特表 2021-533803 ＦＡＳＬ免疫モジュレート遺伝子治療組成物および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-533803(P2021-533803A)

(43)【公表日】2021年12月9日

(54)【発明の名称】ＦＡＳＬ免疫モジュレート遺伝子治療組成物および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20211112BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20211112BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20211112BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20211112BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20211112BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20211112BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20211112BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211112BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211112BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211112BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20211112BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20211112BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20211112BHJP

   A61K 38/16 20060101ALN20211112BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20211112BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 Z

   C12N15/09 110

   C12N15/12ZNA

   C12N15/85 Z

   C12N15/864 100Z

   C07K14/725

   C07K19/00

   C12N5/10

   A61K48/00

   A61P43/00 105

   A61K35/76

   A61P37/02

   C12P21/02 C

   A61K38/16

   A61K38/19

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】152

(21)【出願番号】特願2021-509984(P2021-509984)

(86)(22)【出願日】2019年8月26日

(85)【翻訳文提出日】2021年4月21日

(86)【国際出願番号】US2019048148

(87)【国際公開番号】WO2020041791

(87)【国際公開日】20200227

(31)【優先権主張番号】62/722,550

(32)【優先日】2018年8月24日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】520481046

【氏名又は名称】ロックアネイビオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ネルズ， デイビッド エー．

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG20

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084DA01

4C084DC50

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB211

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA08

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB02

4C087ZB21

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA51

4H045EA20

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

非自己目的ポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする配列、および非切断型ＦＡＳＬをコードする配列を含む組成物であって、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの存在下での非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＰＯＩの発現に特異的なＭＨＣ媒介性免疫原性ペプチドおよびヘルパーＴ細胞が排除される、組成物が開示される。本開示の組成物を作製する方法およびそれを使用する方法も提供される。例えば、本開示の組成物を対象における疾患または障害の組合せ処置、および処置に特異的な免疫遮蔽活性に対して使用することができる。本開示の例示的な疾患または障害は、遺伝性およびエピジェネティックな疾患または障害を含む。

[この文献は図面を表示できません]

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）非自己目的ポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする配列、および
（ｂ）非切断型Ｆａｓリガンド（ＦＡＳＬ）をコードする配列
を含む組成物であって、
前記非切断型ＦＡＳＬの発現により、前記ＰＯＩの発現に特異的なＭＨＣ媒介性免疫原性ペプチドおよびヘルパーＴ細胞が排除される、組成物。

【請求項2】

前記非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞が選択的に排除され、前記ペプチドが、前記非自己ポリペプチドに由来するものであり、ＦＡＳＬの発現が、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの存在下のものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記非自己ＰＯＩが、（ｉ）ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む配列および（ｉｉ）ＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列によってコードされる核タンパク質複合体である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

（ａ）の配列および（ｂ）の配列がベクターに含まれる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ベクターが、発現ベクターである、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記発現ベクターが、プラスミドである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

（ａ）の配列の発現がプロモーターにより駆動される、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

（ｂ）の配列の発現がプロモーターにより駆動される、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記プロモーターが、ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体の存在によって調節されるプロモーターである、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

（ａ）の配列の発現が第１のプロモーターにより駆動され、（ｂ）の配列の発現が第２のプロモーターにより駆動される、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

第１のプロモーターにより前記核タンパク質複合体をコードする配列の発現が駆動され、第２のプロモーターにより（ｂ）の配列の発現が駆動される、請求項３に記載の組成物。

【請求項12】

前記第１のプロモーターが、Ｕ６プロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記第１のプロモーターが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することができるプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

前記プロモーターが、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リシンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記プロモーターをコードする配列が、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

送達ベクターに含まれる、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記送達ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記ＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２であるＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

（ａ）の配列または（ｂ）の配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記ＩＲＥＳまたは前記自己切断ペプチドをコードする配列が、（ａ）の配列と（ｂ）の配列の間に位置する、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記自己切断ペプチドが、２Ａ自己切断ペプチドを含む、請求項１９または２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記非切断型ＦＡＳＬが、メタロプロテイナーゼ切断部位に変異を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項23】

前記メタロプロテイナーゼ切断部位が、アミノ酸配列ＥＬＡＥＬＲを含む、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記変異が、アミノ酸配列ＥＬＡＥＬＲの置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位のうちの１つまたは複数を含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記非切断型ＦＡＳＬが、

【化165】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ_１はグルタミン酸（Ｅ）ではない、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）ではない、Ｘ_３は、アラニン（Ａ）ではない、Ｘ_４はグルタミン酸（Ｅ）ではない、Ｘ_５は、ロイシン（Ｌ）ではない、またはＸ_６はアルギニン（Ｒ）ではない、
請求項２２に記載の組成物。

【請求項26】

前記非切断型ＦＡＳＬが、

【化166】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ_１はグルタミン酸（Ｅ）ではなく、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）ではなく、Ｘ_３は、アラニン（Ａ）ではなく、Ｘ_４はグルタミン酸（Ｅ）ではなく、Ｘ_５は、ロイシン（Ｌ）ではなく、かつ、Ｘ_６はアルギニン（Ｒ）ではない、
請求項２２に記載の組成物。

【請求項27】

前記非切断型ＦＡＳＬがイントロンを含み、前記イントロンが、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの非存在下でＦＡＳＬスプライシングを遮断する、請求項１に記載の組成物。

【請求項28】

ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの存在下で発現される合成ｍＲＮＡ標的部位をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

１）合成ノッチ系、２）マイクロＲＮＡ標的部位、または３）スプリットインテインおよびＩＬ−６もしくはＴＮＦ−アルファの存在下でのＦＡＳＬの発現を調節するための操作されたＩＬ−６もしくはＴＮＦ−アルファ受容体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項30】

前記ＲＮＡ結合性ポリペプチドが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびＣａｓ１３ｄからなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、請求項３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、分子生物学、遺伝子治療、ならびに／またはＲＮＡ分子の発現および活性の改変を対象とし、より詳細には、ＲＮＡ改変および／または遺伝子治療を受けた細胞に対する免疫応答を、免疫エフェクター細胞を排除することによって減弱するための組成物および方法を対象とする。

【0002】

関連出願
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年８月２４日出願の米国特許出願第６２／７２２，５５０号の優先権を主張するものである。

【0003】

配列表の組込み
２０１９年８月２４日に作成された２０．７ＭＢサイズの「ＬＯＣＮ＿００４＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

非自己遺伝子治療に対する有害な免疫応答を減弱することについて長年にわたるが満たされていない必要性が当技術分野において存在する。本開示は、遺伝子治療技法によって処置または改変された細胞に特異的な免疫エフェクター細胞の排除を促進するための組成物および方法を提供する。

