特表 2021-528052 強力で選択的なインターロイキン模倣体のデノボ設計

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-528052(P2021-528052A)

(43)【公表日】2021年10月21日

(54)【発明の名称】強力で選択的なインターロイキン模倣体のデノボ設計

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/19 20060101AFI20210924BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210924BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210924BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210924BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210924BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210924BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20210924BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20210924BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210924BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210924BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20210924BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20210924BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20210924BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20210924BHJP

   G16B 99/00 20190101ALI20210924BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/19

   C12N15/63 ZZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K14/52

   A61K38/19

   A61K45/00

   A61K35/17 Z

   A61K35/12

   A61K48/00

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P37/02

   A61K31/7088

   A61K47/64

   A61K47/60

   G01N33/68

   G16B99/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】160

(21)【出願番号】特願2020-567827(P2020-567827)

(86)(22)【出願日】2019年6月24日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月23日

(86)【国際出願番号】US2019038703

(87)【国際公開番号】WO2020005819

(87)【国際公開日】20200102

(31)【優先権主張番号】62/689,769

(32)【優先日】2018年6月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/768,733

(32)【優先日】2018年11月16日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ

２．ＺＩＧＢＥＥ

(71)【出願人】

【識別番号】517075883

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ワシントン

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】シルバ マンサノ，ダニエル，アドリアーノ

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ショーン

(72)【発明者】

【氏名】ウルゲ，ウムット

(72)【発明者】

【氏名】ベイカー，デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア，ケナン，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】シュパングラー，ジェイミー

(72)【発明者】

【氏名】ウォーキー，カール

(72)【発明者】

【氏名】キジャーノ ルビオ，アルフレード

(72)【発明者】

【氏名】ジュード，ケビン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイツナー，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】マルコス，エンリケ

(72)【発明者】

【氏名】カステリャーノス，ハビエル

【テーマコード（参考）】

2G045

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CB02

2G045DA36

2G045FB03

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC19

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF63

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA11

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084DA12

4C084NA14

4C084ZA891

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC752

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZB07

4C086ZB26

4C086ZB27

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087CA04

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA20

4H045BA17

4H045DA01

4H045DA04

4H045EA20

(57)【要約】

【課題】癌治療のためのＩＬ−２およびＩＬ−４などの中心的な免疫サイトカインであるインターロイキンの大きな可能性は、変異および／または化学修飾によってそれらの治療特性を改善するための多くの努力を誘発した。
【解決手段】ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）、ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）、またはＩＬ−１３受容体αサブユニット（ＩＬ−１３Ｒα）に結合するデノボ設計ポリペプチドが開示され、ならびに当該ポリペプチドを使用する方法および設計する方法が開示される。
【選択図】図３Ｅ

[この文献は図面を表示できません]

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含む、非天然ポリペプチドであって、
（ａ）Ｘ１は、

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１）と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸長のヘリックスペプチドであり、
（ａ）Ｘ３は、

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号２）と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ａ）Ｘ４は、

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号３）と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、前記ポリペプチド内で任意の順序であり得、
アミノ酸リンカーが、前記ドメインのいずれかの間に存在し得、
前記ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）、ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）、またはＩＬ−１３受容体αサブユニット（ＩＬ−１３Ｒα）に結合する、ポリペプチド。

【請求項2】

（ｉ）Ｘ１は、以下の、残基２にＨ、および残基５にＹ、のうちの片方または両方を含み、かつ／あるいは、
（ｉｉ）Ｘ３は、以下の、残基１にＹ、残基３にＦ、残基４にＮ、残基７にＬ、および残基８にＩ、のうちの１、２、３、４、または５つすべてを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基８にＩを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

（ｉ）Ｘ１は、残基２にＥ、および残基５にＫを含み、かつ
（ｉｉ）Ｘ３は、残基１にＦ、残基３にＫ、残基４にＲ、残基７にＲ、および残基８にＮを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基８にＦを含む、請求項１または４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

Ｘ１は、ペプチド

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ３は、ペプチド

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、かつ
Ｘ４は、ペプチド

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

（ｉ）Ｘ１は、以下の、残基７にＬ、残基８にＨ、残基１１にＨ、残基１４にＹ、残基１８にＭ、のうちの１、２、３、４、または５つすべてを含み、かつ／または
（ｉｉ）Ｘ３は、以下の、残基３にＤ、残基４にＹ、残基６にＦ、残基７にＮ、残基１０にＬ、残基１１にＩ、残基１３にＥ、または残基１４にＥ、のうちの１、２、３、４、５、６、７、または８つすべてを含む、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基１９にＩを含む、請求項６または７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

Ｘ１は、ペプチド

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号８）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ３は、ペプチド

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号９）と、その長さに沿って、少なくとも３７％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ４は、ペプチド

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１０）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｉ）Ｘ１は、残基７にＩ、残基８にＴまたはＭ、残基１１にＥ、残基１４にＫ、および残基１８にＳを含み、かつ
（ｉｉ）Ｘ３は、残基３にＲ、残基４にＦ、残基６にＫ、残基７にＲ、残基１０にＲ、残基１１にＮ、残基１３にＷ、および残基１４にＧを含む、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項10】

（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基１９にＦを含む、請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

参照ペプチドドメインに対するアミノ酸置換が、太字でマークされたアミノ酸残基で生じない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記参照ペプチドドメインに対するアミノ酸置換が、保存的アミノ酸置換である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記ドメインが、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｘ１−Ｘ３−Ｘ２−Ｘ４、Ｘ１−Ｘ４−Ｘ２−Ｘ３、Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ４、Ｘ４−Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１、Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ１、およびＸ２−Ｘ１−Ｘ４−Ｘ３からなる群から選択される配置で、Ｎ末端からＣ末端に配置されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

配列番号４に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項６〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【表1】

[この文献は図面を表示できません]

【請求項15】

位置７はＩであり、位置８はＭまたはＴであり、位置１１はＥであり、位置１４はＫであり、位置１８はＳである、請求項１４に記載のポリペプチド。

【請求項16】

以下の、位置７はＩ、位置８はＭまたはＴ、位置１１はＥ、位置１４はＫ、および位置１８はＳ、であるのうちの１、２、３、４、または５つが真ではない、請求項１４に記載のポリペプチド。

【請求項17】

配列番号５に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項６〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【表2】

[この文献は図面を表示できません]

【請求項18】

配列番号５に対する位置１７または２０にシステイン置換を含む、請求項６〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項19】

位置３はＲ、位置４はＦ、位置６はＫ、位置７はＲ、位置１０はＲ、位置１１はＮ、位置１３はＷ、および位置１４はＧ、である、請求項１７または１８に記載のポリペプチド。

【請求項20】

以下の、位置３はＲ、位置４はＦ、位置６はＫ、位置７はＲ、位置１０はＲ、位置１１はＮ、位置１３はＷ、位置１４はＧ、であるのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８つすべてが真ではない、請求項１７または１８に記載のポリペプチド。

【請求項21】

配列番号６に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項６〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【表3】

[この文献は図面を表示できません]

【請求項22】

配列番号６に対する位置３にシステイン置換を含む、請求項６〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項23】

位置１９はＩである、請求項２１または２２に記載のポリペプチド。

【請求項24】

位置１９はＩではない、請求項２１または２２に記載のポリペプチド。

【請求項25】

Ｘ２は、

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号７）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項26】

配列番号７に対するアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項２５に記載のポリペプチド。

【表4】

[この文献は図面を表示できません]

【請求項27】

配列番号７に対する位置１、２、５、９、１２、または１６にシステイン置換を含む、請求項２５または２６に記載のポリペプチド。

【請求項28】

位置１１はＩである、請求項２６または２７に記載のポリペプチド。

【請求項29】

位置１１はＩではない、請求項２６または２７に記載のポリペプチド。

【請求項30】

前記ポリペプチドは、配列番号１１〜９４、１０３〜１８４、１９０〜２４３および２４５〜２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項31】

前記ポリペプチドは、配列番号９０および１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項32】

前記ポリペプチドは、配列番号９０のアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含み、以下の変異のうちの１つ、２つ、またはそれ以上が存在する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
Ｒ５０Ｃ、
Ｅ５３Ｃ、
Ｅ６２Ｃ、
Ｅ６９Ｃ、
Ｒ７３Ｃおよび／または
Ｅ８２Ｃ。

【請求項33】

前記ポリペプチドは、配列番号１８１のアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含み、以下の変異のうちの１つ、２つ、またはそれ以上が存在する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
Ｄ５６Ｃ、
Ｋ５８Ｃ、
Ｄ５９Ｃ、
Ｒ６６Ｃ、
Ｔ７７Ｃ、
Ｅ８５Ｃ、
Ｒ５０Ｃ、
Ｅ５３Ｃ、
Ｅ６２Ｃ、
Ｅ６９Ｃ、
Ｒ７３Ｃおよび／または
Ｅ８２Ｃ。

【請求項34】

前記ポリペプチドは、配列番号１９０〜２４３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含み、あるいは、前記ポリペプチドは、配列番号１９５および２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含み、あるいは、前記ポリペプチドは、配列番号１９５のアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含む、請求項３２または３３に記載のポリペプチド。

【請求項35】

前記ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）含有部分を含むがこれに限定されない安定化化合物に連結されている、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項36】

ＰＥＧ含有部分を含むがこれに限定されない前記安定化化合物は、前記ポリペプチドのシステイン残基に連結されている、請求項３５に記載のポリペプチド。

【請求項37】

前記システイン残基が、Ｘ２に存在する、請求項３６に記載のポリペプチド。

【請求項38】

ＰＥＧ含有部分を含むがこれに限定されない前記安定化化合物が、マレイミド基を介して、配列番号９０に対するアミノ酸残基６２に存在するシステイン残基に連結されていることを含むがこれに限定されない、前記システイン残基に連結されている、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項39】

前記ポリペプチドは、配列番号９２、９３、１８３および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項40】

位置７はＩ、位置８はＴまたはＭ、位置１１はＥ、位置１４はＫ、位置１８はＳ、位置３３はＱ、位置３６はＲ、位置３７はＦ、位置３９はＫ、位置４０はＲ、位置４３はＲ、位置４４はＮ、位置４６はＷ、および位置４７はＧである、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項41】

位置６８はＩ、および位置９８はＦである、請求項４０に記載のポリペプチド。

【請求項42】

以下の、位置７はＩ、位置８はＴまたはＭ、位置１１はＥ、位置１４はＫ、位置１８はＳ、位置３３はＱ、位置３６はＲ、位置３７はＦ、位置３９はＫ、位置４０はＲ、位置４３はＲ、位置４４はＮ、位置４６はＷ、および位置４７はＧ、であるのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個すべてが真ではない、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項43】

以下の、位置６８はＩ、および位置９８はＦ、であるのうちの片方または両方が真ではない、請求項４２に記載のポリペプチド。

【請求項44】

前記ポリペプチドは、配列番号１１〜９４、１０３〜１８４、１９０〜２４３、および２４５〜２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％同一のポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項45】

前記ポリペプチドは、配列番号１１〜９４、１０３〜１８４、１９０〜２４３、および２４５〜２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のポリペプチドを含む、請求項４４に記載のポリペプチド。

【請求項46】

前記ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に結合する、請求項４４または４５に記載のポリペプチド。

【請求項47】

（ａ）Ｘ１は、

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１）と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸長のヘリックスペプチドであり、
（ｃ）Ｘ３は、

【化12】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号２）と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号３）と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、前記ポリペプチド内で任意の順序であり得、
アミノ酸リンカーが、前記ドメインのいずれかの間に存在し得、
前記ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項48】

Ｘ１は、ペプチド

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ３は、ペプチド

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、かつ
Ｘ４は、ペプチド

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸を含むペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項49】

Ｘ１は、ペプチド

【化17】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ３は、ペプチド

【化18】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、かつ
Ｘ４は、ペプチド

【化19】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸を含むペプチドである、請求項４８に記載のポリペプチド。

【請求項50】

Ｘ２が、

【化20】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号７）と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項51】

前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＸ２のシステイン残基で、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）含有部分に連結されている、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項52】

前記ポリペプチドは、配列番号１９５および２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のポリペプチドを含み、前記ＰＥＧ含有部分は、配列番号１９５に対するアミノ酸残基６２で、前記システイン残基に連結されている、請求項５１に記載のポリペプチド。

【請求項53】

前記ドメインは、Ｘ１−Ｘ３−Ｘ２−Ｘ４からなる群から選択される配置で、Ｎ末端からＣ末端に配置されている、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項54】

天然ＩＬ−２の三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を有する構造座標を伴う前記三次元構造を有する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１７、２０〜２１、２４〜２６、２９〜３８、４２〜４３および４７〜５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項55】

表Ｅ２の構造座標を有する三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を有する構造座標を伴う三次元構造を有する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１７、２０〜２１、２４〜２６、２９〜３８、４２〜４４および４７〜５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項56】

前記ポリペプチドは、マウスＩＬ−２受容体βγ_ｃとの三元複合体時に、前記マウスＩＬ−２受容体βγ_ｃとの三元複合体時に、天然ＩＬ−２の三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を有する構造座標を伴う前記三次元構造を有する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１７、２０〜２１、２４〜２６、２９〜３８、４２〜４５および４７〜５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項57】

前記平均二乗偏差が、１．５Å未満である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項58】

前記平均二乗偏差が、１Å未満である、請求項５７に記載のポリペプチド。

【請求項59】

天然ＩＬ−４の三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を有する構造座標を伴う前記三次元構造を有する、請求項４〜６、９〜１５、１７〜１９、２１〜２３、２５〜２８、３０、および３９〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項60】

前記平均二乗偏差が、１．５Å未満である、請求項５９に記載のポリペプチド。

【請求項61】

前記平均二乗偏差が、１Å未満である、請求項５９または６０に記載のポリペプチド。

【請求項62】

前記ポリペプチドの前記三次元構造は、計算モデリングを使用して決定される、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項63】

Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、αヘリックスドメインである、請求項１〜６２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項64】

Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸長は、少なくとも約８アミノ酸長である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項65】

Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸長は、少なくとも約１９アミノ酸長である、請求項１〜６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項66】

Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸長は、１０００アミノ酸長以下、５００アミノ酸長以下、４００アミノ酸長以下、３００アミノ酸長以下、２００アミノ酸長以下、１００アミノ酸長以下、または５０アミノ酸長以下である、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項67】

Ｘ１は、ヒトＩＬ−２受容体のβおよびγサブユニットに結合する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５および６２〜６６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項68】

Ｘ２は、前記ヒトＩＬ−２受容体に結合しない、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５５および６２〜６７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項69】

Ｘ３は、前記ヒトＩＬ−２受容体の前記βサブユニットに結合する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５および６２〜６８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項70】

Ｘ４は、前記ヒトＩＬ−２受容体の前記γサブユニットに結合する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５および６２〜６９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項71】

前記ヒトまたはマウスＩＬ−２受容体の前記αサブユニットに結合しない、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５および６２〜７０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項72】

前記結合が、生物学的に適切な濃度で表面プラズモン共鳴によって決定される特異的結合である、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項73】

前記ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性で結合する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５、および６２〜７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項74】

前記ヒトおよびマウスＩＬ−２受容体に対する前記ポリペプチドの親和性は、天然ＩＬ−２の親和性とほぼ同等か、またはそれを超える、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５、および６２〜７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項75】

前記ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）に、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性で結合する、請求項４〜６、９〜１５、１７〜１９、２１〜２３、２５〜２８、３０、３５〜３７、３９〜４１、および５９〜６６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項76】

前記ヒトおよびマウスＩＬ−４受容体に対する前記ポリペプチドの親和性は、天然ＩＬ−４の親和性とほぼ同等か、またはそれを超える、請求項４〜６、９〜１５、１７〜１９、２１〜２３、２５〜２８、３０、３５〜３７、３９〜４１、５９〜６６、および７５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項77】

前記ポリペプチドは、天然ＩＬ−２とほぼ同等またはそれを超える効力で、前記ＩＬ−２受容体を発現する細胞において、ＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５、および６２〜７４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項78】

前記ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体を発現するが前記ＩＬ−２受容体αを欠く細胞において、天然ＩＬ−２とほぼ同等またはそれを超える効力で、前記ＩＬ−２受容体を発現する細胞において、ＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５、６２〜７４、および７７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項79】

前記ポリペプチドは、天然ＩＬ−２の熱安定性とほぼ同等か、またはそれを超える前記熱安定性を示す、請求項２〜３、６〜８、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２２、２４〜２７、２９〜３８、４２〜５５、６２〜７４、および７７〜７８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項80】

熱安定性試験後、そのフォールディングした構造の少なくとも７０％を維持または回復する、請求項１〜７９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項81】

熱安定性試験後、そのフォールディングした構造の少なくとも８０％を維持または回復する、請求項１〜８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項82】

熱安定性試験後、そのフォールディングした構造の少なくとも９０％を維持または回復する、請求項１〜８１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項83】

熱安定性試験後、その楕円率スペクトルの少なくとも８０％を維持または回復する、請求項１〜８２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項84】

熱安定性試験後、少なくとも７０％の活性を維持または回復する、請求項１〜８３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項85】

熱安定性試験後、少なくとも８０％の活性を維持または回復する、請求項１〜８４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項86】

活性が、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによって決定される、請求項８４または８５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項87】

熱安定性が、２２２ｎＭで円二色性（ＣＤ）分光法によって測定される、請求項７９〜８５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項88】

前記熱安定性試験が、前記ポリペプチドを、１時間の時間枠で、２５℃から９５℃に加熱することと、前記ポリペプチドを、５分間の時間枠で、２５℃に冷却することと、２２２ｎｍで、楕円率をモニターすることと、を含む、請求項８７に記載のポリペプチド。

【請求項89】

前記ポリペプチドは、配列番号９０、１８１、または２４７のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一または１００％同一のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、（ｉ）ヒトまたはマウスＩＬ−２Ｒαに結合せず、（ｉｉ）約１１．２ｎＭの親和性で、ヒトＩＬ２ＲＢに結合し、（ｉｉｉ）約１６．１ｎｍの親和性で、マウスＩＬ２ＲＢに結合し、（ｉｖ）約１８．８ｎＭの親和性で、ヒトＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合し、かつ（ｖ）約３．４ｎＭの親和性で、マウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項90】

前記ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む、請求項１〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項91】

前記ジスルフィド結合は、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４ドメインのうちの２つを一緒に連結する、請求項９０に記載のポリペプチド。

【請求項92】

前記ジスルフィド結合は、前記Ｘ１ドメインを、前記Ｘ４ドメインに連結する、請求項９０または９１に記載のポリペプチド。

【請求項93】

前記ジスルフィド結合は、２つのドメインを一緒に連結するジスルフィド結合を有さない実質的に類似のポリペプチドと比較して、前記ポリペプチドの前記熱安定性を改善する、請求項９０〜９２に記載のポリペプチド。

【請求項94】

前記ポリペプチドは、標的化ドメインをさらに含む、請求項１〜９３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項95】

前記標的化ドメインは、前記ポリペプチドとの翻訳融合物である、請求項９４に記載のポリペプチド。

【請求項96】

前記標的化ドメインは、細胞表面タンパク質に結合する、請求項９４または９５に記載のポリペプチド。

【請求項97】

前記細胞表面タンパク質は、腫瘍細胞、血管構成要素、腫瘍微小環境（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）、他の癌細胞および免疫細胞（これらに限定されないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージを含む）からなる群から選択される細胞の表面に存在し、このような免疫細胞表面マーカーは、これらに限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＴＬＡ−４を含む、請求項９６に記載のポリペプチド。

【請求項98】

前記標的化ドメインは、腫瘍細胞、腫瘍血管構成細胞、または腫瘍微小環境細胞の表面マーカーに結合する、請求項９６に記載のポリペプチド。

【請求項99】

前記細胞表面マーカーは、これらに限定されないが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＴＲＯＰ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＢＣＭＡ、ＣＳ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−ＤＣ、ＨＬＤ−ＤＲ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フェリチン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、Ｌｅ^ｙ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１９−９、上皮増殖因子、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＩＬ−２受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ）、線維芽細胞活性化タンパク質、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、エンドシアリン、血管内皮増殖因子、ａｖＢ３、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、ＰＲ１、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロンシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイントタンパク質、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、フコシルＧＭ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａｌ、ｓＬｅ（動物）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＶ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳＬ精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、レグマイン、Ｔｉｅ３、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＲＯＲ２、ＴＲＡＩＬ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｃ２、ＧＡＧＥ、ＥＧＦＲ、ＣＭＥＴ、ＨＥＲ３、ＭＵＣ１５、ＣＡ６、ＮＡＰＩ２Ｂ、ＴＲＯＰ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬｏｒｆ１８６、ＲＯＮ、ＬＹ６Ｅ、ＦＲＡ、ＤＬＬ３、ＰＴＫ７、ＳＴＲＡ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＥＭ２３８、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＴＣＮ１、ＬＩＶ１、ＲＯＲ１、Ｆｏｓ関連抗原１、および下記に列挙されたマーカーを含む群から選択される、請求項９８に記載のポリペプチド、
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体タイプＩＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００１２０３）、
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３４８６）、
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０１２４４９）、
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ３６１４８６）、
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００５８２３）、
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００６４２４）、
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７つのトロンボスポンジンリピート（タイプ１およびタイプ１様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０４０８７８）、
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３５８６２８）、
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２７５４６３）、
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０１７７６３）、
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ−８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２、６回膜貫通型前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ４５５１３８）、
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０１７６３６）、
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来増殖因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−００３２０３またはＮＭ．ｓｕｂ．−−００３２１２）、
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２６００４）、
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０００６２６）、
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含むＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０３０７６４）、
（１７）ＨＥＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１１７３０）、
（１８）ＮＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１８７２８）、
（１９）ＭＤＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＣ０１７０２３）、
（２０）ＩＬ２０Ｒ．α．（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１８４９７１）、
（２１）ブレビカン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２２９０５３）、
（２２）Ｅｐｈｂ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００４４４２）、
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＸ０９２３２８）、
（２４）ＰＳＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＪ２９７４３６）、
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２６０７６３）、
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−４４３１７７．１）、
（２７）ＣＤ２２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−００１７６２．１）、
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連α、Ｉｇβ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面で複合体を形成するＢ細胞特異的タンパク質は、Ｂ−細胞分化に関与するシグナルを伝達する、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−００１７７４．１）、
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化されるＧタンパク質共役型受容体は、リンパ球の遊走と体液防御に機能し、ＨＩＶ−２感染、およびおそらくＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、および白血病の発症に関与する。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−−００１７０７．１）、
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合してそれらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のβサブユニット、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−００２１１１．１）、
（３１）Ｐ２Ｘ５（細胞外ＡＴＰによって開口するイオンチャネルであるプリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、シナプス伝達および神経新生に関与している可能性があり、欠損は特発性排尿筋不安定性の病態生理学に寄与する可能性がある。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−００２５５２．２）、
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−００１７７３．１）、
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質は、Ｂ細胞の活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は全身性エリテマトーデスの患者で疾患活動性の上昇と関連している。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−００５５７３．１）、
（３４）ＦＣＲＨ１（Ｃ２型Ｉｇ様およびＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインに対する推定受容体であるＦｃ受容体様タンパク質１は、Ｂリンパ球の分化に役割を有する可能性がある。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−４４３１７０．１）、および
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞の発生およびリンパ腫形成に役割を有する可能性がある推定免疫受容体、転座による遺伝子の調節解除が、一部のＢ細胞悪性腫瘍で生じる。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−１１２５７１．１）。

【請求項100】

前記標的化ドメインは、免疫細胞表面マーカーに結合し（これらに限定されないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージを含む）、前記免疫細胞表面マーカーは、これらに限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＴＬＡ−４を含み得、かつ／あるいは、前記標的化ドメインは、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＲＯＰ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ３３、ＣＤ２２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ１２３、ネクチン−４、組織因子抗原、ＣＤ１５４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）またはＭＵＣ１６に結合する、請求項９６に記載のポリペプチド。

【請求項101】

前記標的化ドメインは、これらに限定されないが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、モノボディ、ナノボディ、ダイアボディ、抗体（単一特異性または二重特異性抗体を含む）、これらに限定されないがＲＧＤを含む細胞標的化オリゴペプチド、インテグリン結合ペプチド、デノボ設計バインダー、アプタマー、二環ペプチド、コノトキシン、葉酸などの小分子、および前記細胞表面に結合するウイルスを含み得る、請求項９４〜１００のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項102】

請求項１〜１０１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、組換え核酸。

【請求項103】

プロモーターに作動可能に連結された、請求項１０２に記載の組換え核酸を含む、発現ベクター。

【請求項104】

請求項１０２に記載の核酸および／または請求項１０３に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。

【請求項105】

請求項１〜１０１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０２に記載の組換え核酸、請求項１０３に記載の発現ベクター、または請求項１０４に記載の組換え宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項106】

癌を治療するための方法であって、癌を有する対象に、腫瘍を治療するのに有効な量の、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０２に記載の組換え核酸、請求項１０３に記載の発現ベクター、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞、または請求項１０５に記載の医薬組成物を、投与することを含む、方法。

【請求項107】

前記癌は、結腸癌、黒色腫、腎細胞癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、胃癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、メルケル細胞癌、大腸癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮頸癌、および、マイクロサテライト不安定性、腫瘍遺伝子変異量、ＰＤ−Ｌ１発現レベル、またはイムノスコアアッセイ（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒによって開発された）などの診断検査で選択された任意の腫瘍タイプ、からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

対象における癌を治療するためのおよび／または免疫応答を調節するための薬剤としての使用のための、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０２に記載の組換え核酸、請求項１０３に記載の発現ベクター、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞、または請求項１０５に記載の医薬組成物。

【請求項109】

対象における免疫応答を調節するための方法であって、前記対象に、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０２に記載の組換え核酸、請求項１０３に記載の発現ベクター、請求項０１４に記載の組換え宿主細胞、または請求項１０５に記載の医薬組成物、を投与することを含む、方法。

【請求項110】

前記免疫応答は、抗癌免疫応答、組織修復免疫応答、または創傷治癒免疫応答である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記ポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、組換え宿主細胞、または医薬組成物が、生体材料の成分として投与される、請求項１０９または１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記対象に、第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

前記ポリペプチドは、前記第２の治療剤に対する前記対象の免疫応答を増強する、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記第２の治療剤は、化学療法剤またはキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含むがこれに限定されない抗原特異的免疫療法剤を含む、請求項１１２〜１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

方法であって、
計算装置を使用して、タンパク質の複数の残基の構造を決定することであって、前記複数の残基の前記構造は、特定の受容体結合界面を提供する、タンパク質の複数の残基の構造を決定することと、
前記計算装置によって提供される模倣設計プロトコルを使用して、複数の設計された残基を決定することであって、前記複数の設計された残基は、前記特定の受容体結合界面を提供し、前記複数の設計された残基は、前記複数の残基とは異なる、複数の設計された残基を決定することと、
前記計算装置を使用して、前記複数の設計された残基を連結する１つ以上の連結ヘリックス構造を決定することと、
前記計算装置を使用して、複数の組み合わせにわたって、前記１つ以上の連結ヘリックス構造および前記複数の設計された残基を組み立てることによって、前記タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することと、
前記計算装置を使用して、前記第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のために、前記タンパク質の第２のタンパク質骨格を設計することと、
少なくとも前記第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することと、を含む、方法。

【請求項116】

前記模倣設計プロトコルを使用して前記複数の設計された残基を決定することは、理想化された残基のデータベースを使用して、理想化された残基を決定することを含み、前記理想化された残基は、前記複数の設計された残基の設計された残基に関連する、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記理想化された残基のデータベースを使用して前記理想化された残基を決定することは、
前記理想化された残基のデータベースから、前記理想化された残基に関連する１つ以上の理想化された断片を検索することと、
前記１つ以上の理想化された断片を使用して、前記関連する設計された残基を再構築することによって、前記理想化された残基を決定することと、を含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記１つ以上の理想化された断片を使用して前記関連する設計された残基を再構築することは、
前記１つ以上の理想化された断片の対を、前記１つ以上の理想化された断片の前記対のコンビナトリアル断片アセンブリを使用することによって、再連結することと、
デカルト制約骨格最小化を使用して、前記１つ以上の理想化された断片の前記対が、前記複数の設計された残基のうちの２つ以上をリンクするかどうかを決定することと、を含む、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記１つ以上の理想化された断片を使用して前記関連する設計された残基を再構築することは、
前記理想化された残基のデータベースを使用して、前記理想化された残基の重複する断片が、理想化された断片であることを検証することと、
前記理想化された残基が、前記特定の受容体結合界面に関連する標的受容体と衝突しないかどうかを検証することと、
前記理想化された残基が前記特定の受容体結合界面に関連する標的受容体と衝突しないことを検証した後、前記理想化された残基のデータベースを使用して、前記理想化された残基の各位置で最も可能性の高いアミノ酸を決定することと、を含む、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記１つ以上の連結ヘリックス構造および前記複数の組み合わせにわたる前記複数の設計された残基を組み立てることによって前記タンパク質の前記第１のタンパク質骨格を決定することは、
前記１つ以上の理想化された断片の前記対を組み合わせて再結合することによって、前記１つ以上の理想化された断片の前記対を再結合することと、
前記１つ以上の理想化された断片の前記組換え対を使用して、前記タンパク質の前記第１のタンパク質骨格を決定することと、を含む、請求項１１８に記載の方法。

【請求項121】

前記１つ以上の理想化された断片の前記対を組み合わせて再結合することは、前記１つ以上の理想化された断片の前記対の理想化された断片間の相互連結長に基づいて、前記１つ以上の理想化された断片の前記対をランク付けすることを含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記模倣設計プロトコルを使用して前記複数の設計された残基を決定することは、
前記複数の設計された残基の設計された残基の形状を表す１つ以上のパラメトリック方程式を使用して、理想化された残基を決定することと、
前記複数の設計された残基のうちの少なくとも１つの設計された残基で前記理想化された残基を閉じる単一の断片を決定することと、を含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項123】

前記設計された残基は、ヘリックス構造を含み、前記１つ以上のパラメトリック方程式は、前記ヘリックス構造のφ角およびψ角に関連する方程式を含む、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記ヘリックス構造のφ角およびψ角に関連する前記方程式は、前記ヘリックス構造の前記φ角およびψ角の角度ピッチに関連する１つ以上の項を含む、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記タンパク質の前記第２のタンパク質骨格に関連する前記出力を生成することは、前記タンパク質の前記第２のタンパク質骨格に基づいて、１つ以上の分子を設計することを含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項126】

前記タンパク質の前記第２のタンパク質骨格に関連する前記出力を生成することは、
前記タンパク質の前記第２のタンパク質骨格に基づく前記タンパク質の合成遺伝子を生成することと、
前記合成遺伝子を使用して、インビボで特定のタンパク質を発現させることと、
前記特定のタンパク質を精製することと、を含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項127】

前記合成遺伝子を使用してインビボで前記特定のタンパク質配列を発現させることは、前記合成遺伝子を含む１つ以上の大腸菌で、前記特定のタンパク質配列を発現させることを含む、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

前記タンパク質の前記第２のタンパク質骨格に関連する前記出力を生成することは、前記タンパク質の前記第２のタンパク質骨格の少なくとも一部を含む１つ以上の画像を生成することを含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項129】

前記計算装置は、タンパク質合成装置を含み、前記タンパク質の少なくとも前記第２のタンパク質骨格に関連する前記出力を生成することは、前記タンパク質合成装置を使用して、前記タンパク質の少なくとも前記第２のタンパク質骨格を合成することを含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項130】

