特表 2021-531039 細菌接合システム及びその治療的使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-531039(P2021-531039A)

(43)【公表日】2021年11月18日

(54)【発明の名称】細菌接合システム及びその治療的使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20211022BHJP

   A61K 35/741 20150101ALI20211022BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211022BHJP

   A61K 38/50 20060101ALI20211022BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20211022BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20211022BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20211022BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21

   A61K35/741

   A61K48/00

   A61K38/50

   A61P1/00

   A61P31/04

   C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】137

(21)【出願番号】特願2021-524080(P2021-524080)

(86)(22)【出願日】2019年7月9日

(85)【翻訳文提出日】2021年2月4日

(86)【国際出願番号】CA2019050945

(87)【国際公開番号】WO2020010452

(87)【国際公開日】20200116

(31)【優先権主張番号】62/696,367

(32)【優先日】2018年7月11日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】521017583

【氏名又は名称】ソシエテ ドゥ コメルシアリサション デ プロドゥイ ドゥ ラ ルシェルシェ アプリケ ソクプラ シアンス サンテ エ ユメーヌ エス．ウ．セ．

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】セバスチャン ロドリーグ

(72)【発明者】

【氏名】ケビン ネイユ

(72)【発明者】

【氏名】ナンシー アラー

(72)【発明者】

【氏名】バンサン ビュリュ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084DC22

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZB351

4C084ZB352

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZB35

(57)【要約】

本開示は、接合性細菌宿主細胞を有するＩＶ型接着線毛を含むまたは効果的なインビボ接合を媒介するための接合性送達システムの一部としての交配ペア安定化モジュールの使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子カーゴをレシピエント細菌細胞にインビボで伝達するための接合性細菌宿主細胞であって、
− ペイロードモジュールに機能的に関連付けられた輸送モジュールを含む前記遺伝子カーゴと、
− ＩＶ型分泌系モジュールと、
− ＩＶ型接着線毛を含む交配ペア安定化モジュールであって、前記ＩＶ型接着線毛がアドヘシンを含む、前記交配ペア安定化モジュールと、
− 輸送マシナリーをコードする可動化モジュールと、を含み、
前記輸送モジュールが、前記可動化モジュールによってコードされた輸送マシナリーによって認識されることが可能である、前記接合性細菌宿主細胞。

【請求項2】

前記ＩＶ型接着線毛及び／または前記アドヘシンが以下のタンパク質、すなわち、ＰｉｌＬ、ＰｉｌＮ、ＰｉｌＯ、ＰｉｌＰ、ＰｉｌＱ、ＰｉｌＲ、ＰｉｌＳ、ＰｉｌＴ、ＴｒａＢ、ＰｉｌＵ、ＰｉｌＶ、またはＴｒａＮの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項3】

前記ＩＶ型接着線毛が、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する、請求項１または２に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項4】

前記ＩＶ型分泌系モジュールが、以下のタンパク質、すなわち、ＶｉｒＢ１、ＶｉｒＢ２、ＶｉｒＢ３、ＶｉｒＢ４、ＶｉｒＢ５、ＶｉｒＢ６、ＶｉｒＢ７、ＶｉｒＢ８、ＶｉｒＢ９、ＶｉｒＢ１０、ＶｉｒＢ１１、またはＶｉｒＤ４の少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項5】

前記ＩＶ型分泌系モジュールが、以下の細菌プラスミドファミリー、すなわち、ＭＰＦ_T、ＭＰＦ_F、ＭＰＦ_I、ＭＰＦ_FATA、ＭＰＦ_B、ＭＰＦ_FA、ＭＰＦ_GまたはＭＰＦ_Cの少なくとも１つに由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項6】

− 前記遺伝子カーゴが、第１の染色体外ベクター上に位置し、さらに第１の栄養複製モジュールを含み、
− 前記接合性細菌宿主細胞が、第１の複製マシナリーをコードする第１の維持モジュールを含み、
− 前記第１の栄養複製モジュールが、前記第１の維持モジュールによってコードされた前記第１の複製マシナリーによって認識されることが可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項7】

前記第１の維持モジュールが、以下のタンパク質、すなわち、ＲｅｐＡ、ＰａｒＡ、ＰａｒＢ、ＤＮＡプライマーゼ、ＹｇｉＡ、毒素、Ｖｃｒｘ０２８、ＹｃｆＡ、抗毒素、Ｖｃｒｘ０２７、ＹｃｆＢ、ＤＮＡトポイソメラーゼ、ＹｄｉＡ、またはＹｄｇＡの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項8】

前記第１の栄養複製モジュールまたは前記第１の維持モジュールが、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する、請求項６または７に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項9】

前記遺伝子カーゴが、前記可動化モジュールを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項10】

第２の染色体外ベクター上に位置する伝達マシナリーを含み、
− 前記伝達マシナリーが、前記ＩＶ型分泌系モジュール、前記交配ペア安定化モジュール、及び第２の栄養複製モジュールを含み、
− 前記接合性細菌宿主細胞が、第２の複製マシナリーをコードする第２の維持モジュールを含み、
− 前記第２の栄養複製モジュールが、前記第２の維持モジュールによってコードされた前記第２の複製マシナリーによって認識されることが可能である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項11】

前記第２の維持モジュールが、以下のタンパク質、すなわち、ＲｅｐＡ、ＰａｒＡ、ＰａｒＢ、ＤＮＡプライマーゼ、ＹｇｉＡ、毒素、Ｖｃｒｘ０２８、ＹｃｆＡ、抗毒素、Ｖｃｒｘ０２７、ＹｃｆＢ、ＤＮＡトポイソメラーゼ、ＹｄｉＡ、またはＹｄｇＡの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項12】

前記第２の栄養複製モジュールまたは前記第２の維持モジュールが、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する、請求項１０または１１に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項13】

前記伝達マシナリーが、前記可動化モジュールをさらに含む、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項14】

細菌染色体内に位置する伝達マシナリーを含み、前記伝達マシナリーが、前記ＩＶ型分泌系モジュール、前記交配ペア安定化モジュール、及び前記可動化モジュールを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項15】

排斥モジュールをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項16】

選択モジュールをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項17】

調節モジュールをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項18】

前記調節モジュールが、以下の調節タンパク質または非コーディングＲＮＡ、すなわち、ＹａｊＡ、ＹａｆＡ、ＦｉｎＯ、Ｆｕｒ、Ｆｎｒ、ＫｏｒＡ、ＡｃａＣ、ＡｃａＤ、Ａｃｒ１、Ａｃｒ２、ＳｔｂＡ、ＴｗｒＡ、ＲｅｓＰ、ＫｆｒＡ、ＡｒｄＫ、ｄＣａｓ９、ｃｒＲＮＡ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ｔａＲＮＡ、トーホールドスイッチ、ＡｒａＣ、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、またはＬａｃＩｑの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項19】

前記可動化モジュールが、以下のタンパク質、すなわち、ＶｉｒＣ１、ＮｉｋＢ、またはＮｉｋＡの少なくとも１つを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項20】

前記可動化モジュールが、以下のプラスミドのファミリー、すなわち、ＭＯＢ_P、ＭＯＢ_F、ＭＯＢ_V、ＭＯＢ_H、ＭＯＢ_C、またはＭＯＢ_Qの少なくとも１つに由来する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項21】

前記交配ペア安定化モジュールが、前記アドヘシンをコードする遺伝子に関連付けられたシャフロンを改変するためのシャフラーゼをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項22】

前記シャフロンが、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、及び／またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する、請求項２１に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項23】

前記シャフラーゼが、ｒｃｉ遺伝子によってコードされる、請求項２１または２２に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項24】

前記シャフラーゼが、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項25】

前記ペイロードモジュールが、ヌクレアーゼをコードする、請求項１から２４のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項26】

前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し、規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）関連ＤＮＡ結合（Ｃａｓ）タンパク質、またはＣａｓタンパク質類似体であり、前記ペイロードモジュールが、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質類似体によって認識可能なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子をさらにコードする、請求項２５に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項27】

前記ｃｒＲＮＡ分子が、前記レシピエント細菌内のＤＮＡ分子に実質的に相補的である、請求項２６に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項28】

前記ＤＮＡ分子が、前記レシピエント細菌の遺伝子に対応する、請求項２７に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項29】

前記遺伝子が、前記レシピエント細菌の病原性因子をコードする、請求項２８に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項30】

前記ペイロードモジュールが、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質類似体によって認識可能なトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをさらにコードする、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項31】

前記ペイロードモジュールが、治療用タンパク質をコードする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項32】

前記治療用タンパク質が、代謝産物の産生または分解を可能とする、請求項３１に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項33】

少なくとも１０^-3の細菌接合完了体／レシピエントＣＦＵのインビボ接合効率を有する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項34】

固体培地で得られた対応する接合効率と比較した場合に、液体培地で得られたインビトロ接合効率の比が、０．１％よりも高い、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項35】

プロバイオティクス細菌である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項36】

腸内細菌である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主。

【請求項37】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に由来する、請求項３５または３６に記載の接合性細菌宿主細胞 。

【請求項38】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種に由来する、請求項３７に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項39】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株に由来する、請求項３８に記載の接合性細菌宿主細胞。

【請求項40】

請求項１〜３９のいずれか１項に定義される前記接合性細菌宿主と、賦形剤とを含む、組成物。

【請求項41】

経口投与用に配合されている、請求項４０に記載の組成物。

【請求項42】

請求項１〜３９のいずれか１項に定義される接合性細菌宿主細胞を作製するためのプロセスであって、請求項１〜３９のいずれか１項に定義される前記遺伝子カーゴと、前記ＩＶ型分泌系モジュール、前記交配ペア安定化モジュール、または前記可動化モジュールのうちの少なくとも１つとを細菌内に導入して前記接合性細菌宿主細胞を与えることを含む、前記プロセス。

【請求項43】

請求項６〜３９のいずれか１項に定義される前記栄養複製モジュール、前記維持モジュール、前記調節モジュール、前記選択モジュール、または前記排斥モジュールのうちの少なくとも１つを前記細菌内に導入して前記接合性細菌宿主細胞を与えることをさらに含む、請求項４２に記載のプロセス。

【請求項44】

請求項４２または４３に記載のプロセスによって得られる、接合性組換え細菌宿主細胞。

【請求項45】

請求項４０または４１に定義される組成物を製造するためのプロセスであって、請求項１〜３９のいずれか１項に定義される前記接合性細菌宿主細胞を賦形剤とともに配合することを含む、前記プロセス。

【請求項46】

請求項４５に記載のプロセスによって得られる組成物。

【請求項47】

レシピエント細菌を有することが疑われる対象内で前記接合性細菌宿主細胞から前記レシピエント細菌へと前記遺伝子カーゴをインビボで伝達するための請求項１〜３９もしくは４４のいずれか１項に定義される接合性組換え細菌宿主細胞、または請求項４０、４１、４５もしくは４６のいずれか１項に定義される組成物。

【請求項48】

レシピエント細菌を有することが疑われる対象内で前記接合性細菌宿主細胞から前記レシピエント細菌へと遺伝子カーゴをインビボで伝達するための請求項１〜３９もしくは４４のいずれか１項に定義される接合性組換え細菌宿主細胞、または請求項４０、４１、４５もしくは４６のいずれか１項に定義される組成物の使用。

【請求項49】

レシピエント細菌を有することが疑われる対象内で前記接合性細菌宿主細胞から前記レシピエント細菌へと遺伝子カーゴをインビボで伝達するための薬剤を製造するための請求項１〜３９もしくは４４のいずれか１項に定義される接合性組換え細菌宿主細胞、または請求項４０、４１、４５もしくは４６のいずれか１項に定義される組成物の使用。

【請求項50】

レシピエント細菌を有することが疑われる対象内で接合性細菌宿主細胞から前記レシピエント細菌へと遺伝子カーゴをインビボで伝達するための方法であって、有効量の請求項１〜３９もしくは４４のいずれか１項に定義される接合性組換え細菌宿主細胞、または請求項４０、４１、４５もしくは４６のいずれか１項に定義される組成物を、前記レシピエント細菌への前記遺伝子カーゴの前記伝達を可能とする条件下で前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項51】

前記接合性細菌宿主細胞が、プロバイオティクス細菌宿主細胞である、請求項４７に記載の接合性細菌宿主細胞、請求項４８もしくは４９の使用、または請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記接合性細菌宿主細胞が、腸内細菌である、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項53】

前記接合性細菌宿主細胞の改変システムが、前記レシピエント細菌の制限修飾システムと実質的に同様である、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項54】

前記ペイロードモジュールが、異種タンパク質をコードする、請求項４７〜５３のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞、使用または方法。

【請求項55】

前記異種タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項５４に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項56】

前記異種タンパク質が代謝産物の産生または分解を可能にする、請求項５４に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項57】

前記異種タンパク質が、ヌクレアーゼである、請求項５４に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項58】

前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し、規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）関連ＤＮＡ結合（Ｃａｓ）タンパク質であり、前記ペイロードモジュールが、前記Ｃａｓタンパク質によって認識可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をさらにコードする、請求項５７に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項59】

前記ｇＲＮＡ分子が、前記レシピエント細菌内のＤＮＡ分子に実質的に相補的である、請求項５８に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項60】

前記ＤＮＡ分子が、前記レシピエント細菌内の遺伝子である、請求項５９に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項61】

前記遺伝子が、前記レシピエント細菌内の病原性因子をコードする、請求項６０に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項62】

前記遺伝子が、前記レシピエント細菌内で、抗生物質に対する耐性に関与するタンパク質、毒素、または、前記レシピエント細菌の線毛をコードする、請求項６１に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【請求項63】

前記レシピエント細菌によって引き起こされる腸内毒素症または感染症の症状を治療または緩和するための請求項４７〜６２のいずれか１項に記載の接合性細菌宿主細胞、使用、または方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、インビボで、核酸カーゴを接合性細菌からレシピエント細菌に伝達するための細菌接合システムに関する。

【背景技術】

【0002】

細菌群集は、ヒトと動物の健康に重要な役割を果たしている。腸内毒素症としても知られる腸内微生物集団の不均衡は、いくつか例を挙げただけでも、がん、糖尿病、クローン病、過敏性腸症候群などのいくつかの重篤な疾患に関連していることが現在では明確に確立されている。したがって、細菌群集を正確に操作して健康なマイクロバイオームを回復及び／または維持できることは、これらの疾患を治療するうえで非常に興味深い。例えば、マイクロバイオームの有益な細菌叢を完全な状態に維持する一方で、病原性細菌の選択的な除去または不活性化を可能とする技術があれば、非常に価値のある治療ツールとなるであろう。さらに、微生物群集の特定の細菌を改変して、その細菌がコロニーを形成する臓器に局所的に治療薬を提供することが可能であれば、ヒトと動物の健康を改善するための重要なアプローチとなるであろう。要約すると、ヒトまたは動物のマイクロバイオームの正確なインサイチューの操作を可能とするツールを開発することで、新たな有望な治療の可能性が拓けると考えられる。

【0003】

これと並行して、腸（例えば、カンピロバクター、大腸菌 、サルモネラ菌）、尿路（例えば、大腸菌）、及び創傷（例えば、黄色ブドウ球菌）に感染する抗生物質耐性菌の警戒すべき出現は、公衆衛生上の脅威となっている。新たな抗生物質分子の開発は過去数十年で劇的に減少していることから、これは大きな懸念事項である。２０５０年までに、抗生物質耐性菌はがんよりも多くのヒトの死因になると推定されている。したがって、このような従来の抗生物質の高まる非効率性を緩和するため、抗生物質耐性菌と戦うための新たな代替薬を開発する喫緊の必要性がある。

【0004】

細菌の接合は、ドナー細菌が接合要素を介して遺伝物質をレシピエント細菌に伝達する天然のプロセスである。合成生物学の最近の進歩により、細菌（プロバイオティクスなど）を操作することで細菌の接合を利用してＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼシステムを含む遺伝子カーゴを標的細菌に伝達することが可能である。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９を標的細菌に送達できるプロバイオティクスに基づくこの新しいクラスの薬剤によれば、インサイチューでマイクロバイオームを操作するための、または細菌感染を治療するための効率的な方法を提供できる可能性がある。例えば、このようなプロバイオティクスを利用してＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼシステムを標的細菌に伝達し、抗生物質耐性遺伝子を除去するか、または標的細菌の染色体に二本鎖切断を誘発することにより病原性細菌を排除することができる。この原理は、過剰に表現された細菌種を標的とすることにより、腸内毒素症の治療に直接適用することもでき、それにより、マイクロバイオームを高い精度で編集することができる。

【0005】

細菌の接合を利用してＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９システムを送達することによってマイクロバイオームを改変する、プロバイオティクスを含む細菌の操作は有望な手段であるが、このアプローチには解決する必要のあるいくつかの重要な技術的課題がある。実際問題として、この技術が有用であるためには、（１）操作されたプロバイオティクスが、ヒトまたは動物の体内の環境（例えば、腸、尿管、または創傷内）中、インビボで細菌接合を行うことができること、及び、（２）インビボ接合効率が満足な治療効果を得るうえで充分に高いこと、が必要である。

【0006】

これまで、細菌の接合は、人体または動物の体内においてインビボで曝露される条件とは大きく異なる環境であるペトリ皿中、ほぼインビトロのみで研究されてきた。どの接合性細菌システムが実際にインビボ で機能することができ、どのような効率で機能することができるかについてはほとんど知られていない。ペトリ皿中のインビトロ活性がインビボ活性を示す、化学分子（例えば、従来の抗生物質）から誘導される薬剤とまったく対照的に、生物（例えば、細菌）に基づいた薬剤は予測可能ではない。例えば、不活性な化学分子とは対照的に、細菌は特定の条件に適応し、多数の細胞プロセスに影響する複雑なメカニズムを介して環境に応答する生物である。したがって、インビトロで接合できる細菌がインビボ条件下で接合を行えるかどうかを予測することは困難である。要約すると、治療用ベクターとして生物を使用する薬物の場合 、インビトロでの有効性は、薬物がインビボで機能する能力を予測するうえで充分ではない。

【0007】

要約すると、細菌の接合に基づく新しいクラスの治療薬は、細菌群集 をインサイチューで操作するための非常に有望な治療手段である。しかしながら、実行可能なアプローチとするためには、この技術は実際 にインビボで接合を行うことができ、かつこれを高効率で行うことが可能な細菌システムの開発を必要とする。これにより、このような細菌システムを、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９、または標的細菌を除去または改変することができる他のタイプの遺伝子カーゴを伝達及び送達するための汎用性の高いプラットフォームとして使用できる。

【発明の概要】

【0008】

第１の態様によれば、本開示は、遺伝子カーゴをレシピエント細菌細胞にインビボで伝達するための接合性細菌宿主細胞を提供する。接合性細菌宿主細胞は、（ｉ）遺伝子カーゴ（ただし、遺伝子カーゴは、ペイロードモジュールに機能的に関連付けられた輸送モジュールを含む）、（ｉｉ）ＩＶ型分泌系モジュール、（ｉｉｉ）アドヘシンを含むＩＶ型接着線毛を含む交配ペア安定化モジュール、及び（ｉｖ）可動化モジュールを含む。輸送モジュールは、可動化モジュールによってコードされた輸送マシナリーによって認識され得る。一実施形態では、ＩＶ型接着線毛及び／またはアドヘシンは、以下のタンパク質、すなわち、ＰｉｌＬ、ＰｉｌＮ、ＰｉｌＯ、ＰｉｌＰ、ＰｉｌＱ、ＰｉｌＲ、ＰｉｌＳ、ＰｉｌＴ、ＴｒａＢ、ＰｉｌＵ、ＰｉｌＶ、またはＴｒａＮの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、ＩＶ型接着線毛は、以下の細菌プラスミドファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する。さらに別の実施形態では、ＩＶ型分泌系モジュールは、以下のタンパク質、すなわち、ＶｉｒＢ１、ＶｉｒＢ２、ＶｉｒＢ３、ＶｉｒＢ４、ＶｉｒＢ５、ＶｉｒＢ６、ＶｉｒＢ７、ＶｉｒＢ８、ＶｉｒＢ９、ＶｉｒＢ１０、ＶｉｒＢ１１、またはＶｉｒＤ４の少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、ＩＶ型分泌系モジュールは、以下の細菌プラスミドファミリー、すなわち、ＭＰＦ_T、ＭＰＦ_F、ＭＰＦ_I、ＭＰＦ_FATA、ＭＰＦ_B、ＭＰＦ_FA、ＭＰＦ_G またはＭＰＦ_Cの少なくとも１つに由来する。さらに別の実施形態では、遺伝子カーゴは第１の染色体外ベクター上に位置し、第１の栄養複製モジュールをさらに含み、接合性細菌宿主細胞は、第１の複製マシナリーをコードする第１の維持モジュールを含み、第１の栄養複製モジュールは、第１の維持モジュールによってコードされる第１の複製マシナリーによって認識されることが可能である。そのような実施形態では、第１の維持モジュールは、以下のタンパク質、すなわち、ＲｅｐＡ、ＰａｒＡ、ＰａｒＢ、ＤＮＡプライマーゼ、ＹｇｉＡ、毒素、Ｖｃｒｘ０２８、ＹｃｆＡ、抗毒素、Ｖｃｒｘ０２７、ＹｃｆＢ、ＤＮＡトポイソメラーゼ、ＹｄｉＡ、またはＹｄｇＡのうちの少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、第１の栄養複製モジュールまたは第１の維持モジュールは、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ ／ Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する。さらに別の実施形態では、遺伝子カーゴは、可動化モジュールを含む。一実施形態では、接合性細菌宿主細胞は、第２の染色体外ベクター上に位置する伝達マシナリーを含み、伝達マシナリーは、ＩＶ型分泌系モジュール、交配ペア安定化モジュール、及び第２の栄養複製モジュールを含み、接合性細菌宿主細胞は、第２の複製マシナリーをコードする第２の維持モジュールを含み、第２の栄養複製モジュールは、第２の維持モジュールによってコードされる第２の複製マシナリーによって認識されることが可能である。一実施形態では、第２の維持モジュールは、以下のタンパク質、すなわち、ＲｅｐＡ、ＰａｒＡ、ＰａｒＢ、ＤＮＡプライマーゼ、ＹｇｉＡ、毒素、Ｖｃｒｘ０２８、ＹｃｆＡ、抗毒素、Ｖｃｒｘ０２７、ＹｃｆＢ、ＤＮＡトポイソメラーゼ、ＹｄｉＡまたはＹｄｇＡのうちの少なくとも１つを含む。さらなる実施形態において、第２の栄養複製モジュールまたは第２の維持モジュールは、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ ／ Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する。一実施形態では、伝達マシナリーは、可動化モジュールをさらに含む。さらに別の実施形態において、接合性細菌宿主細胞は、細菌染色体内に位置する伝達マシナリーを含み、伝達マシナリーは、ＩＶ型分泌系モジュール、交配ペア安定化モジュール、及び可動化モジュールを含む。一実施形態では、接合性細菌宿主細胞は、排斥モジュール、選択モジュール、及び／または調節モジュールをさらに含む。一実施形態では、調節モジュールは、以下の調節タンパク質または非コーディングＲＮＡ、すなわち、ＹａｊＡ、ＹａｆＡ、ＦｉｎＯ、Ｆｕｒ、Ｆｎｒ、ＫｏｒＡ、ＡｃａＣ、ＡｃａＤ、Ａｃｒ１、Ａｃｒ２、ＳｔｂＡ、ＴｗｒＡ、ＲｅｓＰ、ＫｆｒＡ、ＡｒｄＫ、ｄＣａｓ９、ｃｒＲＮＡ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ｔａＲＮＡ、トーホールドスイッチ、ＡｒａＣ、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、またはＬａｃＩｑの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、可動化モジュールは、以下のタンパク質、すなわち、ＶｉｒＣ１、ＮｉｋＢまたはＮｉｋＡのうちの少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、可動化モジュールは、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＭＯＢ_F、ＭＯＢ_P、ＭＯＢ_V、ＭＯＢ_H、ＭＯＢ_C またはＭＯＢ_Qの少なくとも１つに由来する。さらなる実施形態において、交配ペア安定化モジュールは、アドヘシンをコードする遺伝子に関連付けられたシャフロンを修飾するためのシャフラーゼをさらに含む。さらに別の実施形態では、シャフロンは、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、及び／またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する。さらなる実施形態において、シャフラーゼは、ｒｃｉ 遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、シャフラーゼは、以下の細菌プラスミドのファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、及び／またはＩｎｃ１８の少なくとも１つに由来する。さらに別の実施形態において、ペイロードモジュールは、ヌクレアーゼをコードする。さらに別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し、規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）関連ＤＮＡ結合（Ｃａｓ）タンパク質、またはＣａｓタンパク質類似体であり、ペイロードモジュールが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質類似体によって認識可能なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子をさらにコードする。さらに別の実施形態において、ｃｒＲＮＡ分子は、レシピエント細菌内のＤＮＡ分子に実質的に相補的である。さらに別の実施形態において、ＤＮＡ分子は、レシピエント細菌内の遺伝子に対応する。一実施形態において、遺伝子は、レシピエント細菌内の病原性因子をコードする。さらに別の実施形態において、ペイロードモジュールは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質類似体によって認識可能なトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをさらにコードする。別の実施形態において、ペイロードモジュールは治療用タンパク質をコードする。別の実施形態において、治療用タンパク質は、代謝産物の産生または分解を可能にする。一実施形態において、接合性細菌宿主細胞は、少なくとも１０^-3（細菌接合完了体／レシピエントＣＦＵ）のインビボ接合効率及び／または０．１％よりも高い固形培地中で得られる対応する接合効率と比較した場合に液体培地で得られるインビトロ接合効率の比を有する。さらに別の実施形態において、接合性細菌は、プロバイオティクス細菌である。さらなる実施形態において、接合性細菌は、腸内細菌である。いくつかの実施形態では、接合性細菌宿主細胞は、エシェリキア属、例えば、エシェリキア・コリ菌（大腸菌）に由来し、いくつかの特定の実施形態では、エシェリキア・コリ（大腸菌）Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株に由来する。

【0009】

第２の態様によれば、本開示は、本明細書で定義される接合性細菌宿主及び賦形剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与用に配合される。

【0010】

第３の態様によれば、本開示は、本明細書で定義される接合性細菌宿主細胞を作製するためのプロセスであって、遺伝子カーゴと、本明細書で定義されるＩＶ型分泌系モジュール、交配ペア安定化モジュールまたは可動化モジュールのうちの少なくとも１つとを細菌に導入して接合性細菌宿主細胞を提供することを含む、プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、プロセスは、本明細書で定義される栄養複製モジュール、維持モジュール、調節モジュール、選択モジュールまたは排斥モジュールうちの少なくとも１つを細菌に導入して接合性細菌宿主細胞を提供することをさらに含む。

【0011】

第４の態様によれば、本開示は、本明細書に記載されるプロセスによって得ることができる、または得られた接合性組換え細菌宿主細胞を提供する。

【0012】

第５の態様によれば、本開示は、本明細書で定義される組成物を製造するためのプロセスであって、本明細書で定義される接合性細菌宿主細胞を賦形剤とともに配合することを含む、プロセスを提供する。

【0013】

第６の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得ることができる、または得られた組成物を提供する。

【0014】

第７の態様によれば、本開示は、レシピエント細菌を有すると疑われる対象内で接合性細菌宿主細胞からレシピエント細菌へと遺伝子カーゴをインビボで伝達するための、本明細書で定義される接合性組換え細菌宿主細胞または本明細書で定義される組成物を提供する。本開示はまた、レシピエント細菌を有すると疑われる対象内で接合性細菌宿主細胞からレシピエント細菌へと遺伝子カーゴをインビボで伝達するための、本明細書で定義される接合性組換え細菌宿主細胞または本明細書で定義される組成物の使用も提供する。本開示は、レシピエント細菌を有すると疑われる対象内で接合性細菌宿主細胞からレシピエント細菌へと遺伝子カーゴをインビボで伝達するための薬剤を製造するための、本明細書で定義される接合性組換え細菌宿主細胞または本明細書で定義される組成物の使用をさらに提供する。本開示はまた、レシピエント細菌を有することが疑われる対象内で接合性細菌宿主細胞からレシピエント細菌へと遺伝子カーゴをインビボで伝達するための方法であって、有効量の本明細書で定義される接合性組換え細菌宿主細胞または本明細書で定義される組成物を、レシピエント細菌への遺伝子カーゴの伝達を可能とする条件下で対象に投与することを含む、方法も提供する。いくつかの実施形態において、接合性細菌宿主細胞は、プロバイオティクス細菌宿主細胞及び／または腸内細菌である。別の実施形態において、接合性細菌宿主細胞の修飾システムは、レシピエント細菌の制限システムと実質的に同様である。別の実施形態において、ペイロードモジュールは、例えば、治療用タンパク質、代謝産物の産生または分解を可能にする異種タンパク質、及び／またはヌクレアーゼなどの異種タンパク質をコードする。一実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター形成する、規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）関連ＤＮＡ結合（Ｃａｓ）タンパク質であり、ペイロードモジュールは、Ｃａｓタンパク質によって認識可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子をさらにコードする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、レシピエント細菌内のＤＮＡ分子に実質的に相補的である。さらなる実施形態において、ＤＮＡ分子は、レシピエント細菌内の遺伝子である。さらに別の実施形態において、遺伝子は、レシピエント細菌内で、病原性因子、抗生物質に対する耐性に関与するタンパク質、毒素、または線毛をコードする。いくつかの実施形態において、接合性細菌宿主細胞は、レシピエント細菌によって引き起こされる腸内毒素症または感染症の症状を治療または緩和するために使用することができる。

【0015】

以上、本発明の性質を一般的に説明したが、以下にその好ましい実施形態を例示として示す添付の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】接合実験においてドナー株とレシピエント株とを簡単に区別するために必要な大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）株誘導体の生成。ＫＮ０１と称されるドナー株は、特殊なメタゲノミクスシークエンシング（１６Ｓ）タグとスペクチノマイシン耐性遺伝子ａａｄ７を含む最初のカセットの挿入によって作製した（図１Ａ）。

【図1B】ＫＮ０２は、ストレプトマイシン耐性の異なるメタゲノミクス配列（１６Ｓ）タグｓｔｒＡＢ 、ＩＰＴＧ誘導性ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光レポーター、及びクロラムフェニコールに対する耐性を付与するｃａｔ遺伝子を含む異なるカセットを有していた（図１Ｂ）。ＫＮ０２を、レシピエントと標的株の両方として使用した。

【図1C】ＫＮ０３は、ＫＮ０２と同じメタゲノミクスシーケンス（１６Ｓ）タグであるストレプトマイシン耐性のｓｔｒＡＢ 、及びテトラサイクリン耐性のｔｅｔＢを含むインサートを有していた（図１Ｃ）。ＫＮ０３を、レシピエントと非標的コントロールの両方として使用した。図１Ａ〜Ｃのすべての遺伝子は、各ＤＮＡコンストラクトの下に示される塩基対（ｂｐ）の総量に合った縮尺で示されている。

【図1D】すべてのインサートは、ａｔｔＬ部位のＴｎ７とａｔｔＲのＴｎ７部位との間に位置するｐＧＲＧ３６のＳｍａＩ及びＸｈｏＩ制限部位にクローニングした（図１Ｄ）。得られたプラスミドをＥｃＮに形質転換し、Ｔｎ７システムの発現をアラビノースで誘導した。これにより、ｐＧＲＧ３６のａｔｔＬ／ＲＴｎ７間に位置するＤＮＡフラグメントが切除され、次いでこれがｇｌｍＳ遺伝子の３’末端に組み込まれた。ｐＧＲＧ３６複製マシナリーは熱感受性であるため、４２℃の非許容温度でのインキュベーションを最終的に用いて細胞から空のベクター骨格をキュアした。

【図2】ｄａｐＡの欠失が大腸菌の代謝に与える影響。ｄａｐＡの欠失は、Ｌ−アスパラギン酸−セミアルデヒドの４−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリネート（ＴＨＤＰ−ＯＨ）への変換を防げる。この反応は、大腸菌における両方の形態のＤＡＰの合成に不可欠である。ただし、Ｌ，Ｌ−ＤＡＰ及びｍｅｓｏ−ＤＡＰは環境から取り込んで、変異を補完することで、ペプチドグリカン及びリジンの両方の合成が可能となりうる。このため、ＤＡＰは、ｄａｐＡ欠失変異体の増殖に不可欠な培地添加物となっている。略語と名称：ＴＨＤＰ−ＯＨ：４−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリネート、ＴＨＤＰ：（Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリネート、スクシニル−ＡＫＰ：Ｎ−スクシニル−Ｌ−２−アミノ−６−ケトピメレート、スクシニル−ＤＡＰ：Ｎ−スクシニル−Ｌ，Ｌ−２，６−ジアミノピメレート、Ｌ，Ｌ−ＤＡＰ：ＬＬ−２，６−ジアミノピメレート、ｍｅｓｏ−ＤＡＰ：ｍｅｓｏ−２，６−ジアミノピメレート、ＤａｐＡ：ジヒドロジピコリネートシンターゼ、ＤａｐＢ：ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＤａｐＤ：ＴＨＤＰＡスクシニラーゼ、ＳｅｒＣ：スクシニル−ＤＡＰアミノトランスフェラーゼ、ＤａｐＥ：スクシニル−ＤＡＰデスクシニラーゼ、ＤａｐＦ：ＤＡＰエピメラーゼ、ＬｙｓＡ：ＤＡＰデカルボキシラーゼ。

【図3-1】

【図3A】ストレプトマイシン（Ｓｍ）処理は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）によるマウスの腸内コロニー形成を改善する。異なるＳｍ濃度が、内因性腸内細菌（白い領域）を減少させ、ＥｃＮコロニー形成（灰色の領域）を促進する能力を、−２日目から開始し、飲み水中、０ｍｇ／Ｌ（図３Ａ）、５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｂ）、１００ｍｇ／Ｌ（図３Ｃ）、２５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｄ）、４５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｅ）、１０００ｍｇ／Ｌ（図３Ｆ）で処理したマウスの糞便中のＣＦＵを定量化することによって評価した。未処理（○）及びストレプトマイシン処理（●）マウスの腸管のいくつかの部分におけるＫＮ０１のコロニー形成レベルを評価した（図３Ｇ）。パネルＧの点線は、接合頻度の評価に充分なＣＦＵレベルを示す。これは、試験したすべてのシステムについて固体支持体上での最小のインビトロ接合率に基づいたものである（約１ｘ１０^-3接合完了体／レシピエント）。黒い横線は、各条件下での平均値を示す。

【図3B】ストレプトマイシン（Ｓｍ）処理は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）によるマウスの腸内コロニー形成を改善する。異なるＳｍ濃度が、内因性腸内細菌（白い領域）を減少させ、ＥｃＮコロニー形成（灰色の領域）を促進する能力を、−２日目から開始し、飲み水中、０ｍｇ／Ｌ（図３Ａ）、５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｂ）、１００ｍｇ／Ｌ（図３Ｃ）、２５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｄ）、４５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｅ）、１０００ｍｇ／Ｌ（図３Ｆ）で処理したマウスの糞便中のＣＦＵを定量化することによって評価した。未処理（○）及びストレプトマイシン処理（●）マウスの腸管のいくつかの部分におけるＫＮ０１のコロニー形成レベルを評価した（図３Ｇ）。パネルＧの点線は、接合頻度の評価に充分なＣＦＵレベルを示す。これは、試験したすべてのシステムについて固体支持体上での最小のインビトロ接合率に基づいたものである（約１ｘ１０^-3接合完了体／レシピエント）。黒い横線は、各条件下での平均値を示す。

【図3C】ストレプトマイシン（Ｓｍ）処理は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）によるマウスの腸内コロニー形成を改善する。異なるＳｍ濃度が、内因性腸内細菌（白い領域）を減少させ、ＥｃＮコロニー形成（灰色の領域）を促進する能力を、−２日目から開始し、飲み水中、０ｍｇ／Ｌ（図３Ａ）、５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｂ）、１００ｍｇ／Ｌ（図３Ｃ）、２５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｄ）、４５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｅ）、１０００ｍｇ／Ｌ（図３Ｆ）で処理したマウスの糞便中のＣＦＵを定量化することによって評価した。未処理（○）及びストレプトマイシン処理（●）マウスの腸管のいくつかの部分におけるＫＮ０１のコロニー形成レベルを評価した（図３Ｇ）。パネルＧの点線は、接合頻度の評価に充分なＣＦＵレベルを示す。これは、試験したすべてのシステムについて固体支持体上での最小のインビトロ接合率に基づいたものである（約１ｘ１０^-3接合完了体／レシピエント）。黒い横線は、各条件下での平均値を示す。

【図3D】ストレプトマイシン（Ｓｍ）処理は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）によるマウスの腸内コロニー形成を改善する。異なるＳｍ濃度が、内因性腸内細菌（白い領域）を減少させ、ＥｃＮコロニー形成（灰色の領域）を促進する能力を、−２日目から開始し、飲み水中、０ｍｇ／Ｌ（図３Ａ）、５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｂ）、１００ｍｇ／Ｌ（図３Ｃ）、２５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｄ）、４５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｅ）、１０００ｍｇ／Ｌ（図３Ｆ）で処理したマウスの糞便中のＣＦＵを定量化することによって評価した。未処理（○）及びストレプトマイシン処理（●）マウスの腸管のいくつかの部分におけるＫＮ０１のコロニー形成レベルを評価した（図３Ｇ）。パネルＧの点線は、接合頻度の評価に充分なＣＦＵレベルを示す。これは、試験したすべてのシステムについて固体支持体上での最小のインビトロ接合率に基づいたものである（約１ｘ１０^-3接合完了体／レシピエント）。黒い横線は、各条件下での平均値を示す。

【図3-2】

【図3E】ストレプトマイシン（Ｓｍ）処理は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）によるマウスの腸内コロニー形成を改善する。異なるＳｍ濃度が、内因性腸内細菌（白い領域）を減少させ、ＥｃＮコロニー形成（灰色の領域）を促進する能力を、−２日目から開始し、飲み水中、０ｍｇ／Ｌ（図３Ａ）、５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｂ）、１００ｍｇ／Ｌ（図３Ｃ）、２５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｄ）、４５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｅ）、１０００ｍｇ／Ｌ（図３Ｆ）で処理したマウスの糞便中のＣＦＵを定量化することによって評価した。未処理（○）及びストレプトマイシン処理（●）マウスの腸管のいくつかの部分におけるＫＮ０１のコロニー形成レベルを評価した（図３Ｇ）。パネルＧの点線は、接合頻度の評価に充分なＣＦＵレベルを示す。これは、試験したすべてのシステムについて固体支持体上での最小のインビトロ接合率に基づいたものである（約１ｘ１０^-3接合完了体／レシピエント）。黒い横線は、各条件下での平均値を示す。

【図3F】ストレプトマイシン（Ｓｍ）処理は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）によるマウスの腸内コロニー形成を改善する。異なるＳｍ濃度が、内因性腸内細菌（白い領域）を減少させ、ＥｃＮコロニー形成（灰色の領域）を促進する能力を、−２日目から開始し、飲み水中、０ｍｇ／Ｌ（図３Ａ）、５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｂ）、１００ｍｇ／Ｌ（図３Ｃ）、２５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｄ）、４５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｅ）、１０００ｍｇ／Ｌ（図３Ｆ）で処理したマウスの糞便中のＣＦＵを定量化することによって評価した。未処理（○）及びストレプトマイシン処理（●）マウスの腸管のいくつかの部分におけるＫＮ０１のコロニー形成レベルを評価した（図３Ｇ）。パネルＧの点線は、接合頻度の評価に充分なＣＦＵレベルを示す。これは、試験したすべてのシステムについて固体支持体上での最小のインビトロ接合率に基づいたものである（約１ｘ１０^-3接合完了体／レシピエント）。黒い横線は、各条件下での平均値を示す。

【図3G】ストレプトマイシン（Ｓｍ）処理は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）によるマウスの腸内コロニー形成を改善する。異なるＳｍ濃度が、内因性腸内細菌（白い領域）を減少させ、ＥｃＮコロニー形成（灰色の領域）を促進する能力を、−２日目から開始し、飲み水中、０ｍｇ／Ｌ（図３Ａ）、５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｂ）、１００ｍｇ／Ｌ（図３Ｃ）、２５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｄ）、４５０ｍｇ／Ｌ（図３Ｅ）、１０００ｍｇ／Ｌ（図３Ｆ）で処理したマウスの糞便中のＣＦＵを定量化することによって評価した。未処理（○）及びストレプトマイシン処理（●）マウスの腸管のいくつかの部分におけるＫＮ０１のコロニー形成レベルを評価した（図３Ｇ）。パネルＧの点線は、接合頻度の評価に充分なＣＦＵレベルを示す。これは、試験したすべてのシステムについて固体支持体上での最小のインビトロ接合率に基づいたものである（約１ｘ１０^-3接合完了体／レシピエント）。黒い横線は、各条件下での平均値を示す。

【図4】接合プラスミド候補の伝達効率の評価。最初に、寒天（固体）及びブロス（液体）の両方で、６つの異なる接合プラスミドの転写効率を３７℃で２時間試験した（Ａ）。接合プラスミドは、実験当たり４匹のマウスを使用して、マウスの腸内におけるそれらの伝達効率についても試験した。レシピエント菌あたりの接合完了体の割合を３日間にわたって糞で評価し（Ｂ）、３日目に盲腸で見られる比率と比較した（Ｃ）。ＴＰ１１４の伝達能力を、４匹のマウスのさらなる組を使用して確認し、同じ時点で寒天上でインビトロで得られた接合頻度と比較した（Ｄ）。Ｓｍ処理マウスと非処理マウスの両方でＴＰ１１４とＲ６Ｋを用いた結合実験を行い、部分的に減少した微生物叢または完全な微生物叢内の移動効率を比較した。プラスミド当たり条件ごとに４匹のマウスで１２時間の接合後の糞便中の伝達速度を測定した（Ｅ）。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均（黒い線）の標準偏差を示す。

【図5】図４Ｂに示されるインビボの伝達速度の計算に使用される生のコロニー形成単位（ＣＦＵ）データ。ドナー（●）、レシピエント（■）、及び接合完了体（▼）細菌のＣＦＵを、各プラスミドについて選択的マッコンキー寒天プレート上で１、２、３日目の糞便試料からカウントした。ｐＯＸ３８（Ａ）、Ｒ６Ｋ（Ｂ）、ＴＰ１１４（Ｃ）、ｐＶＣＲ９４（Ｄ）、Ｒ３８８（Ｅ）及びＲＫ２４（Ｆ）の接合からのＣＦＵを示す。