【0005】

免疫調節に関する経路におけるＦａｓＬ（Ｆａｓリガンド）の役割の重要性は十分に確立されている。活性化Ｔ細胞は、Ｆａｓを上方制御し、活性化誘導性細胞死および自己抗原に対する寛容のプロセスにおいてＦａｓＬ媒介性アポトーシスに対して感受性になる。ＦａｓまたはＦａｓＬが欠損すると、多くの場合、自己免疫性病理または異常なリンパ球増殖が引き起こされ、これにより、経路の代償機構の明らかな欠如が実証される。変異型ＦａｓＬの局所的な提示により、マウスにおける移植された細胞に対する拒絶反応が防止されることが示されているが、ある特定の移植の状況における異所性ＦＡＳＬの発現による移植片生存の達成に関しては結果が混在している。多くの場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体などの非自己治療用導入遺伝子を、そのような処置を必要とする患者に送達する遺伝子治療では、治療用導入遺伝子および／または導入遺伝子を送達するベクターに対する望ましくない免疫応答が誘発される恐れがある。したがって、免疫活性を遮蔽し、それにより、遺伝子治療技法によって処置および／または改変された細胞に特異的な免疫エフェクター細胞の排除を促進するための組成物および方法が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、非自己目的ポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする配列、および非切断型ＦａｓＬをコードする配列を含む組成物であって、非切断型ＦａｓＬの発現により、ＰＯＩの発現に特異的なＭＨＣ媒介性免疫原性ペプチドおよびヘルパーＴ細胞が排除される、組成物を提供する。一部の実施形態では、ＰＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、ＰＯＩは、ＡＡＶウイルスカプシドなどのウイルスカプシドポリペプチドである。他の実施形態では、ＰＯＩは、異種非自己（外来）タンパク質抗原、その断片またはバリアントである。別の実施形態では、非自己タンパク質またはＰＯＩは、細菌タンパク質、古細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、寄生生物タンパク質、腫瘍タンパク質、マイコプラズマタンパク質、酵母タンパク質またはアレルゲンタンパク質からなる群から選択される。一実施形態では、非自己ＰＯＩは、細菌由来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または古細菌由来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である。

【0007】

本開示は、ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列、および非切断型ＦＡＳＬをコードする配列を含む配列を含む組成物であって、非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＲＮＡ結合性ポリペプチドの発現に特異的なＭＨＣ媒介性免疫原性ペプチドおよびヘルパーＴ細胞が排除される、組成物も提供する。

【0008】

本開示の組成物の一部の実施形態では、標的配列は、少なくとも１つのリピート配列を含む。

【0009】

本開示の組成物の一部の実施形態では、配列は、同じベクター内に存在する。

【0010】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターである。

【0011】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターであり、ベクターはＡＡＶカプシドをコードする配列を含む。

【0012】

本開示の組成物の一部の実施形態では、配列は、ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）または２Ａリボソーム部位を含む。

【0013】

本開示の組成物の一部の実施形態では、変異型非切断型ＦａｓＬは、メタロプロテイナーゼ切断部位に少なくとも１つの変異または欠失を含む。一部の実施形態では、変異型非切断型ＦａｓＬは、プロテアーゼ認識領域に少なくとも１つの変異または欠失を含む。別の実施形態では、プロテアーゼ認識領域は、野生型ヒトＦａｓＬの少なくともアミノ酸残基１１９〜１５４である。

【0014】

一部の実施形態では、メタロプロテイナーゼ切断部位は、アミノ酸配列ＥＬＡＥＬＲを含む。別の実施形態では、変異は、アミノ酸配列ＥＬＡＥＬＲの置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位のうちの１つまたは複数を含む。

【0015】

一部の実施形態では、非切断型ＦＡＳＬは、

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

（配列中、Ｘ_１はグルタミン酸（Ｅ）ではない、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）ではない、Ｘ_３は、アラニン（Ａ）ではない、Ｘ_４はグルタミン酸（Ｅ）ではない、Ｘ_５は、ロイシン（Ｌ）ではない、またはＸ_６はアルギニン（Ｒ）ではない）
のアミノ酸配列を含む。

【0016】

一部の実施形態では、非切断型ＦＡＳＬは、

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

（配列中、Ｘ_１はグルタミン酸（Ｅ）ではなく、Ｘ_２はロイシン（Ｌ）ではなく、Ｘ_３は、アラニン（Ａ）ではなく、Ｘ_４はグルタミン酸（Ｅ）ではなく、Ｘ_５は、ロイシン（Ｌ）ではなく、かつ、Ｘ_６はアルギニン（Ｒ）ではない）
のアミノ酸配列を含む。

【0017】

一部の実施形態では、非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞が選択的に排除され、ペプチドは、非自己ポリペプチドに由来するものであり、ＦＡＳＬの発現は、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの存在下のものである。

【0018】

一部の実施形態では、非切断型ＦＡＳＬは、イントロンを含み、イントロンは、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの非存在下でＦＡＳＬスプライシングを遮断する。一部の実施形態では、非切断型ＦＡＳＬは、イントロンを含み、イントロンは、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの非存在下でＦＡＳＬスプライシングを遮断する。さらなる実施形態では、組成物は、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファの存在下で発現される合成ｍＲＮＡ標的部位を含む。

【0019】

一部の実施形態では、組成物は、１）合成ノッチ系、２）マイクロＲＮＡ標的部位、または３）スプリットインテインおよびＩＬ−６もしくはＴＮＦ−アルファの存在下でのＦＡＳＬの発現を調節するための操作されたＩＬ−６もしくはＴＮＦ−アルファ受容体を含む。

【0020】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３ｄ、ＰＵＦ、ＰＵＭＢＹ、およびＰＰＲからなる群から選択される。

【0021】

本開示の組成物の一部の実施形態では、配列は、プロモーターまたは複数のプロモーターを含む。

【0022】

一部の実施形態では、ＦＡＳＬの発現を駆動するプロモーターは、ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体の存在によって調節される。一部の実施形態では、ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体の存在下でＦＡＳＬ発現を駆動することができるプロモーターは、表１または表２に列挙されているプロモーターである。

【0023】

一部の実施形態では、非自己ＰＯＩは、（ｉ）ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む配列、および（ｉｉ）ＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列によってコードされる核タンパク質複合体である。

【0024】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、真核細胞においてｇＲＮＡを発現させることができるプロモーターをコードする配列をさらに含む。

【0025】

本開示の組成物の一部の実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞である。

【0026】

本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの発現を駆動することができるプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、Ｕ６プロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することができるプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リシンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。

【0027】

本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1A】図１Ａ〜Ｂは、本開示の組成物に関連性のある概略図である。（Ａ）Ｔヘルパー細胞を活性化し、処置される組織または細胞に対する細胞傷害効果を高めることができる非自己ポリペプチドの提示をもたらす、ＡＡＶを介した典型的な治療用非自己導入遺伝子の送達を示す。（Ｂ）変異型（メタロプロテイナーゼにより非切断型）バージョンのＦａｓＬをコードする配列を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をコードする導入遺伝子成分などの治療用導入遺伝子（Ｔｘ遺伝子）を含むベクター構築物に含め、それにより、処置された組織または細胞を調べるＴ細胞のプログラム死の促進をもたらし、処置された組織または細胞に対する細胞傷害活性を防止する本開示の組成物の種々の複数の実施形態を示す。

