特表 2021-531041 癌の早期診断のための複合バイオマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-531041(P2021-531041A)

(43)【公表日】2021年11月18日

(54)【発明の名称】癌の早期診断のための複合バイオマーカー

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20211022BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20211022BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20211022BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6886 Z

   C12Q1/02

   C12Q1/686 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2021-526182(P2021-526182)

(86)(22)【出願日】2019年7月3日

(85)【翻訳文提出日】2021年1月18日

(86)【国際出願番号】KR2019008114

(87)【国際公開番号】WO2020017791

(87)【国際公開日】20200123

(31)【優先権主張番号】10-2018-0084334

(32)【優先日】2018年7月19日

(33)【優先権主張国】KR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ

(71)【出願人】

【識別番号】521025577

【氏名又は名称】バイオインフラ ライフ サイエンス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＩＮＦＲＡ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム、チョル−ウ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ジ−ヨン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ユ ジン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR77

4B063QS25

4B063QX01

(57)【要約】

本発明は、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いた癌の早期診断方法に関し、カベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１の発現量を測定して癌を早期に診断する方法などに関する。
【選択図】図２ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）のｍＲＮＡレベルを測定する段階と、
（ｃ）前記測定されたｍＲＮＡレベルがすべて正常ヒトに比べて増加したとき、癌に分類する段階と、を含む、癌の早期診断のための情報提供方法。

【請求項2】

前記生物学的試料は、血液、尿または便であることを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。

【請求項3】

前記癌は、乳癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、前立腺癌、すい臓癌および肺癌よりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。

【請求項4】

カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含む、エクソソームを用いた癌の早期診断用組成物。

【請求項5】

前記ｍＲＮＡレベルを測定する物質は、ｍＲＮＡを増幅させることができるプライマーまたはプローブであることを特徴とする請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記エクソソームは、血液、尿または便から分離したことを特徴とする請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記癌は、乳癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、前立腺癌、すい臓癌および肺癌よりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする請求項４に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物は、１８Ｓ ｒＲＮＡまたは、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）のｍＲＮＡレベルを測定する物質をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。

【請求項9】

カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含む、エクソソームを用いた癌の早期診断用キット。

【請求項10】

前記ｍＲＮＡレベルを測定する物質は、ｍＲＮＡを増幅させることができるプライマーまたはプローブであることを特徴とする請求項９に記載のキット。

【請求項11】

前記エクソソームは、血液、尿または便から分離したことを特徴とする請求項９に記載のキット。

【請求項12】

前記癌は、乳癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、前立腺癌、すい臓癌および肺癌よりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする請求項９に記載のキット。

【請求項13】

前記キットは、１８Ｓ ｒＲＮＡまたは、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）のｍＲＮＡレベルを測定する物質をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載のキット。

【請求項14】

前記キットは、エクソソームからｍＲＮＡを分離する物質をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌の早期診断のための複合バイオマーカー（ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）に関し、より詳しくは、エクソソームを用いた癌の非侵襲的早期診断のための複合バイオマーカーなどに関する。

【背景技術】

【0002】

世界的に癌発病患者の数は、毎年増加している傾向にあり、韓国内でも２００２年の一年間に１０万人に至っている。そのうち、乳癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、前立腺癌、すい臓癌および肺癌は、全世界的に最も高い発病率を示している。このような癌の治療効率は、早期診断の有無によって変わる。癌の早期診断は、どんな治療法より効果的に癌の死亡率を減らすことができるので、癌の早期診断は、個人だけでなく、国家的次元でも医療費の節減において非常に大きい意味を有している。

【0003】

しかしながら、このような癌の診断方法は、ほとんどの場合、組織検査のような侵襲的方法（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ）であって、検査者の苦痛がひどく、感染による副作用および入院と検査後に回復期間を必要とするという点から容易に接近することができないので、一般的に症状が現れる前には、検査を受けないため、早期診断が困難である。したがって、最近には、非侵襲的方法（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ）を通した癌の診断のために、血液、尿、便などからタンパク質、ＤＮＡなどを分析する方法が活発に開発されている。特にＲＮＡの場合には、少量でも増幅が可能なので、診断正確性を顕著に増加させることができるという長所を有しているが、一般的に、ＲＮＡは、血液に存在する多量のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）により容易に破壊されるので、ＲＮＡエクソソーム診断方法は、分析の正確性が劣るという短所がある。また、それぞれの癌による診断バイオマーカーが異なるので、検査時には、多量の試料および高費用の検査費用が発生する（韓国特許出願１０−２０１１−００８００１４号）。

