特表 2021-532175 核酸ナノ粒子、それを含む薬学的組成物、アドリアマイシン含有薬物及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-532175(P2021-532175A)

(43)【公表日】2021年11月25日

(54)【発明の名称】核酸ナノ粒子、それを含む薬学的組成物、アドリアマイシン含有薬物及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/54 20170101AFI20211029BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20211029BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211029BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20211029BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20211029BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20211029BHJP

   C07K 17/08 20060101ALN20211029BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/54ZNA

   A61K31/704

   A61P35/00

   C12N15/11 Z

   C12N15/87 Z

   C12N15/113 Z

   C07K17/08

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】112

(21)【出願番号】特願2021-524092(P2021-524092)

(86)(22)【出願日】2019年7月12日

(85)【翻訳文提出日】2021年3月12日

(86)【国際出願番号】CN2019095766

(87)【国際公開番号】WO2020011248

(87)【国際公開日】20200116

(31)【優先権主張番号】201810766003.4

(32)【優先日】2018年7月12日

(33)【優先権主張国】CN

(31)【優先権主張番号】201810765976.6

(32)【優先日】2018年7月12日

(33)【優先権主張国】CN

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】521017974

【氏名又は名称】百薬智達（北京）納米生物技術有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＩ ＹＡＯ ＺＨＩ ＤＡ（ＢＥＩＪＩＮＧ）ＮＡＮＯＢＩＯ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002734

【氏名又は名称】特許業務法人藤本パートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】王 力源

(72)【発明者】

【氏名】王 萌

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA10

4C086EA10

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA13

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA72

4H045FA81

(57)【要約】

本発明は、核酸ナノ粒子、それを含む薬学的組成物、アドリアマイシン含有薬物及びその製造方法を提供する。該核酸ナノ粒子は、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列を含み核酸ドメインを有し、ａ配列はａ１配列、又はａ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ｂ配列はｂ１配列、又はｂ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ｃ配列はｃ１配列、又はｃ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含む。該核酸ナノ粒子は、上記３本の配列又はそれらの変異配列を含むことで、自己組織化して核酸ドメインを形成できるとともに、担体とすることができる。担体とされる場合、核酸薬物を担持して送達できるとともに、化学薬物などのその他の生物活性物質の担持及び送達にも適用され、したがって、相対的な普遍性を有する。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ配列、ｂ配列及びｃ配列を含む核酸ドメインを有し、
前記ａ配列はａ１配列、又は前記ａ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、前記ｂ配列はｂ１配列、又は前記ｂ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、前記ｃ配列はｃ１配列、又は前記ｃ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、
前記ａ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１：５’−ＣＣＡＧＣＧＵＵＣＣ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２：５’−ＣＣＡＧＣＧＴＴＣＣ−３’であり、
前記ｂ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３：５’−ＧＧＵＵＣＧＣＣＧ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４：５’−ＧＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’であり、
前記ｃ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＧ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＧ−３’である、ことを特徴とする核酸ナノ粒子。

【請求項2】

前記ａ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１であり、前記ｂ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３であり、前記ｃ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５である場合、前記ａ配列、前記ｂ配列、前記ｃ配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの塩基が挿入、欠失又は置換された配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項3】

前記塩基の挿入、欠失又は置換は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２で示される配列の５’末端から１位、２位、４位又は５位の塩基、及び／又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２で示される配列の５’末端から８〜１０位の塩基間、及び／又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４で示される配列の５’末端から１〜３位の塩基間、及び／又は
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４で示される配列の５’末端から６位〜９位の塩基間、及び／又は
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される配列の５’末端から１〜４位の塩基間、及び／又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される配列の５’末端から９〜１２位の塩基間で発生する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項4】

前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列は、自己組織化して下記式（１）で表される構造となり、

【化1】

但し、Ｗ−ＣはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、Ｎ及びＮ’は非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、いずれかの位置のＷ−Ｃはそれぞれ独立してＣ−Ｇ又はＧ−Ｃから選ばれ、
前記ａ配列において、５’末端からの最初のＮはＡであり、２番目のＮはＧであり、３番目のＮはＵ又はＴであり、４番目のＮはＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、
前記ｂ配列において、５’端からの最初のＮ’はＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、２番目のＮ’はＵ又はＴであり、３番目のＮ’はＣであり、
前記ｃ配列において、５’末端から３’末端への方向のＮＮＮＮ配列はＣＡＵＡ又はＣＡＴＡである、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項5】

前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列は、
（１）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＣＵＵＣＧＣＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３’；
（２）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＧＵＵＣＧＣＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’；
（３）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３’
ｂ配列：５’−ＧＣＵＵＣＧＣＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３’；
（４）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＣＵＵＣＧＧＧＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＣＣＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３’；
（５）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＧＵＵＣＧＧＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’；
（６）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＧＵＵＣＧＧＣＣ−３’
ｃ配列：５’−ＧＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’；
（７）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３’
ｂ配列：５’−ＧＣＵＵＣＧＧＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３’；
（８）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’；
（９）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’；
（１０）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’
ｂ配列：５’−ＧＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’；
（１１）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＣＴＴＣＧＧＧＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＣＣＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’；
（１２）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’；
（１３）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’
ｂ配列：５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＣ−３’
ｃ配列：５’−ＧＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’；
（１４）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’
ｂ配列：５’−ＧＣＴＴＣＧＧＣＧ−３’
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’
という組の中の任意の１組である、ことを特徴とする請求項４に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項6】

前記核酸ドメインは、前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列のいずれかの配列の５’末端及び／又は３’末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第１の伸長セグメントをさらに含み、
好ましくは、前記第１の伸長セグメントは、
（１）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＡ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＵＧＧＧ−３’
（２）ａ鎖３’末端：５’−ＧＧＧ−３’、ｂ鎖５’末端：５’−ＣＣＣ−３’
（３）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＡ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＵＧＧ−３’
（４）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＧ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＣＧＧＧ−３’
（５）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＣ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＧＧＧＧ−３’
（６）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＣ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＧＧＧ−３’
（７）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＧ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＣＧＧ−３’
（８）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＡ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＴＧＧＧ−３’
（９）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＡ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＴＧＧ−３’
という組から選ばれる少なくとも任意の１組である、ことを特徴とする請求項４に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項7】

前記核酸ドメインは、前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列のいずれかの配列の５’末端及び／又は３’末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第２の伸長セグメントをさらに含み、
好ましくは、前記第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対の伸長配列であり、
より好ましくは、第２の伸長セグメントは、１〜１０個のＣＧ塩基対の伸長配列である、ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項8】

前記核酸ドメインは、
第１組：ａ鎖５’末端：５’−ＣＧＣＧＣＧ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＣＧＣＧＣＧ−３’
第２組：ａ鎖３’末端：５’−ＣＧＣＣＧＣ−３’、ｂ鎖５’末端：５’−ＧＣＧＧＣＧ−３’
第３組：ｂ鎖３’末端：５’−ＧＧＣＧＧＣ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＧＣＣＧＣＣ−３’
という組の中の少なくとも１組の第２の伸長セグメントをさらに含む、ことを特徴とする請求項７に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項9】

前記第２伸長セグメントは、ＣＧ塩基対とＡＴ／ＡＵ塩基対の両方を含む伸長配列であり、好ましくは、前記第２伸長セグメントは、２〜５０個の塩基対の伸長配列である、ことを特徴とする請求項７に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項10】

前記第２の伸長セグメントは、連続する２〜８個のＣＧ塩基対の配列と連続する２〜８個のＡＴ／ＡＵ塩基対の配列とが交互に配置された伸長配列であり、又は
前記第２の伸長セグメントは、１つのＣＧ塩基対の配列と１つのＡＴ／ＡＵ塩基対の配列とが交互に配置された伸長配列である、ことを特徴とする請求項９に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項11】

前記ａ配列、ｂ配列、及びｃ配列において、塩基、リボース、及びリン酸エステルが少なくとも１つの修飾可能な部位を有し、前記修飾可能な部位のいずれかが、−Ｆ、メチル基、アミノ基、ジスルフィド基、カルボニル基、カルボキシル基、メルカプト基、及びアルデヒド基のいずれかの修飾リンカーによって修飾されており、
好ましくは、前記ａ配列、ｂ配列及びｃ配列におけるＣ又はＵ塩基に２’−Ｆ修飾を有する、ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項12】

前記核酸ドメインに結合されている生物活性物質をさらに含む、ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項13】

前記核酸ドメインの相対分子量と前記生物活性物質の総相対分子量との比が１：１以上であり、
好ましくは、前記生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボーススイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、薬物、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類、及びレシチンのうちの１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項１２に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項14】

前記生物活性物質は、前記標的ヘッド、前記フルオレセイン、及び前記ｍｉＲＮＡであり、
前記標的ヘッドは、前記ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれか、好ましくは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５’末端又は３’末端に位置するか、又は、前記核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、
前記ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲＮＡであり、前記フルオレセインは、前記抗ｍｉＲＮＡの５’末端又は３’末端に修飾され、前記ｍｉＲＮＡは、前記ａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のうちのいずれか１つ又は複数の位置にあり、
好ましくは、前記標的ヘッドは葉酸又はビオチンであり、前記フルオレセインはＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、前記抗ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲ−２１である、ことを特徴とする請求項１３に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項15】

前記薬物は、肝がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん、子宮がん、卵巣がん、黒色腫、白血病、認知症、強直性脊椎炎、悪性リンパ腫、気管支がん、関節リウマチ、ＨＢＶ Ｂ型肝炎、多発性骨髄腫、膵臓がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、鼻咽頭がん、食道がん、口腔がん、エリテマトーデスの治療薬であり、
好ましくは、前記頭頸部がんは、脳がん、神経芽細胞腫又はグリア芽細胞腫である、ことを特徴とする請求項１３に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項16】

前記薬物は、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基、及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物である、ことを特徴とする請求項１３に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項17】

前記タンパク質は、ＳＯＤ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥＧＦＲ及びＰＳＭＡの抗体又はアプタマーのうちの１つ又は複数であり、
前記ビタミンは、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、前記フェノール類は茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである、ことを特徴とする請求項１３に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項18】

前記生物活性物質は、
方式１：物理的インターカレーション
方式２：共有結合
という方式のいずれかの方式で核酸ドメインに結合されている、ことを特徴とする請求項１２に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項19】

前記生物活性物質が物理的インターカレーションの方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記生物活性物質と前記核酸ドメインは、１〜２００：１のモル比で物理的にインターカレーションされている、ことを特徴とする請求項１８に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項20】

前記生物活性物質が物理的インターカレーションの方式及び共有結合の方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記物理的インターカレーションの方式で結合されている生物活性物質と前記共有結合の方式で結合されている薬物とのモル比が１〜２００：１である、ことを特徴とする請求項１９に記載の核酸ナノ粒子である。

【請求項21】

前記共有結合の方式で結合されている生物活性物質は、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により結合されており、
好ましくは、前記溶媒はパラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ又は氷酢酸から選ばれ、
好ましくは、前記リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれ、
好ましくは、前記クリック結合は、生物活性物質前駆体と前記核酸ドメインとを同時にアルキニル基又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することである、ことを特徴とする請求項１８に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項22】

前記生物活性物質がクリック結合の方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、２’ヒドロキシ基、カルボキシル基又はアミノ基から選ばれ、前記核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、Ｇ環外アミノ基、２’−ヒドロキシ基、Ａアミノ基又は２’−ヒドロキシ基から選ばれる、ことを特徴とする請求項２１に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項23】

前記核酸ナノ粒子の粒子径が１〜１００ｎｍ、好ましくは５〜５０ｎｍ、より好ましくは１０〜３０ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１５ｎｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項24】

請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子を含む、ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項25】

アドリアマイシンと、請求項１〜１２のいずれか１項又は請求項２３に記載の核酸ナノ粒子とを含む、ことを特徴とするアドリアマイシン含有薬物。

【請求項26】

アドリアマイシンが物理的結合及び／又は共有結合の方式で前記核酸ナノ粒子に担持され、アドリアマイシンと前記核酸ナノ粒子とのモル比が２〜３００：１、好ましくは１０〜５０：１、より好ましくは１５〜２５：１である、ことを特徴とする請求項２５に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項27】

前記核酸ナノ粒子は、生物活性物質をさらに含み、前記生物活性物質は、前記核酸ドメインに結合されており、前記生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボーススイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類、レシチン、及びアドリアマイシン以外の小分子薬物のうちの１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項２５に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項28】

前記核酸ドメインの相対分子量をＮ_１とし、アドリアマイシンと前記生物活性物質との総相対分子量をＮ_２とすると、Ｎ_１／Ｎ_２≧１：１である、ことを特徴とする請求項２７に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項29】

前記生物活性物質は、前記標的ヘッド、前記フルオレセイン及び前記ｍｉＲＮＡのうちの１つ又は複数であり、
前記標的ヘッドは、前記ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれか、好ましくはａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５’末端又は３’末端に位置するか、又は前記核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、
前記ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲＮＡであり、前記フルオレセインは前記抗ｍｉＲＮＡの５’末端又は３’末端に修飾され、前記ｍｉＲＮＡは前記ａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のうちのいずれか１つ又は複数の位置にあり、
好ましくは、前記標的ヘッドは、葉酸又はビオチンであり、前記フルオレセインは、ＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、
前記抗ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲ−２１である、ことを特徴とする請求項２７に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項30】

アドリアマイシン以外の小分子薬物は、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基、及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物である、ことを特徴とする請求項２７に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項31】

前記タンパク質は、ＳＯＤ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ及びＥＧＦＲ、ＰＳＭＡのうちの１つ又は複数であり、
前記ビタミン類は、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、
前記フェノール類は茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである、ことを特徴とする請求項２７に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項32】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子を提供するステップと、
物理的結合及び／又は共有結合の方式でアドリアマイシンを前記核酸ナノ粒子に担持して、前記アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含む、ことを特徴とするアドリアマイシン含有薬物の製造方法。

【請求項33】

物理的結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、
アドリアマイシンと、前記核酸ナノ粒子と、第１の溶媒とを混合して撹拌して、プレミックス系を得るステップと、
前記プレミックス系中の遊離物質を除去して、前記アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含み、
好ましくは、前記第１の溶媒は、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数であり、
好ましくは、前記プレミックス系中の遊離物質を除去するステップは、前記プレミックス系を無水エタノールと混合し、１０℃未満の温度条件下で前記アドリアマイシン含有薬物を析出させ、より好ましくは、０〜５℃の温度条件下でアドリアマイシン含有薬物を析出させるステップを含む、ことを特徴とする請求項３２に記載の製造方法。

【請求項34】

共有結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、
アドリアマイシン溶液を調製するステップと、
前記アドリアマイシン溶液を、ホルムアルデヒドによる仲介作用により前記核酸ナノ粒子のＧ環外アミノ基と反応させて反応系を得るステップと、
前記反応系を精製して、前記アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含み、
好ましくは、前記反応のステップは
前記アドリアマイシン溶液と、パラホルムアルデヒド溶液と、前記核酸ナノ粒子とを混合し、遮光条件下で反応させて、反応系を得るステップを含み、前記パラホルムアルデヒド溶液の濃度が３．７〜４ｗｔ％であることが好ましく、前記パラホルムアルデヒド溶液がパラホルムアルデヒドと第２の溶媒とを混合した溶液であり、前記第２の溶媒がＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ、及び氷酢酸のうちの１つ又は複数であることが好ましい、ことを特徴とする請求項３２に記載の製造方法。

【請求項35】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子における前記核酸ドメインに対応する一本鎖を自己組織化して、前記核酸ドメインを得るステップを含む、核酸ナノ粒子を製造するステップをさらに含み、
好ましくは、前記核酸ドメインを得た後、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の生物活性物質を物理的結合及び／又は共有結合の方式で前記核酸ドメインに担持して、前記核酸ナノ粒子を得るステップをさらに含み、前記生物活性物質中の薬物は、アドリアマイシン以外の小分子薬物である、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項36】

前記生物活性物質を共有結合の方式で担持する過程において、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により担持し、
好ましくは、前記溶媒共有結合に用いられる第３の溶媒は結合媒体とされ、前記第３の溶媒はパラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数であり、
好ましくは、前記リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれ、
好ましくは、前記クリック結合は、生物活性物質前駆体と前記核酸ドメインとを同時にアルキニル又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することである、ことを特徴とする請求項３４に記載の製造方法。

【請求項37】

前記生物活性物質がクリック結合の方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、２’ヒドロキシ基、カルボキシル基又はアミノ基から選ばれ、前記核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、Ｇ環外アミノ基、２’−ヒドロキシ基、Ａアミノ基又は２’−ヒドロキシ基から選ばれる、ことを特徴とする請求項３５に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、送達担体の分野に関し、具体的には、核酸ナノ粒子、それを含む薬学的組成物、アドリアマイシン含有薬物及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

がんは、人間の健康を脅かす最も主要な疾患となっており、細胞標的投与、遺伝子治療、ＲＮＡｉなどを含む薬物治療はがんを治癒するための最先端研究分野である。しかし、多くの抗がん剤は、水に溶けにくいか、安定性が低いなどの欠点がある。例えばアドリアマイシンなどは、溶解性が低いため、生体にうまく利用されにくく、水溶性の課題を解決することはこのような薬物製剤の臨床応用の肝心な点である。さらに、腫瘍治療及び診断薬物の作用はほとんどが非選択的であり、通常、治療用量では正常組織器官に対する毒性及び副作用が大きい。多くのタンパク質類物質の送達と同様に、核酸類物質は、胃腸管での分解、及び生物学的利用率の低下が、ｓｉＲＮＡの経口送達における主な障害である。静脈内送達であっても、従来のｓｉＲＮＡは血清因子によって速やかに分解されるので、標的位置に到達することができなかった。

【0003】

薬物活性成分は、病巣部位に効果的に到達できないか、正常な細胞や組織に過剰に作用するため、治療目的を実現できないか、毒性や副作用を引き起こす。例えば、卵巣がん、小細胞肺がん、精巣がん、頭頸部扁平上皮がん、子宮頸部がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、胸膜中皮腫、黒色腫及び子宮内膜がんの化学療法治療に広く使用されているプラチナ系薬物は典型的なものである。しかし、プラチナ系薬物は、標的性が悪く、一般的な用量では治療効果を達成することができず、多用量では大量の薬物が正常な細胞や組織に作用して、化学療法後の人体の骨髄抑制作用、胃腸管反応、腎臓毒性や神経毒性などの不良反応を引き起こすため、プラチナ系化学療法薬物の使用が制限されている。

【0004】

薬物活性成分の標的性が低いことによって生じる副作用を軽減するために、薬物送達担体が開発され、その作用は主に薬物活性成分を担持し、活性成分を血液又は組織細胞内に送達して疾患を治療することである。例えば、がんの化学療法では、送達担体は、化学療法薬をがん細胞内に輸送し、薬物活性成分をがん細胞内ＤＮＡと相互作用させ、腫瘍の抑制作用を生じさせる。現在一般的に使用されているプラチナ系化学療法薬物の送達担体には、リポソーム、ミセル、ナノカプセル、高分子−プラチナ複合体やカーボンナノチューブなどがある。

【0005】

さらに、現在、様々な薬物の標的輸送を実現するための様々な方法が存在している。遺伝子銃、エレクトロポレーション装置などの器具や装置を用いて実現することがある。これらの方法は、遺伝子担体を使用する必要がない反面、トランスフェクションの効率が通常低く、操作が複雑で、組織に対する損傷も大きい。また、アデノウイルス、レンチウイルスなどのウイルス担体によって媒介されることもあり、このウイルス担体は、高いインビトロトランスフェクション活性を有するが、その免疫原性と突然変異を起こしやすいという欠点により、インビボ輸送に大きな安全上のリスクをもたらす。また、非ウイルス担体、特に生分解性高分子材料も薬物の標的輸送を達成するために使用される。非ウイルス担体の利点は、主に、所望のトランスフェクション活性を確保しながら、ウイルス担体による免疫原性や多くの炎症反応を大幅に低下できることである。

【0006】

上記の多種の標的輸送方式のうち、現在、非ウイルス担体は最も多く研究されており、しかも一般的には、以下の数種の担体が設計されている。（ａ）カチオン性リポソーム、（ｂ）ポリカチオン性遺伝子担体。中でも、現在、盛んに研究されているのは主にポリカチオン性遺伝子担体、及び遺伝子物質の標的輸送に適するようにするカチオン性リポソームの修飾である。カチオン性リポソームは、高いインビボ及びインビトロトランスフェクション活性を有するが、表面の正電荷によりそのインビボの正常な分布が影響を受けてしまい、また、動物試験では免疫原性と炎症反応を引き起こす可能性がある。ポリカチオン性遺伝子担体の発展はすでに成熟しているが、構造を設計する際に、標的基が構造の表面にあることを保証しにくく、毒性とトランスフェクション活性との設計矛盾が存在し、また、それを結合すると、体内で無毒化分解を実現しにくい。しかし、これらのことから、既存の非ウイルス担体の研究は核酸薬物に着目したものが多く、非核酸系の薬物の送達効果についてはまだ価値のある報告がないことが分かった。

【0007】

従って、どのように信頼できる薬物担体を提供するかは現在の薬物臨床応用の制限を解決するキーである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の主な目的は、従来の薬物の臨床使用が制限されるという問題を解決する信頼できる薬物担体を提供するように、核酸ナノ粒子、それを含む薬学的組成物、アドリアマイシン含有薬物及びその製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を実現するために、本発明の一態様によれば、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列を含む核酸ドメインを有し、ａ配列はａ１配列、又はａ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ｂ配列はｂ１配列、又はｂ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ｃ配列はｃ１配列、又はｃ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ａ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１：５’−ＣＣＡＧＣＧＵＵＣＣ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２：５’−ＣＣＡＧＣＧＴＴＣＣ−３’であり、ｂ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３：５’−ＧＧＵＵＣＧＣＣＧ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４：５’−ＧＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’であり、ｃ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＧ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＧ−３’である、核酸ナノ粒子が提供される。

【0010】

さらに、ａ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１であり、ｂ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３であり、ｃ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５である場合、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの塩基が挿入、欠失又は置換された配列を含む。