【図1B】図１Ａ〜Ｂは、本開示の組成物に関連性のある概略図である。（Ａ）Ｔヘルパー細胞を活性化し、処置される組織または細胞に対する細胞傷害効果を高めることができる非自己ポリペプチドの提示をもたらす、ＡＡＶを介した典型的な治療用非自己導入遺伝子の送達を示す。（Ｂ）変異型（メタロプロテイナーゼにより非切断型）バージョンのＦａｓＬをコードする配列を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をコードする導入遺伝子成分などの治療用導入遺伝子（Ｔｘ遺伝子）を含むベクター構築物に含め、それにより、処置された組織または細胞を調べるＴ細胞のプログラム死の促進をもたらし、処置された組織または細胞に対する細胞傷害活性を防止する本開示の組成物の種々の複数の実施形態を示す。

【0029】

【図2A】図２Ａ〜Ｂは、本開示の組成物に関連性のある概略図である。（Ａ）ヒトにおける、ＡＡＶカプシドに対する体液性応答および細胞性応答の両方の形態の適応免疫の形成をもたらすＡＡＶ反復投与を示す。（Ｂ）変異型非切断型ＦａｓＬおよびＡＡＶベクターカプシド由来のポリペプチドの両方をコードする配列を、治療用導入遺伝子（自己または非自己）をさらに含むベクター構築物に含めることによる本開示の組成物を示す。この結果、ウイルスカプシドに特異的なＴ細胞の排除およびウイルスカプシドに対する適応免疫の形成の防止がもたらされ、それにより、ＡＡＶベクターの効率的かつ安全な再投薬が可能になる。

【図2B】図２Ａ〜Ｂは、本開示の組成物に関連性のある概略図である。（Ａ）ヒトにおける、ＡＡＶカプシドに対する体液性応答および細胞性応答の両方の形態の適応免疫の形成をもたらすＡＡＶ反復投与を示す。（Ｂ）変異型非切断型ＦａｓＬおよびＡＡＶベクターカプシド由来のポリペプチドの両方をコードする配列を、治療用導入遺伝子（自己または非自己）をさらに含むベクター構築物に含めることによる本開示の組成物を示す。この結果、ウイルスカプシドに特異的なＴ細胞の排除およびウイルスカプシドに対する適応免疫の形成の防止がもたらされ、それにより、ＡＡＶベクターの効率的かつ安全な再投薬が可能になる。

【0030】

【図3A】図３Ａ〜Ｆは、Ｔ細胞の活性を検出することができる、本明細書に開示される組成物の実施形態に関連性のある概略図である。（Ａ）ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体によって調節されるプロモーターによって駆動されるＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｂ）Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ標的化系およびＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。ＦＡＳＬは、スプライシングがＣａｓ１３ｄによって負に調節されるイントロンを含む。ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファによって媒介される遺伝子発現の変化時に、Ｃａｓ１３ｄがＦＡＳＬ構築物から引き離され、その結果、ＦＡＳＬのスプライシングが可能になり、ＦＡＳＬタンパク質が産生される。（Ｃ）（Ｂ）における構築物の構成と類似しているが、Ｃａｓ１３ｄをＦＡＳＬプレｍＲＮＡから引き離す連鎖状部位を含有するＴＮＦ−アルファ受容体またはＩＬ−６受容体によって調節される操作されたｍＲＮＡという別の成分が追加された構築物の構成実施形態を示す。（Ｄ）ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファを検出し、その後、ＧＡＬ４などの転写因子を放出し、それにより、ＧＡＬ４により調節されるＦＡＳＬ遺伝子の発現を促進する、Ｓｙｎ−ノッチなどの操作された受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｅ）ＦＡＳＬをコードし、また、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６によって刺激されると下方制御されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の３’ＵＴＲに連鎖状の標的部位を含有する操作されたｍＲＮＡを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｆ）細胞内ドメイン上のインテインを核内に存在するＣａｓ１３ｄ−インテイン融合物と共に有する操作されたバージョンのＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。この構築物実施形態は、Ｃａｓ１３ｄによりＦＡＳＬのスプライシングが調節されるが、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファ検出時のインテインの細胞膜からの放出および核へのトランスロケーションの結果、Ｃａｓ１３ｄに対するインテイン活性がもたらされ、それにより、ＦＡＳＬに対するスプライシング遮断が解放されるという点で（Ｂ）の実施形態と類似している。

【図3B】図３Ａ〜Ｆは、Ｔ細胞の活性を検出することができる、本明細書に開示される組成物の実施形態に関連性のある概略図である。（Ａ）ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体によって調節されるプロモーターによって駆動されるＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｂ）Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ標的化系およびＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。ＦＡＳＬは、スプライシングがＣａｓ１３ｄによって負に調節されるイントロンを含む。ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファによって媒介される遺伝子発現の変化時に、Ｃａｓ１３ｄがＦＡＳＬ構築物から引き離され、その結果、ＦＡＳＬのスプライシングが可能になり、ＦＡＳＬタンパク質が産生される。（Ｃ）（Ｂ）における構築物の構成と類似しているが、Ｃａｓ１３ｄをＦＡＳＬプレｍＲＮＡから引き離す連鎖状部位を含有するＴＮＦ−アルファ受容体またはＩＬ−６受容体によって調節される操作されたｍＲＮＡという別の成分が追加された構築物の構成実施形態を示す。（Ｄ）ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファを検出し、その後、ＧＡＬ４などの転写因子を放出し、それにより、ＧＡＬ４により調節されるＦＡＳＬ遺伝子の発現を促進する、Ｓｙｎ−ノッチなどの操作された受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｅ）ＦＡＳＬをコードし、また、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６によって刺激されると下方制御されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の３’ＵＴＲに連鎖状の標的部位を含有する操作されたｍＲＮＡを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｆ）細胞内ドメイン上のインテインを核内に存在するＣａｓ１３ｄ−インテイン融合物と共に有する操作されたバージョンのＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。この構築物実施形態は、Ｃａｓ１３ｄによりＦＡＳＬのスプライシングが調節されるが、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファ検出時のインテインの細胞膜からの放出および核へのトランスロケーションの結果、Ｃａｓ１３ｄに対するインテイン活性がもたらされ、それにより、ＦＡＳＬに対するスプライシング遮断が解放されるという点で（Ｂ）の実施形態と類似している。