【図6】接合効率に対する、レシピエント株とドナー株のコロニー形成間の時間の影響。Ｓｍ処理マウスに、ドナー株の導入の２時間前または１２時間前にレシピエント細菌を与えた。ＴＰ１１４（Ａ）及びＲ６Ｋ（Ｂ）の接合効率を、４匹のマウスの糞便で４日間追跡し、接合前のレシピエント細菌のコロニー形成の影響を評価した。レシピエントのコロニー形成を、ＴＰ１１４（Ｃ）及びＲ６Ｋ（Ｄ）の両方での実験を通じた糞便からのＣＦＵでも追跡した。時点は、時間＝ ０日目のドナー株導入に関連して示されている。

【図7】ＲＡＳＴ、ＣＤｓｅａｒｃｈ、及びＢＬＡＳＴによって予測されたＴＰ１１４の遺伝子アノテーション。ＴＰ１１４は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ技術の両方を用いてシークエンシングし、ＲＡＳＴを使用して最初にコーディング遺伝子にアノテーションを付けた。遺伝子座タグは、接頭辞ＴＰ１１４−０と、ｇｅｎｂａｎｋに寄託されたＴＰ１１４の配列の開始位置に基づく遺伝子順序を参照する番号（ＭＦ５２１８３６．１）とを有する各ＣＤＳに帰属した。ＣＤｓｅａｒｃｈとＢＬＡＳＴを使用してアノテーションをさらに改良し、推定される機能を遺伝子に帰属させた。名称は、それらの推定されるホモログに基づいた遺伝子に帰属させた。次に、一般的な機能を、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、交配ペアの安定化、可動化、維持、調節、選択、不明な機能などの特定の機能を媒介する異なるモジュールにマニュアルで帰属させた。

【図8-1】

【図8A】ＴＰ１１４とＩｎｃＩファミリーの他のプラスミドとの間の配列相同性。配列同一性を円形のパターンで示すＢＬＡＳＴに似たプログラムであるＢＲＩＧＧを使用して配列相同性を評価した。配列同一性の閾値を、すべての分析で１００％、７０％、及び５０％に設定した。ＴＰ１１４の配列を、サブファミリーの７つのメンバーと、核酸配列（Ａ）、及びそのコード遺伝子のアミノ酸配列（Ｂ）に基づいてＩｎｃＩ２のメンバーと比較した。ＩｎｃＩ２プラスミド間の遺伝子保存も表６にまとめられている。次に、ＴＰ１１４を、核酸配列（Ｃ）及びそのコーディング遺伝子のアミノ酸配列（Ｄ）に基づいて、ＩｎｃＩ１サブファミリーの７つのメンバーと比較した）。ＩｎｃＩ１サブファミリーの相同領域は、ｒｅｐＡ複製開始遺伝子、シャフロン及びそれに関連するシャフラーゼｒｃｉのみで構成されていた。相同性リングの番号は凡例のプラスミドに対応し、１が最も内側のリング、７が最も外側のリングである。

【図8B】ＴＰ１１４とＩｎｃＩファミリーの他のプラスミドとの間の配列相同性。配列同一性を円形のパターンで示すＢＬＡＳＴに似たプログラムであるＢＲＩＧＧを使用して配列相同性を評価した。配列同一性の閾値を、すべての分析で１００％、７０％、及び５０％に設定した。ＴＰ１１４の配列を、サブファミリーの７つのメンバーと、核酸配列（Ａ）、及びそのコード遺伝子のアミノ酸配列（Ｂ）に基づいてＩｎｃＩ２のメンバーと比較した。ＩｎｃＩ２プラスミド間の遺伝子保存も表６にまとめられている。次に、ＴＰ１１４を、核酸配列（Ｃ）及びそのコーディング遺伝子のアミノ酸配列（Ｄ）に基づいて、ＩｎｃＩ１サブファミリーの７つのメンバーと比較した）。ＩｎｃＩ１サブファミリーの相同領域は、ｒｅｐＡ複製開始遺伝子、シャフロン及びそれに関連するシャフラーゼｒｃｉのみで構成されていた。相同性リングの番号は凡例のプラスミドに対応し、１が最も内側のリング、７が最も外側のリングである。

【図8-2】

【図8C】ＴＰ１１４とＩｎｃＩファミリーの他のプラスミドとの間の配列相同性。配列同一性を円形のパターンで示すＢＬＡＳＴに似たプログラムであるＢＲＩＧＧを使用して配列相同性を評価した。配列同一性の閾値を、すべての分析で１００％、７０％、及び５０％に設定した。ＴＰ１１４の配列を、サブファミリーの７つのメンバーと、核酸配列（Ａ）、及びそのコード遺伝子のアミノ酸配列（Ｂ）に基づいてＩｎｃＩ２のメンバーと比較した。ＩｎｃＩ２プラスミド間の遺伝子保存も表６にまとめられている。次に、ＴＰ１１４を、核酸配列（Ｃ）及びそのコーディング遺伝子のアミノ酸配列（Ｄ）に基づいて、ＩｎｃＩ１サブファミリーの７つのメンバーと比較した）。ＩｎｃＩ１サブファミリーの相同領域は、ｒｅｐＡ複製開始遺伝子、シャフロン及びそれに関連するシャフラーゼｒｃｉのみで構成されていた。相同性リングの番号は凡例のプラスミドに対応し、１が最も内側のリング、７が最も外側のリングである。

【図8D】ＴＰ１１４とＩｎｃＩファミリーの他のプラスミドとの間の配列相同性。配列同一性を円形のパターンで示すＢＬＡＳＴに似たプログラムであるＢＲＩＧＧを使用して配列相同性を評価した。配列同一性の閾値を、すべての分析で１００％、７０％、及び５０％に設定した。ＴＰ１１４の配列を、サブファミリーの７つのメンバーと、核酸配列（Ａ）、及びそのコード遺伝子のアミノ酸配列（Ｂ）に基づいてＩｎｃＩ２のメンバーと比較した。ＩｎｃＩ２プラスミド間の遺伝子保存も表６にまとめられている。次に、ＴＰ１１４を、核酸配列（Ｃ）及びそのコーディング遺伝子のアミノ酸配列（Ｄ）に基づいて、ＩｎｃＩ１サブファミリーの７つのメンバーと比較した）。ＩｎｃＩ１サブファミリーの相同領域は、ｒｅｐＡ複製開始遺伝子、シャフロン及びそれに関連するシャフラーゼｒｃｉのみで構成されていた。相同性リングの番号は凡例のプラスミドに対応し、１が最も内側のリング、７が最も外側のリングである。

【図9】高密度トランスポゾン突然変異誘発（ＨＤＴＭ）実験の概要。ＴＰ１１４を含むＥｃＮに、ｐＦＧ０５１（配列番号１４７）（可動性Ｔｎ５転移プラスミド）及びｐＦＧ０３６（配列番号１４６）（ドナー株のＴｎ５トランスポゾンマシナリーを抑制するプラスミド）を含むＭＦＤ ｐｉｒ ＋ を使用してトランスポゾンをボンバードメントした。これにより、ＥｃＮの染色体とＴＰ１１４の両方にＴｎ５がランダムに挿入され、ＨＤＴＭライブラリ１が生成された。インビトロ （固体支持体）及びインビボ（マウス腸内）の両方で接合実験を行って、それらの特定の環境でも伝達することが可能なＴＰ１１４：： Ｔｎ５変異体を選択した。ＨＤＴＭライブラリ１のインビボ伝達を生物学的複製当たり２匹のマウスで２日間行った。この実験から２つのＨＤＴＭライブラリが生成され、糞便試料から回収された接合完了体がＨＤＴＭライブラリ４を構成したのに対し、ＨＤＴＭライブラリ６は、マウスの盲腸から回収された接合完了体で構成されていた。インビトロでの伝達により、ＨＤＴＭライブラリ２が得られ、これを再びインビトロ固体交配（ＨＤＴＭライブラリ３を生成）及び腸内でのインビボ接合（それぞれ糞便中及び盲腸内に見られる接合完了体からなるＨＤＴＭライブラリ５及び７を生成）のドナーとして使用した）。ＨＤＴＭライブラリ８は、ＴＰ１１４の排斥メカニズムを調べるためにＨＤＴＭライブラリ２のＴＰ１１４ ：： ｔｅｔＢ （配列番号１６６）の接合によって生成された。

【図10】ＨＤＴＭライブラリ分析。ＨＤＴＭライブラリをシークエンシングし、リードを用いてＴＰ１１４内のトランスポゾン挿入部位の位置を正確に特定した。次に、ＵＣＳＣ ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒを使用してリードマッピングを視覚化した。黒い線は挿入部位を表し、線の高さはＴＰ１１４の特定の位置でのリードの密度を表す。図に示されるトラックは、ライブラリ３と比較してＨＤＴＭライブラリ２で検出されたバックグラウンドノイズを表している。生物学的複製＃２のデータは、ＨＤＴＭライブラリ１、２、及び３について示されている。

【図11】ＨＤＴＭ試料間の相関。ＴＰ１１４の各１００ｂｐのビン上にマッピングした正規化されたリード数を、ピアソン相関を用いて複製及び条件間で相関させた。互いに強く相関している（濃い灰色で示される１．０）または弱く相関している（白で示される０．０）試料を視覚的に識別するために、データにグレースケールを適用した。試料を、Ｘ．Ｘ．Ｘの３つの数字のフォーマットに従って識別し、最初の位置はＨＤＴＭライブラリ番号を示し、２番目の位置はＨＤＴＭライブラリの生物学的複製を示し、３番目の数字は実験がインビボで行われた場合のマウスの同一性を示す。

【図12】プラスミドの維持に不可欠な遺伝子。ＨＤＴＭライブラリをシークエンシングし、ＴＰ１１４の挿入ポイントに基づいてリードをマッピングした。次に、ＵＣＳＣ ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒを使用してリードマッピングを視覚化した。縦線はトランスポゾンの挿入部位を表し、それぞれの高さはこの位置でのリードの密度に対応している。選択されたラックは、トランスポゾン挿入カバレッジの再現性のある低下について分析されたＨＤＴＭライブラリ１の３つの生物学的複製を示している。これらの低カバレッジ領域は、必須のメンテナンス遺伝子を表すものとみなした。ただし、一部の遺伝子にはマッピング可能性の低い領域が含まれており、これもカバレッジの低い領域として表示され、分析から除外した。カバレッジの低い残りの遺伝子は点線の枠内に示され（表８も参照）、プラスミドの維持に重要であると考えられる。

【図13】ＨＤＴＭライブラリ２及び３の遺伝子カウント比の分布。この手順を繰り返して、ＨＤＴＭライブラリ４〜７の遺伝子の重要性を決定した。最初に、特定の条件下で特定の遺伝子内にマッピングされる正規化されたリード数を計算することにより遺伝子カウントを決定した。次に、遺伝子カウントを、式（条件Ｘの遺伝子カウント−条件１の遺伝子カウント）／条件１の遺伝子カウント）を用いて、ＨＤＴＭライブラリ１の遺伝子カウントと比較した。最大値と平均値（それぞれ黒と灰色の線）は、テストライブラリＸには必須であるが、ライブラリ１には必須ではないと思われる遺伝子のセットを用いて計算した。ＨＤＴＭライブラリ２（Ａ）の遺伝子カウント比の分布を示し（Ａ）、破線部分を拡大して示す（Ｂ）。ＨＤＴＭライブラリ３の遺伝子カウント比の分布を示し（Ｃ）、破線部分を拡大して示す（Ｄ）。最大値のしきい値を下回る遺伝子カウント比を有するすべての遺伝子を、特定の条件で重要であるものとみなした。

【図14】ｐｉｌ遺伝子はインビボでの導入に不可欠であるが、インビトロでは必須ではない。トランスポゾン挿入部位をＴＰ１１４上にマッピングし、ＵＣＳＣ ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒを使用して視覚化した。トランスポゾン挿入密度が、インビトロ及びインビボ接合実験の両方について示されている。黒い線は挿入部位を表し、それらの高さはＴＰ１１４内の特定の位置でのリードの密度を表す。図に示されるトラックは、生物学的複製２のＨＤＴＭライブラリ１、３、６及び７を表す。ＨＤＴＭライブラリ１がインビトロの接合結果の完全な挿入プロファイルを示すのに対して、ＨＤＴＭライブラリ３は２つのインビトロ接合後の挿入密度を示し、ＨＤＴＭライブラリ６及び７は、挿入密度に対するインビボ接合の影響を示す。トラックを比較すると、２つのインビボ接合実験（破線で選択された部分内の遺伝子）についてのみｐｉｌ遺伝子の挿入シグナル強度の低下が明らかである。インビボ接合の遺伝子不可欠性を表１０に要約する。

【図15】維持、インビトロ接合及びインビボ接合に関するＴＰ１１４のコア及び必須遺伝子の分布。ＨＤＴＭによって決定された遺伝子の保存及び遺伝子の不可欠性に関するデータを、ＴＰ１１４の配列上にマッピングした。信頼性の高い必須遺伝子（黒）及びコア遺伝子（灰色）のみが示されている。遺伝子機能を、図７に基づいて帰属させた。

【図16】インビトロでのＴＰ１１４の交配ペア安定化に対するＴ４Ｐ無効化の影響。ＴＰ１１４のＴ４Ｐ変異体においてｐｉｌＳ遺伝子を欠失させ、補完して、固体支持体、静止液体及び攪拌液体条件下での接合を行った（Ａ）。簡単に述べると、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔまたはＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔ＋ｐＰｉｌＳのいずれかを含む約１０⁸ＣＦＵのＫＮ０１株を等量のＫＮ０３株と混合してＴＰ１１４接合効率に対するＴ４Ｐの重要性を評価した。得られた混合物を、固体培地上または液体中で、攪拌を行うかまたは行わずに、３７℃で２時間インキュベートした。次に、接合完了体を総量８００μＬに再懸濁（固体）または希釈（液体）し、適当な抗生物質を含むＬＢ培地にプレーティングして、レシピエント細胞集団全体における接合完了体の割合を評価した。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。＊は、接合完了体形成の頻度が検出限界（＜１０^-8）を下回ったことを示す。ｐｉｌＶ遺伝子全体、またはｐｉｌＶのＣ末端（ｐｉｌＶ遺伝子 の３ ’末端を含む）を再編成することができるシャフロンをＦｌａｇタグで置き換えてＴ４Ｐ変異体の第２のセットを生成した。ｐｉｌＶ変異体の発現を可能にするプラスミド（ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ：：ｃａｔ＋ ｐＰｉｌＶ４’）は、上記と同様の実験条件を使用してこの表現型を補完することができた（Ｂ）。ロックされたｐｉｌＶ変異体のそれぞれの可能性を、上記に述べたものと同じ条件下で、固体支持体、静止液体及び攪拌液体条件下での接合について評価した（それぞれＣ〜Ｅ）。

【図17】ＴＰ１１４のインビボ伝達速度に対するＴ４Ｐ不活性化の影響。ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ変異体がインビボで伝達する能力をＴＰ１１４と比較した。簡単に説明すると、各群５匹のマウスを株の導入の２日前に１ｇ／Ｌのストレプトマイシンで処理した。ドナー株導入の２時間前に、マウスにレシピエント株ＫＮ０３を投与した。次に、レシピエント細菌当たりの接合完了体の割合を糞便中で４日間モニターした（Ａ）。４日目に、マウスを屠殺し、盲腸と糞便との間で接合完了体の割合を比較した（Ｂ）。エラーバーは、少なくとも５つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。同様の実験を、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ：：ｃａｔ、ならびに２つのロックされたｐｉｌＶ変異体（それぞれ、大腸菌レシピエント株へのインビトロ接合が行えない、または行えた、ＴＰ１１４Δシャフロン：：ｐｉｌＶ１−ｃａｔ及びＴＰ１１４Δシャフロン：：ｐｉｌＶ４’−ｃａｔ）で行ったところ、特定の標的細菌に対する接合について特定のｐｉｌＶ変異体の不可欠な役割が示された（Ｃ）。

【図18】不和合性と排斥は、接合プラスミドの伝達を妨げる。不和合性及び排斥メカニズムは、各Ｉｎｃプラスミドファミリーに固有である。ＴＰ１１４を含むＫＮ０２を、異なるプラスミド（ｐＯＸ３８、Ｒ６Ｋ、ＴＰ１１４ ：： ｔｅｔＢ、ｐＶＣＲ９４、Ｒ３８８、ＲＰ４）を有するレシピエント細菌への接合用のドナーとして使用した。接合プラスミドを含まないレシピエント細菌へのＴＰ１１４の伝達速度は点線で示し、標準偏差は灰色で示す（Ａ）。パネルＡのデータに基づいて排斥比を計算した。簡単に述べると、接合プラスミドを欠くレシピエントへのＴＰ１１４の接合頻度を、すでにプラスミドを含んでいるレシピエントへの伝達比で割った。ＴＰ１１４によるｐＣｌｏＤＦ１３の、ＴＰ１１４のコピーを含むかまたは含まないレシピエントへのトランス可動化も評価した（Ｂ）。次に、排斥をインビボで試験した。ストレプトマイシン処理マウスに最初にＫＮ０２＋ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ （配列番号１６６）またはＫＮ０２のいずれかを与え、２時間後にＫＮ０１＋ＴＰ１１４を与えた。次に、糞便中のレシピエント細胞当たりの接合完了体の割合を、４日間連続して毎日分析した（Ｃ）。４日目にマウスを屠殺し、レシピエント細菌あたりの接合完了体の割合を盲腸と糞便の間で比較した（Ｄ）。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図19】排斥は、ＨＤＴＭライブラリ８からの特定のＴＰ１１４変異体では無効化される。ＴＰ１１４：：ｔｅｔＢ （配列番号１６６）は、接合によってＨＤＴＭライブラリ１から変異体プールに伝達された。得られた接合完了体はＨＤＴＭライブラリ８と呼ばれ、排斥についてほとんどが不全であった。個々のＨＤＴＭライブラリ８変異体を単離してからドナー株として使用して、ＴＰ１１４：：Ｔｎ５の排斥不全クローンを単離した。連続した２ラウンドの接合伝達の後、ＴＰ１１４：：ｔｅｔＢ（配列番号１６６）を排斥するＴＰ１１４ ：： Ｔｎ５の能力を、ＫＮ０２＋ＴＰ１１４ ：： ｔｅｔＢ（配列番号１６６）と、レシピエントとしてのＫＮ０１、ＫＮ０１＋ＴＰ１１４またはＫＮ０１＋ＴＰ１１４ ：： Ｔｎ５との間の接合実験で検証した（Ａ）。ＴＰ１１４またはＴＰ１１４ ：： Ｔｎ５の排斥比を、図１８で前述したように、空のレシピエントとも比較した（Ｂ）。最後に、ＴＰ１１４ ：： Ｔｎ５変異体が予想される速度で伝達する能力を、ＫＮ０１をドナー細胞として、ＫＮ０３をレシピエントとして使用して、３７°Ｃで２時間、固体培地上で検証した（Ｃ）。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図20】ＴＰ１１４の伝達効率を制限する遺伝子。トランスポゾン挿入部位をＴＰ１１４上にアラインし、ＵＣＳＣ ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒを使用して視覚化した。インビトロ（ＨＤＴＭライブラリ３）及び インビボ（ＨＤＴＭライブラリ７）条件の代表的な挿入密度トラックが示されている。黒い縦線は、ＴＰ１１４ゲノムの特定の位置でのトランスポゾン密度を表す。図に示されるトラックは、図９に示される生物学的複製＃２のＨＤＴＭライブラリのステップ１、３、及び７を表している。ＴＰ１１４−００５（以前に排斥及び接合頻度の増加を媒介することが示されている）及び ｙａｅＣ （転写抑制因子ｆｉｎＯのホモログ）の２個の遺伝子のみがＨＤＴＭライブラリ１からＨＤＴＭライブラリ３及び７への濃縮を示した。両方の遺伝子は点線の枠で囲まれている。

【図21A】カーゴＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３を試験するために使用されるプラスミドとｇＲＮＡ。Ｋｉｌｌ１挿入デバイス（図２１Ａ）、Ｋｉｌｌ３挿入デバイス（図２１Ｂ）、ｐＲＥＣ１（配列番号１６０）（図２１Ｃ）、ｐＢＸＢ１（配列番号１４５）（図２１ Ｄ）、及びｐＴ（図２１Ｅ）のマップが、一定の縮尺で示されている。プラスミド名の下に塩基対の全長（ｂｐ）が示されている。Ｋｉｌｌ３のｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの操作による融合体）は、Ｋｉｌｌ１のｇＲＮＡと同じプロモーターとターミネーターを用いて設計されている。ｐＴのマップのｃａｔ遺伝子の＊は、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを表している。すべてのｇＲＮＡは、標的のゲノムに導入された、またはプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子である ｃａｔを標的とするように設計した。ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｃａｔ遺伝子の標的配列と一致している（図２１Ｆ）。ｃａｔ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列（配列番号８７）は、ｇＲＮＡ１（配列番号８８、薄い灰色）、ｇＲＮＡ２（配列番号８９、灰色）及びｇＲＮＡ３（配列番号９０、濃い灰色）プロトスペーサー及びそれらのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（実線で囲まれている）の位置を示している（図２１Ｇ）。

【図21B】カーゴＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３を試験するために使用されるプラスミドとｇＲＮＡ。Ｋｉｌｌ１挿入デバイス（図２１Ａ）、Ｋｉｌｌ３挿入デバイス（図２１Ｂ）、ｐＲＥＣ１（配列番号１６０）（図２１Ｃ）、ｐＢＸＢ１（配列番号１４５）（図２１ Ｄ）、及びｐＴ（図２１Ｅ）のマップが、一定の縮尺で示されている。プラスミド名の下に塩基対の全長（ｂｐ）が示されている。Ｋｉｌｌ３のｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの操作による融合体）は、Ｋｉｌｌ１のｇＲＮＡと同じプロモーターとターミネーターを用いて設計されている。ｐＴのマップのｃａｔ遺伝子の＊は、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを表している。すべてのｇＲＮＡは、標的のゲノムに導入された、またはプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子である ｃａｔを標的とするように設計した。ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｃａｔ遺伝子の標的配列と一致している（図２１Ｆ）。ｃａｔ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列（配列番号８７）は、ｇＲＮＡ１（配列番号８８、薄い灰色）、ｇＲＮＡ２（配列番号８９、灰色）及びｇＲＮＡ３（配列番号９０、濃い灰色）プロトスペーサー及びそれらのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（実線で囲まれている）の位置を示している（図２１Ｇ）。

【図21C】カーゴＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３を試験するために使用されるプラスミドとｇＲＮＡ。Ｋｉｌｌ１挿入デバイス（図２１Ａ）、Ｋｉｌｌ３挿入デバイス（図２１Ｂ）、ｐＲＥＣ１（配列番号１６０）（図２１Ｃ）、ｐＢＸＢ１（配列番号１４５）（図２１ Ｄ）、及びｐＴ（図２１Ｅ）のマップが、一定の縮尺で示されている。プラスミド名の下に塩基対の全長（ｂｐ）が示されている。Ｋｉｌｌ３のｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの操作による融合体）は、Ｋｉｌｌ１のｇＲＮＡと同じプロモーターとターミネーターを用いて設計されている。ｐＴのマップのｃａｔ遺伝子の＊は、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを表している。すべてのｇＲＮＡは、標的のゲノムに導入された、またはプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子である ｃａｔを標的とするように設計した。ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｃａｔ遺伝子の標的配列と一致している（図２１Ｆ）。ｃａｔ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列（配列番号８７）は、ｇＲＮＡ１（配列番号８８、薄い灰色）、ｇＲＮＡ２（配列番号８９、灰色）及びｇＲＮＡ３（配列番号９０、濃い灰色）プロトスペーサー及びそれらのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（実線で囲まれている）の位置を示している（図２１Ｇ）。

【図21D】カーゴＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３を試験するために使用されるプラスミドとｇＲＮＡ。Ｋｉｌｌ１挿入デバイス（図２１Ａ）、Ｋｉｌｌ３挿入デバイス（図２１Ｂ）、ｐＲＥＣ１（配列番号１６０）（図２１Ｃ）、ｐＢＸＢ１（配列番号１４５）（図２１ Ｄ）、及びｐＴ（図２１Ｅ）のマップが、一定の縮尺で示されている。プラスミド名の下に塩基対の全長（ｂｐ）が示されている。Ｋｉｌｌ３のｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの操作による融合体）は、Ｋｉｌｌ１のｇＲＮＡと同じプロモーターとターミネーターを用いて設計されている。ｐＴのマップのｃａｔ遺伝子の＊は、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを表している。すべてのｇＲＮＡは、標的のゲノムに導入された、またはプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子である ｃａｔを標的とするように設計した。ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｃａｔ遺伝子の標的配列と一致している（図２１Ｆ）。ｃａｔ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列（配列番号８７）は、ｇＲＮＡ１（配列番号８８、薄い灰色）、ｇＲＮＡ２（配列番号８９、灰色）及びｇＲＮＡ３（配列番号９０、濃い灰色）プロトスペーサー及びそれらのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（実線で囲まれている）の位置を示している（図２１Ｇ）。

【図21E】カーゴＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３を試験するために使用されるプラスミドとｇＲＮＡ。Ｋｉｌｌ１挿入デバイス（図２１Ａ）、Ｋｉｌｌ３挿入デバイス（図２１Ｂ）、ｐＲＥＣ１（配列番号１６０）（図２１Ｃ）、ｐＢＸＢ１（配列番号１４５）（図２１ Ｄ）、及びｐＴ（図２１Ｅ）のマップが、一定の縮尺で示されている。プラスミド名の下に塩基対の全長（ｂｐ）が示されている。Ｋｉｌｌ３のｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの操作による融合体）は、Ｋｉｌｌ１のｇＲＮＡと同じプロモーターとターミネーターを用いて設計されている。ｐＴのマップのｃａｔ遺伝子の＊は、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを表している。すべてのｇＲＮＡは、標的のゲノムに導入された、またはプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子である ｃａｔを標的とするように設計した。ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｃａｔ遺伝子の標的配列と一致している（図２１Ｆ）。ｃａｔ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列（配列番号８７）は、ｇＲＮＡ１（配列番号８８、薄い灰色）、ｇＲＮＡ２（配列番号８９、灰色）及びｇＲＮＡ３（配列番号９０、濃い灰色）プロトスペーサー及びそれらのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（実線で囲まれている）の位置を示している（図２１Ｇ）。

【図21F】カーゴＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３を試験するために使用されるプラスミドとｇＲＮＡ。Ｋｉｌｌ１挿入デバイス（図２１Ａ）、Ｋｉｌｌ３挿入デバイス（図２１Ｂ）、ｐＲＥＣ１（配列番号１６０）（図２１Ｃ）、ｐＢＸＢ１（配列番号１４５）（図２１ Ｄ）、及びｐＴ（図２１Ｅ）のマップが、一定の縮尺で示されている。プラスミド名の下に塩基対の全長（ｂｐ）が示されている。Ｋｉｌｌ３のｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの操作による融合体）は、Ｋｉｌｌ１のｇＲＮＡと同じプロモーターとターミネーターを用いて設計されている。ｐＴのマップのｃａｔ遺伝子の＊は、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを表している。すべてのｇＲＮＡは、標的のゲノムに導入された、またはプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子である ｃａｔを標的とするように設計した。ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｃａｔ遺伝子の標的配列と一致している（図２１Ｆ）。ｃａｔ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列（配列番号８７）は、ｇＲＮＡ１（配列番号８８、薄い灰色）、ｇＲＮＡ２（配列番号８９、灰色）及びｇＲＮＡ３（配列番号９０、濃い灰色）プロトスペーサー及びそれらのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（実線で囲まれている）の位置を示している（図２１Ｇ）。

【図21G】カーゴＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３を試験するために使用されるプラスミドとｇＲＮＡ。Ｋｉｌｌ１挿入デバイス（図２１Ａ）、Ｋｉｌｌ３挿入デバイス（図２１Ｂ）、ｐＲＥＣ１（配列番号１６０）（図２１Ｃ）、ｐＢＸＢ１（配列番号１４５）（図２１ Ｄ）、及びｐＴ（図２１Ｅ）のマップが、一定の縮尺で示されている。プラスミド名の下に塩基対の全長（ｂｐ）が示されている。Ｋｉｌｌ３のｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの操作による融合体）は、Ｋｉｌｌ１のｇＲＮＡと同じプロモーターとターミネーターを用いて設計されている。ｐＴのマップのｃａｔ遺伝子の＊は、ｇＲＮＡのプロトスペーサーを表している。すべてのｇＲＮＡは、標的のゲノムに導入された、またはプラスミド上に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子である ｃａｔを標的とするように設計した。ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｃａｔ遺伝子の標的配列と一致している（図２１Ｆ）。ｃａｔ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列（配列番号８７）は、ｇＲＮＡ１（配列番号８８、薄い灰色）、ｇＲＮＡ２（配列番号８９、灰色）及びｇＲＮＡ３（配列番号９０、濃い灰色）プロトスペーサー及びそれらのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（実線で囲まれている）の位置を示している（図２１Ｇ）。

【図22A】ダブルリコンビナーゼ操作によるＤＮＡ挿入（Ｄｏｕｂｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｏｐｅｒａｔｅｄ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ）（ＤＲＯＩＤ）による伝達マシナリーへの遺伝子カーゴの導入。ＤＲＯＩＤ法は、伝達マシナリーＴＰ１１４へのＫｉｌｌ１の挿入によって例示される（図２２Ａ）。

【図22B】最初のステップは、リコンビニアリングによってｔｅｔＢローディングドックを伝達マシナリーに挿入することである。次に、Ｂｘｂ１インテグラーゼが、それぞれローディングドック及び遺伝子カーゴ挿入デバイス上にあるａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の融合を行う。最後に、ＦＬＰリコンビナーゼを発現させて、２個の新たに連結されたＦＲＴ部位（ｔｅｔＢ、ｐＳＣ１０１ｔｓ、及び ａｔｔＬ部位）間の挿入デバイスセグメントをノックアウトする。Ｋｉｌｌ１の挿入について、リコンビニアリング（図２２Ｂ）、ＤＲＯＩＤステップ１（図２２Ｃ）、及びＤＲＯＩＤステップ２（図２２Ｄ）のＰＣＲによる検証を示す。各レーンのアンプリコンは、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ内のｔｅｔＢとＴＰ１１４との間の右側の接合部であるレーンＤを除いて、太字または数字で図面に示されている。

【図22C】最初のステップは、リコンビニアリングによってｔｅｔＢローディングドックを伝達マシナリーに挿入することである。次に、Ｂｘｂ１インテグラーゼが、それぞれローディングドック及び遺伝子カーゴ挿入デバイス上にあるａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の融合を行う。最後に、ＦＬＰリコンビナーゼを発現させて、２個の新たに連結されたＦＲＴ部位（ｔｅｔＢ、ｐＳＣ１０１ｔｓ、及び ａｔｔＬ部位）間の挿入デバイスセグメントをノックアウトする。Ｋｉｌｌ１の挿入について、リコンビニアリング（図２２Ｂ）、ＤＲＯＩＤステップ１（図２２Ｃ）、及びＤＲＯＩＤステップ２（図２２Ｄ）のＰＣＲによる検証を示す。各レーンのアンプリコンは、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ内のｔｅｔＢとＴＰ１１４との間の右側の接合部であるレーンＤを除いて、太字または数字で図面に示されている。

【図22D】最初のステップは、リコンビニアリングによってｔｅｔＢローディングドックを伝達マシナリーに挿入することである。次に、Ｂｘｂ１インテグラーゼが、それぞれローディングドック及び遺伝子カーゴ挿入デバイス上にあるａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の融合を行う。最後に、ＦＬＰリコンビナーゼを発現させて、２個の新たに連結されたＦＲＴ部位（ｔｅｔＢ、ｐＳＣ１０１ｔｓ、及び ａｔｔＬ部位）間の挿入デバイスセグメントをノックアウトする。Ｋｉｌｌ１の挿入について、リコンビニアリング（図２２Ｂ）、ＤＲＯＩＤステップ１（図２２Ｃ）、及びＤＲＯＩＤステップ２（図２２Ｄ）のＰＣＲによる検証を示す。各レーンのアンプリコンは、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ内のｔｅｔＢとＴＰ１１４との間の右側の接合部であるレーンＤを除いて、太字または数字で図面に示されている。

【図23】接合送達システムの形態の例。細菌は、階層的に編成されたいくつかの構成要素に分解することができる（Ａ）。遺伝子カーゴはいくつかの形態で送達できるが、そのうちの３つを実施例ＩＩＩに示す（Ｂ）。最初のアプローチは、シス可動化によって遺伝子カーゴを送達することであり、その場合、遺伝子カーゴは伝達マシナリーに直接挿入されて接合送達システムをコードする単一のベクターを形成する。２番目の方法は、制約付きシス可動化によって遺伝子カーゴを送達することであり、その場合、必須の複製遺伝子がドナー細菌の染色体に再配置されることでドナー株の外部の接合送達システムの複製を防止する。最後に、遺伝子カーゴと伝達マシナリーを２つ以上のベクターにコードして トランス可動化を可能とすることができる。この設定では、遺伝子カーゴには、伝達マシナリーによって認識され、ドナー株からレシピエント株への伝達を媒介する輸送モジュールが必要である。各送達モードは、Ｘ（バイオコンテインメントされていない）、＋（コンテインメントされている）、及び＋＋（より厳密にコンテインメントされている）で表される異なるレベルのバイオセーフティを与える。ドナー株とレシピエント株の両方の複製及び伝達能力を、Ｘ（不可能）またはチェックマーク（可能）で示している。トランス可動化のためのレシピエントでの複製は、遺伝子カーゴの維持モジュールに依存している。

【図24】標的プラスミド（ｐＴ）を含むレシピエント細胞への形質転換によって評価したＫｉｌｌ１及びＫｉｌｌ３遺伝子カーゴの形質転換効率。５０ｎｇの各遺伝子カーゴ挿入デバイスを生物学的三重複製でＫＮ０３＋ｐＴにエレクトロポレーションし、プレーティングして遺伝子カーゴのみを選択するか（黒い棒）、または遺伝子カーゴとｐＴの両方を選択した（白い棒）。形質転換効率は、エレクトロポレーションしたＤＮＡ１ｍｇあたりの形質転換体として示されている。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。＊は、プレート上にＣＦＵがないことを示す。

【図25A】ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１は、インビトロで混合集団から標的細菌を選択的に排除する。ＣＯＰを、ｃａｔ遺伝子の染色体コピーを保持する大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（図２５Ａ ）またはシトロバクター・ロデンティウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）（図２５Ｂ ）の特異的標的化に用い、これを、他の３つの腸内細菌科で構成される模擬細菌集団で行った。等量の各株を混合した後、ＣＯＰ株と、またはＫＮ０１ΔｄａｐＡ ＋ ＴＰ１１４コントロール株と、３７℃の固体培地上で２時間、インキュベートした。この図は、模擬集団の各株についてＴＰ１１４と比較したＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１の接合完了体の相対存在量（％）を示している。どちらの場合も、標的株の接合完了体の存在量は、具体的には約１０００分の１に減少した。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図25B】ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１は、インビトロで混合集団から標的細菌を選択的に排除する。ＣＯＰを、ｃａｔ遺伝子の染色体コピーを保持する大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（図２５Ａ ）またはシトロバクター・ロデンティウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）（図２５Ｂ ）の特異的標的化に用い、これを、他の３つの腸内細菌科で構成される模擬細菌集団で行った。等量の各株を混合した後、ＣＯＰ株と、またはＫＮ０１ΔｄａｐＡ ＋ ＴＰ１１４コントロール株と、３７℃の固体培地上で２時間、インキュベートした。この図は、模擬集団の各株についてＴＰ１１４と比較したＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１の接合完了体の相対存在量（％）を示している。どちらの場合も、標的株の接合完了体の存在量は、具体的には約１０００分の１に減少した。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図26】ＴＰ１１４複製起点（ｏｒｉＶ）遺伝子座の特定。複製タンパク質ＲｅｐＡをコードする遺伝子座をインシリコで予測し、ｐｉｒ依存性プラスミド骨格に３つの異なる形態でクローニングした。「ｒｅｐＡ＋上流」は、ｒｅｐＡコード配列（ＣＤＳ）＋上流領域から１０００ｂｐに対応し、「ｒｅｐＡ＋下流」は、ｒｅｐＡ ＣＤＳ及び推定されるプロモーター＋下流領域の１０００ｂｐを表し、「ｒｅｐＡ＋両側」には、ｒｅｐＡ ＣＤＳ ＋上流及び下流領域からの１０００ｂｐが含まれる。３つすべてのプラスミドのバージョンを、ｐｉｒ−またはｐｉｒ＋株に形質転換してＴＰ１１４ のｏｒｉＶの活性を試験した。上流領域と下流領域の両方を有するｒｅｐＡ ＣＤＳのみ が、ｐｉｒ−株内で複製することができた。エラーバーは、３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図27】制約付きシス可動化送達は、環境中のプラスミドの持続を防ぐことができる。ＴＰ１１４とＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kを接合によりＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋からｐｉｒ−欠損株（黒い棒）及びｐｉｒ＋株（白い棒）へと、固体ＬＢ培地上、３７℃で２時間、伝達させた。ｐｉｒ−欠損株（＊）へのＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kの場合では接合完了体は検出されず、ｐｉｒ＋株へのＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kの場合では頻度の低下が観察された。まったく対照的に、野生型ＴＰ１１４は通常の頻度（約１０^-3）で伝達することができた（Ａ）。ＴＰ１１４とＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kを接合により、ＫＮ０５からＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋株（灰色の棒）に、固体ＬＢ培地上、３７℃で２時間、伝達させた（Ｂ）。これらの条件下では、両方のプラスミドが同様の速度でコンジュゲートする可能性があります。エラーバーは、３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図28】ｏｒｉＴ_TP114含有プラスミドのトランス可動化。シャトルプラスミドｐＮＡ０１は、ｏｒｉＴ_TP114を含み、したがってＴＰ１１４によって可動化されるはずである。ｐＮＡ０２は、ｏｒｉＴ_TP114のニッキング部位を中心とした７ｂｐの欠失を提示する。ＴＰ１１４とシャトルプラスミド（ｐＮＡ０１またはｐＮＡ０２のいずれか）を含むドナー株を用いたプラスミドｐＮＡ０１（Ａ）及びｐＮＡ０２（Ｂ）のトランス可動化頻度。接合頻度を、ＴＰ１１４（黒い棒）、シャトルプラスミドｐＮＡ０１またはｐＮＡ０２（灰色の棒）を含む接合完了体について、及びＴＰ１１４とシャトルプラスミド（白い棒）の両方を含む接合完了体について計算した。エラーバーは、３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図29】ペアワイズ配列アラインメントによるＴＰ１１４の伝達起点（ｏｒｉＴ）ニッキング部位の位置特定。ｏｒｉＴはプラスミドの認識を可能とし、可動化に不可欠である。この認識は、ｏｒｉＴ配列内のリピートの存在に基づいている。次に、リラクソソームがｏｒｉＴに特異的に結合し、ＤＮＡにニック（一本鎖切断）を入れて接合伝達を開始する。ＴＰ１１４のｏｒｉＴ （配列番号１４１）を、これまでに特徴付けられているＲ６４最小 ｏｒｉＴ （配列番号１４２）と整列させた。ニッキング部位の予測を可能とするために重要なリピートをアライメント上にマッピングした。配列アラインメントは弱かったが、リピートはＴＰ１１４とＲ６４の両方に存在し、ニッキング部位の推定上の局在を示唆した。線「｜」は、完全な配列アラインメントを表し、ドット「．」は、類似性の低い領域を示し、空白スペース 「 」はミスマッチのギャップである。

【図30】伝達起点（ｏｒｉＴ）の欠失がＴＰ１１４の伝達頻度に与える影響。ＴＰ１１４のｏｒｉＴのニッキング部位のおおよその位置をリコンビニアリングによって欠失させ、ＴＰ１１４ΔｏｒｉＴを作製した。最初に大腸菌 ＭＧ１６５５Ｎｘ^R から大腸菌ＭＧ１６５５Ｒｆ^Rへの伝達を用いて接合頻度を評価し、野生型の接合率と比較した（Ａ）。伝達率はＴＰ１１４ΔｏｒｉＴで大幅に低下し、残存伝達事象 （約１０^-6）はおそらくは部分的なｏｒｉＴの認識によるか、またはＴＰ１１４内の隠れたｏｒｉＴの存在によると考えられた。次に、大腸菌ＭＧ１６５５Ｒｆ^RへのＴＰ１１４ΔｏｒｉＴの伝達を試験したところ、接合完了体は検出されなかった（＊）（Ｂ）。エラーバーは、３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図31】非可動化伝達マシナリーによるシャトルプラスミドｐＫＮ３０及びｐＫＮ３１のトランス可動化。ＴＰ１１４とシャトルプラスミド（ｐＫＮ３０またはｐＫＮ３１のいずれか）の両方を含むドナー株を使用したプラスミドｐＫＮ３０（図２８Ａ ）及びｐＫＮ３１（図２８Ｂ）のトランス可動化頻度。プラスミドｐＫＮ３０及びｐＫＮ３１は、それぞれｐＮＡ０１及びｐＮＡ０２のカナマイシン耐性変異体である。ｐＫＮ３０及びｐＫＮ３１は両方ともＴＰ１１４の ｏｒｉＴが含んでいるが、ｐＫＮ３１は、ニッキング部位領域に７ｂｐの欠失があり、その伝達を妨げている。シャトルプラスミド（ｐＫＮ３０またはｐＫＮ３１）であるＴＰ１１４ΔｏｒｉＴ：：ｃａｔ−ｔｅｔＢを含む接合完了体について、また、ＴＰ１１４とシャトルプラスミドの両方を有する接合完了体について接合頻度を計算した。＊は、接合完了体形成の頻度が検出限界（＜１０^-8）を下回ったことを示す。エラーバーは、３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図32】実施例ＩＩＩで説明したトランス可動化の概略図。ＴＰ１１４ ｏｒｉＴ 配列をインシリコで同定し、ｐＮＡ０１にクローニングした。ｏｒｉＴ配列は、ＴＰ１１４ニッカーゼによって認識され、ｐＮＡ０１のトランス可動化を媒介する。しかしながら、予測されるニッキング部位（ニッカーゼ活性に不可欠）を中心とした７ｂｐの欠失は、ｐＮＡ０２のトランス可動化を妨げる。

