特表 2021-528973 抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-528973(P2021-528973A)

(43)【公表日】2021年10月28日

(54)【発明の名称】抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20211001BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20211001BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20211001BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20211001BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20211001BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20211001BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20211001BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20211001BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20211001BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211001BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20211001BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211001BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211001BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13

   C07K16/30ZNA

   C12N15/63 Z

   C12P21/02 C

   C07K16/46

   C07K16/28

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/12

   A61P35/00

   A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】104

(21)【出願番号】特願2020-572396(P2020-572396)

(86)(22)【出願日】2019年7月2日

(85)【翻訳文提出日】2021年2月24日

(86)【国際出願番号】US2019040296

(87)【国際公開番号】WO2020010079

(87)【国際公開日】20200109

(31)【優先権主張番号】62/800,259

(32)【優先日】2019年2月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/693,216

(32)【優先日】2018年7月2日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500203709

【氏名又は名称】アムジェン インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】510089100

【氏名又は名称】ゼンコア インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】ノーラン−ステボー，オリバー

(72)【発明者】

【氏名】リ，コン

(72)【発明者】

【氏名】ムラフスキ，クリストファー・エム

(72)【発明者】

【氏名】アルバ，ベンジャミン・エム

(72)【発明者】

【氏名】アグラマール，ニラジュ・ジャグディッシュ

(72)【発明者】

【氏名】グラハム，ケビン

(72)【発明者】

【氏名】スティーブンス，ジェニッテ・リアン

(72)【発明者】

【氏名】ムーア，グレゴリー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064BJ12

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA08

4B064CA09

4B064CA10

4B064CA11

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA05

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA86X

4B065AA87X

4B065AA87Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＳＴＥＡＰ１に結合する新規の抗原結合タンパク質及び使用方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２のＳＴＥＡＰ１に結合する抗原結合タンパク質であって、
（ａ）重鎖ＣＤＲであって、ｉ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号１４、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号１５若しくはｖｈＣＤＲ２ 配列番号２１及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号１６、又はｉｉ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号３３、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号３４及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号３５から３、２若しくは１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
（ｂ）軽鎖ＣＤＲであって、ｉ）ｖｌＣＤＲ１ 配列番号１１、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号１２及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号１３；又はｉｉ）ｖｌＣＤＲ１ 配列番号３０、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号３１及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号３２から３、２若しくは１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；又は
（ｃ）配列番号１８３又は配列番号１８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；又は
（ｄ）配列番号１８２、配列番号１８４又は配列番号１８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む抗原結合タンパク質。

【請求項2】

ＣＤＲ配列
ａ）配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１５又は配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３；又は
ｂ）配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項3】

ａ）配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３；又は
ｂ）配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３１を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ３
から選択されるＣＤＲ配列を含む、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項4】

配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、
配列番号１５又は配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２、
配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３、
配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、
配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２、及び
配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項5】

配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３１を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項6】

配列番号１８２、配列番号１８４又は配列番号１８５を含む可変重鎖ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項7】

配列番号１８３又は配列番号１８６を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項8】

配列番号１８２又は配列番号１８４を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１８３を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項9】

配列番号１８５を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１８６を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の参照抗原結合タンパク質のＳＴＥＡＰ１に対する結合をクロスブロックするか、又は請求項１〜９のいずれか一項に記載の参照抗原結合タンパク質により、ＳＴＥＡＰ１に対する結合からクロスブロックされる抗原結合タンパク質。

【請求項11】

前記クロスブロックは、表面プラズモン共鳴又はＥＬＩＳＡによって検出される、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項12】

ＳＴＥＡＰ１の細胞外ループ２に結合しない、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項13】

１０，０００より多いＳＴＥＡＰ１の表面密度を有する細胞のＴ細胞依存的な殺滅を優先的に媒介する、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項14】

アミノ酸９２〜１１８及びアミノ酸２７９〜２９０内のＳＴＥＡＰ１の領域に結合する抗原結合タンパク質。

【請求項15】

抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項16】

モノクローナル抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項17】

抗原結合抗体断片である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項18】

一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はドメイン抗体を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項19】

請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質及び生理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項20】

配列番号１８９に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１９０に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１９１に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１９２に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１９３に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１９４に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ３を含む抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含む方法。

【請求項22】

前記対象に抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質を投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

癌の治療を、それを必要とする対象において行うための医薬の調製における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用。

【請求項24】

前記医薬は、有効量の抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質と共同して有効量の前記抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質を投与するためのものである、請求項２３に記載の使用。

【請求項25】

癌の治療を、それを必要とする対象において行う際の使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。

【請求項26】

抗ＰＤ１抗原結合タンパク質とともに投与される、請求項２５に記載の使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項27】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１８９に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１９０に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１９１に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１９２に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１９３に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１９４に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ３を含む、請求項２２、２４又は２６のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項28】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項２７に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項29】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項２８に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項30】

前記抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、抗原結合抗体断片である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項31】

前記抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、抗体である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項32】

前記抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項33】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項34】

前記癌は、前立腺癌である、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項35】

前記癌は、ユーイング肉腫である、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項36】

請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の前記軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項37】

請求項３６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項38】

請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の前記軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド及び請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物。

【請求項39】

抗原結合タンパク質を作製する方法であって、宿主細胞を、請求項３６に記載のポリヌクレオチド又は請求項３８に記載の組成物と、前記軽鎖可変ドメイン及び前記重鎖可変ドメインの発現を可能にする条件下で接触させることを含む方法。

【請求項40】

請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む二重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項41】

ＳＴＥＡＰ１及びＣＤ３に結合する、請求項４０に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項42】

配列番号１７０〜１７２及び１７４〜１７６のＣＤＲ配列を含むＣＤ３結合ドメインを含む、請求項４１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項43】

ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）第１の単量体であって、
１）第１の可変重鎖ドメイン；
２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；
３）ヒトＣＤ３に結合し、且つｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを使用して共有結合されるｓｃＦｖ
を含む第１の重鎖を含む第１の単量体；
ｂ）第２の可変重鎖ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の重鎖を含む第２の単量体；及び
ｃ）可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖
を含み；
前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインは、ヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、前記第２の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインは、ヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、
（ｉ）前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、（ａ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号１４、（ｂ）ｖｈＣＤＲ２ 配列番号１５又は配列番号２１、及び（３）ｖｈＣＤＲ３ 配列番号１６から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ前記可変軽鎖ドメインは、ｖｌＣＤＲ１ 配列番号１１、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号１２及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号１３から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含むか；又は
（ｉｉ）前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、ｖｈＣＤＲ１ 配列番号３３、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号３４及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号３５から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ前記可変軽鎖ドメインは、ｖｌＣＤＲ１ 配列番号３０、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号３１及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号３２から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含むか；又は
（ｉｉｉ）前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８２又は１８４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、且つ前記可変軽鎖ドメインは、配列番号１８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むか；又は
（ｉｖ）前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、且つ前記可変軽鎖ドメインは、配列番号１８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体抗体。

【請求項44】

前記第１の単量体は、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、Ｒ２９２Ｃ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０２Ｃ、Ｅ３５７Ｑ及びＳ３６４Ｋを含み；前記第２の単量体は、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、Ｒ２９２Ｃ、Ｑ２９５Ｅ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０２Ｃ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３８４Ｄ、Ｑ４１８Ｅ及びＮ４２１Ｄを含み；且つ両方の単量体は、２３４位において欠失を含む、請求項４３に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項45】

前記ｓｃＦｖは、
（ｉ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号１７０、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号１７１及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号１７２から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖ドメイン並びにｖｌＣＤＲ１ 配列番号１７４、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号１７５及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号１７６から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖ドメイン；又は
（ｉｉ）配列番号１６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン
を含む、請求項４３又は４４に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項46】

前記ｓｃＦｖは、配列番号１７０を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１７１を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１７２を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１７４を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１７５を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１７６を含むｖｌＣＤＲ３を含むＣＤＲを含む、請求項４３又は４４に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項47】

前記ｓｃＦｖは、配列番号１６９及び配列番号１７３の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項48】

前記ｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカーを有する、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項49】

前記荷電ｓｃＦｖリンカーは、３〜８の正の電荷を有し、且つ配列番号１４３〜１５３からなる群から選択される、請求項４８に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項50】

前記ｓｃＦｖリンカーは、配列番号１５２を含む、請求項４８に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項51】

前記ｓｃＦｖは、配列番号４４の配列を含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項52】

前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、ＣＤＲ配列 配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１５又は配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３を含み、前記可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲ配列 配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３を含む、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項53】

前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、ＣＤＲ配列 配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３を含み、前記可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲ配列 配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３１を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ３を含む、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項54】

前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８２又は配列番号１８４を含み、且つ前記可変軽鎖ドメインは、配列番号１８３を含む、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項55】

前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８５を含み、且つ前記可変軽鎖ドメインは、配列番号１８６を含む、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項56】

アミノ酸置換Ｎ６７Ｑ及び／又は２９２位、２９７位若しくは３０２位の１つ以上における置換を含む、請求項５２又は５３に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項57】

ａ）前記第１の単量体は、配列番号１９又は配列番号２０の配列を含み、前記第２の単量体は、配列番号１８又は１９９の配列を含み、且つ前記共通の軽鎖は、配列番号１７の配列を含むか；又は
ｂ）前記第１の単量体は、配列番号３８の配列を含み、前記第２の単量体は、配列番号３７の配列を含み、且つ前記共通の軽鎖は、配列番号３６の配列を含む、請求項４３に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項58】

ａ）前記第１の単量体は、配列番号２０２の配列を含み、前記第２の単量体は、配列番号２０１の配列を含み、且つ前記共通の軽鎖は、配列番号２００の配列を含むか；
ｂ）前記第１の単量体は、配列番号２０７の配列を含み、前記第２の単量体は、配列番号２０３の配列を含み、且つ前記共通の軽鎖は、配列番号２００の配列を含むか；又は
ｃ）前記第１の単量体は、配列番号２０６の配列を含み、前記第２の単量体は、配列番号２０５の配列を含み、且つ前記共通の軽鎖は、配列番号２０４の配列を含む、請求項４３に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項59】

核酸組成物であって、
ａ）請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の第１の単量体をコードする第１の核酸；
ｂ）請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の第２の単量体をコードする第２の核酸、及び
ｃ）請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の共通の軽鎖をコードする第３の核酸
を含む核酸組成物。

【請求項60】

核酸組成物であって、
ａ）請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の第１の単量体をコードする第１の核酸を含む第１の発現ベクター；
ｂ）請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の第２の単量体をコードする第２の核酸を含む第２の発現ベクター；及び
ｃ）請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の共通の軽鎖をコードする第３の核酸を含む第３の発現ベクター
を含む核酸組成物。

【請求項61】

請求項５９又は６０に記載の核酸組成物を含む宿主細胞。

【請求項62】

請求項４３〜５８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体を含む医薬組成物。

【請求項63】

治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、請求項４３〜５８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体を投与することを含む方法。

【請求項64】

癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、請求項４３〜５８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体を投与することを含む方法。

【請求項65】

前記対象に抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質を投与することをさらに含む、請求項６３又は６４に記載の方法。

【請求項66】

癌の治療を、それを必要とする対象において行うための医薬の調製における、請求項４３〜５８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体の使用。

【請求項67】

前記医薬は、有効量の抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質と共同して有効量の前記ヘテロ二量体抗体を投与するためのものである、請求項６６に記載の使用。

【請求項68】

癌の治療を、それを必要とする対象において行う際の使用のための、請求項４３〜５８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。

【請求項69】

抗ＰＤ１抗原結合タンパク質とともに投与される、請求項６８に記載の使用のためのヘテロ二量体抗体。

【請求項70】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１８９に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１９０に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１９１に記載されるアミノ酸配列を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１９２に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１９３に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１９４に記載されるアミノ酸配列を含むｖｌＣＤＲ３を含む、請求項６５、６７又は６９のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項71】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項７０に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項72】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項７１に記載の方法、使用又は使用のための抗原結合タンパク質。

【請求項73】

前記抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、抗原結合抗体断片である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のためのヘテロ二量体抗体。

【請求項74】

前記抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、抗体である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のためのヘテロ二量体抗体。

【請求項75】

前記抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のためのヘテロ二量体抗体。

【請求項76】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のためのヘテロ二量体抗体。

【請求項77】

前記抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のためのヘテロ二量体抗体。

【請求項78】

前記癌は、前立腺癌である、請求項６４〜７７のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のためのヘテロ二量体抗体。

【請求項79】

前記癌は、ユーイング肉腫である、請求項６４〜７７のいずれか一項に記載の方法、使用又は使用のためのヘテロ二量体抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、前立腺の６回膜貫通上皮抗原１（ＳＴＥＡＰ１）に結合する新規の抗原結合タンパク質及びその使用を提供する。

【0002】

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６９３，２１６号明細書及び２０１９年２月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８００，２５９号明細書に対する優先権を主張し、これらの開示は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

配列表
本願は、本開示の別個の部分として、全体として参照により組み込まれるコンピューター可読形式の配列表（ファイル名：５２６０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：２９８，９１４バイト；作成日：２０１９年６月２７日）を含む。

【背景技術】

【0004】

前立腺癌は、米国における男性の中で最も一般的な癌の１つのままである。Ｕ．Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：１９９９−２０１４ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ Ｒｅｐｏｒｔ．Ａｔｌａｎｔａ（ＧＡ）：Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；２０１７。前立腺癌についての生存率は、他の癌型と比較して相対的に高いが、既存の治療選択肢は、リスク及び望まれない副作用を伴う。例えば、外科手術は、神経損傷及びインポテンスのリスクを伴い、放射線療法は、膀胱又は胃腸癌の発症リスクが増大する可能性がある。従来の化学療法は、治療中の患者の生活の質を制限する多くの副作用を伴う。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

抗体に基づく治療法は、癌及び自己免疫／炎症性障害を含む様々な疾患を治療する際に成功してきた。前立腺癌は、少なくとも部分的には、前立腺癌特異的抗原の存在のため、抗体に基づく療法に特に適していると考えられる。発癌及び潜在的なバイオマーカーの根底にある生物学的機構を解明している近年の進展にもかかわらず、前立腺癌を含む癌のための代替的な抗体に基づく治療選択肢の必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、配列番号２のＳＴＥＡＰ１に結合する抗原結合タンパク質であって、（ａ）重鎖ＣＤＲであって、ｉ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号１４、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号１５若しくはｖｈＣＤＲ２ 配列番号２１及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号１６、又はｉｉ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号３３、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号３４及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号３５から３、２若しくは１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は（ｂ）軽鎖ＣＤＲであって、ｉ）ｖｌＣＤＲ１ 配列番号１１、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号１２及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号１３；又はｉｉ）ｖｌＣＤＲ１ 配列番号３０、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号３１及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号３２から３、２若しくは１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；又は（ｃ）配列番号１８３又は配列番号１８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；又は（ｄ）配列番号１８２、配列番号１８４又は配列番号１８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１５又は配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３を含む。代わりに、抗原結合タンパク質は、配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３１を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ３を含む。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号１８２又は配列番号１８４を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１８３を含む可変軽鎖ドメインを含み；例えば、抗原結合タンパク質は、配列番号１８２を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１８３を含む可変軽鎖ドメイン又は配列番号１８４を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１８３を含む可変軽鎖ドメインを含む。代わりに、抗原結合タンパク質は、配列番号１８５を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１８６を含む可変軽鎖ドメインを含む。本開示は、配列番号２０１を含む重鎖及び配列番号２００を含む軽鎖；又は配列番号２０３を含む重鎖及び配列番号２００を含む軽鎖を含む抗原結合タンパク質をさらに提供する。

【0007】

本開示は、１）第１の単量体であって、第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；並びに３）ヒトＣＤ３に結合し、且つｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖであって、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを使用して共有結合されるｓｃＦｖを含む第１の重鎖を含む第１の単量体を含むヘテロ二量体抗体をさらに提供する。ヘテロ二量体抗体は、第２の可変重鎖ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の重鎖を含む第２の単量体；並びに可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに含む。第１の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、ヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、第２の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、ヒトＳＴＥＡＰ１に結合し、（ｉ）第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、ｖｈＣＤＲ１ 配列番号１４、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号１５又はｖｈＣＤＲ２ 配列番号２１及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号１６から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ可変軽鎖ドメインは、ｖｌＣＤＲ１ 配列番号１１、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号１２及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号１３から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含むか；又は（ｉｉ）第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、ｖｈＣＤＲ１ 配列番号３３、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号３４及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号３５から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含み、且つ可変軽鎖ドメインは、ｖｌＣＤＲ１ 配列番号３０、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号３１及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号３２から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含むか；又は（ｉｉｉ）第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８２又は配列番号１８４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号１８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むか；又は（ｉｖ）第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号１８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。様々な態様において、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、ＣＤＲ配列：配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１５又は配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３を含み；且つ可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲ配列：配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３を含む。様々な態様において、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、ＣＤＲ配列：配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３を含み；且つ可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲ配列：配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３１を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ３を含む。様々な態様において、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８２又は配列番号１８４を含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号１８３（例えば、配列番号１８２及び１８３又は配列番号１８４及び１８３）を含むか、又は第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８５を含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号１８６を含む。ｓｃＦｖは、配列番号１７０を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１７１を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１７２を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１７４を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１７５を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１７６を含むｖｌＣＤＲ３を含むＣＤＲ；又は配列番号１６９及び配列番号１７３の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含む。

【0008】

前立腺癌などの癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を投与することを含む方法も提供される。

【0009】

本明細書の節見出しの使用は、単に読解の便宜のためであり、それ自体を限定することを意図されない。本明細書全体は、統一された開示として見なされることが意図されており、本明細書に記載される特徴の全ての組合せが企図されることを理解すべきである。

【0010】

本明細書では、別段の定義がない限り、本願と関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。用語「含む」、「有する」、「包含する」及び「含有する」は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語として解釈されるべきである。本発明の態様が、特徴を「含む」と記載される場合、実施形態は、特徴「からなる」又は「から本質的になる」とも考えられる。本明細書で提供されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をさらに明らかにするものであり、別段の主張がない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。実施例又は他に記載される場合を除き、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を示す数の全ては、その用語が当業者によって解釈されるとおり、全ての場合に「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。

【0011】

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、単にその範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役割を果たすものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0012】

一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸の化学、製造、製剤化、薬理学並びに医薬の用語法及び手法は、よく知られているものであり、且つ当技術分野において一般に使用されるものである。別段の記載がない限り、本願の方法及び手法は、一般に、当技術分野においてよく知られる通常の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。酵素反応及び精製手法は、製造者の仕様書に従って実施されるか、当技術分野において一般に達成されるように実施されるか、又は本明細書に記載されるとおりに実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び製薬化学と関連して使用される専門用語、並びにそれらの実験室的な手順及び手法は、当技術分野で周知であり、且つ一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、配合及び送達並びに患者の治療に標準的な手法が使用され得る。同一性パーセントは、例えば、全体として且つ特に段落［００７５］〜［００８３］に関して参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０３４２１５５号明細書において記載される方法論を含む、当技術分野で慣例的に使用される方法論を使用して計算される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、本開示の二重特異性抗体を示す。

【図2】図２は、ヒトＣＤ３イプシロン鎖の配列を示す（配列番号１）。

【図3】図３は、ヒトＳＴＥＡＰ１の配列を示す（配列番号２）。細胞外ループの配列に下線が引かれる。

【図4-1】図４Ａ−４Ｅは、ヘテロ二量体化変異体セット（非対称及びｐＩ変異体を含む）の有用な対を示す。

【図4-2】図４Ａ−４Ｅは、ヘテロ二量体化変異体セット（非対称及びｐＩ変異体を含む）の有用な対を示す。

【図4-3】図４Ａ−４Ｅは、ヘテロ二量体化変異体セット（非対称及びｐＩ変異体を含む）の有用な対を示す。

【図4-4】図４Ａ−４Ｅは、ヘテロ二量体化変異体セット（非対称及びｐＩ変異体を含む）の有用な対を示す。

【図4-5】図４Ａ−４Ｅは、ヘテロ二量体化変異体セット（非対称及びｐＩ変異体を含む）の有用な対を示す。

【図5】図５は、等配電子変異体の抗体定常領域及びそれらの対応する置換のリストを示す。ｐＩ＿（−）は、ｐＩの低い変異体を示し、ｐＩ＿（＋）は、ｐＩの高い変異体を示す。これらは、任意選択により且つ独立して本開示のヘテロ二量体化変異体（及び同様に本明細書で概説されるとおりの他の変異体型）と組み合わせることができる。

【図6】図６は、ＦｃγＲ結合を切断する有用な切断変異体を示す（「ノックアウト」又は「ＫＯ」変異体と称される場合がある）。

【図7】図７は、本開示の２つの実施形態を記載する。

【図8-1】図８Ａ−８Ｂは、本明細書に提供される抗原結合タンパク質及びヘテロ二量体抗体形式において使用され得る荷電ｓｃＦｖリンカー及びドメインリンカーを含む有用なリンカーを示す。本開示の様々な態様において、荷電リンカーは、例えば、構成要素として１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを上げるか又は下げるのに有用である。単一の電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８）：９８９−９９５（１９９３）から「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーは、ｓｃＦｖの凝集を減少させ、且つタンパク分解安定性を高めるために使用された。

【図8-2】図８Ａ−８Ｂは、本明細書に提供される抗原結合タンパク質及びヘテロ二量体抗体形式において使用され得る荷電ｓｃＦｖリンカー及びドメインリンカーを含む有用なリンカーを示す。本開示の様々な態様において、荷電リンカーは、例えば、構成要素として１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを上げるか又は下げるのに有用である。単一の電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８）：９８９−９９５（１９９３）から「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーは、ｓｃＦｖの凝集を減少させ、且つタンパク分解安定性を高めるために使用された。

【図9】図９は、ヘテロ二量体の収量（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸによって決定される）及び熱安定性（ＤＳＣによって決定される）とともに操作されたヘテロ二量体−非対称Ｆｃ変異体のリストを示す。決定されなかった熱安定性は、「ｎ．ｄ．」によって示される。追加の情報は、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，８２２，１８６号明細書において提供される。

【図10-1】図１０Ａ−１０Ｂは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１＿Ｌ１．４ ｓｃＦｖ配列に対してなされる。アミノ酸付番は、Ｋａｂａｔ付番である。特定の可変軽鎖及び可変重鎖領域が記述される。列挙される置換は、列挙されるそれらの特異性以外の可変軽鎖及び可変重鎖領域のために利用され得る。追加の情報は、全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレットにおいて提供される。

【図10-2】図１０Ａ−１０Ｂは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１＿Ｌ１．４ ｓｃＦｖ配列に対してなされる。アミノ酸付番は、Ｋａｂａｔ付番である。特定の可変軽鎖及び可変重鎖領域が記述される。列挙される置換は、列挙されるそれらの特異性以外の可変軽鎖及び可変重鎖領域のために利用され得る。追加の情報は、全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０９１６５６号パンフレットにおいて提供される。

【図11】図１１Ａ−１１Ｂは、マウスＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−ＡｍによるＣ４−２Ｂ ｌｕｃ細胞の表面でのＳＴＥＡＰ１の特異的な検出を示す。

【図12-1】図１２Ａ−１２Ｃは、マウスＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ａｍ（図１２Ａ）；４℃で１時間Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ（●）又はＡｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１（■）（図１２Ｂ）及び抗体Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１（図１２Ｃ）を使用するＣ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞上でのＳＴＥＡＰ１の特異的な検出を示す。

【図12-2】図１２Ａ−１２Ｃは、マウスＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ａｍ（図１２Ａ）；４℃で１時間Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ（●）又はＡｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１（■）（図１２Ｂ）及び抗体Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１（図１２Ｃ）を使用するＣ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞上でのＳＴＥＡＰ１の特異的な検出を示す。

【図13】図１３は、ＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ｂｘ（Ａｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ）によるＣ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌上でのＳＴＥＡＰ１の特異的な検出を示す。

【図14】図１４Ａ−１４Ｃは、ＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ａｘ（図１４Ａ）、ＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ^２＋１（図１４Ｂ）及びＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）Ｘｍａｂ^２＋１（図１４Ｃ）は、ヒトＴ細胞によるヒト腫瘍細胞株Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃの標的細胞溶解を媒介したことを示す。

【図15】図１５は、ＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ^２＋１及びＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）Ｘｍａｂ^２＋１は、ヒトＴ細胞によるＣ４−２Ｂ ｌｕｃ ＳＴＥＡＰ１ ＫＯではなく、ヒト腫瘍細胞株Ｃ４−２Ｂの用量依存的な標的細胞溶解を媒介したことを示す。

【図16】図１６Ａ−１６Ｂは、マウスＳＴＥＡＰ１抗体Ａｂ−Ａｍは、試験される２９３Ｔ細胞によって発現されるＳＴＥＡＰ１を検出したことを示す。図１６Ｃは、ＳＴＥＡＰ１結合体Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）Ｘｍａｂ^２＋１は、親ヒト２９３Ｔ細胞株ではないヒトＳＴＥＡＰ１で安定にトランスフェクトされたヒト細胞株２９３Ｔの用量依存的な標的細胞溶解を媒介したことを示す。

【図17-1】図１７Ａは、Ａｂ−Ｂｘ（Ａｂ−Ｂ１−ＸｍＡｂ）及びＡｂ−Ｂ１ Ｘｍａｂ^２＋１は、Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞の標的細胞溶解を媒介したことを示す。図１７Ｂは、Ｘｍａｂ^２＋１ Ａｂ−Ｂ１変異体（すなわちＡｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ、Ａｂ−Ｂ１−Ｓ３９Ａ及びＡｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ／Ｓ３９Ａ）は、Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞の標的細胞溶解を媒介したことを示す。