【図3C】図３Ａ〜Ｆは、Ｔ細胞の活性を検出することができる、本明細書に開示される組成物の実施形態に関連性のある概略図である。（Ａ）ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体によって調節されるプロモーターによって駆動されるＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｂ）Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ標的化系およびＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。ＦＡＳＬは、スプライシングがＣａｓ１３ｄによって負に調節されるイントロンを含む。ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファによって媒介される遺伝子発現の変化時に、Ｃａｓ１３ｄがＦＡＳＬ構築物から引き離され、その結果、ＦＡＳＬのスプライシングが可能になり、ＦＡＳＬタンパク質が産生される。（Ｃ）（Ｂ）における構築物の構成と類似しているが、Ｃａｓ１３ｄをＦＡＳＬプレｍＲＮＡから引き離す連鎖状部位を含有するＴＮＦ−アルファ受容体またはＩＬ−６受容体によって調節される操作されたｍＲＮＡという別の成分が追加された構築物の構成実施形態を示す。（Ｄ）ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファを検出し、その後、ＧＡＬ４などの転写因子を放出し、それにより、ＧＡＬ４により調節されるＦＡＳＬ遺伝子の発現を促進する、Ｓｙｎ−ノッチなどの操作された受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｅ）ＦＡＳＬをコードし、また、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６によって刺激されると下方制御されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の３’ＵＴＲに連鎖状の標的部位を含有する操作されたｍＲＮＡを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｆ）細胞内ドメイン上のインテインを核内に存在するＣａｓ１３ｄ−インテイン融合物と共に有する操作されたバージョンのＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。この構築物実施形態は、Ｃａｓ１３ｄによりＦＡＳＬのスプライシングが調節されるが、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファ検出時のインテインの細胞膜からの放出および核へのトランスロケーションの結果、Ｃａｓ１３ｄに対するインテイン活性がもたらされ、それにより、ＦＡＳＬに対するスプライシング遮断が解放されるという点で（Ｂ）の実施形態と類似している。

【図3D】図３Ａ〜Ｆは、Ｔ細胞の活性を検出することができる、本明細書に開示される組成物の実施形態に関連性のある概略図である。（Ａ）ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体によって調節されるプロモーターによって駆動されるＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｂ）Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ標的化系およびＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。ＦＡＳＬは、スプライシングがＣａｓ１３ｄによって負に調節されるイントロンを含む。ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファによって媒介される遺伝子発現の変化時に、Ｃａｓ１３ｄがＦＡＳＬ構築物から引き離され、その結果、ＦＡＳＬのスプライシングが可能になり、ＦＡＳＬタンパク質が産生される。（Ｃ）（Ｂ）における構築物の構成と類似しているが、Ｃａｓ１３ｄをＦＡＳＬプレｍＲＮＡから引き離す連鎖状部位を含有するＴＮＦ−アルファ受容体またはＩＬ−６受容体によって調節される操作されたｍＲＮＡという別の成分が追加された構築物の構成実施形態を示す。（Ｄ）ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファを検出し、その後、ＧＡＬ４などの転写因子を放出し、それにより、ＧＡＬ４により調節されるＦＡＳＬ遺伝子の発現を促進する、Ｓｙｎ−ノッチなどの操作された受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｅ）ＦＡＳＬをコードし、また、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６によって刺激されると下方制御されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の３’ＵＴＲに連鎖状の標的部位を含有する操作されたｍＲＮＡを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｆ）細胞内ドメイン上のインテインを核内に存在するＣａｓ１３ｄ−インテイン融合物と共に有する操作されたバージョンのＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。この構築物実施形態は、Ｃａｓ１３ｄによりＦＡＳＬのスプライシングが調節されるが、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファ検出時のインテインの細胞膜からの放出および核へのトランスロケーションの結果、Ｃａｓ１３ｄに対するインテイン活性がもたらされ、それにより、ＦＡＳＬに対するスプライシング遮断が解放されるという点で（Ｂ）の実施形態と類似している。

【図3E】図３Ａ〜Ｆは、Ｔ細胞の活性を検出することができる、本明細書に開示される組成物の実施形態に関連性のある概略図である。（Ａ）ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体によって調節されるプロモーターによって駆動されるＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｂ）Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ標的化系およびＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。ＦＡＳＬは、スプライシングがＣａｓ１３ｄによって負に調節されるイントロンを含む。ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファによって媒介される遺伝子発現の変化時に、Ｃａｓ１３ｄがＦＡＳＬ構築物から引き離され、その結果、ＦＡＳＬのスプライシングが可能になり、ＦＡＳＬタンパク質が産生される。（Ｃ）（Ｂ）における構築物の構成と類似しているが、Ｃａｓ１３ｄをＦＡＳＬプレｍＲＮＡから引き離す連鎖状部位を含有するＴＮＦ−アルファ受容体またはＩＬ−６受容体によって調節される操作されたｍＲＮＡという別の成分が追加された構築物の構成実施形態を示す。（Ｄ）ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファを検出し、その後、ＧＡＬ４などの転写因子を放出し、それにより、ＧＡＬ４により調節されるＦＡＳＬ遺伝子の発現を促進する、Ｓｙｎ−ノッチなどの操作された受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｅ）ＦＡＳＬをコードし、また、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６によって刺激されると下方制御されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の３’ＵＴＲに連鎖状の標的部位を含有する操作されたｍＲＮＡを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｆ）細胞内ドメイン上のインテインを核内に存在するＣａｓ１３ｄ−インテイン融合物と共に有する操作されたバージョンのＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。この構築物実施形態は、Ｃａｓ１３ｄによりＦＡＳＬのスプライシングが調節されるが、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファ検出時のインテインの細胞膜からの放出および核へのトランスロケーションの結果、Ｃａｓ１３ｄに対するインテイン活性がもたらされ、それにより、ＦＡＳＬに対するスプライシング遮断が解放されるという点で（Ｂ）の実施形態と類似している。

【図3F】図３Ａ〜Ｆは、Ｔ細胞の活性を検出することができる、本明細書に開示される組成物の実施形態に関連性のある概略図である。（Ａ）ＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体によって調節されるプロモーターによって駆動されるＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｂ）Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ標的化系およびＦＡＳＬを含む構築物の構成実施形態を示す。ＦＡＳＬは、スプライシングがＣａｓ１３ｄによって負に調節されるイントロンを含む。ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファによって媒介される遺伝子発現の変化時に、Ｃａｓ１３ｄがＦＡＳＬ構築物から引き離され、その結果、ＦＡＳＬのスプライシングが可能になり、ＦＡＳＬタンパク質が産生される。（Ｃ）（Ｂ）における構築物の構成と類似しているが、Ｃａｓ１３ｄをＦＡＳＬプレｍＲＮＡから引き離す連鎖状部位を含有するＴＮＦ−アルファ受容体またはＩＬ−６受容体によって調節される操作されたｍＲＮＡという別の成分が追加された構築物の構成実施形態を示す。（Ｄ）ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファを検出し、その後、ＧＡＬ４などの転写因子を放出し、それにより、ＧＡＬ４により調節されるＦＡＳＬ遺伝子の発現を促進する、Ｓｙｎ−ノッチなどの操作された受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｅ）ＦＡＳＬをコードし、また、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６によって刺激されると下方制御されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の３’ＵＴＲに連鎖状の標的部位を含有する操作されたｍＲＮＡを含む構築物の構成実施形態を示す。（Ｆ）細胞内ドメイン上のインテインを核内に存在するＣａｓ１３ｄ−インテイン融合物と共に有する操作されたバージョンのＩＬ−６受容体またはＴＮＦ−アルファ受容体を含む構築物の構成実施形態を示す。この構築物実施形態は、Ｃａｓ１３ｄによりＦＡＳＬのスプライシングが調節されるが、ＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファ検出時のインテインの細胞膜からの放出および核へのトランスロケーションの結果、Ｃａｓ１３ｄに対するインテイン活性がもたらされ、それにより、ＦＡＳＬに対するスプライシング遮断が解放されるという点で（Ｂ）の実施形態と類似している。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本開示は、治療活性および免疫遮蔽活性の組合せのための組成物および方法を提供する。免疫遮蔽活性により、非自己治療活性、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質複合体などの非自己治療用タンパク質の発現に特異的なＭＨＣ媒介性免疫原性ペプチドおよびヘルパーＴ細胞が排除される。組成物は、少なくとも二機能性成分−非自己目的タンパク質（ＰＯＩ）および非切断型変異型ＦａｓＬをコードする核酸配列を含む。本開示の組成物の一実施形態では、組成物は、ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するｇＲＮＡ、ＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列、および非切断型ＦａｓＬをコードする配列を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、組成物は、ベクター構築物を含む。他の実施形態では、配列は、機能的成分を駆動するプロモーターまたは機能的成分のそれぞれもしくはある特定の機能的成分の発現を駆動する別々のプロモーターを含む。多数のコード配列の発現に使用されることも多い追加的なエレメント、例えば、２Ａリボソームスキッピング部位、またはＩＲＥＳなどを、ベクター構築物を含む組成物に組み入れることができる。