前記方法は、タンパク質模倣体を設計するためのものである、請求項１１５〜１２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項131】

請求項１３０に記載の方法によって同定された、非天然タンパク質模倣体。

【請求項132】

サイトカイン模倣体である、請求項１３１に記載の非天然タンパク質。

【請求項133】

ＩＬ−２模倣体またはＩＬ−４模倣体である、請求項１２２に記載の非天然タンパク質。

【請求項134】

計算装置であって、
１つ以上のプロセッサと、
データストレージであって、少なくともコンピュータ可読命令を記憶するように構成され、実行されると、前記計算装置に、
特定の受容体結合界面を提供するタンパク質の複数の残基の構造を決定することと、
模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定することであって、前記複数の設計された残基が、前記特定の受容体結合界面を提供し、前記複数の設計された残基が、前記複数の残基とは異なる、複数の設計された残基を決定することと、
前記複数の設計された残基を連結する１つ以上の連結ヘリックス構造を決定することと、
複数の組み合わせにわたって、前記１つ以上の連結ヘリックス構造および前記複数の設計された残基を組み立てることによって、前記タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することと、
前記第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のために、前記タンパク質の第２のタンパク質骨格を設計することと、
前記タンパク質の少なくとも前記第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することと、を含む機能を実行させるデータストレージと、を含む、計算装置。

【請求項135】

前記模倣設計プロトコルを使用して前記複数の設計された残基を決定することは、理想化された残基のデータベースを使用して、理想化された残基を決定することを含み、前記理想化された残基は、前記複数の設計された残基の設計された残基に関連する、請求項１３４に記載の計算装置。

【請求項136】

前記模倣設計プロトコルを使用して前記複数の設計された残基を決定することは、
前記複数の設計された残基の設計された残基の形状を表す１つ以上のパラメトリック方程式を使用して、理想化された残基を決定することと、
前記複数の設計された残基のうちの少なくとも１つの設計された残基で前記理想化された残基を閉じる単一の断片を決定することと、を含む、請求項１３４に記載の計算装置。

【請求項137】

前記計算装置は、タンパク質合成装置をさらに含み、前記タンパク質の少なくとも前記第２のタンパク質骨格に関連する前記出力を生成することは、前記タンパク質合成装置を使用して、前記タンパク質の少なくとも前記第２のタンパク質骨格を合成することを含む、請求項１３５に記載の計算装置。

【請求項138】

非一時的コンピュータ可読媒体であって、少なくともコンピュータ可読命令を記憶するように構成され、計算装置の１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記計算装置に、
特定の受容体結合界面を提供するタンパク質の複数の残基の構造を決定することと、
模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定することであって、前記複数の設計された残基が、前記特定の受容体結合界面を提供し、前記複数の設計された残基が、前記複数の残基とは異なる、複数の設計された残基を決定することと、
前記複数の設計された残基を連結する１つ以上の連結ヘリックス構造を決定することと、
複数の組み合わせにわたって、前記１つ以上の連結ヘリックス構造および前記複数の設計された残基を組み立てることによって、前記タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することと、
前記第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のために、前記タンパク質の第２のタンパク質骨格を設計することと、
前記タンパク質の少なくとも前記第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することと、を含む機能を実行させる、非一時的コンピュータ可読媒体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１８年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６８９，７６９号および２０１８年１１月１６日に出願された同第６２／７６８，７３３号の優先権を主張し、各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

癌治療のためのＩＬ−２およびＩＬ−４などの中心的な免疫サイトカインであるインターロイキンの大きな可能性は、変異および／または化学修飾によってそれらの治療特性を改善するための多くの努力を誘発した。しかしながら、これらのアプローチは、天然ＩＬ−２またはＩＬ−４と密接に繋がっているため、それらは、ＩＬ−２受容体αサブユニット（ＩＬ−２Ｒα）、ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）、およびＩＬ−１３受容体αサブユニット（ＩＬ−１３Ｒα）との低い安定性や結合などの、望ましくない特性を排除することができない。

【発明の概要】

【0003】

一態様では、方法が提供される。計算装置は、タンパク質の複数の残基の構造を決定し、複数の残基の構造が特定の受容体結合界面を提供する。計算装置は、計算装置によって提供される模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定し、複数の設計された残基は、特定の受容体結合界面を提供し、複数の設計された残基は、複数の残基とは異なる。

【0004】

計算装置は、複数の設計された残基を連結する（ｃｏｎｎｅｃｔ）１つ以上の連結ヘリックス構造を決定する。計算装置は、複数の組み合わせにわたって、１つ以上の連結ヘリックス構造および複数の設計された残基を組み立てることによって、タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定する。計算装置は、第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のために、タンパク質の第２のタンパク質骨格を設計する。計算装置は、少なくとも第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成する。

【0005】

また、本明細書に記載の方法によって調製された非天然タンパク質も含まれる。非天然タンパク質は、サイトカイン、例えば、非天然ＩＬ−２またはＩＬ−４（本明細書ではＩＬ−２、ＩＬ−２／１５模倣体またはＩＬ−４模倣体とも呼ばれる）であり得る。

【0006】

別の態様では、計算装置が提供される。計算装置は、１つ以上のプロセッサと、少なくともコンピュータ可読命令を記憶するように構成されたデータストレージとを含み、１つ以上のプロセッサによって実行されると、計算装置に機能を実行させる。機能は、特定の受容体結合界面を提供するタンパク質の複数の残基の構造を決定することと、模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定することであって、複数の設計された残基は、特定の受容体結合界面を提供し、複数の設計された残基は、複数の残基とは異なる、複数の設計された残基を決定することと、複数の設計された残基を連結する１つ以上の連結ヘリックス構造を決定することと、複数の組み合わせにわたって１つ以上の連結ヘリックス構造および複数の設計された残基を組み立てることによって、タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することと、第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のためにタンパク質の第２のタンパク質骨格を設計することと、タンパク質の少なくとも第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することと、を含む。

【0007】

別の態様では、非一時的コンピュータ可読媒体が提供される。非一時的なコンピュータ可読媒体は、計算装置の１つ以上のプロセッサによって実行されると、計算装置に機能を実行させる少なくともコンピュータ可読命令を記憶するように構成される。機能は、特定の受容体結合界面を提供するタンパク質の複数の残基の構造を決定することと、模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定することであって、複数の設計された残基は、特定の受容体結合界面を提供し、複数の設計された残基は、複数の残基とは異なる、複数の設計された残基を決定することと、複数の設計された残基を連結する１つ以上の連結ヘリックス構造を決定することと、複数の組み合わせにわたって１つ以上の連結ヘリックス構造および複数の設計された残基を組み立てることによって、タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することと、第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のためにタンパク質の第２のタンパク質骨格を設計することと、タンパク質の少なくとも第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することと、を含む。

【0008】

別の態様では、装置が提供される。装置は、特定の受容体結合界面を提供するタンパク質の複数の残基の構造を決定する手段と、模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定する手段であって、複数の設計された残基は、特定の受容体結合界面を提供し、複数の設計された残基は、複数の残基とは異なる、複数の設計された残基を決定する手段と、複数の設計された残基を連結する１つ以上の連結ヘリックス構造を決定する手段と、複数の組み合わせにわたって１つ以上の連結ヘリックス構造および複数の設計された残基を組み立てることによって、タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定する手段と、第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のためにタンパク質の第２のタンパク質骨格を設計する手段と、タンパク質の少なくとも第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成する手段と、を含む。

【0009】

別の態様では、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含む、非天然ポリペプチドが提供され、
（ａ）Ｘ１は、

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１）と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸長のヘリックスペプチドであり、
（ａ）Ｘ３は、

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号２）と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ａ）Ｘ４は、

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号３）と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ポリペプチド内で任意の順序であり得、
アミノ酸リンカーが、ドメインのいずれかの間に存在し得、
ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）、ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）、またはＩＬ−１３受容体αサブユニット（ＩＬ−１３Ｒα）に結合する。

【0010】

他の態様では、医薬組成物が提供され、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体と、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする組換え核酸と、本明細書に開示される組換え核酸を含む発現ベクターと、本明細書に開示される１つ以上の発現ベクターを含む組換え宿主細胞と、を含む。さらなる態様では、癌を治療する方法が提供され、癌を有する対象に、腫瘍を治療するのに有効な量で、１つ以上のポリペプチド、組換え核酸、組換え核酸を含む発現ベクター、および／または本明細書に開示される組換え宿主細胞、あるいはその医薬組成物を、投与することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0011】

以下の図は、例示的な実施形態による。

【0012】

【図1】デノボサイトカイン模倣体の計算設計。図１Ａ）設計された模倣体は、４つのヘリックスを有し、３つの模倣ＩＬ−２は、ｈＩＬ−２Ｒβγ_ｃと相互作用し、４つ目は、最初の３つを所定の位置に保持する。上：第１世代の設計では、ＩＬ−２のコア要素（ヘリックスＨ１〜Ｈ４）の各々が独立して、クラスタ化された理想的な断片データベース（サイズ：４ａａ）からの断片アセンブリを使用して、理想化された。下：第２世代の設計では、コア要素は、代わりに、各ヘリックスの長さを＋／−８ａａ変更できるように、各非実体化ヘリックスの形状を再現するパラメトリック方程式を使用して構築された。図１Ｂ）ヘリックスの対は理想的なループ断片（サイズ：４ａａまたは７ａａ、それぞれｇｅｎ−１およびｇｅｎ−２、「方法」を参照）を使用して再連結された。代表的な例は、ヘリックスの各対を連結する新しく構築された要素とともに示されている。図１Ｃ）図１Ｂで生成されたヘリックスヘアピンは、完全に連結されたタンパク質骨格を生成するために、すべての可能な組み合わせで組み立てられた。図１Ｄ）設計および実験的に成熟したバージョンを酵母ディスプレイによる結合について試験し、高親和性結合を示すものを組換え発現し（大腸菌）、表面プラズモン共鳴およびＩＬ−２様ホスホ−ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）を使用して結合について試験した）。第１世代の３個の設計と第２世代の１０個の設計の結果を、２Ｄプロットにおいて塗りつぶした記号で示している。中空の星印は、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５であり、矢印は、その親（最適化されていない）設計に由来する。

【図2】Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の特性評価。図２Ａ）上から下へ：表面プラズモン共鳴実験では、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、ヒトまたはマウスのＩＬ−２Ｒαに結合しないが、ヒトおよびマウスのＩＬ−２Ｒβの両方に、同様な親和性で結合する（ヒトおよびマウスの受容体について、それぞれＫ_ｄが、約１１．２ｎＭおよび１６．１ｎＭ）。天然（ｎａｔｕｒａｌ）ＩＬ−２のように、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、γ_ｃ受容体にあまり結合しないが、ヒトおよびマウスのＩＬ−２Ｒβγ_ｃの両方について協同的結合を示す（ヒトおよびマウスのヘテロ二量体受容体について、Ｋ_ｄが、約１８．８ｎＭおよび３８．４ｎＭであり、一方、天然ｈＩＬ−２およびＳｕｐｅｒ−２では、約１９３．６ｎＭおよび３００．９ｎＭである。表Ｅ１を参照）。図２Ｂ）上：インビトロｐＳＴＡＴ５シグナル伝達の研究は、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５が、ヒト細胞でＩＬ−２様シグナル伝達を誘発し（ＥＣ_５０）、ＩＬ−２Ｒαの発現の有無にかかわらず（ＣＤ２５）、ヒトＹＴ−１ ＮＫ細胞を、ほぼ同一の効力で活性化することを実証する（ＣＤ２５＋およびＣＤ２５−細胞で、それぞれＥＣ_５０が、約７３．０ＰＭおよび４９．２ｐＭ）。下：同様に、マウスＣＤ４＋初代細胞でのエクスビボ実験は、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５が、マウス細胞で強力なＩＬ−２様シグナル伝達を誘発することもでき、ＩＬ−２Ｒαの発現とは無関係であることを実証する（ＣＤ２５＋およびＣＤ２５−細胞で、それぞれＥＣ_５０が、約２４ｐＭおよびで１２９ｐＭ）。図２Ｃ）上：結合実験（ＯＣＴＥＴ）は、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、顕著な結合の喪失もなく、８０℃で２時間インキュベートされ得るが、ヒトおよびマウスのＩＬ−２は、すぐに活性を失うことを示す。下：生存にＩＬ−２を必要とする培養マウス脾細胞でのエクスビボ実験は、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５が、９５℃で１時間インキュベートしてもまだ、効果的に細胞生存を駆動するが（１０ｎｇ／ｍｌで、約７０％の相対発光）、ｍＩＬ２とＳｕｐｅｒ−２は、事実上非活性である（１０ｎｇ／ｍｌで、それぞれ約１０％および０．１％）ことを実証する。

【図3】Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（Ｎｅｏ−２／１５）およびｍＩＬ−２Ｒβγ_ｃとのその三元複合体の構造。図３Ａ）上：Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（Ｎｅｏ−２／１５）Ａ鎖と設計モデル（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．１．１１Å、１００個のＣα原子について）の構造整列。下：界面ヘリックスＨ１、Ｈ３、およびＨ４の詳細（ｈＩＬ−２に従って番号が付けられている。図１を参照）。界面側鎖は棒で示されている。図３Ｂ）Ｎｅｏ−２／１５とｍＩＬ−２Ｒβおよびγ_ｃとの三元複合体の結晶構造（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ １．２７Å、三元複合体におけるＮｅｏ−２／１５の９３個のモデル化されたＣα原子について）。図３Ｃ）三元複合体における単量体Ｎｅｏ−２／１５（Ａ鎖）とＮｅｏ−２／１５との構造整列（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ １．７１Å、三元複合体における９３個のモデル化されたＣα原子について）。ヘリックスＨ４は、単量体の結晶構造と比較して、三元複合体構造で、ヘリックスＨ４が約４．０Åシフトしていることを示す。図３Ｄ）：ｈＩＬ−２の結晶構造（模式的表現）。ＩＬ−２Ｒβおよびγ_ｃと相互作用する領域が表示されている。ＩＬ−２Ｒαと相互作用するｈＩＬ−２のループリッチ領域は、デノボ模倣Ｎｅｏ−２／１５には存在しない。図３Ｅ）：「ｂ）」の三元複合体からのＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の結晶構造（模式的表現）。ＩＬ−２Ｒβおよびγ_ｃと相互作用する領域が表示されている。ＩＬ−２Ｒαと相互作用するｈＩＬ−２のループリッチ領域は、デノボ模倣Ｎｅｏ−２／１５には存在しない。

【図4】Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の免疫原性、免疫賦活性および治療活性。図４Ａ）ナイーブマウスＴ細胞におけるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（Ｎｅｏ−２／１５）の用量漸増効果。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを、示された濃度のＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５またはｍＩＬ−２で毎日処置した（群あたりｎ＝２〜３）。１４日後、脾臓を採取し、示されたマーカーを使用したフローサイトメトリーによって分析した。棒グラフは、ｍＩＬ−２が、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの増殖を用量依存的に増強させたのに対し、Ｎｅｏ−２／１５は、Ｔｒｅｇ細胞の増殖にほとんどまたはまったく影響を与えなかったことを示す。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、ｍＩＬ−２と比較して高いＣＤ８＋：Ｔｒｅｇ比をもたらした。図４Ｂ）気道炎症モデルのマウスにおけるＮｅｏ−２／１５の効果（２０μｇ／日／マウス、７日）。ナイーブマウスと同様に、Ｎｅｏ−２／１５は、リンパ器官における抗原特異的ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ_ｒｅｇの頻度を増加させず、肺常在性ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．２−、血管内標識化による）の頻度の増加において、ｍＩＬ−２と同等に効果的である。図４Ｃ）Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、検出可能な免疫原性を有さない。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、皮下注射により、５×１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種した。１日目から、マウスを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（１０μｇ）または等モルのｍＩＬ−２で毎日処置した（各群についてｎ＝１０）。１４日後、血清（抗血清）を収集し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ １０％、陰性対照）、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５、ｍＩＬ−２、ｈＩＬ−２、または陰性対照としてのオボアルブミン（ＯＶＡ）でコーティングされたプレートで、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧを検出した（点線は、陰性対照の平均を示す）。抗Ｎｅｏ−２／１５ポリクローナル抗体は、陽性対照として使用され（黒、ｎ＝２）、ｍＩＬ−２またはｈ−ＩＬ２と交差反応しなかった。図４Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、完全フロイントアジュバント中の５００μｇのＫＯ Ｎｅｏ−２／１５で免疫し、７日目と１５日目に不完全フロイントアジュバント中の５００μｇのＫＯ Ｎｅｏ−２／１５で追加免疫した。示されるように、ＫＯ Ｎｅｏ−２／１５および天然Ｎｅｏ−２／１５に対する反応性、ならびにマウスＩＬ−２との交差反応性は、血清（ＰＢＳで１：１，０００に希釈）を、プレートに結合したＫＯ Ｎｅｏ−２／１５、Ｎｅｏ−２／１５またはマウスＩＬ−２と、インキュベートすることよって決定した。ＨＲＰに結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗マウス二次抗体を使用して、血清の結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）を検出し、続いてＴＭＢとインキュベートした。データは、４５０ｎｍでの光学密度として報告されている。上、ナイーブマウス血清、下、免疫したマウス血清。図４Ｅ〜４Ｇ）Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の治療効果。図４Ｅ）ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ＣＴ２６腫瘍を接種した。６日目から、マウスを、ｍＩＬ−２またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（１０μｇ）の腹腔内注射で毎日処置するか、あるいは未処置のまま放置した（群あたりｎ＝５）。腫瘍増殖曲線（上、生存マウスのデータのみを示す）。生存曲線（下）。体重の減少が初期体重の１０％を超えたとき、または腫瘍サイズが１，３００ｍｍ^３に達したときに、マウスを安楽死させた。図４Ｆ）「ａ）」のように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍を接種した。１日目から、マウスをＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（１０μｇ）または等モルのｍＩＬ−２（群あたりｎ＝１０）の腹腔内注射で、毎日処置した。ＴＡ９９による週２回の処置が３日目に追加された。体重の減少が初期体重の１０％を超えたとき、または腫瘍サイズが２，０００ｍｍ^３に達したときに、マウスを安楽死させた。腫瘍増殖曲線（上および左下）。生存曲線、挿入図は平均体重変化を示す（右上）。死因の定量（右下）。図４Ｇ）Ｎｅｏ−２／１５は、マウスＩＬ−２よりも高いＣＤ８＋：Ｔｒｅｇ比を誘発する。示されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍を接種し、毎日腹腔内注射により処置した。ＴＡ９９による処置（下のプロット）は５日目に開始され、週２回継続された。腫瘍が２，０００ｍｍ^３に達したとき、マウスから腫瘍を採取し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ８：Ｔｒｅｇ細胞比は、ＣＤ８^＋であったＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋細胞のパーセンテージを、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋であったもののパーセンテージで割ることによって計算された。

【図5】結腸癌に対するＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の治療効果。図５Ａ）ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ＣＴ２６腫瘍を接種した。９日目に開始し、１４日目に終了するまで、マウスを、指定された濃度のｍＩＬ−２またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の腹腔内注射で毎日処置するか、または未処置のまま放置した（群あたりｎ＝５）。腫瘍増殖曲線（上、生存マウスのデータのみを示す）。生存曲線（下）。体重の減少が初期体重の１０％を超えたとき、または腫瘍サイズが１，３００ｍｍ^３に達したときに、マウスを安楽死させた。図５Ｂ〜５Ｄ）棒グラフは、ＣＴ２６腫瘍を接種し、６日目に開始して１０μｇのＮｅｏｌｕｋｉｎ−２／１５または１０μｇのｍＩＬ−２を毎日腹腔内注射して処置した、あるいは未処置（Ｎｏ Ｔｘ）のＢＡＬＢ／Ｃマウス（群あたりｎ＝３）のＴ細胞集団を比較する。１４日目に、Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージ（ＣＤ４^＋ ＣＤ４５^＋ ＦｏｘＰ３^＋、上のグラフ）およびＣＤ８：Ｔｒｅｇ細胞比（（ＣＤ４５^＋ ＣＤ３^＋ ＣＤ８^＋）／Ｔｒｅｇ、下のグラフ）を、腫瘍（図５Ｂ）、隣接する鼠径リンパ節（ＬＮ）（図５Ｃ）、および脾臓（図５Ｄ）で、評価した。

【図6】黒色腫に対するＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の治療効果。図６Ａ−６Ｅ）Ｂ１６腫瘍を接種し、低用量（１μｇ／マウス／日、ａ〜ｂ）または高用量（１０μｇ／マウス／日、ｃ〜ｄ）のＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線（下）および生存曲線（上）。１日目から、マウス（群あたりｎ＝５）を、１μｇ／マウスの単剤Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５、または等モルのｍＩＬ−２（群あたりｎ＝５）の腹腔内注射で毎日処置し（図６Ａ）、あるいはＴＡ９９による週２回の処置（５日目から）と組み合わせて、同じく処置した（図６Ｂ）。腫瘍サイズが、２，０００ｍｍ^３に達したときに、マウスを安楽死させた。示されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍を接種し、毎日腹腔内注射により処置した。図６Ｃ〜６Ｄ）「ａ〜ｂ）」と同様に、４日目から、マウスに、１０μｇ／マウスのＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５、または等モルのｍＩＬ−２を、いずれか単独で（図６Ｃ）、または４日目に開始する週２回のＴＡ９９と組み合わせて（図６Ｄ）、毎日腹腔内注射により処置した。腫瘍サイズが、２，０００ｍｍ^３に達したときに、マウスを安楽死させた。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の治療効果は用量依存的であり（高用量がより良好）、抗体ＴＡ９９の存在下で増強される。実験は、１回行われた。すべての成長曲線において、データは平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）である。マンテル・コックス検定（９５％信頼区間）を使用して評価された生存曲線を除いて、結果は、一元配置分散分析（９５％信頼区間）によって分析した。

【図7】ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）模倣体（Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−４）への、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の再操作。図７Ａ）ＩＬ−４Ｒαおよびγ_ｃ（ＰＤＢコード ３ＢＰＬ）と複合体化したＩＬ−４の構造へ、構造的に整列されたＮｅｏ−２／１５。ＩＬ−４Ｒαと接触し、Ｎｅｏ−２／１５に移植された１４個のＩＬ−４残基が標識されている。図７Ｂ）Ｎｅｏ−２／１５と比較して１６個のアミノ酸変異を有する、新しいタンパク質Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−４（Ｎｅｏ−４）。これらの変異は標識されており、これらのうちの１３個は、ＩＬ−４Ｒαとの接触を媒介するＩＬ−４残基に由来し（パネル「ａ）」に示されている）、そのうちの３個は（Ｈ８Ｍ、Ｋ６８Ｉ、およびＩ９８Ｆ、図中の下線）、ランダム変異誘発および高結合親和性バリアントのスクリーニングを使用した定向進化によって導入された。図７Ｃ）バイオレイヤー干渉データは、Ｎｅｏ−４が、ＩＬ−４と同様に、単独でＩＬ−４Ｒαに結合し、単独ではγ_ｃに対する親和性を有さないが、溶液中にＩＬ−４Ｒαが存在すると、γ_ｃに結合することを示す。

【図8】ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞に対するＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の刺激効果。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激（図８Ａ）または刺激されていない（図８Ｂ）ヒト初代ＣＤ４（上）またはＣＤ８（下）Ｔ細胞を、示された濃度のヒトＩＬ２またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５で培養した。Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ２の補充なしで培養されたＴ細胞に対する倍率変化として測定される。Ｎｅｏ−２／１５は、刺激されたＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を誘導するのに天然（ｎａｔｉｖｅ）ＩＬ−２と同じくらい効果的であり、刺激されていないＣＡＲ−Ｔ細胞、特に刺激されていないＣＤ８ ＣＡＲ−Ｔ細胞、の増殖を誘導するのに天然ＩＬ−２よりも効果的である。

【図9】３つの異なるデノボ設計ＩＬ−２模倣体からの情報を組み合わせた、４つの一般的なヘリックスの各々の結合残基における全体的な配列保存。配列ロゴは、Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２７、Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２９、およびＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ３６（図１１〜１３）の３つの独立したＳＳＭ変異誘発ライブラリからの結合実験（ヘテロ二量体マウスＩＬ−２Ｒβγｃを使用）からの組み合わせデータを使用して生成された。これらのタンパク質はすべて、マウスおよびヒトＩＬ−２の機能的高親和性デノボ模倣体であり、Ｎｅｏ−２／１５とは異なるトポロジを有するものもあるが、すべては、４つのヘリックスＨ１（図９Ａ、Ｎｅｏ−２／１５の１〜２２は配列番号２４８、ＩＬ−２の６〜２７は配列番号２４９、ＩＬ−１５の１〜１５は配列番号２５０）、Ｈ３（図９Ｂ、Ｎｅｏ−２／１５の３４〜５５は配列番号２５１、ＩＬ−２の８２〜１０３は配列番号２５２、ＩＬ−１５の５９〜８０は配列番号２５３）、Ｈ２’（図９Ｃ、Ｎｅｏ−２／１５の５８〜７６は配列番号２５４、ＩＬ−２の５０〜６８は配列番号２５５、ＩＬ−１５の３４〜５２は配列番号２５６）、およびＨ４（図９Ｄ、Ｎｅｏ−２／１５の８０〜１００は配列番号２５７、ＩＬ−２の１１１〜１３１は配列番号２５８、ＩＬ−１５の９３〜１１３は配列番号２５９）を含有する。ロゴは、独立して、各ヘリックスの組み合わせ情報を示す。各ロゴの下の折れ線グラフは、Ｎｅｏ−２／１５配列の各アミノ酸の確率スコアを示す（高いほど保存されていることを意味する）。横の実線は、Ｎｅｏ−２／１５アミノ酸が３０％以上の確率スコアを有する位置を強調する（つまり、これらのアミノ酸は、試験されたすべてのデノボＩＬ−２模倣体にわたって結合集団で全体的に濃縮されているため、より一般的に受容体との結合に寄与する）。Ｎｅｏ−２／１５の各ヘリックスのトポロジは、各ロゴの左側に示されている。ヒトＩＬ−２およびＩＬ−１５におけるＮｅｏ−２／１５ヘリックスの配列および対応するヘリックスの配列（構造的に整列した）をグラフの下に示し、Ｎｅｏ−２／１５ヘリックスおよび結合界面の特徴を強調している。

【図10】Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０の実験的最適化。図１０Ａ〜１０Ｃ）５０ｎＭ（図１０Ａ）、２ｎＭ（図１０Ｂ）、および０．１ｎＭ（図１０Ｃ）のＩＬ−２Ｒβγ_ｃヘテロ二量体を用いて選択を増加する連続ラウンド後の、特定の位置での濃縮を示すＧ１＿ｎｅｏ２＿４０単一部位変異誘発ライブラリのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリは、１．５×１０^６のヌクレオチド多様性で設計された。図１０Ｄ）最初のコンビナトリアルライブラリで利用可能なアミノ酸残基は、有利（元の配列の上に示されている）および有害（元の配列の下に示されている）であると予測される残基を示すように描写され、元の配列の描写では、黒は、コンビナトリアルライブラリに表される残基を示し、グレーは、コンビナトリアルライブラリに表されない残基を示す。

【図11】Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２７の実験的最適化。１０ｎＭ（図１１Ａ）、１ｎＭ（図１１Ｂ）、０．１ｎＭ（図１１Ｃ）、および０．１ｎＭ（図１１Ｄ）のＩＬ−２Ｒβγ_ｃヘテロ二量体を用いて選択を増加する連続ラウンド後の、特定の位置での濃縮を示すＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２７の単一部位変異誘発ライブラリのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリは、５．３×１０^６のヌクレオチド多様性で設計された。図１１Ｅ）最初のコンビナトリアルライブラリで利用可能なアミノ酸残基が描写され、有利であると予測される残基を示し、黒は、コンビナトリアルライブラリで表される開始配列の残基を示す。

【図12】Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２９の実験的最適化。１０ｎＭ（図１２Ａ）、１ｎＭ（図１２Ｂ）、０．１ｎＭ（図１２Ｃ）、および０．１ｎＭ（図１２Ｄ）のＩＬ−２Ｒβγ_ｃヘテロ二量体を用いて選択を増加する連続ラウンド後の、特定の位置での濃縮を示すＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ２９の単一部位変異誘発ライブラリのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリは、２．９×１０^６のヌクレオチド多様性で設計された。図１２Ｅ）最初のコンビナトリアルライブラリで利用可能なアミノ酸残基が描写され、有利であると予測される残基を示し、黒は、コンビナトリアルライブラリで表される開始配列の残基を示す。

【図13】Ｇ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ３６の実験的最適化。１０ｎＭ（図１３Ａ）、１ｎＭ（図１３Ｂ）、０．１ｎＭ（図１３Ｃ）、および０．１ｎＭ（図１３Ｄ）のＩＬ−２Ｒβγ_ｃヘテロ二量体を用いて選択を増加する連続ラウンド後の、特定の位置での濃縮を示すＧ２＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ＿ｓｅｑ３６の単一部位変異誘発ライブラリのヒートマップ。これらの濃縮データに基づいて、コンビナトリアルライブラリは、２．７×１０^６のヌクレオチド多様性で設計された。図１３Ｅ）最初のコンビナトリアルライブラリで利用可能なアミノ酸残基が描写され、有利であると予測される残基を示し、黒は、コンビナトリアルライブラリで表される開始配列の残基を示す。

【図14】複数のＩＬ−２／ＩＬ−１５デノボ設計模倣体（第１世代）の円二色性（ＣＤ）熱変性実験。図１４Ａ）熱変性曲線および図１４Ｂ）波長スキャン。

【図15A-B】複数のＩＬ−２／ＩＬ−１５デノボ設計模倣体（第１世代）が実験的に最適化された円二色性（ＣＤ）熱変性実験。図１５Ａ）熱変性曲線および図１５Ｂ）波長スキャン。

【図16】ＩＬ−２／ＩＬ−１５模倣設計（第２世代）の円二色性熱融解。図１６Ａおよび図１６Ｃ）熱変性曲線、ならびに図１６Ｂおよび図１６Ｄ）波長スキャン。

【図17】Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の発現、精製、熱変性の特性評価。図１７Ａ）発現およびアフィニティカラムでの精製を示すＳＤＳ Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動。図１７Ｂ）２２２ｎｍでの円二色性は、２５℃から９５℃までの熱融解中で頑強な温度安定性を示す。図１７Ｃ）２５℃、９５℃、次いで再度２５℃での円二色性波長スキャンは、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５が９５℃でも完全に融解せず、２５℃に冷却後は、完全にリフォールディングすることを示している。