【図17-2】図１７Ｃは、Ｘｍａｂ^２＋１ Ａｂ−Ｂ１変異体（すなわちＡｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ、Ａｂ−Ｂ１−Ｓ３９Ａ及びＡｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ／Ｓ３９Ａ）は、Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ ＳＴＥＡＰ１ノックアウト前立腺癌細胞の標的細胞溶解を媒介しなかったことを示す。

【図18-1】図１８Ａ−１８Ｉは、抗原結合タンパク質のいくつかの形式：「ボトルオープナー」形式、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、中央−Ｆｖ、１アーム中央ｓｃＦｖ、１ ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ及び二重ｓｃＦｖを示す。示されるｓｃＦｖドメインの全てに関して、それらは、ＮからＣ末端まで可変重−（任意選択のリンカー）−可変軽又はその逆であり得る。加えて、１アームｓｃＦｖ−ｍＡｂに関して、ｓｃＦｖは、重鎖単量体のＮ末端又は軽鎖のＮ末端のいずれかに結合され得る。

【図18-2】図１８Ａ−１８Ｉは、抗原結合タンパク質のいくつかの形式：「ボトルオープナー」形式、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、中央−Ｆｖ、１アーム中央ｓｃＦｖ、１ ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ及び二重ｓｃＦｖを示す。示されるｓｃＦｖドメインの全てに関して、それらは、ＮからＣ末端まで可変重−（任意選択のリンカー）−可変軽又はその逆であり得る。加えて、１アームｓｃＦｖ−ｍＡｂに関して、ｓｃＦｖは、重鎖単量体のＮ末端又は軽鎖のＮ末端のいずれかに結合され得る。

【図19-1】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-2】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-3】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-4】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-5】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-6】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-7】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-8】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-9】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-10】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-11】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-12】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-13】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-14】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-15】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-16】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-17】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-18】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-19】図１９は、本開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図19-20】本 図１９は、開示のＣＤＲ、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖ、リンカー配列及び単量体配列の配列を提供する。可変領域配列における下線は、ＣＤＲ配列を意味する。

【図20】図２０Ａ−２０Ｂは、実施例９において記載されるＴ細胞依存性の細胞障害性アッセイの結果を示す。図２０Ａは、１つの代表的なＴ細胞ドナーにおけるＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１単独（白丸）及び抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１（黒丸）によって媒介される特異的な細胞障害性（％）を示すグラフである（ｙ軸＝Ｌｏｇ（ｐＭ））。図２０Ｂは、４つの異なるＴ細胞ドナーからのＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１単独（左）及び抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１のＥＣ５０（ｐＭ）を示す。

【図21】図２１Ａ−２１Ｃは、様々な量のＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１に暴露された総Ｔ細胞（図２１Ａ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図２１Ｂ）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図２１Ｃ）におけるＰＤ−１発現（％ＣＤ３＋）を示す線グラフである。グラフにおける丸及び四角は、Ｔ細胞の異なるドナーを意味する。ＰＤ−１発現は、本開示のヘテロ二量体抗体に暴露されたＴ細胞において増加する。

【図22】図２２は、経時的な（試験の日数、ｘ軸）腫瘍体積（ｍｍ^３；ｙ軸）を示す線グラフである。ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（５×１０^６細胞／マウス）は、１日目に雌致死量以下照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側側腹部に皮下注射された。８日目に、ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞（２×１０^７細胞／マウス）は、群１を除いて全ての動物の腹膜腔に注射された。溶媒（群１及び２）又は１．０、０．１若しくは０．０１ｍｇ／ｋｇ（それぞれ群３、４、５）の用量レベルのＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋は、１２、１９及び２６日目（グラフの上部の矢印）に静脈内ボーラス注射によって投与された。腫瘍体積は、電子キャリパーを使用して３回／週測定された。群平均腫瘍体積［ｍｍ^３］＋／−ＳＥＭが示される。図におけるアスタリスクは、溶媒（群２）とＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋治療群との間の統計的有意差（一方向ＡＮＯＶＡ；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）を意味する。

【図23】図２３は、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫腫瘍体積の平均及び中央値である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

ＳＴＥＡＰ１は、３つの細胞外ループ及び２つの細胞内ループをもたらす６つの膜貫通ドメインを含む３３９アミノ酸のタンパク質である。ヒトＳＴＥＡＰ１のアミノ酸配列は、配列番号２として本明細書に記載される。細胞外ループの推定される位置は、アミノ酸９２〜１１８（細胞外ループ１）、アミノ酸１８５〜２１７（細胞外ループ２）及びアミノ酸２７９〜２９０（細胞外ループ３）である。ＳＴＥＡＰ１は、正常組織と比較して前立腺癌において差次的に発現され、骨及びリンパ節前立腺癌転移巣における発現の増加が原発性前立腺癌試料と比較して観察された。ＳＴＥＡＰ１は、例えば、Ｔ細胞依存性の細胞傷害活性又は前立腺癌細胞のリダイレクト溶解を誘発するための二重特異性抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３ Ｔ細胞リクルート抗体など、診断及び抗体に基づく治療薬のための理想的な標的となる。本開示は、本明細書にさらに記載されるとおり、ＳＴＥＡＰ１に結合する抗原結合タンパク質を提供する。

【0015】

抗原結合タンパク質
「抗原結合タンパク質」は、指定された標的抗原（ＳＴＥＡＰ１など）に結合する部分を含むタンパク質である。抗原結合タンパク質は、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する立体構造をとることを可能にする骨格又はフレームワーク部分を含む。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、抗体若しくは免疫グロブリン（例えば、ヘテロ二量体及び／又は二重特異性抗体）、又は抗原結合抗体断片、又は抗体タンパク質生成物である。

【0016】

用語「抗体」は、インタクトな抗原結合免疫グロブリンを指す。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体であり得る。様々な実施形態において、インタクトな抗体は、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ形式において、可変領域は、一般に、約１００〜１１０以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、抗原認識に主に関与し、且つ異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に変動する。可変領域は、通常、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３も参照されたい）、それらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれ；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７、前掲も参照されたい）内にある。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員することを可能にする。

【0017】

様々な態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。ある種の態様では、抗体は、ヒト抗体である。ある種の態様では、抗体（又は他の抗原結合タンパク質）は、キメラであるか又はヒト化されている。用語「キメラ」は、２つ以上の異なる抗体に由来するドメインを含有する抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、１つの種に由来する定常ドメイン及び第２の種に由来する可変ドメインを含有することができるか、又はより一般的には少なくとも２つの種に由来する一続きのアミノ酸配列を含有することができる。「キメラ」及び「ヒト化」の両方は、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせる抗原結合タンパク質を指す場合が多い。キメラ抗体は、同じ種内の２つ以上の異なる抗体のドメインを含有することもできる。一実施形態では、キメラ抗体は、ＣＤＲ移植抗体である。

【0018】

用語「ヒト化」は、抗原結合タンパク質に関して使用される場合、元の供給源の抗体よりも真のヒト抗体に類似した構造及び免疫機能を有するように操作された、非ヒト供給源に由来するＣＤＲ領域を少なくとも有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体などの非ヒト抗体に由来するＣＤＲをヒトフレームワーク領域に移植することを伴い得る。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体の全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、又はそのＣＤＲの範囲内を除いてそのような抗体と同一である。一部又は全てが非ヒト生物に起源を有する核酸によってコードされるＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植されて抗体を生成し、その特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。そのような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６において記載されており、これらは、全て全体として参照により組み込まれる。対応するドナー残基に対して選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰変異」は、初期移植コンストラクトにおいて失われる親和性を回復するために利用されることが多い（例えば、全てが全体として参照により組み込まれる米国特許第５５３０１０１号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６１号明細書；同第５６９３７６２号明細書；同第６１８０３７０号明細書；同第５８５９２０５号明細書；同第５８２１３３７号明細書；同第６０５４２９７号明細書；及び同第６４０７２１３号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も最適に含み、これは、通常、ヒト免疫グロブリンのものであり、したがって、通常、ヒトＦｃ領域を含むことになる。

【0019】

キメラ抗体、ヒト化抗体を作製し、且つ非ヒト抗体を再構築するための様々な技術及び方法は、当技術分野でよく知られる。全てが全体として参照により組み込まれるＴｓｕｒｕｓｈｉｔａ＆Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）及びその中で引用される参考文献；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８６：１００２９−３３；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９；Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４１８１−４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２１−８、米国特許出願公開第２００３００３９６４９号明細書；米国特許第５，８６９，６１９号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書、同第５，８２１，３３７号明細書、同第５，８５９，２０５号明細書；Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−３９；及びＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１４３２−４１を参照されたい。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減するヒト化又は他の方法は、例えば、全体として参照により組み込まれるＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９−９７３において記載されるとおりのリサーフェシング方法を含み得る。親抗体は、親和性成熟され得、これは、当技術分野でよく理解されている。構造に基づく方法は、例えば、米国特許出願公開第２００６０００８８８３号明細書において記載されるとおり、ヒト化及び親和性成熟のために利用され得る。選択に基づく方法は、抗体可変領域をヒト化し且つ／又は親和性成熟させるために利用され得、全てが全体として参照により組み込まれるＷｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１０）：７５３−７５９において記載される方法を含むが、これらに限定されない。ヒト化は、ヒト配列により類似した非ヒト配列を作製するアミノ酸置換を選択することも含み得る。他のヒト化方法は、ＣＤＲの部分のみを移植することを含み得、全てが全体として参照により組み込まれるＴａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５；Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４において記載される方法を含むが、これらに限定されない。

【0020】

他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗原結合抗体断片、すなわち抗体の軽鎖の部分若しくは全て及び／又は抗体の重鎖の部分若しくは全てを欠く抗体の断片である。抗体断片は、組換えにより生成され得るか、又は例えばパパイン及びペプシンなどの酵素を使用してインタクト抗体を切断することによって作製され得る。パパインは、抗体を切断して２個のＦａｂ断片及び１個のＦｃ断片をもたらす。ペプシンは、抗体を切断してＦ（ａｂ’）_２断片及びｐＦｃ’断片をもたらす。例示的な場合において、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）_２断片である。Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価断片である。Ｆａｂは、単離におけるこの領域又は完全長抗体、抗体断片などに関連して、この領域を指し得る。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片である。

【0021】

抗体の構造は、少なくとも約１２〜１５０ｋＤａの分子量範囲に及び、且つ単量体（ｎ＝１）〜二量体（ｎ＝２）、三量体（ｎ＝３）、四量体（ｎ＝４）、また場合によりさらに高次の価数（ｎ）範囲を有する広範な代替形態を創出するために利用されており；このような代替形態は、本明細書では「抗体タンパク質生成物」と称され、抗原結合タンパク質の例である。抗体タンパク質生成物としては、完全な抗体構造に基づくもの及び完全な抗原結合能力を保持する抗体断片を模倣するもの、例えばｓｃＦｖ及びＶＨＨ／ＶＨ（後述）が挙げられる。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がリンカー（例えば、通常約１５アミノ酸長のアミノ酸残基の合成配列）を介して結合されて、連続的なタンパク質鎖を形成する抗体であり、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体折り畳まれ、且つ一価抗原結合部位を形成することを可能にするのに十分な長さである（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照されたい）。

【0022】

完全な抗原結合部位を保持する抗原結合断片は、全体的に可変（Ｖ）領域（単一抗体のＶＬ及びＶＨドメイン）からなるＦｖ断片である。分子の安定性のためにｓｃＦｖ（一本鎖断片可変）断片にＶ領域を連結するため、多くの場合、可溶性の柔軟性のあるアミノ酸ペプチドリンカーを使用するか、又は定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に付加してＦａｂ断片（断片、抗原結合）を生成する。ｓｃＦｖ及びＦａｂ断片は、宿主細胞、例えば原核又は真核の宿主細胞で容易に産生され得る。他の抗体タンパク質生成物としては、ジスルフィド結合安定化ｓｃＦｖ（ｄｓ−ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン又はＶＨ若しくはＶＬドメインの抗原結合断片を含むペプチド）、Ｆｄ断片（ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む）を含むペプチド、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片並びにダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディのような二量体及び多量体抗体形式又はオリゴマー化ドメインに連結されたｓｃＦｖからなる異なる形式を含むミニボディ（ｍｉｎｉＡｂ）が挙げられる。最小断片は、ラクダ科動物重鎖ＡｂのＶＨＨ／ＶＨ及び単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）である。ペプチボディ又はペプチド−Ｆｃ融合体は、さらに別の抗体タンパク質生成物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメイン上に移植された生物学的に活性のあるペプチドからなる。ペプチボディは、当技術分野でさらに記載されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６−５９１（２０１２）を参照されたい。

【0023】

代わりに、抗体タンパク質生成物は、例えば、移植されたＣＤＲ又はＣＤＲ誘導体を有する代替のタンパク質骨格又は人工の骨格を含み得る。そのような骨格としては、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入される変異を含む抗体に由来する骨格及び例えば生体適合性ポリマーを含む完全に合成的な骨格が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ５３，Ｉｓｓｕｅ １：１２１−１２９；Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４を参照されたい。加えて、骨格として、フィブロネクチン成分を利用する抗体模倣物に基づく骨格だけでなく、ペプチド抗体模倣物（「ＰＡＭ」）が使用され得る。

【0024】

様々な態様において、抗原結合タンパク質は、ｉ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号１４、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号１５若しくはｖｈＣＤＲ２ 配列番号２１及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号１６、又はｉｉ）ｖｈＣＤＲ１ 配列番号３３、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号３４及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号３５から３、２若しくは１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；並びに／又はｉ）ｖｌＣＤＲ１ 配列番号１１、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号１２及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号１３；又はｉｉ）ｖｌＣＤＲ１ 配列番号３０、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号３１及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号３２から３、２若しくは１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む。各々のそのような配列の相違は、独立して、欠失、挿入又は置換のいずれかであるが、置換（例えば、保存的置換）が好ましい。保存的置換の例としては、以下の群内での交換が挙げられるが、これらに限定されない：小さい脂肪族の非極性又はわずかに極性の残基、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；極性、負に荷電した残基及びそれらのアミド及びエステル、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；極性、正に荷電した残基、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）；大きい脂肪族の非極性残基、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン；及び大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。

【0025】

様々な態様において、抗原結合タンパク質は、以下のＣＤＲ配列を含む：ａ）配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１５若しくは配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３、又はｂ）配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３。代わりに又は加えて、抗原結合タンパク質は、以下のＣＤＲ配列を含む：ａ）配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３、又はｂ）配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３３を含むｖｌＣＤＲ３。

【0026】

したがって、様々な態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１５又は配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３を含む。代替的な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３１を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ３を含む。

【0027】

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１８３若しくは配列番号１８６と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；及び／又は配列番号１８２、配列番号１８４若しくは配列番号１８５と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。例えば、抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１８３及び配列番号１８２、（ｉｉ）配列番号１８４及び配列番号１８３、又は（ｉｉｉ）配列番号１８５及び配列番号１８６を含み得る。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個の残基でのみ前述のアミノ酸配列と異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み、各々のそのような配列の相違は、独立して、欠失、挿入又は置換（例えば、保存的置換）のいずれかである。様々な態様において、配列の相違は、ＣＤＲの外部（例えば、フレームワーク領域内）に位置する。

【0028】

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１７若しくは配列番号３６と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖；及び／又は配列番号１８、配列番号１９９若しくは配列番号３７と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。例えば、抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１７及び配列番号１８；（ｉｉ）配列番号１７及び配列番号１９９；又は（ｉｉｉ）配列番号３６及び配列番号３７を含み得る。

【0029】

様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号２００若しくは配列番号２０４と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖；及び／又は配列番号２０１、配列番号２０３若しくは配列番号２０５と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。例えば、抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号２００及び配列番号２０１；（ｉｉ）配列番号２００又は配列番号２０３；（ｉｉｉ）配列番号２０４及び配列番号２０５を含み得る。

【0030】

競合、エピトープ、結合親和性
抗原結合タンパク質は、配列番号２のＳＴＥＡＰ１に結合する。特異的な結合（すなわち非特異的な相互作用と測定できるほど異なるＳＴＥＡＰ１への結合）は、例えば、一般的に結合活性を有しない類似構造の分子である対照分子の結合と比較して分子の結合を測定することによって測定され得る。例えば、特異的な結合は、標的に類似する対照分子との競合により測定され得る。

【0031】

ＳＴＥＡＰ１への抗原結合タンパク質の結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）の点から記載され得る。例示的な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫｄは、マイクロモル、ナノモル、ピコモル又はフェムトモルである。通常、抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、標的抗原又はエピトープに対して対照分子の２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍以上であるＫｄを有することになる。また、特定の抗原に対する特異的な結合は、例えば、対照と比較してエピトープに関して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍以上の抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体によって示され得、ここで、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を指す。例示的な態様では、ＳＴＥＡＰ１に関して本明細書に提供される抗原結合タンパク質のＫＤは、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下又は１０^−１２Ｍ以下である。例えば、抗原結合タンパク質のＫＤは、任意選択により、約１０^−４〜１０^−６Ｍ、又は約１０^−７〜１０^−９Ｍ、又は約１０^−１０〜１０^−１２Ｍ、又は約１０^−７〜１０^−１２、又は約１０^−９〜１０^−１２、又は約１０^−１３〜１０^−１５Ｍの範囲内である。代わりに（又は加えて）、抗原結合タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１からの低い解離速度を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、１×１０^−４ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆを有する。別の実施形態では、Ｋ_ｏｆｆは、５×１０^−５ｓ^−１以下である。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、高レベルのＳＴＥＡＰ１を発現する標的細胞と、より少なくＳＴＥＡＰ１を示すそれらのオフターゲット細胞との間で差異化する。例えば、様々な態様において、抗原結合タンパク質は、１細胞当たり約１００，０００個より多いＳＴＥＡＰ受容体（例えば、１細胞当たり約２００，０００個のＳＴＥＡＰ１受容体）〜１細胞当たり約１０，０００個のＳＴＥＡＰ１受容体を含む細胞に優先的に結合する。ＳＴＥＡＰ１に関連する競合、結合親和性及び結合特異性に関する本開示は、第２若しくは第３の抗原（例えば、ＣＤ３）への多特異性の抗原結合タンパク質の結合又は抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質と組み合わせて使用される異なる抗体にも適用されることが理解されるであろう。例えば、例示的な態様では、ＣＤ３（又は下記のとおりのＰＤ−１）に関して本明細書に提供される抗原結合タンパク質のＫｄは、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下又は１０^−１２Ｍ以下である。例えば、抗原結合タンパク質のＫｄは、任意選択により、約１０^−４〜１０^−６Ｍ、又は約１０^−７〜１０^−９Ｍ、又は約１０^−１０〜１０^−１２Ｍ、又は約１０^−７〜１０^−１２、又は約１０^−９〜１０^−１２、又は約１０^−１３〜１０^−１５Ｍの範囲内である。代わりに（又は加えて）、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３からの低い解離速度を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、１×１０^−４ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆを有する。別の実施形態では、Ｋ_ｏｆｆは、ＣＤ３に関して５×１０^−５ｓ^−１以下である。

【0032】

本開示は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載されるとおりのＸｍＡｂ^２＋１形式において含むＡｂ−Ａ、Ａｂ−Ａ１、Ａｂ−Ａ２、Ａｂ−Ｂ又はＡｂ−Ｂ１）のいずれかによるＳＴＥＡＰ１への結合に関して競合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）をさらに提供する。換言すると、本開示は、本明細書に記載される参照抗原結合タンパク質のＳＴＥＡＰ１への結合をクロスブロックするか、又は参照抗原結合タンパク質により、ＳＴＥＡＰ１への結合からクロスブロックされる抗原結合タンパク質を提供する。「競合する」は、１つの抗原結合タンパク質がＳＴＥＡＰ１への参照抗原結合タンパク質の結合を妨げるか、低減するか又は阻害することを意味する。多くの種類の競合結合アッセイを使用することができ、例えば表面プラズモン共鳴、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３を参照されたい）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照されたい）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；１−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２を参照されたい）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）がある。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面に結合されるか又は細胞上に暴露される精製抗原、非標識試験抗原結合タンパク質及び標識参照抗原結合タンパク質の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイ（抗原結合タンパク質を競合させる）によって同定される抗原結合タンパク質としては、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープ、参照抗原結合タンパク質によって認識されるエピトープと重複するエピトープ及び重複しないが、試験抗原結合タンパク質と参照抗原結合タンパク質との間に生じる立体障害を可能にするエピトープに結合する抗原結合タンパク質が挙げられる。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在すると、それは、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の結合を少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害することになる。いくつかの場合、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。少なくとも１つの態様では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、ＳＴＥＡＰ１への参照抗原結合タンパク質の結合が少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少されるように、参照抗原結合タンパク質（例えば、任意選択により、実施例において記載される二重特異性抗体形式などの二重特異性抗体形式（例えば、ＸｍＡｂ^２＋１）において、本明細書に記載されるＡｂ−Ａ、Ａｂ−Ａ１、Ａｂ−Ａ２、Ａｂ−Ｂ又はＡｂ−Ｂ１）と競合する。

【0033】

抗原結合タンパク質は、配列番号２のＳＴＥＡＰ１に結合する。競合（又はクロスブロッキング）抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質によって認識されるエピトープと重複するエピトープ又は重複しないが、試験抗原結合タンパク質と参照抗原結合タンパク質との間に生じる立体障害を可能にするエピトープに結合し得る。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるＡｂ−Ａ、Ａｂ−Ａ１、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）、Ａｂ−Ｂ若しくはＡｂ−Ｂ１又はその二重特異性若しくはヘテロ二量体のバージョン（例えば、Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１又はＡｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ^２＋１）などの参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する。例えば、本開示の抗原結合タンパク質は、任意選択により、第２の細胞外ループの外側の領域でＳＴＥＡＰ１に結合する。抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの実施形態において、アミノ酸９２〜１１８（細胞外ループ１）及び／又はアミノ酸２７９〜２９０（細胞外ループ３）内にあるＳＴＥＡＰ１の領域に結合する。様々な態様において、本開示は、アミノ酸９２〜１１８及びアミノ酸２７９〜２９０内のＳＴＥＡＰ１の領域に結合する抗原結合タンパク質を提供する。また、任意選択により、抗原結合タンパク質は、ＳＴＥＡＰ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｎｏ．Ｑ８ＮＦＴ２；配列番号１７７）に結合しない。必要に応じて、参照抗原結合タンパク質及び／又は試験される抗原結合タンパク質のエピトープは、ＳＴＥＡＰ１又はその部分に結合された抗原結合タンパク質のＸ線血漿構造を解析することによって決定され得る。そのような一実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質（参照又は試験）がそれに結合される場合、結合していない場合と比較して少なくとも１０％の溶媒への接近性の低下を示すＳＴＥＡＰ１の細胞外部分上のそれらの残基として定義される。

【0034】

抗原結合タンパク質を作製する方法
抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗原結合抗体断片及び抗体タンパク質生成物）を作製する好適な方法は、当技術分野で知られる。例えば、抗体を生成するための標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）において記載されている。ＥＢＶ−ハイブリドーマ法及びバクテリオファージベクター発現系は、例えば、Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１−６７（１９８４）、Ｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０−６７（１９８６）及びＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）において記載されている。非ヒト動物において抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，７１４，３５２号明細書及び同第５，８１４，３１８号明細書；並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号明細書（全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。ある種の態様では、ＳＴＥＡＰ１に結合する組換え抗原結合タンパク質が提供される。これに関連して、「組換えタンパク質」は、組換え手法を用いて、例えば組換え核酸の発現によって作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の産生のための方法及び技術は、当技術分野においてよく知られている。

【0035】

結合部位におけるＣＤＲの分子進化も、親和性が増大した抗原結合タンパク質（例えば、抗体）、例えばＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１によって記載されるとおりのｃ−ｅｒｂＢ−２に対する親和性の増大を有する抗体を生成するために使用されてきた。そのような技術は、抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質（又は本明細書に記載される他の抗原結合タンパク質）を調製するのに有用である。

【0036】

ＳＴＥＡＰ１などの抗原に結合する能力に関して抗原結合タンパク質を試験する方法は、当技術分野において知られており、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））及び競合的阻害アッセイ（例えば、全てが全体として且つ特に競合アッセイに関して参照により本明細書に組み込まれるＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，下記；米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号明細書；及び米国特許第７，８７２，１０６号明細書を参照されたい）を含む。実際に、抗原又はそのエピトープへの結合に関して第２の抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質の能力を試験するアッセイは、当技術分野において知られており、且つ例えばＳＴＥＡＰ１に結合する抗体の能力を試験するために使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１７８９０５号明細書、Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４６：１６８−１７１（２０１７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２５：８９−９１（２０１７）；及びＧｏｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２９（２）：２５０−２５３（２０１７）を参照されたい。表面プラズモン共鳴を、抗原結合タンパク質及び第２の抗原結合タンパク質の結合定数を決定するために使用することができ、２つの結合定数が比較され得る。

【0037】

多重特異性抗原結合タンパク質
抗体技術において進行中の問題は、一般に異なる抗原を近接させることができ、且つ新規の機能性及び新規の療法をもたらす、２つ（以上）の異なる抗原に同時に結合する二重特異性（及び／又は多重特異性）抗体についての要望である。本開示は、ＳＴＥＡＰ１及び１つ以上の追加の標的抗原に結合する新規の多重特異性抗原結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本開示は、上記のとおりの抗ＳＴＥＡＰ１結合ドメイン及び第２の標的抗原（異なるＳＴＥＡＰ１エピトープであり得るが、一般に異なる抗原である）に結合する結合領域を含む新規の二重特異性抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）を提供する。様々な態様において、第２の抗原は、エフェクター細胞、すなわち１つ以上のＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）を発現し、且つ抗体のＦｃ領域に起因する１つ以上のエフェクター機能を遂行する白血球上に存在する細胞表面分子である。