【0032】

本開示の組成物および方法の重要な特色は、ＦＡＳＬ発現に関連するタイミングおよびレベルの制御である。ＦＡＳＬの構成的発現には毒性が伴うが、細胞が活性化Ｔ細胞によって攻撃されたときにＦＡＳＬを発現させることにより、選択的なＴ細胞排除が達成されると同時に、これらの毒性問題が回避される。

【0033】

一実施形態では、ＦＡＳＬ系の短期発現を促進する送達方式を利用することにより、ＦＡＳＬ発現の時間的制御が達成される。具体的には、ＦＡＳＬ系をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを有する脂質ナノ粒子などの非ウイルス送達方式により、標的組織における系の一過性発現が促進される。

【0034】

別の実施形態では、ＡＡＶベクターまたは他のウイルス送達または非ウイルス送達方式は、組み込まれた時間的制御を含む。そのような手法の１つは、時計遺伝子などの、概日リズムで循環するプロモーターを伴う。別の手法では、これだけに限定することなく、テトラサイクリン、キュメート（ｃｕｍａｔｅ）、ガラクトース（ＧＡＬ）、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）、セロビオヒドロラーゼ、またはグルコアミラーゼなどの薬物誘導性プロモーターの使用が伴い得る。

【0035】

別の実施形態では、制御された条件下でのみ、組み込まれたセンサーによりＦＡＳＬ発現が促進される。具体的には、特定の遺伝子の発現を認識する遺伝的回路を使用して、細胞傷害性Ｔ細胞の活性を同定し、その後、これらの活性化Ｔ細胞の存在下でのみＦＡＳＬ発現が促進される。

【0036】

したがって、本開示は、変異体（ｍＦＡＳＬ）の発現を調節および／または制御するための組成物および方法を提供する。一実施形態では、活性化Ｔ細胞の存在下でのみ、サイトカインであるＩＬ−６またはＴＮＦアルファの検出を介して組成物によりｍＦＡＳＬが産生される。このｍＦＡＳＬタンパク質により、活性化Ｔ細胞の特異的死滅を介して、治療的処置を受けた細胞が保護される。サイトカインの非存在下では、細胞はＦＡＳＬを下方制御し、それにより、広範なＦＡＳＬの構成的発現に付随する安全性の問題が回避される。

【0037】

一実施形態では、ｍＦＡＳＬの産生は、活性化Ｔ細胞の存在下でのみ、ＩＬ−６および／またはＴＮＦ−アルファの一方または両方によって特異的に活性化されるプロモーターを含む図３Ａなどの構築物の構成の使用によってなされる。ＩＬ−６および／またはＴＮＦ−アルファの一方または両方によって特異的に活性化される例示的なプロモーターとしては、限定することなく、表１および／または表２に列挙されているプロモーターが挙げられる。

【0038】

【表1-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-2】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-3】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-4】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-5】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-6】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-7】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-8】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-9】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-10】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-11】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-12】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-13】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-14】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-15】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-16】

[この文献は図面を表示できません]

【表1-17】

[この文献は図面を表示できません]

【0039】

【表2-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表2-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0040】

別の実施形態では、ｍＦＡＳＬ発現は、ｍＦＡＳＬのスプライシングが妨げられるＲＮＡ標的化系（例えば、Ｃａｓ１３ｄ）を含む図３Ｂなどの構築物の構成によって調節される。具体的には、ＦＡＳＬは、スプライシングがＲＮＡ結合性タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｄ）によって負に調節されるイントロンを含む。ＴＮＦアルファまたはＩＬ−６シグナル伝達の際に、ＲＮＡ標的化系は、ＴＮＦアルファまたはＩＬ−６シグナル伝達の際に発現されるＲＮＡの強力な結合性部位に引き付けられる、すなわち、Ｃａｓ１３ｄがＦＡＳＬ構築物から引き離される。これにより、ｍＦＡＳＬに対するスプライシング遮断が解放され（およびＦＡＳＬのスプライシングが可能になる）、タンパク質の産生が促進される。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、調節されるＦＡＳＬ構築物の構成（例えば、図３Ａなど）のｍＲＮＡに対してアンチセンスである。ＩＬ６またはＴＮＦ−アルファにより調節されるｍＲＮＡを標的とするｇＲＮＡのスペーサー配列を表３に列挙する。

【0041】

【表3-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表3-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0042】

同様の実施形態では、図３Ｃなどの構築物の構成は、Ｃａｓ１３ｄをＦＡＳＬプレｍＲＮＡから引き離す連鎖状部位を含み、また、適当なプロモーター（例えば、これだけに限定することなく、表１または表２のプロモーターなど）の使用を介してＴＮＦアルファまたはＩＬ−６によって調節される操作されたＲＮＡを含む。この場合、操作されたＲＮＡは、ＲＮＡ標的化系の多数の標的部位を含有する。このように、操作されたＲＮＡの発現により、ｍＦＡＳＬ ｍＲＮＡに対するスプライシング遮断が解放される。

【0043】

別の実施形態では、図３Ｄなどの構築物の構成は、ＩＬ−６またはＴＮＦアルファを検出し、ｍＦＡＳＬを駆動するプロモーターの発現を調節する合成ノッチなどの操作された受容体を含む。このように、ｍＦＡＳＬは、ＴＮＦアルファまたはＩＬ−６シグナル伝達の存在下でのみ産生される。

【0044】

例えば、そのような操作されたＳｙｎ−ノッチ受容体によりＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファが検出され、その後、ＧＡＬ４により調節されるＦＡＳＬ遺伝子の発現を促進するＧＡＬ４などの転写因子が放出される。一実施形態では、操作された受容体は、３つのモジュールを含む（Ｎ末端からＣ末端まで）：