【図18】より高い熱安定性を有するＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の単一ジスルフィドステープルバリアント。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５のジスルフィド安定化バリアントの構造モデルが、標識された変異残基の位置および示されるジスルフィド結合とともに示されている。２つの戦略が、ジスルフィドバリアントを生成するために使用された。図１８Ａ）残基３８および７５での内部配置および末端結合。図１８Ｂ）末端バリアントについては、そうでなければジスルフィド結合を形成するために必要だったであろう開始構造へのいかなる歪みも制限するために、３つの残基が各末端に付加された。内部および末端ジスルフィドバリアントについて、２５℃、９５℃および冷却後２５℃でのＣＤスペクトルをそれらの構造モデルの下に示す。両方のバリアントは、９５℃でのごくわずかなシグナルの損失を示し、冷却するとリフォールディングを完了する。図１８Ｃ）各バリアントの熱溶融は、ある範囲の温度にわたって２２２．０ｎｍでＣＤシグナルをモニターすることによって行われた。各ジスルフィドバリアントは、天然のものと比較して、改善された安定性を示す。図１８Ｄ）ＩＬ−２Ｒβγｃへの各バリアントの結合強度は、バイオレイヤー干渉測定によって測定された。結合相互作用を破壊するのとは対照的に、これらのデータは、ジスルフィド結合の導入が模倣体のＩＬ−２Ｒβγｃへの結合を改善することを示している。両方のジスルフィド結合バリアントは、ＩＬ−２Ｒβγｃへの結合の改善を示し（同じ実験条件下でＮｅｏ−２／１５の６．９±０．６１ｎＭと比較して、内部および外部のジスルフィドステープルについて、それぞれＫｄが、約１．３±０．４９および１．８±０．２６ｎＭ）、タンパク質の結合部位のジスルフィド誘導安定化の期待された効果と一致している。

【図19】非結合界面位置での単一点システイン変異体に対するＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の頑強性。図１９Ａ）タンパク質の発現またはＩＬ−２Ｒβγｃへの結合を干渉することなく、システインに個別に変異させることができるＮｅｏｌｕｋｉｎ−２／１５の点変異体の位置を示す概略図。受容体結合への干渉を避けるために位置が選択された。図１９Ｂ）ＩＬ−２Ｒβγ_ｃとのＮｅｏｌｕｋｉｎ−２／１５システイン変異体の会合動態はバイオレイヤー干渉測定を用いて測定する。すべてのバリアントは、Ｎｅｏ−２／１５とほぼ同様に受容体と会合する。

【図20】Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−４の発現、精製、熱変性の特性評価。図２０Ａ）発現およびアフィニティカラムでの精製を示すＳＤＳ Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動。図２０Ｂ）２２２ｎｍでの円二色性は、２５℃から９５℃まで熱融解中で頑強な温度安定性を示す。図２０Ｃ）２５℃、９５℃、次いで再度２５℃での円二色性波長スキャンは、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−４が９５℃でも完全に融解せず、２５℃に冷却後は、完全にリフォールディングすることを示している。

【図21】Ｎｅｏ−２／１５またはＮｅｏ−２／１５−ＰＥＧに応答する非ヒト霊長類のサイトカインレベル。群ごとに２個体の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、群ごとに１個体の雄と１個体の雌が、ビヒクル、Ｎｅｏ−２／１５またはＮｅｏ−２／１５−ＰＥＧ（ＰＥＧ４０Ｋに結合したＥ６２Ｃの単一システイン変異を有するＮｅｏ−２／１５を含む）のいずれかによる処置に割り当てられた。動物は、０（ビヒクル）、０．１、０．２、もしくは０．３ｍｇ／ｋｇのＮｅｏ−２／１５、または０．０５、０．１０、もしくは０．１５ｍｇ／ｋｇのＮｅｏ−２／１５−ＰＥＧのいずれかを、静脈内ボーラスにより投与された。Ｎｅｏ−２／１５ ＰＥＧで処置された動物は、静脈内ボーラスにより投与された。サイトカイン試料は、投与後０、４、８、および２４時間で採取した。サイトカインの血清試料を調製し、−７０℃未満で凍結し、分析用に出荷した。試料は、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスイムノアッセイシステムで分析された。ＩＬ−１０（図２１Ａ〜２１Ｂ）およびＩＬ−１５（図２１Ｃ〜２１Ｄ）を含むいくつかのサイトカインは、ＰＥＧ化分子のより持続的な薬力学的効果と一致して、サイトカイン産生の時間経過における顕著な違いを実証した。

【図22】例示的な計算ネットワークのブロック図。

【図23】例示的な計算装置のブロック図。

【図23】クラウドベースのサーバーシステムとして配置された計算装置の例示的なネットワークのブロック図。

【図24】方法のフローチャート。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「ａ」および「ａｎ」という用語は、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈される。文脈上特に必要がない限り、本明細書で使用される単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。

【0014】

文脈上明らかに別段に必要でない限り、発明を実施するための形態および特許請求の範囲全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（備える）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備えている）」などの語は、排他的意味の対語としての包括的意味、または網羅的意味で、すなわち、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（含むがそれらに限定されない）」の意味で解釈されたい。単数または複数を使用する単語は、それぞれ、複数および単数も含む。さらに、「本明細書における（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上に（ａｂｏｖｅ）」、および「以下に（ｂｅｌｏｗ）」という単語、ならびに類似の趣旨の単語は、本出願で使用される場合、全体としての本出願を指すものであり、本出願のいずれの特定の部分を指すものではない。

【0015】

本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は以下のように省略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。

【0016】

本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、組み合わせて使用することができる。

【0017】

一態様では、本発明は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含む、非天然ポリペプチドを提供し、
（ａ）Ｘ１は、

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１）と、少なくとも２５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸長のヘリックスペプチドであり、
（ｃ）Ｘ３は、

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号２）と、少なくとも２５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号３）と、少なくとも２５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ポリペプチド内で任意の順序であり得、
アミノ酸リンカーが、ドメインのいずれかの間に存在し得、
ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）、ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）、またはＩＬ−１３受容体αサブユニット（ＩＬ−１３Ｒα）に結合する。様々な実施形態では、ポリペプチドは、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性で、ＩＬ−２Ｒβγ_ｃまたはＩＬ−４Ｒαγ_ｃに結合する。

【0018】

一態様では、本発明は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含む、非天然ポリペプチドを提供し、
（ａ）Ｘ１は、

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１）と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸長のヘリックスペプチドであり、
（ｃ）Ｘ３は、

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号２）と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号３）と、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ポリペプチド内で任意の順序であり得、
アミノ酸リンカーが、ドメインのいずれかの間に存在し得、
ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に結合する。様々な実施形態では、ポリペプチドは、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性で、ＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合する。

【0019】

一態様では、本発明は、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４を含む、非天然ポリペプチドを提供し、
（ａ）Ｘ１は、アミノ酸配列

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１）を含むペプチドであり、
（ｂ）Ｘ２は、少なくとも８アミノ酸長のヘリックスペプチドであり、
（ｃ）Ｘ３は、アミノ酸配列

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号２）を含むペプチドであり、
（ｄ）Ｘ４は、アミノ酸配列

【化12】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号３）を含むペプチドであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ポリペプチド内で任意の順序であり得、
アミノ酸リンカーが、ドメインのいずれかの間に存在し得、
ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に結合する。様々な実施形態では、ポリペプチドは、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性で、ＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合する。

【0020】

以下の実施例に示されるように、本開示のポリペプチドは、（ａ）ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に結合するが、ＩＬ−２ＲαもしくはＩＬ−１５Ｒαの結合部位を有さない、ＩＬ−２およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の模倣体、または（ｂ）ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）もしくはＩＬ−１３受容体αサブユニット（ＩＬ−１３Ｒα）に結合するＩＬ−４の模倣体である（天然ＩＬ−４および本明細書に記載のＩＬ−４模倣体は、ＩＬ−１３受容体と交差反応し、ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ１３Ｒαヘテロ二量体を形成する）。この設計は、超安定で、天然のサイトカインよりも高い親和性で、ヒトおよびマウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃまたはＩＬ−４Ｒαγ_ｃに結合し、ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−１５Ｒαとは無関係に、あるいはＩＬ−１３Ｒαとは無関係に、下流の細胞シグナル伝達を誘発する。このポリペプチドは、例えば、癌を治療するために使用することができる。

【0021】

本明細書で使用されるタンパク質模倣体という用語は、別のタンパク質の機能の特定の側面を模倣するタンパク質を指す。２つのタンパク質は、通常、異なるアミノ酸配列および／または異なる構造を有する。とりわけ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５のデノボ模倣体が、本明細書で提供される。これらの模倣体が模倣するＩＬ−２およびＩＬ−１５の機能の側面は、ＳＴＡＴ５のリン酸化につながるＩＬ−２Ｒβγｃのヘテロ二量体化の誘導である。ＩＬ−２とＩＬ−１５は両方ともＩＬ−２Ｒβγｃのヘテロ二量体化を通してシグナルを伝達するため、これらの模倣体は、ＩＬ−２とＩＬ−１５の両方のこの生物学的機能を模倣する。これらの模倣体は、本明細書では、ＩＬ−２の模倣体、ＩＬ−１５の模倣体、またはＩＬ−２とＩＬ−１５の両方の模倣体と呼ばれ得る。

【0022】

また、ＩＬ−４のデノボ模倣体も提供される。これらの模倣体は、ＩＬ−４の特定の機能を模倣することができる。これらの模倣体が模倣するＩＬ−４の機能は、ＩＬ−４Ｒαγ_ｃのヘテロ二量体化（および／またはＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒαのヘテロ二量体化）の誘導である。

【0023】

天然ｈＩＬ−２は、長い不規則なループで連結された４つのヘリックスで構成されている。Ｎ末端ヘリックス（Ｈ１）は、βサブユニットおよびγサブユニットの両方と相互作用し、３番目のヘリックス（Ｈ３）は、βサブユニットと相互作用し、Ｃ末端ヘリックス（Ｈ４）は、γサブユニットと相互作用する。αサブユニットの相互作用表面は、不規則な２番目のヘリックス（Ｈ２）および２つの長いループによって形成され、片方は、Ｈ１をＨ２に連結し、他方は、Ｈ３とＨ４を連結する。理想化タンパク質を設計および作製し、Ｈ１、Ｈ３およびＨ４は、理想化された構造ドメインで置き換えられ、限定されないがヘリックスおよびβ鎖を含み（それぞれ、ドメインＸ１、Ｘ３およびＸ４と称する）、Ｈ１、Ｈ３およびＨ４に触発されてＩＬ−２Ｒβγ_ｃまたはＩＬ−４Ｒαγ_ｃ界面を呈し、Ｈ２は、より良好な充填を提供する理想化ヘリックス（ドメインＸ２と称する）で置換される。実施例に示されるように、広範な変異研究が実施され、各ペプチドドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、ＩＬ−２またはＩＬ−４受容体への結合を失うことなく広範に修飾でき、ドメインは、ＩＬ−２またはＩＬ−４受容体への結合を保持しながら、任意の順序で配置され得ることを実証している。ポリペプチドは、Ｌアミノ酸およびグリシン、Ｄ−アミノ酸およびグリシン、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。

【0024】

したがって、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ポリペプチド内で任意の順序であり得、非限定的な実施形態では、順序は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｘ１−Ｘ３−Ｘ２−Ｘ４、Ｘ１−Ｘ４−Ｘ２−Ｘ３、Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１−Ｘ４、Ｘ４−Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１、Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ１、Ｘ２−Ｘ１−Ｘ４−Ｘ３などであり得る。

【0025】

ドメインは、任意の長さのアミノ酸組成のアミノ酸リンカーによって分離され得る。リンカーの必要性はなく、一実施形態では、いずれのドメイン間にもリンカーが存在しない。他の実施形態では、アミノ酸リンカーは、ドメインＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の間の１、２、または３つすべての接合部の間に存在し得る。リンカーは、意図された用途に適切とみなされる任意の長さであり得る。

【0026】

様々な実施形態では、Ｘ１は、配列番号１と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。他の実施形態では、Ｘ３は、配列番号２と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。さらなる実施形態では、Ｘ４は、配列番号３と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。

【0027】

一実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２／１５模倣体であり、（ｉ）Ｘ１は、以下の、残基２にＨ、および残基５にＹ、のうちの片方もしくは両方を含み、かつ／または（ｉｉ）Ｘ３は、以下の、残基１にＹ、残基３にＦ、残基４にＮ、残基７にＬ、および残基８にＩ、のうちの１、２、３、４、または５つすべてを含む。さらなる実施形態では、（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基８にＩを含む。

【0028】

別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−４模倣体であり、（ｉ）Ｘ１は、残基２にＥおよび残基５にＫを含み、かつ（ｉｉ）Ｘ３は、残基１にＦ、残基３にＫ、残基４にＲ、残基７にＲ、および残基８にＮを含む。さらなる実施形態では、（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基８にＦを含む。

【0029】

これらの実施形態のすべてにおいて、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４は、任意の好適な長さであり得、各ドメインが、それぞれ配列番号１、２、および３のペプチド以外の任意の好適な数の追加のアミノ酸を含み得ることを意味する。一実施形態では、Ｘ１は、ペプチド

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。

【0030】

一実施形態では、Ｘ１は、ペプチド

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド

【化17】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド

【化18】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。

【0031】

一実施形態では、Ｘ１は、ペプチド

【化19】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド

【化20】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド

【化21】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。

【0032】

一実施形態では、Ｘ１は、ペプチド

【化22】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド

【化23】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド

【化24】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。

【0033】

一実施形態では、Ｘ１は、ペプチド

【化25】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。

【0034】

一実施形態では、Ｘ１は、ペプチド

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号４）と、その長さに沿って、１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ３は、ペプチド

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５）と、その長さに沿って、１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘ４は、ペプチド

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号６）と、その長さに沿って、１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。

【0035】

一実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２／１５模倣体であり、（ｉ）Ｘ１は、以下の、残基７にＬ、残基８にＨ、残基１１にＨ、残基１４にＹ、残基１８にＭ、のうちの１、２、３、４、または５つすべてを含み、かつ／あるいは（ｉｉ）Ｘ３は以下の、残基３にＤ、残基４にＹ、残基６にＦ、残基７にＮ、残基１０にＬ、残基１１にＩ、残基１３にＥ、または残基１４にＥ、のうちの１、２、３、４、５、６、７、または８つすべてを含む。さらなる実施形態では、（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基１９にＩを含む。

【0036】

ＩＬ−２模倣体の一実施形態では、参照ペプチドドメイン（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、または６）に対するアミノ酸置換は、太字でマークされたアミノ酸（ＡＡ）残基では起こらない。

【0037】

別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−４／ＩＬ−１３模倣体であり、
Ｘ１は、ペプチド

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号８）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ３は、ペプチド

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号９）と、その長さに沿って、少なくとも３７％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｘ４は、ペプチド

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号１０）と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであり、

【0038】

（ｉ）Ｘ１は、残基７にＩ、残基８にＴまたはＭ、残基１１にＥ、残基１４にＫ、および残基１８にＳを含み、
（ｉｉ）Ｘ３は、残基３にＲ、残基４にＦ、残基６にＫ、残基７にＲ、残基１０にＲ、残基１１にＮ、残基１３にＷ、および残基１４にＧを含む。

【0039】

さらなる実施形態では、（ｉｉｉ）Ｘ４は、残基１９にＦを含む。

【0040】

一実施形態では、参照ペプチドドメインに対するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、所与のアミノ酸を、同様の生理化学的特性を有する残基で置換することができ、例えば、１つの脂肪族残基を別のものに置換すること（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａなどを互いに）、または、１つの極性残基の別のものとの置換（ＬｙｓとＡｒｇ間、ＧｌｕとＡｓｐ間、またはＧｌｎとＡｓｎ間など）ができる。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換は既知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書に記載のアッセイのいずれか１つで試験して、所望の活性、例えば、抗原結合活性および天然または参照ポリペプチドの特異性、が保持されていることを確認することができる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５））：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、（２）無荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然残基は、一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換では、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスに交換する必要があろう。特定の保存的置換には、例えば、ＡｌａをＧｌｙまたはＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎまたはＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａまたはＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎまたはＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕまたはＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅまたはＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、および／またはＰｈｅをＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕに、置換することを含む。

【0041】

一実施形態では、配列番号４に対するＸ１のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。

【表1】

[この文献は図面を表示できません]

【0042】

一実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−４模倣体であり、位置７はＩ、位置８はＭまたはＴ、位置１１はＥ、位置１４はＫ、および位置１８はＳである。

【0043】

別の実施形態では、ポリペプチドはＩＬ−２模倣体であり、以下の、位置７はＩ、位置８はＭまたはＴ、位置１１はＥ、位置１４はＫ、および位置１８はＳ、であるのうちの１、２、３、４、または５つが真ではない。

【0044】

別の実施形態では、配列番号５に対するＸ３のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。

【表2】

[この文献は図面を表示できません]

【0045】

別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−４／ＩＬ−１３模倣体であり、位置３はＲ、位置４はＦ、位置６はＫ、位置７はＲ、位置１０はＲ、位置１１はＮ、位置１３はＷ、および位置１４はＧである。

【0046】

別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２模倣体であり、以下の、位置３はＲ、位置４はＦ、位置６はＫ、位置７はＲ、位置１０はＲ、位置１１はＮ、位置１３はＷ、および位置１４はＧ、であるのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８つすべてが真ではない。

【0047】

そのような実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドはさらに、配列番号５に対する位置１７には、Ｈ、Ｋ、Ｌ、ＮおよびＲのアミノ酸残基に加えて、システインを可能にする。したがって、配列番号５に対するＸ３のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択することができる。

【表3】

[この文献は図面を表示できません]

【0048】

別の実施形態では、配列番号６に対するＸ４のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。

【表4】

[この文献は図面を表示できません]

【0049】

別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−４／ＩＬ−１３模倣体であり、位置１９はＩである。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２模倣体であり、位置１９はＩではない。

【0050】

そのような実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドはさらに、配列番号６に対する位置３には、Ｅ、Ｇ、ＨおよびＫのアミノ酸残基に加えて、システインを可能にする。

【0051】

したがって、配列番号６に対するＸ４のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択することができる。

【表5】

[この文献は図面を表示できません]

【0052】

本明細書に記載されるように、ドメインＸ２は、構造ドメインであり、したがって、関連する他のドメインを連結し（ドメインの順序に応じて）、それらをフォールディングすることを可能にする任意のアミノ酸配列を使用することができる。必要な長さは、作製されるタンパク質の構造によって異なり、８アミノ酸以上にすることができる。例示的かつ非限定的な一実施形態では、Ｘ２は、

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号７）と、その長さに沿って、少なくとも２０％、２７％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むペプチドである。さらなる実施形態では、配列番号７に対するＸ２のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択される。

【表6】

[この文献は図面を表示できません]

【0053】

別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−４／ＩＬ−１３模倣体であり、位置１１はＩである。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２模倣体であり、位置１１はＩではない。

【0054】

そのような実施形態のいずれかにおいても、ポリペプチドはさらに、配列番号７に対する位置５または１６には、システインを可能にする。

【0055】

あるいは、そのような実施形態のいずれかにおいても、ポリペプチドはさらに、配列番号７に対する位置１、２、５、９または１６には、システインを可能にする。

【0056】

したがって、配列番号７に対するＸ２のアミノ酸残基は、以下からなる群から選択することができる。

【表7】

[この文献は図面を表示できません]

【0057】

別の実施形態では、ポリペプチドは、以下のポリペプチド（すなわち、配列番号１１〜９４、１０３〜１８４、１９０〜２４３、および２４５〜２４７）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。下線が引かれた残基は、リンカーであり、任意選択的であり、リンカーの各残基は、存在する場合、任意のアミノ酸を含み得る。以下の各バリアントについて、２つの配列番号、任意選択的かつ可変的であるリンカー位置を含む第１の配列番号および以下に示される配列を列挙する第２の配列番号、が提供される。

【表8-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表8-2】

[この文献は図面を表示できません]

【表8-3】

[この文献は図面を表示できません]

【表8-4】

[この文献は図面を表示できません]

【表8-5】

[この文献は図面を表示できません]

【表8-6】

[この文献は図面を表示できません]

【表8-7】

[この文献は図面を表示できません]

【表8-8】

[この文献は図面を表示できません]

【0058】

以下の各バリアントについて、２つの配列番号、以下に示される配列を列挙する第１の配列番号および任意選択的かつ可変的であるリンカー位置を含む第２の配列番号、が提供される。
＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ５０Ｃ（配列番号１９０）

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ５０Ｃ（配列番号２１７）

【化36】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ５３Ｃ（配列番号１９１）

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ５３Ｃ（配列番号２１８）

【化38】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５６Ｃ（配列番号１９２）

【化39】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５６Ｃ（配列番号２１９）

【化40】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｋ５８Ｃ（配列番号１９３）

【化41】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｋ５８Ｃ（配列番号２２０）

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５９Ｃ（配列番号１９４）

【化43】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５９Ｃ（配列番号２２１）

【化44】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６２Ｃ（配列番号１９５）

【化45】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６２Ｃ（配列番号２２２）

【化46】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ６６Ｃ（配列番号１９６）

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ６６Ｃ（配列番号２２３）

【化48】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６９Ｃ（配列番号１９７）

【化49】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６９Ｃ（配列番号２２４）

【化50】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ７３Ｃ（配列番号１９８）

【化51】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２２５）

【化52】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｔ７７Ｃ（配列番号１９９）

【化53】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｔ７７Ｃ（配列番号２２６）

【化54】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２００）

【化55】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２２７）

【化56】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ８５Ｃ（配列番号２０１）

【化57】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ８５Ｃ（配列番号２２８）

【化58】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ５０Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２０２）

【化59】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ５０Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２２９）

【化60】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ５３Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２０３）

【化61】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ５３Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２３０）

【化62】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５６Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２０４）

【化63】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５６Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２３１）

【化64】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｋ５８Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２０５）

【化65】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｋ５８Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２３２）

【化66】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５９Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２０６）

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５９Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２３３）

【化68】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６２Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２０７）

【化69】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６２Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２３４）

【化70】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ６６Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２０８）

【化71】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ６６Ｃ＿Ｒ７３Ｃ（配列番号２３５）

【化72】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ５０Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２０９）

【化73】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ５０Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２３６）

【化74】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ５３Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２１０）

【化75】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ５３Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２３７）

【化76】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５６Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２１１）

【化77】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５６Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２３８）

【化78】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｋ５８Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２１２）

【化79】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｋ５８Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２３９）

【化80】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５９Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２１３）

【化81】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｄ５９Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２４０）

【化82】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６２Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２１４）

【化83】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６２Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２４１）

【化84】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ６６Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２１５）

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｒ６６Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２４２）

【化86】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６９Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２１６）

【化87】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５＿Ｅ６９Ｃ＿Ｅ８２Ｃ（配列番号２４３）

【化88】

[この文献は図面を表示できません]

【0059】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９０、１８１、および２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0060】

別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９０、１８１、または２４７のアミノ酸配列と同一のポリペプチドを含み、ポリペプチドは、（ｉ）ヒトまたはマウスＩＬ−２Ｒαに結合せず、（ｉｉ）約１１．２ｎＭの親和性で、ヒトＩＬ２ＲＢに結合し、（ｉｉｉ）約１６．１ｎＭの親和性で、マウスＩＬ２ＲＢに結合し、（ｉｖ）約１８．８ｎＭの親和性で、ヒトＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合し、かつ（ｖ）約３．４ｎＭの親和性で、マウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合する。

【0061】

全長ポリペプチドのこれらの実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドは、ＩＬ−４／ＩＬ−１３模倣体であり得、位置７はＩ、位置８はＴまたはＭ、位置１１はＥ、位置１４はＫ、位置１８はＳ、位置３３はＱ、位置３６はＲ、位置３７はＦ、位置３９はＫ、位置４０はＲ、位置４３はＲ、位置４４はＮ、位置４６はＷ、および位置４７はＧである。さらなる実施形態では、位置６８はＩであり、位置９８はＦである。

【0062】

全長ポリペプチドのこれらの実施形態のいずれかにおいて、ポリペプチドは、ＩＬ−２模倣体であり得、以下の、位置７はＩ、位置８はＴまたはＭ、位置１１はＥ、位置１４はＫ、位置１８はＳ、位置３３はＱ、位置３６はＲ、位置３７はＦ、位置３９はＫ、位置４０はＲ、位置４３はＲ、位置４４はＮ、位置４６はＷ、および位置４７はＧ、であるのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個すべてが真ではない。さらなる実施形態では、以下の、位置６８はＩ、および位置９８はＦ、であるのうちの片方または両方が真ではない。

【0063】

一実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドは、天然ＩＬ−２の三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満、１．５Å未満、または１Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を有する構造座標を伴う三次元構造を有する。

【0064】

別の実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドは、表Ｅ２の構造座標を有する三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満、１．５Å未満、または１Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を有する構造座標を伴う三次元構造を有する。

【0065】

さらなる実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドは、マウスＩＬ−２受容体βγ_ｃとの三元複合体時に、マウスＩＬ−２受容体βγ_ｃとの三元複合体時に、天然ＩＬ−２の三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満、１．５Å未満、または１Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を有する構造座標を伴う三次元構造を有する。

【0066】

別の実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−４模倣ポリペプチドは、天然ＩＬ−４の三次元構造の骨格原子またはα炭素原子に重ね合わせた場合、２．５Å未満、１．５Å未満、または１Å未満の共通残基の骨格原子またはα炭素原子の平均二乗偏差を含む構造座標を伴う三次元構造を有する。

【0067】

これらの実施形態の各々において、ポリペプチドの三次元構造は、計算モデリングを使用して決定され得るか、または、代替的に、ポリペプチドの三次元構造は、結晶学的に決定された構造データを使用して決定され得る。

【0068】

本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの一実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、αヘリックスのドメインである。別の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸長は、独立して、少なくとも約８、１０、１２、１４、１６、１９、またはそれ以上のアミノ酸長である。他の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸長は、独立して、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、または５０以下のアミノ酸長である。様々なさらなる実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々のアミノ酸長は、独立して、約８〜１０００、８〜５００、８〜４００、８〜３００、８〜２００、８〜１００、８〜５０、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、１０〜５０、１２〜１０００、１２〜５００、１２〜４００、１２〜３００、１２〜２００、１２〜１００、１２〜５０、１４〜１０００、１４〜５００、１４〜４００、１４〜３００、１４〜２００、１４〜１００、１４〜５０、１６〜１０００、１６〜５００、１６〜４００、１６〜３００、１６〜２００、１６〜１００、１６〜５０、１９〜１０００、１９〜５００、１９〜４００、１９〜３００、１９〜２００、１９〜１００、または約１９〜５０アミノ酸長である。

【0069】

別の実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチド、Ｘ１は、ヒトＩＬ−２受容体のβおよびγサブユニットに結合する。本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ２は、ヒトＩＬ−２受容体に結合しない。本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３は、ヒトＩＬ−２受容体のβサブユニットに結合する。本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドのさらなる実施形態では、Ｘ４は、ヒトＩＬ−２受容体のγサブユニットに結合する。別の実施形態または本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドでは、ポリペプチドは、ヒトまたはマウスＩＬ−２受容体のαサブユニットに結合しない。一実施形態では、受容体への結合は、生物学的に適切な濃度での表面プラズモン共鳴によって決定されるような特異的結合である。別の実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組合せのＩＬ−２模倣ペプチドは、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に結合し、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性で結合する。本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドのさらなる実施形態では、ヒトおよびマウスＩＬ−２受容体に対するポリペプチドの親和性は、天然ＩＬ−２の親和性とほぼ同等かまたはそれを超える。

【0070】

本明細書に開示される任意の実施形態または組合せのＩＬ−４模倣ポリペプチドの一実施形態では、ＩＬ−４受容体αγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−４Ｒαγ_ｃ）に結合し、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下の結合親和性で結合する。本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−４模倣ポリペプチドの別の実施形態では、ヒトおよびマウスＩＬ−４受容体に対するポリペプチドの親和性は、天然ＩＬ−４の親和性とほぼ同等かまたはそれを超える。

【0071】

本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは、天然ＩＬ−２とほぼ同等かまたはそれを超える効力で、ＩＬ−２受容体を発現する細胞において、ＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する。本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドの別の実施形態では、ポリペプチドは、天然ＩＬ−２とほぼ同等かまたはそれを超える効力で、ＩＬ−２受容体を発現する細胞において、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体を発現するが、ＩＬ−２受容体αを欠く細胞において、ＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する。

【0072】

別の実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＩＬ−２模倣ポリペプチドは、天然ＩＬ−２の熱安定性とほぼ同等かまたはそれを超える熱安定性を実証する。

【0073】

さらなる実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリペプチドは、ポリペプチドが、熱安定性試験後に、それらのフォールディングした構造の少なくとも７０％、８０％、または９０％を維持または回復し、かつ／あるいは、熱安定性試験後に、少なくとも８０％のそれらの楕円率スペクトルを維持または回復し、かつ／あるいは、熱安定性試験後に、少なくとも７０％または８０％のそれらの活性を維持または回復する。一実施形態では、そのような活性は、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによって決定される。別の実施形態では、熱安定性は、２２２ｎｍでの円二色性（ＣＤ）分光法によって測定される。さらなる実施形態では、熱安定性試験は、ポリペプチドを１時間の時間枠で２５℃から９５℃に加熱し、ポリペプチドを５分の時間枠で２５℃に冷却し、２２２ｎｍで楕円率をモニターすることを含む。

【0074】

本明細書に記載のポリペプチドは、化学合成または組換え発現することができる（ポリペプチドが遺伝的にコード可能な場合）。ポリペプチドは、インビボで半減期の増加を促進する安定化化合物などの他の化合物に連結され得、限定されないが、アルブミン、ＰＥＧ化（１つ以上のポリエチレングリコール鎖の結合）、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化、グリコシル化を含み、あるいはＦｃ融合または脱免疫バリアントとして産生され得る。このような結合は、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、部分を含むポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）の付加は、ポリペプチドのシステイン残基への、マレイミド基（「ＰＥＧ−ＭＡＬ」）に連結された（ｌｉｎｋｅｄ）ＰＥＧ基の結合を含み得る。ＰＥＧ−ＭＡＬの好適な例は、メトキシＰＥＧ−ＭＡＬ ５ｋＤ、メトキシＰＥＧ−ＭＡＬ ２０ｋＤ、メトキシ（ＰＥＧ）２−ＭＡＬ ４０ｋＤ、メトキシＰＥＧ（ＭＡＬ）２ ５ｋＤ、メトキシＰＥＧ（ＭＡＬ）２ ２０ｋＤ、メトキシＰＥＧ（ＭＡＬ）２ ４０ｋＤ、またはそれらの任意の組み合わせである。米国特許第８，１４８，１０９号も参照のこと。他の実施形態では、ＰＥＧは、分岐鎖ＰＥＧおよび／または複数のＰＥＧ鎖を含み得る。

【0075】

一実施形態では、安定化化合物は、限定されないが、ＰＥＧ含有部分を含み、ポリペプチドのシステイン残基で連結されている。別の実施形態では、システイン残基は、Ｘ２ドメインに存在する。一部の実施形態では、システイン残基は、例えば、Ｘ２ドメインのいくつかの位置のいずれか１つに存在する。一部のこのような実施形態では、Ｘ２ドメインは、少なくとも１９アミノ酸長であり、システイン残基は、それらの１９アミノ酸に対する位置１、２、５、９または１６にある。さらなる実施形態では、ＰＥＧ含有部分を含むがこれに限定されない安定化化合物は、マレイミド基を介して、配列番号９０に対するアミノ酸残基６２に存在するシステイン残基に連結されることを含むがこれに限定されない、システイン残基に連結される。

【0076】

一部の態様では、ポリペプチドは、Ｎｅｏ−２／１５ポリペプチドであり、Ｎｅｏ−２／１５のアミノ酸は、安定化部分（例えば、ＰＥＧ含有部分）をそれに結合するためにシステイン残基に変異している。一部の態様では、ポリペプチドは、Ｎｅｏ−２／１５ポリペプチドであり、配列番号９０、１８１、または２４７に対する位置５０、５３、６２、６９、７３、８２、５６、５８、５９、６６、７７、または８５のアミノ酸、あるいはそれらの組み合わせは、安定化部分（例えば、ＰＥＧ含有部分）をそれらに結合するためにシステイン残基に変異している。したがって、さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９０、１８１、または２４７［Ｎｅｏ−２／１５］のアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含み、以下の変異のうちの１、２、３、４、５、または６つすべてが存在する。
Ｒ５０Ｃ、
Ｅ５３Ｃ、
Ｅ６２Ｃ、
Ｅ６９Ｃ、
Ｒ７３Ｃおよび／または
Ｅ８２Ｃ。