【図33】ＣＯＰシステムは、有益な表現型を与えるＤＮＡをインビボで標的細菌に伝達することができる。ＴＰ１１４を、カナマイシン耐性遺伝子をマウスの腸内の標的細菌に伝達するための接合送達システムとして使用した。ＫＮ０１＋ＴＰ１１４導入の２時間前に、マウスにＫＮ０２を与えた。耐性表現型を獲得したレシピエント細菌（接合完了体）の全レシピエントに対する割合を、糞便中で４日間追跡した（Ａ）。４日目にマウスを屠殺し、盲腸と糞便でレシピエント当たりの接合完了体の割合を比較した（Ｂ）。エラーバーは、４つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図34】実施例ＩＶに示されるような接合プロバイオティクス（ＣＯＰ）の応用。ＣＯＰシステムは、接合伝達によって遺伝子カーゴを送達するプロバイオティクス細胞シャーシに基づいている。この例では、遺伝子カーゴはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をコードしており、これを細菌の集団に伝達して、特定の菌株を、配列固有の基準に基づいて除去するための標的とすることができる（Ａ）。接合は非常に効率的な接合プラスミドによってコードされる伝達マシナリーによって媒介され、接合プラスミドは、この例では遺伝子カーゴを直接保有していることによって、接合送達システムを形成している。接合プラスミドも通常モジュール式であり、遺伝子はその機能に従ってグループ化されている（Ｂ）。標的細胞に入ると、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが発現し、ｇＲＮＡとアセンブルして、細胞のＤＮＡ含量全体をスキャンする。プロトスペーサー配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の下流で見つかると、Ｃａｓ９はＤＮＡの二本鎖切断を媒介する（Ｃ）。細菌性ＣＯＰを使用することで、複雑な微生物集団内の細胞を選択的に標的化することができる。細菌性ＣＯＰは、遺伝子カーゴをレシピエント細胞に伝達するが、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステムは、集団の特定の株のみを標的とする。標的配列がゲノムにある場合、標的細胞はＤＮＡが損なわれたゲノムの完全性のため死に至る。標的がプラスミドにある場合（例えば、病原性関連遺伝子）、プラスミドはキュアされ、標的細胞のディスアームにつながる（Ｄ）。

【図35】ＣＯＰは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９染色体外配列ターゲティングを介して表現型形質の喪失を媒介することができる。ＴＰ１１４（コントロール）またはＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を、マウス腸管内でＫＮ０１からＫＮ０２（標的プラスミドｐＴを含む）に伝達させた。標的株のディスアーム（ｐＴプラスミドのキュレーション）を、すべての標的レシピエント細胞の増殖を可能とするプレート上のコロニー蛍光を分析することにより、糞便中で４日間、経時的に追跡した（Ａ）。ＣＯＰ治療に応じて、コントロール群の４匹のマウスと試験群の３匹のマウスの生の割合で一元配置分散分析を行った。代表的な画像は、プラスミドを失ったコロニーと失っていないコロニーとの間で緑色蛍光がどのように識別できるかを示している（Ｂ）。４日目に、プラスミドキュレーションの結果をマウスの糞便と盲腸とで比較したところ、高い一貫性を示した（Ｃ）。接合完了体のみについて選択した場合、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１はすべてのマウスで１００％のディスアーム率を実現したが、ＴＰ１１４の伝達はそのような活性を示さなかった（Ｄ）。

【図36A】ＣＯＰは、インビボで侵入株によるコロニー形成を防止するために予防的に投与することができる。実験の概略的な説明（図３６Ａ）。

【図36B】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれ、ＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株を、標的／非標的株混合物の１２時間前に投与した（約１０⁸ ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、ドナー株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対的な存在量を示します。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図36C】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれ、ＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株を、標的／非標的株混合物の１２時間前に投与した（約１０⁸ ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、ドナー株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対的な存在量を示します。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図36D】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれ、ＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株を、標的／非標的株混合物の１２時間前に投与した（約１０⁸ ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、ドナー株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対的な存在量を示します。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図36E】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれ、ＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株を、標的／非標的株混合物の１２時間前に投与した（約１０⁸ ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、ドナー株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対的な存在量を示します。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図37A】ＣＯＰは、インビボで標的株を選択的に排除するために治療的に投与することができる。実験の概略図（図３７Ａ）。

【図37B】標的／非標的株混合物を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株の１２時間前に投与した（約１０⁸ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、標的株と非標的株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対存在量を示す。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図37C】標的／非標的株混合物を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株の１２時間前に投与した（約１０⁸ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、標的株と非標的株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対存在量を示す。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図37D】標的／非標的株混合物を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株の１２時間前に投与した（約１０⁸ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、標的株と非標的株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対存在量を示す。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図37E】標的／非標的株混合物を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含む、または含まない（それぞれＣＯＰ及びコントロール）ＴＰ１１４プラスミドを有するプロバイオティクスドナー株の１２時間前に投与した（約１０⁸ＣＦＵ）。糞便１ｍｇあたりの標的株と非標的株の存在量（図３６Ｂ及びＤ）と競合指数（図３６Ｃ及びＥ）を、標的株と非標的株の強制給餌後の時間の関数として示す。競合指数は、標的細菌または非標的細菌の相対存在量を示す。パネルＢ及びＤの破線はＣＦＵの検出上限であり、ｙ軸は検出下限に設定されている。パネルＣ及びＥにおいて、破線は、両方の菌株がまったく同じ適応度を有する状況での両方の菌株に相当する競合比を表している。

【図38】遺伝子カーゴは、細菌集団に有益な影響及び有害な影響を与え得る。この実験では、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３は、カナマイシン耐性遺伝子と、クロラムフェニコール耐性を与える遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムをコードしていた。ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３とＴＰ１１４（コントロール）の両方を、接合により標的プラスミド（ｐＴ）を有するレシピエント細菌に伝達した。プラスミドのキュレーション効率を、最初に抗生物質耐性によってモニターし、プラスミドｐＴとＴＰ１１４またはＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３との共存を評価した。ｐＴとＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３について同時選択することによってＣＦＵが明らかに低下したが、これは、遺伝子カーゴの選択によってレシピエント細菌集団内でのｐＴ損失の増加につながることを示唆している。＊は、接合完了体形成の頻度が検出限界（＜１０^-8）を下回っていたことを示す（Ａ）。次に、カナマイシンを使用して遺伝子カーゴの獲得について選択を行いながら、蛍光コロニー（ｐＴプラスミドを含む）の数を定量化することにより、プラスミドのキュレーションを評価した（Ｂ）。カナマイシン選択を行った標的細胞の増殖後の段階希釈された接合混合物からの細菌スポットの代表的な写真（Ｃ）。エラーバーは、３つの生物学的複製からの平均の標準偏差を示す。

【図39】ＥｃＮドナーとさまざまな細菌種からの異なるレシピエント株との間のいくつかのプラスミドの接合伝達率。最も悪名高い多剤耐性腸内細菌科のいくつかを代表する菌株への、６つの不和合性ファミリーにまたがるいくつかの接合プラスミドのインビトロ伝達。寒天（Ａ）とブロス（Ｂ）の両方で伝達実験を行った。レシピエントのＣＦＵで正規化した伝達頻度を、グレースケールグラデーションを使用して表している。図に示されるデータは、少なくとも３つの生物学的複製の平均である。

【図40】制限系からの保護をＤＮＡ修飾によって獲得することができる。制限修飾系は、遺伝子の水平伝達に対する障壁である。レシピエントの制限系と適合性のある修飾系を有するドナーを使用することで、接合効率が向上する。凡例では、ＭＧ１６５５ ＝大腸菌ＭＧ１６５５、ＥｃＮ ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７である。伝達は、ドナーとレシピエントのペアの間で行われる。図に示されるデータは、少なくとも３つの生物学的複製の平均である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示は、インビボでレシピエント細菌宿主細胞に治療用遺伝子カーゴなどのペイロードを送達するように特別に操作された接合性細菌細胞を開発及び使用するための方法及びシステムに関する。特定の実施形態では、接合性細菌細胞は、インビボで使用することができる（例えば、胃腸管環境または膀胱内で）。いくつかの実施形態において、接合性細菌細胞を用いて、（１）微生物叢の腸内毒素症を治療し、（２）有益な因子を発現するように微生物叢を改変し、（３）抗生物質耐性及び／または抗生物質耐性の広がりを抑制し、（４）特定の病原体を除去し、（５）細菌の病原性因子の発現を抑制することができる。

【0018】

本開示との関連で使用するところの「由来する」なる用語は、天然に存在する生物から得られた、または天然に存在する生物から改変された遺伝物質の使用を指す。

【0019】

接合送達システムの構成要素
本開示の接合送達システムは、細菌内に天然に存在するかまたは遺伝的に導入された遺伝的要素を含み、細菌がその遺伝子カーゴをレシピエント細菌細胞にインビボで伝達することを可能とする。接合送達システムは、伝達マシナリー（遺伝子カーゴを伝達するために必要な遺伝的要素を含む）と、遺伝子カーゴそれ自体の２つの主要な構成要素で構成されている。伝達マシナリーの構成要素は、１つ以上の染色体外ベクター上に配置されるか、及び／または細菌染色体に組み込まれてもよい。伝達マシナリーの構成要素は、互いに対して シス または トランスに位置することができる。遺伝子カーゴは、輸送モジュールをペイロードモジュールと機能的に関連付けて配置することによって、または異種の遺伝子カーゴを接合性細菌宿主細胞に導入することによって、接合性細菌宿主細胞に遺伝子操作により導入されてきた。ペイロードモジュールに機能的に関連付けられた輸送モジュールを含む遺伝子カーゴは、染色体外ベクター上に配置されても、または細菌染色体に組み込まれてもよい。輸送モジュールは、ペイロードモジュールと「機能的に関連付けられ」、それにより、可動化モジュール（例えば、輸送マシナリー）によってコードされたタンパク質が輸送モジュールを認識して輸送モジュールに作用する際にペイロードモジュールの伝達を可能にする。したがって、遺伝子カーゴ上で、ペイロードモジュールは可動化モジュールのタンパク質が輸送モジュールと結合する際にペイロードモジュールの伝達を可能にする位置で輸送モジュールに対してシスに配置される。

【0020】

一実施形態では、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴの構成要素は、１つ以上の染色体外ベクター上のみに配置される。一実施形態では、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴの構成要素は、単一の染色体外ベクター上に配置される。別の実施形態では、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴの構成要素は、複数の染色体外ベクター上に配置される。例えば、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴの構成要素は、図２３Ａに示されるように、２つの異なる染色体ベクターとして編成することができる。

【0021】

別の実施形態では、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴの構成要素は、細菌の染色体のみに配置することができる。

【0022】

いっそうさらなる実施形態では、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴの構成要素は、１つ以上の染色体外ベクター上及び細菌の染色体に配置される／配置することができる。例えば、伝達マシナリーの構成要素を細菌の染色体のみに配置し、遺伝子カーゴの構成要素を染色体外ベクターのみに配置することができる。別の例では、伝達マシナリーの構成要素のいくつかを細菌の染色体及び１つ以上の染色体外ベクターに配置する一方で、遺伝子カーゴの構成要素を１つ以上の染色体外ベクターのみに配置することができる（例として、図２３Ｂに示される実施形態など）。さらに別の例では、伝達マシナリーの構成要素を細菌の染色体のみに配置する一方で、遺伝子カーゴの構成要素のいくつかを細菌の染色体に配置し、他のものを１つ以上の染色体外ベクターに配置することができる。さらに別の例では、伝達マシナリーの構成要素のいくつかを細菌染色体及び１つ以上の染色体外ベクターに配置する一方で、遺伝子カーゴの構成要素のいくつかを細菌染色体に配置し、他のものを１つ以上の染色体外ベクターに配置することができる。

【0023】

本明細書で使用するところの「ゲノム」なる用語は、コーディング配列及び非コーディング配列の両方を含む、ＤＮＡにコードされた生物の遺伝情報全体を指す。「モジュール」なる用語は、同じ機能に寄与する遺伝子群を指す。一実施形態では、同じモジュールからのすべての遺伝子は、同じＤＮＡ分子上で物理的に（シスに）連結されている。さらに別の実施形態では、遺伝子は、複数のＤＮＡ分子に含まれ得る。

【0024】

本明細書で使用するところの「染色体外ベクター」なる用語は、細菌ゲノムとは物理的に異なる遺伝的要素を指す。染色体外ベクターは通常、栄養複製モジュールが存在するため、細菌ゲノムとは独立して複製することができる。いくつかの実施形態において、染色体外ベクターは、例えば、環状プラスミドなどのプラスミドである。ベクターは、通常、ベクターがドナー細菌のゲノムとは独立して複製することが意図されている場合、環状プラスミドであってよく、またはベクターはドナー細菌のゲノムに組み込まれた線状ＤＮＡ分子であってもよい。複数のベクターが存在する実施形態では、それらを同じまたは異なる形態で与えることができる。

【0025】

一実施形態では、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴは、同じ核酸分子または異なる核酸分子の一部であってよい。核酸分子は環状としても、または線形化してもよい（細菌の染色体への組み込みを目的として）。

【0026】

伝達マシナリー及び遺伝子カーゴは、１つ以上のタンパク質、その変異体またはその断片をコードすることができる遺伝子を含むモジュールを含む。タンパク質は、モジュールによってコードされることが知られているタンパク質の変異体であってよい。変異体は、天然／既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較した場合に少なくとも１つのアミノ酸の相違を含む。本明細書で使用するところの変異体とは、タンパク質の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更後の配列が異種タンパク質に関連する生物学的機能を防止または破壊する場合、タンパク質に悪影響を与えると言われる。例えば、タンパク質の全体的な電荷、構造、または疎水性−親水性は、生物学的活性に悪影響を与えることなく変更することができる。したがって、アミノ酸配列は、例えば、異種タンパク質の生物学的活性に悪影響を与えることなく、ペプチドをより疎水性または親水性にするように変更することができる。タンパク質変異体は、本明細書に記載の異種タンパク質と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。当該技術分野では周知の「同一性（％）」なる用語は、配列同士を比較することによって決定される、２つ以上のタンパク質配列または２つ以上のヌクレオチド配列間の関係である。同一性のレベルは、既知のコンピュータプログラムを使用して従来通りに決定することができる。同一性は、これらに限定されるものではないが、以下の文献に記載されるものを含む既知の方法によって容易に計算することができる。すなわち、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．） Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最良の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムとしてコード化されている。配列アラインメント及び同一性（％）の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して行うことができる。本明細書に開示される配列のマルチプルアラインメントは、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いて、Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して行った。Ｃｌｕｓｔａｌメソッドを使用したペアワイズアライメントのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であった。

【0027】

本明細書に記載される変異体タンパク質は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているもので、かかる置換アミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチド（例えば、ポリエチレングリコール）の半減期を延長する化合物と融合されているもの、または（ｉｖ）ポリペプチドの精製用にさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているものであってよい。タンパク質の「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であってよい。

【0028】

タンパク質は、モジュールの遺伝子の１つによってコードされるタンパク質の断片または変異タンパク質の断片であってよい。一実施形態では、フラグメントは、シグナルペプチド配列が除去された既知の／天然のタンパク質に相当する。いくつかの実施形態において、異種タンパク質の「フラグメント」は、タンパク質の少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００またはそれ以上の連続したアミノ酸を有する。フラグメントは、既知の／天然の異種タンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を含み、それでも完全長の異種タンパク質の酵素活性を有する。一実施形態では、フラグメントは、シグナルペプチドを欠くタンパク質のアミノ酸配列に相当する。いくつかの実施形態において、異種タンパク質のフラグメントは、ペプチド合成によって対応する完全長の異種タンパク質を生成するために使用することができる。したがって、フラグメントは、完全長タンパク質を生成するための中間体として使用することができる。

【0029】

接合性細菌細胞
本明細書で使用するところの「接合性細菌（宿主）細胞」、「組換え細菌」または「ドナー細菌」なる用語は、細菌接合を介して水平遺伝子伝達が可能な細菌を指す。本開示との関連で使用される「細菌接合」、「接合」、「接合伝達」または「伝達」なる用語は、遺伝物質（遺伝カーゴと呼ばれる）がドナー細菌から標的細菌（レシピエント細菌細胞とも呼ばれる）へと２個の細菌細胞間に通路を形成する接合孔を介して送達される水平遺伝子伝達 の機構を指す。接合性細菌細胞は、いくつかの実施形態において、１つ以上の病原性因子を除去または不活性化するように、接合で使用される前に改変することができる。いくつかの実施形態において、接合性細菌細胞は、「接合性プロバイオティクス」または「ＣＯＰ」と呼ばれる場合もあるプロバイオティクス細菌であり得る。本明細書で使用するところの「プロバイオティクス」なる用語は、適当な量でかつ適当な経路を介して投与された場合に、有害な効果を有さず、またその宿主に有益な効果を与えることができる細菌を指す。

【0030】

したがって、本開示は、本開示の接合送達システムを有するように遺伝子操作された、プロバイオティクスであり得る細菌を提供する。したがって、本開示は、本開示の接合送達システムを細菌に導入することによって組換え細菌を得るためのプロセスも提供する。

【0031】

ヒトまたは動物の対象に対してプロバイオティクスと呼ばれ、本開示のＣＯＰである可能性がある細菌属としては、これらに限定されるものではないが、バチルス属、ビフィドバクテリウム 属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ラクトバチルス属 、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、及び ストレプトコッカス属が挙げられる。したがって、本開示は、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、及びストレプトコッカス属からのプロバイオティクス組換え細菌、ならびにバチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、またはストレプトコッカス属のプロバイオティクス細菌に接合性細菌ベクターまたはシステムを導入することによってかかるプロバイオティクス細菌を作製するためのプロセスを提供する。ヒト対象に対してプロバイオティクスとみなされる細菌種としては、これらに限定されるものではないが、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（例、ＧＢＩ−３０または６０８６株）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）ラクチス亜種（ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）（例、ＢＢ−１２株）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）インファンティス亜種（ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）（例、ＬＡＢ１８ｓ株）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例、Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（例、ＮＣＦＭ株）、ラクトバチルス・ビフィダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（例、Ｌａｉ、ＬＣＩまたはＮＣＣ５３３株）、ラクトバチルス・パラカゼイＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ （例、Ｓｔｌ １またはＮＣＣ２４６１株）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（例、２９９ｖ株）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ （例、ＡＴＣＣ５５７３０、ＳＤ２１１２、プロテクティス、ＤＳＭ１７９３８、プロデンティス、ＤＳＭ１７９３８、ＡＴＣＣ５５７３０、ＡＴＣＣＰＴＡ５２８９、ＲＣ−１４株）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（例、ＧＧ、ＧＲ−１）及びラクトコッカス・サーモフィルス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍａｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ） （例、Ｂ７株）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）（例、ＵＬ５株）、及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。したがって、本開示は、ヒト対象に対してプロバイオティクスとみなされる細菌種からのプロバイオティクス組換え細菌、ならびにヒトにおいてプロバイオティクスとみなされる細菌株のプロバイオティクス細菌に接合性細菌ベクターまたはシステムを導入することによってかかるプロバイオティクス細菌を作製するためのプロセスを提供する。特定の実施形態では、プロバイオティクスは、エシェリキア属、例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ に由来する。本開示は、接合性細菌ベクターまたはシステムをプロバイオティクス種である大腸菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７に導入することにより、かかるプロバイオティクス組換え細菌を作製するためのプロセスを提供する。

【0032】

伝達マシナリー
接合性細菌宿主細胞は、遺伝子カーゴ、ＩＶ型分泌システムモジュール、可動化モジュール、及びＩＶ型接着線毛を含む交配ペア安定化モジュールを含み、ＩＶ型接着線毛は、アドヘシンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子カーゴの一部ではないモジュールは、伝達マシナリーとして編成することができる。

【0033】

伝達マシナリーは、接合孔の形成と、その後の遺伝子カーゴのレシピエント細菌への物理的伝達を可能にする役割を有する。伝達マシナリーには、以下でさらに説明する異なるモジュールに分割された遺伝子及び調節エレメントが含まれる。これらのモジュール内に存在する遺伝子は、場合により、１つ以上のオペロンの形で編成することができる。

【0034】

本明細書で使用するところの「遺伝子」なる用語は、タンパク質または非コーディングＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の発現に必要な配列情報を含む核酸分子を指す。遺伝子がタンパク質をコードする場合、遺伝子は、プロモーター及び構造遺伝子のオープンリーディングフレーム配列（ＯＲＦ）、ならびにタンパク質の発現に関与する他の配列を含む。遺伝子が非コーディングＲＮＡをコードする場合、遺伝子は、プロモーター、及び非翻訳ＲＮＡをコードする核酸を含む。上記に示したように、遺伝子は、１つ以上のオペロンの形で発現され得る。本明細書で使用するところの「オペロン」なる用語は、当該技術分野では周知であるように、単一のプロモーターの制御下にある遺伝子のクラスターを含む機能単位である。

【0035】

調節エレメントなる用語は、プロモーター、アクチベーター／リプレッサー結合部位、ターミネーター、エンハンサーなどを指す。一実施形態では、複数のプロモーターが、本開示の細菌接合送達システムに含まれる。一実施形態では、１個のみのプロモーターが、本開示の接合送達システムに含まれる。

【0036】

プロモーターが存在する場合、構成的または誘導性であり得る。「構成的」及び「誘導性」なる用語は、動的な発現の状態を指す。構成的発現は経時的に安定しているのに対して、誘導性発現は遺伝子の発現レベルの有意な変化を可能とする。誘導性発現は、転写活性化因子による転写の活性化、転写抑制因子による転写の抑制、または一般的にリボスイッチと呼ばれる機能性の５ ’非翻訳領域による翻訳の制御などのさまざまな形で実現することができる。

【0037】

一実施形態では、伝達マシナリーは、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）モジュール、交配ペア安定化モジュール、及び可動化モジュールを含む。いくつかの実施形態では、伝達マシナリーは、任意選択的に、輸送モジュール、調節モジュール、栄養複製モジュール、維持モジュール、選択モジュール、及び／または排斥モジュールを含むことができる。

【0038】

Ｔ４ＳＳモジュールには、ＩＶ型分泌系の形成に関与する遺伝子及び調節エレメントが含まれる。Ｔ４ＳＳは、ドナー細菌とレシピエント細菌との間に通路を形成する接合孔を確立することができるタンパク質アセンブリである。この接合孔を通じて遺伝子カーゴがドナー細菌からレシピエント細菌に伝達される。いくつかの実施形態において、Ｔ４ＳＳモジュール（接合性細菌細胞に対して異種であり得る）は、接合性細菌細胞のゲノムに組み込まれる。別の実施形態において、Ｔ４ＳＳモジュールは、接合性細菌細胞に対して内因性または異種であり得る１つ以上の染色体外ベクター（プラスミドなど）内に位置する。Ｔ４ＳＳモジュール内に存在する遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ｖｉｒＢ１（ＴＰ１１４−０１２：ｔｒａＢ）、ｖｉｒＢ２（ＴＰ１１４−０１３：ｔｒａＣ）、ｖｉｒＢ３（ＴＰ１１４−０１４：ｔｒａＤ）、ｖｉｒＢ４（ＴＰ１１４−０１５：ｔｒａＥ）、ｖｉｒＢ５（ＴＰ１１４−００４：ｔｒｂＪ）、ｖｉｒＢ６（ＴＰ１１４−００３：ｔｒａＡ）、ｖｉｒＢ７（ＴＰ１１４−０１１：ｙｇｅＡ）、ｖｉｒＢ８（ＴＰ１１４−０１７：ｔｒａＧ）、ｖｉｒＢ９（ＴＰ１１４−０１８：ｔｒａＨ）、ｖｉｒＢ１０（ＴＰ１１４−０１９：ｔｒａＩ）、ｖｉｒＢ１１（ＴＰ１１４−０２０：ｔｒａＪ）及び／またはｖｉｒＤ４（ＴＰ１１４−０２１：ｔｒａＫ）のうちの１つ以上が挙げられる。したがって、Ｔ４ＳＳモジュールは、Ｔ４ＳＳの１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むことができる。さらに、１つ以上のＴ４ＳＳ接合孔、ならびに１つ以上の異なるタイプのＴ４ＳＳが、Ｔ４ＳＳモジュールによってコードされ、ドナー細菌によって発現され得る。一実施形態では、Ｔ４ＳＳをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドの以下のファミリー、すなわちＭＰＦ_T、ＭＰＦ_F、ＭＰＦ_I、ＭＰＦ_FATA、ＭＰＦ_B、ＭＰＦ_FA、ＭＰＦ_G、及び／またはＭＰＦ_Cのうちの１つ以上に由来することができる。別の実施形態では、Ｔ４ＳＳをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＭＰＦ_Tファミリーの１つに由来することができる。例えば、Ｔ４ＳＳをコードする遺伝子は、細菌プラスミドＴＰ１１４に由来するものであってよい。別の例では、Ｔ４ＳＳをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドＲ６Ｋに由来するものであってよい。さらに別の実施形態では、Ｔ４ＳＳをコードする遺伝子は、接合プラスミドのＭＰＦ_Fファミリーの１つに由来するものであってよい。さらに別の実施形態では、Ｔ４ＳＳをコードする遺伝子は、細菌ベクターＦ（またはｐＯＸ３８）に由来するものであってよい。

【0039】

伝達マシナリーには、交配ペア安定化モジュールも含まれる。交配ペア安定化モジュールは、ドナー細菌と標的細菌との物理的相互作用の安定化に関与する遺伝子及び調節エレメントを含む。以下の実施例ＩＩに示されるように、ドナー細菌と標的細菌との間の相互作用を安定化させることは、Ｔ４ＳＳ接合孔の確立に必要な物理的近接性の維持に有利であり、これは、不安定な環境（例えば、インビボまたは液体）中の遺伝子カーゴのその後の伝達にとって重要である。ドナー細菌と標的細菌との間の相互作用の安定化は、揺動が接合細菌細胞から標的細菌への伝達に影響を与え得るインビボ （例えば、胃腸環境または膀胱）において特に重要である。交配ペア安定化モジュール（接合性細菌細胞と異種であり得る）は、接合性細菌細胞のゲノムに組み込まれるか、または１つ以上の細菌ベクター上に配置され得る。

【0040】

交配ペア安定化モジュールには、ＩＶ型接着線毛の形成に関与する遺伝子及び調節エレメントが含まれる。交配ペア安定化モジュール（接合性細菌細胞と異種であり得る）は、接合性細菌細胞のゲノムに組み込まれるか、または１つ以上の細菌ベクター上に配置することができる。本明細書で使用するところのＩＶ型接着線毛とは、細菌細胞から突出し、細菌細胞内に引っ込む細長いフィラメントを形成するタンパク質アセンブリである。ドナー細菌の膜上のＩＶ型接着線毛の存在は、標的細菌を物理的に「つかみ」「引っ張る」ことによって標的細菌の「捕捉」を容易にするものと考えられている。したがって、ドナー細菌の膜上のＩＶ型接着線毛の存在は、ドナー細菌と標的細菌との相互作用を安定化させる。ＩＶ型接着線毛遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ｐｉｌＬ（ＴＰ１１４−００９）、ｐｉｌＮ（ＴＰ１１４−０２２）、ｐｉｌＯ（ＴＰ１１４−０２３）、ｐｉｌＰ（ＴＰ１１４−０２４）、ｐｉｌＱ（ＴＰ１１４−０２５）、ｐｉｌＲ（ＴＰ１１４−０２６）、ｐｉｌＳ（ＴＰ１１４−０２７）、ｐｉｌＴ（ＴＰ１１４−０２８）、ｔｒａＮ、ｔｒａＢ（ＴＰ１１４−０１２）、ｐｉｌＵ（ＴＰ１１４−０２９）及び／またはｐｉｌＶ（ＴＰ１１４−０３０）のうちの１つ以上のものが挙げられる。したがって、交配ペア安定化モジュールは、ＩＶ型接着線毛の１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むことができる。さらに、１つ以上のＩＶ型接着線毛、ならびに１つ以上の異なるタイプのＩＶ型接着線毛は、交配ペア安定化モジュールによってコードされ、ドナー細菌によって発現させることができる。一実施形態では、ＩＶ型接着線毛をコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドの以下のファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、Ｉｎｃ１８のうちの１つに由来し得る。別の実施形態において、ＩＶ型接着線毛をコードする遺伝子は、Ｉ複合体：ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩу、ＩｎｃＢ／Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＫ及び／またはＩｎｃＺに属することができる細菌接合プラスミドの不和合性ファミリーのうちの１つに由来し得る別の実施形態では、ＩＶ型接着線毛をコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩ２ファミリーの１つに由来し得る。例えば、ＩＶ型接着線毛をコードする遺伝子は、細菌ベクターＴＰ１１４に由来し得る。

【0041】

ＩＶ型接着線毛はアドヘシンを含む。アドヘシンは、ドナー細菌膜の表面に提示される場合、標的細菌の外膜上に存在するさまざまな分子（例えば、タンパク質、糖、脂質）と相互作用することができるタンパク質である。例えば、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩ２ファミリーのＰｉｌＶアドヘシンは、グラム陰性菌の外膜に一般的に見られる分子であるリポ多糖（ＬＰＳ）などの受容体と相互作用する。したがって、ドナー細菌がその外膜にＰｉｌＶアドヘシンを提示する場合、ＰｉｌＶはグラム陰性標的細菌のＬＰＳに結合して２つの細胞の相互作用を安定化させる。アドヘシンとしては、これらに限定されるものではないが、ＴＰ１１４由来のｐｉｌＶ（ＴＰ１１４−０３０）、Ｒ６４由来のｐｉｌＶ、ｐＯＸ３８由来のＴＲＡＮのうちの１つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態において、１つ以上のアドヘシン、ならびに１つ以上の異なるタイプのアドヘシンは、交配ペア安定化モジュールによってコードされ、ドナー細菌によって発現させることができる。一実施形態では、アドヘシンは、アクセサリー線毛タンパク質アセンブリ（例えば、ＩＶ型接着線毛など）の一部として、及び／またはＴ４ＳＳ接合線毛タンパク質アセンブリの一部として、及び／または／またはアドヘシンが細菌の表面に表示されることを可能にする分子複合体の一部としてのいずれかによって、ドナー細菌の表面に提示され得る。別の実施形態において、アドヘシンをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドの以下のファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、Ｉｎｃ１８のうちの１つに由来し得る。別の実施形態では、ＩＶ型接着線毛をコードする遺伝子は、Ｉ複合体に属することができる細菌接合プラスミドの不和合性ファミリー：ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩу、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＫ及び／またはＩｎｃＺのうちの１つに由来し得る。さらに別の実施形態では、アドヘシンをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩ２ファミリーの１つに由来することができる。例えば、アドヘシンをコードする遺伝子は、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。さらに別の実施形態では、アドヘシンをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＦＩＩファミリーの１つに由来することができる。例えば、アドヘシンをコードする遺伝子は、細菌ベクターｐＯＸ３８に由来することができる。さらに別の実施形態では、アドヘシンをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＸファミリーの１つに由来することができる。例えば、アドヘシンをコードする遺伝子は、細菌ベクターｐＲ６Ｋに由来することができる。

【0042】

アドヘシン遺伝子は、必要に応じて、シャフロンの存在及びシャフラーゼの活性によって再編成することができる。シャフロンは、アドヘシン遺伝子の３ ’末端に位置し得る複数のＤＮＡ逆位セグメントのクラスターである。リコンビナーゼ活性を有する酵素であるシャフラーゼの作用下で、シャフロンの異なるセグメントの順序をランダムに再編成することができる。この再編成の後、アドヘシン遺伝子と整列する１個のセグメントがアドヘシン遺伝子の終わりになる。したがって、アドヘシン遺伝子がシャフロンに関連付けられている場合、遺伝子の遠位部分は可変であり、シャフロンに含まれる異なるＤＮＡ逆位セグメントのいずれかとなり得る。その結果、シャフロンをともなうアドヘシン遺伝子が転写及び翻訳される場合、アドヘシンのＣ末端も可変であり、アドヘシン遺伝子を終了するシャフロンの逆位セグメントに対応する。各シャフロンのセグメントは、アドヘシンタンパク質に対する特異的な結合親和性を与える。例えば、接合プラスミドのＩｎｃＩ２ファミリーのｐｉｌＶアドヘシン遺伝子に隣接するシャフロンの場合、各シャフロンのセグメントは、特定の受容体に対するＰｉｌＶアドヘシンの結合親和性を付与する。したがって、シャフロンセグメントがアドヘシン遺伝子とアラインされる場合、シャフロンセグメントは、対応するアドヘシンタンパク質の結合親和性を調節する。したがって、ドナー細菌がアドヘシンを提示する場合、シャフロンを用いてドナー細菌と標的細菌との間の相互作用の安定性に影響を与えることができる。シャフロンは、これらに限定されるものではないが、以下のＤＮＡ配列、すなわち、シャフラーゼ認識部位５’−ＧＴＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＴＮＮＮＴＧＧ−３’（配列番号１４０、略語 ｓｒｓ）を含み、これは再編成される代替ＯＲＦ（ａｌｔＯＲＦ）である。したがって、交配ペア安定化モジュール内に存在する１つ以上のアドヘシンタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子は、シャフロンを有することができる。一実施形態では、シャフロンのＤＮＡ配列は、細菌接合プラスミドの以下のファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、Ｉｎｃ１８のうちの１つに由来し得る。別の実施形態において、シャフロンのＤＮＡ配列は、Ｉ複合体に属する細菌接合プラスミドの不和合性ファミリー：ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩу、ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＫ及び／またはＩｎｃＺのうちの１つに由来し得る。別の実施形態では、シャフロンのＤＮＡ配列は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩファミリーの１つに由来することができる。さらに別の実施形態では、シャフロンのＤＮＡ配列は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩ２ファミリーの１つに由来することができる。さらに別の実施形態では、シャフロンのＤＮＡ配列は、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。

【0043】

アドヘシンをコードする遺伝子がシャフロンを含む場合、交配ペア安定化モジュールは、シャフラーゼをコードする１つ以上の遺伝子を含む。シャフラーゼは、シャフロンのＤＮＡ逆位セグメントを再編成することが可能なリコンビナーゼであり、上記のように、アドヘシンタンパク質の結合活性及び特異性に影響し得る。シャフラーゼには、これらに限定されるものではないが、１つ以上のｒｃｉ （ＴＰ１１４−０３１）が含まれる。したがって、交配ペア安定化モジュールは、１つ以上のシャフラーゼタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むことができる。さらに、１つ以上のシャフラーゼ、ならびに１つ以上の異なるタイプのシャフラーゼは、交配ペア安定化モジュールによってコードされ、ドナー細菌によって発現され得る。一実施形態では、シャフラーゼをコードする遺伝子は、以下の細菌接合プラスミドのファミリー、すなわちＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ （Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、Ｉｎｃ１８のうちの１つに由来し得る。別の実施形態において、シャフロン及び／またはシャフラーゼは、Ｉ複合体に属する細菌接合プラスミドの不和合性ファミリー：ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＩу、ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＫ及び／またはＩｎｃＺのうちの１つに由来し得る。別の実施形態では、シャフラーゼをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩファミリーの１つに由来することができる。さらに別の実施形態では、シャフラーゼをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩ２ファミリーの１つに由来することができる。例えば、シャフラーゼをコードする遺伝子は、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。

【0044】

可動化モジュールは、リラクソソーム、例えば、ペイロードモジュールに機能的に関連付けられ、その後、接合孔を通じてレシピエント細菌に遺伝子カーゴを伝達する輸送モジュール（伝達起点（ｏｒｉＴ））を認識することが可能なタンパク質複合体をコードする。可動化モジュール（接合性細菌細胞と異種であってもよい）は、接合性細菌細胞の染色体に組み込まれるか、または１つ以上の細菌ベクター上に配置され得る。可動化モジュールには、これらに限定されるものではないが、ｖｉｒＣ１ （ＴＰ１１４−６８： ｐａｒＡ）、（ＴＰ１１４−４１： ｎｉｋＢ）、及び／または（ＴＰ１１４−４２： ｎｉｋＡ）のうちの１つ以上が含まれる。可動化モジュールは、以下の接合ファミリー、すなわち、ＭＯＢ_F、ＭＯＢ_P、ＭＯＢ_V、ＭＯＢ_H、ＭＯＢ_C及び／またはＭＯＢ_Qのうちの少なくとも１つに由来することができる。別の実施形態では、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＭＯＢ _Pファミリーの１つに由来することができる。例えば、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。さらに別の例では、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌ベクターＲ６Ｋに由来することができる。別の実施形態では、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＭＯＢ_Fファミリーの１つに由来することができる。例えば、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌ベクターｐＯＸ３８に由来することができる。

【0045】

輸送モジュールは、遺伝子カーゴの構成要素であり、遺伝子カーゴは、遺伝子カーゴ及び伝達マシナリーのエレメントがシス編成にある場合には伝達マシナリーにも存在しうる。トランスポートモジュールには、遺伝子カーゴのレシピエント細菌への伝達起点（ｏｒｉＴ）として機能する１つ以上の機能的ＤＮＡエレメントが含まれる。輸送モジュールは、接合性細菌細胞に対して異種であり得る。輸送モジュールは シス作用性であり、したがって、遺伝子カーゴを構成する遺伝子構成要素（染色体または染色体外ベクター）にみられる。上記に示したように、輸送モジュールは可動化モジュールの作用を受ける。本開示との関連で使用される場合、「可動化」なる用語は、接合プラスミドが、ドナー細菌からレシピエント細菌への、伝達起点（ｏｒｉＴ）を含むＤＮＡ分子の伝達を行うプロセスを指す。「伝達起点」（略語ｏｒｉＴ）なる用語は、ＤＮＡ分子内に存在する場合、対応する可動化タンパク質によって認識され、その可動化を可能とするＤＮＡ配列を指す。

【0046】

調節モジュールは、輸送マシナリー内に存在する場合、遺伝子の発現を調節することができるか、または遺伝子の発現を調節するために用いられ得る１つ以上のタンパク質または非コーディングＲＮＡをコードする１つ以上の遺伝子及び調節エレメント（例えば、アクチベーター、リプレッサー、リボスイッチ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ、ｔａＲＮＡ）を含むことができる。調節モジュール（接合性細菌細胞に対して異種であり得る）は、接合性細菌細胞のゲノムに組み込まれるか、または１つ以上の細菌ベクター上に位置することができる。一実施形態では、調節遺伝子及び調節エレメントは、伝達マシナリーまたは接合送達システムのモジュールとは異なる核酸分子上にあってもよい。別の実施形態において、調節遺伝子及び調節エレメントは、これらに限定されるものではないが、他のモジュールと同じプラスミド、別のプラスミド、細菌染色体、ファージ、真核生物染色体、古細菌などの異なる供給源から単離することができる。さらに別の実施形態において、調節遺伝子及び調節エレメントは、天然に存在する遺伝子から操作または発展されたものであってよい。調節モジュールによってコードされる調節タンパク質または非コーディングＲＮＡを使用することで、送達システムをホストする細菌の染色体上に位置する遺伝子を誘導または抑制するだけでなく、伝達マシナリーまたは遺伝子カーゴのモジュールのいずれかに位置する遺伝子を誘導または抑制することができる。一実施形態では、調節モジュールは、これらに限定されるものではないが、ｙａｊＡ（ＴＰ１１４−０５８）、ｙａｆＡ（ＴＰ１１４−０６９）、ｙａｅＣ（ＴＰ１１４−０７０）、ｙｈｅＣ（ＴＰ１１４−０８５），ｆｕｒ、ｆｎｒ、ｋｏｒＡ、ａｃａＣＤ、ａｃｒ１、ａｃｒ２、ｓｔｂＡ、ｔｗｒＡ、ＲｅｓＰ、ｋｆｒＡ、ａｒｄＫ、Ｃａｓ９、ｃｒＲＮＡ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ｔａＲＮＡ、トーホールドスイッチ、ａｒａＣ、ｔｅｔＲ、ｌａｃＩ及び／またはｌａｃＩｑなどの１つ以上の調節タンパク質または非コーディングＲＮＡをコードする１つ以上の遺伝子を含む。

【0047】

伝達マシナリーが染色体外ベクターに（全体的または部分的に）位置している場合、染色体外ベクターには栄養複製モジュールが含まれる。伝達マシナリーの栄養複製モジュールは、遺伝子カーゴの栄養複製モジュールと同じでも異なっていてもよい。細菌宿主のゲノムと独立して複製する１つ以上のベクター上に伝達マシナリーが位置している場合には、栄養複製モジュールが必要である。その場合、伝達マシナリーを含む１つ以上の染色体外ベクターは、細菌宿主内で複製及び維持されるために栄養複製モジュールを必要とする。栄養複製モジュールは、栄養複製の起点（ｏｒｉＶ）として機能する１つ以上の機能的ＤＮＡ要素を含む。ｏｒｉＶは、遺伝子エレメント上に存在するＤＮＡ配列であり、維持モジュールによってコードされた複製マシナリーによって認識されると、細菌宿主内でのプラスミドの複製を可能とする。多目的な用途のため、また、広範囲の細菌宿主におけるベクターの維持のためには、栄養複製モジュールのｏｒｉＶ は、広い宿主範囲のｏｒｉＶ （すなわち、広範囲の細菌宿主種によって認識されるｏｒｉＶ）とすることができる。ベクターの維持を限られた範囲の細菌宿主に制限する必要があるいくつかの実施形態では、制限された、または狭い宿主範囲のｏｒｉＶ（すなわち、限られた範囲の細菌宿主種によって認識されるｏｒｉＶ）を使用することが好ましい場合がある。