【0004】

これより、本発明者らは、リボヌクレアーゼから保護され得る血液内のエクソソームからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離および利用して診断の正確性および再現性を高め、多様な癌を早期に診断できる最小限の複合バイオマーカーを選定して容易に癌を早期診断できる方法について研究した結果、本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するために案出されたものであって、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いてカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）のｍＲＮＡ量を測定して、多様な種類の癌を早期に診断する方法などを提供することをその目的とする。

【0006】

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、（ａ）生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階と、（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）のｍＲＮＡレベルを測定する段階と、（ｃ）前記４個の遺伝子すべてのｍＲＮＡ量が正常ヒトに比べて増加したとき、癌に分類する段階と、を含む、癌の早期診断のための情報提供方法を提供する。

【0008】

また、本発明は、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含むエクソソームを用いた癌の早期診断用組成物を提供する。

【0009】

また、本発明は、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含むエクソソームを用いた癌の早期診断用キットを提供する。

【0010】

本発明の一具体例において、前記生物学的試料は、好ましくは、血液、尿、便などであり、より好ましくは、血液であるが、非侵襲的方法で獲得され得、エクソソームを含んでいる試料であれば、これに制限されない。また、前記エクソソームは、血液、尿、便など非侵襲的方法で獲得され得る試料から分離したエクソソームであれば、制限がない。

【0011】

本発明の他の具体例において、前記癌は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌などであるが、本発明のカベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１の増加した発現量で測定され得る癌の種類であれば、これに制限されない。

【0012】

本発明のさらに他の具体例において、前記ｍＲＮＡレベルを測定する物質は、好ましくは、ｍＲＮＡを増幅させることができるプライマー、プローブなどであるが、カベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１のｍＲＮＡの量を測定できる物質であれば、これに制限されない。

【0013】

本発明のさらに他の具体例において、前記組成物またはキットは、１８Ｓ ｒＲＮＡおよび／または、β−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）のｍＲＮＡレベルを測定する物質をさらに含むことができ、さらに含まれ得る物質は、内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用できるハウスキーピングｍＲＮＡ（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｍＲＮＡ）であれば、制限がない。また、その他にも、癌を早期に診断することができると知られている遺伝子に対するｍＲＮＡを測定できる物質をさらに含むことができる。また、エクソソーム内のｍＲＮＡを分離するための、エクソソーム溶解用物質、ｍＲＮＡ分離用物質などをさらに含むことができる。

【発明の効果】

【0014】

本発明によるカベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１からなるバイオマーカーグループは、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いて非侵襲的方法で多様な癌を高い正確性をもって早期に診断できるので、容易に接近が可能な診断方法であるだけでなく、高い正確性を有するので、癌の早期診断率を顕著に高めることができ、これを通して癌による治療効率を顕著に増加させることができるものと期待される。そして、癌治療後の再発の有無を容易にモニタリングして、再発による治療効率も増加させることができるものと期待される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１ａおよび図１ｂは、本発明の一実施例によるｑＲＴ−ＰＣＲを用いた癌の早期診断用複合バイオマーカーを選別した結果を示す図である。

【図2】図２ａおよび図２ｂは、本発明の一実施例によるｑＲＴ−ＰＣＲを用いた癌の早期診断用複合バイオマーカーを再検証して選別した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

癌の死亡率を最も効果的に減らすことができる方法は、癌の早期診断であり、癌を早期に診断できると、癌による再発率、死亡率などを実質的に減少させることができるものと期待される。

【0017】

本発明では、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いてカベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１からなる複合バイオマーカーのｍＲＮＡレベルを測定することによって、高い正確性をもって非侵襲的方法で多様な癌を早期に診断できるので、癌の早期診断用途に効果的に使用され得るものと期待される。

【0018】

本明細書において「エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、細胞から分泌される二重脂質膜（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ）を有している小さい形態の小胞体を包括的に意味し、エクソソームは、多様な細胞から分泌され、略３０〜２００ｎｍの直径を有していると知られている。このようなエクソソーム内には、細胞に由来する多様な種類のタンパク質、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが含まれており、本発明のエクソソームは、好ましくは、自然的に分泌されたものであるが、人工的に分泌されたものまたは製造されたものも含まれ得る。