【0077】

さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９０、１８１、または２４７のアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含み、以下の変異のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個すべてが存在する。
Ｄ５６Ｃ、
Ｋ５８Ｃ、
Ｄ５９Ｃ、
Ｒ６６Ｃ、
Ｔ７７Ｃ、
Ｅ８５Ｃ、
Ｒ５０Ｃ、
Ｅ５３Ｃ、
Ｅ６２Ｃ、
Ｅ６９Ｃ、
Ｒ７３Ｃおよび／または
Ｅ８２Ｃ。

【0078】

さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９０〜２４３からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0079】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９０および２１７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９０のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0080】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９１および２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９１のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0081】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９２および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９２のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0082】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９３および２２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９３のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0083】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９４および２２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９４のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0084】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９５および２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９５のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0085】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９６および２２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９６のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0086】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９７および２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９７のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0087】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９８および２２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９８のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0088】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９９および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１９９のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0089】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２００および２２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号２００のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0090】

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０１および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。一態様では、ポリペプチドは、配列番号２０１のアミノ酸配列と、その長さに沿って、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0091】

別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９５、２０７、２１４、２２２、２３４、および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含み、あるいは、ポリペプチドは、配列番号１９５、２０７、および２１４からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも２５％、２７％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一のポリペプチドを含む。

【0092】

さらなる実施形態では、ポリペプチドは、標的化ドメインをさらに含む。この実施形態では、ポリペプチドは、目的の標的を対象とすることができる。標的化ドメインは、ポリペプチドに共有結合または非共有結合し得る。標的化ドメインがポリペプチドに非共有結合している実施形態では、そのような非共有結合のための任意の好適な手段を使用することができ、限定されないが、ストレプトアビジン−ビオチンリンカーが含まれる。

【0093】

別の実施形態では、標的化ドメインは、存在する場合、ポリペプチドとの翻訳融合物である。この実施形態では、ポリペプチドおよび標的化ドメインは、翻訳融合物において互いに直接隣接してもよく、または意図された目的に好適なポリペプチドリンカーによって連結されてもよい。例示的なそのようなリンカーとしては、ＷＯ２０１６／１７８９０５、ＷＯ２０１８／１５３８６５（特に、１３ページ目）、およびＷＯ２０１８／１７０１７９（特に、段落［０３１６］〜［０３１７］）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、好適なリンカーとしては、これらに限定されないが、ＧＧＧＧＧ（配列番号９５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号９６）、ＧＧＧＧＧＧ（配列番号９７）、ＧＧＳＧＧＧ（配列番号９８）ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号９９）、ＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号１００）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０１）、および［ＧＧＧＧＸ］_ｎ（配列番号１０２）が挙げられ、ここで、Ｘは、Ｑ、ＥまたはＳであり、ｎは、２〜５である。

【0094】

標的化ドメインは、目的の標的に結合するポリペプチドドメインまたは小分子である。１つの非限定的な実施形態では、標的化ドメインは、細胞表面タンパク質に結合する。この実施形態では、細胞は、好適な標的化ドメインによって結合され得る表面タンパク質を含む、目的の任意の細胞型であり得る。一実施形態では、細胞表面タンパク質は、腫瘍細胞、腫瘍血管構成細胞、腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）、他の癌細胞および免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージを含むが、これらに限定されない）からなる群から選択される細胞の表面に存在する。細胞表面タンパク質が、腫瘍細胞、血管構成細胞、または腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）の表面にある場合、任意の好適な腫瘍細胞、血管構成細胞、または腫瘍微小環境細胞の表面マーカーとしては、限定されないが、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＴＲＯＰ２、ＲＯＲ１、ＲＯＮ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＢＣＭＡ、ＣＳ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−ＤＣ、ＨＬＤ−ＤＲ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フェリチン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、Ｌｅ^ｙ、ＣＡ−１２５、ＣＡ１９−９、上皮増殖因子、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＩＬ−２受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ）、線維芽細胞活性化タンパク質、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、エンドシアリン、血管内皮増殖因子、ａｖＢ３、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、非変異ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、ＰＲ１、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロンシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイントタンパク質、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、フコシルＧＭ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａｌ、ｓＬｅ（動物）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＶ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳＬ精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、レグマイン、Ｔｉｅ３、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＲＯＲ２、ＴＲＡＩＬ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ｃ２、ＧＡＧＥ、ＥＧＦＲ、ＣＭＥＴ、ＨＥＲ３、ＭＵＣ１５、ＣＡ６、ＮＡＰＩ２Ｂ、ＴＲＯＰ２、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬｏｒｆ１８６、ＲＯＮ、ＬＹ６Ｅ、ＦＲＡ、ＤＬＬ３、ＰＴＫ７、ＳＴＲＡ６、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＥＭ２３８、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＴＣＮ１、ＬＩＶ１、ＲＯＲ１、およびＦｏｓ関連抗原１、が挙げられる。

【0095】

他の実施形態では、細胞表面タンパク質が、腫瘍細胞、血管構成細胞、または腫瘍微小環境細胞（例えば、線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、または間質要素）の表面にある場合、任意の好適な腫瘍細胞、血管構成細胞、または腫瘍微小環境細胞の表面マーカーを標的とすることができ、限定されないが、以下のリストの標的を含む：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体タイプＩＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００１２０３）、
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３４８６）、
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０１２４４９）、
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ３６１４８６）、
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００５８２３）、
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−００６４２４）、
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７つのトロンボスポンジンリピート（タイプ１およびタイプ１様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０４０８７８）、
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３５８６２８）、
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２７５４６３）、
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０１７７６３）、
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ−８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２、６回膜貫通型前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ４５５１３８）、
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０１７６３６）、
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来増殖因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ．ｓｕｂ．−−００３２０３またはＮＭ．ｓｕｂ．−−００３２１２）、
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２６００４）、
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ．ｓｕｂ．−−０００６２６）、
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含むＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿−−０３０７６４）、
（１７）ＨＥＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１１７３０）、
（１８）ＮＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１８７２８）、
（１９）ＭＤＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＣ０１７０２３）、
（２０）ＩＬ２０Ｒ．α．（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１８４９７１）、
（２１）ブレビカン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２２９０５３）、
（２２）Ｅｐｈｂ２Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿−−００４４４２）、
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＸ０９２３２８）、
（２４）ＰＳＣＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＪ２９７４３６）、
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２６０７６３）、
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−４４３１７７．１）、
（２７）ＣＤ２２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−００１７６２．１）、
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連α、Ｉｇβ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面で複合体を形成するＢ細胞特異的タンパク質は、Ｂ−細胞分化に関与するシグナルを伝達する。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−００１７７４．１）、
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化されるＧタンパク質共役型受容体は、リンパ球の遊走と液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染、おそらくＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫および白血病の発症に関与する。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−００１７０７．１）、
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合し、それらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のβサブユニット、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−００２１１１．１）、
（３１）Ｐ２Ｘ５（細胞外ＡＴＰによって開口するイオンチャネルであるプリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、シナプス伝達および神経新生に関与している可能性があり、欠損は特発性排尿筋不安定性の病態生理学に寄与する可能性がある。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−００２５５２．２）、
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−００１７７３．１）、
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質は、Ｂ細胞の活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は全身性エリテマトーデスの患者で疾患活動性の上昇と関連している。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−００５５７３．１）、
（３４）ＦＣＲＨ１（Ｃ２型Ｉｇ様およびＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインに対する推定受容体であるＦｃ受容体様タンパク質１は、Ｂリンパ球の分化に役割を有する可能性がある。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−４４３１７０．１）、または
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞の発生およびリンパ腫形成に役割を有する可能性がある免疫受容体、転座による遺伝子の調節解除が、一部のＢ細胞悪性腫瘍で生じる。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿−−１１２５７１．１）。

【0096】

別の実施形態では、標的化ドメインは、免疫細胞表面マーカーに結合する。この実施形態では、標的は、限定されないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージを含む、任意の好適な免疫細胞上の細胞表面タンパク質であり得る。標的化ドメインは、任意の好適な免疫細胞表面マーカーであり得（内在性または操作免疫細胞で、限定されないが、改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む）、限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５４、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＴＬＡ−４を含む。別の実施形態では、標的化ドメインは、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＲＯＰ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ３３、ＣＤ２２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ１２３、ネクチン−４、組織因子抗原、ＣＤ１５４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）またはＭＵＣ１６に結合する、および／または、標的化ドメインは、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＲＯＰ２、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ３３、ＣＤ２２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ１２３、ネクチン−４、組織因子抗原、ＣＤ１５４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）またはＭＵＣ１６に結合する。

【0097】

これらすべての実施形態では、標的化ドメインは、目的の標的に結合する任意の好適なポリペプチドであり得、本開示のポリペプチドに組み込まれ得る。非限定的な実施形態では、標的化ドメインは、限定されないが、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、モノボディ、ナノボディ、ダイアボディ、抗体（単一特異性または二重特異性抗体を含む）、限定されないがＲＧＤを含む細胞標的化オリゴペプチド、インテグリン結合ペプチド、デノボ設計バインダー、アプタマー、二環ペプチド、コノトキシン、葉酸などの小分子、および細胞表面に結合するウイルス、を含み得る。

【0098】

別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む（すなわち、１、２、３、４、またはそれ以上のジスルフィド結合）。２つの異なるヘリックスを連結するジスルフィド結合など、任意の好適なジスルフィド結合を使用することができる。一実施形態では、ジスルフィド結合は、ヘリックス１（Ｘ１）およびヘリックス４（Ｘ４）を連結するジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合は、例えば、２つのドメインを一緒に連結するジスルフィド結合を有さない実質的に類似のポリペプチドと比較して、ポリペプチドの熱安定性を改善し得る。

【0099】

本発明のポリペプチドおよびペプチドドメインは、本開示のポリペプチドまたはペプチドドメインに存在しない、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方に追加の残基を含み得る。これらの追加の残基は、参照ポリペプチドに対する本開示のポリペプチドまたはペプチドドメインのパーセント同一性の決定には含まれない。そのような残基は、限定されないが、検出タグ（すなわち、蛍光タンパク質、抗体エピトープタグなど）、アダプター、精製の目的に好適なリガンド（Ｈｉｓタグなど）、ポリペプチドなどに機能性を付加する他のペプチドドメインを含む、意図された用途に好適な任意の残基であり得る。そのような基の結合に好適な残基は、システイン、リジンまたはｐ−アセチルフェニルアラニン残基を含み得るか、または米国特許第９，６７６，８７１号および同第９，７７７，０７０号に開示されるトランスグルタミナーゼとの反応に好適なアミノ酸タグなどのタグであり得る。

【0100】

さらなる態様では、本発明は、遺伝的にコードされ得る本発明のポリペプチドをコードする、単離された核酸を含む核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。そのような単離された核酸配列は、限定されないが、ポリＡ配列、修飾コザック配列、およびエピトープタグをコードする配列、輸送シグナル、および分泌シグナル、核局在化シグナル、および細胞膜局在化シグナルを含み、精製を促進するおよび／またはコードされたタンパク質を発現するのに有用な追加の配列を含み得る。本明細書の教示に基づいて、どの核酸配列が本開示のポリペプチドをコードするかは、当業者には明らかであろう。

【0101】

別の態様では、本発明は、好適な制御配列に作動可能に連結された本発明の任意の態様の単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」は、核酸コード領域または遺伝子を、遺伝子産物の発現をもたらすことができる任意の制御配列に機能的に連結するベクターを含む。本発明の核酸配列に機能可能に連結された「制御配列」は、核酸分子の発現をもたらすことができる核酸配列である。制御配列が核酸配列と隣接している必要がないのは、それらがその発現を指示するように機能する場合である。したがって、例えば、介在する非翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列と核酸配列との間に存在し得、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。他のそのような制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。そのような発現ベクターには、プラスミドおよびウイルスベースの発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的でもよく（限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含む様々なプロモーターのいずれかによって駆動される）、または誘導性でもよい（限定されないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むいくつかの誘導性プロモーターのいずれかによって駆動される）。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組み込みにより、宿主生物において複製可能でなければならない。様々な実施形態では、発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベースのベクター（限定されないが、レトロウイルスベクターまたは腫瘍溶解性ウイルスを含む）、または任意の他の好適な発現ベクターを含んでもよい。一部の実施形態では、発現ベクターは、治療上の利益のためにインビボでポリペプチドを発現するように、本開示の方法で投与され得る。非限定的な実施形態では、発現ベクターは、細胞治療標的（限定されないが、ＣＡＲ−Ｔ細胞または腫瘍細胞を含む）をトランスフェクトまたは形質導入して、本明細書に開示される治療方法を実施するために使用され得る。

【0102】

さらなる態様において、本開示は、本明細書に開示される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれでもよい。細胞は、限定されないが、細菌の形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチオン媒介、またはウイルス媒介トランスフェクションを含む技術を使用して、本発明の発現ベクターを組み込むように、一時的または安定的に操作することができる。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２^ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと）。．本発明によるポリペプチドを産生する方法は、本発明の追加的な部分である。この方法は、（ａ）本開示のこの態様に従って、ポリペプチドの発現を促す条件下で、宿主を培養するステップと、（ｂ）任意選択的に、発現した融合タンパク質を回収するステップと、を含む。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは、それらは培地から回収される。

【0103】

さらなる態様では、本開示は、本開示のポリペプチドに選択的に結合する抗体を提供する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、およびそれらの断片であり得、当業者に既知の技術を使用して作製され得る。本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」とは、当業者によく理解されているように、１つ以上の他の生体分子、構造、細胞、組織などとは対照的に、本開示のポリペプチドへの抗体の優先的結合を意味する。

【0104】

別の態様では、本開示は、本開示の１つ以上のポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、例えば、以下に記載される本開示の方法において使用することができる。医薬組成物は、本開示のポリペプチドに加えて、（ａ）凍結乾燥保護剤、（ｂ）界面活性剤、（ｃ）増量剤、（ｄ）張度調整剤、（ｅ）安定剤、（ｆ）防腐剤、および／または（ｇ）緩衝剤を含み得る。

【0105】

いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝剤は、トリス緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、または酢酸緩衝剤である。医薬組成物はまた、凍結乾燥保護剤、例えば、スクロース、ソルビトール、またはトレハロースも含み得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、防腐剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびそれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−６５、ポリソルベート−８０ポリソルベート−８５、ポロキサマー−１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、ソルビタントリオレアスト（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、またはそれらの組み合わせを含む。医薬組成物はまた、張度調整剤、例えば、製剤をヒトの血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物も含み得る。例示的な張度調整剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、および塩酸アルギニンが含まれる。他の実施形態では、医薬組成物は、安定剤、例えば、目的のタンパク質と組み合わせると、凍結乾燥または液体の形態での目的のタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止または低減する分子、をさらに含む。例示的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンが含まれる。

【0106】

ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、医薬組成物中の唯一の活性剤であり得るか、または、組成物は、意図された使用に好適な１つ以上の他の活性剤をさらに含み得る。

【0107】

さらなる態様では、本開示は、癌を治療および／または制限するための方法を提供し、それを必要とする対象に、癌を治療および／または制限するための、治療有効量の本開示の１つ以上のポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞、その塩、そのコンジュゲート、またはその医薬組成物、を投与することを含む。この方法が癌の治療を含む場合、１つ以上のポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、すでに癌を有すると診断された対象に投与される。本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」は、以下のうちの１つ以上を達成することを意味する。（ａ）対象における腫瘍および／または転移のサイズまたは体積を低減する、（ｂ）対象における腫瘍および／または転移のサイズまたは体積の増加を制限する、（ｃ）生存率の向上する、（ｄ）癌に関連する症状の重症度を軽減する、（ｅ）癌に関連する症状の発生を制限または予防する、（ｆ）癌に関連する症状の悪化を抑制する。

【0108】

この方法が癌の発症を制限することを含む場合、１つ以上のポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、癌を有することが知られていないが癌のリスクがあり得る対象に、予防的に投与される。本明細書で使用される場合、「制限する」とは、癌のリスクがある対象における癌の発症を制限することを意味し、限定されないが、癌の家族歴を有する対象、遺伝的に癌になりやすい対象、癌の症状を示す対象などを含む。

【0109】

この方法は、任意の好適な癌の発生を治療または制限するために使用することができ、限定されないが、結腸癌、黒色腫、腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、胃癌、尿路上皮癌、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、メルケル細胞癌、大腸癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮頸癌、および、マイクロサテライト不安定性、腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｕｒｄｅｎ）、ＰＤ−Ｌ１発現レベル、またはイムノスコアアッセイ（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒによって開発された）などの診断検査で選択された任意の腫瘍タイプ、が含まれる。

【0110】

対象は、癌を有する、または癌が発生するリスクのある、任意の対象であり得る。一実施形態では、対象は、哺乳動物であり、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシが含まれる。

【0111】

さらなる態様では、本開示は、対象に、ポリペプチド、組換え核酸、発現ベクター、組換え宿主細胞、または本開示の医薬組成物を投与することにより、対象における免疫応答を調節するための方法を提供する。

【0112】

本明細書で使用される場合、調節される「免疫応答」は、刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４またはＣＤ８）、制御性Ｔ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球、好酸球、または好中球などの免疫系の細胞による応答を指す。一部の実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的であり（「抗原特異的応答」）、それらの抗原特異的受容体を介したＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、またはＢ細胞による応答を指す。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などの、Ｔ細胞応答である。これらの細胞によるそのような応答は、例えば、細胞毒性、増殖、サイトカインまたはケモカイン産生、輸送、またはファゴサイトーシスを含み得、応答を受ける免疫細胞の性質に依存し得る。本明細書に記載の組成物および方法の一部の実施形態では、調節される免疫応答は、Ｔ細胞媒介性である。

【0113】

一部の態様では、免疫応答は、抗癌免疫応答である。一部のそのような態様では、本明細書に記載のＩＬ−２模倣体は、対象における抗癌免疫応答を調節するために、癌を有する対象に投与される。

【0114】

一部の態様では、免疫応答は、組織修復免疫応答である。一部のそのような態様では、本明細書に記載のＩＬ−４模倣体は、それを必要とする対象に投与されて、対象における組織修復免疫応答を調節する。

【0115】

一部の態様では、免疫応答は、創傷治癒免疫応答である。一部のそのような態様では、本明細書に記載されるＩＬ−４模倣体は、それを必要とする対象に投与されて、対象における創傷治癒免疫応答を調節する。

【0116】

一部の態様では、対象における第２の治療剤に対する免疫応答を調節するための方法が提供される。一部のそのような態様では、この方法は、有効量の第２の治療剤と組み合わせて、本開示のポリペプチドを、対象に投与することを含む。第２の治療剤は、例えば、化学療法剤または抗原特異的免疫療法剤であり得る。一部の態様では、抗原特異的免疫療法剤は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む。一部の態様では、本開示のポリペプチドは、治療剤に対する対象の免疫応答を増強する。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞応答（ＣＡＲ−Ｔ細胞応答を含む）の改善、先天性Ｔ細胞免疫応答の増強、炎症の低減、制御性Ｔ細胞活性の阻害、またはそれらの組み合わせ、によって増強することができる。

【0117】

一部の態様では、本発明のサイトカイン模倣体、例えば、本明細書に記載のＩＬ−４模倣体は、生体材料に含浸されるか、そうでなければ付随して、生体材料は、対象に導入される。一部の態様では、生体材料は、移植可能な医療装置の構成要素であり、装置は、例えば、生体材料でコーティングされるであろう。そのような医療装置には、例えば、血管および動脈の移植片が含まれる。ＩＬ−４および／またはＩＬ−４随伴生体材料は、例えば、創傷治癒および／または組織修復および組織再生を促進するために使用することができる。

【0118】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、癌を治療するおよび／または制限するのに有効な、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞の量を指す。ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、典型的には、従来の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する単位投与量の製剤中に、上に開示されたものなどの医薬組成物として処方され、限定されないが、経口、吸入スプレーで、静脈内、皮下、腹腔内、および膀胱内を含む任意の好適な経路を介して投与することができる。特定の一実施形態では、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、粘膜投与され、限定されないが、眼内、吸入、または鼻腔内投与を含む。別の特定の実施形態では、ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、経口投与される。そのような特定の実施形態は、液滴、ネブライザ、スプレー、または他の好適な製剤を介して投与され得る。

【0119】

担当の医療関係者によって決定されるように、任意の好適な投与量範囲を使用することができる。投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、療法的または予防的応答）を提供するように調整され得る。好適な用量範囲は、例えば、０．１ｕｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得、あるいは、それは、０．５ｕｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１ｕｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、または５ｕｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、推奨用量は、特に、局所的に投与される場合、０．１ｍｃｇ／ｋｇ未満であり得る。他の実施形態では、推奨用量は、体重／ｍ^２（すなわち、体表面積）に基づくことができ、および／またはそれは、一定用量（例えば、０．５〜１００ｍｇ）で投与することができる。ポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、担当の医療従事者により決定されるように、単回ボーラスで送達され得るか、または２回以上（例えば、２、３、４、５回以上）投与され得る。

【0120】

作製されたポリペプチド、核酸、発現ベクター、および／または宿主細胞は、唯一の予防剤または治療剤として投与されるか、または１つ以上の他の予防剤または治療剤と一緒に（すなわち、組み合わせてまたは別々に）投与され得、限定されないが、腫瘍切除、化学療法、放射線療法、免疫療法などが含まれる。

【0121】

計算環境の例
図２２は、計算ネットワークの例のブロック図である。限定されないが、一部として開示される技術、および／またはソフトウェアであるロゼッタソフトウェアスイート、ロゼッタスクリプト、Ｐｙロゼッタ、ロゼッタアプリケーション、および／または他の本明細書に記載のコンピュータソフトウェアおよびコンピュータハードウェアによって実行される技術などの、本明細書に開示される上記の技術の一部またはすべては、計算装置の一部である、および／または計算装置によって実行され得る。例えば、図Ｘ１は、ネットワーク１０６を介して、クライアント装置１０４ａ、１０４ｂ、および１０４ｃおよびタンパク質データベース１０８と通信するように構成されたタンパク質設計システム１０２を示している。一部の実施形態では、タンパク質設計システム１０２および／またはタンパク質データベース１０８は、限定されないが、ロゼッタの一部であるまたはロゼッタに関連するものとして記載された方法３００および機能性などの、本明細書に記載の方法および技術の一部またはすべてを実行するように構成された計算装置であり得る。タンパク質データベース１０８は、一部の実施形態では、ロゼッタに関連するおよび／またはロゼッタによって使用される情報を記憶することができる。

【0122】

ネットワーク１０６は、ＬＡＮ、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、企業内イントラネット、パブリックインターネット、またはネットワーク化された計算装置間の通信パスを提供するように構成された任意の他のタイプのネットワークに対応し得る。ネットワーク１０６はまた、１つ以上のＬＡＮ、ＷＡＮ、企業イントラネット、および／またはパブリックインターネットの組み合わせに対応し得る。

【0123】

図２２は、３つのクライアント装置１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃのみを示しているが、分散型アプリケーションアーキテクチャは、数十、数百、または数千のクライアント装置にサービスを提供し得る。さらに、クライアント装置１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃ（または任意の追加のクライアント装置）は、通常のラップトップコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ネットワーク端末、無線通信装置（例えば、携帯電話またはスマートフォン）などの、任意の種類の計算装置であり得る。一部の実施形態では、クライアント装置１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃは、問題解決／ロゼッタソフトウェアスイートの使用専用にすることができる。他の実施形態では、クライアント装置１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃは、いくつかのタスクを実行するように構成され、問題解決／ロゼッタソフトウェアスイートの使用に専念する必要のない汎用コンピュータとして使用することができる。さらに他の実施形態では、タンパク質設計システム１０２および／またはタンパク質データベース１０８の機能性の一部またはすべてを、クライアント装置１０４ａ、１０４ｂ、および／または１０４ｃなどのクライアント装置に組み込むことができる。

【0124】

計算環境アーキテクチャ
図２３Ａは、例示的な計算装置（例えば、システム）のブロック図である。特に、図２３Ａに示される計算装置２００は、ロゼッタの一部であるまたはロゼッタに関連するものとして記載された方法３００および機能性などの、本明細書に記載の方法および技術の一部またはすべての、構成要素を含むようにおよび／または１つ以上の機能を実行するように、構成され得る。計算装置２００は、ユーザインターフェースモジュール２０１、ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２、１つ以上のプロセッサ２０３、データストレージ２０４、およびタンパク質合成装置２２０を含み得、これらはすべて、システムバス、ネットワーク、または他のコネクションメカニズム２０５を介して一緒に連結され得る。

【0125】

ユーザインターフェースモジュール２０１は、外部ユーザの入力／出力装置にデータを送信するおよび／またはそれからデータを受信するように動作可能であり得る。例えば、ユーザインターフェースモジュール２０１は、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、コンピュータマウス、トラックボール、ジョイスティック、カメラ、音声認識モジュール、および／または他の同様の装置などのユーザ入力デバイスにデータを送信する、ならびに／あるいは、それにまたは／それからデータを受信するように構成することができる。ユーザインターフェースモジュール２０１はまた、１つ以上のブラウン管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、デジタル光処理（ＤＬＰ）技術を使用するディスプレイ、プリンタ、電球、および／または現在知られている、または後に開発される他の同様の装置などのユーザディスプレイ装置に出力を提供するように構成することができる。ユーザインターフェースモジュール２０１は、スピーカ、スピーカジャック、オーディオ出力ポート、オーディオ出力装置、イヤホン、および／または他の類似の装置などの、可聴出力を生成するように構成することもできる。

【0126】

ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２は、図２２に示されるネットワーク１０６などのネットワークを介して通信するように構成可能な１つ以上の無線インターフェース２０７および／または１つ以上の有線インターフェース２０８を含むことができる。無線インターフェース２０７は、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ送受信器、Ｚｉｇｂｅｅ送受信器、Ｗｉ−Ｆｉ送受信器、ＷｉＭＡＸ送受信器、および／または無線ネットワークを介して通信するように構成可能な他の同様のタイプの無線送受信器などの１つ以上の無線送信器、受信器、および／または送受信器を含むことができる。有線インターフェース２０８は、イーサネット送受信器、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）送受信器、またはツイストペア、１つ以上のワイヤー、同軸ケーブル、光ファイバ連結、または有線ネットワークへの同様の物理的連結を介して通信するように構成可能な同様の送受信器などの、１つ以上の有線送信器、受信器、および／または送受信器を含むことができる。

【0127】

一部の実施形態では、ネットワーク通信インターフェースモジュール２０２は、信頼できる、安全な、および／または認証された通信を提供するように構成することができる。本明細書に記載の各通信について、信頼できる通信（すなわち、保証されたメッセージ配信）を確実にするための情報は、おそらく、メッセージヘッダーおよび／またはフッターの一部として提供することができる（例えば、パケット／メッセージ配列情報、カプセル化ヘッダー（複数可）および／またはフッター（複数可）、サイズ／時間情報、ならびにＣＲＣおよび／またはパリティチェック値などの送信検証情報）。通信は、限定されないが、ＤＥＳ、ＡＥＳ、ＲＳＡ、Ｄｉｆｆｉｅ−Ｈｅｌｌｍａｎ、および／またはＤＳＡなどの、１つ以上の暗号プロトコルおよび／またはアルゴリズムを使用して、安全にし（例えば、コード化または暗号化する）、および／または復号／解読することができる。同様に、他の暗号プロトコルおよび／またはアルゴリズムを使用することもでき、または、通信を安全にするために（次いで復号／解読する）、本明細書に列挙されたものに加えて、それらを使用することもできる。

【0128】

プロセッサ２０３は、１つ以上の汎用プロセッサおよび／または１つ以上の特殊目的プロセッサ（例えば、デジタルシグナルプロセッサ、特定用途向け集積回路など）を含むことができる。プロセッサ２０３は、データストレージ２０４に含まれるコンピュータ可読プログラム命令２０６および／または本明細書に記載される他の命令を実行するように構成することができる。データストレージ２０４は、プロセッサ２０３の少なくとも１つによって読み取られ、および／またはアクセスされ得る１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体を含むことができる。１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体は、全体的または部分的に少なくとも１つのプロセッサ２０３と統合することができ、光学、磁気、有機または他のメモリまたはディスクストレージなどの揮発性および／または不揮発性記憶構成要素を含むことができる。一部の実施形態では、データストレージ２０４は、単一の物理装置（例えば、１つの光学、磁気、有機または他のメモリまたはディスクストレージユニット）を使用して実装することができ、他の実施形態では、データストレージ２０４は、２つ以上の物理装置を使用して実装することができる。

【0129】

データストレージ２０４は、コンピュータ可読プログラム命令２０６およびおそらく追加のデータを含むことができる。例えば、一部の実施形態では、データストレージ２０４は、タンパク質設計システムおよび／またはタンパク質データベース（例えば、タンパク質設計システム１０２、タンパク質データベース１０８）、によって利用されるデータの一部またはすべてを記憶することができる。一部の実施形態では、データストレージ２０４は、本明細書に記載の方法および技術の少なくとも一部、および／または本明細書に記載の装置およびネットワークの機能性の少なくとも一部を実行するために必要なストレージをさらに含むことができる。

【0130】

一部の実施例では、計算装置２００は、タンパク質合成装置２２０を含む。タンパク質合成装置は、プロセッサ２０３および／またはデータストレージ２０４によって提供されるコマンドおよび／またはデータを使用して、タンパク質合成装置２２０に提供される入力データに基づいて、ポリペプチドを合成（または生成する）することができる。例えば、タンパク質合成装置２２０の機能性の一部または全部は、半自動または自動化されたペプチドシンセサイザーによって実行することができる。

【0131】

図２３Ｂは、例示的な実施形態による、クラウドベースのサーバーシステムとして配置された計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、２０９ｃのネットワーク１０６を示している。タンパク質設計システム１０２のデータおよび／またはソフトウェアは、クラウドベースのアプリケーションおよび／またはサービスのプログラム論理および／またはデータを記憶する１つ以上のクラウドベースの装置に記憶することができる。一部の実施例では、タンパク質設計システム１０２は、単一の計算センターに常在する単一の計算装置であり得る。他の実施例では、タンパク質設計システム１０２は、単一の計算センター内の複数の計算装置、または異なる地理的位置にある複数の計算センターに配置された複数の計算装置でさえ含むことができる。

【0132】

一部の実施例では、タンパク質設計システム１０２のデータおよび／またはソフトウェアは、有形のコンピュータ可読媒体（またはコンピュータ可読記憶媒体）に記憶され、クライアント装置１０４ａ、１０４ｂ、および１０４ｃ、および／または他の計算装置によってアクセス可能な、コンピュータ可読情報として符号化することができる。一部の実施例では、タンパク質設計システム１０２のデータおよび／またはソフトウェアは、単一のディスクドライブまたは他の有形記憶媒体に記憶することができ、または１つ以上の異なる地理的位置に位置する複数のディスクドライブまたは他の有形記憶媒体に実装することができる。