【0038】

エフェクター機能の例としては、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシス、細胞表面受容体の下方制御及びＢ細胞活性化が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＤＣＣに関与するエフェクター細胞の例としては、細胞傷害性Ｔ細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球及び好中球が挙げられるが、これらに限定されない。様々な態様において、本開示は、ＣＤ３（例えば、配列番号１）及びＳＴＥＡＰ１（配列番号２）の両方に結合する二重特異性抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）を提供する。様々な態様において、本開示は、ＣＤ３並びにＳＴＥＡＰ１の細胞外ループ１及び３の両方に結合する二重特異性抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）を提供する。

【0039】

様々な態様において、二重特異性抗原結合タンパク質は、高レベルのＳＴＥＡＰ１を発現する標的細胞と、より少なくＳＴＥＡＰ１を示すそれらのオフターゲット細胞との間で差異化する。この点に関して、いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体抗体）は、腫瘍細胞のＴ細胞依存的な殺滅を優先的に媒介することができ、低減した「オフターゲット」効果を示す。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載されるＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質及びＣＤ３抗原結合領域を含む二重特異性抗体は、１０，０００より多いＳＴＥＡＰ１の表面密度を有する細胞のＴ細胞依存的な殺滅を優先的に媒介する（例えば、ＥＣ９０は、１０，０００未満のＳＴＥＡＰ１の表面密度を有する細胞と比較して、１０，０００より多いＳＴＥＡＰ１の表面密度を有する細胞に関して少なくとも１０倍少ない）。

【0040】

本開示は、ＣＤＲ並びに完全な可変軽鎖及び重鎖のセットを含む新規の抗ＣＤ３配列を含む二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、二重特異性コンストラクトのＣＤ３結合ドメイン（任意選択により下記のとおりのｓｃＦｖ）は、ｖｈＣＤＲ１ 配列番号１７０、ｖｈＣＤＲ２ 配列番号１７１及びｖｈＣＤＲ３ 配列番号１７２から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む可変重鎖ドメイン並びにｖｌＣＤＲ１ 配列番号１７４、ｖｌＣＤＲ２ 配列番号１７５及びｖｌＣＤＲ３ 配列番号１７６から３、２又は１個以下のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む可変軽鎖ドメインを含む。例えば、本開示は、配列番号１６９と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン及び配列番号１７３と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％同一又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む多重特異性（例えば、二重特異性）コンストラクトを提供する。

【0041】

例えば、抗ＣＤ３部分は、任意選択により、ＣＤＲ配列 配列番号１７０を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１７１を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１７２を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１７４を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１７５を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１７６を含むｖｌＣＤＲ３を含む。この点に関して、ＣＤ３結合領域は、任意選択により、配列番号１６９の可変重鎖領域及び配列番号１７３の可変軽鎖領域を含む。

【0042】

二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるＳＴＥＡＰ１及びＣＤ３結合ドメインなどの２つの抗原結合ドメイン（例えば、各抗原は、一価で結合される）又は３つ（以上）の抗原結合ドメイン（例えば、一方の抗原は、二価で結合され、且つ他方は、一価で結合される）を含み得る。二重特異性抗体としては、従来型の二重特異性免疫グロブリン（例えば、ＢｓＩｇＧ）、付加された抗原結合ドメイン（例えば、軽鎖又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端が、単一ドメイン抗体又は対になった抗体可変ドメイン（例えば、Ｆｖ又はｓｃＦｖ）などの追加の抗原結合ドメインに連結される）を含むＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片（例えば、二重特異性一本鎖抗体）、二重特異性融合タンパク質（例えば、エフェクター部分に融合された抗原結合ドメイン）及びＢｓＡｂコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、様々な二重特異性形式を記載し、且つ参照により本明細書に組み込まれるＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７−１０６（２０１５）を参照されたい。二重特異性コンストラクトの例としては、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ及びＦａｂ_２二重特異物並びに完全長抗体を含む操作されたコンストラクトが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、全てが明示的に本明細書に組み込まれるＣｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ １［６］：１−９；及びＨｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３［９］：１１２６−１１３６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５［１１］：１２９０−１２９７；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ １［２］：１２８−１４１；国際公開第２００９０３２７８２号パンフレット及び国際公開第２００６０２０２５８号パンフレット；Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３［５］：３６１−３６７；米国特許出願公開第２００２０１０３３４５号明細書；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２；並びにＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２ ＭＡｂｓ ４（２）：１８２を参照されたい。

【0043】

様々な態様において、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性一本鎖抗体（ＢｉＳｃＦｖ）である。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、任意選択によりリンカーを介して類似の構造の第２の抗原結合ドメインに連結された第１の抗原結合ドメインとして互いに一本鎖として連結される。リンカーが使用される場合、そのリンカーは、好ましくは、第１及び第２の抗原結合ドメインの各々が、互いに独立して、それらの差異のある結合特異性を保持し得ることを確実にするのに十分な長さ及び配列である。二重特異性一本鎖分子は、当技術分野において知られ、全てが全体として参照により組み込まれる米国特許第７６３５４７２号明細書、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット；Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０；Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５；Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７；Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３；Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６；及びＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６においてさらに記載されている。

【0044】

代替の二重特異性抗原結合形式は、例えば、本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５４１５１号明細書に記載されている。例えば、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ抗体がＣ末端でＦｖ断片と融合されているｍＡｂ−Ｆｖ形式を含み得る。代わりに、ＩｇＧ抗体がＣ末端でＦａｂと融合されているｍＡｂ−Ｆａｂ形式が使用され得る。ｍＡｂ−Ｆａｂコンストラクトは、ＣＨ及びＣＬ定常ドメインＣ末端を含有するが、ｍＡｂ−Ｆｖは、Ｃ末端Ｆｖ融合体にそれらを含有しない。米国特許出願公開第２０１１／００５４１５１号明細書の図８を参照されたい。任意選択により、ｍＡｂ−Ｆｖ及びｍＡｂ−ＦａｂコンストラクトのＮ末端結合領域は、軽鎖及びＣＨ１ドメインを欠く（すなわち単一ドメインＶＨＨ領域を含む）。ｍＡｂ−Ｆｖ及びｍＡｂ−Ｆａｂコンストラクトは、３つの可変領域を含有し、その結果、それらは、第１の抗原に二価で結合し、且つ第２の抗原に一価で結合する。好適な二重特異性抗原結合形式には、米国特許出願公開第２０１１／００５４１５１号明細書に記載されるＦａｂ−Ｆｖ及びＦａｂ−Ｆａｂコンストラクトも含まれる。Ｆａｂ−Ｆｖ及びＦａｂ−Ｆａｂ免疫グロブリンは、第１の抗原に結合するＮ末端Ｆａｂ断片を含み、Ｃ末端Ｆｖ又はＦａｂ断片は、第２の抗原に結合する。

【0045】

一態様では、本開示は、ヘテロ二量体化形成を促進し、且つ／又はホモ二量体よりヘテロ二量体の精製を容易にすることを可能にするために、抗原をともに結合し、且つ各鎖上で異なる定常領域におけるアミノ酸変異体に依拠するヘテロ二量体抗体の生成に関する。一般に、二重特異性抗体は、宿主細胞に各重鎖及び軽鎖に関する遺伝子を含むことによって作製される。これは、一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）及び２つのホモ二量体（Ａ−Ａ及びＢ−Ｂ）の形成をもたらす。しかしながら、二重特異性抗体の形成における主な障壁は、ホモ二量体抗体からヘテロ二量体抗体を精製すること及び／又はホモ二量体の形成よりヘテロ二量体の形成に偏らせることの困難さである。

【0046】

本開示は、以前の技術に関連する問題を克服するヘテロ二量体抗体を提供する。さらに、ＳＴＥＡＰ１／ＣＤ３二重特異性抗原結合タンパク質に関連して、本開示のヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３の一価の結合を可能にする。Ｔ細胞のＣＤ３活性化は、その関連するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、高い親和性の細胞間の接合部において抗原提示細胞上で抗原負荷ＭＨＣと結合する場合にのみ生じる（Ｋｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４：１３３−１３９）。抗ＣＤ３抗体を使用する非特異的なＣＤ３の二価の架橋は、サイトカインストーム及び毒性を誘発する（Ｐｅｒｒｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３［２］：９５３−６１；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ＆Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７：６２２−６３２；参照により明示的に組み込まれる）。したがって、実際的な臨床使用に関して、標的細胞のリダイレクトされた殺滅のためのＣＤ３共結合の好ましい様式は、共結合された標的との結合時にのみ活性化をもたらす一価の結合である。したがって、一実施形態では、本開示のヘテロ二量体抗体は、効率的な抗体産生をもたらす形式におけるＣＤ３への一価の結合及びＳＴＥＡＰ１への二価の結合の利点を提供する。

【0047】

一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を有する１つの重鎖及び「通常の」Ｆａｂ形式における第２の重鎖を含む、すなわち可変重鎖及び軽鎖を含む例示的なヘテロ二量体抗体形式である。換言すると、ヘテロ二量体抗体は、ａ）第１の可変Ｆｃドメイン及び第１の抗原（任意選択によりＣＤ３）に結合する一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を含む第１の重鎖；ｂ）第２の可変Ｆｃドメイン及び第１の可変重鎖ドメインを含む第２の重鎖；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び第１の定常軽鎖ドメインを含む第１の軽鎖を含み、第１の可変重鎖ドメイン及び第１の可変軽鎖ドメインは、第２の抗原（任意選択によりＳＴＥＡＰ１）に結合する。説明するために、コンストラクトは、ｓｃＦｖ領域−ドメインリンカー−Ｆｃドメインを有する１つの単量体及びＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３と関連する軽鎖を有する第２の単量体を含み、任意選択により、立体及びｐＩ変異体、Ｆｃ及びＦｃＲｎ変異体並びにこれらの領域に含まれる追加の抗原結合ドメイン（任意選択のリンカーを伴う）を含むヘテロ二量体化変異体を伴う。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヒンジ領域又はその断片である。この構造は、ＸｍＡｂ形式である「三重Ｆ」形式（ｓｃＦｖ−ＦＡｂ−Ｆｃ）又は「ボトルオープナー」形式と本明細書で呼ばれる場合がある。２つの鎖は、好ましくは、下により十分に記載されるとおりのヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン及び／又はヒンジ領域）におけるアミノ酸変異体の使用によって結び付けられる。好ましくは、ｓｃＦｖは、ＣＤ３に結合し、且つ任意選択により正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む。代わりに、ｓｃＦｖは、ＳＴＥＡＰ１に結合する。「三重Ｆ」形式は、全体として且つ特にヘテロ二量体抗体構造の開示に関して参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，８２２，１８６号明細書においてさらに記載されている。

【0048】

別の態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとともに、第１の可変重鎖ドメインを含む第１の重鎖、第１のＣＨ１ドメインを含む第１の定常重鎖及び第１のＦｃドメインを含む第１の単量体を含むヘテロ二量体抗体である。ｓｃＦｖは、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを使用して共有結合され、ｓｃＦｖは、ＣＤ３に結合する。ヘテロ二量体抗体は、第２の可変重鎖ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の重鎖を含む第２の単量体をさらに含む。ヘテロ二量体抗体は、ＳＴＥＡＰ１に結合する２つの同一のＦａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。この形式は、１つの標的抗原への二価の結合のために「ＸｍＡｂ^２＋１」形式と本明細書で呼ばれる場合がある。したがって、一実施形態では、本開示のヘテロ二量体抗体は、効率的な抗体産生をもたらす形式におけるＣＤ３への一価の結合及びＳＴＥＡＰ１への二価の結合の利点を提供する。

【0049】

下にさらに記載されるとおり、ヘテロ二量体抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを生成する変異体も含み得る。例えば、様々な態様において、第１及び前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。

【0050】

本開示のＸｍＡｂ^２＋１ヘテロ二量体抗体形式の説明は、図１において提供される。ｓｃＦｖドメイン及び２つのＦａｂ部分の提供により、３つの抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＳＴＥＡＰ１に結合し、且つｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体の１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入される。

【0051】

好ましくは、ヘテロ二量体抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない複数のサブクラスを有するＩｇＧクラスの抗体であるが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥも考えられる。抗体は、アイソタイプ及び／又はサブクラスのハイブリッドも含み得ることが理解されるべきである。例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号明細書に示されるとおりのＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ操作が本開示の一部として考えられる。

【0052】

本開示のヘテロ二量体を生成するために使用され得るいくつかの機構が存在する。加えて、当業者によって理解され、且つ下により十分に記載されるとおり、これらの機構を組み合わせて、高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。

【0053】

１つの機構は、一般に、ヘテロ二量体形成に有利に作用する立体的影響をもたらすアミノ酸操作を指す「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」）と当技術分野において呼ばれ、不利なヘテロ二量体形態も任意選択により使用され得る。これは、特にヘテロ二量体抗体生成の開示に関して、全てが全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０２０５７５６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７（１９９６）；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ２７０：２６；及び米国特許第８，２１６，８０５号明細書において記載されるとおりの「ノブアンドホール」と呼ばれる場合がある。加えて、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）において記載されるとおり、これらの「ノブアンドホール」変異をジスルフィド結合と組み合わせて、ヘテロ二量体化の形成を非対称にすることができる。変異の例は、特に、下に概説されるとおりのｐｉ変異体を含む他のヘテロ二量体化変異体と組み合わせて、Ｔ３６６Ｗと対になるＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ及び架橋するジスルフィドを有するこの変異体、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃと対になるＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃを含む。

【0054】

ヘテロ二量体の生成において有用なさらなる機構は、全体として参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）において記載されるとおり、「静電ステアリング」と呼ばれる場合がある。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれる場合がある。この実施形態において、静電気は、ヘテロ二量化に向けて形成を非対称にするために使用される。当業者が理解するとおり、これらは、ｐＩ、したがって精製に対して影響を有する場合があり、したがって場合によりｐＩ変異体であるとも見なされ得る。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製ツールとして使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（すなわち、これらは、単量体の対応するセットである）及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。フレームワーク領域のいくつかの実施形態では、２２０位の変異は、重鎖及び軽鎖ジスルフィド形成にもはや必要ないシステインを除去する。「立体変異体」は、本開示の任意選択の実施形態である。

【0055】

ヘテロ二量体タンパク質の精製を容易にすることができるいくつかの機構が存在する。あるものは、ｐＩ変異体の使用に依拠し、その結果、各単量体が異なるｐＩを有し、それによりＡ−Ａ、Ａ−Ｂ及びＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製が可能になる。代わりに、分離は、サイズに基づいて実施され得る。一般に下に概説されるとおり、ヘテロ二量体の形成がホモ二量体を上回るように「非対称にする」ことも可能である。したがって、立体ヘテロ二量体化変異体及びｐＩ又は電荷対変異体の組合せが本開示に関連して使用され得る。さらに、ｓｃＦｖは、精製を目的としてｐＩをさらに高める荷電ｓｃＦｖリンカー（正又は負のいずれか）を含み得る。当業者によって理解されるとおり、適正な荷電ｓｃＦｖリンカーを有し、且つ追加のｐｉ調整がない一部の三重Ｆ形式が有用であるが、本発明は、荷電ｓｃＦｖリンカーも有する非対称変異体（及び本明細書に記載されるＦｃ、ＦｃＲｎ及びＫＯ変異体の組合せ）の使用も提供する。

【0056】

分離機構としてｐＩを利用する実施形態では、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドの一方又は両方に導入することができ；すなわち単量体の一方（単純化のために本明細書では「単量体Ａ」と呼ぶ）のｐＩを、単量体Ｂから離れるように操作することができるか、又は単量体Ａ及びＢの両方を変えることができ、単量体ＡのｐＩが上昇し、単量体ＢのｐＩが低下する。一方又は両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を取り除くか又は付加すること（例えば、中性アミノ酸を正又は負に荷電したアミノ酸残基によって置き換える、例えばグリシンをグルタミン酸に置き換える）、荷電した残基を正又は負の電荷から反対の電荷に変える（例えば、アスパラギン酸からリジンに）こと又は荷電した残基を中性残基に変える（例えば、電荷の消失；リジンからセリンに）ことによって行われ得る。加えて、本明細書のヘテロ二量体抗体の作製における使用のための好適なｐＩ変異体は、例えば、ｐＩが著しい免疫原性を導入することなく変えられるように、異なるＩｇＧアイソタイプからｐＩ変異体を移入するアイソタイプであるものであり；全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４０２８８２７５号明細書の図２９を参照されたい。

【0057】

したがって、実施形態は、ヘテロ二量体がホモ二量体から分離できるように、単量体の少なくとも１つにおいてｐＩの十分な変化を生じさせる。これは、「野生型」重鎖定常領域及びそのｐＩを上げるか又は下げるように（ｗｔＡ−＋Ｂ又はｗｔＡ−−Ｂ）操作されている変異領域を用いること又は一方の領域を上げ、他方の領域を下げる（Ａ＋−Ｂ−又はＡ−Ｂ＋）ことによって達成され得る。この議論において、いずれの単量体がｓｃＦｖを含み、いずれがＦａｂを含むかは、問題でないことに留意されたい。ｐＩ変異体の使用と関連する概略図は、米国特許第９，８２２，１８６号明細書（全体として且つ特にヘテロ二量体抗体変異体及び抗ＣＤ３配列の議論に関して参照により本明細書に組み込まれる）の図３４において記載されている。ｐＩ変異体は、変異体の効果が、異なるＦｖ領域を有する異なる抗体に容易に移り、且つ非常に安定であるという点で「プラグアンドプレイ」形式において非対称変異体と組み合わされ得る。

【0058】

したがって、一般に、本開示の態様は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体を含み、これは、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」又は「ｐＩ置換」）を単量体の１つ又は両方に組み込むことにより、「ｐＩヘテロ二量体」（すなわち「ｐＩ抗体」）を形成するために、抗体の単量体の両方でない場合に少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を変えることに向けられる。２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩがわずか０．１ｐＨ単位、例えば０．２、０．３、０．４及び０．５ｐＨ以上の差でも異なれば達成することができる。

【0059】

所望の分離を達成するのに各々又は両方の単量体に含まれるべきｐＩ変異体の数は、ｓｃＦｖ及びＦａｂの開始ｐＩに部分的に依存することになる。すなわち、いずれの単量体を操作するか又はいずれの「方向」（例えば、正側若しくは負側）にするかを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そこから決定がなされる。当技術分野で知られるとおり、異なるＦｖは、利用される異なる開始ｐＩを有することになる。一般に、ｐＩを操作して、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩ差をもたらすが、０．２〜０．５が好ましい。

【0060】

さらに、いくつかの場合（形式に依存する）、ヘテロ二量体は、サイズ（例えば、分子量）に基づいてホモ二量体から分離され得る。例えば、図１８Ａ〜Ｉのいくつかの実施形態において示されるとおり、いくつかの形式は、ホモ二量体及び異なるサイズを有するヘテロ二量体をもたらす（例えば、ボトルオープナーに関して、１つのホモ二量体は、「二重ｓｃＦｖ」形式であり、１つのホモ二量体は、標準的な抗体であり、且つヘテロ二量体は、１つのＦａｂ及び１つのｓｃＦｖを有する）。加えて、図１８Ａ〜Ｉに示されるとおり、いくつかの抗原は、二価で結合される可能性がある（例えば、１つの抗原に対して２つの抗原結合部位）。理解されるとおり、Ｆａｂ及びｓｃＦｖの任意の組合せを利用して、所望の結果及び組合せを達成できる。

【0061】

重鎖の定常領域を使用することにより、ｐＩ変異体を使用してヘテロ二量体化を達成する場合、抗体を含む多重特異性タンパク質の設計及び精製に対するさらなるモジュール方式の手法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異体（非対称及び精製ヘテロ二量体化変異体を含む）は、可変領域に含まれておらず、その結果、個々の各抗体が操作されなければならない。加えて、いくつかの実施形態では、ｐＩ変異体からもたらされる免疫原性の可能性は、ｐＩが著しい免疫原性を導入することなく変化されるように異なるＩｇＧアイソタイプからｐＩ変異体を移入することによって著しく低減される。したがって、解決されるべき追加の問題は、高いヒト配列含量、例えばいずれかの特定の位置での非ヒト残基の最小化又は回避を有する低ｐＩ定常ドメインの解明である。

【0062】

ｐＩ操作で起こり得る副次的な利点は、血清半減期の延長及びＦｃＲｎ結合の増加でもある。すなわち、米国特許出願公開第２０１２００２８３０４号明細書（全体として参照により組み込まれる）において記載されるとおり、抗体定常ドメイン（抗体及びＦｃ融合体において見出されるものを含む）のｐＩを下げることにより、インビボにおいて血清での保持が長期化し得る。長期化された血清半減期に関するこれらのｐＩ変異体も精製のためのｐＩ変化を促進する。

【0063】

本開示のヘテロ二量体融合タンパク質は、一般に図１８Ａ〜Ｉに示されるとおり、様々な構成をとることができる。いくつかの図は、「単一末端」の構成を示し、分子の一方の「アーム」には１種の特異性があり、もう一方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「二重の末端」の構成を示し、分子の「上部」で少なくとも１種の特異性があり、分子の「底部」で１種以上の異なる特異性がある。本開示において有用な１つのヘテロ二量体の骨格は、図１８Ａに示され、且つ上記のとおりの「三重Ｆ」又は「ボトルオープナー」骨格形式である。「三重Ｆ」形式には、いくつかの明確な利点がある。２つのｓｃＦｖコンストラクトに依拠する抗体類似体は、安定性及び凝集の問題を有する場合が多く、これは、「通常の」重鎖と軽鎖の対形成の追加により本明細書に記載されるコンストラクトによって軽減され得る。加えて、２つの重鎖及び２つの軽鎖に依拠する形式とは対照的に、重鎖と軽鎖との不適切な対形成（例えば、軽鎖２と対形成する重鎖１など）による問題はない。追加の有用な抗原結合タンパク質形式が下に記載される。

【0064】

様々な態様において、ヘテロ二量体抗体のｓｃＦｖは、本明細書に記載される抗ＣＤ３ ＣＤＲ配列を含む。例えば、様々な態様において、ｓｃＦｖは、配列番号１７０を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１７１を含むｖｈＣＤＲ２、配列番号１７２を含むｖｈＣＤＲ３、配列番号１７４を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１７５を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１７６を含むｖｌＣＤＲ３を含む。例えば、ｓｃＦｖは、任意選択により、配列番号１６９の可変重鎖領域及び配列番号１７３の可変軽鎖領域を含む。様々な態様において、ｓｃＦｖは、配列番号４４の配列を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、図１９に記載されるアミノ酸配列、例えば配列番号４４に記載されるアミノ酸配列を含む。図１９に記載される配列は、異なる親和性の抗原結合ドメインを提供する。いくつかの適応症において、より強い親和性が好ましい場合があるが、他の場合、より低い親和性が有用であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３に対する「強い」又は「高い親和性」結合体である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含むヘテロ二量体抗体を提供する（例えば、１つの例は、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７（任意選択により適宜荷電リンカーを含む）として示される重鎖及び軽鎖可変ドメインである）。他の実施形態では、本開示は、ＣＤ３に対する「少ない」又は「より低い親和性」結合体である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含むヘテロ二量体抗体を提供する。

【0066】

典型的なｓｃＦｖリンカーは、当技術分野でよく知られており、一般に１０〜２５アミノ酸長であり、且つグリシン及びセリンを含む。「荷電ｓｃＦｖリンカー」は、少なくとも１つのｓｃＦｖを含むヘテロ二量体抗体の作製及び精製における使用のための荷電アミノ酸を利用するｓｃＦｖリンカーを意味する。好適な荷電ｓｃＦｖリンカーは、図８Ａ、８Ｂ及び１９に示されるが、他のものが使用され得る。一般に、本開示に関連して使用について考えられる荷電ｓｃＦｖリンカーは、従来使用される（ＧＧＧＧＳ）_３〜５（配列番号１７９）配列などの標準的な非荷電ｓｃＦｖリンカーと比較して３〜８個（３、４、５、６、７又は８個の全てが可能である）の電荷の変化を有する（負又は正のいずれか）。荷電ｓｃＦｖは、任意選択により、ＩＲＰＲＡＩＧＧＳＫＰＲＶＡ（配列番号１４５）、ＧＫＧＧＳＧＫＧＧＳＧＫＧＧＳ（配列番号１４６）、ＧＧＫＧＳＧＧＫＧＳＧＧＫＧＳ（配列番号１４７）、ＧＧＧＫＳＧＧＧＫＳＧＧＧＫＳ（配列番号１４８）、ＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳ（配列番号１４９）、ＧＧＧＫＳＧＧＫＧＳＧＫＧＧＳ（配列番号１５０）、ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ（配列番号１５１）、ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ（配列番号１５２）又はＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳ（配列番号１５３）から選択されるアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ｓｃＦｖは、アミノ酸配列ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ（配列番号１５２）を含む。