【0011】

さらに、塩基挿入、欠失又は置換は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２で示される配列の５’末端から１位、２位、４位又は５位の塩基、及び／又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２で示される配列の５’末端から８〜１０位の塩基間、及び／又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４で示される配列の５’末端から１〜３位の塩基間、及び／又は
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４で示される配列の５’末端から６位〜９位の塩基間、及び／又は
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される配列の５’末端から１〜４位の塩基間、及び／又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される配列の５’末端から９〜１２位の塩基間で発生する。

【0012】

さらに、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列は、自己組織化して下記式（１）で表される構造となり、

【化1】

但し、Ｗ−ＣはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、Ｎ及びＮ’は非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、いずれかの位置のＷ−Ｃはそれぞれ独立してＣ−Ｇ又はＧ−Ｃから選択され、ａ配列において、５’末端からの最初のＮはＡであり、２番目のＮはＧであり、３番目のＮはＵ又はＴであり、４番目のＮはＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、ｂ配列において、５’末端からの最初のＮ’はＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、２番目のＮ’はＵ又はＴであり、３番目のＮ’はＣであり、ｃ配列において、５’末端から３’末端への方向でのＮＮＮＮ配列はＣＡＵＡ又はＣＡＴＡである。

【0013】

さらに、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列は、以下の任意の１組である。
（１）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＣＵＵＣＧＣＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３’、
（２）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＧＵＵＣＧＣＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’、
（３）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３’、
ｂ配列：５’−ＧＣＵＵＣＧＣＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３’、
（４）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＣＵＵＣＧＧＧＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＣＣＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３’、
（５）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＧＵＵＣＧＧＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’、
（６）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＧＵＵＣＧＧＣＣ−３’、
ｃ配列：５’−ＧＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’、
（７）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３’、
ｂ配列：５’−ＧＣＵＵＣＧＧＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３’、
（８）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’、
（９）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’、
（１０）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’、
ｂ配列：５’−ＧＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’、
（１１）ａ配列：５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＣＴＴＣＧＧＧＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＣＣＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’、
（１２）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’、
（１３）ａ配列：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、
ｂ配列：５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＣ−３’、
ｃ配列：５’−ＧＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’、
（１４）ａ配列：５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’、
ｂ配列：５’−ＧＣＴＴＣＧＧＣＧ−３’、
ｃ配列：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’。

【0014】

さらに、核酸ドメインは、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のいずれかの配列の５’末端及び／又は３’末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第１の伸長セグメントをさらに含み、好ましくは、第１の伸長セグメントは、以下から選ばれる任意の１組である。（１）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＡ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＵＧＧＧ−３’；（２）ａ鎖３’末端：５’−ＧＧＧ−３’、ｂ鎖５’末端：５’−ＣＣＣ−３’；（３）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＡ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＵＧＧ−３’；（４）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＧ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＣＧＧＧ−３’；（５）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＣ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＧＧＧＧ−３’；（６）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＣ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＧＧＧ−３’；（７）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＧ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＣＧＧ−３’；（８）ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＡ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＴＧＧＧ−３’；（９）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＡ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＴＧＧ−３’。

【0015】

さらに、核酸ドメインは、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のいずれかの配列の５’末端及び／又は３’末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第２の伸長セグメントをさらに含み、好ましくは、第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対の伸長配列であり、より好ましくは、第２の伸長セグメントは、１〜１０個のＣＧ塩基対の伸長配列である。

【0016】

さらに、核酸ドメインは、以下の少なくともの１組の第２の伸長セグメントをさらに含む。第１組：ａ鎖５’末端：５’−ＣＧＣＧＣＧ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＣＧＣＧＣＧ−３’；第２組：ａ鎖３’末端：５’−ＣＧＣＣＧＣ−３’、ｂ鎖５’末端：５’−ＧＣＧＧＣＧ−３’；第３組：ｂ鎖３’末端：５’−ＧＧＣＧＧＣ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＧＣＣＧＣＣ−３’。

【0017】

さらに、第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対及びＡＴ／ＡＵ塩基対の両方を含む伸長配列であり、好ましくは、第２の伸長セグメントは、２〜５０つの塩基対の伸長配列である。

【0018】

さらに、第２の伸長セグメントは、連続する２〜８個のＣＧ塩基対の配列と連続する２〜８個のＡＴ／ＡＵ塩基対配列とが交互に配置された伸長配列であり、又は、第２の伸長セグメントは、１つのＣＧ塩基対の配列と１つのＡＴ／ＡＵ塩基対配列とが交互に配置された伸長配列である。

【0019】

さらに、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列において、塩基、リボース及びリン酸エステルが少なくとも１つの修飾可能な部位を有し、修飾可能な部位のいずれかが、−Ｆ、メチル基、アミノ基、ジスルフィド基、カルボニル基、カルボキシル基、メルカプト基、及びアルデヒド基のいずれかの修飾リンカーによって修飾されており、好ましくは、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列におけるＣ又はＵ塩基に２’−Ｆ修飾を有する。

【0020】

さらに、核酸ナノ粒子は、核酸ドメインに結合されている生物活性物質をさらに含む。

【0021】

さらに、核酸ドメインの相対分子量と生物活性物質との総相対分子量との比が１：１以上であり、好ましくは、生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、薬物、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類、及びレシチンのうちの１つ又は複数である。

【0022】

さらに、生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン及びｍｉＲＮＡであり、標的ヘッドは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれか、好ましくは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５’末端又は３’末端に位置するか、又は、核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲＮＡであり、フルオレセインは、抗ｍｉＲＮＡの５’末端又は３’末端に修飾され、ｍｉＲＮＡは、ａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置にあり、好ましくは、標的ヘッドは、葉酸又はビオチンであり、フルオレセインは、ＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、抗ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲ−２１である。

【0023】

さらに、薬物は、肝がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん、子宮がん、卵巣がん、黒色腫、白血病、認知症、強直性脊椎炎、悪性リンパ腫、気管支がん、関節リウマチ、ＨＢＶ Ｂ型肝炎、多発性骨髄腫、膵臓がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、鼻咽頭がん、食道がん、口腔がん、エリテマトーデスの治療薬であり、好ましくは、頭頸部がんは、脳がん、神経芽細胞腫又はグリア芽細胞腫である。

【0024】

さらに、薬物は、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物である。

【0025】

さらに、タンパク質は、ＳＯＤ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥＧＦＲ及びＰＳＭＡの抗体又はアプタマのうちの１つ又は複数であり、ビタミンは、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、フェノール類は、茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである。

【0026】

さらに、生物活性物質は、以下のいずれかの方式で核酸ドメインに結合されている。方式１：物理的インターカレーション；方式２：共有結合。

【0027】

さらに、生物活性物質が物理的インターカレーションの方式で核酸ドメインに結合されている場合、生物活性物質と核酸ドメインは、１〜２００：１のモル比で物理的にインターカレーションされている。

【0028】

さらに、生物活性物質が物理的インターカレーションの方式及び共有結合の方式で核酸ドメイに結合されている場合、物理的インターカレーションの方式で結合されている生物活性物質と共有結合の方式で結合されている薬物のモル比は、１〜２００：１である。

【0029】

さらに、共有結合の方式で結合されている生物活性物質は、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により結合されており、好ましくは、溶媒は、パラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ又は氷酢酸から選択され、好ましくは、リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選択され、好ましくは、クリック結合は、生物活性物質前駆体と核酸ドメインを同時にアルキニル基又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することである。

【0030】

さらに、生物活性物質がクリック結合の方式で核酸ドメインに結合されている場合、生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、２’ヒドロキシ基、カルボキシル基又はアミノ基から選ばれ、核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、Ｇ環外アミノ基、２’−ヒドロキシ基、Ａアミノ基又は２’−ヒドロキシ基から選ばれる。

【0031】

さらに、核酸ナノ粒子の粒子径が１〜１００ｎｍ、好ましくは５〜５０ｎｍ、より好ましくは１０〜３０ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１５ｎｍである。

【0032】

本発明の他の態様によれば、上記の核酸ナノ粒子を含む薬学的組成物がさらに提供される。

【0033】

本発明の第３の態様によれば、アドリアマイシンと、前述した（生物活性物質を担持しない）核酸ナノ粒子とを含むアドリアマイシン含有薬物がさらに提供される。

【0034】

さらに、アドリアマイシンが物理的結合及び／又は共有結合の方式で核酸ナノ粒子に担持され、アドリアマイシンと核酸ナノ粒子とのモル比が２〜３００：１、好ましくは１０〜５０：１、さらに好ましくは１５〜２５：１である。

【0035】

さらに、核酸ナノ粒子は、生物活性物質をさらに含み、生物活性物質は、核酸ドメインに結合されており、生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類レシチン及びアドリアマイシン以外の小分子薬物のうちの１つ又は複数である。

【0036】

さらに、核酸ドメインの相対分子量をＮ_１とし、アドリアマイシンと生物活性物質との総相対分子量をＮ_２とし、Ｎ_１／Ｎ_２≧１：１である。

【0037】

さらに、生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン及びｍｉＲＮＡのうちの１つ又は複数であり、標的ヘッドは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれか、好ましくはａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５’末端又は３’末端に位置するか、又は核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲＮＡであり、フルオレセインは抗ｍｉＲＮＡの５’末端又は３’末端に修飾され、ｍｉＲＮＡはａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置にあり、好ましくは、標的ヘッドは、葉酸又はビオチンであり、フルオレセインは、ＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、抗ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲ−２１である。

【0038】

さらに、アドリアマイシン以外の小分子薬物は、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物である。

【0039】

さらに、タンパク質は、ＳＯＤ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ及びＥＧＦＲ、ＰＳＭＡのうちの１つ又は複数であり、ビタミンは、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、フェノール類は、茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである。

【0040】

本発明の第４の態様によれば、上記のいずれかの（生物活性物質を担持しない）核酸ナノ粒子を提供するステップと、物理的結合及び／又は共有結合の方式でアドリアマイシンを核酸ナノ粒子に担持して、アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含むアドリアマイシン含有薬物の製造方法がさらに提供される。

【0041】

さらに、物理的結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、アドリアマイシンと、核酸ナノ粒子と、第１の溶媒とを混合して撹拌し、プレミックス系を得るステップと、プレミックス系中の遊離物質を除去して、アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含み、好ましくは、第１の溶媒は、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、プレミックス系中の遊離物質を除去するステップは、プレミックス系を無水エタノールと混合し、１０℃未満の温度条件下でアドリアマイシン含有薬物を析出させ、より好ましくは、０〜５℃の温度条件下でアドリアマイシン含有薬物を析出させるステップを含む。

【0042】

さらに、共有結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、アドリアマイシン溶液を調製するステップと、アドリアマイシン溶液を、ホルムアルデヒドによる仲介作用により核酸ナノ粒子のＧ環外アミノ基と反応させて、反応系を得るステップと、反応系を精製して、アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含み、好ましくは、反応のステップは、アドリアマイシン溶液と、パラホルムアルデヒド溶液と、核酸ナノ粒子とを混合し、遮光条件下で反応させて、反応系を得るステップを含み、パラホルムアルデヒド溶液の濃度が３．７〜４ｗｔ％であることが好ましく、パラホルムアルデヒド溶液がパラホルムアルデヒドと第２の溶媒とを混合した溶液であり、第２の溶媒がＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸のうちの１つ又は複数であることが好ましい。

【0043】

さらに、上記製造方法は、前述したいずれかの（生物活性物質を担持しない）核酸ナノ粒子における核酸ドメインに対応する一本鎖を自己組織化して、核酸ドメインを得るステップを含む、核酸ナノ粒子を製造するステップをさらに含み、好ましくは、核酸ドメインを得た後に、製造方法は、生物活性物質を物理的結合及び／又は共有結合の方式で核酸ドメインに担持して、さらに核酸ナノ粒子を得るステップをさらに含み、生物活性物質中の薬物は、アドリアマイシン以外の小分子薬物である。

【0044】

さらに、共有結合の方式で生物活性物質を担持する過程において、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により担持し、好ましくは、溶媒共有結合に用いられる第３の溶媒は結合媒体とされ、第３の溶媒は、パラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれ、好ましくは、クリック結合は、生物活性物質前駆体と核酸ドメインを同時にアルキニル基又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することである。

【0045】

さらに、生物活性物質がクリック結合の方式で核酸ドメインに結合されている場合、生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、２’ヒドロキシ基、カルボキシル基又はアミノ基から選ばれ、核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、Ｇ環外アミノ基、２’−ヒドロキシ基、Ａアミノ基又は２’−ヒドロキシ基から選ばれる。

【発明の効果】

【0046】

本発明に係る核酸ナノ粒子、上記３本の配列又はそれらの変異配列を含むことで、自己組織化して核酸ドメインを形成するとともに、担体として、３本の鎖の任意の５’末端及び／又は３’末端にｓｉＲＮＡ薬物又はｍｉＲＮＡ薬物を結合でき、上記ナノ粒子の形成過程で、核酸ドメインの存在により、担持される核酸薬物に対するヌクレアーゼの分解作用を減少させ、薬物の送達の信頼性及び安定性を向上させる。

【図面の簡単な説明】

【0047】

本願の一部を構成する明細書の図面は、本発明に対するさらなる理解を提供するためのものであり、本発明の例示的な実施例及びその説明は、本発明を解釈するために用いられ、本発明に対する不適切な制限を構成しない。

【0048】

【図1】本発明の実施例１で自己組織化して形成されるＲＮＡナノ粒子の電気泳動の検出結果を示す。

【図2】本発明の実施例１で自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子の電気泳動の検出結果を示す。

【図3】本発明の実施例２で自己組織化して形成される７組の短配列ＲＮＡのナノ粒子の２％のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図4】本発明の実施例２で自己組織化して形成される７組の短配列ＲＮＡのナノ粒子の４％のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図5】本発明の実施例３で自己組織化して形成される７組の一般的な配列のＲＮＡナノ粒子の２％のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図6】本発明の実施例３で自己組織化して形成される７組の一般的な配列のＲＮＡナノ粒子の４％のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図7】本発明の実施例４で自己組織化して形成される７組の一般的な配列のＤＮＡナノ粒子の２％のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図8】本発明の実施例４で自己組織化して形成される７組の一般的な配列のＤＮＡナノ粒子の４％のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図9】本発明の実施例４で自己組織化して形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子Ｄ−７の透過電子顕微鏡写真を示す。

【図10】本発明の実施例５のアドリアマイシン担持生成物の電気泳動の検出結果を示す。

【図11】本発明の実施例５の担持率検出過程で用いられるアドリアマイシン吸光度の検量線を示す。

【図12】本発明の実施例７の異なるナノ粒子のＦＡＣＳ蛍光信号強度の検出結果を示す。

【図13】本発明の実施例７の異なるナノ粒子のＨｅｐＧ２細胞との結合及び内在化結果を示す。

【図14】本発明の実施例９のＲＮＡナノ粒子をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅプログラム下で、血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図15】本発明の実施例９のＲＮＡナノ粒子をＳｔａｉｎ Ｆｒｅｅ Ｇｅｌプログラム下で、血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図16】本発明の実施例１０の異なるナノ粒子のＨｅｐＧ２細胞の増殖状況の検出結果を示す。

【図17】本発明の実施例１１の７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡの自己組織化生成物の非変性ＰＡＧＥゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図18】本発明の実施例１１のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１５の溶解度曲線を示す。

【図19】本発明の実施例１１のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１６の溶解度曲線を示す。

【図20】本発明の実施例１１のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１７の溶解度曲線を示す。

【図21】本発明の実施例１１のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１８の溶解度曲線を示す。

【図22】本発明の実施例１１のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１９の溶解度曲線を示す。

【図23】本発明の実施例１１のＲＮＡナノ粒子Ｒ−２０の溶解度曲線を示す。

【図24】本発明の実施例１１のＲＮＡナノ粒子Ｒ−２１の溶解度曲線を示す。

【図25】本発明の実施例１２の７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡの自己組織化生成物の非変性ＰＡＧＥゲル電気泳動の検出結果を示す。

【図26】本発明の実施例１２のＤＮＡナノ粒子Ｄ−８の溶解度曲線を示す。

【図27】本発明の実施例１２のＤＮＡナノ粒子Ｄ−９の溶解度曲線を示す。

【図28】本発明の実施例１２のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１０の溶解度曲線を示す。

【図29】本発明の実施例１２のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１１の溶解度曲線を示す。

【図30】本発明の実施例１２のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１２の溶解度曲線を示す。

【図31】本発明の実施例１２のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１３の溶解度曲線を示す。

【図32】本発明の実施例１２のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１４の溶解度曲線を示す。

【図33】本発明の実施例１３のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１５を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図34】本発明の実施例１３のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１６を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図35】本発明の実施例１３のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１７を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図36】本発明の実施例１３のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１８を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図37】本発明の実施例１３のＲＮＡナノ粒子Ｒ−１９を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図38】本発明の実施例１３のＲＮＡナノ粒子Ｒ−２０を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図39】本発明の実施例１３のＲＮＡナノ粒子Ｒ−２１を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図40】本発明の実施例１４のＤＮＡナノ粒子Ｄ−８を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図41】本発明の実施例１４のＤＮＡナノ粒子Ｄ−９を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図42】本発明の実施例１４のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１０を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図43】本発明の実施例１４のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１１を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図44】本発明の実施例１４のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１２を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図45】本発明の実施例１４のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１３を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図46】本発明の実施例１４のＤＮＡナノ粒子Ｄ−１４を血清において異なる時間インキュベートした後の電気泳動の検出結果を示す。

【図47a】本発明の実施例１７のＤＭＳＯ及び原薬アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図47b】本発明の実施例１７のＤ−８及びＤ−８−アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図47c】本発明の実施例１７のＤ−９及びＤ−９−アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図47d】本発明の実施例１７のＤ−１０及びＤ−１０−アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図47e】本発明の実施例１７のＤ−１１及びＤ−１１−アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図47f】本発明の実施例１７のＤ−１２及びＤ−１２−アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図47g】本発明の実施例１７のＤ−１３及びＤ−１３−アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図47h】本発明の実施例１７のＤ−１４及びＤ−１４−アドリアマイシンに対応する細胞生存率曲線を示す。

【図48】実施例１８の担持率検出過程で用いられるダウノルビシン吸光度の検量線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

なお、衝突がない場合、本願の実施例及び実施例の特徴を互いに組み合わせることができる。以下、実施例を組み合わせて本発明について詳細に説明する。

【0050】

背景技術に記載されるとおり、従来技術では、薬物送達効率を向上させる薬物担体が複数種あるが、薬物の臨床使用が制限されているという問題を解決しにくい。この状況を改善するために、本願の発明者は、薬物担体として使用可能な従来のすべての材料について研究し、担体の細胞／組織標的性、輸送過程での安定性、標的細胞に入る活性及び効率、標的細胞に到達した後の薬物リリース能力及び細胞に対する毒性などから、さまざまな担体について深く研究して分析し、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子が自己組織化して形成される新しいナノ構造、例えば、ＤＮＡデンドリマーの自己組織化系においてＤＮＡを用いると、ヌクレアーゼの分解に対して顕著な阻害作用を有し、遺伝子治療及び生物医学の分野において非常に重要な使用価値を有することが発見された。

【0051】

従来報告されたＤＮＡ及びＲＮＡが自己組織化して形成されるナノ粒子を分析することで、剛性のＤＮＡナノ粒子に比べて、ＲＮＡナノ粒子は、分子内又は分子間に大量のステムループ構造が存在し、より高い柔軟性及び強い張力を有するため、候補薬物担体としてより多くの利点を持っている。しかし、自然状態でのＲＮＡナノ粒子の安定性が低いが、現在のＲＮＡナノ担体の使用での改良のほとんどは、安定性及び信頼性の向上を中心に展開されている。従来の研究結果が薬物担持の可能性をある程度まで提供するが、核酸薬物、特にｓｉＲＮＡ薬物又はｍｉＲＮＡ薬物などの担持可能性及び有効性に重点をおいて研究されている。非核酸類の薬物が同様に有効であるか否かについては、従来からの報告が非常に少ない。また、従来の自己組織化ナノ粒子、特に、担体として使用される自己組織化ナノ粒子は、ほとんどＲＮＡ鎖が自己組織化して形成されるものであり、ＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖の組合せ形態で自己組織化されるのが非常に少なく、単なるＤＮＡ鎖を用いて自己組織化を実現するものがぜんぜんない。

【0052】

信頼性が高くかつ自己組織化可能な新しいＲＮＡナノ粒子担体を提供するために、出願者は、従来のＲＮＡナノ粒子を比較して改良し、一連の新しいＲＮＡナノ粒子を開発し、使用適合性の向上及びコストの削減から配慮すると、さらに単なるＤＮＡ鎖を用いて自己組織化することを試し、これらのＤＮＡ一本鎖に変更すると、自己組織化してＤＮＡナノ粒子を形成することを実現できるとともに、性能がＲＮＡナノ粒子と同様に優れることを予想外に発見した。また、ＤＮＡナノ粒子の自己組織化は、さらに、価格が低くかつ操作しやすいという長所を有する。実験により、発明者が改良したＲＮＡナノ粒子及びＤＮＡナノ粒子がすべてさまざまな薬物を担持でき、血清において安定して存在できることが検証され、さらなる実験により、それらが薬物を担持して細胞に入ることができ、独立した担体が細胞に対して毒性を有さないことが検証される。薬物を担持する担体が対応する疾病に対して緩和及び治療作用を果たすことができる。

【0053】

上記研究結果に基づき、出願者は、本願の技術的解決手段を提供する。１つの典型的な実施形態では、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列を含む核酸ドメインを有し、ａ配列はａ１配列、又はａ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ｂ配列はｂ１配列、又はｂ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ｃ配列はｃ１配列、又はｃ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、ａ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１：５’−ＣＣＡＧＣＧＵＵＣＣ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２：５’−ＣＣＡＧＣＧＴＴＣＣ−３’であり、ｂ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３：５’−ＧＧＵＵＣＧＣＣＧ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４：５’−ＧＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’であり、ｃ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＧ−３’又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＧ−３’である、核酸ナノ粒子が提供される。

【0054】

上記核酸ナノ粒子は、上記３本の配列又はそれらの変異配列を含むことで、自己組織化して核酸ドメインを形成できるとともに、担体として、３本の鎖の任意の５’末端及び／又は３’末端にｓｉＲＮＡ薬物又はｍｉＲＮＡ薬物を結合できる。上記ナノ粒子の形成過程で、核酸ドメインの存在により、担持される核酸薬物に対するヌクレアーゼの分解作用を減少させ、薬物送達の信頼性及び安定性を向上させる。