【0048】

伝達マシナリーが染色体外ベクター上に（全体的または部分的に）位置する場合、接合性細菌宿主細胞は、維持モジュール（いくつかの実施形態では、伝達マシナリーの一部と見なすことができる）を含む。維持モジュールは、栄養複製モジュールのｏｒｉＶを認識することができるタンパク質（複製マシナリーと呼ばれる）を含み、栄養複製モジュールを含む染色体外ベクター（例えば、プラスミド）の複製を可能とする。維持モジュールは、栄養複製モジュールのｏｒｉＶを認識できるタンパク質を含み、栄養複製モジュールを含むプラスミドの複製を可能とする。維持モジュールは、接合細菌細胞に対して異種であってもよい。ベクターの維持をドナー細菌に限定する必要がある場合、維持モジュールをドナー細菌染色体に配置する（例えば、組み込む）ことが好ましい場合がある。あるいは、維持モジュールは、１つ以上の染色体外ベクター上に配置してもよい。維持モジュールはまた、適当なＤＮＡ分配に関与する１つ以上の遺伝子及び調節エレメントを含むことができる。分配に関与する遺伝子には、プラスミドコピーの娘細胞への均等な分離に関与するタンパク質、毒素及び抗毒素安定化システム、及び／またはプラスミドの複製において複製マシナリーを助けるヘリカーゼ及びＤＮＡプライマーゼが含まれる。維持モジュールのタンパク質としては、これらに限定されるものではないが、ｒｅｐＡ（ＴＰ１１４−０８３：ｒｅｐＡ）、ＴＰ１１４−０８２、ｐａｒＡ（ＴＰ１１４−０６８：ｐａｒＡ）、ｐａｒＢ、ＤＮＡｐｒｉｍａｓｅ（ＴＰ１１４−００６：ｙｇｉＡ）としてしばしばアノテーション付けされるタンパク質、毒素（例えば、ｐＶＣＲ９４のｖｃｒｘ０２８、ＴＰ１１４のＴＰ１１４−０５１：ｙｃｆＡ）、抗毒素（例えば、ｐＶＣＲ９４のｖｃｒｘ０２７、ＴＰ１１４のＴＰ１１４−０５０：ｙｃｆＢ）、ＤＮＡトポイソメラーゼ（ＴＰ１１４−０３５：ｙｄｉＡ及びＴＰ１１４−０３６：ｙｄｇＡ）が挙げられる。したがって、維持モジュールは、複製マシナリーの１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含み、また、ＤＮＡ分配タンパク質をコードする０個以上の遺伝子及び調節エレメントも含むことができる。さらに、１つ以上の複製マシナリー、ならびに１つ以上の異なるタイプの複製マシナリーが、維持モジュール内に存在してもよい。一実施形態では、維持モジュール及び／または栄養複製モジュールは、以下の細菌ベクターのファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ／Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２ 、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ ／ Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１ 、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、及び／またはＩｎｃ１８の１つに由来することができる。一実施形態では、維持モジュール及び／または栄養複製モジュールは、細菌ベクターのＩｎｃＩ２ファミリーの１つに由来することができる。例えば、維持モジュール及び／または栄養複製モジュールは、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。

【0049】

伝達マシナリーはまた、１つ以上の選択モジュールを含むことができる。選択モジュールは、伝達マシナリーの１つ以上のモジュールを有する細菌を同定するための選択可能な形質を付与する１つ以上の遺伝子を含む。選択モジュールは、１つ以上の細菌ベクター及び／または伝達マシナリーの組み込まれたモジュールと機能的に接続されている。伝達マシナリーの選択モジュールは、遺伝子カーゴの選択モジュールと同じでも異なっていてもよい。選択可能な形質は、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質を含む）をコードする遺伝子、栄養要求性選択マーカー、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（例えば、細菌のｌａｃＺ遺伝子）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（例えば、細菌のｃａｔ遺伝子）、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子とすることができる。

【0050】

排斥モジュールは、伝達マシナリーに存在する場合、排斥タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含む。排斥モジュール（接合性細菌細胞に対して内因性または異種であってよい）は、細菌の染色体または１つ以上の染色体外ベクターに位置することができる。排斥タンパク質は、細菌を接合プラスミドに対して耐性とすることにより、遺伝物質の水平伝播を制限する。例えば、特定の細菌接合プラスミド（例えば、Ｒ６４）に対する排斥タンパク質（例えば、ｅｘｃＡＢ）を発現する細菌は、このプラスミドを接合を受け取ることができなくなる。この現象を利用して、接合性細菌細胞間の無効な接合性伝達を回避することができる。例えば、接合性細菌細胞細菌が、遺伝子カーゴを伝播させるために用いられる、それら自身の伝達マシナリーに対する排斥タンパク質を発現するように設計されている場合、接合性細菌細胞細菌間の伝達はもはや起こり得ない（または著しく低い速度で起きる）。排斥タンパク質には、ＴＰ１１４からのＴＰ１１４−０５、プラスミドＲ６４からのｅｘｃＡ及びｅｘｃＢ 、ＲＰ４ からのｔｒｂＫ、プラスミドＦからのｔｒａＳ及びｔｒａＴ（ｐＯＸ３８）のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。したがって、排斥モジュールは、１つ以上の排斥タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むことができる。一実施形態では、排斥タンパク質をコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドの以下のファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２ 、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ ／ Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ＩｎｃＰ−２ 、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、Ｉｎｃ１８の１つに由来することができる。別の実施形態において、排斥タンパク質をコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＩｎｃＩ２ファミリーの１つに由来することができる。例えば、排斥タンパク質をコードする遺伝子は、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。

【0051】

遺伝子カーゴ
遺伝子カーゴは、接合細菌細胞ドナー細菌によって、伝達マシナリーを介して標的細菌に送達されることを意図している。遺伝子カーゴには、以下でさらに説明する異なるモジュールに分割された遺伝子及び調節エレメントが含まれる。これらのモジュール内に存在する遺伝子は、場合により、１つ以上のオペロンの形で編成することができる。

【0052】

遺伝子カーゴは、輸送モジュールに機能的に関連付けられたペイロードモジュールを含む。輸送モジュールは、ペイロードモジュールと「機能的に関連付けられ」、これにより、可動化モジュールによってコード化されたタンパク質が輸送モジュールに作用する際にペイロードモジュールの伝達が可能になる。輸送モジュールをペイロードモジュールと機能的に関連付けるために、ペイロードモジュールまたは輸送モジュールの少なくとも一方が接合性細菌宿主細胞に遺伝的に導入されていることから、遺伝子カーゴは接合性細菌宿主細胞に対して異種である。遺伝子カーゴは、場合により、選択モジュール、栄養複製モジュール、及び／または可動化モジュールを含んでもよい。

【0053】

ペイロードモジュールは、これらに限定されるものではないが、遺伝子、調節エレメント、非コーディングＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡなど）、トランスポゾン、ゲノム（例えば、ファージ、または細菌）を含むことができる。特定の実施形態では、ペイロードモジュールは、レシピエント細胞によって認識され、作用され得るガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び／またはＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする。ペイロードモジュールは、１つ以上のタンパク質、及び／または１つ以上の非コーディング遺伝子エレメント（例えば、ＲＮＡなど）をコードすることができる。ペイロードモジュールはまた、１つ以上の遺伝子、及び／または調節エレメント、及び／または非コーディングＲＮＡ、及び／またはトランスポゾン、及び／またはゲノムの組み合わせであってもよい。

【0054】

特定の実施形態において、ペイロードモジュールは、レシピエント細菌内で発現されることを意図した１つ以上の異種タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする１つ以上の異種遺伝子を含む。本開示との関連で、レシピエント細菌内での異種遺伝子（複数可）の発現は、レシピエント細菌にとって有益、中性、または有害であり得る。異種遺伝子は、その発現がレシピエント細菌に生物学的利点をもたらす場合、レシピエント細菌内で有益に発現されたとみなされる。有益に発現される異種遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ｌａｃＺ、ｌａｃＹ、ｌａｃＡ、ｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、ｇａｄＤ、ｇａｄＴ、ｇａｄＰ、ｓｃｒＡ、ｓｃｒＢ、ｍｅｒＡ、ＡＮ−ＰＥＰが挙げられる。異種遺伝子は、その発現が生物学的利点をもたらさず、レシピエント細菌に生物学的欠点ももたらさない場合、レシピエント細菌内で中性に発現されたとみなされる。中性に発現される異種遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、レシピエント細菌を有する対象に対して治療効果を示すタンパク質（例えば、真核生物成長因子、ホルモン（例えば、グルカゴン様ペプチド−１すなわちＧＬＰ−１、インシュリンなど）、インターロイキンを含むサイトカイン（例えば、インターロイキン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７）、及び／またはケモカイン（例えば、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカイン）などの治療タンパク質）が挙げられる。異種遺伝子は、その発現がレシピエント細菌に生物学的不利益をもたらす場合（例えば、細胞増殖の低下、抗生物質に対する感受性の増加、及び／または致死率の増加）、レシピエント細菌内で有害に発現されたとみなされる。有害に発現される異種遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ヌクレアーゼ（例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ（クラスター形成する、規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）関連ＤＮＡ結合（Ｃａｓ）タンパク質及びその類似体、エンドヌクレアーゼ制限酵素（例えば、ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＤｐｎＩ、ＥｃｏＲ１、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＸｈｏＩ）、及びレシピエント細菌に対して毒性を有する毒素またはタンパク質（例えば、リシン、Ｖｃｒｘ０２８、ＭａｚＦ、ＨｉｃＢ、ＫｉｋＡ、ＣｃｄＢ、マイクロシン）が挙げられる。

【0055】

特定の実施形態では、ペイロードモジュールによってコードされる異種タンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質類似体である。本開示との関連で使用される場合、Ｃａｓタンパク質または関連する類似体とは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がＤＮＡ分子上に局在する特定の位置でＤＮＡ分子の二本鎖切断（平滑または付着末端）を媒介することができるエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼであってよい。本開示との関連において、「Ｃａｓタンパク質類似体」とは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がＤＮＡ分子上に局在する特定の位置でＤＮＡ分子の二本鎖切断（平滑または付着末端）を媒介することができる、またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がＤＮＡ分子上に局在する特定の位置でＤＮＡまたはＲＮＡ分子の一本鎖切断を媒介することができる、Ｃａｓタンパク質の変異体、またはＣａｓタンパク質の断片のことを指す。

【0056】

Ｃａｓタンパク質変異体は、天然のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列と比較した場合に少なくとも１個のアミノ酸の相違を含む。本明細書で使用するところの変異体とは、Ｃａｓタンパク質類似体の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更された配列がＣａｓタンパク質に関連する生物学的機能を防止または破壊する場合にタンパク質に悪影響を与えると言われる。例えば、タンパク質の全体的な電荷、構造、または疎水性−親水性は、生物学的活性に悪影響を与えることなく変更することができる。したがって、アミノ酸配列を、例えば、Ｃａｓタンパク質の生物学的活性に悪影響を与えることなく、ペプチドをより疎水性または親水性にするために変更することができる。Ｃａｓタンパク質変異体は、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一率を有する。当該技術分野では周知の「同一性（％）」なる用語は、配列同士を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係性である。同一性のレベルは、既知のコンピュータプログラムを使用して従来通りに決定することができる。同一性は、これらに限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ （Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ （１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ （Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ （１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）；及び、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含む周知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最良の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムにコード化されている。配列アラインメント及び同一性（％）の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して行うことができる。本明細書に開示される配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０， ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で使用して行った。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアライメントのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ １，ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３，ＷＩＮＤＯＷ＝５，及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であった。

【0057】

本明細書に記載される変異体Ｃａｓタンパク質は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されたものであり、かかる置換アミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされたものでもそうでなくともよい、（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの、または（ｉｉｉ）成熟タンパク質が別の化合物、例えば、タンパク質の半減期を延長する化合物と融合されているもの、または（ｉｖ）ポリペプチドの精製のためにさらなるアミノ酸が成熟タンパク質に融合されているものであってよい。Ｃａｓタンパク質の「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であってよい。

【0058】

Ｃａｓタンパク質類似体は、既知／天然のＣａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質の「フラグメント」（ベーキング酵素「フラグメント」を含む）は、Ｃａｓタンパク質の少なくとも１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、またはそれ以上の連続したアミノ酸を有する。フラグメントは、既知の／天然のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１個少ないアミノ酸残基を含み、なお完全長Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質のフラグメントは、ペプチド合成によって対応する完全長のＣａｓタンパク質を生成するために使用することができる。したがって、フラグメントは、完全長タンパク質を生成するための中間体として使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質フラグメントは、本明細書に記載のＣａｓタンパク質と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有することができる。

【0059】

一実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であり、切断部位での平滑末端の形成を可能とする。一実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（化膿レンサ球菌）に由来することができる。Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分と共働して作用し、二本鎖ＤＮＡを特異的に切断する。ｃｒＲＮＡ部分は、二本鎖ＤＮＡ（例えば、レシピエント細菌に存在する）の核酸配列に特異的であってよく、そのような核酸配列及びＣａｓ９タンパク質の存在下で核酸配列と二重鎖を形成して二重鎖領域にＣａｓ９のエンドヌクレアーゼ活性を特異的に誘導する。ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓ９タンパク質と特異的に結合してｃｒＲＮＡとの密接な会合を可能とする。Ｃａｓ９タンパク質が異種タンパク質である実施形態では、ペイロードモジュールはまた、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡをコードする遺伝子も含むことができる。Ｃａｓ９タンパク質が異種タンパク質である別の実施形態では、ペイロードモジュール核酸分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする遺伝子を含むことができる。ｇＲＮＡは、同じ遺伝子転写産物上に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方を含む。

【0060】

別の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣｐｆ１タンパク質であり、切断部位に粘着末端の形成を可能とする。一実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、フランシセラ・ ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来することができる。Ｃａｓ９タンパク質と異なり、Ｃｐｆ１タンパク質は、二本鎖ＤＮＡの特異的切断を媒介するうえでｃｒＲＮＡの存在のみを必要とする。したがって、Ｃｐｆ１タンパク質がＣａｓタンパク質として使用される実施形態では、ペイロードモジュールは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む必要はない。

【0061】

本開示は、ペイロードモジュール上に見出されるｃｒＲＮＡがＣａｓタンパク質によって認識可能であると規定している。これは、ｃｒＲＮＡが、Ｉ型またはＩＩ型Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼを二本鎖ＤＮＡ分子の特定の位置に誘導するか、またはＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレアーゼをＲＮＡ分子の特定の位置に誘導することができることを意味する。かかる実施形態では、ｃｒＲＮＡがレシピエント細菌ゲノム内の１つ以上の特定の位置（例えば、１つ以上の標的位置）で、またはレシピエント細菌のＲＮＡ分子上の１つ以上の特定の位置で二重鎖を形成することが必要であるため、ｃｒＲＮＡは、レシピエント細菌のゲノム上の、またはレシピエント細菌内に存在するＲＮＡ分子上の１つ以上の標的位置に実質的に相補的でなければならない。本明細書で使用するところの「ゲノム」なる用語には、細菌の染色体及びプラスミドＤＮＡが含まれる。やはり本明細書で使用するところの「実質的に相補的」なる用語は、レシピエント細菌のゲノム内の、またはレシピエント細菌内に存在するＲＮＡ分子内の１つ以上の標的位置と特定の二重鎖を形成することができるような最小レベルの相補性を有するｃｒＲＮＡの配列を指す。

【0062】

一実施形態では、ｃｒＲＮＡは、レシピエント細菌内に単一または複数のコピーで存在する標的配列に実質的に相補的である。そのような実施形態では、レシピエント細菌内への遺伝子カーゴの伝達は、レシピエント細菌内でのｃｒＲＮＡ（レシピエント細菌内で複数の二重鎖を形成する）及びＣａｓタンパク質の発現を可能にし、最終的に標的細菌ゲノム内の複数の二本鎖ＤＮＡ切断の形成につながる。これらの複数の二本鎖ＤＮＡ切断は、最終的にはレシピエント細菌の生存率の低下につながり、レシピエント細菌の死滅につながる可能性が高い。

【0063】

レシピエント細菌の死滅が望ましくない（例えば、レシピエント細菌の集団の死によって引き起こされる炎症反応を避けるため）実施形態では、ｃｒＲＮＡは、レシピエント細菌のゲノム内の単一の位置、例えば、レシピエント細菌の特定の遺伝子に実質的に相補的であり得る。ペイロードモジュールはまた、標的遺伝子座を修復し、ｃｒＲＮＡによるターゲティングからの保護もできる不活性化変異を導入するための鋳型として使用できるＤＮＡ分子も含んでいる必要がある。例えば、ｃｒＲＮＡは、レシピエント細菌内の病原性因子をコードする遺伝子、またはレシピエント細菌内の病原性因子をコードするＲＮＡに実質的に相補的であってよい。そのような実施形態では、ペイロードモジュールの導入は、レシピエント細菌の生存率を変化させることも、レシピエント細菌を保有する対象に有害な影響を生じることもなく、変異が導入された修復鋳型を病原性因子遺伝子に導入することによって病原性因子の不活性化をもたらす。病原性因子は、レシピエント細菌の染色体上またはレシピエント細菌のプラスミド上に位置する可能性がある。

【0064】

レシピエント細菌内の病原性因子は、例えば、抗生物質などの薬剤に対する耐性を付与する遺伝子であり得る。「抗生物質耐性遺伝子」なる用語は、タンパク質をコードするか、または抗生物質耐性を付与する機能的ＲＮＡを転写する遺伝子またはそのコーディング部分を包含する。例えば、抗生物質耐性遺伝子は、（１）抗生物質を分解する酵素、（２）抗生物質を修飾する酵素、（３）抗生物質の排出ポンプなどのポンプ、または（４）抗生物質の作用を抑制する変異された標的に寄与する遺伝子またはそのコーディング部分であり得る。抗生物質耐性形質をコードする遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ａａｄＡ２、ａａｄＡ、ａａｃＣ、ａａｃＡ１、ａｐｈＡ、ｓｔｒＡＢ、ｐｂｐ１Ａ、ｐｂｐ１Ｂ、ｐｂｐ２Ａ、ｐｂｐ２Ｂ、ｄａｃ、ｂｌａ_CMY-2、ｆｌｏＲ、ｃｍｌＡ、ｃａｔ、ｃｍｘ、ｅｒｍＡ、ｍｐｈ２、ｍｅｌ、ｅｒｍ（ｘ）、ｍｅｃＡ、ａａｄＡ１ａ、ｓｕｌ１、ｓｕｌ２、ｔｅｔＡ、ｔｅｔ（Ｗ）、ｂｌａＳＨＶ−１、ｄｈｆｒ、ｖａｎ（Ａ）、ｖａｎ（Ｂ）及びｂｌａ_NDM1が挙げられる。

【0065】

レシピエント細菌の病原性因子は、例えば、毒素をコードする遺伝子であってよい。毒素をコードする遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ｃｃｄＢ、ｒｅｌＥ、ｐａｒＥ、ｄｏｃ、ｖａｐＣ、ｈｉｐＡ、ｓｔｌ、ｅｓｐＡ、ｐａｇ、ｃｔｘＡ、ｃｔｘＢ、ｔｃｐＡ、ｅｘｏＵ、ｅｘｏＳ、ｅｘｏＴ、ＳｇｉＴ、及び ｈｉｐＢが挙げられる。

【0066】

病原性因子は、線毛（ｐｉｌｕｓ）、線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）、鞭毛、またはポンプなどの構造または構成要素である可能性がある。毒性成分をコードする遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ｆｉｍＡ、ｃｓｇＤ、ｔｏｘＴ、ｃｐｓ、ｐｔｋ、ｅｐｓＡ、ｍｉａ、ｓｓｒＢ、ａｃｒＡ、ａｃｒＢ、ｔｏｌＣ 、及び ｃｓｇＡが挙げられる。

【0067】

特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、例えば、大腸菌の病原性因子をコードする遺伝子など、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）に見られる病原性因子をコードする遺伝子、または該遺伝子に由来するＲＮＡ分子に特異的である。大腸菌に見られる病原性因子としては、これらに限定されるものではないが、ＷＯ２０１５／１４８６８０に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態において、病原性因子をコードする遺伝子には、大腸菌の抗生物質耐性遺伝子及び志賀毒素遺伝子（例えば、多剤耐性志賀毒素産生大腸菌）を含む。別の特定の実施形態では、病原性因子をコードする遺伝子として、大腸菌 （例えば、接着性浸潤性大腸菌）の線毛をコードする遺伝子（例えば、１型線毛）をコードする遺伝子が挙げられる。

【0068】

輸送モジュールは、遺伝子カーゴの構成要素であり、遺伝子カーゴのレシピエント細菌への物理的輸送に関与する機能的なＤＮＡ遺伝子座を含む。輸送モジュールは、伝達起点（ｏｒｉＴ）、例えば、ドナー細菌からレシピエント細菌へのベクターの伝達を可能とする核酸配列を含む。輸送モジュールは、接合性細菌細胞に対して異種であってよい。輸送モジュールはシス作用性であり、したがって、遺伝子カーゴを構成する遺伝子構成要素（染色体または染色体外ベクター）上にみられる。上記に示したように、輸送モジュールは可動化モジュールの作用を受ける。本開示との関連で使用される場合、「可動化」なる用語は、接合プラスミドが、ドナー細菌からレシピエント細菌への、伝達起点（ｏｒｉＴ）を含むＤＮＡ分子の伝達を行うプロセスを指す。「伝達起点」（略語ｏｒｉＴ）なる用語は、ＤＮＡ分子内に存在する場合、対応する可動化タンパク質によって認識され、その可動化を可能とするＤＮＡ配列を指す。

【0069】

遺伝子カーゴは、１つ以上の選択モジュールも含むことができる。選択モジュールは、遺伝子カーゴの１つ以上のモジュールを保有する細菌を同定するための選択可能な形質を付与する１つ以上の遺伝子を含む。選択モジュールは、１つ以上の細菌ベクター及び／または遺伝子カーゴの組み込まれたモジュールと機能的に接続される。遺伝子カーゴの選択モジュールは、接合送達システムの選択モジュールと同じでも異なっていてもよい。選択可能な形質は、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質を含む）をコードする遺伝子、栄養要求性選択マーカー、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（例えば、細菌のｌａｃＺ遺伝子）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（例えば、細菌のｃａｔ遺伝子）、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子とすることができる。

【0070】

遺伝子カーゴが染色体外ベクターに（全体的または部分的に）位置している場合、染色体外ベクターは栄養複製モジュールを含む。遺伝子カーゴの栄養複製モジュールは、接合送達システムの栄養複製モジュールと同じでも異なっていてもよい。細菌宿主のゲノムと独立して複製する１つ以上のベクター上に伝達マシナリーが位置している場合には、栄養複製モジュールが必要である。その場合、遺伝子カーゴを含む１つ以上の染色体外ベクターは、細菌宿主内で複製し、また維持されるために栄養複製モジュールを必要とする。栄養複製モジュールは、栄養複製の起点（ｏｒｉＶ）として機能する１つ以上の機能的ＤＮＡ要素を含む。ｏｒｉＶは、遺伝子エレメント上に存在するＤＮＡ配列であり、維持モジュールによってコードされた複製マシナリーによって認識されると、細菌宿主内でのプラスミドの複製を可能とする。多目的な用途のため、また、広範囲の細菌宿主におけるベクターの維持のためには、栄養複製モジュールのｏｒｉＶ は、広い宿主範囲のｏｒｉＶ （すなわち、広範囲の細菌宿主種によって認識されるｏｒｉＶ）とすることができる。ベクターの維持を限られた範囲の細菌宿主に制限する必要があるいくつかの実施形態では、制限された、または狭い宿主範囲のｏｒｉＶ（すなわち、限られた範囲の細菌宿主種によって認識されるｏｒｉＶ）を使用することが好ましい場合がある。

【0071】

遺伝子カーゴが染色体外ベクター上に（全体的または部分的に）位置する場合、接合性細菌宿主細胞は、維持モジュール（いくつかの実施形態では、伝達マシナリーの一部と見なすことができる）を含む。維持モジュールは、栄養複製モジュールのｏｒｉＶを認識することができるタンパク質（複製マシナリーと呼ばれる）を含み、栄養複製モジュールを含む染色体外ベクター（例えば、プラスミド）の複製を可能とする。維持モジュールは、栄養複製モジュールのｏｒｉＶを認識できるタンパク質を含み、栄養複製モジュールを含むプラスミドの複製を可能とする。維持モジュールは、接合細菌細胞に対して異種であってもよい。ベクターの維持をドナー細菌に限定する必要がある場合、維持モジュールをドナー細菌染色体に配置する（例えば、組み込む）ことが好ましい場合がある。あるいは、維持モジュールは、染色体外ベクターの１つ以上に位置してもよい。維持モジュールはまた、適当なＤＮＡ分配に関与する１つ以上の遺伝子及び調節エレメントを含むことができる。分配に関与する遺伝子には、プラスミドコピーの娘細胞への均等な分離に関与するタンパク質、毒素及び抗毒素安定化システム、及び／またはプラスミドの複製において複製マシナリーを助けるヘリカーゼ及びＤＮＡプライマーゼが含まれる。維持モジュールのタンパク質としては、これらに限定されるものではないが、ｒｅｐＡ（ＴＰ１１４−０８３：ｒｅｐＡ）、ＴＰ１１４−０８２、ｐａｒＡ（ＴＰ１１４−０６８：ｐａｒＡ）、ｐａｒＢ、ＤＮＡｐｒｉｍａｓｅ（ＴＰ１１４−００６：ｙｇｉＡ）としてしばしばアノテーション付けされるタンパク質、毒素（例えば、ｐＶＣＲ９４のｖｃｒｘ０２８、ＴＰ１１４のＴＰ１１４−０５１：ｙｃｆＡ）、抗毒素（例えば、ｐＶＣＲ９４のｖｃｒｘ０２７、ＴＰ１１４のＴＰ１１４−０５０：ｙｃｆＢ）、ＤＮＡトポイソメラーゼ（ＴＰ１１４−０３５：ｙｄｉＡ及びＴＰ１１４−０３６：ｙｄｇＡ）が挙げられる。したがって、維持モジュールは、複製マシナリーの１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含み、また、ＤＮＡ分配タンパク質をコードする０個以上の遺伝子及び調節エレメントも含むことができる。さらに、１つ以上のｏｒｉＶ及び複製マシナリー、ならびに１つ以上の異なるタイプのｏｒｉＶ及び複製マシナリーが維持モジュール内に存在してもよい。一実施形態では、維持モジュール及び／または栄養複製モジュールは、以下の細菌ベクターのファミリー、すなわち、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＣ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＥ、ＩｎｃＦ１、ＩｎｃＦ２、ＩｎｃＧ、ＩｎｃＨＩ１、ＩｎｃＨＩ２ 、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＬ ／ Ｍ、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ１、ＩｎｃＱ２、ＩｎｃＲ、ＩｎｃＳ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＸ１、ＩｎｃＸ２、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＺ、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１ 、ＩｎｃＰ−２、ＩｎｃＰ−５、ＩｎｃＰ−７、ＩｎｃＰ−８、ＩｎｃＰ−９、Ｉｎｃ１、Ｉｎｃ４、Ｉｎｃ７、Ｉｎｃ８、Ｉｎｃ９、Ｉｎｃ１１、Ｉｎｃ１３、Ｉｎｃ１４、及び／またはＩｎｃ１８のうちの１つに由来することができる。一実施形態では、維持モジュール及び／または栄養複製モジュールは、細菌ベクターのＩｎｃＩ２ファミリーの１つに由来することができる。例えば、維持モジュール及び／または栄養複製モジュールは、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。

【0072】

可動化モジュールは、リラクソソーム、例えば、遺伝子カーゴに機能的に関連付けられ、その後、接合孔を通じてレシピエント細菌に遺伝子カーゴを伝達する輸送モジュール（伝達起点（ｏｒｉＴ））を認識することが可能なタンパク質複合体をコードする。可動化モジュール（接合性細菌細胞と異種であってもよい）は、接合性細菌細胞の染色体に組み込まれるか、または１つ以上の細菌ベクター上に配置され得る。可動化モジュールには、これらに限定されるものではないが、ｖｉｒＣ１ （ＴＰ１１４−６８： ｐａｒＡ）、（ＴＰ１１４−４１： ｎｉｋＢ）、及び／または（ＴＰ１１４−４２： ｎｉｋＡ）のうちの１つ以上が含まれる。可動化モジュールは、以下の接合ファミリー、すなわち、ＭＯＢ_F、ＭＯＢ_P、ＭＯＢ_V、ＭＯＢ_H、ＭＯＢ_C及び／またはＭＯＢ_Qのうちの少なくとも１つに由来することができる。別の実施形態では、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＭＯＢ_Pファミリーの１つに由来することができる。例えば、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌ベクターＴＰ１１４に由来することができる。さらに別の例では、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌ベクターＲ６Ｋに由来することができる。別の実施形態では、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌接合プラスミドのＭＯＢ_Fファミリーの１つに由来することができる。例えば、可動化マシナリーをコードする遺伝子は、細菌ベクターｐＯＸ３８に由来することができる。

【0073】

接合送達システムの構成
特定の実施形態では、接合送達システムは、遺伝子カーゴの指数関数的な伝播を可能にするためにシス可動化を与えるように設計されている。そのような実施形態では、システムのすべてのモジュールは、単一の染色体外ベクター（いくつかの実施形態では、環状プラスミド）上に位置している。シス可動化に基づくシステムの使用は、コンテインメントがないことに厳密に限られ、接合プラスミドのレシピエント細胞への伝達、及びその後のレシピエント細胞から他のレシピエント細胞への伝達のラウンド、ならびにレシピエント内での接合プラスミドの複製が可能となる。

【0074】

別の特定の実施形態では、接合送達システムは、遺伝子カーゴの速やかな伝播を可能にし、一定程度のコンテインメントを与えるような制約付きシス可動化を与えるように設計されている。そのような実施形態では、維持モジュールは接合細菌細胞の染色体内に位置し、システムの残りのモジュールは単一の染色体外ベクター（いくつかの実施形態では、環状プラスミド）上に位置する。制約付きシス可動化を与えるように設計されたシステムの使用によってある程度のコンテインメントが与えられ、接合プラスミドのレシピエント細胞への伝達、及びその後のレシピエント細胞から他のレシピエント細胞への伝達は可能であるが、レシピエント細胞内での複製は防止される。

【0075】

さらに特定の実施形態では、接合送達システムは、遺伝子カーゴのコンテインメントのレベルを高めるようなトランス可動化を与えるように設計されている。そのような実施形態では、伝達マシナリー全体が接合細菌細胞の染色体に位置するかまたは１個もしくは多数の染色体外ベクター（いくつかの実施形態では、環状プラスミド）上に位置するが、輸送モジュールを欠いている。システムの遺伝子カーゴの各モジュール（ペイロードモジュール及び輸送モジュール）は、単一の染色体外ベクター（いくつかの実施形態では、環状プラスミド）上に位置する。そのような実施形態では、遺伝子カーゴは栄養複製モジュールも含む。トランス可動化を与えるように設計されたシステムの使用により最高レベルのコンテインメントが与えられ、可動化されたプラスミドのレシピエント細胞から別のレシピエント細胞への伝達が防止され、レシピエント細胞内での複製が防止される。

【0076】

遺伝子カーゴの各モジュールは、細菌の染色体に組み込まれてもよい。そのような実施形態では、遺伝子カーゴは切り出されるか、またはペイロードモジュールの上流に（機能的に関連して）栄養複製モジュールを含むことができる。

【0077】

本開示のシステムは、遺伝子カーゴのレシピエント細菌への伝達を可能とすることで、レシピエント細菌内で１つ以上の異種タンパク質及び／または１つ以上の非コーディングＤＮＡまたはＲＮＡ分子を発現するように設計されている。このシステムは、ドナー細菌に導入されると、インビボ（例えば、胃腸環境）の許容される接合効率で遺伝子カーゴを標的細菌に伝達することができる。本開示との関連で使用される場合、「接合効率」とは、ドナー細菌からレシピエント細菌への遺伝子カーゴの伝達の尺度を指す。接合効率は、当業者によって多くの方法でインビボ（例えば、対象内）またはインビトロ（例えば、対象外、（液体または固体）培地中）で決定することができる。接合効率がインビボで測定される実施形態では、接合効率は、利用可能な総レシピエント細菌当たりの細菌接合完了体の数（例えば、接合性細菌細胞から遺伝子カーゴを受け取った細菌の数）として与えることができる。接合効率は、対象の特定の場所、例えば対象の腸内で測定することができる（そしてそのような場合、腸内での接合効率のレベルが与えられる）。本開示との関連で使用される場合、「許容可能なレベルのインビボ接合効率」なる表現は、標的細胞集団に対する、または標的細胞集団による有意な影響を媒介するような遺伝子カーゴの充分な伝達を与えることが可能な、インビボで観察される伝達のレベルを指す。いくつかの実施形態では、システムは、少なくとも１０^-3、１０^-2、または１０^-1（接合完了体細菌／レシピエント細菌）のインビボ接合効率を有する。特定の実施形態では、システムは、少なくとも１０^-3（接合完了体細菌／レシピエント細菌）のインビボ接合効率を有する。特定の実施形態では、システムは、少なくとも１０^-2（接合完了体細菌／レシピエント細菌）のインビボ接合効率を有する。特定の実施形態では、システムは、少なくとも１０^-1（接合完了体細菌／レシピエント細菌）のインビボ接合効率を有する。

【0078】

本開示に示されるように、いくつかの実施形態において、伝達効率はいくつかの交配条件において比較される。したがって、特定の条件下でのインビトロ接合の測定値を、あるベクターのインビボ伝達効率が許容可能であるかどうかを判定するための代用として用いることができる。その結果、いくつかの実施形態では、低酸素条件下、培地中の糞便の存在下、生理学的に適切な温度（例えば、３７℃）、不安定な交配環境（例えば、静的または攪拌ブロス）でのシステムの接合効率は、標準的な固体培地での交配と比較して少なくとも１０^-3、１０^-2、または１０^-1（接合完了体細菌／レシピエント細菌）である。特定の実施形態において、システムは、上記の条件のいずれかで測定した場合、少なくとも１０^-3（接合完了体細菌／レシピエント細菌）のインビトロ接合効率を有する。特定の実施形態において、システムは、上記の条件のいずれかで測定した場合、少なくとも１０^-2（接合完了体細菌／レシピエント細菌）のインビトロ接合効率を有する。特定の実施形態において、システムは、上記の条件のいずれかで測定した場合、少なくとも１０^-1（接合完了体細菌／レシピエント細菌）のインビトロ接合効率を有する。

【0079】

いくつかの実施形態において、液体培地と固体培地における接合効率の比は、ベクターのインビボ伝達効率が許容可能であるかどうかを判定するための代用として用いることができる。以下の実施例に示されるように、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０％より高い接合効率の比は、接合性細菌が許容されるインビボ伝達効率を有することを示す。いくつかの実施形態において、０．１％よりも高い接合効率の比は、接合性細菌が許容されるインビボ伝達効率を有することを示す。

【0080】

本開示はまた、液体培地中で接合する細菌系の能力を測定することにより、インビボ伝達の効率を決定するための方法も含む。かかる方法は、液体培地中で接合性細菌宿主細胞とレシピエント細菌宿主細胞とを接触させることと、かかる液体培地中での接合効率を測定することと、を含む。一実施形態では、液体培地は、特定の温度（例えば、３７℃）で測定した場合に水と実質的に同様の粘度を有する。標準的な固体培地での交配と比較して、接合効率が少なくとも１０^-3、１０^-2、または１０^-1（接合完了体細菌／レシピエント細菌）である場合、接合性細菌細胞は、インビボ（例えば、被験者の胃腸管内）で効果的に接合することが可能であると判定される。上記に代えて、または上記と組み合わせて、この方法は、液体培地と固体培地における接合効率の比を決定することを含み得る。かかる実施形態において、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０％より高い接合効率の比は、接合細菌が許容されるインビボ伝達効率を有することを示す。接合性細菌細胞とレシピエント細菌細胞との接触は、インビボ環境と同じかまたは実質的に同様である特定の温度、例えば、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行うことができる。接合細菌細胞とレシピエント細菌細胞との接触は、静的条件で、または攪拌下で行うことができる。

【0081】

プロバイオティクス組換えドナー細菌、該ドナー細菌を含む組成物、及び該ドナー細菌を作製するためのプロセス
本開示はまた、本明細書に記載される遺伝子カーゴを標的（レシピエント）細菌に伝達するために接合を行うことができるドナー細菌として機能することができる組換え細菌宿主細胞（接合性細菌細胞と呼ばれる）も提供する。接合性細菌細胞細菌は、本明細書に記載される伝達マシナリー及び遺伝子カーゴを含む。いくつかの実施形態では、伝達マシナリー及び遺伝子カーゴは、組換え細菌のゲノムとは独立して複製することができる。そのような実施形態では、伝達マシナリーは、遺伝子カーゴ核酸分子と機能的に関連付けられて例えば単一の一体型ベクター（例えば、単一のプラスミド）を形成することができる。別の実施形態において、伝達マシナリーは、接合性細菌細胞細菌の染色体に（単一の位置または複数の位置に）組み込まれ、遺伝子カーゴ核酸分子は、ドナー細菌のゲノムとは独立して複製され得る。別の実施形態では、ドナー細菌は、伝達マシナリーを含む第１のベクターと、遺伝子カーゴ核酸分子を含む第２のベクターの少なくとも２つの別個のベクター（例えば、２つの別個のプラスミド）を含むことができる。

【0082】

本開示の伝達マシナリーは高いインビボ接合効率を有しているため、対象内で所望の治療効果を実現するうえで必要とされる接合性細菌細胞細菌の量は、本開示のシステムを欠く他の組換え細菌と同等またはそれ以下となると考えられる。

【0083】

いくつかの実施形態において、接合性細菌細胞は、その病原性を低減または消失させるように改変された病原性細菌細胞であってよい。あるいは、本開示の接合性細菌細胞は少なくとも対象に有害ではない（例えば、病原性ではない）ことから、プロバイオティクス細菌であるとみなされ、いくつかの実施形態では、プロバイオティクスはそれ自体で対象に健康上の利益をもたらすことができる。したがって、本開示は、本開示の送達システムを保有するように遺伝子操作された細菌を提供する。したがって、本開示はまた、細菌細胞に本開示のシステムを導入することによって接合性細菌細胞を得るためのプロセスも提供する。場合により、システムは、１つ以上の選択可能な形質を付与する遺伝子を含むことができる。

【0084】

接合性細菌細胞として使用できる細菌細胞としては、これらに限定されるものではないが、バチルス属菌、ビフィドバクテリウム属菌、エンテロコッカス属菌、エシェリキア属菌、ラクトバチルス属菌、ラクトコッカス属菌、ロイコノストック属菌、ペディオコッカス属菌、及びストレプトコッカス属菌が挙げられる。したがって、本開示は、バチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、及びストレプトコッカス属からのプロバイオティクス組換え細菌、ならびにバチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、及びストレプトコッカス属のプロバイオティクス細菌に接合性細菌ベクターまたはシステムを導入することによってかかるプロバイオティクス細菌を作製するためのプロセスを提供する。ヒト対象に対してプロバイオティクスとみなされる細菌種としては、これらに限定されるものではないが、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）（例、ＧＢＩ−３０または６０８６株）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）ラクチス亜種（ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）（例、ＢＢ−１２株）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）インファンティス亜種（ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）（例、ＬＡＢ１８ｓ株）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例、Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（例、ＮＣＦＭ株）、ラクトバチルス・ビフィダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（例、Ｌａｉ、ＬＣＩまたはＮＣＣ５３３株）、ラクトバチルス・パラカゼイＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ （例、Ｓｔｌ １またはＮＣＣ２４６１株）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（例、２９９ｖ株）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ （例、ＡＴＣＣ５５７３０、ＳＤ２１１２、プロテクティス、ＤＳＭ１７９３８、プロデンティス、ＤＳＭ１７９３８、ＡＴＣＣ５５７３０、ＡＴＣＣＰＴＡ５２８９、ＲＣ−１４株）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（例、ＧＧ、ＧＲ−１）及びラクトコッカス・サーモフィルス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍａｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ） （例、Ｂ７株）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）（例、ＵＬ５株）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。したがって、本開示は、いくつかの実施形態において、プロバイオティクスとみなされる細菌種からの接合性細菌組換え細菌、ならびにヒトにおいてプロバイオティクスとみなされる細菌株のプロバイオティクス細菌に接合性細菌ベクターまたはシステムを導入することによってかかるプロバイオティクス細菌を作製するためのプロセスを提供する。特定の実施形態では、プロバイオティクスは、エシェリキア属、例えば、エシェリキア・コリ菌（大腸菌）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ株に由来する。本開示は、接合性細菌ベクターまたはシステムをプロバイオティクス大腸菌、例えば 大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株に導入することにより、そのようなプロバイオティクス組換え細菌を作製するためのプロセスを提供する。

【0085】

一実施形態では、組換えドナー細菌は、組換え細菌を投与した対象の胃腸管内にコロニー形成することができることから、腸内組換え細菌である。一実施形態では、腸内組換え細菌は、胃、腸（小腸及び大腸を含む）、及び／または組換え細菌を投与した対象の結腸内にコロニー形成することができる。

【0086】

一実施形態では、組換え細菌は、組成物（プロバイオティクス組成物であってよい）として配合することができる。組成物はまた、賦形剤、１つ以上の抗生物質（複数可）、選択圧力（選択可能な形質を有する細胞を選択するため）、及び／または１つ以上の化学的に活性な分子、及び／またはプロバイオティクス（非組換え）細菌の１つ以上の株も含むことができる。組成物において、組換え細菌は、溶液／懸濁液として、または乾燥形態で提供することができる。組成物は、任意の経路による投与用に提供することができ、一実施形態では、組成物は、経口投与、注射、吸入などのために提供することができる。組成物が経口投与を意図し、対象の胃腸管にコロニー形成することを意図して使用される場合、その生存率及び目的の場所（レシピエント細菌を含むことが疑われる）に到達するまで接合を行う能力を維持するように組換え細菌を配合するように注意を払う必要がある。

【0087】

したがって、本開示は、組成物を作製するためのプロセスを提供する。概して、プロセスは、組換え細菌を、賦形剤と、また、場合によりさらなるプロバイオティクス細菌及び／または抗生物質及び／または化学的に活性な分子と組み合わせることを含む。プロセスは、組換え細菌の溶液／懸濁液を調製すること、または組換え細菌を乾燥することを含んでもよい。組成物が経口投与を意図する場合、組成物を製造するためのプロセス及び組成物に使用される賦形剤は、経口投与を可能にするように設計／選択される。

【0088】

組換え細菌宿主細胞及び該宿主細胞を含む組成物の治療的使用
本開示の組換え接合性細菌宿主細胞は、遺伝子カーゴを標的（レシピエント）細菌に伝達するためのドナー細菌として機能する。伝達は、接合性細菌細胞が投与される対象（ヒトまたは動物）の体内で起こり得る。対象は、レシピエント細菌を保有していることが疑われるかまたはわかっているものとすることができる。対象は、ヒト対象または動物対象（例えば、非ヒト哺乳動物など）とすることができる。組換え細菌が腸内細菌である実施形態では、伝達は、対象の胃腸管で起こることが意図されている。