【0067】

例示的な態様では、ｓｃＦｖは、本明細書で提供される配列（例えば、配列番号４〜６、８〜１０、１１〜１７、２１、２３〜２５、２７〜２９、３０〜３５、１７０〜１７３及び１７４〜１７６のいずれか１つ以上のＣＤＲ配列、配列番号３、７、２２、２６、４１、４２、４５、４６、４９、５０、５３、５４、５７、５８、６１、６２、６５、６６、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３、１３４、１３７、１３８、１４１、１４２、１６９、１７３及び１８２〜１８６のいずれか１つ以上の可変領域配列；配列番号１４３〜１６８のいずれか１つのｓｃＦｖリンカー配列並びに／又は配列番号１９、２０、３８、４０、４３、４４、４７、４８、５１、５２、５５、５６、５９、６０、６３、６４、６７、６８、７１、７２、７５、７６、７９、８０、８３、８４、８７、８８、９１、９２、９５、９６、９９、１００、１０４、１０４、１０７、１０８、１１１、１１２、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２４、１２７、１２８、１３１、１３２、１３５、１３６、１３９及び１４０のいずれか１つのｓｃＦｖ配列）のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）配列同一性を有するＣＤＲ配列、可変領域配列、ｓｃＦｖリンカー配列又はｓｃＦｖ配列を含む。例えば、ｓｃＦｖは、配列番号４〜６、８〜１０、１１〜１７、２１、２３〜２５、２７〜２９、３０〜３５、１７０〜１７３及び１７４〜１７６のいずれか１つ以上に記載されるが、１つ又は２つのアミノ酸置換を含むＣＤＲ配列を含み得る。代わりに、様々な態様において、ｓｃＦｖは、配列番号３、７、２２、２６、４１、４２、４５、４６、４９、５０、５３、５４、５７、５８、６１、６２、６５、６６、６９、７０、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９３、９４、９７、９８、１０１、１０２、１０５、１０６、１０９、１１０、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３、１３４、１３７、１３８、１４１、１４２、１６９、１７３又は１８２〜１８６に関して改変された可変領域配列を含み得、改変は、ＣＤＲ配列の外部である。

【0068】

ヘテロ二量体抗体の第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、様々な態様において、本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ１ ＣＤＲ又は可変領域配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１４を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号１５又は配列番号２１を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号１６を含むｖｈＣＤＲ３を含み；且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号１１を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号１２を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号１３を含むｖｌＣＤＲ３を含む。代わりに、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３３を含むｖｈＣＤＲ１、配列番号３４を含むｖｈＣＤＲ２及び配列番号３５を含むｖｈＣＤＲ３を含み；且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号３０を含むｖｌＣＤＲ１、配列番号３１を含むｖｌＣＤＲ２及び配列番号３２を含むｖｌＣＤＲ３を含む。好ましい実施形態では、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８２又は配列番号１８４を含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号１８３を含む。代わりに、第１の可変重鎖ドメイン及び第２の可変重鎖ドメインは、配列番号１８５を含み、且つ可変軽鎖ドメインは、配列番号１８６を含む。

【0069】

本開示の様々な態様において、ヘテロ二量体抗体は、ａ）配列番号１９若しくは２０の配列を含む第１の単量体、配列番号１８の配列を含む第２の単量体及び配列番号１７の配列を含む共通の軽鎖；又はｂ）配列番号３８の配列を含む第１の単量体、配列番号３７の配列を含む第２の単量体及び配列番号３６の配列を含む共通の軽鎖を含む。

【0070】

本開示の様々な態様において、ヘテロ二量体抗体は、配列番号２０２若しくは２０７の配列を含む第１の単量体、配列番号２０１若しくは２０３の配列を含む第２の単量体及び配列番号２００の配列を含む共通の軽鎖（例えば、配列番号２０２の配列を含む第１の単量体、配列番号２０１の配列を含む第２の単量体及び配列番号２００の配列を含む軽鎖；又は配列番号２０７の配列を含む第１の単量体、配列番号２０３の配列を含む第２の単量体及び配列番号２００の配列を含む軽鎖）を含む。代わりに、ヘテロ二量体抗体は、配列番号２０６の配列を含む第１の単量体、配列番号２０５の配列を含む第２の単量体及び配列番号２０４の配列を含む共通の軽鎖を含み得る。

【0071】

例示的な態様では、第１及び／又は第２の可変重鎖ドメインは、本明細書で提供される配列（例えば、配列番号４〜６、１４〜１７、２１、２３〜２５、３３〜３５及び１７０〜１７２のいずれか１つ以上のＣＤＲ配列又は配列番号３、２２、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１６９、１８２、１８４及び１８５のいずれか１つの可変領域配列）のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）配列同一性を有するＣＤＲ配列又は可変領域配列を含み得る。例えば、第１及び／又は第２の可変重鎖ドメインは、配列番号４〜６、１４〜１７、２１、２３〜２５、３３〜３５及び１７０〜１７２のいずれか１つ以上において記載されるが、１つ又は２つのアミノ酸置換を含むＣＤＲ配列を含み得る。代わりに、様々な態様において、第１及び／又は第２の可変重鎖ドメインは、配列番号３、２２、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１６９、１８２、１８４又は１８５に関して改変された可変領域配列を含み得、改変は、ＣＤＲ配列の外部である。同様に、可変軽鎖ドメインは、本明細書で提供される配列（例えば、配列番号８〜１０、１１〜１３、２７〜２９、３０〜３２及び１７４〜１７６のいずれか１つ以上のＣＤＲ配列又は配列番号７、２６、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１７３、１８３及び１８６のいずれか１つの可変領域配列）のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）配列同一性を有するＣＤＲ配列又は可変領域配列を含み得る。例えば、可変軽鎖ドメインは、配列番号８〜１０、１１〜１３、２７〜２９、３０〜３２及び１７４〜１７６のいずれか１つ以上において記載されるが、１つ又は２つのアミノ酸置換を含むＣＤＲ配列を含み得る。代わりに、様々な態様において、可変軽鎖ドメインは、配列番号７、２６、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１７３、１８３又は１８６に関して改変された可変領域配列を含み得、改変は、ＣＤＲ配列の外部である。必要に応じて、第１の単量体は、本明細書で提供される配列（配列番号１９、２０、３８、２０２、２０６又は２０７）のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得；第２の単量体は、本明細書で提供される配列（配列番号１８、１９９若しくは３７；又は配列番号２０２、２０７若しくは２０６）のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得；且つ／又は共通の軽鎖は、本明細書で提供される配列（配列番号１７、３６、２００又は２０４）のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は約９０％より高い（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0072】

いくつかの実施形態では、完全長ヘテロ二量体抗体が利用される。「完全長」は、本明細書で概説されるとおりの１つ以上の改変を含む可変及び定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。本開示のヘテロ二量体抗体は、モノクローナル、合成、キメラ及び／又はヒト化であり得る。ヘテロ二量体抗体に関連して、抗原結合抗体断片は、ｐＩ操作など、ヘテロ二量体を生成するように操作され得る少なくとも１つの定常ドメインを含有する。他の抗体断片は、ｐＩ操作された本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ及びＣＬドメインの１つ以上を含有するものを含む。例えば、Ｆｃ融合体は、別のタンパク質に融合されたＦｃ領域（任意選択によりヒンジ領域を有するＣＨ２及びＣＨ３）の融合体である。いくつかのＦｃ融合体が当技術分野で知られ、本発明のヘテロ二量体化変異体の追加によって改善され得る。ＣＨ１；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；ＣＨ２；ＣＨ３；ＣＨ２及びＣＨ３；ＣＨ１及びＣＨ３を含む抗体融合体を作製することができ、これらのいずれか又は全ては、本明細書に記載されるヘテロ二量体化変異体の任意の組合せを利用して、任意選択によりヒンジ領域とともに作製され得る。

【0073】

本開示のヘテロ二量体抗体を含む抗原結合タンパク質は、一般に、単離されるか又は組換え体である。本明細書に記載されるヘテロ二量体抗体の全て又は一部をコードする核酸、ベクター及び宿主細胞が本明細書で記載され、本開示の一部として企図される。

【0074】

抗体構造／Ｆｃ領域改変
本開示は、野生型抗体配列に対してアミノ酸改変を有する改変されたＦｃ変異体を有する抗体を含む。変異体は、それらを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓ又は４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位において置換セリンを有するＦｃ変異体であり、付番は、ＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を定義する。野生型アミノ酸の同一性は、特定されていなくてもよく、その場合、前述の変異体は、４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換がもたらされる順序は、任意であり、すなわち、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同じＦｃ変異体などである。改変は、付加、欠失又は置換であり得る。置換は、天然に存在するアミノ酸及び場合により合成アミノ酸を含み得る。例としては、全てが全体として参照により組み込まれる米国特許第６，５８６，２０７号明細書；米国特許出願公開第２００４０２１４９８８号明細書；国際公開第９８／４８０３２号パンフレット、国際公開第０３／０７３２３８号パンフレット、国際公開第０５／３５７２７Ａ２号パンフレット及び国際公開第０５／７４５２４Ａ２号パンフレット；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４；及びＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が挙げられる。

【0075】

抗体及び他の抗原結合タンパク質に関する本開示において議論される全ての位置に関して、別段の記載がない限り、アミノ酸位置の付番は、ＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス又はＫａｂａｔ若しくはＥＵ付番スキームのようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す（参照により全体として本明細書に組み込まれるＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５）。例えば、各可変重鎖領域（ＶＨ）及び可変軽鎖領域（ＶＬ）は、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）及び４つのＦＲで構成されることが理解される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域におけるおよそアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を意味する）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）並びに重鎖可変領域におけるおよそ３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を意味する）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）並びに／又は超可変ループを形成するそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）並びに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）及び９６〜１０１（ＨＣＤＲ３））；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を包含する。

【0076】

当技術分野において理解されるとおり、ＣＤＲの正確な付番及び配置は、異なる付番系間で異なる場合がある。しかしながら、可変重鎖配列及び／又は可変軽鎖配列の本開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重鎖領域の本開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、且つ各可変軽鎖領域の本開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ付番の有用な比較は、下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（ｌ）：５５−７７（２００３）を参照されたい。

【0077】

【表1】

【0078】

本明細書全体にわたり、Ｋａｂａｔ付番系は、一般に、可変ドメインにおける残基（およそ軽鎖可変領域の残基１〜１０７及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上掲（１９９１））。

【0079】

各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づいて、その著者らは、個々の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類し、そのリストを作成した（全体として参照により組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。

【0080】

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、別個の三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重鎖（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインが興味深い。ＩｇＧ抗体に関連して、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧに関連して、「ＣＨ」ドメインは、以下のとおりである：「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う２３７〜３４０位を指し、且つ「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う３４１〜４４７位を指す。本明細書に示され且つ下記のとおり、ｐＩ変異体は、下で議論されるＣＨ領域及びヒンジ領域の１つ以上におけるものであり得る。様々な態様において、本明細書に示される配列は、ＣＨ１領域の１１８位で開始し；可変領域は、指定される場合を除いて含まれない。

【0081】

別の型の重鎖のＩｇドメインは、ヒンジ領域である。本明細書の「ヒンジ」、又は「ヒンジ領域」、又は「抗体ヒンジ領域」、又は「免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間のアミノ酸を含む可動性のポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵの２２０位で終了し、及びＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、ＥＵの２３７位の残基で開始する。したがって、ＩｇＧの場合、抗体ヒンジは、２２１位（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）〜２３６（ＩｇＧ１におけるＧ２３６）を含むように本明細書で定義され、ここで、付番は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、例えばＦｃ領域に関連して下部ヒンジが含まれ、「下部ヒンジ」は、一般に、２２６〜２３０位を指す。本明細書に記載されるとおり、ｐＩ変異体は、ヒンジ領域においても作製され得る。

【0082】

本明細書で使用する場合、「Ｆｃ」、又は「Ｆｃ領域」、又は「Ｆｃドメイン」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメイン及び場合によりヒンジの一部を除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、且つこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭに関して、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧに関して、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）並びにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下位のヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は、異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６又はＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、付番は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従う。

【0083】

アミノ酸変異体を本開示の抗原結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）に導入して追加の機能性を加え得る。例えば、Ｆｃ領域内でアミノ酸変化を加えて（１つの単量体又は両方のいずれか）、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増大を促進し（例えば、Ｆｃγ受容体への結合の改変）、毒性及び薬物の付加を可能にするか又はその収率を増加させ（例えば、ＡＤＣのため）、またＦｃＲｎへの結合を増加させ、且つ／又は得られる分子の血清半減期を延長することができる。アミノ酸配列を変えることによって調整され得るエフェクター機能としては、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で概説されるあらゆる変異体は、任意選択により且つ独立して、他の変異体と組み合わされ得る。

【0084】

「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、且つＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含むが、これらに限定されない任意の生物に由来し得る。当技術分野で知られるとおり、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる場合が多い２つのポリペプチドを含む。軽鎖は、ベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書で別段の記載がない限り、ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。様々なＦｃＲｎ変異体が、ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させ、且ついくつかの場合に血清半減期を延長するために使用される。ＦｃＲｎ受容体への結合の増加及び血清半減期における対応する増加を付与するＦｃ変異体としては、４３４Ａ、４３４Ｓ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ又はＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、２５２Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。明確さのために、各重鎖は、異なるため、ＦｃＲｎ変異体（及びＦｃ変異体）は、１つ又は両方の単量体に存在し得る。

【0085】

機能性変異体の別の分類は、「Ｆｃγ切断変異体」又は「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ又はＫＯ」変異体である。これらの実施形態では、一部の治療応用のために、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）の１つ以上又は全てに対するＦｃドメインの通常の結合を低減するか又は除去して、さらなる作用機序を回避することが望ましい。「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」又は「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、且つＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーとしては、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；並びにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が挙げられるが、これらに限定されない（全体として参照により組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５）。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含むが、これらに限定されない任意の生物に由来し得る。マウスＦｃγＲとしては、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）及びＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）が挙げられるが、これらに限定されない。多くの実施形態では、ＡＤＣＣ活性を除去するか又は著しく低減するためにＦｃγＲＩＩＩａ結合を切断することが一般に望ましい。米国特許第９，８２２，１８６号明細書の図３６は、野生型の安定性を保持するが、全てのＦｃγＲ結合を除去するＦｃノックアウト（又は切断変異体）の使用を示す。

【0086】

代表的な切断変異体としては、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるものが挙げられる。本明細書で参照される切断変異体は、ＦｃγＲ結合を切断するが、一般にＦｃＲｎ結合を切断しないことが留意されるべきである。

【0087】

当技術分野で知られるとおり、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｆγ受容体への最も高い結合を有し、したがって、切断変異体は、ヘテロ二量体抗体の骨格における定常ドメイン（又はＦｃドメイン）がＩｇＧ１である場合に使用され得る。代わりに又はＩｇＧ１骨格における切断変異体に加えて、グリコシル化位置２９７（一般にＡ又はＳ）での変異は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を著しく切断できる。ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体への結合を天然に減少させ、したがって、それらの骨格は、切断変異体を伴うか又は伴わずに使用され得る。

【0088】

脱アミド化は、抗体活性及び安定性に著しく影響を及ぼし得る。様々な態様において、ヘテロ二量体抗体は、脱アミド化部位を除去するために１つ以上の置換を含む。この点に関して、ヘテロ二量体抗体は、任意選択により、置換Ｎ６７ＱなどのＮ６７位における置換を含む。

【0089】

ヘテロ二量体重鎖定常領域
本開示は、第１のドメインとしての変異体重鎖定常領域を含有する単量体の使用に基づくヘテロ二量体抗体を提供する。本明細書における「単量体」は、ヘテロ二量体タンパク質の半分を意味する。従来型の抗体は、実際には四量体（２つの重鎖及び２つの軽鎖）であることが留意されるべきである。参照の容易さのために、本開示に関連して、重鎖及び軽鎖を含む対が「単量体」と見なされる。ｓｃＦｖ（及びいくつかの場合にはＦａｂ）を含む重鎖領域が単量体と見なされる。本質的に、各単量体は、それが定常領域全体、例えばＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、Ｆｃ領域（ＣＨ２−ＣＨ３）又はＣＨ３ドメインのみであるかどうかにかかわらず、ヘテロ二量化操作を可能にするのに十分な重鎖定常領域を含む。

【0090】

変異体重鎖定常領域は、完全長コンストラクト、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３又は例えばＣＨ２−ＣＨ３若しくはＣＨ３単独を含むそれらの部分を含む重鎖定常領域の全て又は一部を含み得る。加えて、各単量体の重鎖領域は、同じ骨格（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ２−ＣＨ３）又は異なるものであり得る。Ｎ及びＣ末端トランケーション及び付加もその定義に含まれる。例えば、いくつかのｐＩ変異体は、重鎖ドメインのＣ末端への荷電アミノ酸の付加を含む。

【0091】

本明細書で概説されるヘテロ二量体化変異体（例えば、立体及びｐＩ変異体）に加えて、重鎖領域は、ＦｃγＲ及びＦｃＲｎ結合を変えるための変化を含む追加のアミノ酸置換も含有し得る。

【0092】

ヘテロ二量体化変異体は、任意選択により且つ独立して、任意の他の変異体と組み合わされ得る立体変異体（電荷変異体を含む）及びｐＩ変異体を含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる型の変異体を含む。これらの実施形態では、「単量体Ａ」を「単量体Ｂ」と適合させることが重要であり、すなわちヘテロ二量体タンパク質が立体変異体及びｐＩ変異体の両方に依拠する場合、これらは、各単量体に適切に適合される必要があり、例えば、機能する立体変異体のセット（単量体Ａに対する１セット、単量体Ｂに対する１セット）は、各単量体に対する変異体が所望の機能を達成するために設計されるように、ｐＩ変異体セット（単量体Ａに対する１セット、単量体Ｂに対する１セット）と組み合わされる。立体変異体が電荷も変え得る実施例の場合、適切なセットが適切な単量体に適合される必要がある。

【0093】

本明細書で概説されるヘテロ二量体化変異体（例えば、図面において示されるそれらの変異体を含むが、これらに限定されない）は、任意選択により且つ独立して、任意の他の変異体及び任意の他の単量体と組み合わされ得る。ヘテロ二量体化に重要なことは、変異体の「セット」、一方の単量体に関する１つのセット及び他方に関する１つのセットが存在することである。これらが１対１で組み合わされる（例えば、単量体１の一覧が同時に起こる）か又は切り替えられる（単量体１のｐＩ変異体を単量体２の立体変異体により）かどうかは、無関係である。しかしながら、「鎖状態」は、ヘテロ二量体化が有利であるように、組合せが上に概説されるとおりになされる場合、保存されるべきである。例えば、ｐＩを上げる電荷変異体は、上昇ｐＩ変異体及び／又は上昇したｐＩを有するｓｃＦｖリンカーなどとともに使用されるべきである。ヘテロ二量体タンパク質の単量体に関連して、「鎖状態」は、「適合する」ＤＮＡの二本鎖と同様に、ヘテロ二量体化変異体が、ヘテロ二量体を形成するために「適合する」能力を保存するために各単量体に組み込まれることを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異体が単量体Ａに操作される場合（例えば、ｐＩをより高くする）、利用され得る「電荷対」である立体変異体も、ｐＩ変異体に支障をきたさず、例えば、ｐＩを高くする電荷変異体は、同じ「鎖」又は「単量体」に置かれて、両方の機能性を保存する。さらに、追加のＦｃ変異体（ＦｃγＲ結合、ＦｃＲｎ結合のためのもの、切断変異体など）のために、いずれかの単量体又は両方の単量体は、独立して且つ任意選択により、列挙された変異体のいずれかを含み得る。いくつかの場合、両方の単量体は、追加の変異体を有し、且ついくつかの場合、１つの単量体のみが追加の変異体を有するか又はそれらが組み合わされ得る。

【0094】

立体変異体
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって促進される。すなわち、各重鎖においてアミノ酸を変えることにより、異なる重鎖が、同じＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、ヘテロ二量体構造を形成するように会合する可能性が高くなる。代表的な好適な立体変異体は、図面において示される。

【0095】

立体変異体を生成するための１つの機構は、上記の「ノブアンドホール」機構である。ヘテロ二量体の生成において有用なさらなる機構は、全体として参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）において記載されるとおり、「静電ステアリング」と呼ばれる場合がある。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれる場合がある。この実施形態において、静電気は、ヘテロ二量化に向けて形成を非対称にするために使用される。これらは、ｐＩ、したがって精製に対して影響を有する場合があり、したがって場合によりｐＩ変異体であるとも見なされ得る。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製ツールとして使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは、「単量体の対応するセット」である）及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅなどの７５％を超えるヘテロ二量体化をもたらす変異体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0096】

いくつかの実施形態では、非対称変異体は、有利に且つ同時に、「ノブアンドホール」機構及び「静電ステアリング」機構の両方に基づくヘテロ二量体化に有利である。これらの変異体は、「セット」の「対」でもたらされる。すなわち、対の一方のセットは、第１の単量体に組み込まれ、対のもう一方のセットは、第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体における残基と他方における残基との間に１対１の対応を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも振る舞う必要がないことが留意されるべきである。すなわち、セットのこれらの対は、代わりに、ヘテロ二量体形成を促し、且つホモ二量体形成を抑止する２つの単量体間の界面を形成する可能性があり、これにより、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体のパーセンテージが、予想される５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％のホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく、９０％を超えることが可能になる。例示的なヘテロ二量体化「非対称」変異体は、図４において示される。そのような非対称変異体の例としては、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択により架橋ジスルフィドを含む、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ）を含むが、これらに限定されない変異のセットの対が挙げられる。

【0097】

本明細書で概説されるｐＩ変異体又は図面及び説明文が参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号明細書の図３７で示される他の立体変異体など、他の変異体と任意選択により且つ独立して任意の量で組み合わせることができる追加の単量体Ａ及び単量体Ｂの変異体である。

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書で概説される立体変異体は、任意選択により且つ独立して、一方又は両方の単量体にｐＩ変異体（又はＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体、切断変異体などの他の変異体）を含む任意のヘテロ二量体化変異体とともに組み込まれ得る。

【0099】

ヘテロ二量体のためのｐＩ（等電点）変異体
一般に、ｐＩ変異体には２つの分類がある：タンパク質のｐＩを上げるもの（塩基性の変化）及びタンパク質のｐＩを下げるもの（酸性の変化）。本明細書で記載されるとおり、これらの変異体の全ての組合せが実施され得る：一方の単量体が、野生型又は野生型から著しく異なるｐＩを示さない変異体である場合があり、且つ他方がより塩基性又はより酸性のいずれかであり得る。代わりに、各単量体が変化され、一方がより塩基性であり、且つ一方がより酸性である。ｐＩ変異体の例示的な組合せは、図面において示される。

【0100】

様々な実施形態では、例えば図１８Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩの形式において、ｐＩ変異体の好ましい組合せは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対する場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む一方の単量体（負のＦａｂ側）及び（ＧＫＰＧＳ）_４を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）を有する。しかしながら、当業者に理解されるとおり、第１の単量体は、２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まないコンストラクトにおいて（例えば、ドメインの１つにおいてＣＨ１ドメインを利用しない抗体に関して、例えば図１８Ｂ、Ｃ若しくはＤに示されるものなどの二重ｓｃＦｖ形式又は「１アーム」形式において）、好ましい負のｐＩ変異体Ｆｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対する場合Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。

【0101】

酸性のｐＩ変化
変異体重鎖定常ドメインを含む１つの単量体がより正に作製されることになる場合（例えば、ｐＩを下げる）、以下の改変（例えば、置換）の１つ以上は、本開示に関連して好適である：Ｓ１１９Ｅ、Ｋ１３３Ｅ、Ｋ１３３Ｑ、Ｔ１６４Ｅ、Ｋ２０５Ｅ、Ｋ２０５Ｑ、Ｎ２０８Ｄ、Ｋ２１０Ｅ、Ｋ２１０Ｑ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ３２０Ｅ、Ｋ３２２Ｅ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３３４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４４７の欠失、Ｃ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加、Ｇ１３７Ｅ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２７４Ｑ、Ｒ３５５Ｑ、Ｋ３９２Ｎ及びＱ４１９Ｅ。これらの変化は、ＩｇＧ１に対して記載されるが、アイソタイプハイブリッドだけでなく、全てのアイソタイプをこの方法で改変することができる。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４由来である場合、Ｒ１３３Ｅ及びＲ１３３Ｑも使用され得る。

【0102】

塩基性のｐＩ変化
変異体重鎖定常ドメインを含む１つの単量体がより負に作製されることになる場合（例えば、ｐＩを上げる）、以下の例示的な置換の１つ以上は、本開示に関連して好適である：Ｑ１９６Ｋ、Ｐ２１７Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｎ２７６Ｋ及びＨ４３５Ｒ。これらの変化は、ＩｇＧ１に対して記載されるが、アイソタイプハイブリッドだけでなく、全てのアイソタイプをこの方法で改変することができる。

【0103】

ヘテロ二量体抗体軽鎖変異体
ｐＩ変異体も抗体軽鎖において作製され得る。軽鎖のｐＩを下げるためのアミノ酸改変としては、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ及び軽鎖のＣ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加が挙げられるが、これらに限定されない。定常ラムダ軽鎖に基づくこの分類における変化は、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１９９Ｅでの１つ以上の置換を含むが、これらに限定されない。加えて、軽鎖のｐＩを上げることも可能であり、本開示の様々な態様において企図される。

【0104】

アイソタイプ変異体
加えて、本開示の様々な実施形態は、一方のＩｇＧアイソタイプからもう一方に特定の位置でｐＩアミノ酸の「移入」を伴い、したがって変異体に導入されている望まれない免疫原性の可能性を低減するか又は排除する。これらのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号明細書の図２１において示される。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由のために治療抗体に関して共通のアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重鎖定常領域は、ＩｇＧ２のものより高いｐＩを有する（７．３１に対して８．１０）。ＩｇＧ１骨格に特定の位置でＩｇＧ２残基を導入することにより、得られる単量体のｐＩは、下げられ（又は上げられ）、且つより長い血清半減期をさらに示す。例えば、ＩｇＧ１は、１３７位でグリシン（ｐＩ ５．９７）を有し、且つＩｇＧ２は、グルタミン酸（ｐＩ ３．２２）を有する。グルタミン酸を移入することは、得られるタンパク質のｐＩに影響を及ぼすことになる。いくつかのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のｐＩに著しく影響を及ぼすことを要求される。しかしながら、ＩｇＧ２分子における変化でさえ血清半減期の延長を可能にすることは、下で議論されるとおり留意されるべきである。