【0019】

本明細書において「生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」とは、非侵襲的に獲得され得る試料であって、エクソソームを含んでいるすべての試料を意味し、好ましくは、血液、血しょう、血清、骨髄、組織、細胞、唾液、喀痰、髪の毛、尿、便などであってもよく、より好ましくは、血液、尿、便などであってもよいが、カベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１からなる複合バイオマーカーのｍＲＮＡ量を測定できる試料であれば、これに制限されない。

【0020】

本明細書において「情報提供方法（ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、癌の早期診断に関する情報を提供する方法であって、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いてカベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１のｍＲＮＡレベルが増加したとき、癌が誘発された可能性に関する情報を獲得する方法を意味する。

【0021】

本明細書において「ｍＲＮＡのレベルを測定する方法」は、癌を診断するためにエクソソームからカベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１遺伝子のｍＲＮＡ存在の有無およびｍＲＮＡの量を確認する過程であって、エクソソーム内に含まれているｍＲＮＡの量を測定することによって確認することができる。これのための分析方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡマイクロアレイチップ、Ｌｕｍｉｎｅｘを用いたＴａｒｇｅｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）−ＴＡＧ^ＴＭＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅなどがあるが、これらに限定されるものではない。

【0022】

本明細書において、「キット（ｋｉｔ）」とは、エクソソーム内のカベオリン−１、アデニンヌクレオチド転位酵素２、形質転換成長因子ベータ１、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１遺伝子のｍＲＮＡ量を測定して癌の発病の有無を予測できる検診用機器を意味し、患者から分離した生物学的試料から前記遺伝子のｍＲＮＡ量を測定できる形態であれば、制限がない。好ましくは、前記ｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するプローブ（ｐｒｏｂｅ）またはプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）セットを含むことができ、前記「プローブまたはプライマー」は、前記ｍＲＮＡに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｏｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を意味するが、前記遺伝子のｍＲＮＡ量を測定できる物質であれば、これに制限されない。

【0023】

以下、本発明の理解を助けるために、下記実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

【実施例】

【0024】

実施例１：正常ヒトと癌患者の血液試料準備
癌の早期診断用複合バイオマーカーを選別するために、正常ヒトと癌患者の血液試料を準備した。癌患者の試料は、大学病院で癌と確診された患者の血液試料を使用し、正常ヒトの試料は、癌蛋白診断用バイオマーカーを用いた検査結果、正常範囲であるヒトの血液試料を用いた。それぞれの試料は、−８０℃で冷凍保管し、ＳＳＴ（ｓｅｒｕｍ ｓｅｐａｒａｔｏｒ ｔｕｂｅ）真空採血管に採血した血清（ｓｅｒｕｍ）とＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）真空採血管に採血した血しょう（ｐｌａｓｍａ）を使用した。それぞれの試料に含まれているエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）内のＲＮＡを抽出するために、下記表１のように統合試料（ｐｏｏｌｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ）を準備した。準備された統合試料は、２００μｌずつ新しいチューブに分注して、−８０℃で冷凍保管し、すべての試料は、同一に１回の冷凍過程と解凍過程を経ることを原則とした。

【0025】

【表1】

【0026】

実施例２：エクソソーム内のＲＮＡ抽出
実施例１の方法で準備された統合試料からエクソソーム内のｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）を抽出するために、Ｎｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）ＮＸ−４８（（株）ジェノリューション）を使用した。より詳しくは、Ｎｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）ＮＸ−４８を用いて血しょうまたは血清内のエクソソームを溶解（ｌｙｓｉｓ）させ、エクソソームに含まれていた多様なタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）などからＲＮＡのみを純粋に抽出した。抽出されたＲＮＡは、ナノドロップ（ｎａｎｏ−ｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍの波長で吸光度を測定してＲＮＡ濃度を定量し、２６０／２８０ ｒａｔｉｏと２６０／２３０ ｒａｔｉｏを用いてＲＮＡ純度および汚染程度を確認した。

【0027】

実施例３：癌の早期診断用複合バイオマーカーの選別
３．１．癌の早期診断用複合バイオマーカーの一次的選別
癌の早期診断用複合バイオマーカーを選別するために、前記実施例２と同じ方法で抽出したＲＮＡ １００ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としてｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ^ＴＭＰｒｏｂｅ Ｌｏ−ＲＯＸ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ装備（ＡＢＩ）を使用して進めた。癌の早期診断のための複合バイオマーカーの候補としては、（ａ）癌の増殖（ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関与する遺伝子、（ｂ）癌の進行（ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）に関与する遺伝子、（ｃ）腫瘍免疫反応（ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に関与する遺伝子、および（ｄ）癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）関連遺伝子を調査して、一次的に２５個の候補遺伝子を選定し、癌細胞株由来のエクソソーム（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。