【0045】

１）これだけに限定することなく、以下のアミノ酸配列を有するＩＬ−６ ｓｃＦＶなどのＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファ結合性セクション：

【0046】

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

【0047】

２）これだけに限定することなく、以下のアミノ酸配列を有するものなどの合成ノッチ：

【0048】

【化4-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化4-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0049】

および、３）これだけに限定することなく、以下のアミノ酸配列を有するＧＡＬ４などの転写因子：

【0050】

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

【0051】

別の実施形態では、図３Ｅなどの構築物の構成において、ｍＦＡＳＬは、目的のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合性部位をｍＲＮＡ ３’ＵＴＲに配置することによって調節される。操作されたｍＲＮＡは、連鎖状の標的部位（目的のｍｉＲＮＡ（単数または複数））を含み、これらのマイクロＲＮＡがＴＮＦアルファまたはＩＬ−６に供されない細胞において発現されるように選択される。ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６にさらされる細胞ではマイクロＲＮＡの発現が低減し（すなわち、ＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−６によって刺激されるとｍｉＲＮＡが下方制御され）、その結果、サイトカインシグナル伝達の存在下でのみｍＦＡＳＬ発現がもたらされる。一実施形態では、操作されたｍＲＮＡは、これだけに限定することなく、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｔ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐからなる群から選択される、ｍｉＲＮＡの標的部位を含む。

【0052】

別の実施形態では、図３Ｆなどの構築物の構成は、ＩＬ−６またはＴＮＦアルファを検出し、スプリットインテインを含む（例えば、細胞内ドメイン上のインテイン、核内に存在するＣａｓ１３ｄ−インテイン融合物と共に）操作された受容体を含む。ＲＮＡ標的化系（例えば、Ｃａｓ１３ｄなど）により、ｍＦＡＳＬをコードするｍＲＮＡのスプライシングが調節され、インテインが細胞膜から放出される。したがって、合成受容体が活性化されると、融合したスプリットインテインが核にトランスロケーションし、そこで、ＲＮＡ標的化系と融合したスプリットインテインと相互作用する。その結果、機能的なＲＮＡ標的化系が破壊され、ｍＦＡＳＬ ｍＲＮＡスプライシングが補正され、ｍＦＡＳＬタンパク質が産生される。

【0053】

本開示は、治療用およびＦａｓＬ免疫遮蔽性核酸配列を含むベクター、組成物および細胞を提供する。本開示は、本開示のベクター、組成物および細胞を使用して、疾患または障害を処置し、同時に、ベクターおよび／または組成物ならびに処置された細胞に特異的なＭＨＣ媒介性免疫原性応答を排除する方法を提供する。

【0054】

非自己治療用導入遺伝子に対する適応免疫応答の防止
治療用非自己導入遺伝子を有するＡＡＶベクターと変異体ＦＡＬＳ（ｍＦＡＳＬ）を共にパッケージングし、したがって、両方の遺伝子が発現される。ＡＡＶベクターの投与後、処置された細胞は、導入遺伝子およびｍＦＡＳＬの両方を発現し始める。導入遺伝子に由来するペプチドが、多くの細胞型によって行われる抗原提示の典型的なプロセスの一部としてＭＨＣによってディスプレイされる。非自己ペプチドを標的とする調節性およびエフェクターＴ細胞の形成が起こる。これらの導入遺伝子特異的Ｔ細胞により、非自己ペプチドをディスプレイし、同時にｍＦＡＳＬに遭遇する感染（処置された）細胞が調べられる。この非自己ペプチドディスプレイおよびｍＦＡＳＬの存在により、導入遺伝子特異的Ｔ細胞のアポトーシスがもたらされる。これにより、この治療用導入遺伝子およびそれを有する細胞に対する適応免疫応答の局面が排除される。

【0055】

筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）の処置
本開示の組成物を、筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）を処置するために使用し、この場合、治療用導入遺伝子（Ｃａｓ９）およびＤＭ１を引き起こすＣＵＧリピートを標的とする単一ガイドＲＮＡで構成されるＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ系を患者の筋肉または中枢神経系に送達する。ｍＦＡＳＬが存在することにより、Ｃａｓ９に特異的であり、処置された細胞に対して潜在的に細胞傷害性であるＴ細胞の排除が引き起こされる。

【0056】

血友病の処置
本開示の組成物を、血友病を処置するために使用する。血友病を処置するためには、第ＩＸ因子などの分泌型導入遺伝子を使用する。第ＩＸ因子の発現カセットをｍＦＡＳＬと共に有するベクターにより、第ＩＸ因子を発現する細胞に対する適応免疫応答が低減、排除、または防止される。

【0057】

非自己治療用導入遺伝子に対する適応免疫応答の防止と同時のＡＡＶ反復投与に対する免疫応答の防止
本開示の組成物は、ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質の全部または一部で構成される発現したポリペプチドを含有するＡＡＶベクターを含み得る。ＡＡＶカプシドポリペプチドは、系を送達するために使用した血清型と同一である。このＡＡＶカプシドポリペプチドの同時発現により、ＡＡＶカプシドに特異的なＴ細胞の排除が上記の様式で引き起こされる。これにより、ＡＡＶカプシドに対する細胞性免疫および体液性免疫の両方を調節することができるＴ細胞の枯渇が引き起こされる。これにより、同じＡＡＶ血清型の反復投薬が可能になる。本開示の組成物の非存在下で、および、本開示の組成物の開発前に標準治療を使用すると、ウイルスカプシドに対する適応免疫応答の形成に起因して、個々のＡＡＶ血清型を患者において１回よりも多く使用することができない可能性がある。

【0058】

本開示の組成物は、遺伝子治療の第１の投与の間に不完全な治療的移入が起こる状況または第２の用量が望ましい状況において有用であり得る。この場合、第２の用量を超えたその後の用量が望ましい場合を除き、遺伝子治療の第２の用量にはｍＦＡＳＬおよびＡＡＶカプシドポリペプチドが存在する必要はない。１つの状況は、単回用量で筋肉に形質導入する必要があるウイルスの体積が極端に大きい、骨格筋などの大きな器官の処置中であり得る。別の状況は、最初の処置では標的とされる細胞の十分な感染がもたらされない、脳または脊椎への複雑な投与方法を伴う処置中であり得る。

【0059】

非切断型ＦａｓＬ
Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用は、免疫系に関して十分に確立されている。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じたＴ細胞の活性化により、ＦａｓおよびＦａｓＬの両方が上方制御される。ＴＣＲ刺激が低〜中等度の状況では、Ｔ細胞は増殖する。ＴＣＲ刺激が反復されるまたは高レベルである条件下では、Ｔ細胞はアポトーシスに向かって駆動される。この現象は、抗原誘導性細胞死（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ）（ＡＩＣＤ）と称されている。免疫系の調節におけるＡＩＣＤの重要性はＬＰＲマウスにおいて実証されている。Nagata et al., Immunol. Today 16: 39-43(1995)。

