、およびＴＭ４ＳＦ１ ｓｉＲＮＡを使用するノックダウンを、がん細胞株、例えばＡ５４９（非小細胞肺がん細胞株）；ＭｉａＰａｃａ２（膵臓がん細胞株）；およびＳＫＯＶ３（卵巣がん細胞株）でさらに研究した。図２４は、インビトロでの培養したヒト細胞、加えて内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるｓｉＲＮＡノックダウン研究からのデータを提供する。ＴＭ４ＳＦ１ ｓｉＲＮＡの場合：全ての４つの細胞型でノックダウンは９０％を超えた。ｓｉＲＮＡ安定化は、ノックダウン活性に影響を与えなかった。ＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡの場合：ノックダウンはＨＵＶＥＣにおいて９０％を超えたが、腫瘍細胞株ではそれより弱かった（平均７０〜８０％）。ｓｉＲＮＡ安定化は、ノックダウン活性に影響を与えなかった。ＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡの場合：ノックダウンはＨＵＶＥＣにおいて８０％を超えたが、腫瘍細胞株ではそれより弱かった（平均５５〜６６％）。ｓｉＲＮＡ安定化はノックダウン活性に影響を与えた（平均ノックダウンは３４％から４８％であった）。各細胞型につき、Ｃｔｌは、対照ｓｉＲＮＡを意味し；−は、いかなる改変も含まないｓｉＲＮＡを意味し；Ｄｙｅは、５’センス鎖にＣｙ５またはＤｙ５４７色素コンジュゲーションを有するｓｉＲＮＡを意味し；色素−安定化（Ｄｙｅ−ｓｔａｂｌｅ）は、色素コンジュゲーションおよび安定化改変の両方を有するｓｉＲＮＡを意味する。図２４のｎ．ａ．は、データの入手不可か、または実験が実行されなかったかのいずれかである。

【0395】

[0422]図２５は、安定なリンカーを介してＴＭ４ＳＦ１ｓｉ ＲＮＡにコンジュゲートした抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を含有するＡＲＣ（ＡＧＸ−Ａ０７）を使用したＨＵＶＥＣにおけるノックダウンアッセイの結果を示す。この研究のために、ＡＲＣを培養培地に直接添加し、細胞を継代培養するときに除去した。継代培養の２４時間後に色素強度が減衰したことから、ＴＭ４ＳＦ１ ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣによってプロセシングされたことが示される。ｍＲＮＡ発現（図２６における）は、例示的なＴＭ４ＳＦ１ ＡＲＣでの約３７％のＴＭ４ＳＦ１ノックダウンを示す。対照ｓｉＲＮＡ ＡＲＣでノックダウンは見られなかった。図２７に、ＡＧＸ−Ａ０７およびＴＭ４ＳＦ１ ｓｉＲＮＡを含有するＡＲＣ（ＡＧＸ−ＴＭ−ｓｉＲＮＡ）を使用したノックダウンアッセイの定量的データが提供される。

【0396】

[0423]ＨＵＶＥＣにおける類似のノックダウン研究をＡＧＸ−Ａ０７およびＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡを含有するＡＲＣで行った。結果を図２８Ａ〜２８Ｄに示す。ＡＲＣを培養培地に直接添加し、細胞を継代培養するときに除去した。継代培養の２４時間後にｓｉＲＮＡシグナルが減衰したことから、ＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣによってプロセシングされたことが示される。ｍＲＮＡ発現は、約２９．４％のＢＣＬ２Ｌ１ノックダウンを示した（図２８Ｂ）。ウェスタンブロットは、ＢＣＬ２Ｌ１の約１５．７％のノックダウンを示した（図２８Ｃ）。免疫染色は、減衰した陽性染色されたシグナルを示すｍＲＮＡおよびタンパク質の結果の両方を支持した（図２８Ｄ）。ＢＣＬ２Ｌ１ ｓｉＲＮＡを含有するＡＲＣも、Ａ５４９細胞で（図２９Ａ〜２９ｂに結果を示す）（ｍＲＮＡ発現は、約１４．４％のＢＣＬ２Ｌ１ノックダウンを示し、ｓｉＲＮＡシグナルは継代培養の２４時間後に減衰したことから、ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣによってプロセシングされることが示される）；ＭｉａＰａｃａ２細胞で（図３０Ａ〜３０Ｂに結果を示す）（ｓｉＲＮＡシグナルは継代培養の２４時間後に減衰したことから、ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣによってプロセシングされることが示され、ｍＲＮＡ発現は、ＭｉａＰａｃａ２においてＢＣＬ２Ｌ１ノックダウンを示さなかった）；ＳＫＯＶ３細胞で（図３１Ａ〜３１Ｂに結果を示す）（ｓｉＲＮＡシグナルは継代培養の２４時間後に減衰したしたことから、ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣによってプロセシングされることが示され、ｍＲＮＡ発現は、約５．２９％のＢＣＬ２Ｌ１ノックダウンを示した）試験した。

【0397】

[0424]ノックダウン研究を、ＡＧＸ−Ａ０７およびＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡを含有するＡＲＣを有するＨＵＶＥＣ細胞で行った。結果は、図３２Ａ〜３２Ｂに示される。ＡＲＣを培養培地に直接添加し、細胞を継代培養するときに除去した。ｓｉＲＮＡシグナルは継代培養の２４時間後に減衰したことから、ＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣによってプロセシングされることが示される。ｍＲＮＡ発現は、約１０．４％のＭＣＬ１ノックダウンを示した。安定化されたＭＣＬ１が元のＭＣＬ１ ｓｉＲＮＡ活性の５０％を失っていた事実によって、ノックダウン効率が影響を受けた可能性があるという仮説を立てた。

【0398】

[0425]

【0399】

【表3-1】

【0400】

【表3-2】

【0401】

【表3-3】

【0402】

【表3-4】

【0403】

【表3-5】

【0404】

【表3-6】

【0405】

【表3-7】

【0406】

【表3-8】

【0407】

[0426]

【0408】

【表4-1】

【0409】

【表4-2】

【0410】

【表4-3】

【0411】

【表4-4】

【0412】

【表4-5】

【0413】

【表4-6】

【0414】

[0427]

【0415】

【表5】

【0416】

[0428]本発明の開示の好ましい実施形態を本明細書に示し記載したが、このような実施形態は一例として提供されたに過ぎないことは当業者にとって明白であろう。ここで多数のバリエーション、変化、および置換が、本開示から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。本明細書に記載の開示の実施形態に対する様々な選択肢が本開示の実行に採用され得ることが理解されるはずである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによりカバーされることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29-1】

【図29-2】

【図30-1】

【図30-2】

【図31-1】

【図31-2】

【図32-1】

【図32-2】

【国際調査報告】