【0055】

上記自己組織化とは、基本構造単位が自発的に秩序を持った配列構造を形成する技術である。自己組織化過程で、基本構造単位は、非共有結合の相互作用で、安定しかつ所定の秩序を持った幾何学的な外観を有する構造に自発的に組織する又は凝集する。自己組織化過程は、大量の原子、イオン又は分子の間の弱い相互作用力（ここで「弱相互作用力」とは、水素結合、ファンデルワールス力、静電力、疎水作用力などである）の単純な重ね合わせではなく、複数の対象間が同時に自発的に並列して集合して、緊密で、秩序を持った一体を形成し、全体の複雑な相乗作用である。

【0056】

自己組織化の発生には、自己組織化の動力及びガイド作用という２つの条件を必要とする。自己組織化の動力とは、分子間の弱い相互作用力の相乗作用であり、分子自己組織化にエネルギーを提供する。自己組織化のガイド作用とは、分子の空間での相補性であり、つまり、自己組織化の発生には、空間のサイズ及び方向が分子再配列の要求を満たす必要がある。

【0057】

ＤＮＡナノ技術は、下から上への分子自己組織化モードであり、分子構造を起点として、核酸分子の物理的・化学的性質により自発的に安定構造を形成し、厳密な核酸塩基対合規則にしたがう。複数のＤＮＡ断片は、インビトロで正確な秩序で結合され、塩基相補対合規則により、サブ組織化構造を構築し、最終的に複雑な多段構造を形成する。ＤＮＡと異なって、ＲＮＡの構造は、二重螺旋の制限を超えることができる。ＲＮＡは、一連の異なる塩基対を形成でき、塩基対の間に少なくとも２つの水素結合が形成される。異なる塩基は、基準のＷａｓｔｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対タイプ及び非Ｗａｓｔｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対タイプを含む２つのタイプに分けることができ、ＲＮＡが大量及び複数種の循環構造モジュールを形成し、これらのモジュールは、折り畳みＲＮＡの三級構造を構成する基本単位である。ＲＮＡナノ技術は、天然に存在するこれらの３Ｄモジュール及び予測できる相互作用を利用でき、ここで、リボソーム、さまざまなリボザイム及びリボスイッチに存在する天然ＲＮＡアプタマなど、生物学活性を有する多くのＲＮＡ構造は、原子レベルの解像度を有する。ＲＮＡナノ技術の優れた特性は、大きさ及び複雑性が天然ＲＮＡ物質に匹敵する構造を設計できることである。さらに、天然ＲＮＡ複合体内のＲＮＡの独特組織化性質を利用することができる。

【0058】

本願の上記核酸ナノ粒子は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５で示される３本の配列又はそれらの変異後の配列を含み、又は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される３本の配列又はそれらの変異後の配列を含み、すべて、自己組織化して核酸ナノ粒子を形成できることを基準とし、具体的には、変異後の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６配列から変異部位及びその変異タイプを合理的に選択して得られてもよく、又は、適切な断片を伸長することで得られてもよい。

【0059】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５が自己組織化して形成されるナノ粒子は、ＲＮＡナノ粒子であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６が自己組織化して形成されるナノ粒子は、ＤＮＡナノ粒子である。１つの好適な実施例では、上記核酸ナノ粒子がＲＮＡナノ粒子である場合、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のうちの少なくとも１つは少なくとも１つの塩基が挿入、欠失又は置換された配列を含む。該ＲＮＡナノ粒子における変異配列の具体的な位置及び塩基タイプは、自己組織化を実現できる前提で、需要に応じて、薬物担持量が向上する又は安定性が向上するナノ粒子に改良することができる。

【0060】

製造される核酸ナノ粒子がより高い安定性を有するために、上記ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ:１／２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３／４及び／又はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ:５／６で示される配列に対して塩基挿入、欠失又は置換を行うとき、上記配列のある特定の位置での塩基に行ってもよく、変異後の配列を元の配列と同じにし、自己組織化してナノ粒子を形成することができ、他方、変異が元の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を維持することで、上記配列が自己組織化して形成されるナノ粒子と同一の薬担持特性及び類似した安定性を有し、核酸薬物を担持して送達できるとともに、化学薬物などの他の生物活性物質の担持及び送達にも適用され、したがって、相対的な普遍性を有する。

【0061】

１つの好適な実施例では、上記塩基挿入、欠失又は置換は、（１）ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ:１又は２で示されるａ配列の５’末端から１位、２位、４位及び５位の塩基間、及び／又は（２）ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ:１又は２で示されるａ配列の５’末端から８〜１０位の塩基間、及び／又は（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又は４で示されるｂ配列の５’末端から１〜３位の塩基間、及び／又は（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又は４で示されるｂ配列の５’末端から６位〜９位の塩基間、及び／又は（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又は６で示されるｃ配列の５’末端から１〜４位の塩基間、及び／又は（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又は６で示されるｃ配列の５’末端から９〜１２位の塩基間で発生する。

【0062】

上記好適な実施例では、限定された変異が発生する塩基位置は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ:１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される配列で形成されるナノ構造における非典型的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合塩基位置又は突出する未対合塩基位置であるため、これらの突出又はループ構造の形成に影響を与えることなく、それにより、上記配列で形成されるナノ構造の柔軟性及び張力を維持し、担体としての安定性の維持に寄与する。

【0063】

さらに上記核酸ナノ粒子の安定性を向上させるために、１つの好適な実施例では、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列は、自己組織化して下記式（１）で示される構造となり、

【化2】

但し、Ｗ−ＣはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、Ｎ及びＮ’は非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、いずれかの位置のＷ−Ｃはそれぞれ独立してＣ−Ｇ又はＧ−Ｃから選ばれ、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のうちの少なくとも２本の配列のそれぞれの５’末端及び３’末端の２つの塩基が相補せず、ａ配列において、５’末端からの最初のＮはＡであり、２番目のＮはＧであり、３番目のＮはＵ又はＴであり、４番目のＮはＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、ｂ配列において、５’末端からの最初のＮ’はＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、２番目のＮ’はＵ又はＴであり、３番目のＮ’はＣであり、ｃ配列において、５’末端から３’末端への方向でのＮＮＮＮ配列はＣＡＵＡ又はＣＡＴＡである。

【0064】

上記好適な実施例では、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列が自己組織化して式（１）で示される核酸ドメインを形成し、Ｎ及びＮ’で限定される非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合塩基以外、他の位置での塩基がすべて典型的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を形成し、上記Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の塩基がすべてＧ−Ｃ又はＣ−Ｇ塩基対を選択する。Ｇ−Ｃ又はＣ−Ｇ塩基対間の水素結合の作用力がＡ−Ｕ／Ｔ又はＵ／Ｔ−Ａ塩基対間の水素結合の作用力より大きいため、該核酸ナノ構造が安定する。非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合塩基で形成される突出又はループ構造は、核酸ナノ担体により大きい張力を与え、微小環境の変化への適応性が強くなり、したがって、該核酸ナノ粒子の安定性がより高い。

【0065】

上記式（１）構造のナノ粒子では、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列の具体的な配列の構成は、上記構造を形成できる限り、特殊に限定されていない。核酸配列の自己組織化から配慮すると、上記３本の配列が自己組織化して上記式（１）構造のナノ粒子を形成する効率をさらに向上させるために、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の塩基を選択するとき、異なる位置での塩基の選択は、以下の規則にしたがうことが最適である。（１）ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のうち、独立した配列が相補対合して二級構造を形成することなく、（２）ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のうち、任意の２本の配列間の一端が相補対合して二本鎖を形成し、他端が相補対合せず、Ｙ字型又はＴ字型構造を形成する。上記塩基選択規則は、任意の１本の鎖の両端をそれぞれその他の２本の鎖の両端に最大効率で相補対合することで、自己組織化の効率を向上させることである。当然ながら、任意の２本の配列間の一端が相補対合して二本鎖を形成し、他端が相補対合しないという規則を満たす限り、Ｙ字型又はＴ字型構造のほか、三つ叉以外の四角形などの代替的な変形形態であってもよい。

【0066】

上記式（１）構造のナノ粒子では、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合塩基では、ａ配列の５’末端からの４番目のＮ、及びＮと対合されたｂ配列の５’末端からの最初のＮ’は、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合のＵ−Ｕであってもよく、改良後のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合規則にしたがうＴ、Ａ、Ｃ又はＧであってもよい。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合は、鎖間の結合力を向上させ、安定性を向上させるが、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合は、ナノ粒子に大きな湾曲性及び柔軟性を与え、微小環境の変化に対応するとき、ナノ粒子の安定性を向上させることに寄与する。

【0067】

１つの好適な実施例では、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列は、以下の任意の１組である。（１）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７）：５’−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８）：５’−ＣＣＵＵＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９）：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３’；（２）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０）：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１）：５’−ＣＧＵＵＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１２）：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’；（３）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３）：５’−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１４）５’−ＧＣＵＵＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）：５’−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３’；（４）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６）：５’−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７）：５’−ＣＣＵＵＣＧＧＧＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１８）：５’−ＣＣＣＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３’；（５）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１９）：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２０）：５’−ＣＧＵＵＣＧＧＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２１）：５’−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’；（６）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２２）：５’−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２３）：５’−ＣＧＵＵＣＧＧＣＣ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２４）：５’−ＧＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３’；（７）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２５）：５’−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２６）：５’−ＧＣＵＵＣＧＧＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２７）：５’−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３’；（８）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２８）：５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２９）：５’−ＣＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３０）：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’；（９）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３１）：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３２）：５’−ＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３３）：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’；（１０）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３４）：５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３５）：５’−ＧＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３６）：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’；（１１）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３７）：５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３８）：５’−ＣＣＴＴＣＧＧＧＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３９）：５’−ＣＣＣＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’；（１２）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４０）：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４１）：５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４２）：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’；（１３）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４３）：５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４４）：５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＣ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４５）：５’−ＧＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’；（１４）ａ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４６）：５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’、ｂ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４７）：５’−ＧＣＴＴＣＧＧＣＧ−３’、ｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４８）：５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’。

【0068】

上記１４組の配列が自己組織化して形成される核酸ナノ粒子は、より高い安定性を有するとともに、自己組織化効率がより高い。

【0069】

以上に記載の核酸ナノ粒子は、自己組織化して成形することができるとともに、薬物を輸送又は担持する能力も備える。上記核酸ナノ粒子におけるＧ−Ｃ又はＣ−Ｇ塩基対の位置及び担持対象の薬物の種類又は性質によって、担持される薬物の量が異なる。同様に、核酸類薬物は、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のうちのいずれかの５’末端及び／又は３’末端に伸長することで担持することができる。

【0070】

担持される薬物の分子量の大きさ、又は担持時の構造障害の違いに基づいて、上記核酸薬物が大きい分子量の生物活性物質を担持できるために、１つの好適な実施例では、上記核酸ドメインには、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のいずれかの配列の５’末端及び／又は３’末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第１の伸長セグメントがさらに含まれる。担体と担持される物質とは、所定のマッチング関係を必要とし、担体の分子量が小さすぎるが、担持される物質分子量が大きすぎると、力学から配慮すると、担持物質に対する担体の担持又は輸送能力が低下する。したがって、前述した核酸ナノ構造を基に、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のいずれかの配列の５’末端及び／又は３’末端に第１の伸長セグメントを増加させることで、担持物質の大きさとマッチングする担体を取得することができる。

【0071】

上記第１の伸長セグメントの具体的な長さは、担持しようとする物質の大きさに基づいて決定することができる。１つの好適な実施例では、第１の伸長セグメントは、以下から選ばれる任意の１組である。（１）：ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＡ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＵＧＧＧ−３’；（２）：ａ鎖３’末端：５’−ＧＧＧ−３’、ｂ鎖５’末端：５’−ＣＣＣ−３’；（３）：ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＡ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＵＧＧ−３’；（４）：ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＧ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＣＧＧＧ−３’；（５）：ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＣ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＧＧＧＧ−３’；（６）：ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＣ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＧＧＧ−３’。（７）：ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＧ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＣＧＧ−３’；（８）：ａ鎖５’末端：５’−ＣＣＣＡ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＴＧＧＧ−３’；（９）：ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＡ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＴＧＧ−３’；（１０）：ａ鎖５’末端：５’−ＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６２）、ｃ鎖３’末端：５’−ＵＣＧＣＣＧＣＵＣＧＣＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６３）；（１１）：ａ鎖３’末端：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６４）、ｂ鎖５’末端：５’−ＣＣＧＧＣＣＵＣＣＧＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６５）；（１２）ｂ鎖３’末端：５’−ＣＣＡＧＣＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６６）、ｃ鎖５’末端：５’−ＧＧＣＧＧＣＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６７）；（１３）：ａ鎖５’末端：５’−ＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６８）、ｃ鎖３’末端：５’−ＴＣＧＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６９）；（１４）：ａ鎖３’末端：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７０）、ｂ鎖５’末端：５’−ＣＣＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７１）。

【0072】

上記第１の伸長セグメントにより、核酸ナノ構造を形成する３本の配列のいずれかの１本又は複数本の長さを増加させ、また、ＧＣ塩基で構成される第１の伸長セグメントにより、形成されるナノ粒子の安定性をさらに向上させる。また、上記配列で構成される第１の伸長セグメントにより、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列が高い自己組織化活性及び効率を維持する。

【0073】

形成される核酸ナノ粒子の大きさ及び薬物送達担体としてインビボ輸送するときの安定性から配慮すれば、薬物を輸送するとともに、標的細胞に到達する前に、できる限り腎臓によって濾過されない必要がある。１つの好適な実施例では、核酸ドメインは、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列のいずれかの配列の５’末端及び／又は３’末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第２の伸長セグメントをさらに含み、さらに好ましくは、第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対の伸長配列であり、さらに好ましくは、第２の伸長セグメントは、１〜１０個のＣＧ塩基対の伸長配列である。第２の伸長セグメントは、第１の伸長セグメントのほか、さらに加える伸長セグメントである。

【0074】

１つの好適な実施例では、上記核酸ドメインは、以下の少なくともの１組の第２の伸長セグメントをさらに含む。第１組：ａ鎖５’末端：５’−ＣＧＣＧＣＧ−３’、ｃ鎖３’末端：５’−ＣＧＣＧＣＧ−３’；第２組：ａ鎖３’末端：５’−ＣＧＣＣＧＣ−３’、ｂ鎖５’末端：５’−ＧＣＧＧＣＧ−３’；第３組：ｂ鎖３’末端：５’−ＧＧＣＧＧＣ−３’、ｃ鎖５’末端：５’−ＧＣＣＧＣＣ−３’。この第２の伸長セグメントにより、ナノ粒子が免疫原性を有さず、各鎖自体が折り畳んで結合される二級構造の場合が存在しない。

【0075】

なお、上記第１の伸長セグメント及び／又は第２の伸長セグメントには、非対合の塩基対で間隔されてもよい。

【0076】

上記核酸ナノ粒子がより高い分子量の生物活性物質を担持し、薬剤担持量を増加させ、必要な安定性を維持するために、１つの好適な実施例では、第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対及びＡＴ／ＡＵ塩基対の両方を含む伸長配列であり、好ましくは、第２の伸長セグメントは、２〜５０個の塩基対の伸長配列である。ここで、「ＡＴ／ＡＵ塩基」の「／」は、又はの関係であり、具体的には、第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対及びＡＴ塩基対の両方を含む伸長配列であり、又は第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対及びＡＵ塩基対の両方を含む伸長配列である。

【0077】

より具体的には、上記第２の伸長セグメントを加えた後のａ、ｂ及びｃ配列は、それぞれ以下の配列であってもよい。
ａ配列：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４９）：

【化3】

ｂ配列：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５０）：

【化4】

ｃ配列：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５１）：

【化5】

【0078】

上記ａ配列、ｂ配列及びｃ配列におけるＭがＵ又はＴであり、ＭがＴである場合、上記配列の合成コストが大幅に低下する。

【0079】

実際の使用では、実際の需要に応じて、上記ＣＧ塩基対及びＡＴ／ＡＵ塩基対の伸長配列の具体的な設置位置を合理的に調整することができる。１つのさらに好適な実施例では、第２の伸長セグメントは、連続する２〜８個のＣＧ塩基対の配列と連続する２〜８個のＡＴ／ＡＵ塩基対配列とが交互に配置された伸長配列であり、又は第２の伸長セグメントは、１つのＣＧ塩基対の配列と１つのＡＴ／ＡＵ塩基対配列とが交互に配置された伸長配列である。

【0080】

具体的には、上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４９で示されるａ配列におけるＣＧＣＧＣＧ伸長セグメント及びＣＧＣＣＧＣ伸長セグメントをＡＡＡＡＡＡ伸長セグメントの位置とお互いに交換し、上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５０で示されるｂ配列におけるＧＣＧＧＣＧ伸長セグメント及びＧＧＣＧＧＣ伸長セグメントをＴＴＴＴＴＴ伸長セグメントの位置とお互いに交換し、上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５１で示されるｃ配列におけるＧＣＣＧＣＣ伸長セグメントをＡＡＡＡＡＡ伸長セグメントとお互いに交換し、またＣＧＣＣＧＣ伸長セグメントをＴＴＴＴＴＴ伸長セグメントとお互いに交換する。上記配列が自己組織化して形成される核酸ナノ粒子は、インドール類分子構造の化学薬物の担持に適用される（インドール類薬物分子が好ましくはＡに結合される）。

【0081】

過去数年間で、広く使用されている構築材料とされるＲＮＡに存在する３つの主な課題は、以下を含む。１）リボヌクレアーゼ分解に対する敏感性、２）全身注射後の解離に対する敏感性、３）毒性及び悪い免疫反応。現在、この３つの課題が大幅に克服されている。１）リボース−ＯＨ基の２’−フルオロ（２’−Ｆ）又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾により、ＲＮＡが血清において化学的に安定でき、２）天然に存在するある結合配列モチーフが熱力学的に安定し、ＲＮＡナノ粒子全体が超低濃度で完全していることを保持し、３）ＲＮＡナノ粒子の免疫原性が配列及び形状に依存するものであり、調整可能であり、それにより、ＲＮＡナノ粒子が起炎性サイトカインの発生を刺激し、又は、３０ｍｇ／ｋｇの重複静脈注射によって投与されるとき、ＲＮＡナノ粒子が非免疫原性及び非毒性を有する。

【0082】

従って、上記核酸ナノ粒子のリボヌクレアーゼ分解に対する敏感性をさらに低下させるとともに、輸送過程での安定性を向上させるために、１つの好適な実施例では、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列における塩基、リボース及びリン酸エステルは、少なくともの１つ修飾可能な部位を有し、いずれかの修飾可能な部位は、−Ｆ、メチル、アミノ基、ジスルフィド基、カルボニル基、カルボキシル基、メルカプト基及びアルデヒド基のいずれかの修飾ジョイントにより修飾され、好ましくは、ａ配列、ｂ配列及びｃ配列におけるＣ又はＵ塩基には２’−Ｆ修飾を有する。修飾ジョイントがメルカプト基である場合、チオ修飾に属し、修飾強度が弱く、コストが低い。

【0083】

本願に係る上記核酸ナノ粒子が担体とされて担持可能な物質は、生物活性作用を有する任意の物質であってもよい。したがって、１つの好適な実施例では、上記核酸ナノ粒子は、核酸ドメインに結合されている生物活性物質をさらに含む。

【0084】

担持される生物活性物質に対する核酸ナノ粒子の担持効率及び輸送効率を向上させるために、核酸ドメインの相対分子量と生物活性物質の総相対分子量には所定のマッチング関係が存在することが最適である。１つの好適な実施例では、核酸ドメインの相対分子量と生物活性物質の総相対分子量との比が１：１以上であり、好ましくは、生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、薬物（一般的に、小分子薬物、すなわち、化学合成薬物として解釈される）、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類、及びレシチンのうちの１つ又は複数である。

【0085】

具体的には担持される生物活性物質の種類によって、本願の核酸ナノ粒子に対する性能最適化役割が同じではない。例えば、生物活性物質がビオチン又は葉酸である場合、果たす役割は、核酸ナノ粒子に標的性を与え、例えば、がん細胞を特異的に標的することである。生物活性物質がフルオレセインである場合、果たす役割は、核酸ナノ粒子に発光トレーサ効果を与えることである。生物活性物質があるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、薬物（一般的に、小分子薬物として解釈される）、タンパク質、ポリペプチド又はＲＮＡ抗体である場合、異なる生物学的機能によって、該核酸ナノ粒子が特定の治療効果を有する新製品、例えば、性能がより優れた薬物になることができる。また、具体的には担持される生物活性物質の種類によって、具体的には好適に使用されるのはＤＮＡナノ粒子及びＲＮＡナノ粒子であり、実際の需要に応じて合理的に選択することができる。例えば、生物活性物質が薬物である場合、好ましくは、ＤＮＡナノ粒子又はＲＮＡナノ粒子で担持し、組織化して形成されるナノ粒子の一本鎖の長さについては特別な要求がない。 １つの好適な実施例では、生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン及びｍｉＲＮＡであり、標的ヘッドは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの配列、好ましくはａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５’末端又は３’末端に位置するか、又は核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲＮＡであり、フルオレセインは抗ｍｉＲＮＡの５’末端又は３’末端に修飾され、ｍｉＲＮＡはａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置にあり、好ましくは、標的ヘッドは、葉酸又はビオチンであり、フルオレセインは、ＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、前述抗ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲ−２１である。

【0086】

上記標的ヘッドは、リンカー共有結合の方式でａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの配列に結合されてもよく、使用可能なリンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれる。ここで、いわゆる「いずれかの配列」とは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの配列の任意の位置での塩基であり、５’末端又は３’末端に結合するのは、より容易であり、広く使用されている。葉酸修飾は、物理的インターカレーションモード結合又は物理的インターカレーション＋共有結合であってもよい。

【0087】

上記フルオレセインは、従来の常用のフルオレセイン、好ましくはＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であってもよい。