【0089】

一実施形態では、組換え細菌は、意図されたレシピエント細菌の制限修飾システムと同じかまたは同様の修飾モジュールを有するように選択または操作される。細菌には、外来ＤＮＡに対する細菌の防御システムに関与している４つの既知の制限修飾システム（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ型）が存在している。修飾モジュールの類似性は、ＤＮＡを制限作用から保護することにより、レシピエント細菌への遺伝子カーゴ分子の導入を容易とし、それにより接合効率が向上する。例えば、レシピエント細菌がＩ型制限修飾システムを有する実施形態では、同様のＩ型修飾システムを有する組換え細菌、例えば、大腸菌由来の組換え細菌を選択して使用することができる。一実施形態では、制限修飾システムは、ドナー細菌に内因性であり、排斥モジュールの一部である。別の実施形態において、制限修飾システムは、ドナー細菌に対して異種であり、排斥モジュールに組み込まれる。一実施形態では、ドナー細菌の制限修飾システム及びレシピエント細菌の制限修飾システムは、Ｉ型制限修飾システムを含む／である。別の実施形態では、ドナー細菌の制限修飾システム及びレシピエント細菌の制限修飾システムは、ＩＩ型制限修飾システムを含む／である。さらなる実施形態において、ドナー細菌の制限修飾システム及びレシピエント細菌の制限修飾システムは、ＩＩＩ型制限修飾システムを含む／である。さらに別の実施形態において、ドナー細菌の制限修飾システム及びレシピエント細菌の制限修飾システムは、ＩＶ型制限修飾システムを含む／である。

【0090】

したがって、本開示は、遺伝子カーゴを、それを必要とする対象の微生物叢中でドナー細菌からレシピエント細菌に伝達する方法を提供する。伝達は、液体（例えば、尿または血液）または固体表面（例えば、上皮）で行うことができる。微生物叢は、固体表面（胃腸上皮、膀胱上皮または肺上皮など）または液体（例えば、膀胱または尿道の尿、血管内の血液、胃液または胃またはリンパ節のリンパ液など）に存在しうる。この方法は、治療有効量の本開示の接合性細菌細胞細菌を、それを必要とする対象に投与することを含む。本開示との関連で使用される場合、治療有効量とは、対象に対する治療効果を媒介するのに有効な量（用量）を指す。本明細書において、「薬学的な有効量」とは、単独でまたは他の治療薬と組み合わせて服用される、単回投与または任意の用量もしくは経路のいずれかで服用される、所望の治療効果を与える量として解釈され得る点も理解されたい。この方法はまた、組換え細菌の投与の前に、対象内のレシピエント細菌の存在を判定することも含み得る。この方法は、組換え細菌の制限修飾システムが、意図されるレシピエント細菌の制限修飾システムと実質的に同様かどうかを判定することをさらに含むことができる。

【0091】

有利な点として、上記に示したように、本開示のシステムは高いインビボ接合効率を有するので、組換え細菌を投与される対象において所望の治療効果を実現するうえで必要とされる組換え細菌の量は、本開示の接合送達システムを欠く他の組換え細菌よりも少なくなるであろう。

【0092】

遺伝子カーゴが１つ以上の異種タンパク質、及び／または非コーディングＲＮＡ、及び／またはファージゲノム、及び／または細菌ゲノムをコードする実施形態では、レシピエント細菌は、組換え細菌からの接合を受け入れる対象内に存在するあらゆる種類の細菌であり得る。そのような場合、レシピエント細菌は例えば、これらに限定されるものではないが、エロモナス属菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、カンピロバクター属菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、シトロバクター属菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、エンテロバクター属菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、エシェリキア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、クレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、ハフニア属菌（Ｈａｆｎｉａ ｓｐ．）、ヘリコバクター属菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ラクトバチルス属菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ラクトコッカス属菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、モルガネラ属菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐ．）、プレシオモナス属菌（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、プロテウス属菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．）、プロビデンシア属菌（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、シゲラ属菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、スタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、及びエルシニア属菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）を含む腸内細菌叢（対象に対して病原性でありうるかまたは病原性のないものでよい）の一部とすることができる。

【0093】

遺伝子カーゴが１つ以上の異種タンパク質をコードする実施形態では、遺伝子カーゴを受け取った細菌は、その後、１つ以上の異種タンパク質を発現することができる。例えば、レシピエント細菌は、真核生物の成長因子、及び／またはホルモン、及び／またはサイトカイン（インターロイキン及び／またはケモカインを含む）のうちの１つ以上を発現することができる。異種タンパク質の発現は、組換え細菌が投与された対象に治療効果を与えることを意図している。例えば、治療用タンパク質がＧＬＰ−１ペプチドのようなホルモンである場合、本開示は、組換え細菌を使用して、例えば、糖尿病などのＧＬＰ−１の増加が有益な効果を示す状態に関連する症状を予防、治療または緩和することを提供する。別の例では、治療用タンパク質がインターロイキンである場合、本開示は、組換え細菌を使用して、例えば炎症状態などのインターロイキンの増加が有益な効果を示す状態に関連する症状を予防、治療または緩和することを提供する。

【0094】

遺伝子カーゴによってコードされる異種タンパク質がプログラム可能なヌクレアーゼである実施形態では、レシピエント細菌は、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＣａｓタンパク質のうちの１つ以上を発現するように改変することができる。プログラム可能なヌクレアーゼの発現は、組換え細菌が投与された、レシピエント細菌に罹患している対象に治療効果を与えることを目的としている。接合性細菌細胞組換え細菌の投与は、例えば、レシピエント細菌を殺すか、レシピエント細菌を抗生物質に感作するか、または病原性に寄与する、タンパク質または非コーディングＲＮＡの発現を抑制するようにレシピエント細菌を改変することができる。異種タンパク質がＣａｓ９タンパク質のようなＣａｓタンパク質である場合、本開示は、接合性細菌細胞組換え細菌を使用して、意図されたレシピエント細菌によって引き起こされる感染症または腸内毒素症に関連する症状を予防、治療または緩和することを提供する。一実施形態では、意図されるレシピエント細菌によって引き起こされる感染症及び／または腸内毒素症は胃腸管に存在し、組換え細菌は、そのような感染症及び／または腸内毒素症の症状を予防、治療または緩和するために投与される。例えば、対象が多剤耐性志賀毒素産生大腸菌に感染している場合、組換え細菌を使用して、レシピエント細菌の薬剤感受性を回復し、及び／または志賀毒素の発現を阻害することができる。さらに別の例では、対象が付着性侵襲性大腸菌に罹患しており、腸内毒素症に関連するクローン病または炎症性腸疾患にも罹患している場合、組換え細菌を使用して付着線毛の発現を阻害することでレシピエント細菌の胃腸壁への付着性を低下させ、いくつかの実施形態では、腸内毒素症を治療することができる。さらに別の例では、対象が腸内毒素症に関連する尿路感染症または敗血症に罹患している場合、組換え細菌を使用して付着線毛または病原性因子の発現を阻害してレシピエント細菌の病原性を低下させ、いくつかの実施形態では、腸内毒素症を治療することができる。

【0095】

遺伝子カーゴが１つ以上の非コーディングＲＮＡをコードする実施形態では、レシピエント細菌は、その後、１つ以上の非コーディングＲＮＡを発現することができる。例えば、レシピエント細菌は、１つ以上のｃｒＲＮＡ、及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／またはアンチセンスＲＮＡ、及び／またはｇＲＮＡ、及び／またはｒＲＮＡ、及び／またはｔＲＮＡを発現することができる。非コーディングＲＮＡの発現は、組換え細菌が投与された対象に治療効果を与えることを意図している。例えば、治療用の非コーディングＲＮＡがアンチセンスＲＮＡである場合、病原性因子の発現をノックダウンする可能性があり、それによりレシピエントは対象に感染することができなくなる。

【0096】

遺伝子カーゴが１つ以上の非コーディングＲＮＡ及び１つ以上の異種タンパク質をコードする実施形態では、遺伝子カーゴを受け取った細菌は、その後、１つ以上の非コーディングＲＮＡ及び１つ以上の異種タンパク質を発現することができる。例えば、レシピエント細菌は、１つ以上のｃｒＲＮＡ、及び１つ以上のＣａｓタンパク質を発現することができる。ｃｒＲＮＡ及びＣａｓタンパク質の発現は、接合性細菌細胞組換え細菌を投与した対象に治療効果をもたらすことを意図している。例えば、レシピエント細菌のゲノムの特定の遺伝子座にｃｒＲＮＡとＣａｓ９が同時に存在すると、これらの部位で二本鎖切断が生じる。これらの切断は、その後、レシピエント細菌の死を誘発する。

【0097】

組換え細菌は、場合により抗生物質と組み合わせて使用することができる。抗生物質の例としては、これらに限定されるものではないが、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリドノン、ペニシリン、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。アミノグリコシドの例としては、これらに限定されるものではないが、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。アンサマイシンの例としては、これらに限定されるものではないが、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン（ストレプトマイシン）及びそれらの組み合わせが挙げられる。カルバペネムの例としては、これらに限定されるものではないが、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム及びそれらの組み合わせが挙げられる。セファロスポリンの例としては、これらに限定されるものではないが、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン（ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）またはセファロチン（ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール及びそれらの組み合わせが挙げられる。糖ペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。リンコサミドの例としては、これらに限定されるものではないが、クリンダマイシン、リンコマイシン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。リポペプチドの例としては、これに限定されるものではないが、ダプトマイシンが挙げられる。マクロライドの例としては、これらに限定されるものではないが、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。モノバクタムの例としては、これに限定されるものではないが、アズトレオナムが挙げられる。ニトロフランの例としては、これらに限定されるものではないが、フラゾリドン、ニトロフラントイン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。オキサゾリドノンの例としては、これらに限定されるものではないが、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド、オレゾリド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ペニシリンの例としては、これらに限定されるものではないが、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ペニシリンＧ、テモシリン、チカルシリン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。キノロンの例としては、これらに限定されるものではないが、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。スルホンアミドの例としては、これらに限定されるものではないが、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、銀スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファナミド（旧名）、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（Ｃｏ−トリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、スルファミドクリソイジン（旧名）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。テトラサイクリンの例としては、これらに限定されるものではないが、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0098】

本発明は、その範囲を限定するためではなく、本発明を説明するために示される以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されよう。

【0099】

実施例Ｉ−インビトロの細菌接合の伝達効率は 、インビボでの細菌接合の伝達効率を予測しない
菌株、プラスミド及び増殖条件。本実施例で使用したすべての株及びプラスミドを表１に示す。すべてのオリゴヌクレオチド配列を表２に示す。細胞は一般的に、必要に応じて以下の濃度の抗生物質、すなわちアンピシリン（Ａｐ）１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール（Ｃｍ）３４μｇ／ｍＬ、カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍＬ、ナリジクス酸（Ｎｘ）４μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン（Ｓｐ）１００μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン（Ｓｍ）５０μｇ／ｍＬ、スルファメトキサゾール（Ｓｕ）１６０μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン（Ｔｃ）１５μｇ／ｍＬ、及びトリメトプリム（Ｔｍ）３２μｇ／ｍＬを添加したＬｕｒｉａブロスＭｉｌｌｅｒ（ＬＢ）またはＬｕｒｉａブロス寒天Ｍｉｌｌｅｒ培地で増殖させた。ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）栄養要求性は、培地に最終濃度５７μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加することによって補った。すべての培養物は３７℃で通常どおり培養した。感熱性プラスミド（ｐＳＩＭ６、ｐＣＰ２０、ｐＧＲＧ３６）を含む細胞を３０℃で増殖させた。菌齢１８時間以上の細菌培養は実験で使用しなかった。

【0100】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【0101】

ＤＮＡ操作。本実施例で使用したオリゴヌクレオチド配列の詳細なリストを表２に示す。各プラスミドは、ＥＺ１０−Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＢＩＯＢＡＳＩＣ＃ＢＳ６１４）を使用して調製し、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）ミニプレップはＱｕｉｃｋ ｇＤＮＡミニプレップ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を製造元の指示に従って使用して調製した。ＰＣＲ増幅では、それぞれＶｅｒａｓｅｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）またはＴａｑＢ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用してＤＮＡ部分の増幅及びスクリーニングを行った。制限酵素による消化は、製造者の推奨に従って３７℃で１時間インキュベートした。プラスミドは、製造元のプロトコルに従ってＮＥＢｕｉｌｄｅｒ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙミックス（ＮＥＢ）を使用してＧｉｂｓｏｎアセンブリによりアセンブルした。

【0102】

リコンビニアリング。すべてのリコンビニアリング実験は、蒸気に述べたようにｐＳＩＭ６を使用して行った（ＰＭＩＤ：１６７５０６０１）。簡単に説明すると、ｐＳＩＭ６を含む大腸菌株を６００ナノメートルの光学密度が０．４〜０．８に達するまで３０℃で培養した。次に、細胞に４℃で１５分間の熱ショックを与えてから洗浄し、熱ショックを与えた大腸菌細胞にリコンビニアリングカセットをエレクトロポレーションした。次に、細胞を室温で一晩インキュベートした後、選択培地にプレーティングした。次に、コロニーをＰＣＲでスクリーニングして、陽性クローンを同定した。

【0103】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【0104】

ＤＮＡの精製。バッファーの不適合を回避するため、または酵素反応を停止するため、プラスミドアセンブリの各ステップ間でＤＮＡの精製を行った。ＰＣＲ反応を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡ結合ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を製造者のガイドラインに従って使用して、固相可逆固定法（ＳＰＲＩ）によって大まかに精製した。ＤＮＡ試料を制限酵素で消化した場合、ＤＮＡは、細胞懸濁液ＤＮＡ精製プロトコルに関する製造者の推奨に従って、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を使用して精製した。精製後、必要に応じてＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用してＤＮＡ濃度及び純度を常法に従って評価した。

【0105】

エレクトロポレーションによる大腸菌へのＤＮＡ形質転換。通常のプラスミド形質転換をエレクトロポレーションによって行った。エレクトロコンピテントな大腸菌株を２０ｍＬのＬＢブロスから調製した。次に、６００ナノメートルの光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）０．６の指数増殖期に達した培養物を滅菌蒸留水で３回洗浄した。次に、細胞を２００μＬの水に再懸濁し、４０μＬのアリコートに分配した。次に、ＤＮＡをエレクトロコンピテントセルに加え、混合物を１ｍｍエレクトロポレーションキュベットに移した。１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ωのパルスを５ｍｓ間、使用して細胞をエレクトロポレーションした。次に、細胞を１ｍＬの非選択的ＬＢ培地に再懸濁し、１時間回復させた後、選択的培地にプレーティングした。

【0106】

ヒートショックによる大腸菌へのＤＮＡ形質転換。ヒートショック形質転換を主に用いて、ギブソンアセンブリ生成物をクローニングした。化学的コンピテントセルをこれまでに記載されているような塩化ルビジウムプロトコルに従って調製した（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。化学的コンピテントセルを急速冷凍し、使用前に−８０℃で保存した。ギブソンアセンブリ生成物は、ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋化学的コンピテントセルに１／１０の体積比で直接形質転換した。常法により、最大１０μＬのＤＮＡを１００μＬのコンピテントセルに添加した後、４２℃で４５秒間のヒートショックによる形質転換を行った。次に、細胞を１ｍＬの非選択的ＬＢ培地に再懸濁し、３７℃で１時間回復させた後、選択的培地にプレーティングした。

【0107】

接合の定量化のためのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）株への選択マーカーの導入。改変ＥｃＮ株を、これまでに記載されているようにして抗生物質耐性カセットのＴｎ７挿入によって得た（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。表２に記載されているように、対応するプライマーを使用したＰＣＲによって組み込みを確認した。プラスミドの除去を確認するために、アンピシリン耐性の喪失を確認した。より具体的には、ｐＧＲＧ３６ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋から精製し、ＳｍａＩ＋ＸｈｏＩで消化した。対応するプライマー（表２）を用いてインサートをＰＣＲにより増幅し、消化したｐＧＲＧ３６プラスミドのａｔｔＬＴｎ７とａｔｔＲＴｎ７部位との間にギブソンアセンブリにより挿入した（図１）。次に、ギブソンアセンブリ生成物を化学的コンピテントな大腸菌ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋株に形質転換した。得られたプラスミドを制限酵素を用いて分析し、陽性クローンを大腸菌ＭＦＤｐｉｒ＋に形質転換した（Ｆｅｒｒｉｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。プラスミドは、接合によって大腸菌ＭＦＤｐｉｒ＋からＥｃＮに移された。ｇｌｍＳのターミネーターへのカセットの挿入を媒介するため、ＥｃＮをＯＤ_600nmが０．６となるまで、アラビノースを加えたＬＢ中、３０℃で最初に培養した。次に、細胞に４２℃で１時間ヒートショックを与え、３７℃で一晩インキュベートしてプラスミドをクリアランスさせた。次に、細菌培養物のアリコートをＬＢ寒天プレートにストリークした。２０個以上のコロニーを分析し、アンピシリンの非存在下でのみ増殖し、インサートの選択マーカーを含むコロニーを、表２に記載される適当なプライマーを使用したＰＣＲによって調べた。

【0108】

大腸菌ＫＮ０１ΔのｄａｐＡの構築。ｐＳＩＭ６を使用したリコンビニアリングにより、ＥｃＮのｄａｐＡ遺伝子を欠失させることによってＤＡＰ栄養要求性変異体も得た（Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＤＡＰ栄養要求性の復帰は過去に報告されたことがなく（Ｒｏｎｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）、また、ＤＡＰ栄養要求性は補完された場合に細菌の適応度にほとんど影響しない（Ａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）ことから、ＤＡＰ栄養要求性は、伝達頻度を低下させることなく接合用のドナー株とレシピエント株とを区別するための優良なマーカーであることが示されている。ＤＡＰ栄養要求性株を作製するため、ｐＫＤ４のａｐｈ−ＩＩＩａ耐性カセットを、ｄａｐＡに隣接する領域に対する相同性を高めたＰＣＲによって増幅した。次に、精製されたＰＣＲ産物の２回目のＰＣＲラウンドにより、相同性の長さを増加させた。これまでに記載されているようにして、ｐＳＩＭ６を使用してＥｃＮでリコンビニアリングを行った（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００６）。簡単に説明すると、ｐＳＩＭ６を含むＥｃＮに精製ＰＣＲ産物をエレクトロポレーションした。カナマイシン耐性菌を選択し、ＤＡＰ栄養要求性を確認した。カセットの挿入とｄａｐＡの欠失も、対応するプライマーを使用したＰＣＲによって確認した（表２）。ｄａｐＡ遺伝子座へのカセット挿入を確認した後、４２℃で１時間のヒートショックを行い、続いて３７℃で一晩インキュベーションすることにより、株をｐＳＩＭ６からキュアした。次に、培養物を選択プレートにストリークしてＡｐ感受性クローンを同定し、次にこれをｐＣＰ２０で形質転換して、これまでに記載されているようにして耐性カセットを除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ｐＣＰ２０プラスミドを、上記と同じ手順に従ってヒートショックによってキュアした。次に、ＳｍＳｐインサートをＥｃＮΔｄａｐＡ株のゲノムに付加して、ＫＮ０１ΔｄａｐＡを完成させた。

【0109】

インビトロ接合アッセイ。すべてのインビトロ接合アッセイについて、特に明記しない限り、ドナー株はＫＮ０１ΔｄａｐＡとし、レシピエント株はＫＮ０２とした。各菌株を、接合実験の１８時間前に凍結ストックから増殖させ、１：１の体積比（各１００μＬ）で混合し、最大速度で１分間遠心分離し、抗生物質を含まない２００μＬのＬＢで洗浄した。次に、細菌混合物をスピンダウンし、５μＬのＬＢブロスに再懸濁してＤＡＰを含むＬＢ寒天プレート上に堆積させるか、ＤＡＰを含むＬＢブロスにＯＤ_600nm１．０にまで再懸濁した。次に、細胞混合物を３７℃で所望の接合時間だけインキュベートした後、８００μＬの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、希釈及びプレーティング中の増殖を避けるために滅菌ＰＢＳで１０倍段階希釈した。次に、５μＬの各希釈液をドナー、レシピエント、接合完了体を選択するうえで適当な抗生物質を含むＬＢプレート上に二重にスポットし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数をカウントした。すべての接合頻度は、接合完了体の数をレシピエントＣＦＵの総数で割ることによって計算した。ただし、細胞は常に１：１で混合されているため、ドナー当たりの接合頻度は同等であった（データは示さず）。すべての接合実験を、少なくとも３つの独立した生物学的複製で繰り返した。

【0110】

マウスモデル。すべてのマウス関連のプロトコルは、本発明者らが制定したアニマルケアコミッティーガイドライン（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）に準拠して設計し、動物の苦痛を避けるために厳密に評価を行った。すべての実験を通じて、動物に水と通常の餌を自由に与えた。動物は個別に換気されたケージに収容し、同じケージに入れる動物を５匹以下とした。使用したすべての動物は、１６〜２０ ｇ（チャールズリバー）のＣ５７ＢＬ ／６系の雌とし、到着時に３日間の適応期間が与えた。動物の体重と健康状態を各実験を通じて毎日監視した。いずれの実験においてもマウスに健康状態及び体重の有意な低下は見られなかった。Ｓｍ処理したマウス群について、Ｓｍの作業濃度を、腸内細菌のクリアランス及びＥｃＮコロニー形成を最大とするように最初に評価した（Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。１ｇ／ＬのＳｍの濃度を選択し、すべてのＳｍ処理マウス群の強制給餌の２日前に飲み水に添加した。その時点から、最適なＳｍ活性を維持するために給水ボトルを３日毎に入れ替えた。細菌負荷を、指定の時点で糞便をサンプリングすることにより監視した。実験終了時に、動物をイソフルランで麻酔し、頸椎脱臼により屠殺した。次に、動物を解剖してコロニー形成パターンを明らかにし、腸内細菌含有量をＣＦＵによって評価した。

【0111】

マウス接種物の調製。強制給餌の２日前に、適切な菌株を凍結ストックからマッコンキー選択プレートにストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、コロニーを３７℃の選択的ＬＢブロスに接種した。マウスの経口チャレンジの３〜４時間前に、２０ｍＬの選択的ＬＢブロス中の大きな接種物（２００μＬまたは５００μＬ）で菌株を再度継代培養し、ＯＤ_600nm０．６±０．１に達するまで３７℃でインキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＯＤ_600nm６．０に相当する量に濃縮した。接種物のアリコートを用いて細胞濃度を評価した。最終的な細胞懸濁１００μＬを各マウス（約１×１０⁸ＣＦＵ）に経口投与した。

【0112】

糞便及び組織の処理。５００μＬのＰＢＳと０．２ｍｍのガラスビーズ１個を１．５ｍＬの滅菌マイクロチューブに加えることにより、実験に先立って回収チューブを準備した。次に、サンプリングの前後にチューブの重量を測定して、試料の重量でＣＦＵを正規化した。各試料をＦａｓｔＰｒｅｐ−２４（ＭＰ）ビーズビーターで最大速度で１分間ホモジナイズした。次に、ホモジネートを５００ｘｇで３０秒間遠心分離し、大きな破片がピペッティングされる可能性を防いだ。遠心分離は、回収されたＣＦＵに対する有意な影響を示さなかった（データは示さず）。次いで、試料を初期濃度の１０⁰〜１０^-7に滅菌ＰＢＳで１０倍段階希釈し、２．５μＬの各希釈液を、技術的二重反復として選択マッコンキープレート上にスポットした。試料１ｍｇ当たりのＣＦＵを、試料の測定重量の関数として計算した。各実験では、Ｓｍ処理のコントロールとして、抗生物質を含まないマッコンキープレート上での腸内細菌の総クリアランスも追跡した（データは示さず）。

【0113】

マウスの解剖及びＥｃＮコロニー形成パターンの評価。４日目にマウスを屠殺し、解剖して十二指腸、空腸、回腸、盲腸、上行結腸、及び下行結腸を摘出した。腸の各部分を区別するため、胃に付着した小腸の最初の３ｃｍ（ｃｍ）は十二指腸、中央の６ｃｍは空腸、最後の６ｃｍ（盲腸に最も近い部分）は回腸とみなした。上行結腸と下行結腸は、結腸の正確に半分であった。ＣＦＵ分析用に、各切片の２個の間隔を開けた４半部分をサンプリングした。盲腸の縦半分もＣＦＵに使用した。盲腸はマウスの腸の大きくてはっきりと区別できる構造であり、また、ＥｃＮは盲腸に強くコロニー形成するため、この領域を、コロニー形成及び接合性細菌細胞治療を研究するための腸の代表的な部分として選択した。

【0114】

インビボ接合マウスモデル。インビボ接合実験において、ドナー株の導入の２時間または１２時間前に、マウスにレシピエント株で経口チャレンジした。これは、強制給餌前のＰＢＳ溶液中でのプラスミド伝達の可能性を防止するためである。細菌負荷を、指定の時点で糞便をサンプリングすることにより監視した。実験の最後にマウスを屠殺し、盲腸を摘出して、マウスの腸内での接合レベルを確認した。糞便及び組織処理のセクションで述べたように糞便をホモジナイズし、ＣＦＵをマッコンキープレートで得た。

【0115】

統計的分析 統計的有意性は、特に指定がない限り、一元配置分散分析を使用してデータの対数値に対して行った。Ｐ値はグラフ上に直接示され、２つのデータ群間の統計的有意差を表す。Ｐ値が０．０５未満の場合にデータの差が有意であると見なした。

【0116】

１．１ 大病菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７改変株の構築
抗生物質耐性ＥｃＮ変異体の作製。ＥｃＮは天然の抗生物質耐性表現型を有さないため（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＥｃＮの２つの株間の接合効率を定量化することは不可能であった。ドナー株とレシピエント株とを区別するには、２つの異なる耐性マーカーの使用が不可欠である。さらに、接合プラスミド上の抗生物質耐性マーカーの存在によって、レシピエントと接合完了体との区別が可能である。したがって、ＥｃＮのいくつかの株が接合効率の定量化を可能にするために開発されている。菌株の抗生物質耐性変異体を作製する１つの方法は、その染色体に耐性遺伝子を挿入することであった。細菌の染色体へのＤＮＡの組み込みは、Ｔｎ７を用いたシステムを使用して効率的に実現されている（ＭｃＫｅｎｚｉｅ，２００６）。このシステムでは、プラスミドｐＧＲＧ３６を、Ｔｎ７マシナリーを発現させるためのベクターとして使用しているが、目的のＤＮＡ配列を挿入するための骨格としても使用した。目的のＤＮＡ配列は、ｇｌｍＳのターミネーター配列内に挿入することができるようにｐＧＲＧ３６のａｔｔＬ_Tn7とａｔｔＲ_Tn7部位との間へのクローニングを必要とした。Ｔｎ７手法を用いて抗生物質耐性カセットをＥｃＮに挿入し、３つの異なる株を作製した（図１）。これらの株は、インビボで微生物叢を阻害するために使用したＳｍに対していずれも抵抗性であった。さらなる耐性表現型は、３つの菌株のそれぞれに固有であった。例えば、ドナーＫＮ０１はＳｐにも耐性があり、レシピエントＫＮ０２はＣｍにも耐性があり、ＫＮ０３はＴｃにも耐性があった。

【0117】

接合の選択マーカーとしての栄養要求性。抗生物質の存在下の細胞の増殖を可能とする抗生物質耐性と異なり、栄養要求性は通常の条件下で細胞が増殖することを防止する。これは、既知の復帰メカニズムがこれまで報告されておらず、栄養要求性ドナー株は接合能力に欠陥がみられないため、接合実験でドナー株とレシピエント株とをさらに区別するうえで特に有用である。ＥｃＮを、ラムダレッド組換えシステムを発現するプラスミドであるｐＳＩＭ６で最初に形質転換した。次に、ｄａｐＡ遺伝子を、前述のように抗生物質耐性カセットに置き換えた（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ｄａｐＡを欠失させると、リシン生合成経路及びペプチドグリカン壁の合成が中断された（図２）。これにより、細胞はその細胞壁及びアミノ酸リシンを合成できなくなった。いずれの機能も、通常の条件下での細胞の生存に不可欠である。しかしながら、突然変異はＤＡＰの外因性の供給源によって補完される可能性がある（Ａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。次に、プラスミドｐＧＲＧ３６−ＳｍＳｐを用いてＳｍＳｐ耐性遺伝子をＥｃＮΔｄａｐＡの染色体に挿入し、ＫＮ０１ΔｄａｐＡこのドナー株はＤＡＰなしでは増殖できず、接合完了体とレシピエントとのより効果的な区別が可能となった。また、コントロールとして、ｄａｐＡの欠失が接合効率に影響を与えないことを検証したところ、欠失は影響を与えなかった（データは示さず）。

【0118】

ＥｃＮはネズミの腸にコロニーを形成した。インビトロ及びインビボでのいくつかの接合プラスミドの結合効率を比較するため、ＥｃＮがマウスの腸にコロニーを形成する能力を検証した。Ｓｍはマウスにおける大腸菌のコロニー形成の安定性を高めることがこれまでに示されており、ＫＮ０１はＳｍの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）が最も低い（表３）ことから、ＫＮ０１をコロニー形成アッセイで使用して、（１ ）マイクロバイオームから腸内細菌を除去し、（２）ドナー株とレシピエント株のコロニー形成を促進するのに必要なＳｍの濃度を決定した。１，０００ ｍｇ ／ Ｌ（図３Ａ）、４００ ｍｇ ／ Ｌ（図３Ｂ）、２５０ ｍｇ ／ Ｌ（図３Ｃ）、１００ ｍｇ／ Ｌ（図３Ｄ）、５０ ｍｇ ／ Ｌの濃度（図３Ｅ）及び０ ｇ ／ Ｌ（図３Ｆ）のＳｍを試験した。飲み水中１ｇ／ＬのＳｍは、腸内細菌を除去する一方でＫＮ０１株の安定したコロニー形成は可能とした。この濃度をその後の実験で使用した。十二指腸、空腸、回腸、盲腸、上行結腸、下行結腸におけるＫＮ０１のＣＦＵ密度を分析することにより、ＥｃＮのコロニー形成パターンもＳｍ処理マウスと非処理マウスの両方で検討した（図３Ｇ）。コロニー形成は、Ｓｍ処理マウスの腸のすべての部分で高く、腸の回腸と肛門の間の部分で特に高かった（＞１０³ＣＦＵ／ｍｇ組織）。したがって、ＥｃＮは、腸管の異なる領域にコロニーを形成することができることから、インビボでの接合の定量化を行ううえで優れた菌株であった。ただし、盲腸は、より高密度のＫＮ０１（１０⁴ＣＦＵ／ｍｇ組織）を生じる別個の構造であるため、その後の接合の定量化に使用した。

【0119】

【表3】

【0120】

１．２−インビトロとインビボでの接合伝達効率の比較
細菌接合プラスミドの選択。インビボでのＤＮＡの伝達用の最も効率的な細菌接合システムを見つけるため 、６つの接合プラスミドを選択した。これらの６つのプラスミドは、６つの異なる不和合性ファミリーにまたがっている（表４）。不和合性ファミリーは、２つのプラスミドが細胞内で同時に共存する能力に基づく分類である。２つのプラスミドが同じ不和合性ファミリーに属するためには、それらが細胞内で同時に維持されないものである必要がある。プラスミドが不和合となりうる主な形としては、（１）宿主細胞内の他方のプラスミドの伝達を阻害することによるものと、（２）それらの維持モジュール間の強い類似性によるものの２つがある。異なる不和合性ファミリーからプラスミドを選択することにより、プラスミドは系統発生的に互いにより離れている可能性が高くなった。プラスミドは報告されたインビトロ伝達効率についても選択した（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。

【0121】

【表4】

【0122】

細菌の接合効率は、環境の物理的特性により影響された。６つの接合プラスミドを、以下の実験用のドナー株を構成するＫＮ０１ΔｄａｐＡ 及びＫＮ０１株に伝達した。接合プラスミドのうちの１つを含むＫＮ０１ΔｄａｐＡとレシピエントとしてのＫＮ０２との間の接合実験を、寒天プレート（固体交配）とブロス（液体交配）の両方で行ってインビボでの接合プラスミドの接合効率を予測した（図４Ａ）。固体支持体上での接合は、細胞が固体表面に固定化され、せん断力が働かないため、交配ペアの安定化を必要とせずに接合プラスミドを伝達させることが可能である（Ｂｒａｄｌｅｙ，１９８４）。しかしながら、細胞は液体中で絶えず移動しているため、せん断力による接合の中断を避けるために、細胞同士が互いにしっかりとグリップする必要があることから液体中での接合ははるかに不安定な環境である。ほとんどのプラスミドは寒天プレート上で効率的に転写されたが、ｐＯＸ３８及びＲ６Ｋは寒天及びブロスの両方で同様の頻度で接合することができた。ＴＰ１１４によって媒介される結合は、液体伝達条件下では軽度の影響しか受けないようであった。

【0123】

インビボ条件とインビトロ実験室条件との間の接合効率の相違。（インビボでの）治療用途において対象となりうる、細菌接合性細菌細胞システム用の最も適切な伝達マシナリーを構成することができる接合性プラスミドを決定した。それぞれドナー及びレシピエントとして使用したＫＮ０１とＫＮ０２との間の接合を、Ｓｍ処理された接合マウスモデルで行った。マウスに、ドナー株の導入の２時間前にレシピエント株を与えた。接合完了体の割合を、糞便中で３日間モニターした（図４Ｂ）。実験の３日目にマウスを屠殺し、盲腸内の接合完了体の割合を調べた。盲腸内での接合の結果は、糞便で見られるものと一致していた（図４Ｃ）。ドナー、レシピエント、及び接合完了体の生のＣＦＵデータを、各プラスミドについて図５に示す。３つのプラスミド（ｐＯＸ３８、Ｒ６Ｋ、及びＴＰ１１４）のみがマウスで再現性よく接合することができた。これらの中でも、ＴＰ１１４の伝達速度はインビトロと比較してインビボでほぼ１００倍高かった（図４Ａ）。また、ＴＰ１１４は、試験したどの時点でも、他のすべての試験したプラスミドよりも約２４０倍から１，４００，０００倍超、効率的に伝達することができた。ＴＰ１１４のインビボ伝達活性を、５匹のマウスのさらなるグループでも確認し、同じ経過時間を使用して固体培地上でインビトロで測定されたものと比較した（図４Ｄ）。４８時間以上にわたるＴＰ１１４の接合は、インビボ条件と比較してインビトロの伝達速度の改善をほとんど示さなかった。Ｓｍ処理マウスの接合が、そのままの状態のマイクロバイオーム中の伝達速度を反映しているかどうかを検証するため、ＴＰ１１４及びＲ６Ｋを使用したＳｍ処理または未処理のマウスモデルの両方で１２時間の接合実験を行った（図４Ｅ）。伝達速度は両方の条件で同様であり、腸内マイクロバイオームの存在がＴＰ１１４またはＲ６Ｋによる接合に影響しなかったことを示している。レシピエントとドナーの導入間のコロニー形成時間の影響についても、強制給餌の間を２時間または１２時間として調べた。このパラメータは、ＴＰ１１４（図６Ａ）及びＲ６Ｋ（図６Ｂ）の全体的な接合頻度にほとんど影響しなかった。さらに、ＴＰ１１４及びＲ６Ｋの両方のレシピエント株のコロニー形成レベルは、強制給餌間の時間に関係なく同様であった（図６Ｃ及び６Ｄ）。しかし、ＴＰ１１４は、ほぼ１００％の効率速度でインビボで伝達することが可能であることが試験で示された唯一の接合プラスミドであり、したがって、ＣＯＰの伝達マシナリーとして使用するのに最も興味深い候補と考えられた。

【0124】

実施例ＩＩ −ＴＰ１１４によるＤＮＡのインビボ接合送達に必要な遺伝子及び遺伝的要素の同定
菌株、プラスミド及び増殖条件。すべての菌株とプラスミドを表１に示す。すべてのプラスミド配列は、配列の付録に記載されている。本実施例で使用されるオリゴヌクレオチド、菌株の増殖条件、ＤＮＡ操作、プラスミド構築、リコンビニアリング、及び常法の形質転換は、実施例Ｉの材料と方法のセクションに記載されている。

【0125】

ＴＰ１１４のシークエンシング。ＴＰ１１４をＤＳＭＺ（ＤＳＭ−４２４６）から取得し、大腸菌ＭＧ１６５５Ｎｘ^R への接合によって大腸菌Ｋ１２ Ｊ５３−２から伝達させた。得られた菌株を選択的ＬＢブロス中で３７℃で増殖させ、シークエンシングに充分なＤＮＡを得た。ＱＩＡｓｅｑ ＦＸＬｉｂｒａｒｙ キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、約４００〜６００ｂｐのサイズ選択されたゲノムＤＮＡフラグメントからイルミナライブラリを調製した。このイルミナライブラリを、３００ｂｐのペアエンドリードを用いてＭｉＳｅｑ機器でシークエンシングし、インサート全体をカバーするより長い複合リードをアセンブルした（Ｒｏｄｒｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＭｉｎＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）シークエンシングライブラリも、１．５μｇの高分子量ゲノムＤＮＡ及びＲ９ Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングキット（ＳＱＫ−ＮＳＫ００７、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を使用して調製した。イルミナのシークエンシングリードを、デノボで、またはＩｎｃＩ２ファミリーの他の接合プラスミド（Ｒ７２１、ＡＰ００２５２７．１；ｐＣｈｉ７１２２、ＦＲ８５１３０４；ｐＲＭ１２７６１、ＣＰ００７１３４．１；ｐＳＬｙ２１、ＮＺ＿ＣＰ０１６４０５．１）からの参照配列を使用してＲｏｃｈｅ ｇｓＡｓｓｅｍｂｌｅｒバージョン２．６を用いてアセンブルした。次に、大きなデノボ及び参照コンティグをマニュアルアセンブルし、ＢＬＡＳＴｎを使用して高品質のＭｉｎＩＯＮリードでスキャフォールディングした。最後に、より低いリードカバレッジに基づいて選択された１．５ ｋｂの１０個の領域を、サンガーシークエンシングによって再シークエンシングし、対応するプライマーとのアセンブリを確認した（表２）。得られた６４，８１８ｂｐ（Ｇ＋Ｃ含有量４３％）の環状配列をＲＡＳＴアノテーションサーバー（Ａｚｉｚ ｅｔ ａｌ．，２００８）に提出したところ、合計９２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が予測された。次に、アノテーションを調節して、ＴＰ１１４と参照ＩｎｃＩ２プラスミドＲ７２１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰ００２５２７．１）との間で相同遺伝子に一貫した名前を付けた。

【0126】

ＴＰ１１４遺伝子機能の分析。ＴＰ１１４遺伝子機能のインシリコ分析を、ＣＤｓｅａｒｃｈ（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）及びＢＬＡＳＴｐ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）の両方を用いて行った。タンパク質マルチファスタファイルを、ＲＡＳＴによって予測された９２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）すべてについて最初に生成した（Ａｚｉｚ ｅｔ ａｌ．，２００８）。マルチファスタファイルをＣＤｓｅａｒｃｈによって処理して保存されたタンパク質ドメインを見つけ、タンパク質ファミリーまたはスーパーファミリーをＴＰ１１４の各タンパク質コード遺伝子に帰属させた。ＣＤｓｅａｒｃｈが高い信頼性（ｅ値＜１ｘ１０ ^-15）でタンパク質ドメインを同定できなかった場合、マルイチファスタファイルをＢＬＡＳＴにも提出して推定タンパク質ホモログを同定した。いずれの分析もデフォルトのパラメータを使用して行った。同じ結果を示したヒットが５個よりも多い場合にのみ、高い同一性レベルのＢＬＡＳＴヒットを用いて推定機能を帰属させた。これらの基準に一致しなかったタンパク質は、機能が不明であるとみなした。

【0127】

比較ゲノミクス。遺伝子含有量の比較を、配列の利用可能性のみに基づいてＩｎｃＩ１及びＩｎｃＩ２サブファミリーの７つのランダムに選択されたプラスミドのデータベースに対してＴＰ１１４で行った（表５）。ＢＲＩＧスタンドアロンソフトウェア（Ａｌｉｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を使用して、ＴＰ１１４と各プラスミドグループ間のＢＬＡＳＴベースの相同性分析を行った。プラスミド全体のヌクレオチド配列とコード遺伝子のアミノ酸配列の両方を用いて相同性を分析した。遺伝子の保存を、１００％、７０％、及び５０％の配列同一性カットオフを用いて評価した。同一性のパーセンテージを、不一致の場合は−２、一致の場合は＋１、挿入／欠失の場合は線形コストのスコアを割り当てることによって計算した。次に、遺伝子を、プラスミドの１００％に存在する場合にはコア遺伝子、プラスミドの５０％以上に存在する場合にはソフトコア遺伝子、またはプラスミドの５０％未満に存在する場合にはアクセサリー遺伝子として分類した。

【0128】

ＴＰ１１４のｐｉｌＳの欠失。ｐＫＤ３から増幅されたＦＲＴ隣接ｃａｔ遺伝子を使用して、リコンビニアリングによりＴＰ１１４のｐｉｌＳを欠失させた（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。次に、ＭＧ１６５５Ｒｆ ^R の組換えクローンを、適当なプライマーを使用してスクリーニングした（表２）。ｐｉｌＳ欠失により、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔが作製され、次いでこれを大腸菌株ＫＮ０１に伝達した。野生型及びそのｐｉｌＳ変異体が大腸菌ＫＮ０１から大腸菌ＫＮ０３に伝達する能力を、固体、液体（静止）、攪拌下の液体、及びインビボ条件下でアッセイした。