【0028】

癌細胞株由来のエクソソームのｑＲＴ−ＰＣＲ結果、２５個の候補遺伝子のうちカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、ベータ−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電圧−依存性陰イオンチャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｎｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、形質転換成長因子ベータ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１；ＴＧＦ−β１）、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素−結合多機能タンパク質１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−１；ＡＩＭＰ−１）、ノッチ１（ＮＯＴＣＨ１）、ケーラス（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎ ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ；ＫＲＡＳ）、ヒストン脱アセチル化酵素（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ １；ＨＤＡＣ１）、リシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＫＡＲＳ）、形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β３；ＴＧＦ−β３）、癌抗原１２５（Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ １２５；ＣＡ−１２５）、エクト−ノックスジスルフィドチオール交換体２（ｅｃｔｏ−ＮＯＸ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｔｈｉｏｌ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ２；ＥＮＯＸ２）、および癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）の１４個のｍＲＮＡ量が増加したことを確認した。前記１４個の遺伝子を対象として、実施例１および２と同じ方法で準備された癌患者の試料から抽出されたｍＲＮＡを鋳型として用いてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＮＡ濃度の標準化のための内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ）としては、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）および１８Ｓ ｒＲＮＡを使用した。それぞれの遺伝子に対するプローブ（ｐｒｏｂｅ）情報は、下記表２に記載した。ＲＮＡ濃度１００ｎｇを基準としてｑＲＴ−ＰＣＲを実施したとき、Ｃｔ値が３５以上であるＴＧＦ−β３、ＣＡ１２５、ＥＮＯＸ２およびＣＥＡ遺伝子を除いて、ｍＲＮＡの量を測定した。その結果は、図１に示した。

【0029】

【表2】

【0030】

図１に示されたように、正常ヒトの発現レベルを基準として２倍以上有意的に増加したｍＲＮＡであるＣａｖｅｏｌｉｎ−１、β−ｃａｔｅｎｉｎ、ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、ＴＧＦ−β１、およびＡＩＭＰ−１遺伝子６個を選別した。このうちＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１は、癌の増殖と関係していると知られている遺伝子であり、ＡＩＭＰ−１は、癌の進行と、ＴＧＦ−β１は、腫瘍の免疫反応と、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１およびβ−ｃａｔｅｎｉｎは、癌の幹細胞と関係していると知られている遺伝子である。

【0031】

３．２．癌の早期診断用複合バイオマーカーの再検証
実施例３．１の方法で選別された６個の遺伝子を多様な癌の早期診断用複合バイオマーカーとして使用可能であるかを再検証するために、６個の遺伝子を対象として癌患者由来のエクソソームから分離したｍＲＮＡを鋳型としてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。その結果は、図２に示した。

【0032】

図２に示されたように、６個の遺伝子を複合バイオマーカーで組み合わせることより、４個の遺伝子であるＡＩＭＰ−１、ＴＧＦ−β１、ＡＮＴ２、およびＣａｖｅｏｌｉｎ−１を組み合わせて使用した複合バイオマーカーの場合、乳癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肝癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌などの多様な癌の早期診断の正確性が向上することを確認することができた。

【0033】

前記結果を通して、癌に関連していると知られている多様な遺伝子の組合せのうち本発明のＡＩＭＰ−１、ＴＦＧ−β１、ＡＮＴ２、およびＣａｖｅｏｌｉｎ−１の組合せを用いると、多様な癌の早期診断の正確性を顕著に増加させることができるだけでなく、血液内のエクソソームを用いた非侵襲的診断方法で容易な接近が可能なので、癌の早期診断効率を顕著に向上させることができるものと期待される。

【0034】

上記記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。

【産業上の利用可能性】

【0035】

本発明は、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いた癌の早期診断方法に関し、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いて非侵襲的方法で多様な癌を高い正確性をもって早期に診断できるだけでなく、治療後に再発の有無のモニタリングにも用いられるので、癌の早期診断率の増加による癌治療費用の減少と治療後にも不要な検査費用を減少させることができるものと期待される。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【国際調査報告】