【0105】

他の実施形態では、非アイソタイプアミノ酸変化を作製して、得られるタンパク質の全体的な電荷状態を低減するか（例えば、より高いｐＩアミノ酸からより低いｐＩアミノ酸に変化させることによって）、又は安定性などのための構造における適応を可能にする。

【0106】

加えて、重鎖及び軽鎖定常ドメインの両方をｐＩ操作することにより、ヘテロ二量体の各単量体における著しい変化が観察され得る。本明細書で議論されるとおり、２つの単量体が少なくとも０．５異なるｐＩを有することは、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動又は等電点に影響されやすい他の方法による分離を可能にし得る。

【0107】

加えて、等配電子である、例えば親アミノ酸とほぼ同じサイズである電荷変異体であるｐＩ変異体を作製することができ、且つ本明細書で企図される。

【0108】

ｐＩの計算
各単量体のｐＩは、変異体重鎖定常ドメインのｐＩ並びに変異体重鎖定常ドメイン及び融合パートナーを含む全単量体のｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｐＩの変化は、変異体重鎖定常ドメインに基づいて計算される。代わりに、各単量体のｐＩが比較され得る。同様に、「開始」可変領域（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂのいずれか）のｐＩは、いずれの単量体がいずれの方向で設計されることになるかを知らせるために計算される。

【0109】

インビボにおいてより優れたＦｃＲｎ結合を付与するｐＩ変異体
単量体のｐＩを下げるｐＩ変異体は、インビボで血清保持を改善する利点の付加を示し得る。

【0110】

Ｆｃ領域は、エンドソームにおけるｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合がＦｃを占有するため、インビボでより長い半減期を有すると考えられる（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８、参照により本明細書に組み込まれる）。次に、エンドソーム区画は、Ｆｃを細胞表面に再循環させる。区画が細胞外空間に開通すると、より高いｐＨ、約７．４は、Ｆｃの血液への放出を誘導する。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増大は、Ｆｃの血液への放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでＦｃの半減期を延長することになるＦｃ変異は、理想的には低ｐＨでＦｃＲｎ結合を増加させることになる一方、依然としてより高いｐＨでのＦｃの放出を可能にする。アミノ酸のヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲においてその電荷状態を変える。したがって、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体における重要な位置でＨｉｓ残基を見出すことは、驚くべきことではない。

【0111】

近年、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体もより長い血清半減期を有し得ることが示唆されている（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２、全体として参照により組み込まれる）。低下したｐＩ及び延長された半減期を有する定常領域変異体は、抗体の薬物動態特性を向上させることに対してよりモジュール方式の手法を提供する。

【0112】

この実施形態において有用なｐＩ変異体及び精製の最適化のためのそれらの使用は、図面において開示される。

【0113】

変異体の組合せ
当業者によって理解されるとおり、列挙されたヘテロ二量体化変異体の全ては、任意選択により且つ独立して、それらがその「鎖状態」又は「単量体境界」を保持する限り、いずれかの方法で組み合わされ得る。加えて、これらの変異体の全ては、ヘテロ二量体化形式のいずれかに組み合わされ得る。ｐＩ変異体の場合、例示的な実施形態が図面において示されるが、他の組合せは、精製を容易にするために２つの単量体間のｐＩ差を改変する基本的な規則に従って作製され得る。

【0114】

抗原結合タンパク質（例えば、抗体）形式
本開示に関連して有用な１つのヘテロ二量体骨格は、上に記載され且つ図１８に記載される「三重Ｆ」又は「ボトルオープナー」骨格形式である。この実施形態において、抗体の一方の重鎖は、一本鎖Ｆｖ（下に定義されるとおりの「ｓｃＦｖ」）を含有し、且つ他方の重鎖は、可変重鎖及び軽鎖を含む「通常の」Ｆａｂ形式である。本明細書で概説される実施形態の多くは、一般に、ｓｃＦｖリンカー（全てではないが、多くの場合に荷電されている）を使用して共有結合された可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含むｓｃＦｖを含む第１の単量体を含むボトルオープナー形式に依拠し、ここで、ｓｃＦｖは、通常、ドメインリンカー（本明細書で概説されるとおり、荷電されなくても又は荷電されてもよく、外来性又は内在性であり得る（例えば、天然のヒンジドメインの全て又は一部））を介して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合される。ボトルオープナー形式の第２の単量体は、重鎖であり、且つ組成物は、軽鎖をさらに含む。

【0115】

加えて、ボトルオープナー形式のＦｃドメインは、一般に、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ；及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖は、ｐＩ変異体を含む。いくつかの実施形態では、ボトルオープナー形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び可変軽鎖ドメインとともに第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）；並びにｃ）軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、ボトルオープナー形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体及びＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び第１の抗原に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び可変軽鎖ドメインとともに第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）；並びにｃ）軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。

【0117】

本開示に関連して有用な別のヘテロ二量体骨格は、図１８Ｈにおいて示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態において、その形式は、一方の単量体に対する「追加の」可変重鎖ドメインのＣ末端結合及び他方の単量体に対する「追加の」可変軽鎖ドメインのＣ末端結合の使用に依拠し、それにより第３の抗原結合ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分が１つの抗原に結合し、且つ「追加の」ｓｃＦｖドメインが異なる抗原に結合する。

【0118】

この実施形態において、第１の単量体は、ドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合された第１の可変軽鎖ドメインとともに、第１の可変重鎖ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインを含む第１の重鎖を含む（ｖｈｌ−ＣＨｌ−［ドメインリンカー（例えば、ヒンジ）］−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｌ２）。第２の単量体は、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメインの第２の可変重鎖ドメイン及びドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合された第３の可変軽鎖ドメインを含む（ｖｈｌ−ＣＨｌ−ドメインリンカー（例えば、ヒンジ）−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｈ２）。２つのＣ末端に結合された可変ドメインは、ｓｃＦｖを構成する。この実施形態は、２つの同一のＦａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書において所望され且つ記載されるとおりの非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。

【0119】

任意選択により、ｍＡｂ−Ｆｖ形式のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ；及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐＩ変異体を含む。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−Ｆｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに抗原に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の抗原に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の抗原に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。

【0120】

本開示において有用なさらに別のヘテロ二量体骨格は、図１８Ｉにおいて示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態において、その形式は、単量体の１つに対するｓｃＦｖのＣ末端結合の使用に依拠し、それにより第３の抗原結合ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分が１つの抗原に結合し、且つ「追加の」ｓｃＦｖドメインが異なる抗原に結合する。この実施形態において、第１の単量体は、いずれかの向きでｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むＣ末端に共有結合されたｓｃＦｖとともに、第１の重鎖（可変重鎖ドメイン及び定常ドメインを含む）を含む（ｖｈｌ−ＣＨｌ−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２又はｖｈｌ−ＣＨｌ−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２）。この実施形態は、標的抗原の１つに結合する２つの同一のＦａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書において所望され且つ記載されるとおりの非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。

【0121】

加えて、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、任意選択により、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ；及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐＩ変異体を含む。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の抗原に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の抗原に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の抗原に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む形式を含む。

【0122】

本開示において有用なさらに別のヘテロ二量体骨格は、図１８Ｆにおいて示される中央−ｓｃＦｖ又は「ｍＡｂ^２＋１」形式である。その形式は、第３の抗原結合ドメインをこのように形成する挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依拠し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は、１つの標的に結合し、且つ「追加の」ｓｃＦｖドメインは、別のもう１つの標的に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体の１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、それにより第３の抗原結合ドメインをもたらす。この実施形態において、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン（及び任意選択のリンカー／ヒンジ）及びＦｃドメインを含む第１の重鎖を、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとともに含む。ｓｃＦｖは、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で任意選択のドメインリンカーを使用して共有結合される（ＶＨ１−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２−［ヒンジを含む任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３又はｓｃＦｖに関して反対の向き、ＶＨ１−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ＶＬ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ２−［ヒンジを含む任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。いくつかの実施形態では、第１の単量体は、ＶＨ１−ＣＨ１−ドメインリンカー−ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３である。他方の単量体は、標準的なＦａｂ側（すなわちＶＨ１−ＣＨ１−ドメインリンカー（例えば、ヒンジ）−ＣＨ２−ＣＨ３）である。この実施形態は、標的に結合する２つの同一のＦａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書において所望され且つ記載されるとおりの非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。

【0123】

様々な態様において、抗原結合タンパク質は、ＶＨ１−ＣＨ１−［ドメインリンカー］−ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２−［ドメインリンカー（任意選択によりヒンジを含む）］−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１の重鎖；ＶＨ１−ＣＨ１−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２の重鎖；及びＶＬ１を含む共通の軽鎖を含み；ＶＨ１及びＶＬ１はＳＴＥＡＰ１に結合し、且つＶＨ２及びＶＬ２はＣＤ３に結合する。この形式において、ＶＨ２は、任意選択により、配列番号１７０（ＣＤＲ１）、配列番号１７１（ＣＤＲ２）及び配列番号１７２（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含むが、ＶＬ２は、配列番号１７４（ＣＤＲ１）、配列番号１７５（ＣＤＲ２）及び配列番号１７６（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含む。ＶＨ１は、配列番号１４（ＣＤＲ１）、配列番号１５又は２１（ＣＤＲ２）及び配列番号１６（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含み；且つＶＬ１は、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含む。代わりに、ＶＨ１は、配列番号３３（ＣＤＲ１）、配列番号３４（ＣＤＲ２）及び配列番号３５（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含み；且つＶＬ１は、配列番号３０（ＣＤＲ１）、配列番号３１（ＣＤＲ２）及び配列番号３２（ＣＤＲ３）のＣＤＲ配列を含む。任意選択により、抗原結合タンパク質は、Ｅ２３３Ｐ、ｄｅｌＬ２３４、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、ｒ２９２ｃ、ｎ２９７ｇ、ｖ３０２ｃ、Ｅ３５７Ｑ及びＳ３６４Ｋ（ＥＵ付番、小文字は、本明細書でさらに記載されるＳＥＦＬ２置換を参照する）を含むが、これらに限定されない第１の重鎖における改変を含み、且つ第２の重鎖は、Ｎ２０８Ｄ、Ｅ２３３Ｐ、ｄｅｌＬ２３４、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、ｒ２９２ｃ、Ｑ２９５Ｅ、ｎ２９７ｇ、ｖ３０２ｃ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３８４Ｄ、Ｑ４１８Ｅ及びＮ４２１Ｄ（ＥＵ付番、小文字は、本明細書でさらに記載されるＳＥＦＬ２置換を参照する）を含むが、これらに限定されない改変を含む。この実施形態に関連して、使用のためのリンカーは、任意選択により、ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ（配列番号１５２）である。

【0124】

中央ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、任意選択により、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐＩ変異体を含む。いくつかの実施形態では、中央ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む形式を含む。

【0125】

本開示において特に有用な別のヘテロ二量体骨格は、図１８Ｇにおいて示される中央−Ｆｖ形式である。その形式は、第３の抗原結合ドメインをこのように形成する挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依拠し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は、１つの標的に結合し、且つ「追加の」ｓｃＦｖドメインは、別のもう１つの標的に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、それにより第３の抗原結合ドメインをもたらし、ここで、各単量体は、ｓｃＦｖの構成要素を含有する（例えば、一方の単量体は、可変重鎖ドメインを含み、且つ他方は、可変軽鎖ドメインを含む）。この実施形態において、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＦｃドメインを含む第１の重鎖並びに追加の可変軽鎖ドメインを含む。軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合される（ｖｈｌ−ＣＨＩ−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｌ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。他方の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＦｃドメインを含む第１の重鎖並びに追加の可変重鎖ドメインを含む（ｖｈｌ−ＣＨＩ−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合される。この実施形態は、標的に結合する２つの同一のＦａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書において所望され且つ記載されるとおりの非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。

【0126】

本開示に関連して有用なさらなるヘテロ二量体骨格は、図１８Ｃにおいて示される１アーム中央−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態において、一方の単量体は、Ｆｃドメインのみを含むが、他方の単量体は、挿入されるｓｃＦｖドメインを使用し、それにより第２の抗原結合ドメインを形成する。この形式において、Ｆａｂ部分は、１つの標的に結合し、ｓｃＦｖは、もう１つの標的に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体の１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入される。この実施形態において、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＦｃドメインを含む第１の重鎖を、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとともに含む。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合される。第２の単量体は、Ｆｃドメインを含む。この実施形態は、Ｆａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書において所望され且つ記載されるとおりの非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。

【0127】

加えて、１アーム中央−ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、任意選択により、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐＩ変異体を含む。いくつかの実施形態では、１アーム中央ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含むボトルオープナー形式を含む。いくつかの実施形態では、１アーム中央ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐｉ変異体、切断変異体及びＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐｉ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに本明細書で概説されるとおりの第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む形式を含む。

【0128】

本開示において有用なさらなるヘテロ二量体骨格は、図１８Ｄにおいて示される１アームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式である。この実施形態において、一方の単量体は、Ｆｃドメインのみを含むが、他方の単量体は、一般にリンカーの使用を介して重鎖のＮ末端で結合されたｓｃＦｖドメインを使用する：ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨｌ−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３又は（反対の向き）ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３。この形式において、Ｆａｂ部分は、１つの標的に結合し、ｓｃＦｖは、もう１つの標的に結合する。この実施形態は、Ｆａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書において所望され且つ記載されるとおりの非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。

【0129】

１アームｓｃＦｖ−ｍＡｂのＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ；及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐｉ変異体を含む。いくつかの実施形態では、１アームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、非対称変異体、ｐｉ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに本明細書で概説されるとおりの第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。いくつかの実施形態では、１アームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体及びＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐｉ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに本明細書で概説されるとおりの第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。

【0130】

本開示において有用な別のヘテロ二量体骨格は、図１８Ｅにおいて示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態において、その形式は、単量体の１つに対するｓｃＦｖのＮ末端結合の使用に依拠し、それにより第３の抗原結合ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分が１つの標的に結合し、且つ「追加の」ｓｃＦｖドメインが異なる標的に結合する。この実施形態において、第１の単量体は、いずれかの向きでｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むＮ末端に共有結合されたｓｃＦｖとともに、第１の重鎖（可変重鎖ドメイン及び定常ドメインを含む）を含む（（ｖｈｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌｌ−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）又は（反対の向きのｓｃＦｖを有する）（ｖｌｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈｌ−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３））。この実施形態は、標的抗原の１つに結合する２つの同一のＦａｂを形成する重鎖に関連する可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらのコンストラクトは、本明細書において所望され且つ記載されるとおりの非対称変異体、ｐｉ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。

【0131】

ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のＦｃドメインは、任意選択により、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ；及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐＩ変異体を含む。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐｉ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに本明細書で概説されるとおりの第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体及びＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。

【0132】

本開示は、図１８Ｂにおいて示されるものなどの二重ｓｃＦｖ形式も提供する。この実施形態では、ヘテロ二量体抗原結合タンパク質は、２つのｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体（両方が（ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）形式若しくは（ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）形式のいずれか又は一方の向きの１つの単量体及び他の向きの他方の単量体を有する）で構成される。二重ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、任意選択により、非対称変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ；及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択により切断変異体、任意選択により荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、且つ重鎖はｐＩ変異体を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、二重ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体及び切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐｉ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに本明細書で概説されるとおりの第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含む形式を含む。いくつかの実施形態では、二重ｓｃＦｖ形式は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体及びＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体；ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐｉ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ及び第１の可変軽鎖ドメインとともに第１の標的に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン並びに第２の可変重鎖とともに第２の標的に結合するＦｖを形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体；並びにｃ）第１の可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を含むボトルオープナー形式を含む。

【0134】

抗体形式の追加の説明は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／２１８７０７号パンフレットにおいて提供される。

【0135】

抗体結合
本開示の二重特異性抗原結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体抗体）は、様々な態様において、ＣＤ３及びＳＴＥＡＰ１に結合する。異なる結合領域は、独立して、１０^−４Ｍ以下、１０^−５Ｍ以下、１０^−６Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下又は１０^−１２Ｍ以下のそれらの対応する抗原に関するＫＤを示し、ここで、ＫＤは、特異的な抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。結合親和性は、上でさらに記載されている。ＳＴＥＡＰ１結合領域は、例えば、ＣＤ３結合領域がＣＤ３に結合する際と同じ親和性を有してＳＴＥＡＰ１に結合する必要はない。二重特異性抗原結合タンパク質に関連して開示される結合親和性は、ＰＤ−１に結合するコンストラクトを含む本明細書に記載される単一特異性コンストラクトのいずれかにも適用される。

【0136】

追加の抗体修飾
上で概説される修飾に加えて、他の修飾が作製され得る。例えば、分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化され得る（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５、全体として参照により組み込まれる）。加えて、下で概説されるとおりに作製され得る抗体の様々な共有結合的修飾が存在する。

【0137】

抗体の共有結合的修飾は、本開示の範囲内に含まれ、これは、一般に、常にではないものの翻訳後に行われる。例えば、抗体のいくつかの種類の共有結合的修飾は、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。

【0138】

システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾアート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールなどとの反応によっても誘導体化され得る。

【0139】

加えて、システインでの修飾は、下でさらに記載される抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）適用において特に有用である。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、薬物部分のより特異的且つ制御された配置を可能にするために、特に「チオール反応性」である１つ以上のシステインを含有するように操作され得る。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５２１，５４１号明細書を参照されたい。

【0140】

ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化され、なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり；この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施される。

【0141】

リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。

【0142】

アルギニル残基は、１つ又は複数の従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応により修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。

【0143】

チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製する、上記のクロラミンＴ法が好適である。

【0144】

カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、任意選択により、異なるアルキル基、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。

【0145】

二官能性薬剤による誘導体化は、様々な方法における使用のための水不溶性支持体マトリックス又は表面に抗体を架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化され得る中間体が得られる。代わりに、シアノゲン−ブロミド活性化炭水化物並びに全てが全体として参照により組み込まれる米国特許第３，９６９，２８７号明細書；同第３，６９１，０１６号明細書；同第４，１９５，１２８号明細書；同第４，２４７，６４２号明細書；同第４，２２９，５３７号明細書；及び同第４，３３０，４４０号明細書において記載される反応性物質などの反応性水不溶性マトリックスがタンパク質固定化のために利用される。

【0146】

グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化されて、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。代わりに、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本開示の範囲内に含まれる。

【0147】

他の修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］（全体が本明細書に組み込まれる））、Ｎ末端アミンのアセチル化並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

【0148】

加えて、当業者に理解されるとおり、標識（蛍光性、酵素性、磁性、放射性などを含む）は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（及び本開示の他の組成物）のいずれかに付加され得る。

【0149】

グリコシル化
別の種類の共有結合的修飾は、グリコシル化における改変である。別の実施形態では、本明細書で開示される抗体（又は他の種類の抗原結合タンパク質）は、１つ以上の操作されたグリコフォームを含むように修飾され得る。本明細書で使用する場合、「操作されたグリコフォーム」は、抗体に共有結合された糖質組成物を意味し、前記糖質組成物は、親抗体のものと化学的に異なる。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強するか又は低減することを含むが、これに限定されない様々な目的のために有用であり得る。操作されたグリコフォームの好ましい形態は、アフコシル化であり、これは、おそらくＦｃγＲＩＩＩａ受容体へのより緊密な結合を介してＡＤＣＣ機能の増加に相関することが示されている。これに関連して、「アフコシル化」は、宿主細胞において産生される抗体の大半が実質的にフコースを欠き、例えば生成された抗体の９０％、９５％又は９８％が、抗体の糖鎖（一般にＦｃ領域のＮ２９７で結合される）の構成要素として認識できるフコースを有しないことを意味する。定義された機能的にアフコシル化された抗体は、一般に、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して少なくとも５０％以上の親和性を示す。

【0150】

任意選択により、ヘテロ二量体抗体は、例えば、２９２位、２９７位又は３０２位の１つ以上において、もう１つのグリコシル化部位を除去する配列改変を含む。１つの非限定的な実施例は、例えば、全体として且つ特にＳＥＦＬ２変異の説明に関して参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５４６，２０３号明細書においてさらに記載される１つ以上の好適なエフェクター機能（ＳＥＦＬ２）変異（例えば、ＩｇＧ１骨格における）の導入を含む。この改変は、本明細書で開示される任意の他の改変、例えば脱アミド化を減少させるＮ６７Ｑ改変に加えて使用され得る。

【0151】

操作されたグリコフォームは、当技術分野で知られる様々な方法によって作製され得る。例えば、全てが全体として参照により組み込まれるＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書及び同第２００３；０００３０９７号明細書；並びに国際公開第００／６１７３９Ａ１号パンフレット及び国際公開第０１／２９２４６Ａ１号パンフレット、国際公開第０２／３１１４０Ａ１号パンフレット、国際公開第０２／３０９５４Ａ１号パンフレット、並びにポテリジェント（登録商標）技術［Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ］及びＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）グリコシル化操作技術［Ｇｌｙｃａｒｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｅｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］を参照されたい。これらの技術の多くは、例えば、様々な生物又は操作されたか若しくは別の方法による細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）においてＩｇＧを発現させることにより、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］及び／又はβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］））を調節することにより、又はＩｇＧが発現された後に糖質を修飾することにより、Ｆｃ領域に共有結合されたフコシル化及び／又はバイセクティングオリゴ糖のレベルを制御することに基づく。例えば、「糖操作された抗体技術」は、産生中にフコシル化を阻害する修飾された糖類を付加することによって機能し；例えば全体として参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９０３１７８６９号明細書を参照されたい。操作されたグリコフォームは、通常、様々な糖質又はオリゴ糖指し；したがって、抗体は、操作されたグリコフォームを含み得る。

【0152】

代わりに、操作されたグリコフォームは、様々な糖質又はオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体を指し得る。当技術分野で知られるとおり、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論じる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は非存在）又はそのタンパク質を産生する宿主細胞若しくは生物体の両方に依存し得る。個々の発現系について以下で論じる。

【0153】

ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用し得るが、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つの付加を指す。

【0154】

抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上述のトリペプチド配列の１つ以上が含まれるようにアミノ酸配列を改変することにより達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。改変は、１つ以上のセリン若しくはトレオニン残基の開始配列への付加又はそれによる置換によってもなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗体アミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変化により、特に所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成されるように、予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって改変することが好ましい。

【0155】

抗原結合タンパク質（例えば、抗体）上の糖鎖の数を増やす別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。これらの手順は、それらがＮ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、両方が全体として参照により組み込まれる国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６において記載されている。

【0156】

出発抗体（例えば、翻訳後）上に存在する糖鎖の除去は、化学的又は酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は均等な化合物へのタンパク質の曝露が必要となる。この処理により、ポリペプチドは無傷な状態のままで、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化については、両方が全体として参照により組み込まれるＨａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載されている。ポリペプチド上の糖鎖の酵素的切断は、全体として参照により組み込まれるＴｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されるとおりの様々なエンド及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、全体として参照により組み込まれるＤｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載されるとおりの化合物ツニカマイシンの使用によって妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。

【0157】

抗体の共有結合修飾の別の種類は、例えば、全てが全体として参照により組み込まれるＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの２００５−２００６ ＰＥＧカタログ（Ｎｅｋｔａｒのウェブサイトで利用可能）又は米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書；若しくは同第４，１７９，３３７号明細書において記載される様式において、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンなどの様々なポリオールを含むが、これらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーに抗体を連結することを含む。加えて、当技術分野で知られるとおり、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために抗体内の様々な位置でアミノ酸置換がなされ得る。例えば、全体として参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号明細書を参照されたい。

【0158】

追加の機能性のための追加のＦｃ変異体
上記のｐＩアミノ酸変異体及び他の変異体に加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合を改変すること、ＦｃＲｎ受容体への結合の改変などを含むが、これらに限定されない様々な理由のために作製され得るいくつかの有用なＦｃアミノ酸改変が存在する。以下の改変が上記の改変のいずれかに加えて又はその代わりに利用され得る。

【0159】

ＦｃγＲ変異体
ＦｃγＲ受容体の１つ以上に対する結合を変えるために作製され得るいくつかの有用なＦｃ置換がある。結合の増加及び結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害；ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上で結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞性反応）の増加をもたらす。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）に対する結合の減少は、いくつかの状況において同様に有益であり得る。本開示において有用なアミノ酸置換としては、全てが全体として且つ特に開示される変異体に関して参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号明細書（特に図４１）、同第２００６／０１２１０３２号明細書、同第２００６／０２３５２０８号明細書、同第２００７／０１４８１７０号明細書において列挙されるものが挙げられる。有用な特定の変異体としては、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ及び２９９Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。

【0160】

加えて、４３４Ｓ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ又はＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むが、これらに限定されない、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号明細書において具体的に開示されるとおりの、ＦｃＲｎ受容体に対する結合の増加及び血清半減期の増大において有用な追加Ｆｃ置換がある。

【0161】

Ｆｃ切断変異体
本開示に関連して有用な追加の変異体は、Ｆｃγ受容体への結合を切断する（例えば、減少させるか又は除去する）ものである。これは、ヘテロ二量体抗体の潜在的な作用機序を減少させる（例えば、ＡＤＣＣ活性を減少させる）ために望ましい場合がある。いくつかの好適なＦｃ切断変異体は、図６において示され、任意選択により且つ独立して、ｐＩ及び立体変異体を含む任意の他のヘテロ二量体化変異体と組み合わせて含まれ得るか又は除外され得る。