【0133】

図２３Ｂは、例示的な実施形態による、クラウドベースのサーバーシステムを示している。図２３Ｂでは、タンパク質設計システム１０２の機能は、３つの計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、および２０９ｃの間で分散され得る。計算クラスタ２０９ａは、ローカルクラスタネットワーク２１２ａによって連結された１つ以上の計算装置２００ａ、クラスタストレージアレイ２１０ａ、およびクラスタルータ２１１ａを含むことができる。同様に、計算クラスタ２０９ｂは、ローカルクラスタネットワーク２１２ｂによって連結された１つ以上の計算装置２００ｂ、クラスタストレージアレイ２１０ｂ、およびクラスタルータ２１１ｂを含むことができる。同様に、計算クラスタ２０９ｃは、ローカルクラスタネットワーク２１２ｃによって連結された１つ以上の計算装置２００ｃ、クラスタストレージアレイ２１０ｃ、およびクラスタルータ２１１ｃを含むことができる。

【0134】

一部の実施例では、計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、および２０９ｃの各々は、同数の計算装置、同数のクラスタストレージアレイ、および同数のクラスタルータを有することができる。ただし、他の実施例では、各計算クラスタは、異なる数の計算装置、異なる数のクラスタストレージアレイ、および異なる数のクラスタルータを有することができる。各計算クラスタ内の計算装置、クラスタストレージアレイ、およびクラスタルータの数は、各計算クラスタに割り当てられた計算タスク（複数可）によって異なる。

【0135】

計算クラスタ２０９ａでは、例えば、計算装置２００ａは、タンパク質設計システム１０２の様々な計算タスクを実行するように構成することができる。一実施例では、タンパク質設計システム１０２の様々な機能性は、１つ以上の計算装置２００ａ、２００ｂ、および２００ｃの間で分散され得る。計算クラスタ２０９ｂおよび２０９ｃ内の計算装置２００ｂおよび２００ｃは、計算クラスタ２０９ａ内の計算装置２００ａと同様に構成することができる。他方、一部の実施例では、計算装置２００ａ、２００ｂ、および２００ｃは、異なる機能を実行するように構成することができる。

【0136】

一部の実施例では、タンパク質設計システム１０２に関連する計算タスクおよび記憶されたデータは、タンパク質設計システム１０２の処理要件、計算装置２００ａ、２００ｂ、および２００ｃの処理能力、各計算クラスタ内の計算装置間および計算クラスタ自体間のネットワーク連結の待ち時間、および／またはコスト、速度、フォールトトレランス、レジリエンス、効率に寄与し得る他の要因、および／またはシステムアーキテクチャ全体の他の設計目標、に少なくとも部分的に基づいて、計算装置２００ａ、２００ｂ、および２００ｃの間で分散され得る。

【0137】

計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、および２０９ｃのクラスタストレージアレイ２１０ａ、２１０ｂ、および２１０ｃは、データストレージアレイであり得、ハードディスクドライブのグループへの読み取りアクセスおよび書き込みアクセスを管理するように構成されたディスクアレイコントローラを含む。ディスクアレイコントローラは、単独で、またはそれぞれの計算装置と組み合わせて、クラスタストレージアレイに記憶されているデータのバックアップまたは冗長コピーを管理して、ディスクドライブまたはその他のクラスタストレージアレイ障害および／またはネットワーク障害から保護するように構成することもでき、１つ以上の計算装置が１つ以上のクラスタストレージアレイにアクセスするのを防止する。

【0138】

タンパク質設計システム１０２の機能を計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、および２０９ｃの計算装置２００ａ、２００ｂ、および２００ｃに分散させ得る様式と同様に、これらの構成要素の様々なアクティブ部分および／またはバックアップ部分を、クラスタストレージアレイ２１０ａ、２１０ｂ、および２１０ｃの間で分散することができる。例えば、一部のクラスタストレージアレイは、タンパク質設計システム１０２のデータおよび／またはソフトウェアの一部を記憶するように構成することができ、一方、他のクラスタストレージアレイは、タンパク質設計システム１０２のデータおよび／またはソフトウェアの別個の部分を記憶することができる。さらに、一部のクラスタストレージアレイは、他のクラスタストレージアレイに記憶されたデータのバックアップバージョンを記憶するように構成することができる。

【0139】

計算クラスタ２０９ａ、２０９ｂ、および２０９ｃ内のクラスタルータ２１１ａ、２１１ｂ、および２１１ｃは、計算クラスタに内部および外部通信を提供するように構成されたネットワーク機器を含むことができる。例えば、計算クラスタ２０９ａのクラスタルータ２１１ａは、（ｉ）ローカルクラスタネットワーク２１２ａを介して計算装置２００ａとクラスタストレージアレイ２０１ａとの間のローカルエリアネットワーク通信、および（ｉｉ）ネットワーク１０６への広域ネットワーク連結２１３ａを介した、計算クラスタ２０９ａと計算クラスタ２０９ｂおよび２０９ｃとの間の広域ネットワーク通信、を提供するように構成された１つ以上のインターネットスイッチングおよびルーティング装置を含むことができる。クラスタルータ２１１ｂおよび２１１ｃは、クラスタルータ２１１ａと同様のネットワーク機器を含むことができ、クラスタルータ２１１ｂおよび２１１ｃは、クラスタルータ２１１ａが計算クラスタ２０９ａに関して実行するように、計算クラスタ２０９ｂおよび２０９ｂに関して同様のネットワーク機能を実行することができる。

【0140】

一部の実施例では、クラスタルータ２１１ａ、２１１ｂ、および２１１ｃの構成は、計算装置およびクラスタストレージアレイのデータ通信要件、クラスタルータ２１１ａ、２１１ｂ、および２１１ｃのネットワーク機器のデータ通信能力、ローカルネットワーク２１２ａ、２１２ｂ、２１２ｃの待ち時間およびスループット、広域ネットワーク連結２１３ａ、２１３ｂ、および２１３ｃの待ち時間、スループット、およびコスト、および／またはコスト、速度、フォールトトレランス、レジリエンス、効率に寄与し得る他の要因、および／またはモデレーションシステムアーキテクチャのその他の設計目標、に少なくとも部分的に基づき得る。

【0141】

操作方法の実施例
図２４は、例示的な方法３００のフローチャートである。方法３００は、少なくとも図２Ａの文脈で説明される計算装置２００などの計算装置によって実行することができる。少なくとも、以下に述べる方法３００の例は、上で議論されている。

【0142】

方法３００は、ブロック３１０で開始することができ、計算装置は、計算装置を使用してタンパク質の複数の残基の構造を決定することができ、複数の残基の構造は、特定の受容体結合界面を提供する。熟練した開業医によって理解されるように、複数の残基の構造が特定の受容体結合界面を提供する、タンパク質の複数の残基の構造の決定は、典型的には、特定の受容体結合界面に結合する天然タンパク質の元の残基の同定であり、複数の設計される残基は、同じ受容体結合界面に結合し得る同定された残基である。

【0143】

ブロック３２０において、計算装置は、模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定することができ、複数の設計された残基は、特定の受容体結合界面を提供し、複数の設計された残基は、複数の残基とは異なる。

【0144】

一部の実施例では、模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定することは、理想化残基のデータベースを使用して、理想化残基を決定することを含むことができ、理想化残基は、複数の設計された残基の設計された残基に関連する。これらの実施例の一部において、理想化された残基のデータベースを使用して理想化された残基を決定することは、理想化された残基のデータベースから、理想化された残基に関連する１つ以上の理想化された断片を検索することと、１つ以上の理想化された断片を使用して、関連する設計された残基を再構築することによって、理想化された残基を決定することと、を含み得る。これらの実施例の一部において、１つ以上の理想化された断片を使用して関連する設計された残基を再構築することは、１つ以上の理想化された断片の対のコンビナトリアル断片アセンブリの使用によって、１つ以上の理想化された断片の対を再連結することと、デカルト制約付き骨格最小化を使用して、１つ以上の理想化された断片の対が、複数の設計された残基のうちの２つ以上を連結するかどうかを決定することと、を含み得る。これらの実施例の一部では、１つ以上の理想化された断片を使用して関連する設計された残基を再構築することは、理想化された残基のデータベースを使用して、理想化された残基の重複する断片が理想化された断片であることを検証することと、理想化された残基が、特定の受容体結合界面に関連する標的受容体と衝突しないかどうかを検証することと、理想化された残基が、特定の受容体結合界面に関連する標的受容体と衝突しないことを検証した後、理想化された残基のデータベースを使用して、理想化された残基の各位置で最も可能性の高いアミノ酸を決定することと、を含み得る。これらの実施例の一部では、１つ以上の連結ヘリックス構造および複数の組み合わせにわたる複数の設計された残基を組み立てることによって、タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することは、１つ以上の理想化された断片の対を、組み合わせて再結合することによって、１つ以上の理想化された断片の対を再結合することと、１つ以上の理想化された断片の再結合された対を使用して、タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することと、を含み得る。これらの実施例の一部では、１つ以上の理想化された断片の対を組み合わせて再結合することは、１つ以上の理想化された断片の対の理想化された断片間の相互連結長に基づいて、１つ以上の理想化された断片の対をランク付けすることを含み得る。

【0145】

他の実施例では、模倣設計プロトコルを使用して複数の設計された残基を決定することは、複数の設計された残基の設計された残基の形状を表す１つ以上のパラメトリック方程式を使用して、理想化された残基を決定することと、複数の設計された残基のうちの少なくとも１つの設計された残基で理想化された残基を閉じる、単一の断片を決定することと、を含み得る。これらの実施例の一部では、設計された残基は、ヘリックス構造を含むことができ、１つ以上のパラメトリック方程式は、ヘリックス構造のファイ（φ）およびプサイ（ψ）角度に関連する方程式を含むことができる。これらの実施例の一部では、ヘリックス構造のφおよびψ角度に関連する方程式は、ヘリックス構造のφおよびψ角度の角度ピッチに関連する１つ以上の項を含むことができる。

【0146】

ブロック３３０では、計算装置は、複数の設計された残基を連結する１つ以上の連結ヘリックス構造を決定することができる。

【0147】

ブロック３４０では、計算装置は、１つ以上の連結ヘリックス構造および複数の設計された残基を、複数の組み合わせにわたって組み立てることによって、タンパク質の第１のタンパク質骨格を決定することができる。

【0148】

ブロック３５０では、計算装置は、第１のタンパク質骨格に基づいて、柔軟性および低エネルギー構造のために、タンパク質の第２のタンパク質骨格を設計することができる。

【0149】

ブロック３６０では、計算装置は、少なくとも第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することができる。一部の実施例では、タンパク質の第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することは、タンパク質の第２のタンパク質骨格に基づいて、１つ以上の分子を設計することを含み得る。

【0150】

他の実施例では、タンパク質の第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することは、タンパク質の第２のタンパク質骨格に基づくタンパク質の合成遺伝子を生成することと、合成遺伝子を使用して、インビボで特定のタンパク質を発現させることと、特定のタンパク質を精製することと、を含み得る。これらの実施例の一部では、合成遺伝子を使用して、インビボで特定のタンパク質配列を発現させることは、合成遺伝子を含む１つ以上の大腸菌で、特定のタンパク質配列を発現させることを含み得る。

【0151】

他の実施例では、タンパク質の第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することは、タンパク質の第２のタンパク質骨格の少なくとも一部を含む１つ以上の画像を生成することを含み得る。

【0152】

他の実施例では、計算装置は、タンパク質合成装置を含むことができる。次いで、タンパク質の少なくとも第２のタンパク質骨格に関連する出力を生成することは、タンパク質合成装置を使用して、タンパク質の少なくとも第２のタンパク質骨格を合成することを含み得る。

【0153】

一実施形態では、本方法は、本明細書に例示されるように、タンパク質模倣体を設計するためのものである。

【0154】

本明細書に記載の計算方法によって調製された非天然タンパク質も含まれる。非天然タンパク質は、サイトカイン、例えば、非天然ＩＬ−２またはＩＬ−４模倣体であり得る。

【0155】

本明細書に示されている項目は、例示であり、単に本発明の実施形態の例示的な考察を目的とするもので、本発明の様々な実施形態の原理および概念的側面の、最も有用で理解しやすい説明であると考えられるものを提供するために提示されている。この点に関して、本発明の基本的な理解に必要であるよりも詳細に本発明の構造上の詳細を示そうとはせず、本発明のいくつかの形態がどのように実際に具体化され得るかを当業者に明らかにする図面および／または例により、発明を実施するための形態を示す。

【0156】

上記の定義および説明は、以下の実施例で明瞭かつ明確に変更されない限り、または意味の適用によって構成が無意味または本質的に無意味になる場合を除いて、任意の将来の構成で制御することを意図および意図している。用語の構成によって無意味になる、または本質的に無意味になる場合、定義はＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、またはｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）などの当業者に既知の辞書から取得する必要がある。

【0157】

上記の説明は、本開示の実施形態を完全に理解し、その説明を実施可能にするための具体的な詳細を提供する。しかしながら、当業者は、これらの詳細なしに、開示が実施され得ることを理解するであろう。他の実施例では、本開示の実施形態の説明を不必要に不明瞭にすることを回避するために、既知の構造および機能は詳細に示されていないか、または説明されていない。本開示の実施形態の説明は、網羅的であるようにも、本開示を、開示された正確な形態に限定するようにも意図されていない。本開示の特定の実施形態および実施例が例示的な目的で本明細書に記載されているが、当業者であれば認識するであろうが、本開示の範囲内で、様々な同等の修正が可能である。

【0158】

本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照により援用される。開示の態様は、必要であれば、上記の参考文献およびアプリケーションのシステム、機能、および概念を使用して、開示のまたさらなる実施形態を提供するように変更することができる。これらおよび他の変更は、詳細な説明に照らして、開示に加えることができる。

【0159】

前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示の特定の実施形態に関連する利点は、これらの実施形態の文脈で説明されてきたが、他の実施形態もそのような利点を示すことができ、本開示の範囲に該当するために、すべての実施形態が、必ずしもそのような利点を示す必要はない。

【0160】

上記の詳細な説明は、添付の図面を参照して、開示されたシステム、デバイス、および方法の様々な特徴および機能を説明している。図面において、文脈から明らかでない限り、類似の記号は、通常、類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定することを意味していない。本明細書に提示される対象の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般的に記載され、図面に例解されるような本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、および設計することができ、これらのすべてが本明細書に明示的に企図されていることは容易に理解される。

【0161】

本明細書で説明するように、図面におけるラダー図、シナリオ、およびフローチャートのいずれかまたはすべてに関して、各ブロック、および／または通信は、例示的な実施形態に従って、情報の処理および／または情報の送信を表し得る。代替的な実施形態は、これらの例示的な実施形態の範囲内に含まれる。これらの代替的な実施形態では、例えば、ブロック、送信、通信、要求、応答、および／またはメッセージとして説明される機能は、関連する機能性に応じて、示されたまたは議論された順序とは異なる順序で実行することができ、実質的に同時または逆の順序を含む。さらに、より多いかまたは少ないブロック、および／または機能が、本明細書に記載されるラダー図、シナリオ、およびフローチャートのいずれかとともに使用することができ、これらのラダー図、シナリオ、およびフローチャートは、一部または全体で、互いと組み合わせることができる。

【0162】

情報の処理を表すブロックは、本明細書で説明する方法または技術の特定の論理機能を実行するように構成することができる回路に対応し得る。代替的または追加的に、情報の処理を表すブロックは、モジュール、セグメント、またはプログラムコードの一部（関連データを含む）に対応し得る。プログラムコードは、方法または技術において特定の論理機能または動作を実装するためにプロセッサによって実行可能な１つ以上の命令を含むことができる。プログラムコードおよび／または関連データは、ディスクドライブもしくはハードドライブ、または他の記憶媒体を含む記憶装置などの、任意のタイプのコンピュータ可読媒体に記憶することができる。

【0163】

コンピュータ可読媒体はまた、レジスタメモリ、プロセッサキャッシュ、および／またはランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）のような短期間データを記憶するコンピュータ可読媒体などの非一時的コンピュータ可読媒体も含むことができる。コンピュータ可読媒体は、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、光学ディスクもしくは磁気ディスク、および／またはコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）のような二次的または永続的な長期ストレージなどの、プログラムコードおよび／またはデータをより長期間記憶する非一時的コンピュータ可読媒体も含むことができる。コンピュータ可読媒体はまた、任意の他の揮発性または不揮発性記憶システムでもあり得る。コンピュータ可読媒体は、例えば、コンピュータ可読記憶媒体、または有形の記憶装置と見なされ得る。さらに、１つ以上の情報送信を表すブロックは、同じ物理装置中のソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュール間の情報送信に対応し得る。しかしながら、異なる物理デバイスにおけるソフトウェアモジュールおよび／またはハードウェアモジュール間で、他の情報送信が行われ得る。

【0164】

上記の教示に照らして、本開示の多数の修正および変形が可能である。

【実施例】

【0165】

天然サイトカインの機能部位が繰り返されるものの、それ以外はトポロジまたはアミノ酸配列において無関係である、デノボサイトカイン模倣体を設計するための計算アプローチを説明する。この戦略は、ＩＬ−２およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）^１５のデノボ模倣体を設計するために使用されたもので、ＩＬ−２受容体βγ_ｃヘテロ二量体（ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）^{１６，１７}に結合するが、ＩＬ−２ＲαまたはＩＬ−１５Ｒαの結合部位を有さない。設計は、超安定で、天然のサイトカインよりも高い親和性でヒトおよびマウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合し、ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−１５Ｒαとは無関係に、下流の細胞シグナル伝達を誘発する。実験的に最適化された模倣体であるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の結晶構造は、設計モデルに非常に近く、マウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃ複合体についての最初の構造情報を提供する。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、黒色腫および結腸癌のマウスモデルにおいて、ＩＬ−２と比較して非常に効果的な治療活性を有し、毒性が低減され、免疫原性の兆候を有さない。超安定なデノボ模倣体を構築するためのこの戦略は、多数の天然サイトカインおよび他のシグナル伝達タンパク質に容易に適用でき、強化された臨床プロファイルを有する、優れた治療候補の生成を可能にする。

【0166】

天然のタンパク質ホルモンおよびサイトカインの強力な生物学的活性のために、タンパク質操作を通して、それらの潜在的な治療効果を改善するための広範な努力がなされてきた。そのような努力によって、製造を簡素化し、半減期を延長し、受容体相互作用を調節しようとしてきた^{１８−２０}。しかしながら、天然に存在する生物活性タンパク質から始める場合、新しい治療剤の開発には固有の課題がある。第一に、ほとんどの天然タンパク質はほんのわずかしか安定でないため^{２１−２５}、有効性を高めることを目的としたアミノ酸置換は、発現を低下させたり、凝集を引き起こしたりして、製造と保管を困難にする可能性がある。機能ドメインまたは標的化ドメインの欠失または融合などのより大幅な変更は、しばしば実行不可能であり、薬物動態特性および組織浸透を劇的に変化させる可能性がある^１９。第二に、操作されたバリアントに対する免疫応答は、内因性分子^{２６−３５}と交差反応し、壊滅的な結果をもたらす可能性を有する。計算設計アプローチは、これらの課題を回避する改善された治療特性を備えた天然タンパク質の類似体を生成するために開発され、疾患の治療に最適な受容体結合界面の特定のサブセットを呈するデノボサイトカイン模倣体の操作に注力している。

【0167】

多くのサイトカインは、複数の異なる受容体サブユニット^{１５、１６、３６−３９}と相互作用し、ほとんどの天然に存在するタンパク質と同様に、安定性が損なわれるものの機能にとっては重要な、非理想的な構造的特徴を含んでいる。所望の受容体サブユニットと相互作用する構造要素が、空間的に固定され、理想化された球状タンパク質構造が、これらの要素を支持するように構築される、計算プロトコルが開発された。知識ベースのループ閉環と組み合わせた非実体化ヘリックスのパラメトリック構築で短鎖線状エピトープを支持するために、コンビナトリアル断片アセンブリを使用して、以前の取り組みを拡張した（図１ａ〜ｂ）。このアプローチは、ヒトＩＬ−２Ｒβγ_ｃ（ｈＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に対するヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）およびヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）の相互作用表面を模倣するが、ＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２Ｒα）の相互作用表面を完全に欠いている、相互作用表面を有する安定な理想化されたタンパク質をデノボ設計することによって、試験された。変異^{９，４４，４５}（例えば、Ｓｕｐｅｒ−２のＦ４２Ａ変異、Ｈ９^９としても知られている）またはＰＥＧ化（例えば、ＮＫＴＲ−２１４^９，１３）のいずれかによって、ｈＩＬ−２のα相互作用領域を除去する以前の取り組みは、ｈＩＬ−２Ｒβγ_ｃ受容体に対する安定性、結合および／またはサイトカインの効力を著しく減少させ、一方で、α相互作用を完全に除去することに失敗した。

【0168】

ＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合して活性化するＩＬ−２／ＩＬ−１５模倣体の計算設計：天然ｈＩＬ−２は、長い不規則なループによって連結された４つのヘリックスで構成される。Ｎ末端ヘリックス（Ｈ１）は、ＩＬ−２受容体のβサブユニットおよびγサブユニットの両方と相互作用し、３番目のヘリックス（Ｈ３）は、βサブユニットと相互作用し、Ｃ末端ヘリックス（Ｈ４）は、γサブユニットと相互作用する。αサブユニットの相互作用表面は、不規則な２番目のヘリックス（Ｈ２）および２つの長いループによって形成され、片方は、Ｈ１をＨ２に連結し、他方は、Ｈ３とＨ４を連結する。Ｈ１、Ｈ３、Ｈ４によって形成された界面をβとγで再現し、Ｈ２をより良いパッキングを提供する通常のヘリックスに置き換える理想的なタンパク質が設計された。ヘリックスＨ１、Ｈ３、およびＨ４（図１ａを参照）を、結合部位のテンプレートとして使用し、一方、ヘリックスＨ２は、高度に表現されたクラスタ断片（方法を参照）のデータベースを使用して再構築した（Ｈ２’）。ヘリックスの対は、同じデータベースから抽出されたループで連結され（図１ｂを参照）、得られたヘリックスヘアピンは、完全に連結された骨格に結合され（図１ｃを参照）、ロゼッタ^{４６−４８}コンビナトリアルフレキシブル骨格配列の設計計算を、ｈＩＬ−２Ｒβγ_ｃの存在下で実行した（方法を参照）。酵母ディスプレイによる実験的特性評価のために、上位の４つの計算設計、および８つの単一ジスルフィドステープルバリエーション（表Ｓ１を参照）を選択した（方法を参照）。８つの設計が、低ナノモル濃度で、蛍光タグ付きβ−γキメラＩＬ−２受容体に結合することがわかった。最良の非ジスルフィド設計（Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０）を、部位飽和変異誘発に供し、続いてマウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃ（ｍＩＬ−２Ｒβγ_ｃ、図１０を参照）に対する親和性を増加させる置換を選択し、組み合わせた。最適化された設計（大腸菌で組換え発現された）は、低ナノモル濃度またはピコモル濃度でさえ、ＩＬ−２応答性のマウス細胞で、インビトロでｐＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘発することがわかった（表Ｅ１を参照）ものの、熱安定性が比較的低かった（Ｔｍ約４５℃未満、図１４および１５を参照）。安定性を改善するために、計算設計プロトコルを繰り返し、最も親和性の高い第１ラウンド設計の骨格（Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ、トポロジ：Ｈ１→Ｈ４→Ｈ２’→Ｈ３）から開始し、ループ構築プロセスとヘリックス長のパラメトリック変動を組み合わせた（＋／−８アミノ酸、図１ａの下部パネルを参照）。この第２のアプローチは、ヘリックスの各対を連結するループの実質的により多くの組み合わせの探索を可能にすることで、モデルの品質を改善した。Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆの２７のロゼッタ配列の再設計（表Ｓ３を参照）とともに、第２世代の１４の最良の設計が、実験的に特徴付けられ、１つを除くすべてが、低ナノモル濃度でＩＬ−２受容体に結合することがわかった（図１ｄ、表Ｅ１、および図１６）。３つの最も高い親和性および安定性の設計（１つの配列再設計と２つの新しい模倣体）を、ｍＩＬ−２Ｒβγ_ｃ結合について部位飽和変異誘発に供し（図１１〜１３）、続いてヒトおよびマウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃの両方に対して親和性を増加させる置換を選択し、組み合わせた。成熟した設計（表Ｓ４を参照）は、超安定性を維持しながら、増強された結合を示した（表Ｅ１を参照）。最上位の設計であるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（本明細書ではＮｅｏ−２／１５とも呼ばれる）は、ヒトまたはマウスのＩＬ−２とはまったく異なる新しいトポロジおよび配列を有する、１００残基のタンパク質である（構造トポロジ非依存ベースの整列において、ｈＩＬ−２と８９残基にわたる２９％の配列同一性、およびｍＩＬ−２と整列した７６残基にわたる１６％の配列同一性、表Ｅ１を参照）。

【0169】

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の機能的特性評価：Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、高い親和性で、ヒトおよびマウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃに結合するが（それぞれ、Ｋｄが、約３８ｎＭおよび約１９ｎＭ）、ＩＬ−２Ｒαとは相互作用しない（図２ａ）。ヒトおよびマウスＩＬ−２受容体（ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒβγ_ｃ）に対するＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の親和性は、対応する天然ＩＬ−２サイトカインの親和性よりも有意に高い。天然ＩＬ−２とは対照的に、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、ヒトとマウスのＩＬ−２応答細胞の両方で（図２ｂ、上）、およびマウスの初代Ｔ細胞（図２ｂ、下）で、ＩＬ−２Ｒα非依存性のシグナル伝達を誘発する。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、その高い結合親和性により、天然のヒトまたはマウスのＩＬ−２よりも強力に、ＩＬ−２Ｒα細胞を活性化する。初代細胞では、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、おそらくＩＬ−２Ｒα結合性が完全に欠如しているため、Ｓｕｐｅｒ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒα−細胞に対してより活性が高く、ＩＬ−２Ｒα＋細胞に対してより活性が低い。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、超安定であり（図１７を参照）、８０℃で２時間インキュベーションした後もｈＩＬ−２Ｒβγ_ｃに対する結合親和性を失わないが、ｈＩＬ−２およびＳｕｐｅｒ−２は、１０分で完全に失活する（失活の半減期は、それぞれ約４．２分および約２．６分、図２ｃ）。同様に、エクスビボ初代細胞培養では、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、９５℃で６０分間煮沸した後も、Ｔ細胞の生存を効果的に促進したが、これらの条件は、ＩＬ−２とＳｕｐｅｒ−２の両方を不活化した（図２ｃ、下）。他の多くの設計された模倣体について、熱変性研究が実施され、それらの熱安定性も同様に実証された（図１４〜１６を参照）。サイトカイン様分子の、この前例のない安定性は、コールドチェーンストレージの必要性を排除するだけでなく、天然ＩＬ−２のものをはるかに超える、変異（図１３および１８〜１９を参照）、遺伝子融合、および化学修飾に対する堅牢性を示唆し、改善された、または新しい治療特性の開発に貢献する可能性がある（図７を参照）。

【0170】

単量体Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５およびｍＩＬ−２Ｒβγ_ｃとの三元複合体の構造：Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５のＸ線結晶構造が決定され、それが、計算設計モデルと非常に近いことがわかった（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．_Ｃα＝１．１〜１．３Å、非対称単位の６つのコピー、図３ａ）。マウスＩＬ−２Ｒβγ_ｃ（図３Ｂ、表Ｅ２）との三元複合体におけるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の結晶構造が解明された。これは、デノボ設計タンパク質が、これまで未解決であった天然受容体複合体の構造決定を可能にした最初の例であり得る。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５設計モデル、およびマウス三元複合体構造との結晶構造整列、ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．_Ｃαが、それぞれ１．２７および１．２９Å（図３ｃ）。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５（ＩＬ−２番号付け）のヘリックスの順序は、Ｈ１→Ｈ３→Ｈ２’→Ｈ４である（図１ａおよび図３ａ、ｄを参照）。Ｈ１−Ｈ３ループは、三元複合体で無秩序であるが、ヘリックスＨ３は、予測された構造と密接に一致している。単量体構造と比較して、ヘリックスＨ４とＨ２’−Ｈ４ループの外向きの動きもある（図３ｃ）。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、ヘリックスＨ１およびＨ３を介してｍＩＬ−２Ｒβと相互作用し、Ｈ１およびＨ４へリックスを介してγ_ｃと相互作用する（図３ｃ）。これらの領域は、計算設計モデル（図３ａ）および単量体結晶構造の両方と密接に整列する（図３ｃ）。以前に報告されたｈＩＬ−２受容体複合体^４９の結晶構造への構造整列は、２つのタンパク質のトポロジが異なっているにもかかわらず、結合部位におけるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５とｈＩＬ−２のヘリックス骨格間の密接な一致を明らかにする（図３ｄ−ｅ）。ｈＩＬ−２−ｈＩＬ−２Ｒβγ複合体において、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５とｍＩＬ−２Ｒβγ_ｃの間にいくつかの側鎖相互作用が存在するが、他のものは、例えば、Ｌ１９Ｙは、計算設計プロセス中に生じたものである。

【0171】

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の治療用途：ＩＬ−２は、主に毒性によって臨床的使用が制限されていた^{５０−５２}。ヒトにおけるＩＬ−２の毒性の原因となる相互作用は、完全には理解されていないが、マウスモデルにおいて、毒性はＴ細胞に依存せず、ＩＬ−２Ｒα鎖（ＣＤ２５＋）を欠損した動物では緩和される。したがって、ＩＬ−２Ｒαとの相互作用を弱めるために、ＩＬ−２を再操作することに多くの努力が向けられてきたが、ＣＤ２５結合部位の変異は、非常に不安定化させる可能性がある^６。ＩＬ−２の固有の低い安定性と、ＣＤ２５に対する密接に進化した依存性は、再操作されたＩＬ−２化合物の翻訳に対して障壁となっている。他の取り組みでは、ＩＬ−１５^{５３，５４}に焦点が当てられてきたが、なぜならＩＬ−１５が、ＣＤ２５に対して親和性を有さないが、ＩＬ−２Ｒβγ_ｃを二量体化することによって、ＩＬ−２と同様のシグナル伝達を誘発するためである。しかしながら、ＩＬ−１５は、主に抗原提示細胞とナチュラルキラー細胞が呈するＩＬ−１５α（ＣＤ２１５）受容体による、トランス提示に依存している。天然ＩＬ−１５の安定性の低さと、トランス提示への依存も、再操作の取り組みに対する実質的な障壁となっている^{５３−５５}。

【0172】

ナイーブマウスの用量漸増研究では、ｍＩＬ−２は、ＣＤ２５＋細胞への優先的な結合と一致して^{４１，５６，５７}、制御性Ｔ細胞を優先的に増殖させるのに対して、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、主にＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を促進させる（図４ａ）、試験した最高用量でさえ、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導しないか、または最小限しか誘導しない。同様に、気道炎症のマウスモデルでは、通常、組織に常在するＣＤ８＋Ｔ細胞をわずかな割合で誘導するが、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、リンパ器官のＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋抗原特異的Ｔｒｅｇを増加させることなく、Ｔｈｙ１．２⁻ＣＤ４４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加をもたらす（図４ｂ）。