【0129】

ｐｉｌＶアドヘシン、ｐｉｌＶのＣ末端シャフロンの欠失、及びｐｉｌＶのＣ末端変異体のロッキング。ＦＲＴ配列に挟まれたｃａｔクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットを適当なプライマー（表２）を使用してｐＫＤ３から増幅し、シャフラーゼ遺伝子ｒｃｉに隣接する領域に対する相同性を与えた。次に、ＭＧ１６５５Ｒｆ^R内でｐＳＩＭ６を使用してリコンビニアリングすることにより、カセットをＴＰ１１４に挿入してＴＰ１１４Δｒｃｉ：：ｃａｔを生成した。次いで、ｐＳＩＭ６を非許容温度での菌株のインキュベーションによってキュアしてから、ｐＥ−ＦＬＰで形質転換した。これにより、ＴＰ１１４Δｒｃｉ：：ｃａｔからｃａｔ遺伝子が切り出され、ｒｃｉによって与えられる組換え能力を欠いたＴＰ１１４の変異体であるＴＰ１１４Δｒｃｉが作製された。ｐｉｌＶのＮ末端に隣接する領域に相同性を有する、ＦＲＴ隣接ｃａｔ遺伝子及び前のｒｃｉ欠失を含むカセットを増幅し、ＭＧ１６５５Ｒｆ^R株内でｐＳＩＭ６を使用した第２ラウンドのリコンビニアリングで再び使用した。次に、得られた菌株ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ−ｒｃｉ：：ｃａｔをｐＥ−ＦＬＰで処理し、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ−ｒｃｉを作製した。あるいは、ＦＬＡＧタグ及びＦＲＴ隣接ｃａｔ遺伝子を含むカセットをｐＫＤ３から増幅した（ＦＬＡＧタグはＰＣＲプライマーによって与えられる）。カセットをＴＰ１１４に挿入し、リコンビニアリングによってｐｉｌＶの３’末端、シャフロン、及び欠失させたシャフラーゼ遺伝子領域を置き換えた（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。次に、大腸菌ＭＧ１６５５Ｒｆ^Rの組換えクローンを適当なプライマー（表２）を用いてスクリーニングした。欠失によって、シャフロンがＦＬＡＧタグで置き換えられたＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン−ｒｃｉ：：ｃａｔが作製された。ｐｉｌＶの各Ｃ末端変異体もＰＣＲによって増幅し、ＦＲＴ隣接クロラムフェニコール耐性カセットに融合した。完全なカセットには、ｐｉｌＶ遺伝子及びシャフラーゼ欠失痕（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｃａｒ）の相同領域が含まれていた。これらのカセットを用いたリコンビニアリングによって、各ｐｉｌＶ変異体について「ロックされた」形態が作製された（ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ１−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ２−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ５−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ５’−ｃａｔ）。ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ−ｒｃｉ、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶΔシャフロン−ｒｃｉ：：ｃａｔ、及びｐｉｌＶアドヘシンの変異体を含む、ＴＰ１１４の変異体バージョン（ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ１−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ２−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ５−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ５’−ｃａｔ）を大腸菌株ＫＮ０１に伝達した。野生型ＴＰ１１４及びＴＰ１１４のｐｉｌＶ変異体バージョンが大腸菌ＫＮ０１から大腸菌ＫＮ０３に伝達する能力を、固体、液体（静的）、攪拌条件下の液体下でアッセイした。

【0130】

ｐＰｉｌＳ及びｐＰｉｌＶ４’の構築と使用。ＴＰ１１４からのｐｉｌＳ遺伝子、ｐＢＡＤ３０からのｏｒｉＶ_p15A−ａｒａＣ−Ｐ_BAD、及びｐＳＢ１Ｃ３からのｃａｔを表２に列挙されたプライマーを用いて増幅し、それらをギブソンアセンブリにより連結することによってプラスミドｐＰｉｌＳを構築した。次に、プラスミドｐＰｉｌＳを、補完実験用にＫＮ０１＋ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳに形質転換した。同様に、ＴＰ１１４からのｐｉｌＶ４’遺伝子、ｐＢＡＤ３０からのｏｒｉＶ_p15A−ａｒａＣ−Ｐ_BAD、及びｐＳＢ１Ｃ３からのｃａｔを表２に列挙されたプライマーを用いて増幅し、それらをギブソンアセンブリにより連結することによってプラスミドｐＰｉｌＶ４’を構築した。次に、プラスミドｐＰｉｌＶ４’を、補完実験用にＫＮ０１＋ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳに形質転換した。ｐｉｌＳ及びｐｉｌＶ４’遺伝子は、ＡｒａＣ⁴⁰の調節下にあり、アラビノース誘導性発現を与える。補完実験を行うため、ドナー株とレシピエント株を３７℃で一晩増殖させた。接合の２時間前に、アラビノースを１％ｗ ／ ｖの最終濃度でドナー株培養物に添加した。次に、各培養物のＯＤ_600nmを測定し、細胞をＬＢ＋１％アラビノースで洗浄した後、ＬＢ＋１％アラビノース中、４０_OD600nmに相当する量に再懸濁した。次に、２．５μＬのドナー株とレシピエント株を互いに混合し、ＬＢ＋１％アラビノースプレートに付着させて固体接合させるか、１９５μＬの予熱したＬＢ ＋ １％アラビノースと混合して液体静止条件及び液体攪拌条件の両方で接合させた。次に、３７℃で２時間交配を行った。さらに、液体攪拌条件下での接合反応を回転攪拌機に入れた。インキュベーション後、交配反応を１０倍段階希釈し、選択培地にプレーティングしてドナー、レシピエント、及び接合完了体のＣＦＵ分析を行った。

【0131】

インビトロ接合アッセイすべてのインビトロ 抱合実験は、実施例Ｉの材料及び方法のセクションに記載されているように実施した。注意すべき点として、攪拌下での液体交配では、細胞混合物を標準的な静的インキュベーションの代わりに、ロータリーミキサー上で３７℃で２時間インキュベートした。

【0132】

高密度トランスポゾン突然変異誘発（ＨＤＴＭ）。接合支援ランダムトランスポゾン突然変異誘発実験を行った。転移システムは、ｐＦＧ０３６（ｃＩ転写リプレッサーをコードするプラスミド）、ｐＦＧ０５１（ｃＩの抑制下のＴｎ５トランスポゾンマシナリー、ＲＰ４ベースの伝達起点及びＳｐ^Rトランスポゾンをコードするｐｉｒ依存性自殺プラスミド）、及びＭＦＤｐｉｒ＋（Ｆｅｒｒｉｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）（ＲＰ４接合マシナリー、ジアミノピメリン酸栄養要求性、及び細胞内でのｐＦＧ０５１の維持に必要なＰｉタンパク質を有する）で構成されていた。これらの各ステップに関与する遺伝子の機能を明確に特定するために、ＨＤＴＭ実験をいくつかの連続したステップで行った。最初に、ｐＦＧ０５１をＭＦＤｐｉｒ＋ からＴＰ１１４を含むＥｃＮへと、３重にＬＢ＋ＤＡＰプレート上で２時間、３０℃で接合して伝達した。ＥｃＮに入ると、Ｔｎ５マシナリーはｐＦＧ０５１から発現され、ＴＰ１１４へのランダムなトランスポゾン挿入を媒介した。次に、接合完了体を複製当たり６枚のプレートに全体的にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、接合完了体クローンは細胞芝生を形成し、これをセルスクレーパーを使用して回収した後、選択用抗生物質を含むＬＢブロスに再懸濁した。次に、変異体ライブラリを形成する接合完了体を洗浄し、４．５ｍＬのＬＢ ＋ ２５％グリセロールに再懸濁し、保存用に凍結した。また、変異体ライブラリ１００μＬをＫＮ０２に対する、次いでＫＮ０３に対する２つの連続接合伝達実験に使用した。どちらもインビトロ及びインビボで平行して行った。

【0133】

インビボＨＤＴＭライブラリ接合のマウスモデル。マウス関連の実験は、わずかな変更を加えて、実施例Ｉの材料及び方法のセクションに記載されているように行った。ドナー株の接種物を、マウスの強制給餌の３〜４時間前に調製した。高密度トランスポゾン変異誘発（ＨＤＴＭ）変異体ライブラリの凍結ストック５００μＬを２０ｍＬの選択用ＬＢブロスに接種し、３７℃で４時間インキュベートしてから強制給餌を行った。準備ができたら、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、６．０ＯＤ_600nmに相当する体積まで濃縮した。マウスに、ドナー株の導入の３時間前にレシピエント株で経口チャレンジした。次に、２４時間及び４８時間で糞便サンプリングを行って接合をモニターした。４８時間後、マウスを屠殺し、盲腸を摘出した。また、接合完了体では、シークエンシング用の接合完了体クローンを多数取得するために、マウス当たり４ ｘ １００μＬもプレーティングした。

【0134】

ＨＤＴＭライブラリのシークエンシング。各試料について、変異体ライブラリの１．５ｍＬの凍結ストックのアリコートを氷上で１５分間解凍した。アリコートを遠心分離し、Ｑｕｉｃｋ ｇＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の細胞溶解バッファー３００μＬに細胞を再懸濁した。ＤＮＡを、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｌｕｓ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用して、４℃で３０秒オン、３０秒オフを１２サイクル行って断片化した。断片化後、細胞懸濁液用のＱｕｉｃｋ ｇＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットのプロトコルに従い、ＤＮＡを５０μＬの分子グレードの水に溶出した。次に、Ｅｎｄ−ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ ＨＣ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用して１０μｇのＤＮＡを末端修復した後、ＡＭＰｕｒｅ ＤＮＡ ＸＰ磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用してＤＮＡを精製した。次に、精製したＤＮＡを、ｄＡＴＰを添加したＴａｑＢ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用して６８℃で３０分間アデニル化し、ＡＭＰｕｒｅ ＤＮＡ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）で再度精製した。次に、ＮｅｘｔｅｒａアダプテーターＢを、２つのオリゴヌクレオチド：５’−ＰＯ₄−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＣ−ＩｎｖｄＴ−３ ’（配列番号９１）及び５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴ−３’（配列番号９２）をアニーリングすることによって作製した。アニーリングは、アニーリングバッファー（１０ｍＭ ＴｒｉｓＮａＣｌ ｐＨ ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の各オリゴヌクレオチド４０μＭを９８℃に加熱してから、４℃に達するまで１０秒ごとに０．１℃ずつゆっくりと下げて行った。ＮｅｘｔｅｒａアダプテーターＢを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用して１６℃で一晩ライゲーションした。ＤＮＡ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用してＤＮＡを再度精製し、Ｖｅｒａｓｅｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を使用してｑＰＣＲマシンでバーコード化を実行した。増幅反応は指数期の終わりに停止した。ＤＮＡを再度精製し、Ｑｕａｎｔ−ｉｔ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＤＮＡアッセイを使用して定量した。増幅された変異体ライブラリの品質及びサイズ分布を、高感度ＤＮＡチップを使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価した。次に、変異体ライブラリをプールし、Ｎｅｘｔｅｒａ技術を使用してＩｌｌｕｍｉｎａによってシークエンシングした。

【0135】

ＨＤＴＭ変異体分析。リードは、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃバージョン０．３２を、パラメータＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：２０及びＭＩＮＬＥＮ：３０で使用して、それら品質及びＮｅｘｔｅｒａ Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターの存在に基づいて最初にトリミングした（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。トリミングの前後のリードの品質を、デフォルトのパラメータを使用してＦａｓｔＱＣで評価した（Ａｎｄｒｅｗ，２０１０）。ＥｃＮの染色体上にマッピングしたリードをフィルターにかけ、残りのリードをＴＰ１１４にマッピングした。これらのアラインメントは、デフォルトのパラメータを用いてＢＷＡ ＭＥＭで行った（Ｌｉ，２０１３）。マッピング品質のスコアが３０未満のアライメントは破棄した。次に、９ｂｐのＴｎ５挿入部位重複の中央の塩基対の位置を用いて、対応するすべてのアラインメントを表した（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。シークエンシングノイズをフィルター除去するため、１つのリードによってのみ表される挿入部位は破棄した。次に、正規化されたリードカウント（ライブラリサイズに基づく）を有する挿入マップを、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｉｎ ａ Ｂｏｘを用いて視覚化した（Ｈａｅｕｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。条件１の遺伝子の不可欠性をマニュアルで検証し、３つの複製すべてでマッピング可能な再現性のある低カバレッジ領域を検索した。次に、各条件について各ＴＰ１１４の遺伝子の正規化されたリードカウント（ライブラリサイズに基づく）を計算することによって、遺伝子カウントテーブルを生成した。遺伝子の最初の５％と最後の１５％の挿入部位は、機能的な遺伝子断片につながる可能性があるため、リードカウントでは考慮しなかった。インビトロ及びインビボ接合に重要な遺伝子を、条件１と試験条件との間の遺伝子リードカウント比に基づいて決定した。遺伝子リードカウント比の計算に使用される式は、以下である：（リードカウントｘ−リードカウント１）／読み取りカウント１。次に、インビトロでの接合（ｔｒａＡＢＣＤＥＧＨＩＪＫ、ｔｒｂＪ、ｎｉｋＡＢ）及びインビボでの接合（ｐｉｌＬＮＯＰＱＲＳＵＶ）に不可欠であると考えられる遺伝子のコアセットを使用して、各条件の最大比の値を設定した。遺伝子数の比が最大値を下回るすべての遺伝子を、特定の条件で必須であるとみなした。

【0136】

２．１−ＴＰ１１４接合プラスミドの比較ゲノミクス
ＴＰ１１４シークエンシングとアノテーション。実施例Ｉにおいて、ＴＰ１１４は、インビボでのＤＮＡカーゴ送達の最も強力な接合プラスミドであることが特定された。したがって、これは、ＣＯＰシステムのトランスファー機構として使用されるうえで最も興味深いプラスミドであった。しかしながら、ＴＰ１１４についてはほとんど知られていない。したがって、インビボでのＴＰ１１４の伝達効率の理解に向けた最初のステップは、その完全な配列を決定することであった。Ｉｌｌｕｍｉｎａ及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングテクノロジーを用いて、大腸菌ＭＧ１６５５株内でＴＰ１１４のシークエンシングを行った。次に、ＩｎｃＩ２プラスミドファミリーからの関連プラスミドＲ７２１へのリファレンスマッピング及びデノボ配列アセンブリなど、いくつかの方法で配列をアセンブルした。次に、ＲＡＳＴを使用してプラスミドに自動的にアノテーションを付け、潜在的なＯＲＦを見つけた。次に、配列相同性に基づいてＲ７２１からのアノテーションと比較することにより、アノテーションを修正した。Ｒ７２１上の遺伝子に対して９８％を超えるヌクレオチド相同性を有する遺伝子に、プラスミド間で一貫するように再びアノテーション付けした。次に、ＴＰ１１４の完全な配列及びアノテーションをアクセッション番号ＭＦ５２１８３６．１でＧｅｎｂａｎｋに提出した。プラスミドＴＰ１１４は、９２個のＣＤＳを含む６４，８１８ｂｐの長さであり、平均Ｇ＋Ｃ比率は４３％である。機能的相同体を見つけるためにＢＬＡＳＴｎ及びＣＤｓｅａｒｃｈを使用してＴＰ１１４の遺伝子を、さらに特徴付けた。接合プラスミドはモジュール式である傾向があるため、各遺伝子を特定の機能（ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、交配ペアの安定化、維持、調節、選択、及び不明な機能）を有する特定のモジュールに帰属させた。次に、遺伝子をＴＰ１１４にマッピングして、ＴＰ１１４の遺伝子の第１のグラフィカルマップを生成した（図７）。

【0137】

ＴＰ１１４遺伝子保存分析。接合プラスミド上に存在する特定の遺伝子の重要性を決定する１つの方法は、その遺伝子の保存を分析することである。遺伝子の保存は、密接に関連する接合プラスミドに対する配列相同性によって評価することができる。幸いなことに、接合プラスミドは、同じ細胞内で安定して維持される能力、または同じバクテリオファージの標的となりうる能力に基づいて、不和合性ファミリーに分類されている。２つのプラスミドが同じホストを共有できないことは、複製タンパク質配列間の類似性にしばしば関連している。したがって、ＴＰ１１４の複製タンパク質の一次配列は、ＩｎｃＩ２プラスミドサブファミリーに属するＲ７２１のものと高度に類似しているため、ＴＰ１１４はＩｎｃＩ２プラスミドとして分類されている。ＩｎｃＩプラスミドファミリーはＩｎｃＩ１とＩｎｃＩ２の２つのサブファミリーに分けられ、両方のグループがどれだけ配列相同性を共有しているかは未だに不明である。したがって、比較ゲノミクス分析は、両方のプラスミドサブファミリーで行った。ＩｎｃＩ１及びＩｎｃＩ２サブファミリーの７つのプラスミドを、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）で全ゲノム配列が利用できるかどうかに基づいて選択した（表５）。次に、これらのプラスミドを、スタンドアロンのＢＲＩＧソフトウェアを使用したＴＰ１１４との相同性分析のデータベースとして使用した。ＴＰ１１４の遺伝子は、ほとんどの場合、核酸レベルとアミノ酸レベルの両方で、ＩｎｃＩ２プラスミド全体で高度に保存されていた（図８Ａ及び図８Ｂ）。これは、ほとんどのＩｎｃＩ２プラスミドが、インビボでＤＮＡを効率的に伝達するＴＰ１１４の能力を共有できることを示唆した。ＩｎｃＩ１プラスミドに対する相同性は、核酸レベルとアミノ酸レベルの両方で極めて乏しかった（図８Ｃ及び図８Ｄ）。ＩｎｃＩ１グループとＩｎｃＩ２グループの間で遺伝子機能は類似しているものの、これら２つのサブファミリー間では高い配列の相違が見られた。したがって、遺伝子保存の分析では、ＩｎｃＩ１グループとの配列相同性が低すぎたことから、ＩｎｃＩ２サブファミリーのみを考慮した。遺伝子は、コア、ソフトコア、アクセサリーの３つのグループに分類した（表６）。コア遺伝子がＩｎｃＩ２ファミリーのすべてのプラスミドで保存されていたのに対して、ソフトコア遺伝子はプラスミドの５０％以上で保存されていた。最後に、遺伝子がプラスミドの５０％未満に存在する場合、遺伝子をアクセサリーとみなした。

【0138】

【表5】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【0139】

交配ペア安定化モジュールをコードしたＴＰ１１４。Ｉ−ｃｏｍｐｌｅｘプラスミド（ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）、ＩｎｃＩ１、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＫ、ｉｎｃＺなど）に共通する興味深い特徴の１つに、機能性ＩＶ型線毛（Ｔ４Ｐ）をコードする遺伝子の存在がある（Ｓｅｋｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。Ｉ−ｃｏｍｐｌｅｘの他のプラスミドで観察されたように、ＴＰ１１４は従来のＴ４ＳＳから独立したＴ４Ｐをコードしていた。このような装置は、レシピエントの膜に直接結合し、線毛を引っ込めることでドナー／レシピエントの直接的な接触を促すことにより、交配ペア安定化を改善すると考えられている（以下、交配ペア安定化モジュールと呼ぶ）（Ｂｒａｄｌｅｙ，１９８４）。Ｔ４Ｐをコードすることが知られているプラスミドファミリーはごくわずかである（例：ＩｎｃＩ１（Ｉｓｈｉｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＩｎｃＩ２（Ｓｅｋｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ＩｎｃＢ ／ Ｏ（Ｉｎｃ１０）（Ｐａｐａｇｉａｎｎｉｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ＩｎｃＫ（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、及びＩｎｃＺ（Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３））。

【0140】

２．２−ＴＰ１１４の高密度トランスポゾン突然変異誘発。

【0141】

ＨＤＴＭ実験計画。ＴＰ１１４遺伝子の機能を完全に特徴づけるため、いくつかのＨＤＴＭ実験が必要とされた。そこで、ＨＤＴＭを説明するスキームを、実験の範囲を完全に理解するために提示する（図９）。ＨＤＴＭステップ１は、ＴＰ１１４変異体の完全なライブラリを生成した。この時点で、トランスポゾンが細胞内の短期間のプラスミド維持に必要な遺伝子を破壊すると、プラスミドの喪失につながる。抗生物質を使用してＴＰ１１４とＴｎ５トランスポゾンについて選択することにより、プラスミドを失った細胞は生存しなくなる。したがって、必須の維持遺伝子内にＴｎ５を挿入すると、それらの遺伝子の配列の決定が妨げられ、遺伝子座のカバレッジが低くなる。次に、このＨＤＴＭライブラリ１を、一方はＴＰ１１４ ：： Ｔｎ５をインビトロでの固体交配によって伝達させ（ステップ２）、もう一方はインビボで交配を行う（接合完了体が糞便から得られる場合はステップ４、接合完了体が盲腸から回収される場合はステップ６）、２つの異なる接合実験で使用した。ＨＤＴＭライブラリ２によりインビトロでの接合に不可欠な遺伝子が明らかとなったのに対して、ＨＤＴＭライブラリ４と６によりインビボでの接合に不可欠な遺伝子が明らかとなった。これにより、両方の環境で必要とされる遺伝子と１つの特定の環境でのみ必要とされる遺伝子とを区別することができた。ＨＤＴＭライブラリ２を、さらに、インビトロ （ステップ３）及びインビボ（糞便から抽出された接合完了体ではステップ５、及び盲腸から抽出された接合完了体ではステップ７）の２つの補助的交配実験においてドナーとして使用した。この２回目の伝達は、Ｔｎ５トランスポゾンによって不活性化されると接合効率にプラスの効果をもたらす遺伝子を濃縮すると予想される（例、転写抑制因子）。さらに、２回目の伝達ステップでは、最初のドナー細胞を希釈することでバックグラウンドが最小限に抑えられている。最後に、ＨＤＴＭステップ８では、改変されたＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢのＨＤＴＭライブラリ２への伝達を必要とした。同じ不和合性ファミリーの接合プラスミドは、通常、排斥と呼ばれるメカニズムによって別の関連するプラスミドの獲得を防ぐことができる。ＴＰ１１４は排斥を媒介することができるため、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢは、排斥関連遺伝子（複数可）がＴｎ５トランスポゾンによって破壊された場合にのみ細胞に入ることができる。

【0142】

ＨＤＴＭ分析の考慮事項。ＨＤＴＭ変異体ライブラリの分析により、ＴＰ１１４でｂｐ当たり９．６８個の挿入の平均カバレッジが明らかになった。この高解像度により、最小のアノテーション付きＴＰ１１４遺伝子の不可欠性を評価することが可能となった。しかしながら、ＴＰ１１４は、リードをマッピングすることができない繰り返し領域（０マッピング可能領域と呼ばれる）を含む７個の遺伝子のセットをコードしている（表７）。これらの遺伝子は過小に存在しているように見えたが、必ずしも必須ではなく、マッピング可能な遺伝子の部分のみを考慮して分析した。ＨＤＴＭ実験では、ドナーＤＮＡ汚染の可能性も考慮した。ＨＤＴＭライブラリを用いて連続伝達実験を行うことにより、バックグラウンド汚染が大幅に減少し、一貫した結果が示された。そのため、ＨＤＴＭライブラリ２からＨＤＴＭライブラリ３へのバックグラウンドレベルの明らかな低下が見られ、ライブラリ間で一貫した結果が観察された（図１０）。ＨＤＴＭ分析では、多数の複製及び条件を利用することで条件間及び生物学的複製間のリードカウントの比較も可能であった。複製間及び条件間の類似性はピアソン相関によって評価し、相関の高い複製と異なる条件間の弱い相関が明らかになった（図１１）。異なる条件は変異体の集団に異なる選択圧力をかけることからこの種の分布が予想され、特定の条件ごとに最適なフィットを有する変異体が選択された。ＨＤＴＭライブラリ４及び６のマウス群Ｃからの複製のみが他のマウスとの相関が弱く、分析から除外した。

【0143】

【表7】

【0144】

ＨＤＴＭによって、ＴＰ１１４の複製と維持に関する重要な機能が特定された。ＨＤＴＭの最初のステップは、すべての遺伝子に挿入を有する変異ライブラリを生成することであった（ライブラリ１）。この設定では、ＴＰ１１４の複製と維持に重要な配列への挿入のみが、生存不能なクローンを生成するはずである。したがって、複製に重要な遺伝子は、他の遺伝子と比較して、リードカバレッジで過小に表現されているはずである。疑われるように、再現可能に過小に表現された６個の遺伝子のコアセットを除いて、ほとんどの遺伝子は高い挿入カバレッジを有していた（図１２）。とりわけ、ｒｅｐＡ はプラスミド維持の重要な因子であることが既に疑われており、ａｐｈ−ＩＩＩ 遺伝子は接合完了体の選択に使用されるため、不可欠と考えられる。複製と維持に不可欠な遺伝子のリストを表８に示す。これらの遺伝子のほとんどは、維持モジュールの一部であることが既に疑われているか、またはＩｎｃＩ２ファミリーで高度に保存されている。しかしながら、プラスミドの維持への関与が予測されたｙｇｉＡ （ＴＰ１１４−００６）、ｙｄｉＡ （ＴＰ１１４−０３５）、ｙｄｇＡ （ＴＰ１１４−０３６）、ｔｒａＬ （ＴＰ１１４−０４４）、及びＴＰ１１４−０７２は、ＨＤＴＭによって重要ではないことが判明した。これらの遺伝子は、機能的な冗長性のため、大腸菌内のプラスミド維持に必要ではない可能性があったが、他の宿主種でのプラスミド維持に関与している可能性があった。ｔｒａＬのようないくつかの遺伝子は、接合プラスミドの別の機能に関与している可能性がある。それにもかかわらず、遺伝子機能の予測は、ＨＤＴＭの結果とほぼ一致していた。

【0145】

【表8】

【0146】

固体培地でのインビトロ接合に不可欠なＴＰ１１４遺伝子の特定。固体培地上でのインビトロ交配における遺伝子の重要性を、遺伝子カウント比によって評価した。遺伝子カウント比は、特定の遺伝子に２つの異なるコンテキストでマッピングされるリードの数を比較することによって計算した。簡単に言えば、インビトロでの接合伝達の後に過小に発現された遺伝子（ライブラリ１と比較してライブラリ２及び３）は、負の遺伝子カウント比を示した。遺伝子の不可欠性を評価し、バイアスを説明するため、接合に不可欠であると予測された遺伝子のセット（ｔｒａＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫ、ｔｒｂＪ、ｎｉｋＡＢ）を使用して、不可欠遺伝子の最大及び平均の遺伝子カウント比を評価した。ただし、ｔｒａＦは遺伝子カウント比が高く、外れ値とみなし、接合には不可欠ではないものとみなした。ＨＤＴＭライブラリ２と３の両方について遺伝子分布をプロットし（図１３）、最大遺伝子カウント比の値を下回るすべての遺伝子を、特定のライブラリにおいて接合に不可欠であるものとみなした。プラスミドの維持に関与しているものとすでに決定されている遺伝子は破棄した。インビトロでのＴＰ１１４接合に不可欠な遺伝子のリストを表９に示す。

【0147】

【表9】

【0148】

インビボでのＴＰ１１４接合に重要な遺伝子の特定。ＴＰ１１４のインビボ接合のための遺伝子の不可欠性の分析を、インビトロ分析と同様に行った。ただし、ｐｉｌ遺伝子はインビボ 接合においてのみ不可欠であることが明らかだったため、最大遺伝子カウント比を固定するために用いたセットは、ｐｉｌＬＭＮＯＰＱＲＳＴＵＶで構成した（図１４）。ｐｉｌＭ及びｐｉｌＴ遺伝子は、外れ値であったため、セットから除外した。少なくともＨＤＴＭライブラリ５及び７においてインビボでのみ重要であると疑われている遺伝子を使用することが重要であった。実際、ＨＤＴＭライブラリ５及び７はＨＤＴＭライブラリ２のインビボ接合によって生成され、ＨＤＴＭライブラリ２はＨＤＴＭライブラリ１のインビトロ伝達から生成される。このように、最初のインビトロ交配はインビトロで伝達できるプラスミドに強い選択圧力をかけ、インビトロで不可欠の遺伝子はインビボでも不可欠であり得るため、これらの遺伝子を播種することによってインビボでのみ不可欠である遺伝子の大部分が除外された。しかしながら、合計１２匹のマウスを含む４つの異なる条件をインビボ接合に用いたため、遺伝子の不可欠性は、同じまたは異なる条件からの複製間の一貫性によって評価することもできる。インビボ条件のいずれかのしきい値を下回った遺伝子を表１０に示す。しかしながら、プラスミドの維持に重要であることがすでに証明されている遺伝子は、遺伝子カウント比が０による除算につながることが多いため、この表には含まれていない。インビボ接合のドナー細胞としてＨＤＴＭライブラリ１を使用した場合（条件４及び６）、糞便試料において４０個の遺伝子が不可欠であり、盲腸試料において３６個が不可欠であることがわかった。これらの遺伝子のうち、３１個が両方の条件で共有されていた。これと一貫して、インビボでのＨＤＴＭライブラリ２の接合（条件５及び７）では、糞便試料において４０個の遺伝子が重要であり、盲腸試料では３７個の遺伝子が重要であることがわかり、３３個の遺伝子が共有されていた。合計で４０個の遺伝子が少なくとも１つの条件で重要であることがわかり、そのうち３１個がすべての条件で共有されていた。興味深いことに、インビトロ接合に重要な遺伝子のほとんどはインビボ接合にも重要であった。条件５及び７はインビトロ伝達に従うため、これは予想されたことである。さらに、ｐｉｌ 遺伝子のほとんどはインビボ伝達に不可欠であったが、ｐｉｌＭとｐｉｌＴは２つの唯一の例外であった。

【0149】

【表10-1】

【表10-2】

【0150】

ＴＰ１１４は、接合に重要な遺伝子のコアセットを有していた。多数の生物学的複製でＨＤＴＭを行うことにより、信頼水準をＴＰ１１４の異なる機能に対する各遺伝子の重要性に帰することができた（表１１）。信頼水準は結果の再現性に基づいており、＋＋が最高の信頼水準であり、−が最低である。プラスミドの維持については、信頼水準は他の条件とは異なる原因に帰された。＋＋の信頼水準は、遺伝子がすべての複製で不可欠であることを意味し、−は、少なくとも１つの条件において不可欠ではなかったことを意味した。他のすべての条件の場合、信頼水準は条件間の再現性の程度に基づいており、＋＋は、遺伝子がすべての条件で不可欠であったことを意味し、＋は、１つの条件でのみ不可欠であったことを意味し、−は不可欠ではなかったことを意味する。

【0151】

【表11-1】

【表11-2】

【表11-3】

【表11-4】

【0152】

ＴＰ１１４の交配ペア安定化モジュールのインビボ接合における不可欠性の確認。インビトロでの交配ペア安定化におけるＴ４Ｐ（ｐｉｌ遺伝子）の役割が、ＩｎｃＩ２ファミリーの別のモデルプラスミドであるＲ７２１で疑われた。しかしながら、ＴＰ１１４のＨＤＴＭデータは、Ｔ４Ｐの形成に関与することが予想される遺伝子は、インビボでの伝達に不可欠であることを示唆した。このことは、Ｔ４Ｐが固体交配ではインビトロで必要とされないこと、そして環境条件の違いがＴ４Ｐをインビボで不可欠なものにすることを意味した。この仮説を確認するには、Ｔ４Ｐ機能を完全に無効化することが望ましい。プレピリン遺伝子ｐｉｌＳは、ＨＤＴＭデータがインビボ伝達におけるこの遺伝子に対する強い依存性を明らかにし、また、Ｔ４Ｐの構造におけるその重要な役割のため、最初に欠失の候補として選択した。プレピリンはＴ４Ｐを形成する主要なサブユニットであり、最初に特定のペプチダーゼによってピリンにプロセスされた後、分泌されて線毛に組み立てられる。したがって、ｐｉｌＳを欠失させると、線毛の形成が無効化され、そのアセンブリが妨げられることが予想される。ｐｉｌＳ遺伝子を、組換えアプローチを用いてＴＰ１１４から欠失させた。次に、得られたＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔを、さらなる試験を行うためにＫＮ０１内に固体交配接合によって伝達させた。そのように、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔを、固体、液体、及び液体攪拌条件でＫＮ０１からＫＮ０３に接合するその能力について試験した（図１６Ａ）。固体交配においてＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔが伝達する能力は変化しなかったのに対して、液体中では攪拌を行った、または行わない場合に伝達効率の急激な低下が観察された。これは、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔの接合効率が、野生型ＴＰ１１４と比較して不安定な条件下で損なわれたことを示唆している。トランスで ｐｉｌＳを発現するプラスミドｐＰｉｌＳを用いた補完は、接合率の有意な回復をもたらした。腸管内での接合におけるＴ４Ｐの関与を試験するため、マウスモデルを用いて接合実験を行った。合計で５匹のＳＭ処置したマウスに、最初にレシピエント株としてのＫＮ０３を、次いでドナーとしてのＫＮ０１＋ＴＰ１１４またはＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔを与えた。接合効率を、４日間連続して糞便を収集することでモニターした（図１７Ａ）。４日目にマウスを屠殺して糞便と盲腸に見られる接合効率を比較した（図１７Ｂ）。野生型ＴＰ１１４はその予想された頻度（＞１０^-1）で接合することができたが、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＳ：：ｃａｔ はインビボで伝達できなかった。これは、インビボ接合におけるＴＰ１１４のＴ４Ｐの重要な役割を示し、ＩｎｃＩ２接合プラスミドにまたがったＴ４Ｐの保存を説明する可能性がある。

【0153】

ＴＰ１１４におけるｐｉｌＶアドヘシン変異体とシャフロンの役割。ＨＤＴＭデータは、ｐｉｌＶのＮ末端部分のみがインビボ接合に不可欠であることを示したが、これは実際にはＨＤＴＭ法のアーティファクトであることが疑われた。この変則的な結果は、ｐｉｌＶのＣ末端にシャフロンが存在し、これが遺伝子の末端を再編成していくつかの変異体を生成することによる。ｐｉｌＶ遺伝子は、ドナー細菌によるレシピエント細胞の認識に関与していると考えられているアドヘシンをコードしている。アドヘシンはＴ４Ｐの先端に存在して接触を確立し、２個の細胞間の相互作用を安定させると考えられている。したがって、シャフラーゼを欠失させてシャフロンをＴＰ１１４Δｒｃｉ内での安定したコンフォメーションに固定した。次に、インビボ接合におけるｐｉｌＶとシャフロンの役割を評価するために、最初の実験でｐｉｌＶ遺伝子全体を欠失させてＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ−ｒｃｉを作製した。別の変異体では、シャフロンのみをＦｌａｇタグに置き換え、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン−ｒｃｉ：：ｃａｔさらに別の一連の変異体において、ｐｉｌＶ遺伝子変異体を特定のコンフォメーションに固定した（ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ１−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ２−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ５−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ５’−ｃａｔ）。これは、ｐｉｌＶのＣ末端部分がＰｉｌＶを介した接着に不可欠であるかどうかを試験し、異なるｐｉｌＶ変異体の重要性を解明するために行った。そのため、ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ−ｒｃｉ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン−ｒｃｉ：： ｃａｔ、及びすべての固定されたｐｉｌＶ変異体をＫＮ０１に伝達して、交配ペア安定化におけるそれらの役割を試験した。各コンストラクトを、固体、静的液体及び攪拌液体条件下での接合によってＫＮ０３レシピエント細菌に伝達させた。ｐｉｌＶアドヘシンは、両方の液体条件での接合に不可欠であることがわかり、交配ペア安定化におけるアドヘシンの役割が確認された（図１６Ｂ）。より正確には、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン−ｒｃｉ：：ｃａｔ が固体支持体上で接合する能力は、コントロールと比較してわずかに低下したが、液体中で接合する能力（攪拌のあるなしによらず）は完全に無効化された（図１６Ｂ）。これは、ＨＤＴＭデータによって示唆された結果とは異なり、ｐｉｌＶのＣ末端部分が機能的なアドヘシンを生成するうえで不可欠であることを示した。さらに、２つの大腸菌細胞間でのＴＰ１１４ ｐｉｌＶ変異体の伝達が固体培地上のすべてのｐｉｌＶの形態で高い接合効率をもたらしたのに対して（図１６Ｃ）、一部の変異体のみ（すなわち、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４−ｃａｔ、及びＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４’−ｃａｔ）が、静的液体（図１６Ｄ）及び攪拌液体条件（図１６Ｅ）で交配ペア安定化及び接合をもたらした。これは、ｐｉｌＶ 変異体が細菌の表面の異なる構造を認識し、プラスミド伝達にこれらの相互作用が必要であることを示した。このように、変異体ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ３’−ｃａｔ、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４−ｃａｔ、及びＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４’−ｃａｔがＥｃＮの表面に存在する構造、おそらくはリポ多糖、を認識したのに対して、他の変異体はＥｃＮ上に見られない構造を認識した。この相互作用がインビボでの接合に必要であることを確認するため、ＥｃＮを認識する（ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：： ｐｉｌＶ４’−ｃａｔ）、または認識しない（ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：： ｐｉｌＶ１−ｃａｔ）１つの変異体であるｐｉｌＶ欠失変異体ＴＰ１１４ΔｐｉｌＶ−ｒｃｉを、レシピエントとしてＫＮ０３を用いたインビボ接合アッセイに使用した（図１７Ｃ）。このアッセイでは、唯一、ＴＰ１１４ｐｉｌＶΔシャフロン：：ｐｉｌＶ４’−ｃａｔのみがインビボで接合を行うことができ、レシピエント細菌の表面へのＰｉｌＶアドヘシンの結合がインビボでの接合に必要であることが確認された。

【0154】

ＴＰ１１４の排斥タンパク質の同定。排斥と不和合性は、２つのプラスミドが同じ細胞を共有することを妨げる２つのメカニズムである。不和合性は受動的であり、２つの複製または維持システムが類似しすぎている場合に生じるのに対して、排斥は、細胞間接触またはレシピエントへのＤＮＡ侵入を防ぐ能動的なメカニズムである。ＴＰ１１４における排斥の存在と範囲を最初に検証した。これを行うため、６つの異なる接合プラスミドを有するＫＮ０２からＫＮ０１への接合実験を行った。選択されたプラスミドは６つの不和合性ファミリーにまたがり、それらのファミリーを最初に不和合性と排斥に基づいて分類した。ＴＰ１１４のみが独自の排斥を媒介できるはずである。予想された通り、排斥現象は、ＴＰ１１４がＴＰ１１４を有するレシピエントに伝達する場合にのみ観察された（図１８Ａ）（図１８Ｂ）。しかしながら、この実験では、不和合性を維持及び排斥と区別することはできなかった。これは、ＴＰ１１４のＴ４ＳＳを乗っ取って接合する能力を有するが、完全に異なる複製メカニズムを使用する可動性プラスミドｐＣｌｏＤＦ１３を使用して解決した。図１８Ｂに示されるように、ＴＰ１１４とｐＣｌｏＤＦ１３の両方の排斥率は類似しており、ＴＰ１１４が排斥されることが証明された。この耐性メカニズムを特徴付ける最終的な試みとして排斥実験をインビボで行い、ＫＮ０１＋ＴＰ１１４及びＫＮ０２＋ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢを接合ペアとして使用した。この環境では排斥はさらにストリンジェントであり、４日間で接合完了体を生成することはほとんどなかった（図１８Ｃ）。注目すべき点として、結果は糞便と盲腸とで一貫していた（図１８Ｄ）。ＨＤＴＭライブラリ２を使用して、排斥の原因となる遺伝子を調べた。ＨＤＴＭの最終ステップでは、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢをＨＤＴＭライブラリ２に伝達させ、接合完了体をシークエンシングした。ほとんどの接合完了体では、これまで機能が不明であった遺伝子であるＴＰ１１４−００５にトランスポゾンが挿入されていた（表１２）。排斥タンパク質がＴＰ１１４−００５であることを確認するため、ＨＤＴＭライブラリ８からのクローンを最初にＭＧ１６５５Ｎｘ^Rに伝達させ、次にＫＮ０２に戻した。インビトロ 接合効率によりＴＰ１１４は細胞の１％に伝達することができるため、２ラウンドの連続した伝達を用いることで、ＴＰ１１４ ：： Ｔｎ５クローンが分離され、それにより、同じレシピエント細胞への伝達が最小限に抑えられる。また、排斥が不充分な場合でも、不和合性は、維持不和合性メカニズムを通じて、同じ細胞内のＴＰ１１４の２つの異なるクローンの持続を防ぐはずである。ＴＰ１１４−００５への挿入はより高頻度であるため、それらも容易に分離されるはずである。ＴＰ１１４ ：： Ｔｎ５の３つのクローンの排斥能力を、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢをＫＮ０１からＫＮ０２に伝達させることによって試験した。高い接合頻度（図１９Ａ）及び排斥率（図１９Ｂ）によって示されるように、ほとんどのクローンは排斥を行うことができなかった。予期せざる点として、これらのクローンが接合する能力を試験している間、排斥不全クローンは野生型ＴＰ１１４よりも約１０倍効率的であった（図１９Ｃ）。したがって、ＴＰ１１４−００５遺伝子及び対応するタンパク質が排斥プロセスに関与しているものと理解される。

【0155】

【表12】

【0156】

ＴＰ１１４の接合に有害な影響を与える遺伝子の同定。ＨＤＴＭ実験は、ＴＰ１１４の接合伝達の頻度を制限する遺伝子を発見するうえで役立った。これらの遺伝子は、各伝達ステップの後にカウント比が増加した遺伝子を調べることによって決定することができる。本発明者らの実験では、２個の遺伝子のみがインビトロとインビボの両方でＴＰ１１４の伝達に有害であることがわかった。これらの遺伝子は、ＴＰ１１４−００５（以前は排斥タンパク質として同定されていた）及び ｙａｅＣ （ＴＰ１１４−０７０）であった（図２０）。興味深い点として、遺伝子機能分析により、ｙａｅＣは 、接合プラスミドのＩｎｃＦファミリーの遺伝子を抑制する転写因子であるｆｉｎＯホモログであることが明らかになった。したがって、ｙａｅＣ遺伝子は、インビトロ及びインビボの両方でＴＰ１１４の伝達を制限する転写抑制因子である可能性が最も高い。この遺伝子の欠失が、インビトロ及びインビボの両方でＴＰ１１４の伝達を向上させるうえで望ましいと考えられる。

【0157】

実施例ＩＩＩ−ＴＰ１１４に由来する接合送達システムの構築
菌株、プラスミド及び増殖条件。本実施例で使用されるすべての菌株とプラスミドを表１に示す。すべてのプラスミド配列は、配列の付録に記載されている。本実施例で使用されるオリゴヌクレオチドは表２に示される。株の増殖条件、ＤＮＡ操作、プラスミド構築、リコンビニアリング、及び常法の形質転換の詳細は、実施例Ｉの材料と方法のセクションに記載されている。