【0162】

いくつかの実施形態において、ｐＩ変異体を含まず、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正側と対になるｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、非対称変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含有する第１の単量体（「負側」）（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）が特に有用であり、正側は、ｓｃＦｖを含む単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第２の実施形態は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正側（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖを含む単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第３の実施形態は、ｐＩ変異体を有さず、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを有する正側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖを含む単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第４の実施形態は、ｐＩ変異体を含まず、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む正側と対になるｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、非対称変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９を含有する第１の単量体（「負側」）（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用する。第５の実施形態は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む正側（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用する。第６の実施形態は、正側単量体の非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカー（特にｓｃＦｖが抗ＣＤ３である場合）を含有する。第７の実施形態は、ｐＩ変異体を含まず、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む正側と対になるｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、非対称変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ及び切断変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含有する第１の単量体（「負側」）（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第８の実施形態は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む正側（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第９の実施形態は、ｐＩ変異体を有さず、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを有する正側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第１０の実施形態は、ｐＩ変異体を含まず、非対称変異体Ｓ３６４／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む正側と対になるｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、非対称変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ及び切断変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含有する第１の単量体（「負側」）（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第１１の実施形態は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む正側（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。第１２の実施形態は、ｐＩ変異体を有さず、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを有する正側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）と対になるＩ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び切断変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む第１の負側単量体（任意選択によりＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを含有する両方の単量体）を利用し、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、且つ荷電ｓｃＦｖリンカーを含有する。

【0163】

様々な態様において、第１の可変重鎖ドメインを含む第１の重鎖、第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖、ヒトＣＤ３に結合し、且つｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン重鎖を含むｓｃＦｖを含む第１の単量体（すなわち「Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ」重鎖）は、上部ヒンジにおいて欠失を含み、且つＣＨ２及びＣＨ３置換が導入される。置換は、例えば、Ｅ２３３Ｐ、ｄｅｌＬ２３４、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、ｒ２９２ｃ、ｎ２９７ｇ、ｖ３０２ｃ、Ｅ３５７Ｑ及びＳ３６４Ｋ（ＥＵ付番、小文字は、ＳＥＦＬ２置換を指す）の１つ以上（例えば、全て）を含む。第２の可変重鎖ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む第２の重鎖を含む第２の単量体は、任意選択により、以下の変異の１つ以上（例えば、全て）を含む：Ｎ２０８Ｄ、Ｅ２３３Ｐ、ｄｅｌＬ２３４、Ｌ２３５Ｖ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２６７Ｋ、ｒ２９２ｃ、Ｑ２９５Ｅ、ｎ２９７ｇ、ｖ３０２ｃ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３８４Ｄ、Ｑ４１８Ｅ及びＮ４２１Ｄ（ＥＵ付番、小文字は、ＳＥＦＬ２置換を指す）。

【0164】

リンカー
本明細書の「リンカー」は、「リンカー配列」若しくは「スペーサー」又は文法的に正しい均等物として参照される。ホモ又はヘテロ二官能性リンカーは、よく知られている（全体として参照により組み込まれる１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，１５５−２００頁を参照されたい）。（一般的な「リンカー」と、「ｓｃＦｖリンカー」と、「荷電ｓｃＦｖリンカー」との間の区別に留意されたい。）いくつかの戦略を使用して、共有結合的に分子をともに連結し得る。これらとしては、タンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端との間のポリペプチド結合、ジスルフィド結合を介する結合及び化学的架橋試薬を介する結合が挙げられるが、これらに限定されない。この実施形態の一態様では、リンカーは、組換え技術又はペプチド合成によって生成されるペプチド結合である。リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含み得る：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ又はＴｈｒ。リンカーペプチドは、２つの分子を、それらが互いに対して妥当な立体構造をとり、その結果、所望の活性を保持するように連結するのに十分である長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーが使用され得る。有用なリンカーとしては、グリシン−セリンポリマー、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１７８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１７９）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１８０）（ここで、ｎは、少なくとも１の整数である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；及び他の可動性リンカーが挙げられる。代わりに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない様々な非タンパク質性のポリマーがリンカーとして有用であり得る。

【0165】

他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの任意の配列を含み得るが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基ではなく；例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣκ又はＣλに由来し得る。リンカーは、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε及びＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列は、Ｉｇ様タンパク質などの他のタンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列及び他のタンパク質由来の他の天然配列にも由来し得る。

【0166】

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で概説される任意の２つのドメインをともに連結するのに使用される「ドメインリンカー」である。例えば、図１８Ｆにおいて、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合するドメインリンカーは、ｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合する別の任意選択のドメインリンカーとともに存在し得る（ただし、多くの実施形態では、ヒンジがこのドメインリンカーとして使用される）。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヒンジ領域及びその断片である。

【0167】

抗体−薬物コンジュゲート
本開示の抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はヘテロ二量体抗体）は、任意選択により、薬物とコンジュゲートされて、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成する。一般に、ＡＤＣは、癌研究応用を含む様々な関連において使用されるが、ここで、細胞障害性薬剤又は細胞分裂阻害剤の局所的送達のための抗体−薬物コンジュゲートの使用は、薬物部分の腫瘍への標的化された送達を可能にし、これにより、より高い有効性、より低い毒性などが可能になる場合がある。この技術の概要は、全てが全体として参照により本明細書に組み込まれるＤｕｃｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２１：５−１３（２０１０）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．１４（３）：１５４（２００８）；及びＳｅｎｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２３５−２４４（２００９）において提供される。

【0168】

一般に、コンジュゲーションは、下でさらに記載されるとおり抗体への共有結合によって実施され、且つ一般にリンカー、多くの場合にペプチド結合に依拠する（これは、本明細書に記載されるとおり、標的部位でのプロテアーゼ又はそれ以外による切断に感受性であるように設計され得る）。加えて、リンカー−薬物単位（ＬＵ−Ｄ）の結合は、抗体内のシステインに対する結合によって達成され得る。１抗体当たりの薬物部分の数は、反応の条件に応じて変化し得、且つ１：１〜１０：１の薬物：抗体で変動し得る。当業者に理解されるとおり、実際の数は、平均値である。

【0169】

ＡＤＣの薬物は、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞障害性薬剤を含むが、これらに限定されないいくつかの薬剤のいずれかから選択され得る。本開示は、ＡＤＣを使用する方法をさらに提供する。

【0170】

本開示に関連して、使用のための薬物は、細胞障害薬物、特に癌療法のために使用されるものを含む。そのような薬物は、一般に、ＤＮＡ損傷薬剤、代謝拮抗薬、天然の生成物及びそれらの類似体を含む。細胞障害性薬剤の例示的なクラスは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤及びチミジル酸シンターゼ阻害剤などの酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、マイタンシノイド、分化誘導剤並びにタキソールを含む。

【0171】

これらのクラスのメンバーは、例えば、メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン及びエトポシド又はリン酸エトポシドなどのポドフィロトキシン誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールを含むタキサン、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリチアマイシン、エスペラミシン、エン−ジイン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリチアマイシン、カンプトテシン、マイタンシノイド（ＤＭ１を含む）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）及びマイタンシノイド（ＤＭ４）並びにそれらの類似体を含む。

【0172】

毒素は、抗体−毒素コンジュゲートとして使用され得、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ （２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３号明細書；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３）及びカリチアマイシン（Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）を含む。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってそれらの細胞障害効果及び細胞増殖抑制効果を発揮し得る。

【0173】

抗体（又は他の抗原結合タンパク質）のコンジュゲート並びにマイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテシン、カリチアマイシン及びＣＣ１０６５などの１つ以上の小分子毒素並びに毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が企図される。

【0174】

マイタンシノイド薬物部分としての使用に好適なマイタンシン化合物は、当技術分野でよく知られており、遺伝子操作技術を使用してもたらされる既知の方法（Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ ９９：７９６８−７９７３を参照されたい）に従って天然の供給源から、又は既知の方法に従って合成的に調製されるマイタンシノール及びマイタンシノール類似体から単離され得る。下記のとおり、薬物は、抗体へのコンジュゲーションのためのチオール基又はアミン基などの機能的に活性な基の組み込みによって修飾され得る。

【0175】

例示的なマイタンシノイド薬物部分は、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号明細書）（アンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元により調製される）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号明細書及び同第４，３０７，０１６号明細書）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）若しくはアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用する脱メチル又はＬＡＨを使用する脱塩素により調製される）；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号明細書）（塩化アシルを使用するアシル化により調製される）並びに他の位置での修飾を有するものなどの修飾された芳香環を有するものを含む。

【0176】

例示的なマイタンシノイド薬物部分は、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号明細書）（Ｈ２Ｓ又はＰ２Ｓ５によるマイタンシノールの還元により調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号明細書）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号明細書）（ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製される）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号明細書）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの変換により調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号明細書及び同第４，３１５，９２９号明細書）（トレウィア・ヌドルフローラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）から単離される）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号明細書及び同第４，３２２，３４８号明細書）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの脱メチル化により調製される）；並びに４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号明細書）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）などの修飾を有するものも含む。

【0177】

ＤＭ１（参照により組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号明細書において開示される）及びＤＭ４（参照により組み込まれる米国特許第７，２７６，４９７号明細書において開示される）が特に有用である。また、全てが全体として参照により明示的に組み込まれる米国特許第５，４１６，０６４号明細書；同第６，４４１，１６３号明細書；同第７，３０３，７４９号明細書；同第７，３６８，５６５号明細書；及び同第７，６０１，３５４号明細書；国際公開第０１／２４７６３号パンフレット、国際公開第０２／０９８８８３号パンフレット、国際公開第０２／１６３６８号パンフレット及び国際公開第０４／１０３３２７２号パンフレット；並びに米国特許出願第１２／６３１，５０８号明細書におけるいくつかの追加のマイタンシノイド誘導体及び方法を参照されたい。

【0178】

マイタンシノイドを含有するＡＤＣ、それを作製する方法及びそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書；同第５，４１６，０６４号明細書；同第６，４４１，１６３号明細書並びに欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書において開示され、これらの開示は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に対して向けられるモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたマイタンシノイドで設計されたＤＭ１を含むＡＤＣを記載した。

【0179】

Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）は、マイタンシノイドが、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７又はＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に対してジスルフィドリンカーを介してコンジュゲートされたＡＤＣを記載している。薬物コンジュゲートは、遊離マイタンシノイド薬物と同様のある程度の細胞障害性を達成し、１抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加させることができた。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ドラスタチン又はドラスタチンペプチド性類似体若しくは誘導体又はオーリスタチンを含む（米国特許第５，６３５，４８３号明細書及び同第５，７８０，５８８号明細書）。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解並びに核及び細胞分裂に支障をきたすことが示されており（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ （１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有する。ドラスタチン又はオーリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合され得る（国際公開第０２／０８８１７２号パンフレット）。様々な態様において、ヘテロ二量体抗体は、エリブリンの投与も含む治療計画の一部である。

【0181】

例示的なオーリスタチンの実施形態は、２００４年３月２８日に提出されたＳｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３に開示され、且つ開示が全体として参照により明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４８号明細書に記載されるＮ末端に連結されたモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦを含む。例示的なオーリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＥである（全体として参照により明示的に組み込まれる米国特許第６，８８４，８６９号明細書を参照されたい）。別の例示的なオーリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＦである（全体として参照により明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書並びに米国特許第５，７６７，２３７号明細書及び同第６，１２４，４３１号明細書を参照されたい）。

【0182】

通常、ペプチドに基づく薬物部分は、２つ以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製され得る。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野でよく知られる液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）に従って作製され得る。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号明細書及び同第５，７８０，５８８号明細書；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ ５：８５９−８６３；及びＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（７）：７７８−７８４の方法に従って調製され得る

【0183】

他の実施形態では、ＡＤＣは、１つ以上のカリチアマイシン分子を含む。例えば、マイロターグは、最初の市販のＡＤＣ薬物であり、ペイロードとしてカリチアマイシンγ１を利用する（全体として参照により組み込まれる米国特許第４，９７０，１９８号明細書を参照されたい）。追加のカリチアマイシン誘導体は、全てが参照により明示的に組み込まれる米国特許第５，２６４，５８６号明細書、同第５，３８４，４１２号明細書、同第５，５５０，２４６号明細書、同第５，７３９，１１６号明細書、同第５，７７３，００１号明細書、同第５，７６７，２８５号明細書及び同第５，８７７，２９６号明細書において記載される。抗生物質のカリチアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二重鎖ＤＮＡ切断を生成できる。カリチアマイシンファミリーのコンジュゲートの作製については、米国特許第５，７１２，３７４号明細書、同第５，７１４，５８６号明細書、同第５，７３９，１１６号明細書、同第５，７６７，２８５号明細書、同第５，７７０，７０１号明細書、同第５，７７０，７１０号明細書、同第５，７７３，００１号明細書、同第５，８７７，２９６号明細書（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙに対する）を参照されたい。使用され得るカリチアマイシンの構造的類似体としては、γ１Ｉ、α２Ｉ、α２Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄに対する前述の米国特許）。抗体がコンジュゲートされ得る別の抗腫瘍薬物は、葉酸代謝拮抗剤であるＱＦＡである。カリチアマイシン及びＱＦＡは、両方とも細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。したがって、抗体媒介性の内部移行を介するこれらの薬剤の細胞取込みは、それらの細胞障害効果を大幅に増強する。

【0184】

ＣＣ−１０６５（参照により組み込まれる米国特許第４，１６９，８８８号明細書を参照されたい）及びデュオカルマイシンは、ＡＤＣにおいて利用される抗腫瘍抗生物質のファミリーのメンバーである。これらの抗生物質は、副溝におけるアデニンのＮ３でＤＮＡを配列選択的にアルキル化することにより機能するように見え、アポトーシスを引き起こす現象のカスケードを開始する。デュオカルマイシンの重要なメンバーとしては、デュオカルマイシンＡ（参照により組み込まれる米国特許第４，９２３，９９０号明細書）及びデュオカルマイシンＳＡ（参照により組み込まれる米国特許第５，１０１，０３８号明細書）並びに全てが参照により明示的に組み込まれる米国特許第７，５１７，９０３号明細書、同第７，６９１，９６２号明細書、同第５，１０１，０３８号明細書；同第５，６４１，７８０号明細書；同第５，１８７，１８６号明細書；同第５，０７０，０９２号明細書；同第５，０７０，０９２号明細書；同第５，６４１，７８０号明細書；同第５，１０１，０３８号明細書；同第５，０８４，４６８号明細書；同第５，４７５，０９２号明細書；同第５，５８５，４９９号明細書；同第５，７０３，０８０号明細書；同第６，９８９，４５２号明細書；同第７，０８７，６００号明細書；同第７，１２９，２６１号明細書；同第７，４９８，３０２号明細書；同第７，５０７，４２０号明細書；及び同第５，８４６，５４５号明細書；並びに国際公開第２００７／０８９１４９号パンフレット及び国際公開第２００９／０１７３９４Ａ１号パンフレットに記載されるとおりの多数の類似体が挙げられる。

【0185】

他の細胞障害性薬剤
抗原結合タンパク質にコンジュゲートされ得る他の抗腫瘍薬剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号明細書及び第５，７７０，７１０号明細書に記載されるＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として一括して知られる薬剤のファミリー並びにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号明細書）が挙げられる。

【0186】

使用され得る酵素的に活性な毒素及びその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・カランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレットを参照されたい。

【0187】

本開示は、抗原結合タンパク質と、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間で形成されるＡＤＣをさらに企図する。

【0188】

腫瘍の選択的破壊のために、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はヘテロ二量体抗体）は、高度に放射性の原子を含み得る。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生成のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。

【0189】

放射性又は他の標識は、既知の様式におけるコンジュゲートにおいて組み込まれ得る。例えば、ペプチドは、生合成され得るか、又は例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成により合成され得る。Ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１などの標識は、ペプチドにおけるシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合され得る。ヨードゲン法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）がヨウ素−１２３を組み込むために使用され得る。“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”（Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は、他の方法の詳細を記載している。

【0190】

いくつかの場合、ｐが他の薬物負荷を有するＡＤＣから一定の値である均一なＡＤＣの分離、精製及び特徴付けは、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段によって達成され得る。例示的な実施形態では、ｐは、２、３、４、５、６、７若しくは８又はその分数である。

【0191】

化学修飾も、その化合物の反応を本発明のコンジュゲートを作製する目的に対してより好都合にするために、所望の化合物に対してなされ得ることが理解されるであろう。例えば、官能基、例えばアミン、ヒドロキシル又はスルフヒドリルは、薬物の活性又は他の特性に最小限の又は許容される効果を及ぼす位置で薬物に付加され得る。

【0192】

リンカー単位
通常、抗原結合タンパク質−薬物コンジュゲートは、薬物単位と抗原結合タンパク質単位との間にリンカー単位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内又は細胞外条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断により、適切な環境において抗原結合タンパク質から薬物単位が放出される。例えば、ある種のプロテアーゼを分泌する固形腫瘍は、切断可能なリンカーの標的としての役割を果たす可能性があり；他の実施形態では、それは、利用される細胞内プロテアーゼである。さらに他の実施形態では、リンカー単位は、切断可能ではなく、薬物は、例えば、リソソームにおける抗体分解によって放出される。

【0193】

いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又は小胞状細胞内構造内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３以上のアミノ酸長である。

【0194】

切断剤としては、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンを含み得るが、これらに限定されず、これらの全ては、標的細胞の内部で活性の薬物の放出をもたらすジペプチド薬物誘導体を加水分解することが知られる（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３を参照されたい）。ＣＤ３８発現細胞に存在する酵素により切断可能なペプチジルリンカーである。例えば、癌性組織において高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼのカテプシンＢにより切断可能なペプチジルリンカーが使用され得る（例えば、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ又はＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー（配列番号１８１））。そのようなリンカーの他の例は、全体として参照により組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号明細書において記載される。

【0195】

いくつかの実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーによるドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号明細書を参照されたい）。

【0196】

他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、すなわち一定のｐＨ値で加水分解に対して感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解できる。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る。（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号明細書；同第５，８２４，８０５号明細書；及び同第５，６２２，９２９号明細書；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照されたい）。そのようなリンカーは、血液中のものなどの中性ｐＨ条件下で相対的に安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５又は５．０未満で不安定である。ある種の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号明細書を参照されたい））である。

【0197】

さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で知られており、例えばＳＡＴＡ（Ｎ−サクシニミジル−５−アセチルチオアセタート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチラート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−サクシニミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−並びにＳＰＤＢ及びＳＭＰＴを使用して形成され得るものが挙げられる。例えば、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７）を参照されたい。また、米国特許第４，８８０，９３５号明細書も参照されたい。

【0198】

他の実施形態では、リンカーは、マロナートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）又は３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。

【0199】

さらに他の実施形態では、リンカー単位は、切断可能ではなく、薬物は、抗体分解によって放出される。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書を参照されたい。

【0200】

多くの実施形態では、リンカーは、自己犠牲である。本明細書で使用する場合、用語「自己犠牲スペーサー」は、間隔をあけた２つの化学的部分を合わせて共有結合して安定した３部分からなる分子にすることができる二官能性の化学的部分を指す。それは、第１の部分に対するその結合が切断される場合、第２の化学的部分から自発的に分離することになる。例えば、薬物及び切断可能な基質が自己犠牲リンカーを介して任意選択により結合され、且つ全てが参照により明示的に組み込まれる、薬物−切断可能な基質のコンジュゲートに関する国際公開第２００７０５９４０４Ａ２号パンフレット、国際公開第０６１１０４７６Ａ２号パンフレット、国際公開第０５１１２９１９Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１０／０６２１７１号パンフレット、国際公開第０９／０１７３９４号パンフレット、国際公開第０７／０８９１４９号パンフレット、国際公開第０７／０１８４３１号パンフレット、国際公開第０４／０４３４９３号パンフレット及び国際公開第０２／０８３１８０号パンフレットを参照されたい。

【0201】

多くの場合、リンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性ではなく、すなわち、抗原結合タンパク質−薬物コンジュゲートの試料中のリンカーの約２０％、１５％、１０％、５％、３％以下又は約１％以下は、抗原結合タンパク質−薬物コンジュゲートが細胞外環境（例えば、血漿中）に存在するときに切断される。リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性でないかどうかは、例えば、抗原結合タンパク質−薬物コンジュゲート化合物を血漿と既定の期間（例えば、２、４、８、１６又は２４時間）インキュベートし、続いて血漿中に存在する遊離薬物の量を定量化することによって決定され得る。

【0202】

互いに排他的ではない他の実施形態では、リンカーは、細胞内部移行を促進する。ある種の実施形態では、リンカーは、治療剤にコンジュゲートされるときに（すなわち本明細書に記載されるとおりのＡＤＣのリンカー−治療剤部分の環境において）細胞内部移行を促進する。さらに他の実施形態では、リンカーは、オーリスタチン化合物及び本開示の抗原結合タンパク質の両方にコンジュゲートされるときに細胞内部移行を促進する。

【0203】

本組成物及び方法とともに使用され得る様々な例示的なリンカーは、国際公開第２００４−０１０９５７号パンフレット並びに米国特許出願公開第２００６／００７４００８号明細書、同第２００５０２３８６４９号明細書及び同第２００６／００２４３１７号明細書（各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。

【0204】

上記の治療剤は、別々に投与され得、すなわち様々な実施形態において抗原結合タンパク質にコンジュゲートされない場合があることが理解されるであろう。

【0205】

薬物負荷
薬物負荷は、ｐにより表され、分子における１抗原結合タンパク質当たりの薬物部分の平均数である。薬物負荷（「ｐ」）は、１抗原結合タンパク質当たりの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超える部分（Ｄ）であり得るが、多くの場合、平均数は、分数又は小数である。一般に、１〜４の薬物負荷が多くの場合に有用であり、且つ１〜２も有用である。本開示のＡＤＣは、１〜２０の薬物部分の範囲でコンジュゲートされた抗原結合タンパク質の収集物を含む。コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製物中の１抗原結合タンパク質当たりの薬物部分の平均数は、質量分析及びＥＬＩＳＡアッセイなどの従来の手段によって特徴付けされ得る。

【0206】

ｐの点からＡＤＣの定量的分布も決定され得る。いくつかの場合、ｐが他の薬物負荷を有するＡＤＣから一定の値である均一なＡＤＣの分離、精製及び特徴付けは、電気泳動などの手段によって達成され得る。

【0207】

いくつかのＡＤＣに関して、ｐは、抗原結合タンパク質上の結合部位の数によって制限され得る。例えば、結合がシステインチオールである場合、上記の例示的な実施形態の場合のように、抗原結合タンパク質は、１つのみ又は複数のシステインチオール基を有し得るか、又はリンカーが結合され得る１つのみ又は複数の十分に反応性のチオール基を有し得る。ある種の実施形態では、より高い薬物負荷、例えばｐ＞５は、ある種の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性又は細胞透過性の消失を引き起こす場合がある。ある種の実施形態では、本開示のＡＤＣに関する薬物負荷は、１〜約８；約２〜約６；約３〜約５；約３〜約４；約３．１〜約３．９；約３．２〜約３．８；約３．２〜約３．７；約３．２〜約３．６；約３．３〜約３．８；又は約３．３〜約３．７の範囲である。実際に、ある種のＡＤＣに関して、１抗原結合タンパク質当たりの薬物部分の最適な比は、８未満であり得、且つ約２〜約５であり得る。米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９Ａ１号明細書（全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0208】

ある種の実施形態では、薬物部分の理論的最大値未満がコンジュゲーション反応中に抗原結合タンパク質にコンジュゲートされる。抗原結合タンパク質は、例えば、下記のとおりの薬物−リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しないリジン残基を含有し得る。一般に、抗体は、薬物部分に連結され得る多くの遊離及び反応性のシステインチオール基を含有せず；実際に、抗体中の大部分のシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。ある種の実施形態では、抗体は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤とともに、部分的又は全体的な還元条件下で反応されて、反応性のシステインチオール基を生成し得る。ある種の実施形態では、抗体は、変性条件にかけられて、リジン又はシステインなどの反応性求核基を暴露する。

【0209】

ＡＤＣの負荷（薬物／抗原結合タンパク質比）は、例えば、（ｉ）抗体に対して薬物−リンカー中間体又はリンカー試薬のモル過剰量を制限すること、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間又は温度を制限すること、（ｉｉｉ）部分的又は限定的なシステインチオール修飾のための反応性条件、（ｉｖ）システイン残基の数及び位置がリンカー−薬物結合の数及び／又は位置の制御のために修飾されるように抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を組込み技術により操作すること（例えば、国際公開第２００６／０３４４８８号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込まれる）において開示されるとおりに調製されるチオＭａｂ又はチオＦａｂなど）による様々な方法において制御され得る。

【0210】

２つ以上の求核基が薬物−リンカー中間体又はリンカー試薬に続いて薬物部分試薬と反応する場合、得られる生成物は、抗原結合タンパク質に結合した１つ以上の薬物部分の分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であることが理解されるべきである。１抗原結合タンパク質当たりの薬物の平均数は、抗原結合タンパク質に特異的且つ薬物に特異的な二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって混合物から計算され得る。個々のＡＤＣ分子は、質量分析により混合物において同定され得、且つＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離され得る。

【0211】

いくつかの実施形態では、単一の負荷値を有する均一なＡＤＣは、電気泳動又はクロマトグラフィーによりコンジュゲーション混合物から単離され得る。

【0212】

組成物
本開示に従う使用のための製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、所望の純度を有する抗原結合タンパク質を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と混合することによって保管のために調製される。本開示の組成物は、無菌であることが好ましい。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用する用量及び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、それらには、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）；並びに／或いはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0213】

製剤は、治療されている特定の徴候のために必要に応じて２つ以上の活性化合物も含有し得、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものである。例えば、他の特異性を有する抗原結合タンパク質を提供することが望ましい場合がある。代わりに又は加えて、組成物は、本明細書で言及される薬物のいずれかなどの細胞障害性薬剤、サイトカイン、増殖阻害剤及び／又は小分子アンタゴニストを含み得る。このような分子は、意図する目的のために有効な量で組み合わされて好適に存在する。