【0173】

デノボタンパク質設計により、天然サイトカインの構造的制限を回避できるが、抗薬物抗体を誘発する可能性がある。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５が抗薬物反応を誘発するかどうかを試験するために、担癌マウスを２週間にわたって毎日Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５で処置し、処置されたどの動物にも抗薬物抗体の証拠は観察されなかった（図４ｃ、左パネル、他のデノボ設計の治療剤候補について同様の免疫応答の欠如が観察された^４１）。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５に対するポリクローナル抗体は、完全フロイントアジュバント中の不活性Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５変異体（Ｋ．Ｏ．Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ）をマウスにワクチン接種することによって産生された。これらのポリクローナル抗Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５抗体は、ヒトまたはマウスのＩＬ−２と交差反応しなかった（図４ｃ）。天然ＩＬ−２への結合がないことは、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５に対する免疫応答があったとしても、この応答が内因性ＩＬ−２と交差反応する可能性が低いことを示唆している。さらに、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５とｈＩＬ−２の間の配列同一性が低いため（＜３０％、表Ｅ１を参照）、宿主ＩＬ−２に対する自己免疫応答は、以前に操作されたｈＩＬ−２バリアント（例えば、Ｓｕｐｅｒ−２、表Ｅ１を参照）で、はるかに可能性が高く、ほんのわずかの変異による内因性ＩＬ−２とは異なっている。

【0174】

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の治療効果は、免疫原性が低いＢ１６Ｆ１０黒色腫、および免疫原性がより高いＣＴ２６結腸癌マウスモデルで試験された。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５による単剤処置は、両方の癌モデルにおいて腫瘍増殖の用量依存的な遅延をもたらした。ＣＴ２６結腸癌では、単剤処置は組換えｍＩＬ−２で観察されたものよりも改善された有効性を示した（図４ｄおよび図５）。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫では、抗黒色腫抗体ＴＡ９９（抗ＴＲＰ１）との併用処置により、腫瘍の成長が有意に遅延したが、ＴＡ９９処置のみではほとんど効果がなかった（図４ｅおよび図６）。長期生存実験（８週間）では、ＴＡ９９と組み合わせたＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、ｍＩＬ−２と比較して、毒性が大幅に低下し、全体的に優れた治療効果を示した（図４ｅ）。ｍＩＬ−２とＴＡ９９の組み合わせで処置されたマウスは着実に体重が減少し、全体的な健康状態は安楽死を必要とするところまで減少したが、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５とＴＡ９９の組み合わせではほとんど減少は観察されなかった（図４ｅ）。治療上の利点と一致して、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５処置は、腫瘍内ＣＤ８：Ｔ_ｒｅｇ比の有意な増加をもたらし（図４ｆおよび図５を参照）、これは以前、効果的な抗腫瘍免疫応答と相関していた^５８。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５によるＣＤ８：Ｔ_ｒｅｇ比の増加は、用量と抗原に依存する（図４ｆ）。最適な治療効果は、高用量で、および他の免疫療法と組み合わせて得られた（図６を参照）。まとめると、これらのデータは、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５が、免疫増強活性のようなＩＬ−２に由来する予測される恒常性の利益を示すが、ＣＤ２５^＋の優先的結合に関連する有害な効果がないことを示している。これらの強化された特性と低毒性により、組換えＩＬ−２が広く使用されていない他の免疫療法のために、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５を日常的に使用できるようになる可能性がある。そのような使用の例として、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を増強するためのＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の潜在的な適用を調査した（図８を参照）。０．５×１０^６個のＲＡＪＩ腫瘍細胞を接種したＮＳＧマウスを、未処置のままにしたか、０．８×１０^６個の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞（腫瘍細胞接種後に７日間の注入）で処置したか、あるいは、腫瘍接種後の８〜１４日目での２０μｇ／日のヒトＩＬ−２またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５のいずれかに加えて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞で同様に処置した。予想通り、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、このモデルで、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果を有意に増強し、腫瘍の増殖を遅らせ、マウスの生存を延長した（データは示さず）。

【0175】

タンパク質模倣体のデノボ設計は、タンパク質ベースの治療法の分野を変革する可能性を有し、サイトカインだけでなく、既知または正確に予測可能な構造を持つ事実上あらゆる生物学的に活性な分子に対して、治療特性が強化され、副作用が低減された、バイオスーペリア分子の開発を可能にする。現在の従来の操作アプローチの漸進的な性質のために（例えば、１〜３アミノ酸置換、単一部位での化学修飾）、親分子の欠点のほとんどは、必然的に、しばしば悪化した形で、得られる操作されたバリアントに受け継がれる。模倣体をデノボ構築することによって、これらの欠点を完全に回避することができる。組換えＩＬ−２およびｈＩＬ−２の操作されたバリアントとは異なり、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は大腸菌で可溶的に発現でき（図１７を参照）、高温で活性を保持し、ＩＬ−２Ｒαと相互作用せず、新しい機能の操作を可能にする実質的な配列変化に対して頑強である（図７）。デノボ設計タンパク質は、サイズが小さく、安定性が高いため、免疫原性は低いようであり、ｈＩＬ−２の漸増的バリアントとは対照的に、模倣体に対するいずれの抗体反応も、天然の親サイトカインと交差反応する可能性が低い。それらの高い安定性と頑強性、およびそれらの仕立てられた相互作用表面のために、設計された模倣体は、異なるタンパク質の機能性を組み合わせた次世代治療法、例えば、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の標的バージョン、において特に強力である可能性が高い。

【0176】

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の頑強なモジュール性。ジスルフィドステープリングとＩＬ−４模倣体への再操作：Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、高度にモジュール性であるため、その安定性を増加させる、または結合優先度を変更するなど、その性質を容易に調整することができる。このモジュール性と頑強性は、計算設計で、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５^５９の機能を保持する安定性強化の単一ジスルフィドステープルを導入することによる利点が活用された。このために、２つの直交的戦略を使用した。最初に、好ましい幾何学的配置を有する位置の対を検索し、続いて柔軟な骨格を最小化することによって、ジスルフィド架橋を導入した。最終的な設計では、残基３８と７５の間に単一ジスルフィドが導入され、ヘリックスＨ３およびＨ２が安定化された。第２のアプローチでは、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５のＮ末端とＣ末端をリモデリングして、タンパク質全体を包含する単一ジスルフィドステープルを導入できるようにした（末端ＰおよびＳ残基の除去後、Ｎ末端およびＣ末端について、それぞれ、配列ＣＮＳＮ（配列番号２６０）およびＮＦＱＣ（配列番号２６１）を付加した、図１８を参照）。両方のジスルフィドステープリング戦略は、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の配列と機能にほとんど影響を与えないまま、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の安定性を高めた（融解温度Ｔｍ＞９５℃）（図１８を参照）。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５のモジュール性の特性を使用して、その結合優先度を改変した。インターロイキン２ファミリーのすべてのサイトカインは、γ_ｃと相互作用し、共通のアーキテクチャを共有する。したがって、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、ＩＬ−２Ｒβ（ヘリックスＨ１およびＨ３）と相互作用する結合部位の半分のアミノ酸のみを変更することによって、ＩＬ−２ファミリーの別のサイトカイン模倣体に変換できるものと仮定された。概念の証拠として、ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）を、標的として選択した。なぜなら、それがＩＬ−２と広範な構造的相同性を共有し、再生医療で潜在的な用途があるためである^{６０，６１}。Ｎｅｏ−２／１５モデルを、ヒトＩＬ−４がそのＩＬ−４受容体に結合した構造に整列すること、およびＮｅｏ−２／１５の１４残基を変異させ、ＩＬ−４とＩＬ−４ｒの間の相互作用を媒介するそれらの構造的位置でＩＬ−４のアミノ酸と一致させることによって、Ｎｅｏ−２／１５が、ヒトＩＬ−４受容体に結合するが（ＩＬ−４Ｒαおよびγ_ｃを含む）、ヒトＩＬ−２受容体には結合しない（ＩＬ−２Ｒβおよびγ_ｃを含む）ように改変した（図７）。結合を、ランダム変異誘発を使用した定向進化および高結合親和性バリアントのスクリーニングによって、さらに最適化した。２つの追加のアミノ酸置換を導入し、ＩＬ−４タンパク質から移植した１４個の元の残基のうちの１つを改変することによって、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５から、合計１６個の変異を有する新しいタンパク質Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−４を生成した。得られた最適化された設計であるＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−４（表Ｓ５を参照）を、大腸菌から組換え発現および精製し、結合について試験した。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−４は、ＩＬ−４Ｒα受容体に高い親和性で結合し、ＩＬ−４Ｒαγ_ｃに協同して結合し（図７参照）、ＩＬ−２受容体には結合せず、なんら親和性を有さない（データは示さず）。Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−４は、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の優れた熱安定性を保持し（図２０ｂ、ｃを参照）、ＩＬ−４のＩＬ−１３受容体に対する天然の交差反応性を考慮すると、予想通り、ＩＬ−１３受容体に結合する（データは示さず）。全体として、これは、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５がモジュール的な足場として機能するのに十分頑強であり、その機能または物理的特性を非常に予測可能な方法で改変するために、かなりの合理的な配列変更が、導入され得ることを示している。

【0177】

方法
デノボサイトカイン模倣体の設計計算：デノボサイトカイン模倣体の設計は、設計のためのテンプレートとしてのＩＬ−２Ｒβγ_ｃ受容体との四次複合体中のｈＩＬ−２の構造を定義することによって開始した。検査後、結合部位を構成する残基は、Ｒｏｓｅｔｔａ（ロゼッタ）のメタデータ（ＰＤＢＩｎｆｏＬａｂｅｌｓ）を使用してホットスポットとして定義された。構造は、ＰｙＲｏｓｅｔｔａでプログラムされた新しい模倣設計プロトコルに送り込まれ、標的テンプレートを構成するコア−二次構造要素を自動的に検出し、設計用の完全なＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ互換情報を含む、結果として得られるデノボ模倣骨格を産生することができる。簡単には、模倣構築アルゴリズムは、次のように機能する。第１世代の設計では、非常に理想的な断片（断片サイズが４アミノ酸）のクラスタ化されたデータベースからのループを使用して再構築することにより、各コア要素が理想化された。理想化後、模倣構築プロトコルは、理想化された要素を、すべての可能な組み合わせの対により、再連結することを目的としている。これを行うには、データベースからの配列非依存的断片のコンビナトリアル断片アセンブリを使用し、続いて潜在的なソリューションのデカルト制約骨格最小化を使用する（すなわち、構築された断片のＮ端とＣ端が２つの二次構造を連結するのに十分近い場合）。最小化後、ソリューションに、非常に理想的な断片が含まれること（すなわち、２つの連結された要素を構成するあらゆる重複する断片もデータベース内に含まれる）、および骨格が標的（コンテキスト）受容体と衝突しないことを検証する。次に、通過する骨格ソリューションを、断片の同じデータベースを使用して特性を明らかにし、各位置で最も可能性の高いアミノ酸を決定した（この情報は設計のメタデータにコード化された）。次に、連結された二次構造の対のソリューションを組み合わせて再結合し、グラフ理論の連結された構成要素を使用することによって、完全に連結された骨格を産生した。ソリューションの数は要素の対ごとに指数関数的に増加するため、断片の組み合わせの各ステップで、コア要素の対間の相互連結が短いものを優先するように設計をランク付けし、次のステップに進むために最上位のソリューションのみを保持した。次に、完全に連結されたソリューションを、層（界面、コア、非コア表面、表面）ごとに特性を明らかにして、可能なアミノ酸の同一性を、層と互換性のあるものに制限した。最後に、ホットスポット、互換性のある構築断片のアミノ酸および層に関するすべての情報が組み合わされた（ホットスポットはアミノ酸の確率よりも優先され、アミノ酸の確率はレイヤーよりも優先される）。次に、これらの完全に特性が明らかにされた骨格は、柔軟な骨格の設計とフィルタリングのためにＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓに渡された（付録Ａのｒｏｓｅｔｔａ−ｓｃｒｉｐｔを参照）。第２世代の設計については、２つのアプローチを採用した。最初のアプローチでは、最良の第１世代の最適化設計の配列再設計が実行された（Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ、付録Ｂを参照）。第２のアプローチでは、Ｇ１＿ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆを標的テンプレートとして使用して、新しい模倣体が操作された。この第２世代の模倣設計プロトコルは、第１世代で説明されたものと似ているが、２つの重要な違いがある。まず、コア断片は、もはや断片から構築されなくなったが、代わりに、標的ヘリックスの各々をできる限り近くに再現させた繰り返しの二次構造をもたらす繰り返しのφ角およびψ角（ωは１８０°に固定）のパラメトリック方程式を見出すことによって、ヘリックスに曲率を有する可能性を与えるために（最終パラメータ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、あらゆるＸ−アミノ酸についてφ角およびψ角での「ピッチ」を可能にし、これらのパラメトリック方程式を使用することで、ループ構築プロセスと組み合わせて（最大／最小８アミノ酸）、標的構造中のコア要素の各々のサイズを随意に変更することが可能になり（サイズを拡大または縮小する）、コア要素のサイズが減少しても、ホットスポットが結合部位から除去されないようにした。第２世代の設計における２つ目の違いは、二次構造のコア要素を再連結する代わりに、７アミノ酸の断片サイズが使用され、２つ以上の断片のコンビナトリアルアセンブリは許容されなかったことである（すなわち、単一の断片で、二次構造の対を閉じることができるはずである）。残りの設計アルゴリズムは、本質的に、第１世代で採用されたものと同様であった（付録Ｃを参照）。使用されたロゼッタエネルギー関数は、第１世代と第２世代の設計で、それぞれ「ｔａｌａｒｉｓ２０１３」と「ｔａｌａｒｉｓ２０１４」であった。

【0178】

デノボ模倣体の骨格の設計に使用される非常に理想的な断片のデータベースは、ＲＣＳＢタンパク質データバンクからの非冗長な一般に利用可能なタンパク質構造の広範なデータベースを使用して（第１世代の設計に使用した４−ｍｅｒデータベース用の１６７６７個のＰＤＢ、および第２世代の設計に使用した７−ｍｅｒデータベース用の７０６２個のＰＤＢからなる）、新しいロゼッタアプリケーションである「ｋｃｅｎｔｅｒｓ＿ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ＿ｏｆ＿ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」を用いて構築された。

【0179】

酵母ディスプレイ：酵母を、線状化ｐＥＴｃｏｎ３ベクターと一緒に、ディスプレイ用のタンパク質をコードする遺伝子で形質転換した。ベクターを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による１００倍の過剰消化によって線状化し、次いで、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。遺伝子は、５’および３’末端の両方に、ベクターとの５０塩基の重複を含み、相同組換えによって、遺伝子が、ベクター上のＡＧＡ２遺伝子とｍｙｃタグとの間に、インフレームで配置されるようにした。前述のように、酵母を、Ｃ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ培地で増殖させた後、ＳＧＣＡＡ培地で誘導した。誘導の１２〜１８時間後、細胞を冷したディスプレイ緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ_４ ｐＨ８、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、４℃で撹拌しながら、さまざまな濃度のビオチン化受容体（いずれかヒトもしくはマウスＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、またはヒトＩＬ−４Ｒα）とともにインキュベートした。約３０分後、細胞を、冷やした緩衝液中で再度洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（３×１０^６細胞あたり１ｕＬ）およびストレプトアビジン−フィコエリトリン（酵母の１００μＬの体積当たり１μＬの）とともに、氷上で５分間インキュベートした。次に、酵母を洗浄し、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）でカウントするか、またはＦＡＣＳ（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００）で選別した。最初の受容体インキュベーションが、ビオチン化ＩＬ−２Ｒγと非ビオチン化ＩＬ−４Ｒαとの組み合わせで行った実験では、非ビオチン化受容体が、モル過剰で提供された。

【0180】

変異誘発および親和性成熟：エラープローンＰＣＲベースの変異誘発の場合、変異させる設計をｐＥＴｃｏｎ３ベクターにクローニングし、ＭｕｔａＧｅｎｅ ＩＩ変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指示に従って使用して増幅し、ヌクレオチドあたり約１％の変異頻度を得た。１μｇのこの変異遺伝子を、１μｇの線状化されたｐＥＴｃｏｎ３ベクターとともに、１０^８程度の形質転換効率で、ＥＢＹ１００酵母にエレクトロポレーションした。その酵母を、集団が収束するまで、受容体の濃度を徐々に減少させながら、連続して複数回誘導および選別した。各選別間で、酵母を、Ｃ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ培地で再増殖させた。

【0181】

部位飽和変異誘発（ＳＳＭ）ライブラリは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔの合成ＤＮＡから構築された。各設計テンプレートの各アミノ酸について、フォワードプライマーとリバースプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅で、縮重ＮＮＫコドンを含む５’ＰＣＲ産物、および３’ＰＣＲ産物、が得られるようにした。ＣＯＦおよびＣＯＲプライマーによる「左」および「右」産物の増幅から、一連のテンプレート産物が得られ、それぞれ、異なる残基位置での縮重ＮＮＫコドンからなっていた。各設計について、これらの産物をプールして、ＳＳＭライブラリを得た。ＳＳＭライブラリは、Ｂｅｎａｔｕｉｌらによって以前に記載されたプロトコルを使用して、線状化ｐＥＴＣＯＮ３ベクターとともに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株であるＥＢＹ１００細胞にエレクトロポレーションすることによって、形質転換された。

【0182】

コンビナトリアルライブラリは、あいまいなヌクレオチドを含むＧｅｎｓｃｒｉｐｔからの合成ＤＮＡから構築され、同様に、線状化ｐＥＴＣＯＮ３ベクターに形質転換された。

【0183】

タンパク質発現：設計されたタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド発現ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｎ末端６ｘＨｉｓタグおよびトロンビン切断部位）にクローニングした。次いで、プラスミドを化学的にコンピテントな大腸菌Ｌｅｍｏ２１細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ＢｒｏｔｈおよびＭ塩を使用してタンパク質発現を行い、ＯＤ^６００が約０．８に達するまで、培養物を３７℃で増殖させた後、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で発現を誘導し、温度を１８℃に下げた。約１８時間の発現後、細胞を回収し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０Ｐマイクロフルイダイザを用いて、１８，０００ｐｓｉで溶解し、２４，０００ｇで２０分間遠心分離して、可溶性画分を澄ませた。可溶性画分は、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ（Ｑｉａｇｅｎ）、続いてＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。精製されたＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５は、溶液中の分子量種の質量分析（ＭＳ）検証（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、単量体状態および分子量を検証するためのサイズ排除−多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗｙａｔｔ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにエンドトキシンレベル（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）によって特徴づけられた。

【0184】

ｈＩＬ−２（１〜１３３アミノ酸）、ｈＩＬ−２Ｒα（１〜２１７アミノ酸）、ｈＩＬ−２Ｒβ（１〜２１４アミノ酸）、ｈＩＬ−２Ｒγ（１〜２３２アミノ酸）、ｍＩＬ−２（１〜１４９アミノ酸）、ｍＩＬ−２Ｒα外部ドメイン（１〜２１３アミノ酸）、ｍＩＬ−２Ｒβ外部ドメイン（１〜２１５アミノ酸）、およびｍγ_ｃ外部ドメイン（１〜２３３アミノ酸）を含むヒトおよびマウスＩＬ−２複合体成分は、以前に記載されているように^{１７，４９}、バキュロウイルス発現システムを使用して、分泌および精製された。すべてのタンパク質は、ＨＢＳで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイジングカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して＞９８％の均一性まで精製された。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。ビオチン化ヒトＩＬ−２およびマウスＩＬ−２受容体サブユニットの発現については、Ｃ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）−ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号２６２）を含むタンパク質を発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを介して記載されたように精製し、次いで、０．５ｍＭのＢｉｃｉｎｅ ｐＨ８．３、１００ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭの酢酸マグネシウム、および５００ｍＭのビオチン（Ｓｉｇｍａ）中で、可溶性ＢｉｒＡリガーゼ酵素を用いてビオチン化した。過剰なビオチンは、ＨＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。

【0185】

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２結晶および共結晶構造：Ｃ末端６ｘＨｉｓタグ付きエンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏＨ）とマウスＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγを、前述のように、バキュロウイルスシステムを使用してＨｉ−ｆｉｖｅ細胞で別々に発現させた。ＩＬ−２Ｒγは、５μＭキフネンシンの存在下で増殖させた。約７２時間後、分泌されたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムに通すことによって培地から精製し、ＨＢＳ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３）中の２００ｍＭのイミダゾールで溶出した。ＥｎｄｏＨは、透析濾過によりＨＢＳ緩衝液に交換した。ｍＩＬ−２Ｒγを、１：７５（ｗ／ｗ）のｅｎｄｏＨとともに一晩インキュベーションすることによって、脱グリコシル化した。ｍＩＬ−２ＲβおよびｍＩＬ−２Ｒγを、さらに精製し、Ｓ２００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＦＰＬＣで緩衝液交換した。

【0186】

単量体のＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５を、１２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、２．４Ｍのマロン酸ナトリウムｐＨ７．０からの蒸気拡散によって結晶化し、結晶を回収し、さらなる凍結保護せずに急速冷凍した。結晶は、スタンフォードシンクロトロン放射光研究所のビームライン１２−２で、２．０Åの分解能で回折し、ＸＤＳを使用して、指数付けて積分した（Ｋａｂｓｃｈ，２０１０）。空間群は、Ｐｏｉｎｔｌｅｓｓ（Ｅｖａｎｓ，２００６）で割り当てられ、スケーリングは、ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ（Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）のＡｉｍｌｅｓｓ（Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，２０１３）で実行した。本発明者らの予測モデルを検索アンサンブルとして使用して、非対称ユニットに配置された６つのプロトマーを用いて、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．，２００７）の分子置換によって構造を解析した。Ａｕｔｏｂｕｉｌｄ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）で最初に再構築した後、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０）とＰｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）を使用して、手動の再構築と精密化の反復サイクルを実行した。

【0187】

三元Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ：ｍＩＬ−２Ｒβ：ｍＩＬ−２Ｒγ複合体を結晶化するために、３種類のタンパク質を等モル比で組み合わせ、１：１００（ｗ／ｗ）のカルボキシペプチダーゼＡおよびＢで一晩消化して精製タグを除去し、Ｓ２００カラムを使用してＦＰＬＣで精製した。３種類のタンパク質すべてを含む画分をプールし、２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最初の針状微結晶は、０．１ＭイミダゾールｐＨ８．０、１Ｍクエン酸ナトリウムからの蒸気拡散によって形成され、マイクロシードマトリックススクリーニングで後に使用するための、マイクロシードストックの調製に使用した（ＭＭＳ、（Ｄ’Ａｒｃｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４））。ＭＭＳを１回繰り返した後、同じ沈殿剤で成長させた結晶を、３０％エチレングリコールで凍結保護し、収穫して、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅのビームライン２３ＩＤ−Ｂで、３．４Åｘ３．８Åｘ４．１Åの分解能で異方的に回折した。この構造は、検索アンサンブルとしてヒトＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγ構造（ｐｄｂ ＩＤ ２Ｂ５Ｉ）を使用したＰｈａｓｅｒでの分子置換によって解析された。これによって、２つのポリアラニンアルファヘリックスを手動で構築できる電子密度マップが得られた。Ｐｈｅｎｉｘでの剛体精密化（ｒｉｇｉｄ ｂｏｄｙ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）に続いて、２つのモデル化されていないαヘリックスの電子密度が、ＢＣループといくつかの芳香族側鎖とともに可視化され、単量体Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎのドッキングが可能になった。ＭＭＳをさらに２回繰り返し、添加剤スクリーン（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用すると、１５０ｎｌのタンパク質、０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５を含む１２５ｎｌのウェル溶液、５％デキストラン硫酸、２．１Ｍ硫酸アンモニウム、および１．３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０、３００ｍＭクエン酸ナトリウムを含む２５ｎｌのマイクロシードストックを使用して、蒸気拡散によって成長した結晶が産生された。３Ｍマロン酸ナトリウムで凍結保護された結晶を瞬間冷凍し、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅのビームライン５．０．１で、異方的に２．５Åｘ３．７Åｘ３．８Åに回折した。ＸＤＳでデータを処理した後、ＳＴＡＲＡＮＩＳＯサーバー（Ｂｒｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を使用して、楕円分解能限界が適用された。モデルの迅速な収束は、ＴＬＳを使用したこれらの反射に対する精密化と、Ｂｕｓｔｅｒ（Ｓｍａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｂｒｉｃｏｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）での高分解能ヒト受容体（ＰＤＢ ｉｄ ２Ｂ５Ｉ）およびＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５構造への標的拘束によって得られ、Ｃｏｏｔでの手動再構築、続いてＰｈｅｎｉｘでの標的拘束なしの最終ラウンドの精密化を用いた。構造図は、ＰｙＭｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．２０１０．Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．０）で作成された。このプロジェクトで使用されたソフトウェアは、ＳＢＧｒｉｄによってインストールされ、構成された（Ｍｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0188】

細胞株：非修飾ＹＴ−１^６４およびＩＬ−２Ｒα^＋ＹＴ−１ヒトナチュラルキラー細胞^６５は、ＲＰＭＩ完全培地で培養した（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、最小非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびペニシリン−ストレプトマイシン［Ｇｉｂｃｏ］を補充したＲＰＭＩ１６４０培地）。ＡＴＣＣから購入したＣＴＬＬ−２細胞は、ＣｏｎＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含む１０％Ｔ−ＳＴＩＭ培養の補充で補完されたＲＰＭＩで培養した。全ての細胞は、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中、３７℃で維持した。ＩＬ−２Ｒαを発現するＹＴ−１細胞の亜集団は、以前に記載されているように、磁気選択を介して精製した^１７。ＩＬ−２Ｒα発現の濃縮と持続性は、ＰＥ結合抗ヒトＩＬ−２Ｒα（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体の結合をＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析することによってモニターした。

【0189】

円二色性（ＣＤ）：遠紫外ＣＤ測定は、ＡＶＩＶ分光計モデル４２０を用いて、１ｍｍ光路長のキュベット内のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、約０．２０ｍｇ／ｍｌ（本文で特に明記しない限り）のタンパク質濃度で行った。温度を２５から９５℃へと融解し、２２２ｎｍでの吸収シグナルをモニターした（２℃／分のステップ、ステップごとに３０秒の平衡化）。波長スキャン（１９５〜２６０ｎｍ）を、２５℃と９５℃で収集し、急速リフォールディング後（〜５分）、２５℃で再び収集した。

【0190】

結合研究：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：ＩＬ−２受容体親和性滴定研究では、ビオチン化ヒトまたはマウスＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγ受容体を、ストレプトアビジンでコーティングされたチップに固定化して、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析した。非特異的結合を差し引くために、無関係なビオチン化タンパク質を、参照チャネルに固定化した。物質移動効果を最小限に抑えるために、１００応答ユニット（ＲＵ）未満の各リガンドを固定化した。ｈＩＬ−２、ｍＩＬ−２、Ｓｕｐｅｒ−２、または操作ＩＬ−２模倣体の３倍段階希釈液を、固定化リガンド上に６０秒間流し、解離を２４０秒間測定した。ＩＬ−２Ｒβγ_ｃ結合研究については、飽和濃度のｈＩＬ−２Ｒβ（３ｕＭ）またはｍＩＬ−２Ｒβ（５ｕＭ）を、それぞれ、示された濃度のｈＩＬ−２またはｍＩＬ−２に加えた。表面の再生は、すべての相互作用について、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５中の１ＭのＭｇＣｌ２への１５秒間の曝露を使用して行った。ＳＰＲ実験は、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃で実施し、すべての結合研究は、分析物の再結合を防ぐために、５０Ｌ／ｍｉｎの流速で実施した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン２．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、視覚化および処理した。平衡滴定曲線のフィッティングと平衡結合解離（ＫＤ）値の決定は、すべての結合相互作用が一次であると仮定して、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用して実行された。バイオレイヤー干渉測定（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）：結合データはＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）で収集され、１：１結合モデルを使用して、機器の統合ソフトウェアを使用して処理された。ビオチン化標的受容体、ヒトまたはマウスのＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、もしくはヒトＩＬ−４Ｒαのいずれかを、結合緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、０．５％脱脂粉乳）中、１μｇ／ｍｌで、３００秒間、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサ（ＳＡ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に機能化した。分析物タンパク質を、濃縮ストックから結合緩衝液へと希釈した。結合緩衝液のみでベースラインを測定した後、バイオセンサを１００ｎＭの設計タンパク質を含むウェルに浸し（結合）、次いで、そのセンサを、ベースラインウェルに再度浸して（解離）、結合速度をモニターした。結合実験では、ＩＬ−２Ｒγがセンサに結合している間に、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−４Ｒαのいずれかを溶液に補充し、補充タンパク質は、２．５倍モル過剰で提供された。

【0191】

ＳＴＡＴ５リン酸化研究：インビトロ研究：約２ｘ１０^５個のＹＴ−１、ＩＬ−２Ｒα^＋ＹＴ−１、またはＣＴＬＬ−２細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、ｈＩＬ−２、ｍＩＬ−２、Ｓｕｐｅｒ−２、または操作ＩＬ−２模倣体の段階希釈を含むＲＰＭＩ完全培地に再懸濁した。細胞を、３７℃で１５分間刺激し、ホルムアルデヒドを１．５％まで添加することによって直ちに固定し、室温で１０分間インキュベートた。細胞の透過処理は、氷冷した１００％メタノールに４℃で３０分間再懸濁することで達成された。固定および透過処理した細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］ｐＨ７．２）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７結合抗ＳＴＡＴ５ｐＹ６９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２時間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）でＭＦＩを測定した。用量反応曲線をロジスティックモデルに適合させ、未刺激細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引き、最大シグナル強度に正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアを使用して半最大有効濃度（ＥＣ_５０値）を計算した。実験を３重で行い、３回実施したところ、同様の結果が得られた。エクスビボ研究：脾臓およびリンパ節は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＢ６；１２９Ｓ４−Ｉｌ２ｒａ^{ｔｍ１Ｄｗ}（ＣＤ２５ＫＯ）マウスから採取し、ソート緩衝液（ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水中２％ウシ胎児血清）中の、単一の細胞懸濁液に調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞懸濁液を、ビオチン結合抗Ｂ２２０、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｔｅｒ１１９、およびＣＤ１９抗体（１：１００）で、氷上で３０分間染色することによって、負の選択を通して濃縮した。ソート緩衝液で洗浄後、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を、１０^７個の全細胞あたり２０μＬ、細胞懸濁液に添加し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、再懸濁し、ＥａｓｙＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、負の選択を行った。約１ｘ１０^５個の濃縮細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルへ、ｍＩＬ−２、Ｓｕｐｅｒ−２、またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の１０倍段階希釈を含む５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ完全培地中に添加した。細胞を、５％ＣＯ_２中、３７℃で２０分間刺激し、４％ＰＦＡで固定し、４℃で３０分間インキュベートした。固定後、細胞を回収し、ソート緩衝液で２回洗浄し、透過処理のために、ｄＨ_２Ｏ中の９０％氷冷メタノール５００μＬで、３０分間氷上で再度固定した。細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中の抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（１：３００）、抗ＣＤ４４−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（１：２００）、抗ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７（１：２００）、および試料あたり５μＬの抗ｐＳＴＡＴ５−ＰＥ ｐＹ６９４で、暗中室温で４５分間染色した。細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈで洗浄し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析するためにソート緩衝液に再懸濁した。