【0060】

Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用が免疫特権に寄与することも十分に確立されている。具体的には、多数の試験により、移植の状況におけるＦａｓＬ発現の誘導によって操作された免疫特権が実証されている。Bellgrau et al., Nature 377: 630-632(1995)； Griffith et al., Science 270: 1189-1192(1995)、Lau et al., Science 273: 109-112(1996)。

【0061】

ＦａｓＬは、マトリックスメタロプロテアーゼによりタンパク質分解により切断され、また、細胞膜に結合している。可溶性ＦａｓＬは循環系全体を通して広範に放出され、循環するので、非特異的かつ広範にわたる細胞死を引き起こすことが分かっている。Ogasawara et al., Nature 364: 806-809(1993), published erratum, Nature 365: 568 (1993)、Tanaka et al., Nature Med. 2: 317-322(1996)、Rodriguez et al., J. Exp. Med. 183: 1031-1036(1996)。そのように、Ｆａｓ／ＦａｓＬの選択的なモジュレーション、ならびにその後の特定の標的組織および細胞に対する選択的なアポトーシスの誘導は、ＦａｓＬプロテアーゼ認識領域を変異させることによって達成されている。これは、野生型ＦａｓＬプロテアーゼ認識領域に少なくとも１つの変異または欠失を生じさせることにより、ＦａｓＬポリペプチドの細胞膜からのタンパク質分解による切断が阻害され、可溶性ＦａｓＬの産生および可溶性ＦａｓＬによる有害な非選択的影響が最小限になることが見いだされているからである。野生型、全長ヒトＦａｓＬの配列は当技術分野で公知である。野生型、全長ヒトＦａｓＬの細胞外ドメインは、アミノ酸残基１０３〜２８１によって定義され、野生型ヒトＦａｓＬのプロテアーゼ認識領域は少なくともアミノ酸残基１１９〜１５４を含む。残基には野生型ヒトＦａｓＬの既知のアミノ酸配列を参照して番号が付されている。Takahashi et al., Int'l Immunol. 6: 1567-1574(1994)を参照されたい。さらに、非切断型変異型ＦａｓＬポリペプチドおよびそれを生成する方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９９９／０３６０７９に見いだすことができる。

【0062】

「ＦＡＳＬ」および「ｍＦａｓＬ」という用語法は、本明細書では、互換的に使用され、非切断型変異型ＦａｓＬを指す。

【0063】

一実施形態では、例示的な変異型非切断型ＦａｓＬ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＭＭＰ切断部位が太字になっている）を、以下のアミノ酸配列内に１つまたは複数の変異または欠失を生じさせることによって生成することができる：

【0064】

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

【0065】

別の実施形態では、例示的な変異型非切断型ＦａｓＬ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＭＭＰ切断部位が太字になっている）を、以下のアミノ酸配列内に１つまたは複数の変異または欠失を生じさせることによって生成することができる：

【0066】

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

【0067】

非自己ＰＯＩ
本開示の組成物の１つの成分に関するある実施形態に関しては、組成物の核酸配列は、非自己目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする。一実施形態では、非自己ＰＯＩは、異種非自己（または外来）タンパク質抗原、その断片またはバリアントである。例示的な非自己タンパク質またはＰＯＩとしては、限定することなく、細菌タンパク質、古細菌タンパク質、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスカプシド）、寄生生物タンパク質、腫瘍タンパク質、マイコプラズマタンパク質、酵母タンパク質またはアレルゲンタンパク質が挙げられる。一実施形態では、非自己ＰＯＩは、細菌由来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または古細菌由来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である。別の実施形態では、非自己ＰＯＩは、治療用導入遺伝子（自己または非自己導入遺伝子）を有するウイルスベクターに特異的なウイルスカプシドである。

【0068】

ＡＡＶカプシド−自己または非自己遺伝子治療の反復投与
ヒトおよび動物モデルにおけるＡＡＶ反復投与は、一般には、ＡＡＶカプシドに対する体液性応答および細胞性応答の両方の形態の適応免疫の形成をもたらす（図２Ａ）。結果として、ＡＡＶの反復用量により、毒作用の潜在性を伴う初回用量後の遺伝子形質導入の減弱がもたらされる。最初の処置に使用されるＡＡＶベクター内に含まれる導入遺伝子ペイロード（自己または非自己導入遺伝子）にＦＡＳＬおよびＡＡＶカプシド由来のポリペプチドの両方を含めることにより、ウイルスカプシドに特異的なＴ細胞を排除することができる（図２Ｂ）。これらのカプシド特異的Ｔ細胞の排除により、ウイルスカプシドに対する適応免疫の形成が防止され、効率的かつ安全な再投薬が可能になる。具体的には、ウイルスカプシドポリペプチドの発現により、ウイルスカプシドに特異的なペプチドの感染細胞によるＭＨＣを介したディスプレイが引き起こされ、それにより、カプシド特異的Ｔ細胞（ウイルスカプシドペプチドに対するＴＣＲを有する）と感染細胞の相互作用が促進される。感染細胞におけるＦＡＳＬの同時発現により、これらのカプシド特異的Ｔ細胞の死滅が促進される。カプシドに対する細胞性免疫および体液性免疫のどちらの開始にもＴ細胞が必要とされるので、同じＡＡＶ血清型を用いたその後の処置は適応免疫系によって減弱されない。

【0069】

ＡＡＶ生物学は、広範囲にわたって研究されており、当技術分野において周知である。本明細書に開示される組成物に使用するためのＡＡＶカプシドは、限定することなく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（ＡＡＶ１とＡＡＶ２のハイブリッド）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ならびに、これだけに限定することなく、Ａｎｃ８０ ＡＡＶ（ＡＡＶ１、２、６、８および９の祖先）などの合成ＡＡＶ血清型を含めたＡＡＶ血清型に由来する。

【0070】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、

【0071】

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

であるＡＡＶ９ ＶＰ１アミノ酸配列に由来する。

【0072】

別の実施形態では、ＡＡＶ９カプシド（ＶＰ１のサブセット）の予測される表面残基は、

【0073】

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0074】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

であるＡｎｃ８０ ＡＡＶ ＶＰ１アミノ酸配列に由来する。

【0075】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

であるＡＡＶ１２ ＶＰ１アミノ酸配列に由来する。

【0076】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、

【化12】

[この文献は図面を表示できません]

であるＡＡＶ１ ＶＰ１アミノ酸配列に由来する。

【0077】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

であるＡＡＶ２ ＶＰ１アミノ酸配列に由来する。

【0078】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

であるＡＡＶ６ ＶＰ１アミノ酸配列に由来する。

【0079】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

であるＡＡＶ８ ＶＰ１アミノ酸配列に由来する。

【0080】

ＲＮＡ結合性タンパク質
本開示のＲＮＡ結合性タンパク質、ポリペプチド、またはドメインは、これだけに限定することなく、ＲＮＡ結合性タンパク質またはポリペプチドまたはドメインのＲＮＡ結合性部分（複数可）を含む。