【0214】

活性成分は、例えば、コアセルベーション手法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションにも取り込まれ得る。このような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0215】

徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の好適な例としては、抗原結合タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニルコポリマー、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間を超えて分子を放出できるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。

【0216】

カプセル化された抗体が長時間体内に残存する場合、３７℃の水分に曝露される結果として、それらは、変性又は凝集し、生物学的活性の消失及び免疫原性の可能な変化が生じ得る。関与している機構に応じた安定化のための合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子間のＳ−Ｓ結合の形成であると分かったら、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化を達成することができる。

【0217】

投与様式
抗原結合タンパク質及び任意選択により化学療法剤又は別の抗体治療（例えば、抗ＰＤ−１抗体）などの併用療法は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、関節内、病巣内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、腫瘍内、求心性リンパ管又は吸入経路などの臨床的に許容される方法に従って対象に投与される。抗原結合タンパク質の静脈内又は皮下投与が好ましい。ボーラス注射及び持続注入は、例えば、疾患又は損傷の部位での局所投与と同様に企図される。エクスビボでの手順における抗原結合タンパク質（任意選択により別の治療剤を伴う）の使用も企図される。例えば、患者の血液又は他の体液は、エクスビボで抗原結合タンパク質と接触され得、また任意選択により投与され得る。抗原結合タンパク質は、好適な不溶性マトリックス又は固体支持材料に結合され得る。

【0218】

使用方法
本開示は、治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はヘテロ二量体抗体）を投与することを含む方法を提供する。様々な実施形態では、本開示は、癌（前立腺癌又はユーイング肉腫など）の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はヘテロ二量体抗体）を投与することを含む方法を提供する。本開示は、治療を、それを必要とする対象において行うための本開示の抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はヘテロ二量体抗体）の使用であって、対象における癌（例えば、前立腺癌又はユーイング肉腫）の治療のための使用などをさらに提供する。癌は、好ましくは、ＳＴＥＡＰ１の増加した発現（例えば、１０，０００ ＳＴＥＡＰ１／細胞より多い）を伴う癌である。癌の例としては、前立腺、乳房、膵臓、膀胱、胃腸管、精巣、卵巣、子宮頚部の癌並びに肉腫（ユーイング肉腫）及び黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0219】

本明細書に記載される対象を治療する方法は、疾患若しくは状態の改善及び／又は疾患若しくは状態と関連する症状における改善をもたらすことが意図される。例えば、治療応答は、疾患における以下の改善の１つ以上を指すであろう：（１）新生細胞の数の減少；（２）新生細胞死の増加；（３）新生細胞生存の阻害；（５）腫瘍増殖又は新たな病変の出現の阻害（すなわちある程度遅くする、好ましくは止める）；（６）患者の生存率の上昇；及び／又は（７）（例えば、前立腺癌、頻尿症、夜間多尿、血尿症、排尿障害又は骨痛に関連して；ユーイング肉腫、疼痛、腫脹又は患部の圧痛に関連して）疾患又は状態と関連する１つ以上の症状の多少の緩和。

【0220】

任意の所与の疾患又は状態における治療応答は、その疾患又は状態に特異的な標準化された効果判定基準によって決定され得る。腫瘍応答は、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、骨スキャン、超音波、腫瘍生検採取、血行中の腫瘍細胞の計数及び／又は腫瘍抗原（例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及び／又はアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ））の測定などのスクリーニング手法を使用して評価され得る。これらの治療応答に加えて、療法を受けている対象は、疾患に関連する症状における改善の有益な効果を経験し得る。

【0221】

対象は、哺乳動物、好ましくはヒト、任意選択によりヒト男性である。癌に関連して、対象は、疾患の任意のステージ（すなわちステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶ前立腺癌）により診断され得るか、又は依然として臨床的に確認されていない癌を発症するリスクで診断され得る。

【0222】

前立腺癌に関して、対象は、前立腺癌に関連する症状（本明細書に記載されるものなど）の減少、腫瘍サイズの減少、前立腺癌マーカーのレベルの低減、新たな病変の出現の速度の低減などを経験し得る。様々な態様において、本開示の方法は、対象において治療をモニタリングすることをさらに含む。対象の健康における改善が企図される（例えば、臨床的に検出可能な疾患がないこと、新たな病変の非存在下での測定可能な腫瘍量（すなわち対象において存在する悪性細胞の数又は腫瘍質量の測定される容積）の任意の減少（少なくとも約５０％の減少など）、疼痛の低減、排尿の改善）。

【0223】

本開示に従う治療は、「治療有効量」の使用される医薬を含む。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、疾患状態、年齢、性別及び個体の体重並びに個体において所望の応答を誘発する医薬の能力などの要因に応じて変動し得る。治療有効量は、治療上有益な効果のいずれの毒性又は有害作用にもまさる量である。腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化するその能力によっても測定され得る。本開示の抗原結合タンパク質の治療有効量に関する例示的な非限定的な範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。非経口組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与単位剤形において製剤化され得る。本明細書で使用する場合、投与単位剤形は、治療される対象に対する単位投与量として適合された物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要とされる医薬品担体と共同して所望の生物学的効果をもたらすように計算された既定量の治療薬を含有する。

【0224】

いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、単一特異性抗体又はヘテロ二量体抗体）は、１つ以上の追加の治療剤、例えば化学療法剤又は免疫療法剤と組み合わせて使用される。追加の治療剤は、連続的に（互いに数分、数時間、数日又は数週間以内）又は並行して投与され得る。それらは、予め混合された単一の組成物においても患者に投与され得る。

【0225】

ＤＮＡ損傷化学療法剤の非限定的な例としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン及びその類似体又は代謝産物並びにドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド及びダウノルビシン）；アルキル化薬剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ及びシクロホスファミド）；ＤＮＡ干渉物質（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、エピルビシン及びカルボプラチン）；ＤＮＡ干渉物質及びブレオマイシンなどのフリーラジカル発生剤；並びにヌクレオシド模倣物（例えば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及びヒドロキシ尿素）が挙げられる。

【0226】

細胞複製を妨害する化学療法剤としては、パクリタキセル、ドセタキセル及び関連する類似体；カバジタキセル；ビンクリスチン、ビンブラスチン及び関連する類似体；サリドマイド、レナリドミド及び関連する類似体（例えば、ＣＣ−５０１３及びＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブメシル酸塩及びゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；ＩκＢキナーゼの阻害剤を含むＮＦ−κＢ阻害剤；癌において過剰発現されるタンパク質に結合し、それにより細胞複製を下方制御する抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ及びベバシズマブ）；並びに阻害が細胞複製を下方制御する、癌において上方制御されるか、過剰発現されるか又は活性化されることが知られるタンパク質又は酵素の他の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0227】

いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質（例えば、単一特異性抗体又はヘテロ二量体抗体）は、ドセタキソールによる治療前、それと同時又はその後に使用され得る。様々な態様において、抗原結合タンパク質（例えば、単一特異性抗体又はヘテロ二量体抗体）は、外科手術及び／又は放射線照射（例えば、外部ビーム又は密封小線源治療）を含む治療計画の一部として投与される。

【0228】

様々な態様において、抗原結合タンパク質（例えば、単一特異性抗体又はヘテロ二量体抗体）は、ホルモン療法（例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモンの放出又は産生を遮断する薬剤などのアンドロゲン除去療法（例えば、リュープロリド、ゴセレリン、トリプトレリン又はデガレリクス）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド又はニルタミド）、ケトコナゾール、酢酸アビラテロン、エンザルタミド）の投与も含む治療計画の一部として提供される。

【0229】

様々な態様において、抗原結合タンパク質（例えば、単一特異性抗体又はヘテロ二量体抗体）は、別の免疫療法（例えば、シプロイセル−Ｔ、ベバシズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＡＭ−２２４、ＭＤＸ−１１０５、ｅｆｔｉｌａｇｉｍｏｄ ａｌｐｈａ（ＩＭＰ３２１）又はエノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１））の投与も含む治療計画の一部として提供される。この点に関して、方法は、任意選択により、癌関連抗原又は免疫応答に関連する抗原などの様々な抗原を標的化する別の抗原結合タンパク質の投与を含む。例えば、様々な実施形態において、抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２などのその結合パートナーの１つ以上との相互作用に起因するシグナル伝達を減少させるか、遮断するか、阻害するか、抑制するか、又は干渉するＰＤ−１標的化抗原結合タンパク質（例えば、抗体）とともに対象に投与される。特定の態様において、ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２への結合を阻害する。一実施形態では、ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、機能不全Ｔ細胞の機能不全をより低減するように（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強するように）、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を媒介するＴリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって媒介されるか、又はそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを減少させる。抗ＰＤ−１抗体の例としては、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ＢＭＳ ９３６５５８、ＢＭＳ−９３６５５９、ＴＳＲ−０４２（Ｔｅｓａｒｏ）、ｅＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びピディリズマブ（ＣＴ−０１１）が挙げられる。本開示は、ＰＤ−１抗原結合タンパク質を参照するが、本開示は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２などのその結合パートナーの１つ以上との相互作用に起因するシグナル伝達を減少させるか、遮断するか、阻害するか、抑制するか、又は干渉する他のＰＤ−１結合アンタゴニストの使用も企図する。

【0230】

抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質に関して本明細書で提供される開示は、抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質にも適用される。例えば、様々な場合において、抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質は、モノクローナルＩｇＧなどの抗体である。抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、一価又は二価である。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、配列番号１８７のアミノ酸配列を有するヒトＰＤ−１に結合する。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、配列番号１８８のアミノ酸配列を有するカニクイザルＰＤ−１に結合する。例示的な場合において、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、ヒトＰＤ−１及びカニクイザルＰＤ−１の両方に結合する。

【0231】

例示的な実施形態では、ＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物の結合強度は、ＫＤに関して記載され得る。例示的な態様では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物のＫＤは、約１０^−１Ｍ、約１０^−２Ｍ、約１０^−３Ｍ、約１０^−４Ｍ、約１０^−５Ｍ、約１０^−６Ｍ、約１０^−７Ｍ、約１０^−８Ｍ、約１０^−９Ｍ又はそれ未満である。例示的な態様では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物のＫＤは、マイクロモル、ナノモル、ピコモル又はフェムトモルである。例示的な態様では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物のＫＤは、約１０^−４〜１０^−６Ｍ、又は１０^−７〜１０^−９Ｍ、又は１０^−１０〜１０^−１２Ｍ、又は１０^−１３〜１０^−１５Ｍの範囲内である。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、ヒトＰＤ−１、カニクイザルＰＤ−１又は両方に対して高い親和性を有する。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、ヒトＰＤ−１に対して１００ｐＭ未満、任意選択により約１ｐＭ〜約５０ｐＭのＫＤを有する。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、ヒトＰＤ−１に対して約１ｐＭ〜約２０ｐＭ以内又は約１０ｐＭ未満のＫＤを有する。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、カニクイザルＰＤ−１に対して１００ｐＭ未満、任意選択により約１ｐＭ〜約７５ｐＭのＫＤを有する。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、カニクイザルＰＤ−１に対して約１ｐＭ〜約２０ｐＭ以内又は約１０ｐＭ未満のＫＤを有する。

【0232】

例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２との間の結合相互作用の少なくとも５０％を阻害する。例示的な態様では、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２との間の結合相互作用の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％又は少なくとも約７０％の阻害を示す。

【0233】

例示的な場合において、抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞によるＩＬ−２のＰＤ−１媒介性の産生を阻害する。例示的な態様では、ＭＬＲにおける抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物のＩＣ５０は、約０．１ｎＭ〜約５ｎＭ以内である。例示的な態様では、ＭＬＲにおける抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物のＩＣは、２ｎＭ未満又は１ｎＭ未満である。例示的な態様では、ＭＬＲにおける抗ＰＤ−１抗体、その抗原結合抗体断片又は抗ＰＤ−１抗体タンパク質生成物のＩＣ５０は、約０．５ｎＭ〜約２ｎＭである。

【0234】

ＰＤ−１に結合する能力に関して抗体を試験する方法は、当技術分野で知られており、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＳＰＲ及び競合的阻害アッセイ（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，下記及び米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号明細書並びに競合アッセイに関する上の節を参照されたい）などの任意の好適な抗体−抗原結合アッセイを含む。他の結合アッセイ、例えば抗原又はそのエピトープへの結合に関して第２の抗体と競合する抗体の能力を試験する競合的結合アッセイ又は競合アッセイを使用して、ＰＤ−１に対して結合する抗体の能力を試験することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１７８９０５号明細書、Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４６：１６８−１７１（２０１７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２５：８９−９１（２０１７）；及びＧｏｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２９（２）：２５０−２５３（２０１７）を参照されたい。また、２つの抗体を比較する他の方法が当技術分野で知られており、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む。ＳＰＲを、抗体及び第２の抗体の結合定数を決定するために使用することができ、２つの結合定数が比較され得る。本開示は、開示される方法に関連して、ＰＤ−１タンパク質に対する本明細書に記載される抗ＰＤ−１抗体のいずれかの結合と競合するか、又はクロスブロックする抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質の使用を企図する。

【0235】

ヒト及びカニクイザルＰＤ−１結合親和性を特徴付けするための代表的な方法は、以下のとおりである。抗体は、可溶性組換え受容体ヒトＰＤ−１（１−１７０）−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ又はカニクイザルＰＤ−１（１−１６７）−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓの３段階希釈物を含有するウェル中でインキュベートされる。両方の場合において、３０ｎＭの最高ＰＤ−１濃度が選択され得る。３００秒間の結合及び５００秒間の解離は、これらのパラメーターが、通常、正確な動力学的フィットに十分な曲率をもたらすために使用され得る。ヒト／カニクイザルＰＤ−１の結合親和性は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ及びＲＥＤ３８４機器で定量化され得る。標準的なＯｃｔｅｔ試料緩衝液が試料希釈及び結合ペースライン、結合並びに解離工程のために使用され得る（例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１０ｍｇ．ｍｌ ＢＳＡ、０．１３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）。ＦｏｒｔｅＢｉｏの未加工データは、標準的な機器データ分析ソフトウェア（ｖ９及びｖ１０）を使用して以下の様式で処理され得る：（ａ）固定化された標的を有するが相互作用がない２つの参照曲線（すなわち緩衝液のみ）が平均化され、同じカラム中の残存している試料の曲線から減算され；（ｂ）結合及び解離曲線が単離され、Ｙ軸に対して整列され；（ｃ）結合及び解離工程が整列され；（ｄ）シグナルのノイズを減らすために、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタリングが実施され、及び（ｅ）各々の試料−標的相互作用について得られた結合曲線及び解離曲線のセットが単一の１：１結合モデルによりグローバルフィッティングされて、結合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄの測定値が決定され；平衡解離定数ＫＤが解離速度定数と結合速度定数との比（＝ｋｄ／ｋａ）として算出される。

【0236】

例示的な場合において、抗ＰＤ−１抗体（又はその抗原結合抗体断片若しくは抗体タンパク質生成物）は、配列番号１８９に記載される重鎖（ＨＣ）相補性決定領域１（ｖｈＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号１９０に記載されるＨＣ ＣＤＲ２（ｖｈＣＤＲ２）アミノ酸配列、配列番号１９１に記載されるＨＣ ＣＤＲ３（ｖｈＣＤＲ３）アミノ酸配列、配列番号１９２に記載される軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１（ｖｌＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号１９３に記載されるＬＣ ＣＤＲ２（ｖｌＣＤＲ２）アミノ酸配列及び配列番号１９４に記載されるＬＣ ＣＤＲ３（ｖｌＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、抗ＰＤ−１抗体（又はその抗原結合抗体断片若しくは抗体タンパク質生成物）は、配列番号１９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ｖｈ）及び／又は配列番号１９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ｖｌ）を含む。例示的な実施形態では、抗ＰＤ−１抗体（又はその抗原結合抗体断片若しくは抗体タンパク質生成物）は、配列番号１９７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は配列番号１９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0237】

例示的な態様では、本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ１コンストラクトは、腫瘍転移を阻害し、且つ／又は少なくとも１つの細胞集団に対して抗増殖性効果を有するのに有効なサイトカイン、リンホカイン、増殖因子又は造血因子の投与を含む治療レジメンの一部である。そのようなサイトカイン、リンホカイン、増殖因子又は他の造血因子としては、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子及びエリスロポエチンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる増殖因子としては、例えば、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘因物質、グリア細胞由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合性上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β１．２、トランスフォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子β３、トランスフォーミング増殖因子β５、潜在型トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体並びにキメラタンパク質及びその生物学的又は免疫学的に活性な断片が挙げられる。例示的な実施形態では、抗ＳＴＥＡＰ１コンストラクトは、前述のサイトカイン、リンホカイン、増殖因子又は他の造血因子のいずれか１つに特異的な抗体の投与を含む治療レジメンの一部として投与される。

【0238】

本開示は、癌の治療を、それを必要とする対象において行うための医薬の調製における抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体の使用を企図する。任意選択により、医薬は、有効量の抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される抗ＰＤ−１抗原結合タンパク質のいずれか）と共同して有効量の抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体を投与するためのものである。

【0239】

本開示は、癌の治療を、それを必要とする対象において行う際の（すなわち前立腺癌又はユーイング肉腫などの癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法における）使用のための、本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体をさらに企図する。任意選択により、抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体は、抗ＰＤ１抗原結合タンパク質とともに投与される。「〜とともに投与する」は、抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体が、抗ＰＤ１抗原結合タンパク質の投与を含む治療レジメンの一部であることを意味する。実際に、抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体抗体）は、抗ＰＤ１抗原結合タンパク質による治療前、それと同時に又はその後に使用され得る。抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体及び抗ＰＤ１抗原結合タンパク質の投与は、同時に行われる必要はないが、本開示は、成分が同じ医薬組成物中に含まれ、一緒に投与される実施形態を企図する。本開示は、抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体及び抗ＰＤ１抗原結合タンパク質が、並行して投与されるか又は近い時間で投与される別々の医薬組成物中に存在する治療の方法も提供する。抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質又はヘテロ二量体抗体及び抗ＰＤ１抗原結合タンパク質は、いずれかの順序で連続的に（例えば、互いに数分、数時間、数日又は数週間以内）投与され得る。投与様式は、上に記載される。

【0240】

本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ１抗原結合タンパク質は、例えば、ＳＴＥＡＰ１の存在をインビトロ又はインビボのいずれかで検出するアッセイでも使用され得る。抗原結合タンパク質は、例えば、免疫親和性クロマトグラフィーによりＳＴＥＡＰ１を精製するためにも使用され得る。

【0241】

核酸、ベクター、宿主細胞
本開示は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、単一特異性抗体又はヘテロ二量体抗体）をコードする核酸組成物をさらに提供する。本開示の抗原結合タンパク質の成分をコードする核酸は、当技術分野で知られるとおり、且つ抗原結合タンパク質を生成するために使用される宿主細胞に依存して、発現ベクターに組み込まれ得る。発現ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び他の発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、所望のポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製開始点、選択マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結される。発現ベクターは、染色体外ベクター又は組込みベクターであり得る。

【0242】

本開示の核酸及び／又は発現ベクターは、任意選択により、多くの実施形態において有用な哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）とともに、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫及び／又は真菌細胞を含む任意の数の当技術分野でよく知られるとおりの様々な種類の宿主細胞に導入される。別の態様では、本開示は、抗原結合タンパク質をコードする発現ベクターが導入されたそのような宿主細胞を提供する。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞又はその派生体（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ）、Ｃ１２７細胞、マウス胚線維芽細胞（３Ｔ３細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその派生体（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ−３）、マウス黒色腫細胞（例えば、ＮＳ０、ＧＳ−ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、ヒト骨肉腫上皮細胞Ｕ２−ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞（Ａ５４９）、ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、マウス脳腫瘍細胞（ＣＡＤ）、胚性癌腫細胞（Ｐ１９）、マウス神経芽細胞腫細胞（Ｎ２ａ）、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、網膜芽細胞腫細胞（Ｙ７９）、ヒト網膜芽細胞腫細胞（ＳＯ−Ｒｂ５０）、ヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウスＢ骨髄腫細胞（Ｊ５５８Ｌ）及びアフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞及びその派生体（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１によって記載されるとおりアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩに由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）を含む）が挙げられる。形質転換された細胞を、抗原結合タンパク質の発現を促進する条件下で培養することができ、そのタンパク質を従来の精製手順によって回収することができる。そのような精製手順の１つは、例えば、ＳＴＥＡＰ１の全て又は一部（例えば、１つ以上の細胞外ループ）が結合したマトリックス上での親和性クロマトグラフィーの使用を含む。本明細書での使用のために企図される抗原結合タンパク質は、実質的に内在性の材料が混入されていない実質的に均一な組換え抗原結合タンパク質を含む。

【0243】

ヘテロ二量体抗体に関して、様々な態様において、第１の単量体をコードする核酸、第２の単量体をコードする核酸及び共通の軽鎖をコードする核酸を含む組成物が提供される。本開示は、単量体の部分及び共通の軽鎖、例えばＳＴＥＡＰ１に結合する本明細書で開示される６つのＣＤＲを含む抗ＳＴＥＡＰ１ Ｆａｂ又は抗体断片、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、ＳＴＥＡＰ１及び／又はＣＤ３に結合する可変軽鎖ドメイン及び／又は可変重鎖ドメインなどをコードする核酸コンストラクトも提供する。

【0244】

いくつかの実施形態では、各単量体をコードする核酸及び任意選択により共通の軽鎖をコードする核酸は、それぞれ一般に異なる又は同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内に含有される。様々な実施形態において、これらの２つ又は３つの核酸の各々は、異なる発現ベクター上に含有される。米国特許出願公開第２０１６／０２１５０６３号明細書（全体として且つ特に組換え抗体産生の議論に関して参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるとおり、異なるベクター比率を使用して、ヘテロ二量体形成を駆動することができる。驚くべきことに、抗体コンストラクトが第１の単量体：第２の単量体：軽鎖を１：１：２の比で含む場合、必ずしも最良の結果をもたらす比はない。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２１５０６３号明細書の図６５を参照されたい。様々な態様において、本開示は、核酸組成物であって、ａ）第１の単量体をコードする第１の核酸を含む第１の発現ベクター；ｂ）第２の単量体をコードする第２の核酸を含む第２の発現ベクター；及びｃ）共通の軽鎖をコードする第３の核酸を含む第３の発現ベクターを含む核酸組成物を提供する。代替的な実施形態では、共通の軽鎖をコードする第３の核酸は、第１又は第２の核酸と同じ発現ベクター上に存在する。

【0245】

ヘテロ二量体抗体は、任意選択により、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。作製されると、通常、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む抗体精製工程が実施される。本明細書で議論されるとおり、２つの単量体が少なくとも０．５異なるｐＩを有することは、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動又は等電点に影響されやすい他の方法による分離を可能にし得る。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）を変えるｐＩ置換を包含し、その結果、その各単量体が異なるｐＩを有し、且つヘテロ二量体も異なるｐＩを有し、それにより等電点精製ヘテロ二量体を容易にする（例えば、アニオン交換カラム、カチオン交換カラム）。これらの置換は、精製後に混入しているｍＡｂホモ二量体の同定及びモニタリングも促進する（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ及び分析的ＩＥＸカラム）。

【0246】

キット
いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、キットにおいて提供される。例示的な態様では、キットは、単位用量（すなわち好適な担体中で分散された別々の量）として抗原結合タンパク質を含む。例示的な態様において、キットは、いくつかの単位用量、例えば任意選択により１週間又は１ヶ月供給分の単位用量を含み、各単位用量は個々にパッケージ化されるか、又はそうでなければ他の単位用量から分離される。いくつかの実施形態では、キット／単位用量の成分は、患者に投与するための説明書とともにパッケージ化される。いくつかの実施形態では、キットは、患者に投与するための１つ以上のデバイス、例えば針及び送達デバイス（シリンジなど）を含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、使用準備済の形態、例えばシリンジ、静脈内バッグなどの中に予めパッケージ化されるが、それは、抗原結合タンパク質が、再構成を必要とする凍結乾燥形態において提供され得ることも企図される。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載されるもののいずれかを含む他の治療剤又は診断剤又は薬学的に許容される担体（例えば、溶媒、緩衝液、希釈剤など）をさらに含む。

【0247】

本明細書中に引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が参照によって組み込まれるように個別的且つ具体的に指定され、その全体が本明細書に記載されているかのような場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

【0248】

以下の実施例は、単に本開示を説明するために与えられ、決してその範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0249】

実施例１
この実施例は、本明細書に記載されるとおりの単一特異性抗体を使用する前立腺癌細胞の表面でのＳＴＥＡＰ１の検出を記載する。

【0250】

ＳＴＥＡＰ１に対して向けられるＣＲＩＳＰＲコンストラクトを使用してＳＴＥＡＰ１発現を失うように操作された前立腺癌細胞（Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ細胞（図１１Ａ）又はＣ４−２Ｂ ｌｕｃ^{ＳＴＥＡＰ１ ＫＯ}細胞（図１１Ｂ））を１０μｇ／ｍＬの濃度でアイソタイプ対照抗体又は抗ＳＴＥＡＰ１マウスモノクローナル抗体（Ａｂ−Ａｍ）と４℃において１時間インキュベートした。細胞結合Ａｂ−Ａｍは、ＦＩＴＣ−コンジュゲート（図１１Ａ）又はＡＰＣ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（図１１Ｂ）とのインキュベーション後にフローサイトメトリーにより検出された。ＳＴＥＡＰ１依存的なシグナルを同定するＦＩＴＣ又はＡＰＣ蛍光は、ヒストグラム（塗りつぶしの灰色ヒストグラム）においてプロットされ、アイソタイプ対照（白色ヒストグラム）に対して比較された。結果は、図１１Ａ及び１１Ｂにおいて示される。