【0158】

ローディングドックｐＲＥＣ１の構築。ｐＲＥＣ１は、ローディングドックカセットを増幅し、これを１つの簡単なステップで伝達マシナリーに挿入するための鋳型として使用されるプラスミドである。この例では、ｐＲＥＣ１を使用して、ＴＰ１１４伝達マシナリーにローディングドックを挿入した。これを行うため、ｐＲＥＣ１を最初にギブソンアセンブリによってプラスミドにアセンブルした（ ｐＦＧ０１８ からのｔｅｔＢ耐性遺伝子とｐＫＤ４からの ｏｒｉＶ_R6K を増幅する）。ＦＲＴ及び ａｔｔＰ_Bxb1部位をプライマーアセンブリテールによって与えた。得られたプラスミドｐＲＥＣ１（図２１Ｃ）を、その後のＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＦＲＴ−ｔｅｔＢ−ａｔｔＰ_Bxb1 カセットをリコンビニアリングによってＴＰ１１４に挿入し、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ プラスミドを作製した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。これにより、このバージョンのＴＰ１１４を、ＤＲＯＩＤ（Ｄｏｕｂｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｏｐｅｒａｔｅｄ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ）（ＤＮＡのダブルリコンビナーゼ操作による挿入）による遺伝子カーゴの挿入に使用することができる。

【0159】

ｐＢＸＢ１の構築。プラスミドｐＢＸＢ１はインテグラーゼＢｘｂ１を含み、ｐＳＢ１Ａ３からのｏｒｉＶ_pMB1及びアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）、及びｇＢｌｏｃｋ−ＢｘｂＩからのＢＬＡインテグラーゼ遺伝子を増幅することによってアセンブルした（図２１Ｄ）。Ｂｘｂ１インテグラーゼのプロモーターは、Ｂｘｂ１インテグラーゼの構成的発現を可能にする。２つのＰＣＲ産物をＳＰＲＩによって精製し、ｐＢＸＢ１をギブソンアセンブリによって構築した後、化学的にコンピテントなＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋に形質転換した。

【0160】

ダブルリコンビナーゼ操作挿入ＤＮＡ（ＤＲＯＩＤ）。同じベクター上で遺伝子カーゴと伝達マシナリーとを組み合わせるために、ここではＤＲＯＩＤと呼ばれる新しいプロセスが開発された（図２２Ａ）。この例では、ＤＲＯＩＤ法を使用して、プラスミド複製を不安定にすることなく２個のＤＮＡ分子を結合した。ＤＲＯＩＤ法では、両方のＤＮＡ分子に特定の組み込み部位と組換え部位が含まれている必要がある。伝達マシナリーの場合、組換え部位は、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢのｔｅｔＢインサートに存在するローディングドックによって与えられる（図２２Ｂ）。遺伝子カーゴの場合、組換え部位は、挿入デバイス」（図２１ＡＢ）と呼ばれる一時的な骨格内にそのアセンブリ時に与えられ、挿入デバイスはＤＲＯＩＤ手順中に除去される。ｐＢＸＢ１及び遺伝子カーゴ挿入デバイスの１つを、エレクトロポレーションによって同じＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋株に形質転換した。次に、改変されたＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢを、３０℃での接合により、ｐＢＸＢ１とＫｉｌｌ１または３挿入デバイスの一方とを含むＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋に伝達した。インテグラーゼは構成的に発現されるため、組み込みを促進するには単一の継代培養ステップで充分である。得られたプラスミドＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ−Ｋｉｌｌ１または３を次に 大腸菌 ＭＧ１６５５Ｎｘ^Rへの接合によって伝達した。遺伝子カーゴからとＴＰ１１４ ：： ｔｅｔＢからの選択モジュールを有する接合完了体を選択した。この時点から、菌株を３７°Ｃで培養して、ＴＰ１１４を不安定化させる可能性のある組み込まれた遺伝子カーゴからの熱感受性複製起点（ｏｒｉＶ_pSC101ts）の活性化を回避した。次いで、大腸菌 ＭＧ１６５５Ｎｘ^R＋ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ−Ｋｉｌｌ１または３をエレクトロポレーションによってｐＣＰ２０で形質転換した。ｐＣＰ２０は、リコンビニアリングカセット内のＦＲＴ部位及び遺伝子カーゴ内のＦＲＴ部位の両方を認識するＦＬＰリコンビナーゼを発現し、これらを再結合してｔｅｔＢ、ａｔｔＬ_bxb1部位、及び挿入デバイスを構成するｏｒｉＶ_pSC101tsをノックアウトする（図２２Ａ）。インサートの完全性を、ＴＰ１１４、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ （図２２Ｂ）、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ−Ｋｉｌｌ１（図２２Ｃ）、及びＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１（図２２Ｄ）についてＰＣＲにより評価した（ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３についてのデータは示されていない）。ＤＲＯＩＤ技術は、大きなコンストラクトの染色体挿入や非常に大きなプラスミドまたは外因性染色体のアセンブリなど、いくつかの用途にも速やかに適応させることができる。

【0161】

Ｃａｓ９テスト遺伝子カーゴ挿入デバイスの構築。ｃａｓ９とｇＲＮＡ（複数可）をコードする２つの遺伝子カーゴを、ＤＲＯＩＤ法を用いて伝達マシナリーに挿入した。このような大規模な遺伝子クラスターのアセンブリは通常複雑であり、複数のステップが必要であるが、ＤＲＯＩＤによるアプローチはプロセスを大幅に簡素化するものである。ｃａｓ９−ｇＲＮＡ遺伝子クラスターの最も重要な側面の１つは、高度に特異的なｇＲＮＡを設計することである。そのようなｇＲＮＡｓを設計するため、ＤＮＡ２．０（ＡＴＵＭ）ウェブベースのソフトウェアを、標的配列としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を、オフターゲット配列として大腸菌Ｋ−１２のゲノムを使用して実行した。次に、最も強力なｇＲＮＡスペーサー（最高の ΔＧ、最低のオフターゲット）を 腸内細菌科及びＥｃＮゲノムに対してＢＬＡＳＴｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）にかけ、オフターゲットの高い候補ｇＲＮＡを除去した。このバイオインフォマティクス戦略により、３つのｇＲＮＡ（すなわちｇＲＮＡ １、２、及び３）が同定された（図２１ＦＧ）。遺伝子カーゴを、２段階のアプローチで伝達マシナリーベクターに導入した。これを行うため、対応するプライマー（表２）を使用して、ｐＫＮ０２のｃａｓ９遺伝子、ｐＫＤ４のカナマイシン耐性カセット、及びｐＧＲＧ３６のｏｒｉＶ_pSC101tsを組み合わせて第１のプラスミドを作製した。ｇＲＮＡ１の全体を前のコンストラクト（ｐＫＮ０２）から増幅し、ｇＲＮＡ２及び３スペーサーをＰＣＲプライマー中に直接付加した。ｇＲＮＡ１（Ｋｉｌｌ１）とともにｃａｓ９遺伝子を含む第１の遺伝子カーゴを作製した。ｇＲＮＡ１、２、及び３（Ｋｉｌｌ３）とともにｃａｓ９遺伝子をコードする別の遺伝子カーゴも得た。遺伝子カーゴＫｉｌｌ３では、遺伝子座の反復的性質によるミスアセンブリを防ぐため、各ｇＲＮＡ間にアセンブリタグを配置した。他の断片の連結は、ｇＲＮＡ１とｏｒｉＶ_pSC101tsとの間のＦＲＴ部位、及びｏｒｉＶ_pSC101tsとｃａｓ９との間のａｔｔＰ_bxb1部位などの短い配列のプライマーテール中への付加を容易にした。どちらの遺伝子カーゴ挿入デバイスもギブソンアセンブリによって構築した。すべてのｇＲＮＡ配列を、サンガーシークエンシングによって確認した（データは示さず）。Ｋｉｌｌ１とＫｉｌｌ３の完全なプラスミドマップをそれぞれ図２１Ａと２１Ｂに示す。

【0162】

インビトロ接合アッセイ実施例Ｉの材料及び方法のセクションに記載されているようにして、インビトロ接合実験を行った。

【0163】

クロラムフェニコール耐性シトロバクター・ロデンティウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）の生成。ｐＧＲＧ３６の使用及びＴｎ７を介したＤＮＡの挿入に関する詳細は、実施例Ｉの材料及び方法のセクション及び図１に示されている。詳細には、組み込みプラスミドｐＧＲＧ３６−ＳｍＣｍを、エレクトロポレーションにより Ｃ．ロデンティウム（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）に形質転換した。ｇｌｍＳ遺伝子のターミネーターへのカセット挿入を媒介するため 、Ｃ．ロデンティウム（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）ＤＢＳ１００を、ＯＤ_600nm０．６となるまでアラビノースを含むＬＢ中で３０℃で最初に培養した。次に、細胞に４２℃で１時間ヒートショックを与え、３７℃で一晩インキュベートしてプラスミドをクリアランスさせた。次に、細胞をＬＢ寒天プレート上にストリークし、インサートのみを選択した。表２のプライマーｏＧＳＣ６−Ｆ、ｏＧＳＣ６−Ｒ、ｏＧＳＣ５−Ｆ、ｏｐｉｒ３−Ｆ、及びｏｐｉｒ３−Ｒを使用して、プラスミドのキュレーションとゲノムへのカセットの挿入を確認した。

【0164】

ｐＮＡ２２、ｐＮＡ２３及びｐＮＡ２４の構築と試験。ｐＮＡ２２〜２４のプラスミド群を、ＴＰ１１４の複製に関与する最小のＤＮＡ配列を区切るように設計した。複製開始配列は、ＴＰ１１４中でこれまでにＴＰ１１４−０８３として同定されたｒｅｐＡ遺伝子の近くに通常位置している（実施例ＩＩを参照）（Ｐｒａｓｋｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。複製する最小のＤＮＡ配列を単離するため、ｒｅｐＡとｒｅｐＡの上流または下流のいずれかに位置する１，０００ｂｐの領域、またはその両方をギブソンアセンブリによってｐＫＤ３にクローニングし、ｐＮＡ２２〜ｐＮＡ２４を作製した。ｐＫＤ３の複製は ｐｉｒ依存性であるため、コンストラクトを化学的にコンピテントな Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＣ１００Ｄｐｉｒ ＋に形質転換した（Ｍｅｔｃａｌｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。次に、ＴＰ１１４からの複製起点の機能を Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３での形質転換によって試験した。

【0165】

ｐｉｒ＋ＥｃＮ（ＫＮ０５）株の作製。ｐｉｒ遺伝子をＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋から増幅し、ｐＦＧ０１８のｒｒｎＢターミネーターとＳｍａＩ＋ＸｈｏＩで消化したｐＧＲＧ３６骨格とでアセンブルした。次に、得られたプラスミドｐＧＲＧ−ｐｉｒ＋（Ｋｖｉｔｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）をＭＦＤｐｉｒ＋（Ｆｅｒｒｉｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）に形質転換し、ＲＰ４を介した接合によりＥｃＮへと可動化した。ｇｌｍＳ遺伝子のターミネーターへのｐｉｒ挿入を誘導するため、ＥｃＮを、０．６ＯＤ_600nmにまでアラビノースを含むＬＢ中で３０℃で最初に培養した。次に、細胞に４２℃で１時間ヒートショックを与え、３７℃で一晩インキュベートしてプラスミドをクリアランスさせた。ｐＧＲＧ３６の骨格を選択するため、アンピシリンを含む、または含まないプレート上に２０個以上のコロニーをストリークすることによってプラスミドキュレーションを試験した。次に、プラスミドのキュレーションが確認されたクローンを、表２に示されるそれぞれのプライマーを使用して、ｐｉｒ挿入についてＰＣＲによってスクリーニングした。

【0166】

伝達マシナリーのホスト制約付き複製。ｃａｔ及びｏｒｉＶＲ６Ｋ をコードするカセット をｐＫＤ３から増幅し、大腸菌ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋株でＴＰ１１４−０８３のＣＤＳ（ｒｅｐＡ）を置き換えるために使用した_。組換えクローンを、得られたプラスミドＴＰ１１４の表２複製からの対応するプライマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングした。得られたプラスミドＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kの複製は、ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋の染色体に位置するｐｉｒ遺伝子に依存しているはずである。ＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kのｐｉｒ依存性複製を、ｐｉｒ＋ （ＫＮ０５及びＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋）またはｐｉｒ− 宿主（ＫＮ０１）での接合伝達により確認した。

【0167】

インシリコｏｒｉＴ_TP114予測。転移の起点（ｏｒｉＴ）は通常、接合性及び可動性プラスミドのニッカーゼのプロモーターの近くに位置している。ＴＰ１１４では、予測されるニッカーゼタンパク質をコードするｎｉｋＡＢ（ＴＰ１１４−０４１及びＴＰ１１４−０４２）のプロモーターの近くに大きな遺伝子間領域が位置している。ＴＰ１１４（ｏｒｉＴ_TP114）配列の潜在的なｏｒｉＴのインシリコ分析を、ＢＬＡＳＴｎを使用して表５に記載される他のＩｎｃＩ２プラスミドと最初に比較して潜在的なｏｒｉＴ_TP114内の高度に保存された領域を見つけた。これにより、ｏｒｉＴ_TP114を１３８ｂｐのコア配列に絞り込むことができた。次に、このコアｏｒｉＴ_TP114を、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ Ｗｅｂベースソフトウェア（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００） を使用したペアワイズシーケンスアラインメントによって最小ｏｒｉＴ_R64 （Ｆｕｒｕｙａ ａｎｄ Ｋｏｍａｎｏ，２０００）と比較した。アラインメントは、デフォルト設定を用いて行った（ギャップの形成に１０、拡張に０．５のコスト）。次に、結果にマニュアルでアノテーションを付け、重要な繰り返しの位置、推定上の結合及びニッキング部位を示した。

【0168】

ｐＮＡ０１及び誘導体の構築。予測されたｏｒｉＴ_TP114を含む全遺伝子間領域を増幅、クローニングし、ギブソンアセンブリを使用して、ｐＳＩＭ７の宿主範囲の広いｏｒｉＶ_pBBR1、及びｐＦＧ０１８のｔｅｔＢとアセンブルし、それによりｐＮＡ０１を作製した。代替的プラスミド（ｐＮＡ０２）は、ｏｒｉＴ_TP114配列の予測されるニッキング部位を中心とする７ｂｐの欠失を含み、ｐＮＡ０１と同じ骨格とアセンブルされたものである。ｐＮＡ０１及びｐＮＡ０２のカナマイシン耐性変異体（それぞれｐＫＮ３０及びｐＫＮ３１）を、ｐＮＡ０１またはｐＮＡ０２の骨格を増幅し、ｐＫＤ４からカナマイシン耐性遺伝子を増幅することによって作製した。次に、ＰＣＲフラグメントを精製し、ギブソンアセンブリを使用して互いにアセンブルした。

【0169】

ｏｒｉＴ_TP114の欠失。ＦＲＴに隣接するｃａｔのカセットをｐＫＤ３から増幅し、リコンビニアリングによって、ニッキング部位を構成する予測されたｏｒｉＴ_TP114の一部を欠失させた。欠失クローンをＰＣＲによって検証し、次に接合実験で使用して、伝達頻度に対する欠失の影響を評価した。

【0170】

統計的分析統計的有意性を、実施例Ｉの材料及び方法のセクションに記載されているように行った。

【0171】

３．０−接合送達システムの形態
遺伝子カーゴの送達モードのバリエーション。遺伝子カーゴ核酸分子は、それぞれに利点と潜在的な不便を伴うさまざまなアプローチを使用して送達することができる。このセクションでは、ＣＯＰ送達モードについて説明する。まず、図２３Ａに示すように、ＣＯＰはいくつかの要素に分解することができる。ＣＯＰは、最初、プロバイオティクス細菌と接合送達システムとで構成されている。接合送達システムは、伝達マシナリーと、それ自体が機能的な遺伝子モジュールを含む遺伝子カーゴでそれ自体が構成されている。このように、接合送達システムは、いくつかのベクターに分解することができ、プロバイオティクスドナーの染色体に部分的に組み込むことができる。遺伝子カーゴを可動化するための最初の戦略は、遺伝子カーゴを伝達マシナリーに挿入して、細菌細胞の集団内で自律的に増殖できる単一のベクターを形成することである。この方法は、最大限の接合伝達が必要な用途において望ましい場合があるが、微生物叢中での接合送達システムの持続につながる可能性もある。したがって、遺伝子カーゴの一過性の発現を与える別の増殖の方法も検討する必要がある。例えば、遺伝子カーゴは、時間の経過とともに、または短期間で異なるレベルで発現されることが必要な場合がある（例えば、ＧＬＰ−１などのインスリン刺激ペプチドの発現）。あるいは、遺伝子カーゴが細菌集団に対する負の影響を媒介する場合、環境中でのその持続は、耐性菌の出現につながる可能性がある。このような代替方法の例には、制約付きシス可動化及びトランス可動化が含まれる。これらを図２３Ｂに示し、次のサブセクションで検討する。

【0172】

３．１ −シス可動化による遺伝子カーゴ輸送
強力な接合送達システムモードとしてのシス可動化。シス可動化は、伝達マシナリーと遺伝子カーゴの両方が同じベクター上にある送達モードである。この条件では、接合送達システムがレシピエント細菌に伝達され、レシピエント細菌が新しいドナーとなる。１つのドナー細菌が複数のドナー細胞を生じて連鎖反応を引き起こす可能性があるため、このプロセスによれば、接合送達システムと遺伝子カーゴは指数関数的に伝達される。この指数関数的な拡散のため、シス可動化は、細菌集団内で遺伝子カーゴを増殖させるための理論上は最も効率的な送達モードであるが、環境内での接合送達システムの持続にもつながる。シス可動化戦略の主な課題の１つに、伝達マシナリーと遺伝子カーゴを同じベクター上で連結することがある。

【0173】

ＤＲＯＩＤは、ＤＮＡ分子を融合するための強力な方法である。２つのＤＮＡ分子の結合を媒介するには、例えば、ギブソンアセンブリ、消化ライゲーション、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ、ＵＳＥＲクローニング、その他の誘導法などのいくつかの方法を使用することができる。代替案の１つとして、リコンビニアリング、遺伝子ドクター、ＮＯ−ＳＣＡＲなどの組換えベースの方法を使用することがある。ただし、これらの方法では大きなＤＮＡフラグメントを簡単に欠失させることができるが、特定の位置に挿入することができるＤＮＡ分子の長さによって制限される。ＤＲＯＩＤ法は、非常に迅速に行うことができ、セリンインテグラーゼを使用することでオーソゴナルな挿入部位に対して高度に特異的であるため、既存の方法に比べていくつかの利点がある。ＤＲＯＩＤによれば、両方のＤＮＡ分子同士の融合がサイズに依存しないため、複雑な遺伝子クラスターを有する大きなＤＮＡ分子を簡単に挿入することができる。ＤＮＡ分子の融合後、特定のＤＮＡフラグメントを切除する第２のリコンビナーゼの作用により、望ましくないＤＮＡ配列を簡単に除去することができる。ＤＲＯＩＤ法では、挿入部位（１つのＦＲＴ部位と１つのａｔｔＲ_Bxb1部位）の両端に、互いに相同ではない特徴的な痕跡が残る。これにより、挿入されたＤＮＡ分子をノックアウトする可能性のある痕跡間の組換えが防止される。

【0174】

遺伝子カーゴ挿入デバイスの機能テスト。ＤＲＯＩＤ法を試験するために、２つの遺伝子カーゴ挿入デバイスを構築した。この例では、遺伝子カーゴはｃａｔ遺伝子を標的とするｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体で構成されているため、ｃａｔ遺伝子（ｐＴ）を有するプラスミドを含む細胞にＫｉｌｌ１またはＫｉｌｌ３挿入デバイスを定期的に形質転換するとプラスミドが失われるはずである。したがって、遺伝子カーゴが機能していることを検証するためのコントロールとして、遺伝子カーゴ挿入デバイスを、最初にｐＴプラスミドを含む細胞に直接形質転換した。挿入デバイスとｐＴプラスミドの両方を同時に選択するのではなく、遺伝子カーゴ挿入デバイスのみを選択した場合に形質転換効率が大幅に高くなることがわかった（図２４）。さらに、ｐＴはＧＦＰをコードしているため（図２１．Ｆ）、細胞内に存在すると、青色光の下で簡単に視覚化できる蛍光シグナルが発生する。Ｋｉｌｌ１とＫｉｌｌ３の両方の挿入デバイスの形質転換からのＣＦＵはすべてＧＦＰ陰性であり、形質転換体内のｐＴのクリアランスを示している。これは、両方の遺伝子カーゴがそれらの挿入デバイスで機能していることを示している。

【0175】

ＤＲＯＩＤによる伝達マシナリーへの２つの試験遺伝子カーゴの挿入。ＤＲＯＩＤ法は３つの簡単なステップに分けることができる（図２２Ａ）。最初のステップは、リコンビニアリングによってローディングドックを標的ＤＮＡ分子に挿入することである（図２２Ｂ）。このステップは１回だけ必要である。次に、得られたプラスミドを、同じアプローチを使用していくつかの異なる遺伝子カーゴを挿入するために使用することができる。ローディングドックは、ａｔｔＢ部位_Bxb1をコードするｐＲＥＣ１の断片であり、ＴＰ１１４に挿入されてａｐｈ−ＩＩＩ遺伝子を置換して、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢを生成する。２番目のステップでは、遺伝子カーゴ挿入デバイスとプラスミドｐＢＸＢ１の両方を同じ細胞にクローニングする必要がある。Ｋｉｌｌ１（図２１Ａ）とＫｉｌｌ３（図２１Ｂ）の２個の遺伝子カーゴ挿入デバイスを使用してＤＲＯＩＤ法を試験した。ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢを、ｐＢＸＢ１とＫｉｌｌ１または３を含む大腸菌ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋へと接合によって伝達させた。次に、ＴＰ１１４ ：：ｔｅｔＢ−Ｋｉｌｌ１または３（図２２Ｃ）を、大腸菌ＭＧ１６５５Ｎｘ^Rへと伝達させた。方法の最後のステップは、大腸菌ＭＧ１６５５Ｎｘ^R＋ＴＰ１１４：：ｔｅｔＢ−Ｋｉｌｌ１または３をｐＣＰ２０で形質転換することである。このステップにより、ｔｅｔＢ、ａｔｔＬ_Bxb1 、及び ｏｒｉＶ_pSC101tsを除去することができる（図２２Ｄ）。最終的な接合送達システムであるＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１とＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３を、ＫＮ０１及びＫＮ０１ΔのｄａｐＡに伝達した。ステップ１〜３までのプロセス全体が完了するまでに１１日間かかるが、ステップ１は毎回必要ではない。したがって、これにより、遺伝子カーゴのクリーンな挿入を行う時間が７日間に短縮される。

【0176】

異なる細胞型における遺伝子カーゴのシス可動化。伝達マシナリー（ＴＰ１１４）へのＤＲＯＩＤ後に遺伝子カーゴが機能するかどうかを試験するため、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１をモデルとして使用した。ＫＮ０２、大腸菌ＭＧ１６５５Ｎｘ^R、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、及びサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の４つの異なるレシピエント細胞の１：１ミックスに接合送達システムＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を伝達した。このミックスでは、ＫＮ０２のみがクロラムフェニコールに耐性を有するため、ｃａｓ９−ｇＲＮＡ遺伝子カーゴの標的とするのはＫＮ０２のみとすべきである。ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１の効率を、ＣＯＰに供した細胞の生存比率によって評価した。これらのＣＯＰに供した細胞の生存比率は、接合送達システムを受け取って生存した細胞の割合を表す。ＣＯＰに供した細胞の生存比率は、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１（接合送達システムを生き延びた細胞）の接合効率をＴＰ１１４の接合効率（接合送達システムを受けるはずであった全細胞）で割ることによって計算した。予想通り、接合送達システムによってＫＮ０２のみが排除された（図２５Ａ）。殺滅がＫＮ０２のゲノムにおけるオフターゲティングによるものではなかったことを確認するため、４つのレシピエントの第２の混合物（シトロバクター・ロデンティウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）ＫＮ０４、大腸菌ＭＧ１６５５Ｎｘ^R、ＫＮ０３、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））を調製した。このミックス中ではＣ．ロデンティウム（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）ＫＮ０４のみが、その染色体内のｃａｔ遺伝子の挿入のためにクロラムフェニコールに耐性である。ＣＯＰに供した細胞の生存比率を再び用いて、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１の効率を評価した。予測されたように、Ｃ．ロデンティウム（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）ＫＮ０４のみがＣＯＰシステムの影響を受け、これにより、ｃａｓ９−ｇＲＮＡ遺伝子カーゴが異なる細胞で発現され、ｃａｔ遺伝子に対して高度に特異的であることが示された（図２５Ｂ）。

【0177】

ＤＲＯＩＤ法により、伝達マシナリーと遺伝子カーゴとが１個のベクターにうまく融合された。本実施例では、ＤＲＯＩＤ法を使用して、伝達マシナリーと遺伝子カーゴとを３つのステップで結合できることが示された。これらのステップは、遺伝子カーゴと伝達マシナリーとの間の機能的な重複を避けるように設計されたものである。ＦＲＴ組換えステップは、伝達マシナリーから選択モジュールを除去し、遺伝子カーゴから維持モジュールを除去し、それにより、単一の選択及び栄養複製モジュールを有する単一のＤＮＡ分子を作製するうえで必要とされた。そこで、本発明の接合性送達システムを、しばしば抗生物質耐性腸内感染症及び尿路感染症の原因となる細菌の分類群である腸内細菌のいくつかの代表的な菌への遺伝子カーゴの送達の概念の証明に用いた。

【0178】

３．２ −制約されたシス可動化による遺伝子カーゴの送達
バイオセーフティ対策としての制約付きシス可動化。制約付きシス可動化システムは、遺伝子カーゴと伝達マシナリーが同じＤＮＡ分子上に配置された接合送達システムで構成されている。しかし、かかるシステムでは、維持モジュールからの不可欠な複製開始遺伝子がドナー株の染色体に挿入される（図２３Ｂ）。これにより、接合送達システムの複製がＣＯＰ染色体に依存するようになる。レシピエント株は接合送達システムからの遺伝子を発現することができることから、かかるシステムはなお、指数関数的な速度で増殖することができると考えられる。しかしながら、接合送達システムは、レシピエント細菌内では複製できないため、最終的には失われる。したがって、システムは高い接合効率を示すが、環境中で持続しないため、投与のダイナミクスをより適切に制御し、バイオセーフティレベルを向上させることができる。

【0179】

ｏｒｉＶ_TP114の位置特定。制約付き複製に向けた最初のステップは、制約付きシス可動化ではｒｅｐＡをドナー細胞染色体に再配置する必要があることから、ＴＰ１１４（ｏｒｉＶ_TP114）の複製起点の位置を確認することである。接合プラスミド複製は通常、ＲｅｐＡと呼ばれるプラスミドにコードされたタンパク質によって開始される。このタンパク質は、宿主細胞からＤＮＡ複製マシナリーを動員してプラスミドＤＮＡの複製を可能にする。Ｔｐ１１４によってコードされる複製開始タンパク質は、インシリコ分析によって、ｒｅｐＡ 遺伝子ＴＰ１１４−０８３によってコードされていることが予測された（実施例ＩＩを参照）。ほとんどの接合プラスミドでは、ｏｒｉＶはｒｅｐＡ遺伝子の近くの遺伝子間領域に見出される。ただし、ＴＰ１１４内で、ｒｅｐＡ は２つの遺伝子間領域によって挟まれている。どちらがｏｒｉＶ_TP114であるかは不明であった。そのため、ｒｅｐＡを、遺伝子の１，０００ｂｐ上流、下流、または両側１，０００ｂｐのいずれかでプラスミド骨格にクローニングした。プラスミド骨格は、染色体に組み込まれたｐｉｒ遺伝子に依存する複製起点であるｏｒｉＶ_R6Kを含む。アセンブリを、最初にｐｉｒ＋株大腸菌ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋で検証した後、ｐｉｒ−株ＢＷ２５１１３にクローニングしてｏｒｉＶ_TP114機能分析を行った（図２６）。試験した３つのプラスミドのうち、ｐｉｒ−宿主内で複製できたのは１つだけであった。このプラスミドは、遺伝子の両側にｒｅｐＡ及び１，０００ｂｐを含んでいた。この結果は、ＴＰ１１４−０８３が実際のＲｅｐＡタンパク質をコードしており、ｏｒｉＶ_TP114がｒｅｐＡ遺伝子の近くにあることを示している。

【0180】

ＴＰ１１４の制約付きシス可動化。制約付きシス可動化は、伝達マシナリーと遺伝子カーゴが、染色体にコードされた複製タンパク質の制御下で複製する同じベクター上に位置する接合送達システムを指す。制約付きシス可動化を開発するには、複製タンパク質とそれに関連する ｏｒｉＶを特性評価することが必要である。ｏｒｉＶ_TP114とそのｒｅｐＡ遺伝子の位置が特定されたが、複製タンパク質とｏｒｉＶのペアを選択するためには他のいくつかの要因を考慮する必要がある。例えば、複製タンパク質は、環境中の接合送達システムの維持を避けるため、潜在的なレシピエント細胞の染色体では稀でなければならない。また、接合送達システムの不和合性に基づく拒絶を低減するには、ＴＰ１１４の複製システムとは異種の複製システムを使用することが望ましい場合がある。最も研究され、理解されている複製システムの１つに、Ｒ６Ｋの ｐｉｒ依存性ｏｒｉＶ_R6Kがある。ｐｉｒ遺伝子によってコードされるＰｉタンパク質は、ＩｎｃＸファミリーの接合プラスミドに天然に見られ、細菌の染色体に頻繁に見られないという利点がある。Ｔｎ７組み込みプラスミドｐＧＲＧ３６に基づいたｐｉｒ組み込みシステムが開発されており、ｐｉｒ＋ＥｃＮ株ＫＮ０５が作製されている。ＴＰ１１４−０８３ （ｒｅｐＡ）を市販の大腸菌ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋クローニング株を用いてｏｒｉＶ_R6K及びクロラムフェニコール耐性カセット（ｃａｔ）に置き換え、ＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kを作製した。次に、このプラスミドをＫＮ０５及びＫＮ０１に伝達してＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kがｐｉｒ＋及びｐｉｒ−株でそれぞれ複製する能力を評価した。接合効率を、同じ条件下で野生型ＴＰ１１４と比較した（図２７Ａ）。予想通り、ＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6KのＫＮ０１（ｐｉｒ−株）への伝達からは接合完了体は得られなかったが、ＫＮ０５（ｐｉｒ＋株）への接合では接合完了体が得られた。しかしながら、ＴＰ１１４ΔｒｅｐＡ：：ｃａｔ−ｏｒｉＶ_R6Kの接合効率は、野生型ＴＰ１１４の接合効率よりも低かった。今回はドナー株としてＫＮ０５を使用し、レシピエントとして大腸菌ＥＣ１００Ｄｐｉｒ＋を使用して、第２の接合実験を試みた（図２７Ｂ）。その場合、両方のプラスミドの結合効率は同等であり、この場合、制約付きシス可動化が結合効率にほとんど影響しなかったことを示している。かかる維持モジュールを使用すると、ｐｉｒ−株へのプラスミドの伝達は影響されないはずであるが、レシピエント細胞での複製は不可能であるはずである。これは、遺伝子カーゴのペイロードと伝達マシナリーの発現はｐｉｒ−株で依然、行われるが、この発現は一過性のものであることを意味する。かかる一過性発現は、定常的発現がＣＯＰ効果、環境、または対象に有害となり得るいくつかの状況で望ましい。したがって、制約付きシス可動化は、高い結合効率を維持しながら、プラスミドの持続を防ぐ効率的な方法である。

【0181】

３．３ −トランス可動化による遺伝子カーゴ配送
遺伝子カーゴの配送モードとしてのトランス可動化。トランス可動化は、トランスファー機構と遺伝子カーゴが２つの異なるＤＮＡ分子上に存在するベクターシステムを使用して実現される（図２３Ｂ）。この形態では、遺伝子カーゴは、伝達マシナリーの栄養複製モジュールと和合性のある輸送モジュールを含む必要がある。伝達マシナリーは、染色体への挿入またはそれ自体の輸送モジュールの破壊のいずれかによって固定化することができる（ｏｒｉＴ）。したがって、送達のこのモードは、遺伝子カーゴがレシピエント細菌へとトランス（伝達マシナリーとは独立した異なるＤＮＡ分子上）で可動化されることを可能とする。遺伝子カーゴの栄養複製モジュールの選択は、環境中でのその持続よりも高い重要性を有し得る。この送達モードは、最大のバイオコンテインメントを可能にするが、レシピエント細菌が遺伝子カーゴを増殖させることができないため、より適度な伝達効率が得られる。

【0182】

ＴＰ１１４の伝達起点（ｏｒｉＴ）の位置特定。すべての可動化プラスミドは、接合プロセスが生じるうえでリラクソソームによるそれらのｏｒｉＴの認識に依存している。リラクソソームは、ｏｒｉＴ上の特定の配列を認識して結合し、ニッキング部位と呼ばれる特定の場所でＤＮＡの一本鎖を切断するマルチヘテロマータンパク質複合体である。次に、ＤＮＡの一本鎖がＴ４ＳＳに導かれ、Ｔ４ＳＳを介してレシピエント細胞に伝達される。Ｔ４ＳＳをコードしていない可動化プラスミドは、別の接合プラスミドによってコードされたＴ４ＳＳを使用することができる。しかしながら、可動性プラスミドは、それ自身のｏｒｉＴ 配列に特異的なそれ自身のリラクソソームをコードしている。したがって、ｏｒｉＴ は、伝達マシナリーによる遺伝子カーゴ伝達における最も重要な配列の１つである。本明細書に示される従来の例では、遺伝子カーゴとトランスファー機構との間の物理的連結を利用して、ＤＮＡ伝達に伝達マシナリーのｏｒｉＴ配列をシスで用いている。しかしながら、可動化プラスミドで観察されるように、ｏｒｉＴ配列を伝達マシナリーから遺伝子カーゴの核酸分子に再配置して、遺伝子カーゴをレシピエント細胞にトランスでのみ可動化することが可能である。重要な点として、ｏｒｉＴ_TP114を最初に特定する必要があった。他の接合プラスミドのトポロジーに基づくと、ｏｒｉＴ 配列は、リラクソソームのサブユニットであるニッカーゼ遺伝子の近くにしばしば位置している。ＴＰ１１４上で、ニッカーゼは、これまでに同定されているニッカーゼと同じタンパク質ファミリーｐｆａｍ０３４３２ドメインを共有するコア遺伝子であるＴＰ１１４−０４１（ｎｉｋＢ）であると予測される。ＴＰ１１４では、２個の分岐遺伝子を含む３６８ｂｐの遺伝子間領域がｎｉｋＢのプロモーター領域の近くに位置し、潜在的なｏｒｉＴを示している。

【0183】

トランス可動性ベクターｐＮＡ０１の構築。３６８ｂｐの予測されたｏｒｉＴ_TP114を、栄養複製モジュール（ｏｒｉＶ_pBBR1）とペイロードモジュール（ｔｅｔＭ） を含む広宿主域プラスミド骨格にクローニングした。遺伝子カーゴｐＮＡ０１を、ＴＰ１１４を含むＫＮ０１ΔｄａｐＡに形質転換した後、次いでＫＮ０２へと可動化した（図２８Ａ）。ｐＮＡ０１の接合効率はＴＰ１１４の接合効率と同等であり、ｐＮＡ０１にクローニングされた３６８ ｂｐのＤＮＡ配列がｏｒｉＴ_TP114であることが確認された。

【0184】

ＴＰ１１４のニッキングサイトの特定。トランス可動化効率は、ｏｒｉＴの欠失またはドナーの染色体への組み込みのいずれかによるＴＰ１１４の固定化によってわずかに完成され得る。伝達マシナリーの固定化は、標的細菌へのその拡散を防ぎ、環境中の伝達マシナリーの持続を制限することによってバイオセーフティを向上させることができる。また、固定化された伝達マシナリーは、遺伝子カーゴをトランスで可動化することができ、それにより、レシピエントで発現される必要のある遺伝子のみの伝達を可能とする。しかしながら、ｏｒｉＴ_TP114は、２個の分岐遺伝子間の遺伝子間領域に位置している。これは、この領域に２個のアノテーション付けされていないプロモーターが含まれており、その一方が必須のニッカーゼ遺伝子ｎｉｋＢしたがって、ｎｉｋＢ発現の障害の可能性を避けるためには、正確な欠失が求められる。ｏｒｉＴ_TP114 とＩｎｃＩ２ファミリーの他のプラスミドの配列比較（表５）により、配列保存に関する詳細情報が与えられた。試験したプラスミドの中で、ｐＣｈｉ７１２２−３のみがｏｒｉＴ_TP114配列の最初の１３８ｂｐに対して相同性を示した。したがって、ｎｉｋＢプロモーターとニッキングサイトの両方がｏｒｉＴ_TP114のこの部分に位置特定される可能性が最も高い。細菌プロモーターは通常、−１０及び−３５ボックスで構成され、場合によりオペレーター配列を含むことができる。ｎｉｋＢはｏｒｉＴ_TP114の上流に位置し、１３位に−１０ボックスモチーフがみつかったため、ｎｉｋＢのプロモーターはｏｒｉＴ_TP114の最初の１００ｂｐに位置特定される可能性が最も高い。ＩｎｃＩ１モデルプラスミドＲ６４では、コアｏｒｉＴ_R64配列は９２ｂｐの長さであるものと決定され、ニッキング部位は７７位の高度に保存されたグアニンに位置している。ＥＭＢＯＳＳニードルソフトウェア（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００） を用いて行ったペアワイズ配列アラインメントは、ｏｒｉＴ_TP114と最小のｏｒｉＴ_R64の最初の１３８塩基対間で３６％の相同性を示した（図２９）。このアラインメントは、重要なリピート及びＮｉｋＡの結合部位がＲ６４とＴＰ１１４との間で比較的よく保存されていることを示している。ＴＰ１１４のこれらのモチーフの位置を用い、ニッキング部位は１２４位のＧであると予測された。ニッキング部位が実際に１２４位に位置することを検証するため、１２１〜１２７位までの７ｂｐを欠失させてから、２番目のベクター、すなわちｐＮＡ０２にクローニングした。遺伝子カーゴｐＮＡ０２は、７ｂｐの欠失を除いてｐＮＡ０１と同じであるため、ＴＰ１１４によって可動化されないはずである。ＴＰ１１４を含むＫＮ０１からＫＮ０２へのｐＮＡ０２のトランス可動化を、ｐＮＡ０１の場合とまったく同じようにして試験した。しかしながら、トランス可動化は、ｐＮＡ０２のｏｒｉＴ_TP114の７ｂｐの欠失によって事実上無効化された（図２８Ｂ）。このことは、ＴＰ１１４のニッキング部位がこの領域にあることを示している。

【0185】

ＴＰ１１４の伝達マシナリーからのｏｒｉＴ_TP114の欠失。上記のように、ｏｒｉＴ の変異を行ってドナー株に接合プラスミドを固定化することができる。トランス可動化はこの固定化から利することができる。固定化がなされない場合、伝達マシナリーと遺伝子カーゴがＴ４ＳＳを介した伝達について競合する。ＴＰ１１４の固定化をＦＲＴ隣接ｃａｔカセットのリコンビニアリングによる挿入によって行い、１１６〜２５４位にわたるｏｒｉＴ_TP114に１３８ｂｐの欠失を行った。この欠失はニッキング部位をカバーし、ｏｒｉＴ_TP114の認識、ひいては伝達マシナリーの接合 を防ぎ、同時にｎｉｋＢの発現は影響されない。ＴＰ１１４ΔｏｒｉＴ：：ｃａｔ−ｔｅｔＢを、ＭＧ１６５５Ｎｘ^R内で生成し、接合によりＫＮ０１に伝達した。ＴＰ１１４ΔｏｒｉＴ：：ｃａｔ−ｔｅｔＢの接合効率は大きく損なわれたが、それでもいくつかの接合完了体を得た（図３０Ａ）。かかる伝達によって、ＭＧ１６５５Ｎｘ^R株に潜在的に依然存在しうるＴＰ１１４からＴＰ１１４ΔｏｒｉＴ：：ｃａｔ−ｔｅｔＢ を単離する排斥機構が可能となった。したがって、ＫＮ０１からＭＧ１６５５Ｒｆ^Rへと向かう、接合効率の第二の試験を行った。今回は、接合完了体は回収されず、ＴＰ１１４の伝達機能が完全に無効化されたことを示している（図３０Ｂ）。次に、それぞれ、ｐＮＡ０１及びｐＮＡ０２、ｐＫＮ３０及びｐＫＮ３１のカナマイシン抵抗性誘導体を、ＫＮ０１＋ＴＰ１１４ΔｏｒｉＴ：：ｃａｔ−ｔｅｔＢに形質転換した。バイオコンテインメントされた伝達マシナリーを使用して、ｐＫＮ３０及びｐＫＮ３１をＭＧ１６５５Ｎｘ^Rへとトランスで可動化した（図３１）。ｐＫＮ３０のみがＭＧ１６５５Ｎｘ^Rに伝達することができ、これにより、この閉じ込め方法が高度にストリンジェントであることが確認された。しかしながら、その結合効率はＴＰ１１４の約１０分の１であった。これは、リラクソソーム関連遺伝子を伝達マシナリーから遺伝子カーゴベクターに再配置することによってさらに改善することができる。要約すると、本実施例で示すように、トランス可動化では、リラクソソームを伝達マシナリー（ＴＰ１１４）から発現させる必要があった。これにより、リラクソソームはｐＮＡ０１上のｏｒｉＴ_TP114を認識し、Ｔ４ＳＳを介してその可動化を媒介した。しかしながら、ｐＮＡ０２のニッキング部位の７ｂｐの欠失は、リラクソソームによるｏｒｉＴ_TP114の認識及びプロセシングを妨げ、それによりｐＮＡ０２の伝達を妨げた（図３２）。

【0186】

実施例ＩＶ−遺伝子カーゴの送達及び応用
菌株、プラスミド及び増殖条件。本実験で使用されるすべての菌株とプラスミドを表１に示す。すべてのプラスミド配列は、配列の付録に記載されている。菌株、プラスミド、増殖条件、インビトロ 接合、糞便及び組織の処理、インビボ接合、及び統計分析に関する詳細は、実施例Ｉの材料及び方法のセクションに記載されている。