【0088】

上記ｍｉＲＮＡは、がん抑制効果を有するｍｉＲＮＡであってもよく、対応する病症を抑制できる抗ｍｉＲＮＡであってもよく、実際の使用では、医療需要に応じて合理的に選択する必要がある。上記抗ｍｉＲＮＡは、上記ａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置に合成することができる。上記３つの位置にすべて抗ｍｉＲＮＡが合成されると、抗ｍｉＲＮＡによる、対応するｍｉＲＮＡに対する抑制作用がより強い。

【0089】

好ましくは、抗ｍｉＲ−２１であり、ｍｉＲ−２１は、複数種のがんの発生及び発展に参加し、浸潤及び転移の主な発癌性遺伝子である。抗ｍｉＲ−２１は、広い標的遺伝子を効果的に同時に調整でき、がん症の異質性問題の解決に寄与する。したがって、上記好適な核酸ナノ粒子では、葉酸又はビオチンなどの標的ヘッドは、がん細胞を特異的に標的とすることができ、がん細胞と結合して内在化した後、抗ｍｉＲ−２１は非常に高い親和力及び特異性でｍｉＲ−２１塩基と相補し、それにより、発癌性ｍｉＲ−２１の発現を効果的に減少させる。従って、実際の需要に応じて、上記抗ｍｉＲ−２１が上記ａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置に合成することができる。上記３つの位置にすべて抗ｍｉＲ−２１が合成されると、抗ｍｉＲ−２１によるｍｉＲ−２１に対する抑制作用がより強い。

【0090】

上記担持可能な生物活性物質が薬物である場合、異なる薬物が治療可能な疾病タイプによって、薬物は、肝がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん、子宮がん、卵巣がん、黒色腫、白血病、認知症、強直性脊椎炎、悪性リンパ腫、気管支がん、関節リウマチ、ＨＢＶ Ｂ型肝炎、多発性骨髄腫、膵臓がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、鼻咽頭がん、食道がん、口腔がん、エリテマトーデスの治療薬を含むがこれらに限られず、好ましくは、頭頸部がんは、脳がん、神経芽細胞腫又はグリア芽細胞腫である。

【0091】

上記担持可能な生物活性物質が薬物である場合、薬物の分子構造又は持っている特徴性基によって、薬物は、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物を含むがこれらに限られない。

【0092】

１つの好適な実施例では、上記タンパク質は、ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメア逆転写酵素）及びＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）の抗体又はアプタマのうちの１つ又は複数であり、上記ビタミンは、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、上記フェノール類は、茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである。

【0093】

担持される生物活性物質によって、適切な結合方式を選択して上記核酸ナノ担体と結合することができる。１つの好適な実施例では、上記生物活性物質は、方式１：物理的インターカレーション；方式２：共有結合のうちのいずれかの方式で核酸ドメインに結合されている。

【0094】

なお、上記分類は、ある生物活性物質の核酸ナノ担体との結合方式が１種だけあるというわけではない。ある生物活性物質は、物理的インターカレーションの方式で核酸ナノ担体に結合されてもよいし、物理的インターカレーションと共有結合の方式でと核酸ナノ担体に結合されてもよく、また、クリック結合方式で結合されてもよい。しかし、ある特定の生物活性物質の場合、結合方式が１種だけある可能性があり、結合方式が複数種ある可能性もあるが、そのうち、ある方式が結合効率のため有利な実用的価値を持っている可能性がある。

【0095】

上記結合方式では、異なる薬物が物理的インターカレーションの方式で核酸ドメインに結合されている場合、インターカレーションの結合部位及び数がやや異なる。例えば、アントラサイクリン類、アクリジン類薬物は、インターカレーションされるとき、通常、ＧＣ塩基対の間にインターカレーションされ、好ましくは、インターカレーション部位の数が核酸ドメインにおけるＧＣ塩基対の数に応じて異なり、１〜１００：１の比でインターカレーションされる。ナフタリンアミド薬物は、インターカレーションされるとき、通常、ＡＡ塩基対の間にインターカレーションされ、好ましくは、インターカレーション部位の数が核酸ドメインにおけるＡＡ塩基対の数に応じて異なり、ピリドカルバゾール類は、ＡＡ塩基対の数に応じて１〜２００：１の比でインターカレーションされる。

【0096】

薬物が物理的インターカレーションと共有結合の２つの方式で核酸ドメインに結合されている場合、アントラサイクリン類、アクリジン類薬物は、インターカレーションされるとき、通常、ＧＣ塩基対の間にインターカレーションされ、好ましくは、インターカレーション部位の数が核酸ドメインにおけるＧＣ塩基対の数に応じて異なり、１〜１００：１の比でインターカレーションされる。ナフタリンアミド薬物は、インターカレーションされるとき、通常、ＡＡ塩基対の間にインターカレーションされ、好ましくは、インターカレーション部位の数が核酸ドメインにおけるＡＡ塩基対の数に応じて異なり、ピリドカルバゾール類は、ＡＡ塩基対の数に応じて１〜２００：１の比でインターカレーションされる。

【0097】

具体的には、生物活性物質の種類、核酸ナノ粒子において形成される核酸ドメインのａ、ｂ及びｃ配列の長さ、及びＧＣ相補塩基対の数に応じて、生物活性物質と核酸ドメインとのモル比を合理的に選択して物理的インターカレーションを行うことができる

【0098】

１つの好適な実施例では、生物活性物質が物理的インターカレーションの方式で核酸ドメインに結合されている場合、生物活性物質が核酸ドメインに１〜２００：１のモル比で物理的にインターカレーションされている。該結合方式は、アントラサイクリン類、アクリジン類薬物に適用される。該比範囲において物理的インターカレーションすると、担持需要を満たすことができるし、薬効需要を満たすこともできる。

【0099】

１つの好適な実施例では、生物活性物質が物理的インターカレーションの方式と共有結合の方式で核酸ドメインに結合されている場合、物理的インターカレーションの方式で結合されている生物活性物質と共有結合の方式で結合されている薬物とのモル比が１〜２００：１である。該結合方式は、アントラサイクリン類、アクリジン類の薬物に適用される。上記異なる結合方式で結合されている薬物の比は、効率的な担持を満たすことができ、細胞に対して毒性作用がなく、標的位置に到達した後に薬物の効果的なリリースを実現する限り、上記範囲に限られない。

【0100】

１つの好適な実施例では、共有結合の方式で結合されている生物活性物質は、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により結合されており、好ましくは、溶媒は、パラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ又は氷酢酸から選ばれ、好ましくは、リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれる。好ましくは、クリック結合は、生物活性物質前駆体と核酸ドメインを同時にアルキニル基又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することである。

【0101】

生物活性物質前駆体及び核酸ドメインの両方をアルキニル基又はアジドで修飾し、クリック結合の方式で結合されている場合、薬物の異なる構造の変化とともに、異なるクリック結合を選択する。活物質構造によって、結合位置が対応して変わる可能性があることは、当業者にとって理解できるものである。

【0102】

１つの好適な実施例では、生物活性物質がクリック結合の方式で核酸ドメインに結合されている場合、生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、ヒドロキシ、カルボキシル基、メルカプト基又はアミノ基から選ばれ、核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、アミノ基、イミノ基又はヒドロキシから選ばれる。

【0103】

なお、上記核酸ドメインと薬物が結合されている場合、核酸ドメインが水溶性であり、ほとんどの薬物は、水溶性が低く、核酸ドメインに結合された後、水溶性が向上する。上記薬物がアントラサイクリン類である場合、これらの薬物がヌクレオチドグアノシンにおける−ＮＨ結合（適切なｐＨ値の条件下で、該−ＮＨ基の活性が薬物と共有結合可能なその他の基の活性より数百倍高い）を介して核酸ドメインと共有結合し、それにより、薬物を担持する核酸ドメインを形成する。したがって、具体的な薬物分子の大きさ及び具体的に設計される核酸ドメインのａ配列、ｂ配列及びｃ配列におけるＧＣ塩基対の数量に基づいて、結合際、１．１〜１．３倍の理論的な過飽和結合量で結合反応し、１つの核酸ドメインに多くとも３５〜４５個の薬物を結合できる。上記薬物がその他の構造である場合、担持量が具体的な薬物の占有部位状況（分子構造、形態、形状及び分子量を含むがこれらに限られない）に関連しているため、薬物の活性部位と核酸ドメインのヌクレオチドグアノシンにおける−ＮＨ結合との結合条件が厳しく、担持できるが、過剰結合の状況が生じにくい。

【0104】

１つの好適な実施例では、核酸ナノ粒子の粒子径が１〜１００ｎｍ、好ましくは５〜５０ｎｍ、より好ましくは１０〜３０ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１５ｎｍである。該範囲において、大きさが適切であり、細胞表面のレセプター仲介の細胞食現象により細胞膜に入ることができるし、非特異性の細胞を透過して腎臓により濾過して除去されることを回避でき、したがって、好ましい粒子径サイズが薬物動態学、薬効学、生物学的分布及び毒理学の分布の改良に寄与する。

【0105】

第２の典型的な実施形態では、以上のいずれかの核酸ナノ粒子を含む薬学的組成物がさらに提供される。本願に係る上記核酸ナノ粒子を含む薬物において、核酸ドメインが目標の細胞を標的とする標的ヘッドの修飾により、良好な標的性を有し、さらに対応する治療薬物及び／又はトレーサー分子を担持でき、それにより、治療薬物及び／又はトレーサー分子を安定して送達でき、信頼性が非常に高い。

【0106】

第３の典型的な実施形態では、アドリアマイシン含有薬物が提供され、該アドリアマイシン含有薬物は、アドリアマイシン及び前述したいずれかの（生物活性物質を担持しない）核酸ナノ粒子を含むか、又は、該アドリアマイシン含有薬物は、前述したいずれかの（生物活性物質を担持する）核酸ナノ粒子であり、生物活性物質は、少なくとも薬物であり、該薬物がアドリアマイシンを含む。

【0107】

上記に係るアドリアマイシン含有薬物が核酸ナノ粒子及びアドリアマイシンを含み、アドリアマイシンが核酸ナノ粒子に担持される。該核酸ナノ粒子は、上記３本の配列又はそれらの変異配列を含むことで、自己組織化して核酸ドメインを形成でき、担体として、３本の鎖の任意の５’末端及び／又は３’末端にアドリアマイシンを結合でき、又は、アドリアマイシンを核酸ドメインの鎖間に安定してインターカレーションできる。本発明に係るアドリアマイシン含有薬物は、核酸ドメインの標的ヘッドが修飾された後、高い標的性を有し、アドリアマイシンを安定して送達でき、信頼性が非常に高い。

【0108】

前述したとおり、生物活性物質が薬物であり、薬物がアドリアマイシンである場合、アドリアマイシンは、物理的結合及び／又は共有結合の方式で担持することができる。アドリアマイシンが物理的インターカレーションと共有結合の２種の方式で核酸ドメインに結合されている場合、通常、ＧＣ塩基対の間に物理的にインターカレーションされ、好ましくは、インターカレーション部位の数が核酸ドメインにおけるＧＣ塩基対の数に応じて異なり、１〜１００：１の比でインターカレーションされる。共有結合の方式で結合されている場合、アドリアマイシンは、通常、Ｇ環外アミノ基と化学反応して共有結合を形成する。さらに好ましくは、アドリアマイシンと核酸ナノ粒子とのモル比が２〜３００：１、好ましくは１０〜５０：１、さらに好ましくは１５〜２５：１である。

【0109】

本願に係るアドリアマイシン含有薬物では、核酸ナノ粒子は、アドリアマイシンの送達担体とされ、また、異なる薬物の目的に基づいて、１つの好適な実施例では、上記核酸ナノ粒子は、核酸ドメインに結合されている生物活性物質をさらに含む。生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類、レシチン及びアドリアマイシン以外の小分子薬物のうちの１つ又は複数である。

【0110】

核酸ナノ粒子による、担持される生物活性物質に対する担持効率及び輸送効率を向上させるために、核酸ドメインの相対分子量とアドリアマイシン及び生物活性物質の相対分子量とには、所定のマッチング関係が存在することが最適である。１つの好適な実施例では、核酸ドメインの相対分子量をＮ_１とし、アドリアマイシンと生物活性物質との総相対分子量をＮ_２とし、Ｎ_１／Ｎ_２≧１：１である。

【0111】

具体的に担持される生物活性物質の種類によって、本発明では、アドリアマイシン含有薬物は、異なる性能が最適化される。例えば、生物活性物質がビオチン又は葉酸である場合、果される役割は、該アドリアマイシン含有薬物に標的性を与え、例えば、がん細胞を特異的に標的にすることである。生物活性物質がフルオレセインである場合、果される役割は、核酸ナノ粒子に発光トレーサ効果を与えることである。生物活性物質があるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ抗体、アドリアマイシン以外の小分子薬物である場合、異なる生物学的機能によって、該アドリアマイシン含有薬物が特定の治療効果を有する新製品、例えば性能がより優れた薬物になる可能性がある。

【0112】

１つの好適な実施例では、生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン及びｍｉＲＮＡであり、標的ヘッドは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれか、好ましくはａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５’末端又は３’末端に位置するか、又は核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲＮＡであり、フルオレセインは抗ｍｉＲＮＡの５’末端又は３’末端に修飾され、ｍｉＲＮＡはａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置にあり、好ましくは、標的ヘッドは、葉酸又はビオチンであり、フルオレセインは、ＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、前記抗ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲ−２１である。

【0113】

上記標的ヘッドがリンカー共有結合の方式でａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかに結合することができ、使用可能なリンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれる。ここで、いわゆる「いずれかの配列」とは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの配列の任意の位置での塩基であり、５’末端又は３’末端に結合するのは、より容易であり、広く使用されている。葉酸修飾は、物理的インターカレーション結合又は物理的インターカレーション＋共有結合であってもよい。

【0114】

上記フルオレセインは、従来の常用のフルオレセインであってもよく、好ましくはＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数である。

【0115】

上記ｍｉＲＮＡは、がん抑制効果を有するｍｉＲＮＡであってもよく、対応する病症を抑制できる抗ｍｉＲＮＡであってもよく、実際の使用では、医療需要に応じて合理的に選択する必要がある。上記抗ｍｉＲＮＡは、上記ａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置に合成することができる。上記３つの位置にすべて抗ｍｉＲＮＡが合成されると、抗ｍｉＲＮＡによる、対応するｍｉＲＮＡに対する抑制作用がより強い。

【0116】

好ましくは、抗ｍｉＲ−２１であり、ｍｉＲ−２１は、複数種のがんの発生及び発展に参加し、浸潤及び転移の主な発癌性遺伝子である。抗ｍｉＲ−２１は、広い標的遺伝子を効果的に同時に調整でき、がん症の異質性問題の解決に寄与する。したがって、上記好適な核酸ナノ粒子では、葉酸又はビオチンなどの標的ヘッドは、がん細胞を特異的に標的とすることができ、がん細胞と結合して内在化した後、抗ｍｉＲ−２１は非常に高い親和力及び特異性でｍｉＲ−２１塩基と相補し、それにより、発癌性ｍｉＲ−２１の発現を効果的に減少させる。従って、実際の需要に応じて、上記抗ｍｉＲ−２１が上記ａ配列の３’末端、ｃ配列の５’末端及び３’末端のいずれか１つ又は複数の位置に合成することができる。上記３つの位置にすべて抗ｍｉＲ−２１が合成されると、抗ｍｉＲ−２１によるｍｉＲ−２１に対する抑制作用がより強い。

【0117】

上記担持可能な生物活性物質がアドリアマイシン以外の他の小分子薬物である場合、異なる薬物が治療できる疾病のタイプによって、薬物は、肝がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん、子宮がん、卵巣がん、黒色腫、白血病、認知症、強直性脊椎炎、悪性リンパ腫、気管支がん、関節リウマチ、ＨＢＶ Ｂ型肝炎、多発性骨髄腫、膵臓がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、鼻咽頭がん、食道がん、口腔がん、エリテマトーデスの治療薬を含むがこれらに限られず、好ましくは、頭頸部がんは、脳がん、神経芽細胞腫又はグリア芽細胞腫である。

【0118】

上記担持可能な生物活性物質がアドリアマイシン以外の小分子薬物である場合、薬物の分子構造又は持っている特徴性基によって、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物を含むがこれらに限られない。

【0119】

１つの好適な実施例では、上記タンパク質は、ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメア逆転写酵素）及びＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）の抗体又はアプタマのうちの１つ又は複数であり、上記ビタミンは、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、上記フェノール類は、茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである。

【0120】

１つの好適な実施例では、核酸ナノ粒子の粒子径が１〜１００ｎｍ、好ましくは５〜５０ｎｍ、より好ましくは１０〜３０ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１５ｎｍである。該範囲において、大きさが適切であり、細胞表面のレセプター仲介の細胞食現象により細胞膜に入ることができるし、非特異性の細胞を透過して腎臓により濾過して除去されることを回避でき、したがって、好ましい粒子径サイズが薬物動態学、薬効学、生物学的分布及び毒理学の分布の改良に寄与する。

【0121】

本発明の第３の典型的な実施形態では、上記（生物活性物質を担持しない）核酸ナノ粒子を提供するステップと、物理的結合及び／又は共有結合の方式でアドリアマイシンを核酸ナノ粒子に担持して、アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含む、上記アドリアマイシン含有薬物の製造方法がさらに提供される。

【0122】

物理的結合の方式を用いる場合、アドリアマイシンは、通常、ＧＣ塩基対の間に物理的にインターカレーションされている。共有結合の方式で結合されている場合、アドリアマイシンが一般的にＧ環外アミノ基と化学反応して共有結合を形成する。上記方法で製造されるアドリアマイシン含有薬物は、標的ヘッドを修飾した後、高い標的性を有し、アドリアマイシンを安定して送達でき、信頼性が非常に高い。

【0123】

１つの好適な実施例では、物理的結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、アドリアマイシンと、核酸ナノ粒子と、第１の溶媒とを混合して撹拌して、プレミックス系を得るステップと、プレミックス系中の遊離物質を除去して、アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含む。具体的なアドリアマイシン、核酸ナノ粒子の使用量は、担持量の変化に応じて調整することができ、これは当業者にとって理解できることであり、ここで繰り返し説明しない。

【0124】

物理的結合の効率及び安定性を向上させるために、好ましくは、１リットルあたりの第１の溶媒に加えたアドリアマイシンの量が０．１〜１ｇである。好ましくは、第１の溶媒は、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数である。好ましくは、プレミックス系中の遊離物質を除去するステップは、プレミックス系を無水エタノールと混合し、１０℃未満の温度条件下でアドリアマイシン含有薬物を析出させ、より好ましくは、０〜５℃の温度条件下でアドリアマイシン含有薬物を析出させるステップを含む。

【0125】

１つの好適な実施例では、共有結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、アドリアマイシン溶液を調製するステップと、アドリアマイシン溶液をホルムアルデヒドによる仲介作用により核酸ナノ粒子のＧ環外アミノ基と反応させて反応系を得るステップと、反応系を精製して、アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含む。

【0126】

ホルムアルデヒドによる仲介により、以下の反応が生じることができる。

【化6】

【0127】

好ましくは、反応のステップは、アドリアマイシン溶液と、パラホルムアルデヒド溶液と、核酸ナノ粒子とを混合し、遮光条件下で反応させて、反応系を得るステップを含む。パラホルムアルデヒド溶液は、ホルムアルデヒド小分子をリリースできるため、上記化学反応に参加する。反応効率を向上させるために、パラホルムアルデヒド溶液の濃度が３．７〜４ｗｔ％であることが好ましくは、パラホルムアルデヒド溶液がパラホルムアルデヒド及び第２の溶媒を混合して形成される溶液であり、第２の溶媒がＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸のうちの１つ又は複数であることが好ましい。

【0128】

上記製造方法では、核酸ナノ粒子は、自己組織化で製造することができ、例えば、（１）ＲＮＡ又はＤＮＡ一本鎖ａ、ｂ、ｃを同時に混合してＤＥＰＣ水又はＴＭＳ緩衝液に溶かし、（２）混合溶液を８０℃／９５℃に加熱し（ＲＮＡ組織化温度が８０℃、ＤＮＡ組織化温度が９５℃である）、５ｍｉｎ維持してから、２℃／ｍｉｎのレートで室温にゆっくり降温し、（３）生成物を８％（ｍ／ｖ）の非変性ＰＡＧＥゲルにロードしてＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で、１００Ｖで複合体を電気泳動により精製し、（４）目的とするバンドを切り出してＲＮＡ／ＤＮＡ溶離緩衝液に３７℃で溶離し、この後に一晩エタノールで沈殿させ、減圧して低温で蒸発させ、自己組織化生成物を獲得して、核酸ドメインを獲得し、さらに核酸ナノ粒子を獲得することができる。

【0129】

上記アドリアマイシン含有薬物がその他の機能を有するために、１つの好適な実施例では、核酸ドメインを得た後に、製造方法は、以上に記載の生物活性物質を物理的結合及び／又は共有結合の方式で前記核酸ドメインに担持して、さらに前記核酸ナノ粒子を得るステップをさらに含む。生物活性物質の担持方式は、同様に物理的結合及び／又は共有結合であってもよい。共有結合の方式は、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により担持することを含むが、これらに限られず、好ましくは、溶媒共有結合で用いられる第３の溶媒を結合媒体とし、第３の溶媒は、パラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数であり、好ましくは、リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれ、好ましくは、クリック結合は、生物活性物質前駆体と核酸ドメインを同時にアルキニル基又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することである。

【0130】

なお、上記分類は、ある生物活性物質の核酸ドメインとの結合方式が１種だけあるというわけではない。ある生物活性物質は、物理的インターカレーションの方式で核酸ドメインに結合されてもよいし、物理的インターカレーションと共有結合の方式で核酸ドメインに結合されてもよく、また、クリック結合の方式で結合されてもよい。しかし、ある特定の生物活性物質の場合、結合方式が１種だけある可能性があり、結合方式が複数種ある可能性もあるが、そのうち、ある方式が結合効率のため有利な実用的価値を持っている可能性がある。

【0131】

上記結合方式では、異なる薬物が物理的インターカレーションの方式で核酸ドメインに結合されている場合、インターカレーションの結合部位及び数がやや異なる。例えば、アントラサイクリン類、アクリジン類薬物は、インターカレーションされるとき、通常、ＧＣ塩基対の間にインターカレーションされ、好ましくは、インターカレーション部位の数が核酸ドメインにおけるＧＣ塩基対の数に応じて異なり、１〜１００：１の比でインターカレーションされる。ナフタリンアミド薬物は、インターカレーションされるとき、通常、ＡＡ塩基対の間にインターカレーションされ、好ましくは、インターカレーション部位の数が核酸ドメインにおけるＡＡ塩基対の数に応じて異なり、ピリドカルバゾール類は、ＡＡ塩基対の数に応じて１〜２００：１の比でインターカレーションされる。