【0251】

実施例２
この実施例は、抗ＳＴＥＡＰ１抗体の特徴付けを記載する。

【0252】

一連の２２個の抗ヒトＳＴＥＡＰ１マウスモノクローナル抗体が作製された。抗体Ａは、試験された他のもの：Ａｂ−Ａ（６０．１）、Ａｂ−Ｂ（３．６）、Ａｂ−Ｃ（２．４）及びＡｂ−Ｄ（４．３）と比較して、向上したフローサイトメトリー結合特性（親ｍＡｂ結合ＬｎＣＡＰ（＋）／ＤＵ１４５（−）ＦＡＣＳシフト（倍率））を実証した。

【0253】

本開示の抗体によって認識されるＳＴＥＡＰ１の領域を決定するために、ＳＴＥＡＰ１の３つの細胞外ループの各々がＳＴＥＡＰ２の対応する領域で置換され、且つ２９３細胞中で発現されたキメラコンストラクトが作製された。Ａｂ−Ａは、ＳＴＥＡＰ１に結合し、ＳＴＥＡＰ２に結合しない。ＳＴＥＡＰ１の細胞外ループ１及び３をＳＴＥＡＰ２由来の対応するループと置き換えることは、結合を抑制したが、ＳＴＥＡＰ１に結合するＡｂ−Ａは、細胞外ループ２がＳＴＥＡＰ２対応物と置き換えられたときに破壊された。Ａｂ−Ａは、細胞外ループ２の外部でＳＴＥＡＰ１に結合するように見える。

【0254】

Ａｂ−Ａ１、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）及びＡｂ−Ｂ１のＳＴＥＡＰ−１結合アーム及び抗ＣＤ３結合アームを含むヘテロ二量体抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０６３号明細書において記載されるとおりの「ＸｍＡｂ」形式で調製された。これらのヘテロ二量体抗体は、ＴＤＣＣ活性（ｐＭ）を示した：Ａｂ−Ａ１ｘ（２７３．８）、Ａｂ−Ａ２ｘ（３８７．９）及びＡｂ−Ｂ１ｘ（１２８．７）。

【0255】

実施例３
この実施例は、本開示のヘテロ二量体抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３（Ｘｍａｂ^２＋１）のＣ４−２Ｂ細胞に対する結合（ＥＣ５０により特徴付けされる）を、異なる骨格を有する抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＸｍＡｂ）と比較する。

【0256】

「ＸｍＡｂ」形式における３つの抗ＳＴＥＡＰ１ヒト化抗体（Ａｂ−Ａ１、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）及びＡｂ−Ｂ１）は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０６３号明細書（特に「ボトルオープナー」形式の議論に関して、参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるとおりに作製された。ＸｍＡｂ形式は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖに結合されたＦｃドメインを含む第１の重鎖；Ｆｃドメイン及び第１の可変重鎖ドメインを含む第２の重鎖；並びに可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を伴う。可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインは、ＳＴＥＡＰ１に結合する。２つの抗ＳＴＥＡＰ１ヒト化抗体は、ヘテロ二量体ＸｍＡｂ^２＋１形式（Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１及びＡｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ^２＋１）において作製された。Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１及びＡｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ^２＋１のＣＤＲ配列は、配列番号１１〜１６（Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１）及び配列番号３０〜３５（Ａｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ^２＋１）において記載される。本明細書でＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１と呼ばれるＮ６７Ｑ改変を有するＡｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１の変異体も作製された。Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１のＣＤＲ配列は、配列番号１１〜１３、１４、１６及び２１において記載される。抗体の命名Ａｂ−Ａ２及びＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、本明細書で互換的に使用される。Ｃ４−２Ｂ前立腺癌細胞の表面で発現されるＳＴＥＡＰ１に結合するヘテロ二量体二重特異性抗体の能力は、ヒト化されていないＸｍＡｂ形式（Ａｂ−Ｍｘ１、Ａｂ−Ｍｘ２及びＡｂ−Ｍｘ３）における３つのマウス抗ＳＴＥＡＰ１抗体とともに評価された。

【0257】

Ｃ４−２Ｂ−Ｌｕｃ細胞を最大５μＭの漸増濃度のＡｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１、Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ、Ａｂ−Ｂ１ Ｘｍａｂ、Ａｂ−Ｍｘ１、Ａｂ−Ｍｘ２及びＡｂ−Ｍｘ３とともに４℃で１時間インキュベートした。細胞結合抗体を、ＡＰＣ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体とのインキュベーション後のフローサイトメトリー及び試験された対応する抗体の漸増濃度でのＡＰＣチャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）により検出した。表３に示されるとおり、Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ^２＋１は、ＸｍＡｂ形式（すなわちＡｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ）の同じ結合体の結合ＥＣ５０より６５倍低かった細胞結合を示し、これは、対応するＸｍＡｂのものを超える非常に強力な結合活性を示している。ＸｍＡｂ^２＋１形式は、前立腺癌細胞上で発現されるＳＴＥＡＰ１に対するＡｂ−Ａ結合体の結合を大幅に向上させた。

【0258】

【表2】

【0259】

実験は、様々な形式（Ａｂ−Ａ（従来型、単一特異性抗体、非ヒト化）、Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ形式、Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ^２＋１形式及びＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）Ｘｍａｂ^２＋１形式（Ｎ６７Ｑ改変を有する））のＡｂ−Ａ並びにＡｂ−Ｂ ＸｍＡｂ形式で繰り返された。Ｃ４−２Ｂ−Ｌｕｃ細胞を最大５μＭの漸増濃度の抗ＳＴＥＡＰＩ ＸｍＡｂ又はＸｍＡｂ^２＋１分子とともに４℃で１時間インキュベートした。細胞結合ＸｍＡｂをＡＰＣ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体とのインキュベーション後のフローサイトメトリーにより検出し、対応する抗ＳＴＥＡＰＩ ＸｍＡｂ分子の漸増濃度でのＡＰＣチャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が示された。結果は、図１２Ａ〜１２Ｃ及び図１３並びに下の表４において示される。

【0260】

【表3】

【0261】

抗体は、全てヘテロ二量体形式にかかわらずＳＴＥＡＰ１に結合した。ＸｍＡｂ^２＋１形式は、他の抗体形式と比較してＳＴＥＡＰ１への結合の向上を実証した。

【0262】

ＴＤＣＣ活性も、上記のものと同様の方法を使用して評価された。全ての試験された抗体は、ＸｍＡｂ^２＋１の抗体によりＴＤＣＣ活性を示し、これは、Ｘｍａｂ抗体より優れた活性を実証している：Ａｂ−Ａ ＸｍＡｂ（ＥＣ５０＝２７４ｐＭ、ＥＣ９０＝４３８ｐＭ）、Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ（ＥＣ５０＝３８８ｐＭ、ＥＣ９０＝７２２ｐＭ）、Ａｂ−Ｂ１ Ｘｍａｂ（ＥＣ５０＝１２９ｐＭ、ＥＣ９０＝２６５ｐＭ）、Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ^２＋１（ＥＣ５０＝６ｐＭ、ＥＣ９０＝１１ｐＭ）及びＡｂ−Ｂ１ Ｘｍａｂ^２＋１（ＥＣ５０＝１９ｐＭ、ＥＣ９０＝４３ｐＭ）。

【0263】

実施例５
この実施例は、抗ＳＴＥＡＰ１ ＸｍＡｂ及びＸｍＡｂ^２＋１によって媒介されるヒトＴ細胞によるヒト腫瘍細胞株Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃの溶解を特徴付けする。

【0264】

Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞をヒト汎Ｔ細胞とともに１０：１のＥ：Ｔ細胞比及び漸増濃度の（図１４Ａ）Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ、（図１４Ｂ）Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１又は（図１４Ｃ）Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１形式（Ｎ６７Ｑ置換を有する）で４８時間共培養した。標的細胞溶解は、ルシフェラーゼ活性の測定によりモニターされ、特異的な細胞障害性は、ＸｍＡｂのない対照条件と比較して各濃度でプロットされた。図１４Ａ〜１４Ｃに示されるとおり、Ａｂ−Ａ１ Ｘｍａｂ、Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１及びＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、標的細胞溶解の媒介において奏功した。

【0265】

実施例６
この実施例は、ＳＴＥＡＰ１発現細胞と、ＳＴＥＡＰを発現しない細胞との間で違いを識別する本開示のヘテロ二量体抗体の能力を実証する。

【0266】

ＳＴＥＡＰ１陽性Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞（●）及びＳＴＥＡＰ１陰性Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ^{ＳＴＥＡＰ１ ＫＯ}細胞（■）をヒト汎Ｔ細胞とともに１０：１のＥ：Ｔ細胞比及び漸増濃度のＡｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１で４８時間共培養した標的細胞溶解は、ルシフェラーゼ活性の測定によりモニターされ、特異的な細胞障害性は、対照条件（ＸｍＡｂを欠く）と比較して各濃度でプロットされた。結果は、図１５及び下の表５において示される。Ａｂ−Ａ１ ＸｍＡｂ^２＋１は、ＳＴＥＡＰ１発現をノックアウトするように改変されたＣ４−２Ｂ ｌｕｃ細胞ではなく、ヒト腫瘍細胞株Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃの標的細胞溶解を用量依存的に媒介した。

【0267】

【表4】

【0268】

さらに、ヒトＳＴＥＡＰ１で安定にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（図１６Ａ）又は親２９３Ｔ細胞（図１６Ｂ）をアイソタイプ対照抗体又は抗ＳＴＥＡＰ１ Ａｂ−Ａマウスモノクローナル抗体（Ａｂ−Ａｍ；二重特異性形式ではない）とともに１０μｇ／ｍＬの濃度において４℃で１時間インキュベートした。細胞結合Ａｂ−Ａｍは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体とのインキュベーション後にフローサイトメトリーによって検出された（図１６Ａ）。ＳＴＥＡＰ１依存的なシグナルを同定するＦＩＴＣ蛍光は、ヒストグラム（塗りつぶしの灰色ヒストグラム）においてプロットされ、アイソタイプ対照（白色ヒストグラム）に対して比較された。図１６Ａ及び図１６Ｂにおいて示されるとおり、Ａｂ−Ａｍは、試験された両方の細胞集団において発現されるＳＴＥＡＰ−１を検出した。

【0269】

図１６Ｃは、ＳＴＥＡＰ１安定２９３Ｔ細胞（●）及びＳＴＥＡＰ１陰性親２９３Ｔ細胞（■）をヒト汎Ｔ細胞とともに１０：１のＥ：Ｔ細胞比及び漸増濃度のＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１で４８時間共培養する結果を示す。標的細胞溶解は、ルシフェラーゼ活性の測定によりモニターされ、特異的な細胞障害性は、ＸｍＡｂのない対照条件と比較して各濃度でプロットされた。結果は、図１６Ａ〜１６Ｃ及び下の表６において示される。抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３ヘテロ二量体抗体は、ＳＴＥＡＰ１発現細胞の細胞溶解を選択的に媒介した。

【0270】

【表5】

【0271】

ＳＴＥＡＰ１陽性Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞も、ヒト汎Ｔ細胞とともに１０：１のＥ：Ｔ細胞比及び漸増濃度のＡｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ（●）又はＡｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ^２＋１（■）で４８時間共培養した。図１７Ａに示されるとおり、Ａｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ及びＡｂ−Ｂ１ Ｘｍａｂ^２＋１は、Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞の標的細胞溶解を媒介した。

【0272】

Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞をヒト汎Ｔ細胞とともに１０：１のＥ：Ｔ細胞比及び漸増濃度のＸｍＡｂ^２＋１ Ａｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ（Ｇ３７Ａ置換を有するＸｍＡｂ^２＋１）（■）、ＸｍＡｂ^２＋１ Ａｂ−Ｂ１−Ｓ３９Ａ（Ｓ３９Ａ置換を有するＸｍＡｂ^２＋１形式）（▲）又はＸｍＡｂ^２＋１ Ａｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ／Ｓ３９Ａ（Ｇ３７Ａ及びＳ３９Ａ置換の両方を有するＸｍＡｂ^２＋１形式）（▼）で４８時間共培養した。図１７Ｂに示されるとおり、Ａｂ−Ｂ１変異体（すなわちＡｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ、Ａｂ−Ｂ１−Ｓ３９Ａ及びＡｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ／Ｓ３９Ａ）は、Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ前立腺癌細胞の標的細胞溶解を媒介した。下の表７を参照されたい。同様に、ＳＴＥＡＰ１陰性Ｃ４−２Ｂ ｌｕｃ^{ＳＴＥＡＰ１ ＫＯ}癌細胞をヒト汎Ｔ細胞とともに１０：１のＥ：Ｔ細胞比及び漸増濃度のＡｂ−Ｂ１ ＸｍＡｂ^２＋１（●）、Ａｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ（■）、Ａｂ−Ｂ１−Ｓ３９Ａ（▲）又はＡｂ−Ｂ１−Ｇ３７Ａ／Ｓ３９Ａ（▼）で４８時間共培養した標的細胞溶解は、ルシフェラーゼ活性の測定によりモニターされ、特異的な細胞障害性は、ＸｍＡｂのない対照条件と比較して各濃度でプロットされた。結果は、図１７Ｃ及び下の表７において示される。抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３ヘテロ二量体抗体は、ＳＴＥＡＰ１発現細胞の細胞溶解を選択的に媒介し、本開示のＸｍＡｂ^２＋１形式は、他の形式より性能が優れていた。

【0273】

【表6】

【0274】

実施例７
この実施例は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３εに対する本開示のヘテロ二量体抗体、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１の平衡結合定数（ＫＤ）を特徴付けする。

【0275】

組換えヒト又はカニクイザルＣＤ３εに対するＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ−Ｐｉｏｎｅｅｒ ＦＥ）を使用して測定された。組換えヒトＣＤ３ε−Ｆｃ及びカニクイザルＣＤ３ε−Ｆｃは、約６０ＲＵで標準的なアミンカップリング手順を使用してＣＭ５チップ表面上に固定化された。Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、１００、３３．３、１１．１及び３．７ｎＭの濃度で注射された。リガンドに対するＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１相互作用の結合及び解離速度は、下の表８において記載されるとおり、それぞれ１２０秒及び３００秒間記録された。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）値は、解離速度定数及び結合速度定数（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）の比率として導き出された。

【0276】

【表7】

【0277】

実施例８
この実施例は、本開示のヘテロ二量体抗体（Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１）が、ある範囲のＳＴＥＡＰ１表面密度を示す標的細胞の溶解を媒介することを実証する。

【0278】

様々な標的細胞株（ＳＮＵ−５、Ｃ４−２Ｂ、Ｓｋ−Ｎ−ＭＣ、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ、ＶＣａＰ、ＩＭ−９５、ＴＹＫＮＵ、２２ＲＶ−１、ＨＢＳＣＭ、ＨＵＣＣＴ１、ＰＣ３、ＨＣＴ１１６及びＮＣＩＨ１８６９）の表面でのＳＴＥＡＰ−１密度が評価された。Ｄａｋｏ Ｑｉｆｉｋｉｔ法を使用して測定されるとおりに３列目においてＳＴＥＡＰ１密度（１細胞当たりのＳＴＥＡＰ Ｉ抗体結合部位の数）を同定する下の表９を参照されたい。

【0279】

【表8】

【0280】

別々の試験において、ＯＥ３３、ＥＢＣ１及びＡ６７３細胞株の表面でのＳＴＥＡＰ−１密度が評価された。Ｄａｋｏ Ｑｉｆｉｋｉｔ法を使用して測定されるとおりに３列目においてＳＴＥＡＰ１密度（１細胞当たりのＳＴＥＡＰ Ｉ抗体結合部位の数）を同定する下の表１０を参照されたい。

【0281】

【表9】

【0282】

ヒトドナー由来のＴ細胞を漸増濃度のＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１分子とともに標的細胞株と３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、標的細胞生存率は、細胞生存率を測定するｓｔｅａｄｙ ｇｌｏ（Ｂ）又はｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏを使用して測定された。Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、様々なＥＣ９０を有して全ての細胞株を殺滅した。

【0283】

Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、１細胞（ＳＮＵ５細胞株）当たり約２００，０００個のＳＴＥＡＰ１受容体〜１細胞（ＬＯＸ−ＩＭＶ細胞株）当たり約１０，０００個のＳＴＥＡＰ１受容体の範囲のＳＴＥＡＰ１密度を有する癌細胞株を殺滅できる。Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１の効力は、ＳＴＥＡＰ１受容体密度が１細胞当たり１０，０００個未満に落ちるときに低減する。この点に関して、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、１０，０００より多いＳＴＥＡＰ１の表面密度を有する細胞のＴ細胞依存的な殺滅を優先的に媒介する（例えば、ＥＣ９０は、１０，０００未満のＳＴＥＡＰ１の表面密度を有する細胞と比較して、１０，０００より多いＳＴＥＡＰ１の表面密度を有する細胞に関して少なくとも１０倍少ない）。

【0284】

癌細胞の特異な殺滅は、Ａｂ−Ａ２−Ｎ６７Ｇ ＸｍＡｂ^２＋１と比較してＸｍａｂ^２＋１形式の他の抗体（Ａｂ−Ｂ−Ｇ５２Ａ ＸｍＡｂ^２＋１及びマウス抗体Ａｂ−Ｃｍ ＸｍＡｂ^２＋１）により評価された。Ａｂ−Ａ２−Ｎ６７Ｇ ＸｍＡｂ^２＋１は、高ＳＴＥＡＰ１発現細胞と低ＳＴＥＡＰ１発現細胞との間の特異な殺滅を実証したが、Ａｂ−Ｂ−Ｇ５２Ａ ＸｍＡｂ^２＋１は、高ＳＴＥＡＰ１発現細胞と低ＳＴＥＡＰ１発現細胞との間を識別せず、代わりにいずれのＳＴＥＡＰ１発現細胞も殺滅した。表１１を参照されたい。Ａｂ−Ａ２−Ｎ６７Ｇ ＸｍＡｂ^２＋１は、ＨＳＭＢＣ（一次ヒト平滑筋気管支細胞）などの低いレベル（すなわち１０，０００／細胞未満）でＳＴＥＡＰ１を発現する正常細胞を残す。

【0285】

【表10】

【0286】

実施例９
この実施例は、Ｔ細胞依存性の細胞傷害活性が、抗ＰＤ−１抗体とともに本明細書に記載される抗ＣＤ３／抗ＳＴＥＡＰ１ヘテロ二量体抗体の組合せを使用して増強されることを実証する。

【0287】

ＰＤ−Ｌ１過剰発現細胞株の作製：ＧＰ２−２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％ ＨＥＰＥＳ及び１％ ＧｌｕｔａＭＡＸで補充されたＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞を、１０ｃｍのディッシュにおいて７５％の培養密度で蒔き、３７℃、５％ ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌朝、細胞をトランスフェクトした。チューブＡに４５μＬのリポフェクタミン３０００及び５００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地を加えた。チューブＢに１５μｇのＭＳＣＶ＿ＧＦＰ＿ＰＤ−Ｌ１プラスミド、１．８μｇのＶＳＶ−ｇプラスミド、３０μＬのＰ３０００試薬及び５００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地を加えた。チューブＡ及びＢを混合し、室温で１０分間インキュベートした。混合物をＧＰ２−２９３細胞のディッシュに滴下して加え、これを３７℃、５％ ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌朝、培地を除去し、１０ｍＬの新鮮な培養培地で置き換えた。その日の午後に標的細胞を６ウェルプレートに７５％の培養密度で蒔き、３７℃、５％ ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌朝、ウイルス上清をＧＰ２−２９３細胞から回収し、遠心分離した（５分、１２００ｒｐｍ）。上清を新しいチューブに回収し、ポリブレンを１：１０００で加えた。培地を、標的細胞を含有するプレートから除去し、２ｍＬのウイルス上清を加えた。上清細胞に関して、１Ｅ６細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０％ ウシ胎仔血清及び１％ ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで補充された５００μＬ ＲＰＭＩにおいて再懸濁し、６ウェルプレートに蒔き、これに２ｍＬのウイルス上清を加えた。標的細胞及びウイルス上清を含有するプレートを１２００×ｇにおいて３２℃で１．５時間遠心分離し、続いて３７℃、５％ ＣＯ_２でインキュベートした。培養培地を５時間後に加えた。４日後、細胞を、ＦＡＣＳｙｍｐｏｎｙによるフローサイトメトリーによってＧＦＰ及びＰＤ−Ｌ１発現について分析した。ＰＤ−Ｌ１を、ＰＥ−コンジュゲート抗体、クローン２９Ｅ．２Ａ３を使用して検出した。ＰＤ−Ｌ１発現について＜７０％陽性の細胞をＢＤ Ｍｅｌｏｄｙソーター上で選別して、高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する細胞について選択した。

【0288】

Ｔ細胞依存性の細胞障害性（ＴＤＣＣ）アッセイ：Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１を細胞培養培地（ＲＰＭＩ、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で希釈し、段階希釈し（１：３、合計２２）、Ｂｒａｖｏリキッドハンドリングロボットを使用して黒色透明底３８４ウェルプレートに移した。ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄ（１：１、４８時間）で予め活性化されたヒト汎Ｔ細胞（ｎ＝４）を、磁石を使用してビーズから分離し、細胞培養培地中で希釈した。（各ドナーからの一定分量の活性化Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってＰＤ−１発現について評価した。細胞を上記のとおり染色し、データをＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ フローサイトメーター上で収集し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．１を使用して分析した。）活性化Ｔ細胞（２５００細胞／２０μＬ；４列／ドナー）に続いてＰＤ−Ｌ１を過剰発現する標的細胞を、最終のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が１：１になるように３８４ウェルアッセイプレート（２５００細胞／２０μＬ；全プレート）に蒔いた。配列番号１８９〜１９４のＣＤＲ配列を含む本開示の抗ＰＤ−１抗体（５μで１０μｇ／ｍＬ最終）を各Ｔ細胞ドナーの２つの列に加えた。プレートをＭｉｃｒｏＣｌｉｍｅの蓋で覆い、３７℃、５％ ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。ルシフェラーゼを発現する標的細胞によるアッセイに関して、３０μＬのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ又はＯｎｅ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。ルシフェラーゼを発現しない接着標的細胞を有するプレートを、ＥＬ４０６プレートワッシャーを使用してＰＢＳで洗浄してＴ細胞を除去し、２５μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を加えた。プレートを、試薬とともに室温の暗所で１０分間インキュベートした。発光を、ＢｉｏＴｅｋ Ｎｅｏプレートリーダーを使用して検出した。特異的な細胞障害性は、Ａｂ−Ａ２ ＸｍＡｂ^２＋１を伴わないＴ細胞とインキュベートされた標的細胞に対して計算された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、用量曲線をプロットし、４パラメーター可変勾配曲線フィッティングによりＥＣ５０値を計算した。

【0289】

ＴＤＣＣアッセイの結果は、図２０Ａ及び２０Ｂにおいて示される。Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１及び抗ＰＤ−１抗体の組合せは、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１単独と比較して、細胞障害性の増強及びＥＣ５０の低減を実証した。

【0290】

実施例１０
この実施例は、インビボでユーイング肉腫の腫瘍体積を減少させる本開示のヘテロ二量体抗体（例えば、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１）の能力を実証する。

【0291】

致死量以下照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌免疫無防備状態マウスに対して、１日目に５×１０^６細胞のＳＴＥＡＰ１発現ＳＫ−Ｎ−ＭＣ腫瘍細胞を移植した。８日目に２×１０^７個のＣＤ３＋ヒトＴ細胞を腹腔内注射した。Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１又は溶媒対照を１２、１９及び２６日目に０．０１、０．１又は１ｍｇ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により投与した。経時的な腫瘍体積データは、図表によって示される（図２２）。

【0292】

Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、初期の腫瘍退縮を誘導し、１５日目〜２２日目で全ての投与群において相対的な腫瘍体積（ＲＴＶ）が＜１になったが、溶媒治療動物のＲＴＶは、試験終了まで持続的に増大した。最も低い用量のＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１（０．０１ｍｇ／ｋｇ）を受容している動物に由来する腫瘍は、２２目後に再増殖を開始したが、より高いＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１用量（０．１及び１ｍｇ／ｋｇ）で治療されたマウスに関する平均ＲＴＶは、２８日目及び２５日目までそれぞれ＜１であった（表１２）。

【0293】

【表11】

【0294】

溶媒治療対照群２と比較した場合、１５日目〜２２日目において、ｐ値＜０．００１は、全てのＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１用量レベルで達成され、２２日目後、ｐ値＜０．００１は、０．１及び１ｍｇ／ｋｇ Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１用量で達成された（図２３）。２８日目において、溶媒治療マウス（群２）の腫瘍は、治療開始前のそれらの開始体積と比較して平均５．２９倍大きくなったが、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１治療群における群平均ＲＴＶは、０．６１（群３）、１．１３（群４）及び４．２４（群５）であった（表１）。２８日目の生存期の最後において、最も高いＡｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１用量群（群３）の９／１０の動物は、腫瘍がないと見なされ、９７％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を有した（表１３）。

【0295】

【表12】

【0296】

したがって、臨床的に関連のある異種移植モデルにおいて、Ａｂ−Ａ２（Ｎ６７Ｑ）ＸｍＡｂ^２＋１は、納得できる抗腫瘍活性を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図19-4】

【図19-5】

【図19-6】

【図19-7】

【図19-8】

【図19-9】

【図19-10】

【図19-11】

【図19-12】

【図19-13】

【図19-14】

【図19-15】

【図19-16】

【図19-17】

【図19-18】

【図19-19】

【図19-20】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

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【国際調査報告】