【0192】

インビボマウス気道炎症実験：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスに、ＰＢＳに再懸濁した２０μＬの全ハウスダストダニ抗原（Ｇｒｅｅｒ）を、マウス１匹あたりＤｅｒｐ１が計２３μｇになるように、鼻腔内接種した。１〜７日目から、マウスに、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０μｇのｍＩＬ−２、滅菌ＰＢＳ中のモル当量のＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５、または注射なしで、腹腔内注射を毎日行った。８日目に、以前に記載されているように（Ｈｏｎｄｏｗｉｃｚ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１６）、循環Ｔ細胞を、血管内標識し、リンパ節および脾臓または肺から、四量体陽性細胞を濃縮した。フローサイトメトリー分析のために、カラムの素通り画分と結合画分の両方を保存した。細胞を抗体で表面染色し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。動物モデル：Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入するか、社内で飼育した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した。動物は、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＤＦＣＩ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、Ｄｉｒｅｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ、およびｉＭＭ Ｌｉｓｂｏａ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルに従って維持した。

【0193】

結腸直腸癌のインビボマウス実験：ＣＴ２６細胞は、ポルトガルのＩＧＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｇｕｌｂｅｎｋｉａｎ ｄｅ Ｃｉｅｎｃｉａ）にあるＪｏｃｅｌｙｎｅ Ｄｅｍｅｎｇｅｏｔの研究グループから供給された。０日目に、５ｘ１０＾５細胞を、５０μＬのダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）とＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１：１混合液とともに、ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した６日目から、５０μＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中のＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５およびｍＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって投与した。抗ＰＤ−１抗体（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）による処置は、マウスあたり２００μｇ（ＰＢＳ中）を、週に２回、腹腔内注射することによって実施した。腫瘍体積が１，３００ｍｍ３に達したとき、マウスを犠牲にした。

【0194】

黒色腫のインビボ実験：Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ＡＴＣＣから購入した。０日目に、５００μＬのハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ）中の５×１０^５細胞を、皮下注射することによって接種した。１日目から、２００μＬのＬＰＳフリーＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ）中のＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５およびｍＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって投与した。示されているように、数日後に、１５０μｇ／マウスのＴＡ９９（マサチューセッツ工科大学のＮｏｏｒ ＭｏｍｉｎおよびＤａｎｅ Ｗｉｔｔｒｕｐ両氏からの寄贈）による処置を追加した。腫瘍体積が２，０００ｍｍ３に達したとき、マウスを犠牲にした。

【0195】

フローサイトメトリー：切除した腫瘍を細かく切り刻み、酵素で消化し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、４０μｍフィルターを通した。脾臓および腫瘍流入領域リンパ節からの細胞を、１ｍＬシリンジプランジャーの背面を使用して、４０μｍセルストレーナを通してＰＢＳに分散させた。すべての細胞懸濁液を、ＰＢＳで１回洗浄し、細胞ペレットを、フルオロフォア結合抗体を含有する２％不活化ウシ胎児血清に再懸濁した。細胞を、４℃で１５分間インキュベートした後、固定し、透過処理し、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＦｏｘＰ３染色キットを使用して染色した。試料は、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析した。黒色腫実験で使用された抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は、ＣＤ４５−ＢＶ７１１（クローン３０−Ｆ１１）、ＣＤ８−ＢＶ６５０（５３−６．７）、ＣＤ４−ＢＶ４２１（ＧＫ１．５）、ＴＣＲβ−ＢＶ５１０（Ｈ５７−５９７）、ＣＤ２５−ＡＦ４８８（ＰＣ６１）、ＦｏｘＰ３−ＰＥ（ＭＦ−１４）であった。結腸癌実験で使用された抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、ＣＤ４５−ＢＶ５１０（３０−Ｆ１１）、ＣＤ３−ＢＶ７１１（１７Ａ２）、ＣＤ４９ｂ−ＦＩＴＣ（ＤＸ５）、ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＧＫ１．５）、ＣＤ８−ＰＥＣｙ７（５３−６．７）、Ｆｏｘｐ３−ＡＰＣ（ＦＪＫ−１６ｓ）であった。Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、死細胞を除外した。

【0196】

抗Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５ポリクローナル抗体の生成：マウスに、ＰＢＳと完全フロイントアジュバントの１：１エマルジョン２００μＬ中の５００μｇのＫ．Ｏ．Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎを、腹腔内注射した。７日目および１５日目に、マウスに、ＰＢＳと不完全フロイントアジュバントの１：１エマルジョン２００μＬ中の５００μｇのＫＯＮｅｏｌｅｕｋｉｎを、追加免疫した。２０日目に、血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５の認識を確認した。

【0197】

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、炭酸緩衝液中の１００ｎｇ／ｍＬのＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５、ｍＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。標的タンパク質への抗体結合は、７５ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して検出した。プレートは、テトラメチルベンジジンおよびＨＣｌで現像した。ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチモードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0198】

Ｔ細胞増殖アッセイ：ＥａｓｙＳｅｐ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスの脾臓から細胞を単離した。それらを、９６ウェル培養プレートのＲＰＭＩ中に、１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。培地には、通常または熱処理されたＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５、ｒｍＩＬ−２、またはＳｕｐｅｒ−２が補充された。３７℃で５日間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞の生存と増殖を測定した。

【0199】

統計分析および検定力分析：インビボでのマウス気道炎症実験：ＭＩＫＥＬインビボでのマウス結腸癌実験：ＣＡＲＬＯＳインビボでのマウス黒色腫実験：担癌マウスの生存率の比較は、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して行った。担癌マウスの体重減少の比較は、両側ｔ検定を使用して行った。０．０５未満のＰ値を、有意であると見なした。最小群サイズは、予想される大きな効果量（Ｃｏｈｅｎのｄ＝１．７５）について、Ｇ＊Ｐｏｗｅｒを使用して決定した。

【0200】

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５とのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合のバイオレイヤー干渉測定分析。半減期の延長のためにＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５をＭＳＡに遺伝子融合しても、サイトカイン模倣体は、マウスＩＬ−２ＲＢｅｔａおよびＩＬ−２ＲＧａｍｍａに対する元々の結合親和性（３３．５±０．２ｎＭ）を維持する（データ未掲載）。この研究で利用した構築物は以下の通りであった：
任意選択的：（括弧内のＨｉｓＴａｇ ＴＥＶ切断部位）
マウス血清アルブミン（イタリック体）
リンカー
Ｎｅｏ２／１５（太字）

【化89】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号２４４）

【0201】

ビオチン−ｍＩＬ２γをストレプトアビジンバイオセンサに固定化し、ＭＳＡ−Ｎｅｏ２の濃度を、飽和濃度のｍＩＬ２Ｂｅｔａの存在下で、７２９から１ｎＭに滴定した。バイオレイヤー干渉測定は、上記のように実行された。結合データは、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）で収集され、１：１の結合モデルを使用して、機器の統合ソフトウェアを使用して処理された。ビオチン化標的受容体、ヒトまたはマウスのＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、もしくはヒトＩＬ−４Ｒαのいずれかを、結合緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、０．５％脱脂粉乳）中、１μｇ／ｍｌで、３００秒間、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサ（ＳＡ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に機能化した。分析物タンパク質を、濃縮ストックから結合緩衝液へと希釈した。結合緩衝液のみでベースラインを測定した後、バイオセンサを１００ｎＭの設計タンパク質を含むウェルに浸し（結合）、次いで、そのセンサを、ベースラインウェルに再度浸して（解離）、結合速度をモニターした。

【0202】

ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ実験：インビトロＴ細胞増殖アッセイ。初代ヒトＴ細胞は、健康なドナーから入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）上で遠心分離によって分離した。Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＣＤ８またはＣＤ４ネガティブ単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。Ｔ細胞を刺激するために、Ｔ細胞を解凍し、５０ＩＵ／ｍｌ（３．１ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ２を補充した培地中で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）と、１：１の比率でインキュベートした。４日間のインキュベーション後、ビーズを除去した。刺激した、または新たに解凍して刺激していないＴ細胞を、９６ウェルフォーマットで、それぞれ３００００または５００００細胞／ウェルでプレーティングし、示された濃度のＩＬ２またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５で、３重で培養した。３日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ２．０を使用して、増殖を測定した（プロメガ）。

【0203】

インビボＲＡＪＩ実験：６〜８週齢のＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ｆｆｌｕｃ／ｅＧＦＰで形質導入された０．５＊１０＾６個のＲＡＪＩ腫瘍細胞は、ＮＳＧマウスに尾静脈注射された。腫瘍注射の７日後、（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１６）に記載されているように調製したレンチウイルス形質導入抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（０．４＊１０＾６個のＣＤ４、０．４＊１０＾６個のＣＤ８）を、マウスに静脈内注入した。２０μｇ／マウスのｈＩＬ２またはＮｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５を、腫瘍注射後８〜１６日目に腹腔内投与した。

【0204】

ＰＥＧ化ポリペプチドの調製：単一または二重のシステイン変異を有するＮｅｏ−２／１５ストックをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、１．０〜２．０ｍｇ／ｍｌに調整した。ＴＣＥＰを、タンパク質に対して１０：１のモル比で添加し、ＲＴで１０分間インキュベートして、ジスルフィドを還元した。マレイミド修飾ＰＥＧ４０ｋ（ＰＥＧ４０ｋ−ＭＡ）またはＰＥＧ３０ｋ（ＰＥＧ３０ｋ−ＭＡ）粉末を、還元タンパク質溶液に、１０：１のＰＥＧ：システインのモル比で直接添加し、撹拌しながら２時間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に一定分量を、反応混合物から直接採取した。これらのデータは、予想される化学量論において、ＰＥＧ４０ｋ−ＭＡまたはＰＥＧ３０ｋ−ＭＡとＮｅｏ−２／１５システイン変異体との間の共有結合の迅速で、自発的で、かつほぼ定量的な形成を実証している。

【0205】

Ｎｅｏ−２／１５およびＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５−Ｅ６２Ｃ（Ｎｅｏ−２／１５−ＰＥＧ）による処置は、複数の炎症マーカーのレベルの変化を実証した：２個体の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、１群あたり１人の男性および１人の女性は、いずれか、ビヒクル（群１）、Ｎｅｏ−２／１５（ＰＥＧなし）（群２〜４）またはＮｅｏ−２／１５ ＰＥＧ（群５〜７、Ｅ６２Ｃの単一システイン変異およびＰＥＧ４０Ｋ）による治療に割り当てられた。ビヒクルまたはＮｅｏ−２／１５（ＰＥＧなし）で処置された動物は、研究１、２、３、４、５、６および７日目（１日１回を１週間）に、いずれか、０（ビヒクル）、または０．０７、０．２１もしくは０．１４ｍｇ／ｋｇ／日のＮｅｏ２／１５（ＰＥＧなし）（それぞれ、群２、３および４）の用量調整値の用量レベルで、静脈内（ＩＶ）ボーラスにより投与された。Ｎｅｏ−２／１５ ＰＥＧで処置された動物は、研究１日目および７日目に、０．０５、０．１５、または０．１０ｍｇ／ｋｇ／日のＮｅｏ−２／１５ＰＥＧ（それぞれ、群５、６および７）の用量レベルで、静脈内ボーラスにより投与された。サイトカイン試料は、１日目および７日目に、投与後０、４、８、および２４時間の時点で、採取された。サイトカインの血清試料を調製し、−７０℃未満で凍結し、分析用に出荷した。試料は、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスイムノアッセイシステムで分析された。ＩＬ−１５およびＩＬ−１０を含むいくつかのサイトカインは、サイトカイン産生の時間経過で顕著な違いを実証し、ＰＥＧ化分子のより持続的な薬力学的効果と一致していた。

【0206】

標的化Ｎｅｏ−２／１５融合体は、それらのＩＬ−２Ｒ結合親和性を保持し、抗腫瘍効果を実証した。選択された標的化ドメインは、ペプチドリンカーを介してＮｅｏ−２／１５のＮ末端またはＣ末端に融合され、バイオレイヤー干渉測定によって、ヒトおよびマウスＩＬ−２Ｒへのそれらの結合親和性を特徴づけるために、インビトロで試験された。その結果、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにＮｅｏ−２／１５を融合しても、ＩＬ−２Ｒに結合するその能力が妨げられないことを確認した。その後のインビトロのフローサイトメトリー研究から、これらの融合タンパク質が、細胞の表面上の標的受容体に結合できることを確認した。標的構築物の有効性は、インビボのマウス実験で評価され、腫瘍細胞または免疫細胞に対する標的Ｎｅｏ−２／１５部分が、非標的対照よりも有益な抗腫瘍効果を有することが実証された（データは示さず）。

【0207】

試験された融合としては、限定されないが、以下が含まれる：（ｉ）配列番号１００のリンカーを介したＮｅｏ ２／１５のＣ末端への抗ＣＤ４７ナノボディの融合、（ｂ）配列番号１００のリンカーを介したＮｅｏ２／１５のＮ末端への抗ＣＤ４７ナノボディの融合、（ｃ）配列番号１００のリンカーを介したＮｅｏ２／１５のＣ末端への抗ＣＴＬＡ４ナノボディの融合、（ｄ）配列番号１００のリンカーを介したＮｅｏ２／１５のＮ末端への抗ＣＴＬＡ４ナノボディの融合、（ｅ）配列番号１００のリンカーを介したＮｅｏ２／１５のＣ末端への抗ＰＤＬ−１ナノボディの融合、（ｆ）配列番号１００のリンカーを介したＮｅｏ２／１５のＮ末端への抗ＰＤＬ−１ナノボディの融合。

【0208】

Ｎｅｏ−２／１５へのアルブミンの融合は、ＩＬ−２Ｒ結合親和性を維持した。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を、ペプチドリンカーを介してＮｅｏ ２／１５のＮ末端に融合し、バイオレイヤー干渉測定によってインビトロで試験して、マウスＩＬ−２Ｒへのその結合親和性を特徴づけた。ビオチン−ｍＩＬ２γをストレプトアビジンバイオセンサに固定化し、ＭＳＡ−Ｎｅｏ２の濃度を、飽和濃度のｍＩＬ２Ｂｅｔａの存在下で、７２９から１ｎＭに滴定した。これらの融合は、ＩＬ−２Ｒ結合能力を維持した（データは示さず）。

【0209】

ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で意味のある抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発しない。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５（ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５の場合：Ｅ６２Ｃの単一システイン変異およびＰＥＧ４０Ｋ）が、ＡＤＡを誘発する可能性について、非ヒト霊長類で試験した。動物に、いずれかの化合物を１週間静脈内投与した：ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５を１目および７日目に、野生型Ｎｅｏ−２／１５を１〜７日目に。その後、様々な時点で採血し、投与した化合物に特異的な抗体の存在について分析した。各用量群は、１匹のオスと１匹のメスのマカクで構成された。非ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５は、０．１ｍ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇで、７日間連続で、毎日の静脈内ボーラス注射を介して投与した。ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５は、１日目と７日目に、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．１０ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス注射を介して投与された。ビヒクル対照群には、等量の生理食塩水を、７日間連続で、毎日投与した。研究１日目（投与前）、２２、２９、および４３日目のＡＤＡ分析のために、橈側皮静脈または伏在静脈を介して各動物から約７５０ｕｌの血液を採取した。湿った氷上で、血清分離管を使用して血液から血清を抽出し、その後、分析するまで−８０℃で保存した。ビヒクルまたはＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５のいずれかを投与されたすべてのカニクイザルでは、２２、２９、および４３日目のＡＤＡが、試験で陰性であり、ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５が、マカクの免疫系に対してまったく外来的な計算上設計されたタンパク質であるにもかかわらず、反復投与後であっても、検出可能な免疫応答が誘発されなかったことを実証している。ビヒクル対照を投与された両方（雄１匹、雌１匹）のマカクは、１、１５、２２、および２８日目において、野生型Ｎｅｏ−２／１５に対するＡＤＡが、試験で陰性であった。非ＰＥＧ化Ｎｅｏ−２／１５を投与された群のすべての動物（雄３匹、雌２匹）は、１日目（投与前）に、ＡＤＡが試験で陰性であった。これらのうち、５匹のうちの３匹（６０％）は、２２、２９、および４３日目に、ＡＤＡに対して陰性のままであった。残りの２匹の動物では、その後、２２、２９、または４３日目に、ＡＤＡに対して試験で陽性であった。１人の対象は、２２日目と２９日目に試験で陽性であったが、４３日目には陰性に戻った。その対象の場合、ＡＤＡ応答は低くて一過性であり、臨床的意義が最小限であることを示唆している。別の対象は、２２、２９、および４３日目に試験で陽性であった。その対象の場合、測定されたＡＤＡ濃度は１００ｎｇ／ｍｌをはるかに下回っていたため、臨床的関連性は不明であった。

【0210】

データ表
表Ｅ１。ＩＬ−２／ＩＬ−１５のいくつかのデノボ設計模倣体の特性評価。この表は、デノボＩＬ−２／ＩＬ−１５模倣体および参照サイトカイン：ｍＩＬ−２Ｒβ、ｍＩＬ−２Ｒβγｃ、のＫｄ、ＥＣ_５０、ｈＩＬ−２（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）およびｍＩＬ−２（ＰＤＢ：）に対する構造整列（ＭＩＣＡＮ^６３）による配列類似性、各分子の親、そのアミノ酸長、ならびにデノボＩＬ−２模倣体の配列を示している。「Ｎ／Ｓ」は有意差なし（ｎｏｎ−ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を意味し、「Ｎ／Ａ」はデータなし（ｎｏｎ−ａｖａｉｌａｂｌｅ）を意味する。

【表9-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表9-2】

[この文献は図面を表示できません]

【表9-3】

[この文献は図面を表示できません]

【表10】

[この文献は図面を表示できません]

【表11】

[この文献は図面を表示できません]

【表12】

[この文献は図面を表示できません]

【表13-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表13-2】

[この文献は図面を表示できません]

【表13-3】

[この文献は図面を表示できません]

【表14】

[この文献は図面を表示できません]

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５−Ｈ８Ｙ−Ｋ３３Ｅ：Ｈ１−＞Ｈ３−＞Ｈ２’−＞Ｈ４

【化90】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号９４）

【0211】

Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２／１５−Ｈ８Ｙ−Ｋ３３ＥのＩＬ２受容体への結合を、バイオレイヤー干渉測定によって測定したところ、ＩＬ２Ｒｂｅｔａのみに対して試験した場合と、ＩＬ２Ｒｂｅｔａ−ｇａｍｍａ複合体に対して試験した場合との両方で、ＩＬ２−Ｒｂｅｔａに対して、Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ−２よりも結合親和性が高いことがわかった。この親和性の増加は、主に、ＩＬ２−Ｒｂｅｔａからの解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の改善に起因していた。

【表15】

[この文献は図面を表示できません]