【0187】

蛍光測定。特定の染色体ＤＮＡ配列またはプラスミドＤＮＡ配列の切断におけるｇＲＮＡ−ｃａｓ９ペイロードの有効性を評価するため、２種類の標的細菌を使用した。最初のものであるＫＮ０２は、そのゲノム内に組み込ま れた緑色蛍光タンパク質（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）（ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（商標））をコードする遺伝子を有している。２番目のＫＮ０３は、クロラムフェニコール耐性遺伝子とｇｆｐ遺伝子を有するｐＴプラスミドを持っている（Ｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＫＮ０２の細菌ゲノムまたはＫＮ０３内のプラスミドｐＴの完全性を測定するためのプロキシとして蛍光を用いた。簡単に言えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子を保持するｐＴプラスミドに切断がない限り、細菌宿主で維持することができ、ＧＦＰが発現される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムがクロラムフェニコール耐性遺伝子を切断するとすぐにｐＴが失われ、それによりＧＦＰ蛍光が失われる。ｐＴをキュアするＣＯＰシステムの効率を測定するため、レシピエントと接合完了体を選択するプレート上で緑色蛍光コロニー及び非蛍光コロニーの数をカウントした。Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００を使用して蛍光を測定し、ＩｍａｇｅＦｉｊｉソフトウェアを使用して画像を分析した。

【0188】

細胞の蛍光誘導。高レベルの蛍光タンパク質が標的細菌の適応度に及ぼす可能性のある悪影響を制限するため、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に置いた。ゲノム標的とプラスミド標的の両方で、蛍光シグナルは誘導性であった。ｐＴのｇｆｐ遺伝子は、アラビノースによって作用が阻害されるタンパク質であるＡｒａＣの抑制下にある（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。そのため、ｐＴ上のｇｆｐを、１％アラビノースの存在下で誘導することができる。ＫＮ０２細胞（染色体標的）の場合、蛍光はＮｅｏｎＧｒｅｅｎによって媒介される。大腸菌ＫＮ０２のＮｅｏｎＧｒｅｅｎ遺伝子は、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導することができる（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、ＧＦＰと同様の吸収及び発光スペクトルで緑色蛍光を発するが、より明るい蛍光を発する（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。プラスミド標的とゲノム標的の両方で、青色光を使用したトランスイルミネーター下及びセルソーター（ＦＡＣＳＪａｚｚ）で蛍光発光が確認された（データは示さず）。

【0189】

コロニー写真。インビトロ及びインビボ実験の間のｐＴ損失を追跡するため、１％アラビノースを添加したＬＢ寒天プレート上でＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ９５００を使用してコロニーの蛍光を検出した。これを行うため、１つはローパスブルーフィルターと４７３ｎｍレーザーを使用したＧＦＰの検出用のものと、もう１つはローパスレッドフィルターと６３５ｎｍレーザーを使用した明視野画像用のものの２つの画像を撮影した。これらの２つの画像を、ＩｍａｇｅＦｉｊｉソフトウェアを使用してマージした（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。次に、緑色の蛍光コロニーと非蛍光コロニーをマニュアルでカウントした。

【0190】

ＦＡＣＳによる死亡率の評価。標的がゲノムであるインビトロ実験では、生菌／死菌アプローチを使用して死亡率を調査した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用して、生菌と死菌を区別した。通常、ＰＩは損傷した膜しか通過できないため、死細胞の検出に用いられる（Ｄａｖｅｙ，２０１１）。ＫＮ０２の蛍光を、インビトロのＣＯＰ処理によって誘導した。死細胞を検出するため、細胞を０．８５％ＮａＣｌ中、３０μＭのＰＩで暗所で１５分間染色した。次に、細胞を２回洗浄し、０．８５％ＮａＣｌに迅速かつ正確な細胞検出を可能とする密度で再懸濁した。ＦＡＣＳＪａｚｚサイトメーターを使用して、試料当たり１０００００個の細胞で緑と赤の蛍光を即座に評価した。

【0191】

４．１−レシピエント細菌に対して有益な効果を有するペイロードを伝達するためのＣＯＰシステムのインビボでの使用
ＣＯＰシステムを用いて、標的細菌に有益な遺伝子カーゴを伝達することができる。かかる遺伝子カーゴは、レシピエント細菌に有利な表現型を与える遺伝子をコードすることができる。特定の細菌種に表現型の利点を与えることは、過小に存在している種の増殖を助けることにより、乱れた微生物叢のバランスを取り戻す助けとなり得る。例えば、これは、ラクトースなどの新しい炭素源を利用できるようにする遺伝子を導入することによって行うことができる。ラクトース分解酵素を与えることは細菌に利益をもたらすが、ラクトース不耐症の場合は対象にも利益をもたらす。ペイロードに含まれる可能性のある有益な遺伝子の別の例として、抗生物質耐性遺伝子がある。特定の細菌を特定の微生物叢で濃縮する必要がある場合、抗生物質治療の前に耐性遺伝子をこれらの細菌に伝達することでそれらの集団が大幅に濃縮される。

【0192】

ＣＯＰシステムは、インビボで標的細菌に有益な表現型の特徴を与えるペイロードを伝達することができる。ＣＯＰを、腸内環境において有益な表現型形質を標的細菌に与える遺伝子カーゴを伝達する能力について試験した。これを行うため、ＫＮ０１＋ＴＰ１１４をドナーとしたインビボ接合マウスモデルを用い、ＫＮ０２レシピエント細菌にカナマイシン耐性遺伝子を与えた。ＫＮ０２細菌がカナマイシンに耐性を有するようになったため、ＣＯＰは実験の最初の２日以内に高レベルの遺伝子カーゴの伝達を実現した（図３３Ａ）。得られた結果は、盲腸と糞便との間で一貫していた（図３３Ｂ）。レシピエント集団のほとんどは、実験を通じてカナマイシンに抵抗する能力を獲得し、これにより、ＣＯＰを用いて有益な表現型形質をインビボで細菌に伝達及び送達できることが示された。

【0193】

４．２−レシピエント細菌に有害なペイロードを伝達するためのＣＯＰのインビボでの使用
ＣＯＰシステムを使用してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムをペイロードとしてインビボで送達することができる。本実施例では、ＣＯＰを腸内環境で使用して、特定の遺伝子を不活性化するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９システムを標的細菌に送達する。これを実証するため、伝達マシナリーと遺伝子カーゴが同じベクター上に配置された接合送達システムを有するプロバイオティクスＥｃＮ（図３４Ａ）でＣＯＰを構成した（実施例ＩＩＩのシス可動化を参照）（図３４Ｂ）。この構成では、伝達マシナリーと遺伝子カーゴとが互いに連結されているため、これらは両方とも標的細菌に伝達され、標的細菌は、局所微生物叢内でのカーゴの指数関数的な拡散に寄与するドナーとなる。標的レシピエント細胞に入ると、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡペイロードが発現され、ゲノムをスキャンして、調整可能なｇＲＮＡスペーサーの配列によって決定される特定の標的配列を探す。標的配列が検出されると、Ｃａｓ９は細胞のＤＮＡの二本鎖切断を触媒する（図３４Ｃ）。接合送達システムの構築については、実施例３．１に詳述されている。簡単に言えば、遺伝子カーゴと伝達マシナリーとをＤＲＯＩＤ法を使用して互いに連結した。遺伝子カーゴのペイロードを、ｃａｓ９ 遺伝子と１つ（Ｋｉｌｌ１）または３つ（Ｋｉｌｌ３）のｇＲＮＡで構成した。この概念実証のため、遺伝子カーゴからのｇＲＮＡを、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）に特異的に結合するように設計した。ｃａｔターゲット配列は、プラスミドまたは標的細菌の染色体上に自然に見られる。ｃａｔが標的株の染色体上に位置する場合、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９によって引き起こされる二本鎖切断の結果として標的細胞が殺された。一方、ｃａｔがプラスミド上に位置する場合、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９によって誘導された二本鎖切断はプラスミドの分解を促進し、細胞は「ディスアーム」された（図３４Ｄ）。

【0194】

４．２．１−抗生物質に対して細菌を感作するペイロードを送達するためのＣＯＰのインビボでの使用。

【0195】

ＣＯＰを用いて、標的細菌の表現型形質をなくすペイロードを送達することができる。ＣＯＰがその遺伝子カーゴの伝達によって媒介される有害な影響をもたらし得る１つの形は、特定の表現型を発現する標的細菌の能力を妨げることである。最も悪名高い表現型の１つは、抗生物質に対する耐性である。そのため、細菌集団における抗生物質耐性遺伝子の喪失を誘導するＣＯＰを設計することが望ましい場合がある。プログラム可能なエンドヌクレアーゼ（例えばｃａｓ９）の使用は、極めて高い耐性を有する病原菌の出現の原因となる抗生物質耐性遺伝子の標的化と消失に大変有望である。抗生物質耐性遺伝子は、細菌の染色体とプラスミドの両方に見られる。これらの遺伝子が、接合性及び可動化プラスミドのように水平方向に伝達可能な遺伝子エレメント上にある場合、これらはより問題となる。この特定の状況では、耐性表現型が他の種の細菌に伝達され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を含むＣＯＰを使用すると、これらの耐性遺伝子を標的とし、そのような可動性遺伝子エレメントを有する細菌をインビボでディスアームすることができる。

【0196】

ＣＯＰは、抗生物質耐性プラスミドをインビボでキュアするペイロードを送達することができる。ＣＯＰをインビボ接合実験において使用し、ペイロードを送達して標的細菌から抗生物質耐性プラスミドを排除することができるかどうかを試験した。これを行うため、ＣＯＰを、マウス腸管内の共生大腸菌株からｐＴを排除することが可能なペイロードを送達する能力について試験した。ｐＴを有するＫＮ０３を、ＴＰ１１４を有するＫＮ０１またはＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を有するＫＮ０１の１２時間前にマウスに導入した。レシピエント細胞におけるｐＴの存在を、選択的ＬＢプレート上の蛍光によってモニターした。ＣＯＰシステムを１回投与すると、４日間の実験を通じて標的プラスミドの７３％程度を除去することができる（図３５Ａ及びＢ）。コントロール群（ＫＮ０１＋ＴＰ１１４）ではプラスミドの喪失は観察されず、ＣＯＰシステムのすべての接合完了体は標的プラスミドを欠いていた（図３５Ｃ）。糞便試料の結果は、実験終了時にマウスの盲腸でみられた頻度と一致していた（図３５Ｄ）。これらの結果は、特異的細胞からの耐性プラスミドを硬化させることが可能であることが示された ここ抗生物質耐性表現型の喪失を引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９を含むペイロードを送達するためにＣＯＰシステムを使用して腸内細菌叢におけるインビボ。

【0197】

４２．２−ペイロードを送達して細菌を選択的に殺すためのＣＯＰシステムのインビボ使用。

【0198】

ＣＯＰシステムは、従来の抗生物質の代替として使用することができる。混合集団中の特定の細菌を標的とし、排除するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の使用は、抗生物質耐性の出現が我々が細菌感染を治療する能力にとって脅威となっていることから、大きな関心を集めている用途の１つである。ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を使用すると、ＣＯＰは染色体配列を病原菌のゲノム内にターゲティングして病原菌を排除することができる。ほとんどの細菌は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を行えないため、Ｃａｓ９を介した染色体の平滑な二本鎖切断によって死につながり得る。この インビボ 例では、細菌の特定の菌株が、他の密接に関連する菌株に影響を与えることなく効果的に標的化され、集団から排除される。複雑な細菌集団から特定の細菌を排除するペイロードを送達するＣＯＰの能力を試験するため、密接に関連した標的株と非標的株のセットを必要とした。これらの実験では、ＫＮ０１ΔｄａｐＡ をドナー株として使用し、標的染色体ｃａｔ遺伝子を保有するＫＮ０２を標的株として使用したのに対して、ｃａｔの代わりに染色体ｔｅｔＢ遺伝子を保有するＫＮ０３を非標的株として使用した。

【0199】

４．２．２．１−インビボで細菌を選択的に殺すためのＣＯＰシステムの予防的使用。

【0200】

ＣＯＰ ＴＰ１１４：：Ｋｉｌｌ１システムの予防的使用の用途。予防的治療は、感染または不要な細菌株の拡散を防ぐために、ＣＯＰの毎日の摂取を意味する。この種の治療は、例えば、旅行中、または抗生物質治療からの回復中など、被験者が特定のタイプの細菌感染に曝露されやすい状況で有用となり得る。ＣＯＰの予防的使用はまた、抗生物質耐性菌を標的とすることで健康を改善し、それによって抗生物質耐性感染の可能性を低下させ得る。そのような予防的治療の研究のためのマウスモデルを設計した。マウスに最初にＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１またはＴＰ１１４（コントロールとして）を有するＣＯＰシステムを与え、１２時間後に標的細菌と非標的細菌（それぞれＫＮ０２及びＫＮ０３）の１：１混合物に曝露した。次に、標的細菌と非標的細菌のそれぞれの存在量を、糞便中で４日間にわたって追跡した（図３６Ａ）。

【0201】

ＣＯＰシステムは、予防的に投与することでインビボで侵入標的細菌を特異的に排除するペイロードを送達することができる。マウスの予防的治療を、ＣＯＰ ＫＮ０１＋ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１またはＫＮ０１＋ＴＰ１１４（コントロールのプラセボ治療）を使用して厳密に追跡した。ＣＯＰ予防的治療は、非標的株と比較して標的株の存在量の１３倍もの特異的減少をもたらし、この減少は１日でもたらされた。ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を有するＣＯＰ ＫＮ０１の予防的治療の単回投与のみによって、標的株の生ＣＦＵ数の明らかな低下が観察された（図３６Ｂと３６Ｄを比較）。２つの菌株間のＣＦＵカウントを比較することにより、標的菌株と非標的菌株との間の競合比を計算した。例えば、標的株の競合比は、標的株のＣＦＵカウントを全レシピエント株のＣＦＵカウントで割ることによって計算した。同等のことを行って非標的株の競合比を計算した。競合比は、ＣＯＰシステムの影響を強調するために２つの株の適応度を比較している。菌株の競合比は生のＣＦＵと一致し、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を有するＣＯＰ ＫＮ０１による処置における２、３、４日目のレシピエント菌株間には明確な差があったが、コントロールでは差はなかった（図３６Ｃと３６Ｅを比較）。菌株のコロニー形成の差は、ＣＯＰ技術が効率的かつ特異的に標的株をインビボで排除し、非標的株の繁殖を可能とすることを示唆している。これにより、ＣＯＰシステムを予防的に使用してペイロードをインビボで送達することで腸内細菌叢に侵入する病原菌を特異的に防ぐことができることが示された。

【0202】

４．２．２．２−インビボで細菌を選択的に殺滅するためのＣＯＰシステムの治療的使用。

【0203】

インビボでのＣＯＰの治療的使用の例。ＣＯＰの治療的使用は、ＣＯＰの投与が特定の病原菌の検出後に行われることを意味する。ＣＯＰは、病原菌を排除または不活性化するために投与される。このタイプの治療は、特定の病原体細胞に死を誘発することが望ましい状況で有用となり得る。実際、ＣＯＰシステムの高い特異性は、日和見病原体の確立を防ぎ、抗生物質関連下痢などの病状の出現を制限すると考えられる。さらに、標的細菌がすべての既知の抗生物質に耐性を有するような状況では、対象の治療が好ましいと考えられる。それにもかかわらず、ＣＯＰの高い特異性は、個人において過剰に存在する種を効率的に標的とすることにより、腸内毒素症を有する対象の腸内細菌叢の正確な操作を可能にしうる。そのような治療的処置の有効性を調べるためのマウスモデルを考案した。マウスに、最初に標的細菌と非標的細菌（それぞれＫＮ０２とＫＮ０３）の１：１混合物を与え、１２時間後、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１システムまたはＴＰ１１４（コントロール）のいずれかを含むＣＯＰで処置した。糞便中の標的細菌と非標的細菌の存在量を４日間追跡した（図３７Ａ）。

【0204】

ＣＯＰは、ペイロードを送達してインビボで標的細菌を排除することができる。マウスの治療的処置を、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を有するＣＯＰ ＫＮ０１またはＴＰ１１４を有するＫＮ０１（コントロールのプラセボ処置）を使用して厳密に追跡した。ＣＯＰによる治療的処置の単回投与は、わずか２日以内に非標的株と比較して標的株の２，１１６倍もの減少を伴う優れた結果をもたらした。生のＣＦＵの有意な減少は、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を有するＣＯＰ ＫＮ０１で処置したマウスで２、３、及び４日目に観察されたが、プラセボ処理マウスでは観察されなかった（図３７Ｂと３７Ｄを比較）。標的及び非標的競合指数（予防的治療のセクションで計算したもの）は、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ１を有するＣＯＰ ＫＮ０１で処置したマウスでは非標的株の明らかな優位性を示したが、コントロール群ではそのような優位性は示されなかった（図３７Ｃと３７Ｅを比較）。これにより、ＣＯＰ技術を治療的に使用して、インビボで細菌を排除するように特に設計されたペイロードを送達できることが示された。

【0205】

４．３−細菌集団に複合的な影響を与えるペイロードを伝達するためのＣＯＰシステムのインビボでの使用
レシピエント細菌に有益及び有害な影響を与えるペイロードの利用。ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３送達システムを使用すると、同じ遺伝子カーゴ内での有益な遺伝子（カナマイシン耐性）と有害な遺伝子（Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ）の両方の伝達を利用して細菌の集団を操作することが可能である。例えば、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３のカナマイシン耐性遺伝子を標的細菌に伝達し、それらの細胞をカナマイシンに曝露することにより、遺伝子カーゴの獲得に向かった選択的圧力が生じ、これにより、レシピエント細菌がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の作用を受けるようになる。標的遺伝子ｃａｔを含み、ＧＦＰを発現するプラスミドｐＴを使用して、このアプローチを実証した（図２１Ｅ）。ＴＰ１１４はインビトロの固体培地上で約１％の頻度で伝達するため、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、抗生物質選択を行わずに集団の約１％でプラスミドの喪失を媒介できる可能性がある。ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３のみ、またはＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３とｐＴの両方を選択することにより、ｐＴを含むＫＮ０３へのＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３の伝達を測定した。コントロールとして、ＴＰ１１４をｐＴを有するＫＮ０３に伝達して、プラスミドのキュレーションがプラスミドの不和合性に起因するものではないことを確認した（図３８Ａ）。伝達頻度は、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３を含む両方のプラスミドのみについて選択した場合に大幅に低いが、ＴＰ１１４では低くならないことがわかった。これにより、プラスミドのキュレーションはＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３上に存在するｇＲＮＡ−Ｃａｓ９システムによるものであることが示唆された。ＧＦＰシグナルを使用することで、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３を含むＣＯＰ処置後にｐＴがキュアしたレシピエント細菌の数を求めることができた。この数は、選択を行わない場合、１〜７％の間の範囲であった。しかしながら、レシピエント細胞内のＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３について選択するためのカナマイシンの存在下では、プラスミドのキュレーションは１００％に達した（図３８Ｂ及び３８Ｃ）。ｐＴの喪失も、選択的抗生物質培地で６３個の接合完了体コロニーを継代培養することによって確認された（ＴＰ１１４について２１個、ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３について４２個）。ＴＰ１１４ ：： Ｋｉｌｌ３からの接合完了体のみがｐＴ損失について首尾よく確認された（４２／４２）。ｐＴ株を保有するＫＮ０３へのＴＰ１１４ ＷＴプラスミドの接合は、接合完了体におけるｐＴの喪失を引き起こさず、プラスミドの喪失が、プラスミドの不和合性ではなく、遺伝子カーゴの発現によるものであることを示している。この戦略を用いると、システムの効率をインビトロで約１％〜１００％に高めることができる。このタイプの戦略は、一度に複数の耐性遺伝子を標的とする複数のｇＲＮＡを使用するようにスケールアップすることができる。これにより、システムが１つの耐性のみを拡散しながら、いくつかの抗生物質耐性遺伝子を排除することができる。したがって、いくつかの実施形態では、耐性遺伝子を拡散し、ＣＯＰを抗生物質治療と組み合わせることが望ましい場合があると予想される。

【0206】

４．４−ＣＯＰは種にまたがってペイロードを送達できる
ＣＯＰは、表現型形質を種にまたがったペイロードとして送達することができる。他の種の細菌に有益な形質を伝達するＣＯＰの能力を、ＣＯＰとしてのＴＰ１１４を有する大腸菌ＫＮ０１ΔｄａｐＡと、個々のレシピエントとしての多様な細菌種との間の接合によって最初に試験した。レシピエント細菌（サルモネラ・エンテリカ・（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）サブストレイン ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＲ−１１、大腸菌ＭＧ１６５５Ｎｘ^R、シトロバクター・ロデンティウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）ＤＢＳ１００、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ ３５０２９、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ １３８８３、大腸菌ＫＮ０２）を、腸内細菌叢に最も頻繁にみられる細菌科であるエンテロバクター科の一部として選択した。プロセスを、固体及び液体交配条件下で、代替的な伝達マシナリー（接合プラスミドｐＶＣＲ９４、ＲＫ２４、ｐＯＸ３８、Ｒ６Ｋ、Ｒ３８８）を使用して繰り返した（図３９Ａ及び３９Ｂ）。ほとんどの伝達マシナリーは、抗生物質耐性を種をまたいで伝達することができ、これらの遺伝子コンストラクトの幅広い宿主範囲が示された。ペイロードの伝達頻度はレシピエント間で異なったが、すべてのレシピエント細菌は表現型形質を問題なく獲得できた。

【0207】

制限修飾（ＲＭ）システムの和合性は、遺伝子の水平伝達（ＨＧＴ）に役立つ。次に、伝達頻度間の差を検討した。ＨＧＴの主な障壁の１つは、制限修飾システムの和合性である。そのため、伝達された遺伝子カーゴの安定性は、レシピエント細菌が遺伝子コンストラクトを標的化して排除する能力に依存する。新しいＤＮＡ分子のターゲティングは、特定のヌクレアーゼによる認識を回避するためにＤＮＡ分子が特異的に修飾されるＲＭシステムにしばしば依存する。このように、プロバイオティクスドナーの修飾システムとレシピエントの制限システムとの間の和合性は、特定のヌクレアーゼによる遺伝子カーゴの認識率に影響する可能性がある。注目すべき点として、接合によるＤＮＡの伝達は、試験したほとんどの接合システムについて、大腸菌ＭＧ１６５５Ｎｘ^R からＥｃＮへ、及びＥｃＮからＭＧ１６５５Ｎｘ^Rへは制限されるようであったが、２つのＭＧ１６５５またはＥｃＮ株間では制限されないようであった（図４０）。この結果は、ＭＧ１６５５の修飾システムがＥｃＮの制限システムと和合性がない（また、その逆）ことを示唆している。したがって、レシピエント細菌と和合性のある修飾システムを有するドナー細菌を選択するかまたは操作することにより、レシピエント細菌内でのペイロードの安定性を高めることができる。あるいは、抗制限タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子カーゴに加えることで不和合な細菌間の伝達性を高めることができます。そのような抗制限遺伝子の１つはＲＫ２４（ｋｃｌＡ）に見られ、ＭＧ１６５５からＥｃＮへの接合の低下がないことを説明するものである。ＲＫ２４の抗制限システムにより、抗生物質耐性遺伝子のいくつかの種にまたがった伝達頻度が一般的に向上した（図３９Ａ）。したがって、ＣＯＰシステムに制限防止タンパク質を加えることは、種をまたいだカーゴの送達を改善するうえで望ましいと考えられる。

【0208】

接合プラスミドは、ドナー株からほとんど独立して機能する単離された遺伝子コンストラクトである。接合プラスミドはいくつかの属の細菌に拡散しうるため、ＤＮＡ伝達を実現するための宿主染色体からのそれらの独立性は、それらの経時的な持続にとって重要である。細胞は接合プラスミドにリソースを提供するが、そのようなプラスミドはしばしば自動調節され、その適当な機能に必要なタンパク質の多くを発現する。そのため、接合プラスミドの伝達効率は、宿主細菌によって大きく影響されるべきではない。この仮説を検証するため、２個の遠縁の大腸菌株ＭＧ１６５５Ｎｘ^Rと大腸菌ＫＮ０１を、菌株内での接合効率を比較するために選択した。図４０の結果は、接合効率がドナー株に依存しておらず、試験した株の両方で同じであることを示唆した。試験したすべての接合プラスミドの伝達効率は、２つの株が遠縁である場合であっても、両方の大腸菌ドナー株で同じであった。したがって、ＣＯＰシステムは、多くのプロバイオティクス宿主内で機能するように容易に適合させることが可能である。

【0209】

参考文献
Ａｌｉｋｈａｎ ＮＦ，Ｐｅｔｔｙ ＮＫ，Ｂｅｎ Ｚａｋｏｕｒ ＮＬ，Ｂｅａｔｓｏｎ ＳＡ．ＢＬＡＳＴ Ｒｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ （ＢＲＩＧ）：ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１ Ａｕｇ ８；１２：４０２．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−１２−４０２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１８２４４２３．
Ａｌｌａｒｄ Ｎ，Ｇａｒｎｅａｕ Ｄ，Ｐｏｕｌｉｎ−Ｌａｐｒａｄｅ Ｄ，Ｂｕｒｒｕｓ Ｖ，Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ Ｒ，Ｒｏｙ Ｓ．Ａ ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｄｏｎｏｒ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ．Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ａｕｇ；６１（８）：５６５−７４．ｄｏｉ：１０．１１３９／ｃｊｍ−２０１５−００４１．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊｕｎ ３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６１６６７１０．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｇｉｓｈ Ｗ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ，Ｍｙｅｒｓ ＥＷ，Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ．Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３−１０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２３１７１２．
Ａｎｄｒｅｗ Ｓ．（２０１０）．ＦａｓｔＱＣ：ａ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｏｎｌｉｎｅ ａｔ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／
Ａｚｉｚ ＲＫ，Ｂａｒｔｅｌｓ Ｄ，Ｂｅｓｔ ＡＡ，ＤｅＪｏｎｇｈ Ｍ，Ｄｉｓｚ Ｔ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＲＡ，Ｆｏｒｍｓｍａ Ｋ，Ｇｅｒｄｅｓ Ｓ，Ｇｌａｓｓ ＥＭ，Ｋｕｂａｌ Ｍ，Ｍｅｙｅｒ Ｆ，Ｏｌｓｅｎ ＧＪ，Ｏｌｓｏｎ Ｒ，Ｏｓｔｅｒｍａｎ ＡＬ，Ｏｖｅｒｂｅｅｋ ＲＡ，ＭｃＮｅｉｌ ＬＫ，Ｐａａｒｍａｎｎ Ｄ，Ｐａｃｚｉａｎ Ｔ，Ｐａｒｒｅｌｌｏ Ｂ，Ｐｕｓｃｈ ＧＤ，Ｒｅｉｃｈ Ｃ，Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｒ，Ｖａｓｓｉｅｖａ Ｏ，Ｖｏｎｓｔｅｉｎ Ｖ，Ｗｉｌｋｅ Ａ，Ｚａｇｎｉｔｋｏ Ｏ．Ｔｈｅ ＲＡＳＴ Ｓｅｒｖｅｒ：ｒａｐｉｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｕｂｓｙｓｔｅｍｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８ Ｆｅｂ ８；９：７５．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−９−７５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８２６１２３８．
Ｂｏｒｎ ＴＬ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ＪＳ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｏｃｔ；３（５）：６０７−１３．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０５０８６６３．
Ｂｅｎｊａｍｉｎ ＷＨ Ｊｒ，Ｔｕｒｎｂｏｕｇｈ ＣＬ Ｊｒ，Ｐｏｓｅｙ ＢＳ，Ｂｒｉｌｅｓ ＤＥ．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｅｘｐｌｏｉｔ ｔｈｅ Ｉｔｙｓ／ｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．１９８６ Ｍａｒ；５１（３）：８７２−８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：３５１２４３７．
Ｂｏｌｇｅｒ ＡＭ，Ｌｏｈｓｅ Ｍ，Ｕｓａｄｅｌ Ｂ．Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４ Ａｕｇ １；３０（１５）：２１１４−２０．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１７０．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｐｒ １．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４６９５４０４．
Ｂｒａｄｌｅｙ ＤＥ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｃｋ ａｎｄ ｔｈｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｐｉｌｉ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐｓ Ｉ１，Ｉ２，Ｉ５，Ｂ，Ｋ ａｎｄ Ｚ．Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８４ Ｊｕｎ；１３０（６）：１４８９−５０２．
Ｂｒａｄｌｅｙ ＤＥ，Ｔａｙｌｏｒ ＤＥ，Ｃｏｈｅｎ ＤＲ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｍｏｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８０ Ｓｅｐ；１４３（３）：１４６６−７０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：６１０６０１３．
Ｃａｒｒａｒｏ Ｎ，Ｍａｔｔｅａｕ Ｄ，Ｌｕｏ Ｐ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅ Ｓ，Ｂｕｒｒｕｓ Ｖ．Ｔｈｅ ｍａｓｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＩｎｃＡ／Ｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｓｌａｎｄｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１４ Ｏｃｔ ２３；１０（１０）：ｅ１００４７１４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００４７１４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１４ Ｏｃｔ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５３４０５４９．
Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ Ｄ，Ｄａｃｃｏｒｄ Ａ，Ｒｅｎｅ Ｍ，Ｂｕｒｒｕｓ Ｖ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒ （ｏｒｉＴ） ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＸＴ／Ｒ３９１ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００８ Ａｕｇ；１９０（１５）：５３２８−３８．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００１５０−０８．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｊｕｎ ６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８５３９７３３．
Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡ，Ｗａｎｎｅｒ ＢＬ．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００ Ｊｕｎ ６；９７（１２）：６６４０−５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０８２９０７９．
Ｄａｔｔａ Ｓ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ，Ｃｏｕｒｔ ＤＬ．Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｇｅｎｅ．２００６ Ｓｅｐ １；３７９：１０９−１５．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｍａｙ ４．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１６７５０６０１．
Ｄａｖｅｙ ＨＭ．Ｌｉｆｅ，ｄｅａｔｈ，ａｎｄ ｉｎ−ｂｅｔｗｅｅｎ：ｍｅａｎｉｎｇｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ａｕｇ １５；７７（１６）：５５７１−６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．００７４４−１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ ２４．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１７０５５５０．
Ｆｅｒｒｉｅｒｅｓ Ｌ，Ｈｅｍｅｒｙ Ｇ，Ｎｈａｍ Ｔ，Ｇｕｅｒｏｕｔ ＡＭ，Ｍａｚｅｌ Ｄ，Ｂｅｌｏｉｎ Ｃ，Ｇｈｉｇｏ ＪＭ．Ｓｉｌｅｎｔ ｍｉｓｃｈｉｅｆ：ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｓｉｎｇ ｓｕｉｃｉｄａｌ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ＲＰ４ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ；１９２（２４）：６４１８−２７．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００６２１−１０．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｏｃｔ ８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０９３５０９３．
Ｆｕｒｕｙａ Ｎ，Ｋｏｍａｎｏ Ｔ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｎｃＩ１ ｐｌａｓｍｉｄ Ｒ６４：ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｅｔｓ ｏｆ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｏｒｉＴ ｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ６４ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０００ Ｊｕｎ；１８２（１１）：３１９１−６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０８０９６９９．
Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ＩＹ，Ｍｉｌｌｅｒ ＪＡ，Ｋｉｌ ＹＶ，Ｌａｎｚｏｖ ＶＡ，Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ＷＳ．Ｔｎ５／ＩＳ５０ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９８ Ｓｅｐ １；９５（１８）：１０７１６−２１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：９７２４７７０．
Ｇｒｅｅｎ Ｒ，Ｒｏｇｅｒｓ ＥＪ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１３；５２９：３２９−３６．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８−０−１２−４１８６８７−３．０００２８−８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４０１１０５９．
Ｇｕｚｍａｎ ＬＭ，Ｂｅｌｉｎ Ｄ，Ｃａｒｓｏｎ ＭＪ，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ Ｊ．Ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ＰＢＡＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５ Ｊｕｌ；１７７（１４）：４１２１−３０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：７６０８０８７．
Ｈａｅｕｓｓｌｅｒ Ｍ，Ｒａｎｅｙ ＢＪ，Ｈｉｎｒｉｃｈｓ ＡＳ，Ｃｌａｗｓｏｎ Ｈ，Ｚｗｅｉｇ ＡＳ，Ｋａｒｏｌｃｈｉｋ Ｄ，Ｃａｓｐｅｒ Ｊ，Ｓｐｅｉｒ ＭＬ，Ｈａｕｓｓｌｅｒ Ｄ，Ｋｅｎｔ ＷＪ．Ｎａｖｉｇａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｉｎ ａ Ｂｏｘ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１５ Ｍａｒ １；３１（５）：７６４−６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ７１２．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｏｃｔ ２７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５３４８２１２．
Ｉｓｈｉｗａ Ａ，Ｋｏｍａｎｏ Ｔ．Ｔｈｉｎ ｐｉｌｕｓ ＰｉｌＶ ａｄｈｅｓｉｎｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ Ｒ６４ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３ Ｓｅｐ；１８５（１７）：５１９２−９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１２９２３０９２．
Ｋｏｔｕｌａ ＪＷ，Ｋｅｒｎｓ ＳＪ，Ｓｈａｋｅｔ ＬＡ，Ｓｉｒａｊ Ｌ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＪＪ，Ｗａｙ ＪＣ，Ｓｉｌｖｅｒ ＰＡ．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｒｅｃｏｒｄ ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｕｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４ Ａｐｒ １；１１１（１３）：４８３８−４３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３２１３２１１１１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｍａｒ １７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４６３９５１４．
Ｋｖｉｔｋｏ ＢＨ，Ｂｒｕｃｋｂａｕｅｒ Ｓ，Ｐｒｕｃｈａ Ｊ，ＭｃＭｉｌｌａｎ Ｉ，Ｂｒｅｌａｎｄ ＥＪ，Ｌｅｈｍａｎ Ｓ，Ｍｌａｄｉｎｉｃｈ Ｋ，Ｃｈｏｉ ＫＨ，Ｋａｒｋｈｏｆｆ−Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ Ｒ，Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ＨＰ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｒ＋ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｈｏｓｔｓ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｒ６Ｋ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ．ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅｓ．２０１２ Ｍａｒ ２０；５：１５７．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５６−０５００−５−１５７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２４３３７９７．
Ｌｉ，Ｈ （２０１３） Ａｌｉｇｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ，ｃｌｏｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｎｔｉｇｓ ｗｉｔｈ ＢＷＡ−ＭＥＭ．ａｒＸｉｖ：１３０３．３９９７ｖ１ ［ｑ−ｂｉｏ．ＧＮ］．
Ｌｕｔｚ Ｒ，Ｂｕｊａｒｄ Ｈ．Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ｔｈｅ ＬａｃＲ／Ｏ，ｔｈｅ ＴｅｔＲ／Ｏ ａｎｄ ＡｒａＣ／Ｉ１−Ｉ２ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｍａｒ １５；２５（６）：１２０３−１０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：９０９２６３０．
Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ，Ｂｏ Ｙ，Ｈａｎ Ｌ，Ｈｅ Ｊ，Ｌａｎｃｚｙｃｋｉ ＣＪ，Ｌｕ Ｓ，Ｃｈｉｔｓａｚ Ｆ，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ＭＫ，Ｇｅｅｒ ＲＣ，Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＮＲ，Ｇｗａｄｚ Ｍ，Ｈｕｒｗｉｔｚ ＤＩ，Ｌｕ Ｆ，Ｍａｒｃｈｌｅｒ ＧＨ，Ｓｏｎｇ ＪＳ，Ｔｈａｎｋｉ Ｎ，Ｗａｎｇ Ｚ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ ＲＡ，Ｚｈａｎｇ Ｄ，Ｚｈｅｎｇ Ｃ，Ｇｅｅｒ ＬＹ，Ｂｒｙａｎｔ ＳＨ．ＣＤＤ／ＳＰＡＲＣＬＥ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７ Ｊａｎ ４；４５（Ｄ１）：Ｄ２００−Ｄ２０３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ１１２９．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｎｏｖ ２９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７８９９６７４．
ＭｃＫｅｎｚｉｅ ＧＪ，Ｃｒａｉｇ ＮＬ．Ｆａｓｔ，ｅａｓｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ：ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｔｎ７ ｗｉｔｈｏｕｔ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ．ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ ２８；６：３９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１６６４６９６２．
Ｍｅｔｃａｌｆ ＷＷ，Ｊｉａｎｇ Ｗ，Ｗａｎｎｅｒ ＢＬ．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ａｌｌｅｌｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｎｅｗ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｏｓｔｓ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｒ６Ｋ ｇａｍｍａ ｏｒｉｇｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ．Ｇｅｎｅ．１９９４ Ｊａｎ ２８；１３８（１−２）：１−７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：８１２５２８３．
Ｏｒｍｏ Ｍ，Ｃｕｂｉｔｔ ＡＢ，Ｋａｌｌｉｏ Ｋ，Ｇｒｏｓｓ ＬＡ，Ｔｓｉｅｎ ＲＹ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ＳＪ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６ Ｓｅｐ ６；２７３（５２８０）：１３９２−５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：８７０３０７５．
Ｐａｐａｇｉａｎｎｉｔｓｉｓ ＣＣ，Ｔｚｏｕｖｅｌｅｋｉｓ ＬＳ，Ｋｏｔｓａｋｉｓ ＳＤ，Ｔｚｅｌｅｐｉ Ｅ，Ｍｉｒｉａｇｏｕ Ｖ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐＲ３５２１，ａｎ ＩｎｃＢ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＡＣＣ−４，ＳＣＯ−１，ａｎｄ ＴＥＭ−１ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１１ Ｊａｎ；５５（１）：３７６−８１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．００８７５−１０．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｏｃｔ １８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０９５６５９４．
Ｐｒａｓｚｋｉｅｒ Ｊ，Ｐｉｔｔａｒｄ ＡＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００５ Ｍａｒ；５３（２）：９７−１１２．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１５７３７３９７．
Ｒｉｃｅ Ｐ，Ｌｏｎｇｄｅｎ Ｉ，Ｂｌｅａｓｂｙ Ａ．ＥＭＢＯＳＳ：ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２０００ Ｊｕｎ；１６（６）：２７６−７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１０８２７４５６．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅ Ｓ，Ｍａｔｅｒｎａ ＡＣ，Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ ＳＣ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＭＣ，Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ ＲＲ，Ａｌｍ ＥＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ ＳＷ．Ｕｎｌｏｃｋｉｎｇ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ Ｊｕｌ ２８；５（７）：ｅ１１８４０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１１８４０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０６７６３７８．
Ｒｏｎｃｈｅｌ ＭＣ，Ｒａｍｏｓ ＪＬ．Ｄｕａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｒｅｉｎｆｏｒｃｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｒｈｉｚｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；６７（６）：２６４９−５６．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１１３７５１７６；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ９２９２０．
Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ Ｊ，Ａｒｇａｎｄａ−Ｃａｒｒｅｒａｓ Ｉ，Ｆｒｉｓｅ Ｅ，Ｋａｙｎｉｇ Ｖ，Ｌｏｎｇａｉｒ Ｍ，Ｐｉｅｔｚｓｃｈ Ｔ，Ｐｒｅｉｂｉｓｃｈ Ｓ，Ｒｕｅｄｅｎ Ｃ，Ｓａａｌｆｅｌｄ Ｓ，Ｓｃｈｍｉｄ Ｂ，Ｔｉｎｅｖｅｚ ＪＹ，Ｗｈｉｔｅ ＤＪ，Ｈａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ Ｖ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ Ｋ，Ｔｏｍａｎｃａｋ Ｐ，Ｃａｒｄｏｎａ Ａ．Ｆｉｊｉ：ａｎ ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ｊｕｎ ２８；９（７）：６７６−８２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２０１９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２７４３７７２．
Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ＳＮ，Ｃａｒａｔｔｏｌｉ Ａ，Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ Ｓ，Ｃｏｌｌａｕｄ Ａ，Ｅｎｄｉｍｉａｎｉ Ａ，Ｐｅｒｒｅｔｅｎ Ｖ．Ｐｌａｓｍｉｄｓ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｂｌａ（ＣＭＹ −２／４） ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｒｏｍ Ｐｏｕｌｔｒｙ，Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｍｅａｔ，ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ａ Ｎｏｖｅｌ ＩｎｃＫ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ＩｎｃＫ２．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７ Ｍａｒ １５；８：４０７．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１７．００４０７．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１７．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２８３６０８９４．
Ｓｅｋｉｚｕｋａ Ｔ，Ｋａｗａｎｉｓｈｉ Ｍ，Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｍ，Ｓｈｉｍａ Ａ，Ｋａｔｏ Ｋ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ａ，Ｍａｔｓｕｉ Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ，Ｋｕｒｏｄａ Ｍ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ，ｓｈｕｆｆｌｏｎｓ，ｉｎ ＩｎｃＩ２ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７ Ａｐｒ １９；７（１）：９２８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８−０１７−０１０８２−ｙ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２８４２４５２８．
Ｓｈａｎｅｒ ＮＣ，Ｌａｍｂｅｒｔ ＧＧ，Ｃｈａｍｍａｓ Ａ，Ｎｉ Ｙ，Ｃｒａｎｆｉｌｌ ＰＪ，Ｂａｉｒｄ ＭＡ，Ｓｅｌｌ ＢＲ，Ａｌｌｅｎ ＪＲ，Ｄａｙ ＲＮ，Ｉｓｒａｅｌｓｓｏｎ Ｍ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＭＷ，Ｗａｎｇ Ｊ．Ａ ｂｒｉｇｈｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：４０７−９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２４１３．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｍａｒ ２４．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２３５２４３９２．
Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ，Ｕ．＆ Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｊ．Ｔｈｅ ｎｏｎ−ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ − ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．２１，１２２−１５８ （２００９）．
Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ Ｃ，Ｈａｓｓａｎ ＫＡ，Ｒｏｙ Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｐ，Ｐａｕｌｓｅｎ ＩＴ，Ｗａｌｋｅｒ ＭＪ，Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ ＳＰ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｓｈａｒｉｎｇ ａ ｕｎｉｑｕｅ ＩＳ２６−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐａｔｈｏｔｙｐｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｓｔｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｎｏｖ ４；８（１１）：ｅ７８８６２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７８８６２．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４２２３８５９．

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図21F】

【図21G】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図36E】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図37D】

【図37E】

【図38】

【図39】

【図40】

【配列表】

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【国際調査報告】