【0132】

具体的には、生物活性物質の種類、核酸ナノ粒子において形成される核酸ドメインのａ、ｂ及びｃ配列の長さ、及びＧＣ相補塩基対の数に応じて、生物活性物質と核酸ドメインとのモル比を合理的に選択して物理的インターカレーションを行うことができる。

【0133】

１つの好適な実施例では、生物活性物質が物理的インターカレーションの方式及び共有結合の方式で核酸ドメインに結合されている場合、物理的インターカレーションの方式で結合されている生物活性物質と共有結合の方式で結合されている薬物とのモル比が１〜２００：１である。該結合方式は、アントラサイクリン類、アクリジン類の薬物に適用される。上記異なる結合方式で結合されている薬物の比は、効率的な担持を満たすことができ、細胞に対して毒性作用がなく、標的位置に到達した後に薬物の効果的なリリースを実現する限り、上記範囲に限られない。

【0134】

生物活性物質前駆体及び核酸ドメインの両方をアルキニル基又はアジドで修飾し、クリック結合の方式で結合されている場合、薬物の異なる構造の変化とともに、異なるクリック結合を選択する。活物質構造によって、結合位置が対応して変わる可能性があることは、当業者にとって理解できるものである。

【0135】

１つの好適な実施例では、生物活性物質がクリック結合の方式で核酸ドメインに結合されている場合、生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基又はアミノ基から選ばれ、核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、アミノ基、イミノ基又はヒドロキシ基から選ばれる。

【0136】

なお、本願に係る配列又は配列の変形が自己組織化して形成される核酸ナノ粒子は、基本構造単位としてもよく、実際の使用需要に応じて、さらに重合して、二量化体、三量化体、四量体、五量体、六量体又は七量体などのポリマーを形成してもよい。

【0137】

以下、具体的な実施例を参照しながら、本願の有益な効果についてさらに説明する。

【0138】

核酸ナノ粒子の組織化

【0139】

実施例１
一、ＲＮＡ及びＤＮＡナノ粒子担体
（１）ＲＮＡナノ粒子を構成する３本のポリヌクレオチド塩基配列は、具体的には表１に示された。

【表1】

【0140】

（２）ＤＮＡナノ粒子の３本のポリヌクレオチド塩基配列
ＤＮＡは、Ｕの代わりにＴを用いる以外、上記ＲＮＡと同一の配列を用いた。ここで、ａ鎖の分子量が８８０２．６６、ｂ鎖の分子量が８２８０．３３、ｃ鎖の分子量が９６０５．２であった。

【0141】

上記ＲＮＡナノ粒子及びＤＮＡナノ粒子のａ、ｂ及びｃ鎖は、すべて生工生物工程（上海）股ふん有限公司に委託して合成されるものであった。

【0142】

二、自己組織化実験ステップ。
（１）１：１：１のモル比でＲＮＡ又はＤＮＡ一本鎖ａ、ｂ、ｃを同時に混合してＤＥＰＣ水又はＴＭＳ緩衝液に溶かし、
（２）混合溶液を８０℃／９５℃（ＲＮＡの組織化温度が８０℃、ＤＮＡの組織化温度が９５℃である）に加熱し、５ｍｉｎ維持してから、２℃／ｍｉｎのレートで室温にゆっくり降温し、
（３）生成物を８％（ｍ／ｖ）の非変性ＰＡＧＥゲルにロードしてＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で、１００Ｖで複合体を電気泳動により精製し、
（４）目的とするバンドを切り出してＲＮＡ／ＤＮＡ溶離緩衝液に３７℃で溶離し、この後に一晩エタノールで沈殿させ、減圧して低温で蒸発させ、自己組織化生成物を得、
（５）電気泳動分析検出及びレーザ走査観察を行った。

【0143】

三、自己組織化実験結果
電気泳動の検出結果
ＲＮＡ自己組織化生成物の電気泳動の検出結果は、図１に示された。図１において、レーン１〜３は、左から右へ順にａ鎖、ｂ鎖、ＲＮＡ自己組織化生成物であった。図から分かるように、ＲＮＡ自己組織化生成物は、少し分散するが、単一のバンドを明瞭に見えた。分子量が組織化後の分子量であり、一本鎖の分子量より大きいため、バンド位置がａ鎖及びｂ鎖より後であり、実際の状況が理論と一致し、上記ＲＮＡ一本鎖の間が自己組織化して、安定した複合構造を形成し、ＲＮＡナノ粒子を形成したことが証明された。

【0144】

ＤＮＡ自己組織化生成物の電気泳動の検出結果は、図２に示された。図２において、レーン１〜３は、左から右へ順にａ鎖、ｂ鎖、ＤＮＡ自己組織化生成物であった。図から分かるように、ＤＮＡ自己組織化生成物のバンドが明るくかつ明瞭であり、単一のバンドであり、上記ＤＮＡ一本鎖の間が自己組織化して、安定した複合構造を形成し、ＤＮＡナノ粒子を形成したことが証明された。

【0145】

該実施例では、ゲル電気泳動によれば、ＲＮＡコア配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５を含むａ配列、ｂ配列、ｃ配列は、自己組織化してＲＮＡナノ粒子になることができ、ＤＮＡコア配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６を含むａ配列、ｂ配列、ｃ配列は、自己組織化してＤＮＡナノ粒子になることにできたことが検証された。

【0146】

上記ＲＮＡナノ粒子及びＤＮＡナノ粒子のａ配列、ｂ配列、ｃ配列は、核酸ドメインを形成するコア配列を有する以外、核酸ドメイン担持機能を促進する様々な伸長配列（薬物担持結合配列を含む）、及び核酸ドメインに結合されている標的ヘッド又はフルオレセインを有した。これから分かるように、これらのコア配列以外の物質の存在により、核酸ドメインの形成及び核酸ナノ粒子の自己組織化の成功に影響を与えることなかった。自己組織化された核酸ナノ粒子は、標的ヘッドのガイドで、標的性を有することができ、フルオレセインは、該核酸ナノ粒子に可視性及び追跡可能性を与えることができた。

【0147】

実施例２
一、７組の短配列ＲＮＡのナノ粒子担体
（１）ＲＮＡナノ粒子を構成する７組の３本のポリヌクレオチド塩基配列

【0148】

【表2】

【0149】

【表3】

【0150】

【表4】

【0151】

【表5】

【0152】

【表6】

【0153】

【表7】

【0154】

【表8】

【0155】

上記７組の短配列ＲＮＡのナノ粒子担体の一本鎖は、すべて生工生物工程（上海）股ふん有限公司に委託して合成されるものであった。

【0156】

二、自己組織化実験ステップ
（１）１：１：１のモル比でＲＮＡ一本鎖ａ、ｂ、ｃを同時に混合してＤＥＰＣ水又はＴＭＳ緩衝液に溶かし、
（２）混合溶液を８０℃に加熱し、５ｍｉｎ維持してから、２℃／ｍｉｎのレートで室温にゆっくり降温し、
（３）生成物を８％（ｍ／ｖ）の非変性ＰＡＧＥゲルにロードしてＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で、１００Ｖで複合体を電気泳動により精製し、
（４）目的とするバンドを切り出してＲＮＡ溶離緩衝液に３７℃で溶離し、この後に一晩エタノールで沈殿させ、減圧して低温で蒸発させ、短配列ＲＮＡの自己組織化生成物を得、
（５）電気泳動分析検出及びレーザ走査観察を行い、
（６）電位検出を行った。

【0157】

三、自己組織化実験結果
（１）電気泳動の検出結果
７組の短配列ＲＮＡの自己組織化生成物の２％のアガロースゲル電気泳動図は、図３に示された。図３において、レーン１〜７は、左から右へ順に短配列Ｒ−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｒ−４、Ｒ−５、Ｒ−６、Ｒ−７であった。

【0158】

７組の短配列ＲＮＡの自己組織化生成物の４％のアガロースゲル電気泳動図は、図４に示された。図４において、レーン１〜７は、左から右へ順に短配列Ｒ−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｒ−４、Ｒ−５、Ｒ−６、Ｒ−７であった。

【0159】

図３及び図４の結果から明瞭に見えるように、７組の短配列自己組織化生成物のうちのＲ−２、Ｒ−３、Ｒ−５、Ｒ−７のバンドが明るくかつ明瞭であり、Ｒ−１、Ｒ−４、Ｒ−６が少し分散するが、単一のバンドを見え、７組の短配列がすべて自己組織化してＲＮＡナノ粒子構造になることができることが示された。

【0160】

（２）電位測定
測定方法：電位サンプル（自己組織化生成物を超純水に溶ける）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
ソフトウェアを開き、メニューＭｅａｓＵｒｅ ＭａｎＵａｌをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
ソフトウェア検出パラメータを設定し、
次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。

【0161】

測定結果：７組の短配列ＲＮＡのナノ粒子の電位検出結果は、以下のとおりであった。

【0162】

【表9】

【0163】

【表10】

【0164】

【表11】

【0165】

【表12】

【0166】

【表13-1】

【0167】

【表13-2】

【0168】

【表14】

【0169】

上記電位検出データから分かるように、７組の短配列ＲＮＡの自己組織化生成物がすべて良好な安定性を有し、各短配列ＲＮＡが自己組織化して形成されるナノ粒子が安定した自己組織化構造を有することがさらに示された。

【0170】

該実施例は、異なるａ、ｂ、ｃコア配列の組合せが、自己組織化して核酸ドメインを有するＲＮＡナノ粒子を形成でき、構造が安定することを示した。実施例１に基づいて分かるように、これらの異なるコア配列の組合せにさまざまな機能の伸長断片を加え、又は標的ヘッド、フルオレセインなどを結合すると、同様に組織化してＲＮＡナノ粒子を形成することができ、薬物担持、細胞標的性、可視性及び追跡可能性などの性能を有した。

【0171】

これらの性能をさらに検証するために、実施例２に伸長断片を加え、具体的には実施例３に示された。実施例２のＲＮＡコア配列に対応するＤＮＡコア配列に伸長断片を加え、また、標的ヘッドを結合するか、又は、標的ヘッドを結合せず、具体的には実施例４に示された。

【0172】

実施例３
一、７組の一般的な配列のＲＮＡナノ粒子担体
（１）ＲＮＡナノ粒子を構成する７組の３本のポリヌクレオチド塩基配列

【0173】

【表15】

【0174】

【表16】

【0175】

【表17】

【0176】

【表18】

【0177】

【表19】

【0178】

【表20】

【0179】

【表21】

【0180】

上記７組の一般的な配列のＲＮＡナノ粒子担体の一本鎖は、すべて、蘇州吉瑪公司に委託して合成されるものであり、Ｒ−８〜Ｒ−１４のａ配列、ｂ配列、ｃ配列は、それぞれＲ−１〜Ｒ−７のａ配列、ｂ配列、ｃ配列に伸長セグメントを加えて形成される拡張されたＲＮＡオリゴヌクレオチド配列であり、標的モジュール断片を拡張せず、Ｃ／Ｕ塩基に２’Ｆ修飾を行った（耐酵素消化性及び安定性を強化させた）。また、上記ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１４には、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）のｓｉＲＮＡ核酸干渉の治療断片が修飾され、具体的には、ａ鎖３’末端にＳｕｒｖｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡのセンス鎖（ａ鎖の下線部分に示される）を拡張し、ｂ鎖の５’末端にアンチセンス鎖（ｂ鎖の下線部分に示される）を拡張して結合し、相補的な塩基対を形成した。

【0181】

二、自己組織化実験ステップ
（１）１：１：１のモル比でＲＮＡ一本鎖ａ、ｂ、ｃを同時に混合してＤＥＰＣ水又はＴＭＳ緩衝液に溶かし、
（２）混合溶液を８０℃に加熱し、５ｍｉｎ維持してから、２℃／ｍｉｎのレートで室温にゆっくり降温し、
（３）生成物を８％（ｍ／ｖ）の非変性ＰＡＧＥゲルにロードしてＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で、１００Ｖで複合体を電気泳動により精製し、
（４）目的とするバンドを切り出してＲＮＡ溶離緩衝液に３７℃で溶離し、この後に一晩エタノールで沈殿させ、減圧して低温で蒸発させ、
（５）電気泳動分析検出及びレーザ走査観察を行い、
（６）電位測定を行った。

【0182】

三、自己組織化実験結果
（１）電気泳動の検出結果
７組の一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物の２％のアガロースゲル電気泳動図は、図５に示された。図５において、レーン１〜７は、左から右へ順に一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物Ｒ−８、Ｒ−９、Ｒ−１０、Ｒ−１１、Ｒ−１２、Ｒ−１３、Ｒ−１４であった。

【0183】

７組の一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物の４％のアガロースゲル電気泳動図は、図６に示された。図６において、レーン１〜７は、左から右へ順に一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物Ｒ−８、Ｒ−９、Ｒ−１０、Ｒ−１１、Ｒ−１２、Ｒ−１３、Ｒ−１４であった。

【0184】

図５及び図６の結果から明瞭に見えるように、７組の一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物のバンドがすべて明るくかつ明瞭な単一のバンドであり、７組の一般的な配列がすべて自己組織化してナノ構造になることができることが示された。一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物Ｒ−１４は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ
ｓｉＲＮＡ核酸干渉の治療断片が修飾された後でも、安定した自己組織化構造を有し、本発明では、核酸ナノ粒子が核酸薬を担持することができ、核酸薬の送達担体機能を有することが説明された。

【0185】

（２）電位測定
測定方法：電位サンプル（自己組織化生成物を超純水に溶ける）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
ソフトウェアを開き、メニューＭｅａｓＵｒｅ ＭａｎＵａｌをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
ソフトウェア検出パラメータを設定し、
次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。

【0186】

測定結果：７組の一般的な配列のＲＮＡナノ粒子の電位検出結果は、以下のとおりであった。

【0187】

【表22】

【0188】

【表23】

【0189】

【表24】

【0190】

【表25】

【0191】

【表26】

【0192】

【表27】

【0193】

【表28】

【0194】

上記電位検出データから分かるように、７組の一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物は、すべて良好な安定性を有し、さらに各一般的な配列ＲＮＡが自己組織化して形成されるナノ粒子が安定した自己組織化構造を有することが示された。

【0195】

該実施例により示されるように、異なる組合せのＲＮＡコア配列に伸長断片を加えることによりも、自己組織化して構造が安定したＲＮＡナノ粒子を形成できた。また、加えた伸長断片は、ＲＮＡナノ粒子に優れた薬物担持性能を与えた（具体的には実施例５及び実施例７に示された）。

【0196】

実施例４
一、７組の一般的な配列のＤＮＡナノ粒子担体
（１）ＤＮＡナノ粒子を構成する７組の３本のポリヌクレオチド塩基配列
表における一部のａ鎖にはＥＧＦＲａｐｔ標的ヘッド又はＰＳＭＡａｐｔ（Ａ９Ｌ）標的ヘッドが拡張された。
ＥＧＦＲａｐｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９７）：ＧＣＣＴＴＡＧＴＡＡＣＧＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＧＡＴＴＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣ、
ＰＳＭＡａｐｔ（Ａ９Ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９８）：
ＧＧＧＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＴＣＴＡＣＧＴＣＣＣ。

【0197】

【表29】

【0198】

【表30】

【0199】

【表31】

【0200】

【表32】

【0201】

【表33】

【0202】

【表34】

【0203】

【表35】

【0204】

上記７組の一般的な配列のＤＮＡナノ粒子の一本鎖は、すべて蘇州泓迅に委託して合成されるものであり、
Ｄ−１は、以上に記載のコア配列（８）（ａ配列５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’、ｂ配列５’−ＣＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’）に、ＥＧＦＲａｐｔ標的ヘッド（下線部分に示される）を含む拡張配列を加えて形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子であり、
Ｄ−２は、以上に記載のコア配列（９）（ａ配列５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、ｂ配列５’−ＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’）に、ＥＧＦＲａｐｔ標的ヘッド（下線部分に示される）を含む拡張配列を加えて形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子であり、
Ｄ−３は、以上に記載のコア配列（１０）（ａ配列５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’、ｂ配列５’−ＧＣＴＴＣＧＣＣＧ−３’、ｃ配列５’−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’）に、ＥＧＦＲａｐｔ標的ヘッド（下線部分に示される）を含む拡張配列を加えて形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子であり、
Ｄ−４は、以上に記載のコア配列（１１）（ａ配列５’−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’、ｂ配列５’−ＣＣＴＴＣＧＧＧＧ−３’、ｃ配列５’−ＣＣＣＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’）に、ＰＳＭＡａｐｔ標的ヘッド（下線部分に示される）を含む拡張配列を加えて形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子であり、
Ｄ−５は、以上に記載のコア配列（１２）（ａ配列５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、ｂ配列５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＧ−３’、ｃ配列５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’）に、ＰＳＭＡａｐｔ標的ヘッド（下線部分に示される）を含む拡張配列を加えて形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子であり、
Ｄ−６は、以上に記載のコア配列（１３）（ａ配列５’−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３’、ｂ配列５’−ＣＧＴＴＣＧＧＣＣ−３’、ｃ配列５’−ＧＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３’）に、標的ヘッド構造を含まない拡張配列を加えて形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子であり、
Ｄ−７は、以上に記載のコア配列（１４）（ａ配列５’−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３’、ｂ配列５’−ＧＣＴＴＣＧＧＣＧ−３’、ｃ配列５’−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’）に、標的ヘッド構造を含まない拡張配列を加えて形成される一般的な配列のＤＮＡナノ粒子であった。

【0205】

二、自己組織化実験ステップ
（１）１：１：１のモル比でＤＮＡ一本鎖ａ、ｂ、ｃを同時に混合してＤＥＰＣ水又はＴＭＳ緩衝液に溶かし、
（２）混合溶液を９５℃に加熱し、５ｍｉｎ維持してから、２℃／ｍｉｎのレートで室温にゆっくり降温し、
（３）生成物を８％（ｍ／ｖ）の非変性ＰＡＧＥゲルにロードしてＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で、１００Ｖで複合体を電気泳動により精製し、
（４）目的とするバンドを切り出してＤＮＡ溶離緩衝液に３７℃で溶離し、この後に一晩エタノールで沈殿させ、減圧して低温で蒸発させ、一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物を獲得し、
（５）電気泳動分析検出及びレーザ走査観察を行い、
（６）電位検出を行い、
（７）粒子径測定を行い、
（８）電子顕微鏡を介して観察した。

【0206】

三、自己組織化実験結果
（１）電気泳動の検出結果
７組の一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物の２％のアガロースゲル電気泳動図は、図７に示された。図７において、レーン１〜７は、左から右へ順に一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物のＤ−１、Ｄ−２、Ｄ−３、Ｄ−４、Ｄ−５、Ｄ−６、Ｄ−７であった。

【0207】

７組の一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物の４％のアガロースゲル電気泳動図は、図８に示された。図８において、レーン１〜７は、左から右へ順に一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物のＤ−１、Ｄ−２、Ｄ−３、Ｄ−４、Ｄ−５、Ｄ−６、Ｄ−７であった。

【0208】

図７及び図８の結果から明瞭に見えるように、７組の一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物のバンドがすべて明るくかつ明瞭であり、７組の一般的な配列ＤＮＡ鎖がすべて自己組織化を完了しており、安定したナノ粒子構造を形成したことが示された。Ｄ−６、Ｄ−７の２組の自己組織化構造は、ＥＧＦＲａｐｔ又はＰＳＭＡａｐｔ標的ヘッドを保有するため、分子量がやや低く、バンド位置が他のバンドより明らかに前であり、実際が理論的状況に完全に一致し、さらに自己組織化構造の安定性を証明した。

【0209】

該実施例により示されるように、これらの異なるＤＮＡコア配列の組合せにさまざまな機能の伸長断片を加えるか、又は、標的ヘッドを結合すると、同様に組織化してＤＮＡナノ粒子を形成でき、同様に薬物担持性、細胞標的性、可視性及び追跡可能性などの性能を有した（具体的には実施例６及び実施例８に示された）。

【0210】

（２）電位測定
測定方法：電位サンプル（自己組織化生成物を超純水に溶ける）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
ソフトウェアを開き、メニューＭｅａｓＵｒｅ ＭａｎＵａｌをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
ソフトウェア検出パラメータを設定し、
次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。

【0211】

測定結果：３組の一般的な配列のＤＮＡナノ粒子の電位検出結果は、以下のとおりであった。

【0212】

【表36】

【0213】

【表37】

【0214】

【表38】

【0215】

上記電位検出データから分かるように、３組の一般的な配列のＲＮＡ自己組織化生成物は、すべて良好な安定性を有し、各一般的な配列ＲＮＡが自己組織化して形成されるナノ粒子が安定した自己組織化構造を有することがさらに示された。

【0216】

（３）粒子径測定
１．電位サンプル（一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物のＤ−７）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
２．ソフトウェアを開き、メニューをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
３．ソフトウェア検出パラメータを設定し、
４．次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。自己組織化生成物のＤ−７の流体力学サイズのＤＬＳ測定値結果は、以下のとおりであった。

【0217】

【表39】

【0218】

（４）電子顕微鏡による観察結果
上記一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物のＤ−７に対して透過電子顕微鏡照射を行い、ステップは、以下のとおりであった。
１、１滴のサンプルを、カーボンでコーティングされた４００メッシュの銅網に室温で１分間浮遊し、
２、ろ紙で液体を吸い取り、
３、２％の酢酸ウランで１分間染色し、
４、ろ紙で吸い取り、室温で乾燥させ、
５、ＪＥＭ−１４００透過電子顕微鏡を介して１２０ｋｖで観察し、写真を撮った。

【0219】

結果は、図９に示され、図から明瞭に見えるように、上記一般的な配列のＤＮＡ自己組織化生成物のＤ−７がＴ字型構造の一体構造であった。

【0220】

アドリアマイシン（Ｄｏｘ）担持実験

【0221】

実施例５
化学的方法による担持
一、実験材料及び実験方法
１．実験材料及び試薬
（１）核酸ナノ粒子：実施例１のＲＮＡナノ粒子から；
（２）ＤＥＰＣ水、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ製；
（３）ＰＢＳ緩衝液、ｃｅｌｌｇｒｏ製；
（４）４％のパラホルムアルデヒド；
（５）アドリアマイシン（Ｄｏｘ）；
（６）クロロホルム、北京化工大学製；
（７）無水エタノール、北京化工大学製。