付録Ａ．模倣体第１世代の配列設計のためのＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓＸＭＬプロトコル。
＜ＲＯＳＥＴＴＡＳＣＲＩＰＴＳ＞
＜ＳＣＯＲＥＦＸＮＳ＞
＜ＳＦＸＮ６ ｗｅｉｇｈｔｓ＝ｔａｌａｒｉｓ２０１３．ｗｔｓ ／＞
＜ＳＦＸＮ６ｄＡ ｗｅｉｇｈｔｓ＝ｔａｌａｒｉｓ２０１３＿ｄｏｗｎＡｌａ．ｗｔｓ ／＞
＜／ＳＣＯＲＥＦＸＮＳ＞
＜ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜ＳＳＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ” ｃｍｄ＝“／ｗｏｒｋ／ｄａｄｒｉａｎｏ／ＰＲＯＧＲＡＭＳ／ｐｓｉｐｒｅｄ／ｒｕｎｐｓｉｐｒｅｄ＿ｓｉｎｇｌｅ” ｕｓｅ＿ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＝“０” ｕｓｅ＿ｓｖｍ＝“０” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．８０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＳｃｏｒｅＴｙｐｅ ｎａｍｅ＝“ｒａｍａ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６” ｓｃｏｒｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｒａｍａ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＰａｃｋＳｔａｔ ｎａｍｅ＝ｐａｃｋ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．６３ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝１／＞
＜Ｈｏｌｅｓ ｎａｍｅ＝ｈｏｌｅｓ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１．２ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝０／＞
＜ＳｃｏｒｅＴｙｐｅ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６” ｓｃｏｒｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｔｏｔａｌ＿ｓｃｏｒｅ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＲｅｓｉｄｕｅＣｏｕｎｔ ｎａｍｅ＝“ｎｒｅｓ” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ” ｅｑｕａｔｉｏｎ＝“ＳＣＯＲＥ／ＮＲＥＳ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“−１．７” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”＞
＜ＳＣＯＲＥ ｎａｍｅ＝“ＳＣＯＲＥ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ” ／＞
＜ＮＲＥＳ ｎａｍｅ＝“ＮＲＥＳ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝”ｎｒｅｓ” ／＞
＜／ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ＞
＜ＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔａｔｅｍｅｎｔ ｎａｍｅ＝ｆｉｌｔ＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｓｐｒｅｄ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒａｍａ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｐａｃｋ ／＞
＜／ＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔａｔｅｍｅｎｔ＞
＜／ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜ＴＡＳＫＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳ＞
＜ＩｎｉｔｉａｌｉｚｅＦｒｏｍＣｏｍｍａｎｄｌｉｎｅ ｎａｍｅ＝“ｉｎｉｔ”／＞
＜ＩｎｃｌｕｄｅＣｕｒｒｅｎｔ ｎａｍｅ＝“ｉｎｃｌｃｕｒ”／＞
＜ＬｉｍｉｔＡｒｏｍａＣｈｉ２ ｎａｍｅ＝ｌｉｍｉｔｃｈｉ２ ／＞
ＤｉｓａｌｌｏｗＩｆＮｏｎｎａｔｉｖｅ ｎａｍｅ＝“ｎｏｔ＿ａａ＿Ｈ” ｄｉｓａｌｌｏｗ＿ａａｓ＝“Ｈ”／＞
＜ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｅｓｆｉｌｅ” ｆｉｌｅｎａｍｅ＝“．／ｉｎｐｕｔ．ｒｅｓｆｉｌｅ” ／＞
＜／ＴＡＳＫＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳ＞
＜ＭＯＶＥＲＳ＞
＜Ｄｓｓｐ ｎａｍｅ＝ｄｓｓｐ／＞
＜ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎ ｎａｍｅ＝“ｆｄｅｓｉｇｎ” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ” ａｌｌｏｗ＿ｄｅｓｉｇｎ＝“１” ｏｎｌｙ＿ｄｅｓｉｇｎ＿ｗｏｒｓｔ＿ｒｅｇｉｏｎ＝“０” ｄｅｓｉｇｎ＿ｂｙ＿ｐｓｉｐｒｅｄ＝“０” ｄｅｓｉｇｎ＿ｂｙ＿ｆｒａｇ＿ｑｕａｌ＝“０” ｒｅｐｅａｔｓ＝“２” ｃｌｅａｒ＿ｄｅｓｉｇｎａｂｌｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝“０” ｍａｘ＿ｒｅｄｅｓｉｇｎｓ＝”２０００” ／＞
＜ＦａｓｔＲｅｌａｘ ｎａｍｅ＝ｒｅｌａｘ ／＞
＜ＰａｒｓｅｄＰｒｏｔｏｃｏｌ ｎａｍｅ＝“ｃｏｍｐｌｅｘＤｅｓｉｇｎ” ＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｆｄｅｓｉｇｎ” ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｌａｘ” ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｄｓｓｐ” ／＞
＜／ＰａｒｓｅｄＰｒｏｔｏｃｏｌ＞
＜ＬｏｏｐＯｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｆａｓｔＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ” ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃｏｍｐｌｅｘＤｅｓｉｇｎ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｆｉｌｔ ｄｒｉｆｔ＝０ ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ＝“１０” ｍｓ＿ｗｈｅｎｆａｉｌ＝ＦＡＩＬ＿ＤＯ＿ＮＯＴ＿ＲＥＴＲＹ／＞
＜／ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＡＰＰＬＹ＿ＴＯ＿ＰＯＳＥ＞
＜／ＡＰＰＬＹ＿ＴＯ＿ＰＯＳＥ＞
＜ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｆａｓｔＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｓｐｒｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｐａｃｋ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｃｏｒｅ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｈｏｌｅｓ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒａｍａ ／＞
＜／ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ＞
＜／ＲＯＳＥＴＴＡＳＣＲＩＰＴＳ＞
付録Ｂ．Ｇ１＿Ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆ（すなわち、第２世代）の配列再設計のためのＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓＸＭＬプロトコル。
＜ＲＯＳＥＴＴＡＳＣＲＩＰＴＳ＞
＜ＳＣＯＲＥＦＸＮＳ＞
＜ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ／＞
＜ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｖａｎｉｌｌａ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ＿ｄｏｗｎＡｌａ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ／＞
＜ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ＿ｄｏｗｎＡｌａ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ＞
＜Ｒｅｗｅｉｇｈｔ ｓｃｏｒｅｔｙｐｅ＝ｆａ＿ｒｅｐ ｗｅｉｇｈｔ＝０．０５ ／＞
＜Ｒｅｗｅｉｇｈｔ ｓｃｏｒｅｔｙｐｅ＝ｆａ＿ｅｌｅｃ ｗｅｉｇｈｔ＝１．０ ／＞
＜／ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ ＞
＜ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｅｌｅｃｔ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ＿ｄｏｗｎＡｌａ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ＞
＜Ｒｅｗｅｉｇｈｔ ｓｃｏｒｅｔｙｐｅ＝ｆａ＿ｅｌｅｃ ｗｅｉｇｈｔ＝２．０ ／＞
＜／ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｅｌｅｃｔ ＞
＜／ＳＣＯＲＥＦＸＮＳ＞
＜ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＳｗｉｔｃｈＣｈａｉｎＯｒｄｅｒ ｎａｍｅ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｃｈａｉｎ＿ｏｒｄｅｒ＝“１”／＞
＜／ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜！−−Ｎｏｔ Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜Ｈｏｌｅｓ ｎａｍｅ＝“ｈｏｌｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．２” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＳｃｏｒｅＴｙｐｅ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ” ｓｃｏｒｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｔｏｔａｌ＿ｓｃｏｒｅ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＲｅｓｉｄｕｅＣｏｕｎｔ ｎａｍｅ＝“ｎｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＰａｃｋＳｔａｔ ｎａｍｅ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“０．６５” ｒｅｐｅａｔｓ＝“３” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＳＳＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｃｍｄ＝“／ｗｏｒｋ／ｄａｄｒｉａｎｏ／ＰＲＯＧＲＡＭＳ／ｐｓｉｐｒｅｄ／ｒｕｎｐｓｉｐｒｅｄ＿ｓｉｎｇｌｅ” ｕｓｅ＿ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＝“０” ｕｓｅ＿ｓｖｍ＝“０” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．８５ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＢｕｒｉｅｄＵｎｓａｔＨｂｏｎｄｓ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｃｕｔｏｆｆ＝０ ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ” ｊｕｍｐ＿ｎｕｍｂｅｒ＝０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ１＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ２＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ３＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｅｑｕａｔｉｏｎ＝“ＳＣＯＲＥ／ＮＲＥＳ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“−１．８” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”＞
＜ＳＣＯＲＥ ｎａｍｅ＝“ＳＣＯＲＥ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜ＮＲＥＳ ｎａｍｅ＝“ＮＲＥＳ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｎｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜／ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ＞
＜！−−Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜ＰａｃｋＳｔａｔ ｎａｍｅ＝“ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“０．６５” ｒｅｐｅａｔｓ＝“３” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１” ／＞
＜ＳＳＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｃｍｄ＝“／ｗｏｒｋ／ｄａｄｒｉａｎｏ／ＰＲＯＧＲＡＭＳ／ｐｓｉｐｒｅｄ／ｒｕｎｐｓｉｐｒｅｄ＿ｓｉｎｇｌｅ” ｕｓｅ＿ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＝“０” ｕｓｅ＿ｓｖｍ＝“０” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．８５ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｅｑｕａｔｉｏｎ＝“ＳＣＯＲＥ／ＮＲＥＳ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“−１．８” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”＞
＜ＳＣＯＲＥ ｎａｍｅ＝“ＳＣＯＲＥ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜ＮＲＥＳ ｎａｍｅ＝“ＮＲＥＳ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｎｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜／ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ＞
＜ＣａｖｉｔｙＶｏｌｕｍｅ ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜ＢｕｒｉｅｄＵｎｓａｔＨｂｏｎｄｓ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｃｕｔｏｆｆ＝０ ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ” ｊｕｍｐ＿ｎｕｍｂｅｒ＝０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ１＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ２＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ３＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔａｔｅｍｅｎｔ ｎａｍｅ＝ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ ＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜／ＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔａｔｅｍｅｎｔ＞
＜／ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜！−−Ｃｈａｉｎ Ａ Ｆｉｌｔｅｒｓ−−＞
＜！−−Ｎｏｔ Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜！−−Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ＿ｃｈａｉｎＡ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜／ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜ＲＥＳＩＤＵＥ＿ＳＥＬＥＣＴＯＲＳ＞
＜ＲｅｓｉｄｕｅＰＤＢＩｎｆｏＨａｓＬａｂｅｌ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ｐｒｏｐｅｒｔｙ＝“ＨＯＴＳＰＯＴＢ” ／＞
＜／ＲＥＳＩＤＵＥ＿ＳＥＬＥＣＴＯＲＳ＞
＜ＴＡＳＫＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳ＞
＜ＩｎｉｔｉａｌｉｚｅＦｒｏｍＣｏｍｍａｎｄｌｉｎｅ ｎａｍｅ＝“ｉｎｉｔ”／＞
＜ＩｎｃｌｕｄｅＣｕｒｒｅｎｔ ｎａｍｅ＝“ｉｎｃｌｃｕｒ”／＞
＜ＬｉｍｉｔＡｒｏｍａＣｈｉ２ ｎａｍｅ＝ｌｉｍｉｔｃｈｉ２ ／＞
＜ＤｉｓａｌｌｏｗＩｆＮｏｎｎａｔｉｖｅ ｎａｍｅ＝“ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ” ｄｉｓａｌｌｏｗ＿ａａｓ＝“Ｈ”／＞
＜ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｅｓｆｉｌｅ” ｆｉｌｅｎａｍｅ＝“．／ｉｎｐｕｔ．ｒｅｓｆｉｌｅ” ／＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＣｈａｉｎＦｒｏｍＲｅｐａｃｋｉｎｇ ｎａｍｅ＝“ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ” ｃｈａｉｎ＝“２” ／＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＣｈａｉｎＦｒｏｍＲｅｐａｃｋｉｎｇ ｎａｍｅ＝“ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ” ｃｈａｉｎ＝“３” ／＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＣｈａｉｎＦｒｏｍＲｅｐａｃｋｉｎｇ ｎａｍｅ＝“ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ｃｈａｉｎ＝“４” ／＞
＜！−−Ｓｅｌｅｃｔ ｄｅｓｉｇｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ ｓａｓａ ａｎｄ ｐａｃｋａｂｌｅ ｂｙ ｆｌａｇ−−＞
＜ＳｅｌｅｃｔＢｙＳＡＳＡ ｎａｍｅ＝“ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ” ｍｏｄｅ＝“ｍｃ” ｐｒｏｂｅ＿ｒａｄｉｕｓ＝２．０ ｃｏｒｅ＿ａｓａ＝２０．０ ｓｕｒｆａｃｅ＿ａｓａ＝３０．０ ｃｏｒｅ＝１ ｂｏｕｎｄａｒｙ＝０ ｓｕｒｆａｃｅ＝０ ｖｅｒｂｏｓｅ＝１ ／＞
＜！−−Ｒｅｓｔｒｉｃｔ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｔｏ Ｒｅｐａｃｋｉｎｇ−−＞
＜ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ” ｓｅｌｅｃｔｏｒ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ＞
＜ＲｅｓｔｒｉｃｔＴｏＲｅｐａｃｋｉｎｇＲＬＴ／＞
＜／ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ＞
＜！−−Ｌａｙｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｓ Ｔｏｍ Ｈｅｌｐｅｄ ｔｏ ｓｅｔ ｏｍｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈａｎｋｓ Ｔｏｍ Ｌ．：）−−＞
＜ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ ｎａｍｅ＝“ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ” ｌａｙｅｒ＝“ａｌｌ” ｕｓｅ＿ｓｉｄｅｃｈａｉｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝“Ｔｒｕｅ” ｐｏｒｅ＿ｒａｄｉｕｓ＝“２．０” ｖｅｒｂｏｓｅ＝“ｔｒｕｅ” ＞
＜ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｎａｍｅ＝“ｄｉｓｕｌｆ” ＞
＜ａｌｌ ａａ＝“ｃ” ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ＞
＜ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｓｅｌｅｃｔｏｒ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＲｅｐａｃｋｉｎｇＲＬＴ／＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ＞
＜ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｅｓｆｉｌｅ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｆｉｌｅｎａｍｅ＝“．／ｉｎｐｕｔ＿ｆｉｘ．ｒｅｓｆｉｌｅ” ＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ＞
＜ｃｏｒｅ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｃｏｒｅ＞
＜ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜／ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ＞
＜ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ ｎａｍｅ＝“ｌａｙｅｒ＿ｂｏｕｎｄａｒｙ＿ｓｕｒｆａｃｅ” ｌａｙｅｒ＝“ｂｏｕｎｄａｒｙ＿ｓｕｒｆａｃｅ” ｕｓｅ＿ｓｉｄｅｃｈａｉｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝“Ｔｒｕｅ” ｐｏｒｅ＿ｒａｄｉｕｓ＝“２．０” ｖｅｒｂｏｓｅ＝“ｔｒｕｅ” ＞
＜ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｎａｍｅ＝“ｄｉｓｕｌｆ” ＞
＜ａｌｌ ａａ＝“ｃ” ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ＞
＜ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｓｅｌｅｃｔｏｒ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＲｅｐａｃｋｉｎｇＲＬＴ／＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ＞
＜ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｅｓｆｉｌｅ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｆｉｌｅｎａｍｅ＝“．／ｉｎｐｕｔ＿ｆｉｘ．ｒｅｓｆｉｌｅ” ＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ＞
＜ｃｏｒｅ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｃｏｒｅ＞
＜ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜／ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ＞
＜／ＴＡＳＫＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳ＞
＜ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＳａｖｅＰｏｓｅＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓａｖｅ＿ＲＭＳＤｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”／＞
＜ＡｄｄＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓＴｏＣｕｒｒｅｎｔＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝ｃｏｎｓｔｒａｉｎＣＡ ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ＣＡ＿ｏｎｌｙ＝１ ／＞
＜ＣｌｅａｒＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝ｃｌｅａｒＡｌｌＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ／＞
＜ＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｎｏｒｅｐ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ｏｎｌｙＣｏｒｅ＿ｎｏｒｅｐ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＴａｓｋＡｗａｒｅＭｉｎＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＳＣ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ” ｂｂ＝“０” ｃｈｉ＝“１” ｊｕｍｐ＝“１” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＴａｓｋＡｗａｒｅＭｉｎＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＢＢＳＣ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ” ｂｂ＝“１” ｃｈｉ＝“１” ｊｕｍｐ＝“１” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎ ｎａｍｅ＝“ｆｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｅｌｅｃ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｖａｎｉｌｌａ” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ｏｎｌｙ＿ｄｅｓｉｇｎ＿ｗｏｒｓｔ＿ｒｅｇｉｏｎ＝“０” ｄｅｓｉｇｎ＿ｂｙ＿ｐｓｉｐｒｅｄ＝“０” ｄｅｓｉｇｎ＿ｂｙ＿ｆｒａｇ＿ｑｕａｌ＝“０” ｒｅｐｅａｔｓ＝“３” ｃｌｅａｒ＿ｄｅｓｉｇｎａｂｌｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝“０” ｍａｘ＿ｒｅｄｅｓｉｇｎｓ＝“２０００” ＞
＜ＦａｓｔＲｅｌａｘ ｎａｍｅ＝ｆａｓｔ＿ｒｅｌａｘ＿ｖａｎｉｌｌａ ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｖａｎｉｌｌａ”＞
＜ＭｏｖｅＭａｐ ｎａｍｅ＝“ｍａｐｐｙｆｒ”＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝１ ｃｈｉ＝１ ｂｂ＝１／＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝２ ｃｈｉ＝０ ｂｂ＝０／＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝３ ｃｈｉ＝０ ｂｂ＝０／＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝４ ｃｈｉ＝０ ｂｂ＝０／＞
＜Ｊｕｍｐ ｎｕｍｂｅｒ＝１ ｓｅｔｔｉｎｇ＝０／＞
＜／ＭｏｖｅＭａｐ＞
＜／ＦａｓｔＲｅｌａｘ＞
＜ＰａｒｓｅｄＰｒｏｔｏｃｏｌ ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｗ＿ｍｉｎｉｍｉｚｅ＿ｖａｎｉｌｌａ” ＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃｏｎｓｔｒａｉｎＣＡ” ／＞ ＜！−− ＳＴＡＲＴ ＣＡ−ｃｏｎｔｒａｉｎｔｓ −−＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｎｏｒｅｐ” ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＳＣ” ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＢＢＳＣ” ／＞
Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ／＞ ＜！−− Ｃｈｅｃｋ ＲＭＳＤ −−＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃｌｅａｒＡｌｌＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ” ／＞ ＜！−− ＥＮＤ ＣＡ−ｃｏｎｔｒａｉｎｔｓ −−＞
＜／ＰａｒｓｅｄＰｒｏｔｏｃｏｌ＞
＜ＧｅｎｅｒｉｃＳｉｍｕｌａｔｅｄＡｎｎｅａｌｅｒ ｎａｍｅ＝“ＳＡ＿ＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ”
ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ｏｎｌｙＣｏｒｅ＿ｎｏｒｅｐ” ｔｒｉａｌｓ＝“１００”
ｐｅｒｉｏｄｉｃ＿ｍｏｖｅｒ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｗ＿ｍｉｎｉｍｉｚｅ＿ｖａｎｉｌｌａ” ｅｖａｌ＿ｐｅｒｉｏｄ＝“２０” ｈｉｓｔｏｒｙ＝“１０”
ｂｏｌｚ＿ｒａｎｋ＝“１” ｒｅｃｏｖｅｒ＿ｌｏｗ＝“１” ｐｒｅａｐｐｌｙ＝“０” ｄｒｉｆｔ＝“１”
ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ＿ｆｉｌｅ＝“ｍｃ” ｋｅｅｐ＿ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ＿ｆｉｌｅ＝“０”
ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＝“１．５” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ”
ｓｔｏｐｐｉｎｇ＿ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ＝“ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ＿ｃｈａｉｎＡ” ＞
＜Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＝０．０５ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＝０．０５ ／＞
＜／Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜／ＧｅｎｅｒｉｃＳｉｍｕｌａｔｅｄＡｎｎｅａｌｅｒ＞
＜ＧｅｎｅｒｉｃＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ ｎａｍｅ＝“ＭＣ＿ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ”
ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｆｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｅｌｅｃ”
ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ”
ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ”
ｔｒｉａｌｓ＝“３” ｐｒｅａｐｐｌｙ＝“０”
ｓｔｏｐｐｉｎｇ＿ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ＝“ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ＿ｃｈａｉｎＡ” ＞
＜Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ／＞
＜／Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜／ＧｅｎｅｒｉｃＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ＞
＜／ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＡＰＰＬＹ＿ＴＯ＿ＰＯＳＥ＞
＜／ＡＰＰＬＹ＿ＴＯ＿ＰＯＳＥ＞
＜ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓａｖｅ＿ＲＭＳＤｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ＳＡ＿ＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒｍｓｄ１＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ＭＣ＿ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒｍｓｄ２＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｆａｓｔ＿ｒｅｌａｘ＿ｖａｎｉｌｌａ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒｍｓｄ３＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ／＞
＜／ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ＞
＜／ＲＯＳＥＴＴＡＳＣＲＩＰＴＳ＞
付録Ｃ．新しい模倣体第２世代（すなわち、テンプレートとしてＧ１＿Ｎｅｏ２＿４０＿１Ｆに基づくミメティック）の配列設計のためのＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓＸＭＬプロトコル。
＜ＲＯＳＥＴＴＡＳＣＲＩＰＴＳ＞
＜ＳＣＯＲＥＦＸＮＳ＞
＜ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ／＞
＜ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｖａｎｉｌｌａ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ＿ｄｏｗｎＡｌａ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ／＞
＜ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ＿ｄｏｗｎＡｌａ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ＞
＜Ｒｅｗｅｉｇｈｔ ｓｃｏｒｅｔｙｐｅ＝ｆａ＿ｒｅｐ ｗｅｉｇｈｔ＝０．０５ ／＞
＜Ｒｅｗｅｉｇｈｔ ｓｃｏｒｅｔｙｐｅ＝ｆａ＿ｅｌｅｃ ｗｅｉｇｈｔ＝１．０ ／＞
＜／ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ ＞
＜ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｅｌｅｃｔ ｗｅｉｇｈｔｓ＝“．／ｔａｌａｒｉｓ２０１４＿ｃａｒｔ＿ｄｏｗｎＡｌａ．ｗｔｓ” ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ＝０ ＞
＜Ｒｅｗｅｉｇｈｔ ｓｃｏｒｅｔｙｐｅ＝ｆａ＿ｅｌｅｃ ｗｅｉｇｈｔ＝２．０ ／＞
＜／ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｅｌｅｃｔ ＞
＜／ＳＣＯＲＥＦＸＮＳ＞
＜ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＳｗｉｔｃｈＣｈａｉｎＯｒｄｅｒ ｎａｍｅ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｃｈａｉｎ＿ｏｒｄｅｒ＝“１”／＞
＜／ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜！−−Ｎｏｔ Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜Ｈｏｌｅｓ ｎａｍｅ＝“ｈｏｌｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．２” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＳｃｏｒｅＴｙｐｅ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ” ｓｃｏｒｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｔｏｔａｌ＿ｓｃｏｒｅ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＲｅｓｉｄｕｅＣｏｕｎｔ ｎａｍｅ＝“ｎｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＰａｃｋＳｔａｔ ｎａｍｅ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“０．６５” ｒｅｐｅａｔｓ＝“３” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０” ／＞
＜ＳＳＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｃｍｄ＝“／ｗｏｒｋ／ｄａｄｒｉａｎｏ／ＰＲＯＧＲＡＭＳ／ｐｓｉｐｒｅｄ／ｒｕｎｐｓｉｐｒｅｄ＿ｓｉｎｇｌｅ” ｕｓｅ＿ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＝“０” ｕｓｅ＿ｓｖｍ＝“０” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．８５ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＢｕｒｉｅｄＵｎｓａｔＨｂｏｎｄｓ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｃｕｔｏｆｆ＝０ ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ” ｊｕｍｐ＿ｎｕｍｂｅｒ＝０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ１＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ２＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ３＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｅｑｕａｔｉｏｎ＝“ＳＣＯＲＥ／ＮＲＥＳ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“−１．８” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”＞
＜ＳＣＯＲＥ ｎａｍｅ＝“ＳＣＯＲＥ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜ＮＲＥＳ ｎａｍｅ＝“ＮＲＥＳ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｎｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜／ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ＞
＜！−−Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜ＰａｃｋＳｔａｔ ｎａｍｅ＝“ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“０．６５” ｒｅｐｅａｔｓ＝“３” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１” ／＞
＜ＳＳＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｃｍｄ＝“／ｗｏｒｋ／ｄａｄｒｉａｎｏ／ＰＲＯＧＲＡＭＳ／ｐｓｉｐｒｅｄ／ｒｕｎｐｓｉｐｒｅｄ＿ｓｉｎｇｌｅ” ｕｓｅ＿ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ＝“０” ｕｓｅ＿ｓｖｍ＝“０” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．８５ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｅｑｕａｔｉｏｎ＝“ＳＣＯＲＥ／ＮＲＥＳ” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“−１．８” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”＞
＜ＳＣＯＲＥ ｎａｍｅ＝“ＳＣＯＲＥ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜ＮＲＥＳ ｎａｍｅ＝“ＮＲＥＳ” ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｎｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜／ＣａｌｃｕｌａｔｏｒＦｉｌｔｅｒ＞
＜ＣａｖｉｔｙＶｏｌｕｍｅ ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ／＞
＜ＢｕｒｉｅｄＵｎｓａｔＨｂｏｎｄｓ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｃｕｔｏｆｆ＝０ ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ” ｊｕｍｐ＿ｎｕｍｂｅｒ＝０ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ１＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ２＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＲｍｓｄＳｉｍｐｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ３＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｃｈａｉｎ＝“１” ａｌｉｇｎ＝“１” ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝“１．０” ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔａｔｅｍｅｎｔ ｎａｍｅ＝ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ ＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜／ＣｏｍｐｏｕｎｄＳｔａｔｅｍｅｎｔ＞
＜／ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜！−−Ｃｈａｉｎ Ａ Ｆｉｌｔｅｒｓ−−＞
＜！−−Ｎｏｔ Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“０”／＞
＜！−−Ｅｎａｂｌｅｄ−−＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｓｐｒｅｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ＿ｃｈａｉｎＡ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜ＭｏｖｅＢｅｆｏｒｅＦｉｌｔｅｒ ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ｍｏｖｅｒ＝“ｋｅｅｐ＿ｏｎｌｙ＿ｃｈａｉｎ＿Ａ” ｆｉｌｔｅｒ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｅｎａｂｌｅｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝“１”／＞
＜／ＦＩＬＴＥＲＳ＞
＜ＲＥＳＩＤＵＥ＿ＳＥＬＥＣＴＯＲＳ＞
＜ＲｅｓｉｄｕｅＰＤＢＩｎｆｏＨａｓＬａｂｅｌ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ｐｒｏｐｅｒｔｙ＝“ＨＯＴＳＰＯＴＢ” ／＞
＜／ＲＥＳＩＤＵＥ＿ＳＥＬＥＣＴＯＲＳ＞
＜ＴＡＳＫＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳ＞
＜ＩｎｉｔｉａｌｉｚｅＦｒｏｍＣｏｍｍａｎｄｌｉｎｅ ｎａｍｅ＝“ｉｎｉｔ”／＞
＜ＩｎｃｌｕｄｅＣｕｒｒｅｎｔ ｎａｍｅ＝“ｉｎｃｌｃｕｒ”／＞
＜ＬｉｍｉｔＡｒｏｍａＣｈｉ２ ｎａｍｅ＝ｌｉｍｉｔｃｈｉ２ ／＞
＜ＤｉｓａｌｌｏｗＩｆＮｏｎｎａｔｉｖｅ ｎａｍｅ＝“ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ” ｄｉｓａｌｌｏｗ＿ａａｓ＝“Ｈ”／＞
＜ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｅｓｆｉｌｅ” ｆｉｌｅｎａｍｅ＝“．／ｉｎｐｕｔ．ｒｅｓｆｉｌｅ” ／＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＣｈａｉｎＦｒｏｍＲｅｐａｃｋｉｎｇ ｎａｍｅ＝“ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ” ｃｈａｉｎ＝“２” ／＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＣｈａｉｎＦｒｏｍＲｅｐａｃｋｉｎｇ ｎａｍｅ＝“ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ” ｃｈａｉｎ＝“３” ／＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＣｈａｉｎＦｒｏｍＲｅｐａｃｋｉｎｇ ｎａｍｅ＝“ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ｃｈａｉｎ＝“４” ／＞
＜！−−Ｓｅｌｅｃｔ ｄｅｓｉｇｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ ｓａｓａ ａｎｄ ｐａｃｋａｂｌｅ ｂｙ ｆｌａｇ−−＞
＜ＳｅｌｅｃｔＢｙＳＡＳＡ ｎａｍｅ＝“ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ” ｍｏｄｅ＝“ｍｃ” ｐｒｏｂｅ＿ｒａｄｉｕｓ＝２．０ ｃｏｒｅ＿ａｓａ＝２０．０ ｓｕｒｆａｃｅ＿ａｓａ＝３０．０ ｃｏｒｅ＝１ ｂｏｕｎｄａｒｙ＝０ ｓｕｒｆａｃｅ＝０ ｖｅｒｂｏｓｅ＝１ ／＞
＜！−−Ｒｅｓｔｒｉｃｔ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｔｏ Ｒｅｐａｃｋｉｎｇ−−＞
＜ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ” ｓｅｌｅｃｔｏｒ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ＞
＜ＲｅｓｔｒｉｃｔＴｏＲｅｐａｃｋｉｎｇＲＬＴ／＞
＜／ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ＞
＜！−−Ｌａｙｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｓ Ｔｏｍ Ｈｅｌｐｅｄ ｔｏ ｓｅｔ ｏｍｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈａｎｋｓ Ｔｏｍ Ｌ．：）−−＞
＜ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ ｎａｍｅ＝“ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ” ｌａｙｅｒ＝“ａｌｌ” ｕｓｅ＿ｓｉｄｅｃｈａｉｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝“Ｔｒｕｅ” ｐｏｒｅ＿ｒａｄｉｕｓ＝“２．０” ｖｅｒｂｏｓｅ＝“ｔｒｕｅ” ＞
＜ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｎａｍｅ＝“ｄｉｓｕｌｆ” ＞
＜ａｌｌ ａａ＝“ｃ” ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ＞
＜ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｓｅｌｅｃｔｏｒ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＲｅｐａｃｋｉｎｇＲＬＴ／＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ＞
＜ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｅｓｆｉｌｅ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｆｉｌｅｎａｍｅ＝“．／ｉｎｐｕｔ＿ｆｉｘ．ｒｅｓｆｉｌｅ” ＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ＞
＜ｃｏｒｅ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｃｏｒｅ＞
＜ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜／ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ＞
＜ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ ｎａｍｅ＝“ｌａｙｅｒ＿ｂｏｕｎｄａｒｙ＿ｓｕｒｆａｃｅ” ｌａｙｅｒ＝“ｂｏｕｎｄａｒｙ＿ｓｕｒｆａｃｅ” ｕｓｅ＿ｓｉｄｅｃｈａｉｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝“Ｔｒｕｅ” ｐｏｒｅ＿ｒａｄｉｕｓ＝“２．０” ｖｅｒｂｏｓｅ＝“ｔｒｕｅ” ＞
＜ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｎａｍｅ＝“ｄｉｓｕｌｆ” ＞
＜ａｌｌ ａａ＝“ｃ” ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＮｏＲｅｐａｃｋＤｉｓｕｌｆｉｄｅｓ＞
＜ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ ｎａｍｅ＝“ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｓｅｌｅｃｔｏｒ＝“ｈｏｔｓｐｏｔｓ” ＞
＜ＰｒｅｖｅｎｔＲｅｐａｃｋｉｎｇＲＬＴ／＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＯｐｅｒａｔｅＯｎＲｅｓｉｄｕｅＳｕｂｓｅｔ＞
＜ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ ｎａｍｅ＝“ｒｅｓｆｉｌｅ＿ｌａｙｅｒｄｅｓｉｇｎＯｍｉｔ” ｆｉｌｅｎａｍｅ＝“．／ｉｎｐｕｔ＿ｆｉｘ．ｒｅｓｆｉｌｅ” ＞
＜ａｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ＝“ｆｉｘｅｄ” ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝“ｏｍｉｔ” ／＞
＜／ＲｅａｄＲｅｓｆｉｌｅ＞
＜ｃｏｒｅ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｃｏｒｅ＞
＜ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜ａｌｌ ａｐｐｅｎｄ＝“Ｍ” ／＞
＜／ｂｏｕｎｄａｒｙ＞
＜／ＬａｙｅｒＤｅｓｉｇｎ＞
＜／ＴＡＳＫＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳ＞
＜ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＳａｖｅＰｏｓｅＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｓａｖｅ＿ＲＭＳＤｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｎａｍｅ＝“ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”／＞
＜ＡｄｄＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓＴｏＣｕｒｒｅｎｔＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝ｃｏｎｓｔｒａｉｎＣＡ ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ＣＡ＿ｏｎｌｙ＝１ ／＞
＜ＣｌｅａｒＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝ｃｌｅａｒＡｌｌＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ／＞
＜ＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｎｏｒｅｐ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＰａｃｋＲｏｔａｍｅｒｓＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ｏｎｌｙＣｏｒｅ＿ｎｏｒｅｐ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｎｏｒｅｐ＿ｅｌｅｃｔ” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｏｎｌｙ＿ｃｏｒｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＴａｓｋＡｗａｒｅＭｉｎＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＳＣ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ” ｂｂ＝“０” ｃｈｉ＝“１” ｊｕｍｐ＝“１” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＴａｓｋＡｗａｒｅＭｉｎＭｏｖｅｒ ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＢＢＳＣ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６＿ｖａｎｉｌｌａ” ｂｂ＝“１” ｃｈｉ＝“１” ｊｕｍｐ＝“１” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ／＞
＜ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎ ｎａｍｅ＝“ｆｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｅｌｅｃ” ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｖａｎｉｌｌａ” ｔａｓｋ＿ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ＝“ｉｎｉｔ，ｒｅｓｆｉｌｅ，ｉｎｃｌｃｕｒ，ｌｉｍｉｔｃｈｉ２，ｏｎｌｙ＿ｎａｔｉｖｅ＿Ｈ，ｌａｙｅｒ＿ａｌｌ，ｈｏｔｓｐｏｔ＿ｏｎｌｙｒｅｐａｃｋ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｂ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｃ，ｎｏｔ＿ｃｈａｉｎ＿Ｄ” ｏｎｌｙ＿ｄｅｓｉｇｎ＿ｗｏｒｓｔ＿ｒｅｇｉｏｎ＝“０” ｄｅｓｉｇｎ＿ｂｙ＿ｐｓｉｐｒｅｄ＝“０” ｄｅｓｉｇｎ＿ｂｙ＿ｆｒａｇ＿ｑｕａｌ＝“０” ｒｅｐｅａｔｓ＝“３” ｃｌｅａｒ＿ｄｅｓｉｇｎａｂｌｅ＿ｒｅｓｉｄｕｅｓ＝“０” ｍａｘ＿ｒｅｄｅｓｉｇｎｓ＝“２０００” ＞
＜ＦａｓｔＲｅｌａｘ ｎａｍｅ＝ｆａｓｔ＿ｒｅｌａｘ＿ｖａｎｉｌｌａ ｓｃｏｒｅｆｘｎ＝“ＳＦＸＮ６ｄＡ＿ｖａｎｉｌｌａ”＞
＜ＭｏｖｅＭａｐ ｎａｍｅ＝“ｍａｐｐｙｆｒ”＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝１ ｃｈｉ＝１ ｂｂ＝１／＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝２ ｃｈｉ＝０ ｂｂ＝０／＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝３ ｃｈｉ＝０ ｂｂ＝０／＞
＜Ｃｈａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ＝４ ｃｈｉ＝０ ｂｂ＝０／＞
＜Ｊｕｍｐ ｎｕｍｂｅｒ＝１ ｓｅｔｔｉｎｇ＝０／＞
＜／ＭｏｖｅＭａｐ＞
＜／ＦａｓｔＲｅｌａｘ＞
＜ＰａｒｓｅｄＰｒｏｔｏｃｏｌ ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｗ＿ｍｉｎｉｍｉｚｅ＿ｖａｎｉｌｌａ” ＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃｏｎｓｔｒａｉｎＣＡ” ／＞ ＜！−− ＳＴＡＲＴ ＣＡ−ｃｏｎｔｒａｉｎｔｓ −−＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｎｏｒｅｐ” ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＳＣ” ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｍｉｎ＿ｖａｎｉｌｌａ＿ＢＢＳＣ” ／＞
Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｒｍｓｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ” ／＞ ＜！−− Ｃｈｅｃｋ ＲＭＳＤ −−＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃｌｅａｒＡｌｌＣｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ” ／＞ ＜！−− ＥＮＤ ＣＡ−ｃｏｎｔｒａｉｎｔｓ −−＞
＜／ＰａｒｓｅｄＰｒｏｔｏｃｏｌ＞
＜ＧｅｎｅｒｉｃＳｉｍｕｌａｔｅｄＡｎｎｅａｌｅｒ ｎａｍｅ＝“ＳＡ＿ＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ”
ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ｏｎｌｙＣｏｒｅ＿ｎｏｒｅｐ” ｔｒｉａｌｓ＝“１００”
ｐｅｒｉｏｄｉｃ＿ｍｏｖｅｒ＝“ｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｗ＿ｍｉｎｉｍｉｚｅ＿ｖａｎｉｌｌａ” ｅｖａｌ＿ｐｅｒｉｏｄ＝“２０” ｈｉｓｔｏｒｙ＝“１０”
ｂｏｌｚ＿ｒａｎｋ＝“１” ｒｅｃｏｖｅｒ＿ｌｏｗ＝“１” ｐｒｅａｐｐｌｙ＝“０” ｄｒｉｆｔ＝“１”
ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ＿ｆｉｌｅ＝“ｍｃ” ｋｅｅｐ＿ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ＿ｆｉｌｅ＝“０”
ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＝“１．５” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ”
ｓｔｏｐｐｉｎｇ＿ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ＝“ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ＿ｃｈａｉｎＡ” ＞
＜Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＝０．０５ ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＝０．０５ ／＞
＜／Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜／ＧｅｎｅｒｉｃＳｉｍｕｌａｔｅｄＡｎｎｅａｌｅｒ＞
＜ＧｅｎｅｒｉｃＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ ｎａｍｅ＝“ＭＣ＿ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ”
ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｆｄｅｓｉｇｎ＿ａｌｌ＿ｅｌｅｃ”
ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ”
ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ”
ｔｒｉａｌｓ＝“３” ｐｒｅａｐｐｌｙ＝“０”
ｓｔｏｐｐｉｎｇ＿ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ＝“ａｌｌ＿ｅｎａｂｌｅｄ＿ｆｉｌｔｅｒｓ＿ｃｈａｉｎＡ” ＞
＜Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ／＞
＜ＡＮＤ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝“ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ” ｓａｍｐｌｅ＿ｔｙｐｅ＝“ｌｏｗ” ／＞
＜／Ｆｉｌｔｅｒｓ＞
＜／ＧｅｎｅｒｉｃＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ＞
＜／ＭＯＶＥＲＳ＞
＜ＡＰＰＬＹ＿ＴＯ＿ＰＯＳＥ＞
＜／ＡＰＰＬＹ＿ＴＯ＿ＰＯＳＥ＞
＜ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓａｖｅ＿ＲＭＳＤｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ＳＡ＿ＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒｍｓｄ１＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ＭＣ＿ＦａｓｔＤｅｓｉｇｎＰｒｏｔｅｉｎ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒｍｓｄ２＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｍｏｖｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｆａｓｔ＿ｒｅｌａｘ＿ｖａｎｉｌｌａ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｒｍｓｄ３＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｕｎｓａｔ＿ｃｏｒｅ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｃｏｒｅ＿ｒｅｓ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｓｓｐｒｅｄ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｅｎａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｐａｃｋｓｔａｔ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ／＞
＜Ａｄｄ ｆｉｌｔｅｒ＿ｎａｍｅ＝ｃａｖ＿ｖｏｌ＿ｃｈａｉｎＡ＿ｄｉｓａｂｌｅｄ ／＞
＜／ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ＞
＜／ＲＯＳＥＴＴＡＳＣＲＩＰＴＳ＞

【図1A】

[この文献は図面を表示できません]

【図1B】

[この文献は図面を表示できません]

【図1C】

[この文献は図面を表示できません]

【図1D】

[この文献は図面を表示できません]

【図2A】

[この文献は図面を表示できません]

【図2B】

[この文献は図面を表示できません]

【図2C】

[この文献は図面を表示できません]

【図3A】

[この文献は図面を表示できません]

【図3B】

[この文献は図面を表示できません]

【図3C】

[この文献は図面を表示できません]

【図3D】

[この文献は図面を表示できません]

【図3E】

[この文献は図面を表示できません]

【図4A】

[この文献は図面を表示できません]

【図4B】

[この文献は図面を表示できません]

【図4C】

[この文献は図面を表示できません]

【図4D】

[この文献は図面を表示できません]

【図4E】

[この文献は図面を表示できません]

【図4F】

[この文献は図面を表示できません]

【図4G】

[この文献は図面を表示できません]

【図5A】

[この文献は図面を表示できません]

【図5B】

[この文献は図面を表示できません]

【図5C】

[この文献は図面を表示できません]

【図5D】

[この文献は図面を表示できません]

【図6A】

[この文献は図面を表示できません]

【図6B】

[この文献は図面を表示できません]

【図6C】

[この文献は図面を表示できません]

【図6D】

[この文献は図面を表示できません]

【図7A】

[この文献は図面を表示できません]

【図7B】

[この文献は図面を表示できません]

【図7C】

[この文献は図面を表示できません]

【図8A】

[この文献は図面を表示できません]

【図8B】

[この文献は図面を表示できません]

【図9A】

[この文献は図面を表示できません]

【図9B】

[この文献は図面を表示できません]

【図9C】

[この文献は図面を表示できません]

【図9D】

[この文献は図面を表示できません]

【図10A】

[この文献は図面を表示できません]

【図10B】

[この文献は図面を表示できません]

【図10C】

[この文献は図面を表示できません]

【図10D】

[この文献は図面を表示できません]

【図11A】

[この文献は図面を表示できません]

【図11B】

[この文献は図面を表示できません]

【図11C】

[この文献は図面を表示できません]

【図11D】

[この文献は図面を表示できません]

【図11E】

[この文献は図面を表示できません]

【図12A】

[この文献は図面を表示できません]

【図12B】

[この文献は図面を表示できません]

【図12C】

[この文献は図面を表示できません]

【図12D】

[この文献は図面を表示できません]

【図12E】

[この文献は図面を表示できません]

【図13A】

[この文献は図面を表示できません]

【図13B】

[この文献は図面を表示できません]

【図13C】

[この文献は図面を表示できません]

【図13D】

[この文献は図面を表示できません]

【図13E】

[この文献は図面を表示できません]

【図14A】

[この文献は図面を表示できません]

【図14B】

[この文献は図面を表示できません]

【図15A】

[この文献は図面を表示できません]

【図15B】

[この文献は図面を表示できません]

【図16A】

[この文献は図面を表示できません]

【図16B】

[この文献は図面を表示できません]

【図16C】

[この文献は図面を表示できません]

【図16D】

[この文献は図面を表示できません]

【図17A】

[この文献は図面を表示できません]

【図17B】

[この文献は図面を表示できません]

【図17C】

[この文献は図面を表示できません]

【図18A】

[この文献は図面を表示できません]

【図18B】

[この文献は図面を表示できません]

【図18C】

[この文献は図面を表示できません]

【図18D】

[この文献は図面を表示できません]

【図19A】

[この文献は図面を表示できません]

【図19B】

[この文献は図面を表示できません]

【図20A】

[この文献は図面を表示できません]

【図20B】

[この文献は図面を表示できません]

【図20C】

[この文献は図面を表示できません]

【図21A】

[この文献は図面を表示できません]

【図21B】

[この文献は図面を表示できません]

【図21C】

[この文献は図面を表示できません]

【図21D】

[この文献は図面を表示できません]

【図22】

[この文献は図面を表示できません]

【図23A】

[この文献は図面を表示できません]

【図23B】

[この文献は図面を表示できません]

【図24】

[この文献は図面を表示できません]

【配列表】

2021528052000001.app

【手続補正書】

【提出日】2021年2月8日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【国際調査報告】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]