【0222】

２．実験方法
（１）アドリアマイシン（５．０ｍｇ、８．６μｍｏｌ、４０ｅｑ．）を精密に秤取してＤＥＰＣ水（１．８ｍＬ）及びＰＢＳ緩衝液（２．１ｍＬ）に溶かし、氷水浴で冷却しながら、４％のパラホルムアルデヒド水溶液（０．４ｍＬ）を加えて混合し、この混合液を全部ＲＮＡナノ粒子（２１５ｎｍｏｌ）と混合し、遮光条件下で４℃で７２時間反応した。

【0223】

（２）１０μＬの反応液を１０倍希釈し、５０μＭのアドリアマイシン水溶液及び３１０ｎｇ／μＬのＲＮＡナノ粒子を対照とし、等体積でサンプルを注入してＨＰＬＣ分析を行った。各成分のピーク面積比に基づいて、反応転化がほとんど完了したと判断できた。

【0224】

（３）反応液をクロロホルム抽出（１０ｍＬｘ３）し、次に１０倍の体積の無水エタノールを加え、混合後に４℃で遮光放置して生成物を（４時間）十分析出した。遠心し、上清を移し、固体生成物を再びエタノールで洗浄し、溶媒を低温で減圧して蒸発させて暗赤色の固体担持生成物を得た。

【0225】

（４）少量の生成物をＤＥＰＣ水に溶かし、８％のＰＡＧＥゲルにロードし、ＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で１００Ｖで１時間電気泳動し、電気泳動結果は、図１０に示された。図１０において、左から右へ、レーン１〜５は、それぞれ１）２０ｂｐ
ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、２−４）ＲＮＡナノ粒子のブランク粒子及び５）アドリアマイシン担持生成物であった。図１０から見えるように、アドリアマイシン担持生成物のバンドがＲＮＡナノ粒子ブランク粒子より少し後に位置した。

【0226】

（５）担持率計算
１．既知の濃度２μＭ、４μＭ、６μＭ、８μＭ、１０μＭのアドリアマイシン−ＰＢＳ基準溶液をそれぞれ１００μｌ調製し、
２．アドリアマイシン担持生成物を１００μｌのＰＢＳに溶解し、
３．基準液とアドリアマイシン担持生成物をＰＣＲプレートに入れ、８５℃で５ｍｉｎ加熱し、次に室温まで冷却させ、
４．マイクロプレートリーダーを利用して４９２ｎｍでのアドリアマイシンの吸光度を測定し、検量線（図１１で示される）をレンダリングし、担持生成物中のアドリアマイシンのモル濃度を計算し、
５．分光光度計を利用して２６０ｎｍでのＲＮＡの吸光度を測定し、各サンプルに含まれるアドリアマイシン担持生成物の質量濃度を獲得し、
６．測定して得られたアドリアマイシンモル濃度及びアドリアマイシン担持生成物の質量濃度に基づいて、担持率を計算した。

【0227】

計算の具体的な過程は、以下のとおりであった。
Ｃ_ＲＮＡｈ−１＝９．５ｕｇ／μｌ、Ｍ_ＲＮＡｈ≒３００００、１００μｌ、Ｃ_{アドリアマイシン}−１＝８．０３３μＭ、１００μｌ
Ｃ_ＲＮＡｈ−２＝１．２１ｕｇ／μｌ、Ｍ_ＲＮＡｈ≒３００００、１００μｌ；Ｃ_{アドリアマイシン}−１＝９．２００μＭ、１００μｌ

【数1】

【0228】

Ｎ−１及びＮ−２の平均値から、ＲＮＡｈ−アドリアマイシンの担持率が約２４であり、各核酸ナノ粒子担体に約２４個のアドリアマイシン分子を担持できることが示された。

【0229】

物理的方法による担持
１）アドリアマイシンとＲＮＡナノ粒子の質量比を１：１にし、
２）０．１ｍｇのアドリアマイシン原薬を称取して５０μｌのＤＭＳＯに溶かし、次に３００μｌのＰＢＳを加えて混合し、
３）ＲＮＡ粒子を２００μｌのＤＥＰＣ水に溶かし、アドリアマイシン−ＰＢＳ混合液に加え、混合し、ｐＨを約７．５に調整し、
４）全部の溶液を５５℃のウォーターバスに入れ、３ｈ反応し、
５）反応終了後、直接１０倍の体積の無水エタノールを加え、４℃で４ｈ析出し、
６）１０倍の無水エタノールで４回洗浄し、１．５ｍＬのＥＰチューブに移した。次に、以上と同一の方法で担持率の測定を行い、測定結果がアドリアマイシン担持率１５．５であった。

【0230】

実施例５により示されるように、伸長断片、標的ヘッド及びフルオレセインを有するＲＮＡナノ粒子（実施例１）は、薬物担持機能を有し、物理的インターカレーション及び共有結合（パラホルムアルデヒド−溶媒共有）の方式で薬物担持を実現することができた。

【0231】

実施例６
実施例５に係る化学的方法による担持方法（特別な制限がない限り、方法は実施例５と同じ）は、それぞれ前述した実施例１のＤＮＡナノ粒子、実施例２のＲ−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｒ−４、Ｒ−５、Ｒ−６、Ｒ−７が自己組織化して形成されるＲＮＡナノ粒子、実施例４のＤ−２、Ｄ−６及びＤ−７が自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子をアドリアマイシン担持担体として用い、測定したアドリアマイシン担持率はそれぞれ以下のとおりであった。

【0232】

実施例１のＤＮＡナノ粒子のアドリアマイシン担持率が３００であった（該方法では、アドリアマイシンが１．２ｍｇ、ＤＥＰＣ水が０．５ｍｇ、ＰＢＳ緩衝液が８．５ｍｌ、４％のパラホルムアルデヒド水溶液が１ｍｌ、ＤＮＡナノ粒子が２．５ｎｍｏｌであり、ＤＮＡナノ粒子を２０μｌの水に溶けた）。

【0233】

ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１のアドリアマイシン担持率が３．５、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−２のアドリアマイシン担持率が２．４、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−３のアドリアマイシン担持率が４．８、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−４のアドリアマイシン担持率が３．５、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−５のアドリアマイシン担持率が１２．５、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−６のアドリアマイシン担持率が２．８、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−２のアドリアマイシン担持率が１４、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−６のアドリアマイシン担持率が１１、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−７のアドリアマイシン担持率が１０であった。

【0234】

フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）実験によるＲＮＡナノ粒子の細胞結合能力の検出

【0235】

実施例７
一、実験材料及び実験方法
１．被検サンプルは表４０に示された。

【表40】

注：表においてＲＮＡｈとは、実施例１で自己組織化して形成されるＲＮＡナノ粒子のうち、Ｂｉｏｔｉｎ修飾が行われていない対照ナノ粒子であり、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎｅ−ｑｕａｓａｒ６７０とは、実施例１で自己組織化して形成されるＲＮＡナノ粒子の５’末端にｑｕａｓａｒ６７０フルオレセインを修飾して形成されるナノ粒子であり、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎｅ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘとは、さらにアドリアマイシン薬物を担持して（実施例５の化学的方法による担持）形成されるナノ粒子であった。

【0236】

２．用いられた実験試薬及びそれらの由来は、以下のとおりであった。
ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ１１８７５５００ＢＴ−５００ｍＬ）；ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏ、ＦＮＡ５００−５００ ｍＬ）；ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ＰＳ）（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０−１２２−１００ ｍＬ）；ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ２００１２５００ＢＴ−５００ ｍＬ）；Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、０７９０１−５００ ｍＬ）；ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ５８７９−１ Ｌ）。

【0237】

３．用いられた実験器具は、以下のとおりであった。
倒立顕微鏡（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１、ＴＨ４−２００）；フローサイトメトリ（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。

【0238】

４．実験方法
（１）ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１％ＰＳ培地を用い、３７℃で５％のＣＯ_２においてＨｅｐＧ２細胞を培養した。
（２）ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン消化し、ＰＢＳで１回洗浄した。
（３）それぞれ２×１０^５個の細胞とＲＮＡｈ、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘナノ粒子を３７℃で５％のＣＯ_２において１ｈインキュベートし、各サンプルがそれぞれ２００ｎＭ及び４００ｎＭの２つの濃度を有し、各濃度でサンプルごとに３つの反復を有した。
（４）細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、ＦＡＣＳ器具で検出した。
（５）データを収集して統計分析を行った。

【0239】

二、実験結果
実験結果は、表４１、図１２及び図１３に示された。

【0240】

【表41】

【0241】

図１２において、ＡがＨｅｐＧ２細胞対照群に対応し、Ｂが２００ｎＭ濃度のＲＮＡｈ対照ナノ粒子に対応し、Ｃが２００ｎＭ濃度のＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０ナノ粒子に対応し、Ｄが２００ｎＭ濃度のＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘナノ粒子に対応し、Ｅが４００ｎＭ濃度のＲＮＡｈ対照ナノ粒子に対応し、Ｆが４００ｎＭ濃度のＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０ナノ粒子に対応し、Ｇが４００ｎＭ濃度のＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘナノ粒子に対応した。

【0242】

表４１及び図１２から見えるように、標的ヘッドが修飾されていない単なるＲＮＡナノ粒子は、細胞標的性を有さず、ＨｅｐＧ２細胞と結合できるように、ビオチンを担持する必要があった。また、図１２のＦＡＣＳ結果は、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０及びＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘナノ粒子のＨｅｐＧ２細胞との結合能力が高い（Ｐ＜０．０００１）ことを示した。

【0243】

図１３は、顕微鏡で検出された、ナノ粒子のＨｅｐＧ２細胞との結合及び内在化結果を示した。細胞結合及び内在化実験の結果は、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０及びＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘナノ粒子がすべてＨｅｐＧ２細胞と結合して内在化できることを示した（アドリアマイシンを担持するナノ粒子ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−ＤｏｘとＨｅｐＧ２細胞とが共インキュベートされた後、細胞が明らかに赤く染色され、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘナノ粒子の濃度及び時間の増加に伴って色が濃くなり、薬を担持するＲＮＡナノ粒子のＨｅｐＧ２細胞との結合及び内在化能力が強いことが示された。ＲＮＡｈ−Ｂｉｏ−ｑｕａｓａｒ６７０もＨｅｐＧ２細胞との結合及び内在化の能力を有するが、Ｄｏｘを含まないため、赤く染色することができなかった）。

【0244】

実施例８
一、実験材料及び試験方法
１．被検サンプルは表４２に示された。

【表42】

注：ＤＯＸ−Ｄ−１−ＥＧＦＲとは、前述した実施例４で自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子Ｄ−１がアドリアマイシン（担持ステップは実施例５と同じであり、以下同じ）を担持して形成されるナノ粒子であり（Ｄ−１自身はＥＧＦＲを担持しており、ここで、ＤＯＸ−Ｄ−１−ＥＧＦＲとして表現する原因は、標的ヘッドのタイプ及びアドリアマイシンの担持を明瞭にするためであり、以下同じ）、ＤＯＸ−Ｄ−２−ＥＧＦＲとは、前述した実施例で自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子Ｄ−２がアドリアマイシンを担持して形成されるナノ粒子であり、ＤＯＸ−Ｄ−５−ＰＳＭＡとは、前述した実施例で自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子Ｄ−５がアドリアマイシンを担持して形成されるナノ粒子であった。

【0245】

２．細胞情報は、表４３に示された。

【表43】

【0246】

３．用いられた実験試薬及びそれらの由来は、以下のとおりであった。
ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＹＹ０１６７−５００Ｍｌ）；
ＭＥＭ（ＹＳ４１５０−５００ｍＬ）；
ＭＥＭ ＮＥＡＡ（１００×）（ＧＢＩＣＯ、Ｃａｔ＃１８７２９８２）；
ＦＢＳウシ胎仔血清（ＧＢＩＣＯ、Ｃａｔ＃１００９９１４１）。

【0247】

４．用いられた実験器具は、以下のとおりであった。
フローサイトメトリＧｕａｖａ
ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマルチラベルマイクロプレートリーダー、ＭＤ、２１０４−００１０Ａ。

【0248】

５．実験方法
５．１細胞培養
ａ）細胞を対応する培地に復活させ、３７℃で、５％のＣＯ_２細胞培養器において培養した。
ｂ）細胞がＴ７５細胞培養瓶で対数成長期になるとき（約８０％の合流率）、元の培地を、葉酸及びビオチンを含まない培地に交換した。

【0249】

５．２結合実験
ａ）最初の日に細胞を収集して計数し、２×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で２４ウェルプレートに播種した。
ｂ）次の日に、ＰＢＳでサンプルを希釈した。ＰＢＳですべてのサンプルを１００μＭに希釈し、１μＭの溶液を調製し、マイクロプレートリーダーにおいて蛍光基（アドリアマイシン：Ｅｘ＝４８０ｎｍ、Ｅｍ＝５８０ｎｍ）が正常に発光するか否かを検出した。
ｃ）ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。
ｄ）培地に溶けたナノ粒子を加え、３７℃のＣＯ_２培養器において細胞を１６ｈインキュベートした。ナノ粒子濃度が２μＭであり、サンプル順序は、以下の表４４に示された。

【表44】

ｅ）ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。
ｆ）トリプシン消化された細胞を収集してＰＢＳで細胞を２回洗浄した。
ｇ）ＰＢＳで洗浄された細胞を４００ｕＬのＰＢＳに再懸濁し、５ｍＬのフローサイトメトリーチューブに移した。
ｈ）フローサイトメトリにロードする前に、サンプルを遮光する必要があった。
ｉ）フローサイトメトリで検出した。アドリアマイシンのＥｘ＝４８０ｎｍ、Ｅｍ＝５８０ｎｍ（黄色通路）で細胞の蛍光強度を検出した。
ｊ）ＦｌｏｗＪｏソフトウェアでＦＡＣＳデータを分析した。
ｋ）ブランク細胞組のバックグラウンド蛍光強度に基づいてゲートを設定し、各ＤＮＡナノ粒子の細胞との結合率を分析した。

【0250】

二、実験結果
実験結果は、表４５、４６及び４７に示された。

【0251】

【表45】

【0252】

【表46】

【0253】

【表47】

【0254】

上記表４６、４７のデータ結果から分かるように、ＤＯＸ−Ｄ−１−ＤＮＡｈ−ＥＧＦＲのＵ８７ＭＧ細胞との結合能力が非常に強く、投与濃度が２μＭで、投与時間が１６ｈである場合に、結合効率が１００％であった。ＤＯＸ−Ｄ−２−ＥＧＦＲのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との結合能力が非常に強く、投与濃度が２μＭで、投与時間が１６ｈである場合に、結合効率が１００％であった。ＤＯＸ−Ｄ−３−ＥＧＦＲのＨＣＣ−７８細胞との結合能力が非常に強く、投与濃度が２μＭで、投与時間が１６ｈである場合に、結合効率が１００％であった。

【0255】

その他の核酸ナノ粒子（ＲＮＡナノ粒子及び残りのＤＮＡナノ粒子を含む）は、すべて、ＤＯＸ−Ｄ−１−ＤＮＡｈ−ＥＧＦＲ、ＤＯＸ−Ｄ−２−ＥＧＦＲ又はＤＯＸ−Ｄ−５−ＰＳＭＡと同一の標的ヘッドＥＧＦＲａｐｔ又はＰＳＭＡａｐｔを保有するか、又は、伸長セグメントを増加させるという方式でＥＧＦＲａｐｔ又はＰＳＭＡａｐｔを保有できるため、対応する細胞と、相当する結合効率を有した。また、すべてＤＯＸ−Ｄ−１−ＤＮＡｈ−ＥＧＦＲ、ＤＯＸ−Ｄ−２−ＥＧＦＲ又はＤＯＸ−Ｄ−５−ＰＳＭＡと同一の薬物担持配列（ＧＣ担持部位配列）を保有するため、相当する薬物担持機能を有した。

【0256】

核酸ナノ粒子の血清での安定性の検出

【0257】

実施例９
一、実験材料及び実験方法
１．被検サンプル：ＰＢＳ溶液に溶解した、実施例１で製造されたＲＮＡナノ粒子。

【0258】

２．実験試薬
ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ１１８７５５００ＢＴ−５００ ｍＬ）；ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏ、ＦＮＡ５００−５００ ｍＬ）；ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ＰＳ）（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０−１２２−１００ ｍＬ）；ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ２００１２５００ＢＴ−５００ ｍＬ）；Ｎｏｖｅｘ^TMＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（２Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＣ２６７３−２０ ｍＬ）；Ｎｏｖｅｘ^TM８％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＸＰ０００８０ＢＯＸ−１．０ ｍｍ）；Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｘ）（Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、ＬＣ２６７２−５００ ｍＬ）；Ｇ２５０染色液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｐ００１７−２５０ ｍＬ）。

【0259】

３．実験器具
分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ、ＮＤ２０００Ｃ）；Ｍｉｎｉ Ｇｅｌ Ｔａｎｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＳ０３０１）；結像システム（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ）。

【0260】

４．実験方法
（１）３５０μｌのＰＢＳを吸い取ってＲＮＡナノ粒子サンプルに加え、十分に混合した。
（２）２μＭのＲＮＡナノ粒子を１０％の血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に入れてインキュベートした。
（３）３７℃で１０ｍｉｎ、１ｈ、１２ｈ、３６ｈインキュベートしてそれぞれロードした。
（４）ＮａｎｏＤｒｏｐで定量化した後、２００ｎｇのＲＮＡナノ粒子を、同じ体積のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳサンプル緩衝液（２Ｘ）に加え、十分に混合した。
（５）Ｎｏｖｅｘ^TM８％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｍｉｎｉ ｇｅｌに順にロードし、２００Ｖ、３０ｍｉｎであるようにプログラムを設定し、電気泳動を開始した。
（６）電気泳動終了後、Ｇ２５０で染色し、レベルシェーカーに３０ｍｉｎ〜１ｈ放置し、写真を撮った。

【0261】

二、実験結果

【表48】

【0262】

電気泳動の検出結果は、図１４及び図１５に示された。図１４は８％の非変性ゲルの電気泳動結果（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅプログラム）を示し、図１５は８％の非変性ゲルの電気泳動結果（Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅ Ｇｅｌプログラム）を示した。ＲＮＡナノ粒子の血清安定性試験の結果によれば、１０ｍｉｎ、１ｈ、１２ｈ及び３６ｈの非変性ゲルの結果（図１４及び図１５）は、異なる時間にＲＮＡナノ粒子サンプルのバンドに明らかな違いがないことが示され、ＲＮＡナノ粒子が１０％のＦＢＳの１６４０培地において安定し、明らかに分解していないことが示された。

【0263】

ＲＮＡナノ粒子のＨｅｐＧ２細胞での細胞毒性の研究

【0264】

実施例１０
一、実験材料及び実験方法
１．被検サンプルは、実施例７の３つのサンプルであった。

【0265】

２．実験試薬
ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ１１８７５５００ＢＴ−５００ ｍＬ）；ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏ、ＦＮＡ５００−５００ ｍＬ）；ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ＰＳ）（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０−１２２−１００ ｍＬ）；ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ２００１２５００ＢＴ−５００ ｍＬ）；Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、０７９０１−５００ ｍＬ）；ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ５８７９−１ Ｌ）；Ｄｏｘ（ＨＩＳＵＮ Ｐｈａｒｍ、Ｈ３３０２１９８０−１０ ｍｇ）；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７２−１００ ｍＬ）。

【0266】

３．実験器具
倒立顕微鏡（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７１、ＴＨ４−２００）；９６ウェルプレートリーダー（９６−ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３）。

【0267】

４．実験方法
（１）ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１％ＰＳ培地を、３７℃で５％のＣＯ_２においてＨｅｐＧ２細胞を培養した。
（２）ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン消化し、５０００個の細胞／１００μＬで９６ウェルプレートの各ウェルに接種し、３７℃で５％のＣＯ_２において一晩培養した。
（３）次の日に細胞上清を除去し、培地で被検サンプルを希釈し、プレートに播種された細胞に２００ｎＭのＲＮＡｈ、ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎｅ、ＲＮＡｈ−Ｄｏｘ及びＤｏｘをそれぞれ１００μＬ加え、サンプルごとに４つの反復を有した。
（４）７２ｈ培養した後、各ウェルにＣＴＧ試薬を１００μＬ加え、２ｍｉｎ振とうし、１０ｍｉｎ室温で静置し、全過程で遮光した。
（５）最後にＳｏｆｔ Ｍａｘ
Ｐｒｏ５ソフトウェアで読み取った。

【0268】

二、実験結果

【表49】

【0269】

実験結果は、表４９及び図１６に示され、図１６において、ａがＰＢＳの細胞増殖結果に対応し、ｂがＤＭＳＯの細胞増殖結果に対応し、ｃがＤｏｘ（アドリアマイシン）の細胞増殖結果に対応し、ｄがＲＮＡｈの細胞増殖結果に対応し、ｅがＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０の細胞増殖結果に対応し、ｆがＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎ−ｑｕａｓａｒ６７０−Ｄｏｘの細胞増殖結果に対応した。

【0270】

表４９及び図１６から見えるように、ＣＴＧ結果により、２００ｎＭの薬担持ナノ粒子ＲＮＡｈ−Ｂｉｏｔｉｎｅ−ＤｏｘがＨｅｐＧ２細胞に対して明らかな細胞毒性を有するが（Ｐ＜０．０００１）、２００ｎＭのＲＮＡｈ−ＢｉｏｔｉｎｅがＨｅｐＧ２細胞に対して細胞毒性を有さないことが示された。

【0271】

核酸ナノ粒子の組織化

【0272】

実施例１１
一、７組の伸長セグメントの変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子担体
（１）伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子を構成する７組の３本のポリヌクレオチド塩基配列

【0273】

【表50】

【0274】

【表51】

【0275】

【表52】

【0276】

【表53】

【0277】

【表54】

【0278】

【表55】

【0279】

【表56】

【0280】

二、自己組織化試験のステップ
（１）１：１：１のモル比でＲＮＡ一本鎖ａ、ｂ、ｃを同時に混合してＤＥＰＣ水又はＴＭＳ緩衝液に溶かし、
（２）混合溶液を８０℃に加熱し、５ｍｉｎ維持してから、２℃／ｍｉｎのレートで室温にゆっくり降温し、
（３）生成物を８％（ｍ／ｖ）の非変性ＰＡＧＥゲルにロードしてＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で、１００Ｖで複合体を電気泳動により精製し、
（４）目的とするバンドを切り出してＲＮＡ溶離緩衝液に３７℃で溶離し、この後に一晩エタノールで沈殿させ、減圧して低温で蒸発させ、
（５）電気泳動分析検出及びレーザ走査観察を行い、
（６）電位測定を行い、
（７）粒子径測定を行い、
（８）Ｔｍ値測定を行った。

【0281】

三、自己組織化試験結果
（１）電気泳動検出
主な試薬及び器具は、以下のとおりであった。

【表57】

【表58】

【0282】

ステップ
<１>ＲＮＡナノ粒子を以下の表５９の方法にしたがって超純水で希釈した。

【表59】

<２>１０μＬの処理済みのサンプル（５００ｎｇ）と２μＬの６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを混合し、氷において操作し、マーキングしておいた。
<３>８％の非変性ＰＡＧＥゲルを用意し、異なるインキュベート時間でのサンプルを同一のゲルにロードし、１２μＬの処理済みのサンプルを全部ロードして、１００Ｖで４０ｍｉｎ電気泳動するようにプログラムを設定した。
<４>電気泳動が終了し、染色し、レベルシェーカーに３０ｍｉｎ放置し、写真を撮った。

【0283】

検出結果
７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡの自己組織化生成物の非変性ＰＡＧＥゲルの電気泳動結果は、図１７に示された。図１７において、レーン１〜７は、左から右へ順に７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡの自己組織化生成物Ｒ−１５、Ｒ−１６、Ｒ−１７、Ｒ−１８、Ｒ−１９、Ｒ−２０、Ｒ−２１であった。

【0284】

図１７の結果から明瞭に見えるように、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡの自己組織化生成物のバンドがすべて明るくかつ明瞭であり、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡ鎖がすべて自己組織化を完了しており、安定したナノ粒子構造を形成したことが示された。

【0285】

（２）電位測定
測定方法：電位サンプル（自己組織化生成物を超純水に溶ける）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
ソフトウェアを開き、メニューＭｅａｓＵｒｅ ＭａｎＵａｌをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
ソフトウェア検出パラメータを設定し、
次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。

【0286】

測定結果：７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子の２５℃での電位検出結果は、以下のとおりであった。

【0287】

【表60】

【0288】

【表61】

【0289】

【表62】

【0290】

【表63】

【0291】

【表64】

【0292】

【表65】

【0293】

【表66】

【0294】

上記電位検出データから分かるように、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子は、すべて良好な安定性を有し、各伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡが自己組織化して形成されるナノ粒子が安定した自己組織化構造を有することがさらに示された。

【0295】

（３）粒子径測定
１．電位サンプル（７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡ）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
２．ソフトウェアを開き、メニューをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
３．ソフトウェア検出パラメータを設定し、
４．次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡの流体力学サイズのＤＬＳ測定値結果はそれぞれ、以下のとおりであった。

【0296】

【表67】

【0297】

（４）ＴＭ値検出
溶解度曲線法を用いて、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子のＴＭ値を検出し、サンプルが電位サンプルと一致した。

【0298】

試薬及び器具は、以下のとおりであった。

【表68】

【表69】

【0299】

ステップ
<１>サンプルを超純水で希釈した後、希釈された５μｇのサンプルを２μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料（１：２００で希釈）と混合し、最終体積が２０μＬであり、希釈濃度は、以下のとおりであった。

【表70】

<２>室温で３０ｍｉｎ遮光しながらインキュベートし、
<３>フローサイトメーターで検出し、２０℃で開始し、１秒に０．１℃〜９５℃加熱し、５ｓおきに１回読み取るようにプログラムを設定した。

【0300】

検出結果
７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子のＴＭ値は以下のとおりであった。Ｒ−１５の溶解度曲線図は、図１８に示され、Ｒ−１６の溶解度曲線図は、図１９に示され、Ｒ−１７の溶解度曲線図は、図２０に示され、Ｒ−１８の溶解度曲線図は、図２１に示され、Ｒ−１９の溶解度曲線図は、図２２に示され、Ｒ−２０の溶解度曲線図は、図２３に示され、Ｒ−２１の溶解度曲線図は、図２４に示された。ＲＮＡサンプルの特殊性のため、今回の検出は２０〜９０℃範囲での１／２ＲＦＵｍａｘ値に対応する温度をサンプルのＴｍ値とした。

【0301】

【表71】

【0302】

７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子のＴＭ値がすべて高く、自己組織化生成物が良好な構造安定性を有することが示された。

【0303】

実施例１２
一、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子担体

【0304】

（１）伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子を構成する７組の３本のポリヌクレオチド塩基配列

【0305】

【表72】

【0306】

【表73】

【0307】

【表74】

【0308】

【表75】

【0309】

【表76】

【0310】

【表77】

【0311】

【表78】

【0312】

二、自己組織化試験ステップ
（１）１：１：１のモル比でＤＮＡ一本鎖ａ、ｂ、ｃを同時に混合してＤＥＰＣ水又はＴＭＳ緩衝液に溶かし、
（２）混合溶液を９５℃に加熱し、５ｍｉｎ維持してから、２℃／ｍｉｎのレートで室温にゆっくり降温し、
（３）生成物を８％（ｍ／ｖ）の非変性ＰＡＧＥゲルにロードしてＴＢＭ緩衝液において４℃条件下で、１００Ｖで複合体を電気泳動により精製し、
（４）目的とするバンドを切り出してＤＮＡ溶離緩衝液に３７℃で溶離し、この後に一晩エタノールで沈殿させ、減圧して低温で蒸発させ、ＤＮＡ自己組織化生成物を獲得し、
（５）電気泳動分析検出及びレーザ走査観察を行い、
（６）電位検出を行い、
（７）粒子径検出を行い、
（８）ＴＭ値検出を行った。

【0313】

三、自己組織化試験結果
（１）電気泳動検出
主な試薬及び器具は、以下のとおりであった。

【表79】

【表80】

【0314】

ステップ
<１>ＤＮＡナノ粒子を以下の表８１の方法にしたがって超純水で希釈した。

【表81】

<２>１０μＬの処理済みのサンプル（５００ｎｇ）を２μＬの６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと混合し、氷において操作し、マーキングしておいた。
<３>８％の非変性ＰＡＧＥゲルを用意し、異なるインキュベート時間でのサンプルを同一のゲルにロードし、１２μＬの処理済みのサンプルを全部ロードして、１００Ｖで４０ｍｉｎ電気泳動するようにプログラムを設定した。
<４>電気泳動が終了し、染色し、レベルシェーカーに３０ｍｉｎ放置し、写真を撮った。

【0315】

検出結果
７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡの自己組織化生成物の非変性ＰＡＧＥゲルの電気泳動結果は、図２５に示された。図２５において、レーン１〜７は、左から右へ順に７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡの自己組織化生成物のＤ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３、Ｄ−１４であった。

【0316】

図３７結果から明瞭に見えるように、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡの自己組織化生成物のバンドはすべて、明るくかつ明瞭であり、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡ鎖がすべて自己組織化を完了し、安定したナノ粒子構造を形成することが示された。

【0317】

（２）電位測定
測定方法：電位サンプル（自己組織化生成物を超純水に溶ける）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
ソフトウェアを開き、メニューＭｅａｓＵｒｅ ＭａｎＵａｌをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
ソフトウェア検出パラメータを設定し、
次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。

【0318】

測定結果：７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子の２５℃電位検出結果は、以下のとおりであった。

【0319】

【表82】

【0320】

【表83】

【0321】

【表84】

【0322】

【表85】

【0323】

【表86】

【0324】

【表87】

【0325】

【表88】

【0326】

上記電位検出データから分かるように、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子がすべて良好な安定性を有し、各伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡが自己組織化して形成されるナノ粒子が安定した自己組織化構造を有することがさらに示された。

【0327】

（３）粒子径測定
<１>電位サンプル（７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡ）を用意してサンプルセルに入れ、器具のサンプルセルの蓋を開き、器具に入れ、
<２>ソフトウェアを開き、メニューをクリックし、手動測定パラメータの設定ダイアログボックスが出現し、
<３>ソフトウェア検出パラメータを設定し、
<４>次にＯＫをクリックして設定を終了させ、測定ダイアログボックスが出現し、Ｓｔａｒｔをクリックして開始した。７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡの流体力学サイズのＤＬＳ測定値結果はそれぞれ、以下のとおりであった。

【0328】

【表89】

【0329】

（４）ＴＭ値検出
溶解度曲線法を用い、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子のＴＭ値を検出し、サンプルが電位サンプルに一致した。

【0330】

試薬及び器具は、以下のとおりであった。

【表90】

【表91】

【0331】

ステップ
<１>サンプルを超純水で希釈した後、５μｇの希釈されたサンプルと２μＬのＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ染料（１：２００で希釈）を混合し、最終体積が２０μＬであり、希釈濃度は、以下のとおりであった。

【表92】

<２>室温で３０ｍｉｎ遮光しならインキュベートし、
<３>フローサイトメーターで検出し、２０℃で開始し、１秒に０．１℃〜９５℃加熱し、５ｓおきに１回読み取るようにプログラムを設定した。

【0332】

検出結果
７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子のＴＭ値は以下のとおりであった。Ｄ−８の溶解度曲線図は、図２６に示され、Ｄ−９の溶解度曲線図は、図２７に示され、Ｄ−１０の溶解度曲線図は、図２８に示され、Ｄ−１１の溶解度曲線図は、図２９に示され、Ｄ−１２の溶解度曲線図は、図３０に示され、Ｄ−１３の溶解度曲線図は、図３１に示され、Ｄ−１４の溶解度曲線図は、図３２に示された。

【0333】

【表93】

【0334】

図２６〜３２から分かるように、７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子の溶解度曲線のＴＭ値がすべて高く、サンプルの純度が高くかつ自己組織化構造が安定することが示された。

【0335】

核酸ナノ粒子の血清での安定性を検出
実施例１３
非変性ＰＡＧＥ法を用いて７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＲＮＡのナノ粒子の血清での安定性を特徴付けした。

【0336】

主な試薬及び器具は、以下のとおりであった。

【表94】

【表95】

【0337】

ステップ
<１>ＲＮＡナノ粒子を以下の表の濃度に調製し、次に調製後のサンプルを以下の表における方法で５チューブに希釈し、希釈後のサンプルを３７℃で異なる時間（０、１０ｍｉｎ、１ｈ、１２ｈ、３６ｈ）水浴し、

【表96】

<２>処理済みのサンプル１０μＬと２μＬ６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを混合し、氷において操作し、マーキングしておき、
<３>８％の非変性ＰＡＧＥゲルを用意し、異なるインキュベート時間でのサンプルを同一のゲルにロードし、１２μＬの処理済みのサンプルを全部ロードして、１００Ｖで４０ｍｉｎ電気泳動するようにプログラムを設定した、
<４>電気泳動が終了し、染色し、レベルシェーカーに入れて３０ｍｉｎゆっくりと振とうし、写真を撮った。

【0338】

Ｒ−１５の電気泳動の検出結果は、図３３に示され、Ｒ−１６の電気泳動の検出結果は、図３４に示され、Ｒ−１７の電気泳動の検出結果は、図３５に示され、Ｒ−１８の電気泳動の検出結果は、図３６に示され、Ｒ−１９の電気泳動の検出結果は、図３７に示され、Ｒ−２０の電気泳動の検出結果は、図３８に示され、Ｒ−２１の電気泳動の検出結果は、図３９に示された。図３３〜３９において、左から右へのレーンはそれぞれ、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１：３６ｈ；２：１２ｈ；３：１ｈ；４：１０ｍｉｎ；５：０ｍｉｎであった。血清安定性試験の結果から分かるように、１０ｍｉｎ、１ｈ、１２ｈ及び３６ｈの非変性ゲルの結果により、異なる時間でのＲＮＡナノ粒子サンプルバンドに明らかな違いがないことが示され、ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１５〜Ｒ−２１が５０％のＦＢＳの１６４０培地において安定し、明らかに分解していないことが示された。

【0339】

実施例１４
非変性ＰＡＧＥ法を用いて７組の伸長セグメント変形＋コア短配列ＤＮＡナノ粒子の血清での安定性を特徴付けした。

【0340】

主な試薬及び器具は、以下のとおりであった。

【表97】

【表98】

【0341】

ステップ
<１>ＤＮＡナノ粒子を以下の表の濃度に調製し、次に調製後のサンプルを以下の表における方法で５チューブに希釈し、希釈後にサンプルを３７℃で異なる時間（０、１０ｍｉｎ、１ｈ、１２ｈ、３６ｈ）水浴し、

【表99】

<２>５μＬの処理済みのサンプルと１μＬの６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを混合し、氷において操作し、マーキングしておき、
<３>８％の非変性ＰＡＧＥゲルを用意し、異なるインキュベート時間でのサンプルを同一のゲルにロードし、６μＬの処理済みのサンプルを全部ロードして、１００Ｖで４０ｍｉｎ電気泳動するようにプログラムを設定した、
<４>電気泳動が終了し、染色し、レベルシェーカーに入れて３０ｍｉｎゆっくりと振とうし、写真を撮った。

【0342】

Ｄ−８の電気泳動の検出結果は、図４０に示され、Ｄ−９の電気泳動の検出結果は、図４１に示され、Ｄ−１０の電気泳動の検出結果は、図４２に示され、Ｄ−１１の電気泳動の検出結果は、図４３に示され、Ｄ−１２の電気泳動の検出結果は、図４４に示され、Ｄ−１３の電気泳動の検出結果は、図４５に示され、Ｄ−１４の電気泳動の検出結果は、図４６に示された。図４０〜４６において、左から右へのレーンはそれぞれ、Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；１：３６ｈ；２：１２ｈ；３：１ｈ；４：１０ｍｉｎ；５：０ｍｉｎであった。血清安定性試験結果から分かるように、１０ｍｉｎ、１ｈ、１２ｈ及び３６ｈの非変性ゲルの結果により、異なる時間ＤＮＡナノ粒子サンプルバンドに明らかな違いがないことが示され、ＤＮＡナノ粒子Ｄ−８〜Ｄ−１４が５０％のＦＢＳの１６４０培地において安定し、明らかに分解していないことが示された。

【0343】

核酸ナノ粒子薬物担持試験

【0344】

実施例１５
アドリアマイシン担持実験
実施例５の化学的方法による担持方法（特別な制限がない限り、方法が実施例５と同じ）に基づいて、それぞれ前述した実施例１１のＲ−１５、Ｒ−１６、Ｒ−１７、Ｒ−１８、Ｒ−１９、Ｒ−２０及びＲ−２１が自己組織化して形成されるＲＮＡナノ粒子、実施例１２のＤ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３及びＤ−１４が自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子をアドリアマイシン担持担体として用い、測定されたアドリアマイシン担持率はそれぞれ、以下のとおりであった。

【0345】

ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１５のアドリアマイシン担持率が２０．５、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１６のアドリアマイシン担持率が２９．４、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１７のアドリアマイシン担持率が３０．９、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１８のアドリアマイシン担持率が３４．１、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−１９のアドリアマイシン担持率が２７．１、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−２０のアドリアマイシン担持率が３０．２、
ＲＮＡナノ粒子Ｒ−２１のアドリアマイシン担持率が２０．１、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−８のアドリアマイシン担持率が２８．０、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−９のアドリアマイシン担持率が２７．９、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−１０のアドリアマイシン担持率が１８．９、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−１１のアドリアマイシン担持率が２６．８、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−１２のアドリアマイシン担持率が２７．６、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−１３のアドリアマイシン担持率が３１．８、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−１４のアドリアマイシン担持率が３２であった。

【0346】

フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）実験によるＤＮＡナノ粒子及び担体薬の細胞結合能力の検出

【0347】

実施例１６
一、細胞情報
ＨｅｐＧ２（協和細胞庫から）；培地は、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１％二重抗体（ｇｉｂｃｏ、１５１４０−１２２）であり、培養条件は、３７℃、５％のＣＯ_２、飽和湿度であった。

【0348】

二、被検物
ブランク担体：前述した実施例１２のＤ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３及びＤ−１４が自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子担体。
担体薬：実施例５の化学的方法による担持方法（特別な制限がない限り、方法が実施例５と同じ）に基づいて、前述した実施例１２のＤ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３及びＤ−１４が自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子を用いてアドリアマイシンを担持し、それぞれ、Ｄ−８−アドリアマイシン、Ｄ−９−アドリアマイシン、Ｄ−１０−アドリアマイシン、Ｄ−１１−アドリアマイシン、Ｄ−１２−アドリアマイシン、Ｄ−１３−アドリアマイシン及びＤ−１４−アドリアマイシンとした。

【0349】

主要装置、消耗品

【表100】

【0350】

四、主な試薬

【表101】

【0351】

五、実験方法
１．細胞状態が対数成長期になるように調整し、培地をビオチンなし無葉酸の培地に交換し、３７℃の培養器に入れて一晩インキュベートし、
２．インキュベート終了後、トリプシン消化して細胞懸濁液を収集し、１０００ｒｍｐで５ｍｉｎ遠心し、濃度を調整した後、２×１０^５−５×１０^５細胞／ＥＰチューブを、１ｍＬ／チューブの１％のＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄し、吸い去られることを防止するように、チューブの底部の細胞を観察していた。
３．被検物を溶解し、被検物を使用濃度に希釈し、
４．細胞上清を全部吸い取り、各チューブに１００μＬの対応するサンプルを順に加え、遮光し、３７℃で２ｈインキュベートし、
５．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄し、１０００ｒｍｐで５ｍｉｎ遠心し、
６．最後に３００μｌのＰＢＳで細胞沈殿を再懸濁し、フローサイトメトリーで検出し（本実施例で用いられるブランク担体がＱｕａｓａｒ６７０で標識されており、担体薬中のアドリアマイシンが蛍光を持っており、従って、それぞれＦＬ４−ＡＰＣ及びＦＬ２−ＰＥにより検出できる）、
７．データ分析を行った。

【0352】

六、実験結果
１．実験結果は、以下の表に示された。

【表102】

【0353】

２．結論
１．ＨｅｐＧ２細胞とＤ−８−アドリアマイシン（担体薬）及びＤ−８（ブランク担体）がインキュベートされた後、すべて非常に高い（９３．１％〜９８．４％）の結合率を有した。
２．ＨｅｐＧ２細胞とＤ−９−アドリアマイシン（担体薬）及びＤ−９（ブランク担体）がインキュベートされた後、すべて非常に高い（８８．６％〜９８．１％）の結合率を有した。
３．ＨｅｐＧ２細胞とＤ−１０−アドリアマイシン（担体薬）及びＤ−１０（ブランク担体）がインキュベートされた後、すべて非常に高い（８９．４％〜９８．３％）の結合率を有した。
４．ＨｅｐＧ２細胞とＤ−１１−アドリアマイシン（担体薬）及びＤ−１１（ブランク担体）がインキュベートされた後、すべて非常に高い（８９．３％〜９７．８％）の結合率を有した。
５．ＨｅｐＧ２細胞とＤ−１２−アドリアマイシン（担体薬）及びＤ−１２（ブランク担体）がインキュベートされた後、すべて非常に高い（９４．６％〜９７．１％）の結合率を有した。
６．ＨｅｐＧ２細胞とＤ−１３−アドリアマイシン（担体薬）及びＤ−１３（ブランク担体）がインキュベートされた後、すべて非常に高い（８９．６％〜９８．２％）の結合率を有した。
７．ＨｅｐＧ２細胞とＤ−１４−アドリアマイシン（担体薬）及びＤ−１４（ブランク担体）がインキュベートされた後、すべて非常に高い（９０．３％〜９８．３％）の結合率を有した。

【0354】

ＤＮＡナノ粒子及び担体薬のＨｅｐＧ２細胞での細胞毒性の研究

【0355】

実施例１７
ＣＣＫ８法を用いてＤＮＡナノ粒子及び担体薬によるＨｅｐＧ２に対する毒性を検出した。

【0356】

一、主な試薬

【表103】

【0357】

二、主要消耗品及び器具

【表104】

【0358】

三、細胞情報
ＨｅｐＧ２（協和細胞庫から）；培地は、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１％二重抗体（ｇｉｂｃｏ、１５１４０−１２２）であり、培養条件は、３７℃、５％のＣＯ_２、飽和湿度であった。

【0359】

四、実験材料
１．被検サンプル
ブランク担体：前述した実施例１２のＤ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３及びＤ−１４が自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子担体を、それぞれＤ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３及びＤ−１４とした。
担体薬：実施例５の化学的方法による担持方法（特別な制限がない限り、方法が実施例５と同じ）に基づいて、前述した実施例１２のＤ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３及びＤ−１４が自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子を用いてアドリアマイシン担持し、それぞれＤ−８−アドリアマイシン、Ｄ−９−アドリアマイシン、Ｄ−１０−アドリアマイシン、Ｄ−１１−アドリアマイシン、Ｄ−１２−アドリアマイシン、Ｄ−１３−アドリアマイシン及びＤ−１４−アドリアマイシンとした。
原薬アドリアマイシン。
ＤＭＳＯ。

【0360】

五、実験ステップ
１．対数成長期のＨｅｐＧ２細胞を、トリパンブルー染色により計数して、細胞生存率が９８．３％で、体積１００μＬ／ウェル、５０００Ｃｅｌｌ／ウェルで８つの９６ウェルプレートのそれぞれの５７個のウェルに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
２．以下の表で被検サンプルを希釈して加えた。元の培地を除去し、１００μＬの異なる濃度の被検サンプルの培地を加え、１群ことに３つの反復を有した。

【表105】

Ｃ８ウェル中のサンプルの調製方法は、３２４μＬの完全な培地を使用し、そしてＣ９ウェルから吸い取ることであった。
本実施例では、担持薬及びブランク担体をそれぞれＰＢＳで１００μＭの原液に調製し、次に完全な培地（ビオチンなしのＤＭＥＭ）で希釈した。原薬アドリアマイシンをＤＭＳＯで１００μＭの原液に調製し、次に完全な培地（ビオチンなしのＤＭＥＭ）で希釈した。ＤＭＳＯをそのまま完全な培地（ビオチンなしのＤＭＥＭ）で希釈した。
３．被検サンプルを加えて、９６ウェルプレートを３７℃で５％のＣＯ_２培養器に入れて７２ｈインキュベートした。
４．キットを取り出して室温で融け、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ−８溶液を加え、ＣＣＫ８溶液と培地を１：９で混合し、次に１００μＬ／ウェルでウェルに加えてもよかった。
５．細胞培養器内に続いて４ｈインキュベートし、時間が細胞のタイプ及び細胞の密度などの実験状況に基づいて決定された。
６．マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
７．計算：細胞活性（％）＝（ＯＤ実験群−ＯＤブランク群）×１００％／（ＯＤ対照群−ＯＤブランク群）、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ５．０で計算してＩＣ_５０を得た。

【0361】

六、実験結果

【表106】

【0362】

結論
以上の表及び図４７ａ、図４７ｂ、図４７ｃ、図４７ｄ、図４７ｅ、図４７ｆ、図４７ｇ、図４７ｈから分かるように、原薬アドリアマイシン及び担持薬Ｄ−８−アドリアマイシン、Ｄ−９−アドリアマイシン、Ｄ−１０−アドリアマイシン、Ｄ−１１−アドリアマイシン、Ｄ−１２−アドリアマイシン、Ｄ−１３−アドリアマイシン及びＤ−１４−アドリアマイシンがＨｅｐＧ２細胞に作用するＩＣ_５０はそれぞれ、０．２７２５μＭ、０．０５０８７μＭ、０．０３８６、０．０３９５５、０．０４２７１、０．０２２９４、０．０３０１７及び０．０３４５８であり、ＤＭＳＯがＨｅｐＧ２細胞に作用するＩＣ_５０は０．１％より大きく、Ｄ−８（ブランク担体）、Ｄ−９（ブランク担体）、Ｄ−１０（ブランク担体）、Ｄ−１１（ブランク担体）、Ｄ−１２（ブランク担体）、Ｄ−１３（ブランク担体）及びＤ−１４（ブランク担体）がＨｅｐＧ２細胞に作用するＩＣ_５０はすべて１μＭより大きかった。ＨｅｐＧ２細胞系の場合、単なるブランク担体Ｄ−８、Ｄ−９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２、Ｄ−１３及びＤ−１４に比べて、小分子薬物の原薬アドリアマイシン及び担持薬Ｄ−８−アドリアマイシン、Ｄ−９−アドリアマイシン、Ｄ−１０−アドリアマイシン、Ｄ−１１−アドリアマイシン、Ｄ−１２−アドリアマイシン、Ｄ−１３−アドリアマイシン及びＤ−１４−アドリアマイシンがすべてＨｅｐＧ２細胞に対して毒性を有し、担持薬Ｄ−８−アドリアマイシン、Ｄ−９−アドリアマイシン、Ｄ−１０−アドリアマイシン、Ｄ−１１−アドリアマイシン、Ｄ−１２−アドリアマイシン、Ｄ−１３−アドリアマイシン及びＤ−１４−アドリアマイシンが原薬アドリアマイシンに比べて顕著な相乗効果を有することが示された。

【0363】

ダウノルビシン担持実験

【0364】

実施例１８
実施例５の化学的方法による担持方法（特別な制限がない限り、方法が実施例５と同じ）に基づいて、前述した実施例１２のＤ−１０及びＤ−１４が自己組織化して形成されるＤＮＡナノ粒子を、ダウノルビシン担持担体として用いた。マイクロプレートリーダーを利用して４９２ｎｍでのダウノルビシンの吸光度を測定し、検量線（図４８で示される）をレンダリングした。

【0365】

測定されたダウノルビシン担持率はそれぞれ、以下のとおりであった。
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−１０のダウノルビシン担持率 ２４．０、
ＤＮＡナノ粒子Ｄ−１４のダウノルビシン担持率 ２５．１。

【0366】

以上の説明から分かるように、本発明の上記の実施例は、以下の技術的効果を実現する。本願は、熱力学的安定性、化学安定性、高い担持率及び多価組み合わせモジュールを有する一連の核酸ナノ粒子担体を提供する。当該担体に対して独特したモジュール化設計を行うことで、天然相容の親和力を維持するとともに、高い安定性及びさまざまな組合せ特徴を有するコアモジュール構造を得る。該構造は、標的モジュール、結像及びプローブモジュール、治療モジュール及び他の複合スマートモジュールを含むさまざまな機能性モジュールを柔軟かつ高効率に集成することができ、それにより、インビボ標的投与に使用でき、正確な診断治療を実現する。

【0367】

以上は、本発明の好適な実施例にすぎず、本発明を制限するためのものではなく、当業者にとって、本発明に対するさまざまな変更及び変化ができる。本発明の要旨及び原則内に行われる任意の改定、等価置換や改良などは、すべて本発明の保護範囲に含まれるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47a】

【図47b】

【図47c】

【図47d】

【図47e】

【図47f】

【図47g】

【図47h】

【図48】

【手続補正書】

【提出日】2021年3月12日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ配列、ｂ配列及びｃ配列を含む核酸ドメインを有し、
前記ａ配列はａ１配列、又は前記ａ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、前記ｂ配列はｂ１配列、又は前記ｂ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、前記ｃ配列はｃ１配列、又は前記ｃ１配列に少なくとも１つの塩基の挿入、欠失又は置換が生じた配列を含み、
前記ａ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１：５'−ＣＣＡＧＣＧＵＵＣＣ−３'又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２：５'−ＣＣＡＧＣＧＴＴＣＣ−３'であり、
前記ｂ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３：５'−ＧＧＵＵＣＧＣＣＧ−３'又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４：５'−ＧＧＴＴＣＧＣＣＧ−３'であり、
前記ｃ１配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５：５'−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＧ−３'又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６：５'−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＧ−３'である、ことを特徴とする核酸ナノ粒子。

【請求項2】

前記ａ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１であり、前記ｂ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３であり、前記ｃ１配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５である場合、前記ａ配列、前記ｂ配列、前記ｃ配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの塩基が挿入、欠失又は置換された配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項3】

前記塩基の挿入、欠失又は置換は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２で示される配列の５'末端から１位、２位、４位又は５位の塩基、及び／又は
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２で示される配列の５'末端から８〜１０位の塩基間、及び／又は
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４で示される配列の５'末端から１〜３位の塩基間、及び／又は
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４で示される配列の５'末端から６位〜９位の塩基間、及び／又は
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される配列の５'末端から１〜４位の塩基間、及び／又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６で示される配列の５'末端から９〜１２位の塩基間で発生する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項4】

前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列は、自己組織化して下記式（１）で表される構造となり、

【化1】

但し、Ｗ−ＣはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、Ｎ及びＮ'は非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合を表し、いずれかの位置のＷ−Ｃはそれぞれ独立してＣ−Ｇ又はＧ−Ｃから選ばれ、
前記ａ配列において、５'末端からの最初のＮはＡであり、２番目のＮはＧであり、３番目のＮはＵ又はＴであり、４番目のＮはＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、
前記ｂ配列において、５'端からの最初のＮ'はＵ、Ｔ、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかであり、２番目のＮ'はＵ又はＴであり、３番目のＮ'はＣであり、
前記ｃ配列において、５'末端から３'末端への方向のＮＮＮＮ配列はＣＡＵＡ又はＣＡＴＡであり、
好ましくは、前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列は、
（１）ａ配列：５'−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＣＵＵＣＧＣＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３'；
（２）ａ配列：５'−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＧＵＵＣＧＣＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３'；
（３）ａ配列：５'−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３'
ｂ配列：５'−ＧＣＵＵＣＧＣＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＧＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３'；
（４）ａ配列：５'−ＧＧＡＧＣＧＵＵＧＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＣＵＵＣＧＧＧＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＣＣＣＣＡＵＡＧＣＣＣ−３'；
（５）ａ配列：５'−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＧＵＵＣＧＧＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３'；
（６）ａ配列：５'−ＧＣＡＧＣＧＵＵＣＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＧＵＵＣＧＧＣＣ−３'
ｃ配列：５'−ＧＧＣＣＣＡＵＡＧＣＧＣ−３'；
（７）ａ配列：５'−ＣＧＡＧＣＧＵＵＧＣ−３'
ｂ配列：５'−ＧＣＵＵＣＧＧＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＣＣＣＡＵＡＧＣＣＧ−３'；
（８）ａ配列：５'−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＣＴＴＣＧＣＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３'；
（９）ａ配列：５'−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３'；
（１０）ａ配列：５'−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３'
ｂ配列：５'−ＧＣＴＴＣＧＣＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３'；
（１１）ａ配列：５'−ＧＧＡＧＣＧＴＴＧＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＣＴＴＣＧＧＧＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＣＣＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３'；
（１２）ａ配列：５'−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＧＴＴＣＧＧＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３'；
（１３）ａ配列：５'−ＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧ−３'
ｂ配列：５'−ＣＧＴＴＣＧＧＣＣ−３'
ｃ配列：５'−ＧＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＣ−３'；
（１４）ａ配列：５'−ＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣ−３'
ｂ配列：５'−ＧＣＴＴＣＧＧＣＧ−３'
ｃ配列：５'−ＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＣＧ−３'
という組の中の任意の１組である、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項5】

前記核酸ドメインは、前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列のいずれかの配列の５'末端及び／又は３'末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第１の伸長セグメントをさらに含み、
好ましくは、前記第１の伸長セグメントは、
（１）ａ鎖５'末端：５'−ＣＣＣＡ−３'、ｃ鎖３'末端：５'−ＵＧＧＧ−３'
（２）ａ鎖３'末端：５'−ＧＧＧ−３'、ｂ鎖５'末端：５'−ＣＣＣ−３'
（３）ｂ鎖３'末端：５'−ＣＣＡ−３'、ｃ鎖５'末端：５'−ＵＧＧ−３'
（４）ａ鎖５'末端：５'−ＣＣＣＧ−３'、ｃ鎖３'末端：５'−ＣＧＧＧ−３'
（５）ａ鎖５'末端：５'−ＣＣＣＣ−３'、ｃ鎖３'末端：５'−ＧＧＧＧ−３'
（６）ｂ鎖３'末端：５'−ＣＣＣ−３'、ｃ鎖５'末端：５'−ＧＧＧ−３'
（７）ｂ鎖３'末端：５'−ＣＣＧ−３'、ｃ鎖５'末端：５'−ＣＧＧ−３'
（８）ａ鎖５'末端：５'−ＣＣＣＡ−３'、ｃ鎖３'末端：５'−ＴＧＧＧ−３'
（９）ｂ鎖３'末端：５'−ＣＣＡ−３'、ｃ鎖５'末端：５'−ＴＧＧ−３'
という組から選ばれる少なくとも任意の１組であり、
好ましくは、前記核酸ドメインは、前記ａ配列、前記ｂ配列及び前記ｃ配列のいずれかの配列の５'末端及び／又は３'末端に位置した、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合の伸長セグメントである第２の伸長セグメントをさらに含み、好ましくは、前記第２の伸長セグメントは、ＣＧ塩基対の伸長配列であり、より好ましくは、第２の伸長セグメントは、１〜１０個のＣＧ塩基対の伸長配列であり、
好ましくは、前記核酸ドメインは、
第１組：ａ鎖５'末端：５'−ＣＧＣＧＣＧ−３'、ｃ鎖３'末端：５'−ＣＧＣＧＣＧ−３'
第２組：ａ鎖３'末端：５'−ＣＧＣＣＧＣ−３'、ｂ鎖５'末端：５'−ＧＣＧＧＣＧ−３'
第３組：ｂ鎖３'末端：５'−ＧＧＣＧＧＣ−３'、ｃ鎖５'末端：５'−ＧＣＣＧＣＣ−３'
という組の中の少なくとも１組の第２の伸長セグメントをさらに含み、
好ましくは、前記第２伸長セグメントは、ＣＧ塩基対とＡＴ／ＡＵ塩基対の両方を含む伸長配列であり、好ましくは、前記第２伸長セグメントは、２〜５０個の塩基対の伸長配列であり、
好ましくは、前記第２の伸長セグメントは、連続する２〜８個のＣＧ塩基対の配列と連続する２〜８個のＡＴ／ＡＵ塩基対の配列とが交互に配置された伸長配列であり、又は
前記第２の伸長セグメントは、１つのＣＧ塩基対の配列と１つのＡＴ／ＡＵ塩基対の配列とが交互に配置された伸長配列である、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項6】

前記ａ配列、ｂ配列、及びｃ配列において、塩基、リボース、及びリン酸エステルが少なくとも１つの修飾可能な部位を有し、前記修飾可能な部位のいずれかが、−Ｆ、メチル基、アミノ基、ジスルフィド基、カルボニル基、カルボキシル基、メルカプト基、及びアルデヒド基のいずれかの修飾リンカーによって修飾されており、
好ましくは、前記ａ配列、ｂ配列及びｃ配列におけるＣ又はＵ塩基に２'−Ｆ修飾を有する、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項7】

前記核酸ドメインに結合されている生物活性物質をさらに含み、
好ましくは、前記核酸ドメインの相対分子量と前記生物活性物質の総相対分子量との比が１：１以上であり、
好ましくは、前記生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボーススイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、薬物、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類、及びレシチンのうちの１つ又は複数であり、
好ましくは、前記生物活性物質は、前記標的ヘッド、前記フルオレセイン、及び前記ｍｉＲＮＡであり、
前記標的ヘッドは、前記ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれか、好ましくは、ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５'末端又は３'末端に位置するか、又は、前記核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、
前記ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲＮＡであり、前記フルオレセインは、前記抗ｍｉＲＮＡの５'末端又は３'末端に修飾され、前記ｍｉＲＮＡは、前記ａ配列の３'末端、ｃ配列の５'末端及び３'末端のうちのいずれか１つ又は複数の位置にあり、
好ましくは、前記標的ヘッドは葉酸又はビオチンであり、前記フルオレセインはＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、前記抗ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲ−２１であり、
好ましくは、前記タンパク質は、ＳＯＤ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥＧＦＲ及びＰＳＭＡの抗体又はアプタマーのうちの１つ又は複数であり、
前記ビタミンは、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、前記フェノール類は茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである、ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項8】

前記薬物は、肝がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん、子宮がん、卵巣がん、黒色腫、白血病、認知症、強直性脊椎炎、悪性リンパ腫、気管支がん、関節リウマチ、ＨＢＶ Ｂ型肝炎、多発性骨髄腫、膵臓がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、鼻咽頭がん、食道がん、口腔がん、エリテマトーデスの治療薬であり、
好ましくは、前記頭頸部がんは、脳がん、神経芽細胞腫又はグリア芽細胞腫であり、
好ましくは、前記薬物は、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基、及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物である、ことを特徴とする請求項７に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項9】

前記生物活性物質は、
方式１：物理的インターカレーション
方式２：共有結合
という方式のいずれかの方式で核酸ドメインに結合されており、
好ましくは、前記生物活性物質が物理的インターカレーションの方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記生物活性物質と前記核酸ドメインは、１〜２００：１のモル比で物理的にインターカレーションされており、
好ましくは、前記生物活性物質が物理的インターカレーションの方式及び共有結合の方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記物理的インターカレーションの方式で結合されている生物活性物質と前記共有結合の方式で結合されている薬物とのモル比が１〜２００：１であり、
好ましくは、前記共有結合の方式で結合されている生物活性物質は、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により結合されており、好ましくは、前記溶媒はパラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ又は氷酢酸から選ばれ、好ましくは、前記リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれ、好ましくは、前記クリック結合は、生物活性物質前駆体と前記核酸ドメインとを同時にアルキニル基又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することであり、
好ましくは、前記生物活性物質がクリック結合の方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、２'ヒドロキシ基、カルボキシル基又はアミノ基から選ばれ、前記核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、Ｇ環外アミノ基、２'−ヒドロキシ基、Ａアミノ基又は２'−ヒドロキシ基から選ばれる、ことを特徴とする請求項７又は８に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項10】

前記核酸ナノ粒子の粒子径が１〜１００ｎｍ、好ましくは５〜５０ｎｍ、より好ましくは１０〜３０ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１５ｎｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の核酸ナノ粒子。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子を含む、ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項12】

アドリアマイシンと、請求項１〜７のいずれか１項又は請求項１０に記載の核酸ナノ粒子とを含む、ことを特徴とするアドリアマイシン含有薬物。

【請求項13】

アドリアマイシンが物理的結合及び／又は共有結合の方式で前記核酸ナノ粒子に担持され、アドリアマイシンと前記核酸ナノ粒子とのモル比が２〜３００：１、好ましくは１０〜５０：１、より好ましくは１５〜２５：１である、ことを特徴とする請求項１２に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項14】

前記核酸ナノ粒子は、生物活性物質をさらに含み、前記生物活性物質は、前記核酸ドメインに結合されており、前記生物活性物質は、標的ヘッド、フルオレセイン、干渉核酸ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、リボーススイッチ、アプタマー、ＲＮＡ抗体、タンパク質、ポリペプチド、フラボノイド、グルコース、天然サリチル酸、モノクローナル抗体、ビタミン、フェノール類、レシチン、及びアドリアマイシン以外の小分子薬物のうちの１つ又は複数であり、
好ましくは、前記核酸ドメインの相対分子量をＮ₁とし、アドリアマイシンと前記生物活性物質との総相対分子量をＮ₂とすると、Ｎ₁／Ｎ₂≧１：１であり、
好ましくは、前記生物活性物質は、前記標的ヘッド、前記フルオレセイン及び前記ｍｉＲＮＡのうちの１つ又は複数であり、
前記標的ヘッドは、前記ａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれか、好ましくはａ配列、ｂ配列、ｃ配列のいずれかの５'末端又は３'末端に位置するか、又は前記核酸ドメインのＧＣ結合の間にインターカレーションされ、
前記ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲＮＡであり、前記フルオレセインは前記抗ｍｉＲＮＡの５'末端又は３'末端に修飾され、前記ｍｉＲＮＡは前記ａ配列の３'末端、ｃ配列の５'末端及び３'末端のうちのいずれか１つ又は複数の位置にあり、
好ましくは、前記標的ヘッドは、葉酸又はビオチンであり、前記フルオレセインは、ＦＡＭ、ＣＹ５及びＣＹ３のうちのいずれか１つ又は複数であり、
前記抗ｍｉＲＮＡは抗ｍｉＲ−２１であり、
好ましくは、アドリアマイシン以外の小分子薬物は、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、メルカプト基、ベンゼン環基、及びアセチルアミノ基のうちのいずれか１つ又は複数を含む薬物であり、
好ましくは、前記タンパク質は、ＳＯＤ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ及びＥＧＦＲ、ＰＳＭＡのうちの１つ又は複数であり、
前記ビタミン類は、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はエステル化アスコルビン酸であり、
前記フェノール類は茶ポリフェノール及び／又はブドウポリフェノールである、ことを特徴とする請求項１２又は１３に記載のアドリアマイシン含有薬物。

【請求項15】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子を提供するステップと、
物理的結合及び／又は共有結合の方式でアドリアマイシンを前記核酸ナノ粒子に担持して、前記アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含む、ことを特徴とするアドリアマイシン含有薬物の製造方法。

【請求項16】

物理的結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、
アドリアマイシンと、前記核酸ナノ粒子と、第１の溶媒とを混合して撹拌して、プレミックス系を得るステップと、
前記プレミックス系中の遊離物質を除去して、前記アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含み、
好ましくは、前記第１の溶媒は、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数であり、
好ましくは、前記プレミックス系中の遊離物質を除去するステップは、前記プレミックス系を無水エタノールと混合し、１０℃未満の温度条件下で前記アドリアマイシン含有薬物を析出させ、より好ましくは、０〜５℃の温度条件下でアドリアマイシン含有薬物を析出させるステップを含む、ことを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。

【請求項17】

共有結合の方式でアドリアマイシンを担持するステップは、
アドリアマイシン溶液を調製するステップと、
前記アドリアマイシン溶液を、ホルムアルデヒドによる仲介作用により前記核酸ナノ粒子のＧ環外アミノ基と反応させて反応系を得るステップと、
前記反応系を精製して、前記アドリアマイシン含有薬物を得るステップとを含み、
好ましくは、前記反応のステップは
前記アドリアマイシン溶液と、パラホルムアルデヒド溶液と、前記核酸ナノ粒子とを混合し、遮光条件下で反応させて、反応系を得るステップを含み、前記パラホルムアルデヒド溶液の濃度が３．７〜４ｗｔ％であることが好ましく、前記パラホルムアルデヒド溶液がパラホルムアルデヒドと第２の溶媒とを混合した溶液であり、前記第２の溶媒がＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ、及び氷酢酸のうちの１つ又は複数であることが好ましい、ことを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。

【請求項18】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸ナノ粒子における前記核酸ドメインに対応する一本鎖を自己組織化して、前記核酸ドメインを得るステップを含む、核酸ナノ粒子を製造するステップをさらに含み、
好ましくは、前記核酸ドメインを得た後、請求項７〜８のいずれか１項に記載の生物活性物質を物理的結合及び／又は共有結合の方式で前記核酸ドメインに担持して、前記核酸ナノ粒子を得るステップをさらに含み、前記生物活性物質中の薬物は、アドリアマイシン以外の小分子薬物であり、
好ましくは、前記生物活性物質を共有結合の方式で担持する過程において、溶媒共有結合、リンカー共有結合又はクリック結合により担持し、
好ましくは、前記溶媒共有結合に用いられる第３の溶媒は結合媒体とされ、前記第３の溶媒はパラホルムアルデヒド、ＤＣＭ、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ＤＭＳＯ、ＰＢＳ及び氷酢酸から選ばれる１つ又は複数であり、
好ましくは、前記リンカーは、ジスルフィド結合、ｐ−フェニルアジド基、ブロモプロピイン又はＰＥＧから選ばれ、
好ましくは、前記クリック結合は、生物活性物質前駆体と前記核酸ドメインとを同時にアルキニル又はアジドで修飾した後、クリックを介して結合することであり、
好ましくは、前記生物活性物質がクリック結合の方式で前記核酸ドメインに結合されている場合、前記生物活性物質前駆体のアルキニル基又はアジド修飾部位は、２'ヒドロキシ基、カルボキシル基又はアミノ基から選ばれ、前記核酸ドメインのアルキニル基又はアジド修飾部位は、Ｇ環外アミノ基、２'−ヒドロキシ基、Ａアミノ基又は２'−ヒドロキシ基から選ばれる、ことを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。

【国際調査報告】