【0081】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。本開示の例示的なＣａｓ９タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた任意の種から単離され得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ９タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒａｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ ＣＦ８９−１２、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ ｓｔｒ．Ｆ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ ｓｔｒ．ＤＳＭ １６５１１、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、ａ Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、ａｎ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ Ｂ５１０、ａ Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ ｓｔｒ．Ｂｕｄｄｙ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｓｔｒ．Ｐａｒｉｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａを含めた任意の種から単離され得るまたはそれに由来し得る。

【0082】

本開示の例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列：

【化16-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化16-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0083】

ヌクレアーゼが不活化されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質は、１０位のアスパラギン酸（Ｄ）のアラニン（Ａ）による置換および８４０位のヒスチジン（Ｈ）のアラニン（Ａ）による置換を含み得る。本開示の例示的なヌクレアーゼが不活化されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは太字で下線が引かれている）：

【化17-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化17-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0084】

ヌクレアーゼが不活化されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはその一部、ＨＮＨドメイン、ＤＮＡｓｅ活性部位、ββα−メタルフォールドまたはＤＮＡｓｅ活性部位を含むその一部またはこれらの任意の組合せの欠失を含み得る。

【0085】

他の例示的なＣａｓ９タンパク質またはその一部は、以下のアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。

【0086】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化18】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0087】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化19-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化19-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0088】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化20】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0089】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化21-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化21-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0090】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ．ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化22】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0091】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化23-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化23-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0092】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化24】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0093】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化25-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化25-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0094】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ
Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0095】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化27-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化27-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0096】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0097】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化29-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化29-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0098】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0099】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0100】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化32-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化32-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0101】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0102】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化34-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化34-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0103】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0104】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化36-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化36-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0105】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0106】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化38-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化38-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0107】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化39】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0108】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｏ．ｌａｎｅｕｓ Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：

【化40-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化40-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0109】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ｆＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質を含む。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた任意の種から単離され得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６およびＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＮＤ２００６を含めた任意の種から単離され得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、ヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。

【0110】

本開示の例示的な野生型Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）タンパク質は、アミノ酸配列：

【化41-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化41-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0111】

本開示の例示的な野生型Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）タンパク質は、アミノ酸配列：

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0112】

本開示の例示的な野生型Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）タンパク質は、アミノ酸配列：

【化43-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化43-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0113】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質を含む。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた任意の種から単離され得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ １／２ｂ（ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ ３５９６７ ／ ＤＳＭ ２０７５１ ／ ＣＩＰ １００１００ ／ ＳＬＣＣ ３９５４）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９−０３１７、ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６−０６３５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓを含めた任意の種から単離され得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、ＤＮＡヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質としては、これだけに限定されないが、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄおよびこれらのオルソログが挙げられる。本開示の例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが本明細書ではそれぞれＣｓｘ２７およびＣｓｘ２８と称される亜型１および２が挙げられる。

【0114】

例示的なＣａｓ１３ａタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：

【表4-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表4-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0115】

本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ａタンパク質は、アミノ酸配列：

【化44-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化44-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0116】

例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：

【表5-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表5-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0117】

本開示の例示的な野生型Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ ＡＴＣＣ ４３７６７ Ｃａｓ１３ｂ（ＢｚＣａｓ１３ｂ）タンパク質は、アミノ酸配列：

【化45】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0118】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄは、ＶＩ−Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のエフェクターである。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切る（cut）またはそれに結合することができる、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、１つまたは複数の高等真核生物および原核生物ヌクレオチド結合性（ＨＥＰＮ）ドメインを含み得る。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、野生型ＨＥＰＮドメインまたは変異型ＨＥＰＮドメインのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切ることはできないが、ガイドＲＮＡをプロセシングすることができる変異型ＨＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、プロトスペーサーフランキング配列を必要としない。ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質のさらなる例および配列について、限定することなく、具体的な参照がなされる、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ公開第ＷＯ２０１９／０４０６６４号およびＵＳ２０１９／００６２７２４も参照されたい。

【0119】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６０４９０００２５１：

【化46】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0120】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５４６０００２７５：

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0121】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４１１４０００３７４：

【化48】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0122】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２１０００６１９：

【化49】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0123】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２００２０００４１１：

【化50】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0124】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３５５２０００３１１：

【化51】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0125】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１００３７０００５２７：

【化52】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0126】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２３８０００３２９：

【化53】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0127】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２６４３０００４９２：

【化54】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0128】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８７４００００５７：

【化55】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0129】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４７８１０００４８９：

【化56-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化56-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0130】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１２１４４０００３５２：

【化57】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0131】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５５９００００４４８：

【化58】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0132】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５２５０００３４９：

【化59】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0133】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２２９０００３０２：

【化60】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0134】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３２２７０００３４３：

【化61】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0135】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７０３００００４６９：

【化62】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0136】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１７Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０、ｃ８７００００４３：

【化63】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0137】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＢＶＨ０１００３０３７．１、ヒト腸内メタゲノム配列（ＷＧＳコンティグｅｍｂ｜ＯＢＸＺ０１００００９４．１｜およびｅｍｂ｜ＯＢＪＦ０１００００３３．１｜にも見いだされる）：

【化64】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0138】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜（培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）：

【化65-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化65-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0139】

ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）の例示的なダイレクトリピート配列：コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜（培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）（配列番号９５）は、核酸配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ ＤＲ：

【化66】

[この文献は図面を表示できません]

【0140】

（配列番号９６）
を含むまたはそれからなる。

【0141】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグＯＧＺＣ０１０００６３９．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0142】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＨＢＭ０１０００７６４．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：

【化68】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0143】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＨＣＰ０１００００４４．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：

【化69】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0144】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＧＤＦ０１００８５１４．１|（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：

【化70】

[この文献は図面を表示できません]

【0145】

（配列番号１００）
を含み得るまたはそれからなり得る。

【0146】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＧＰＮ０１００２６１０．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：

【化71】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0147】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＢＬＩ０１０２０２４４およびｅｍｂ｜ＯＢＬＩ０１０３８６７９（ブタ腸内メタゲノム由来）由来：

【化72】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0148】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグＯＩＺＸ０１０００４２７．１：

【化73】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0149】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグＯＣＴＷ０１１５８７２６６．１：

【化74】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0150】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＧＮＦ０１００９１４１．１：

【化75】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0151】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＩＥＮ０１００２１９６．１：

【化76-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化76-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0152】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６：

【化77】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）の例示的なダイレクトリピート配列：コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６（配列番号１０７）は、核酸配列：ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄダイレクトリピート１：ｇｔｇａｇａａｇｔｃ ｔｃｃｔｔａｔｇｇｇ ｇａｇａｔｇｃｔａｃ（配列番号１０８）を含むまたはそれからなる。

【0153】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇａ０１２９３０６＿１０００７３５：

【化78-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化78-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0154】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇａ０１２９３１７＿１００８０６７：

【化79】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0155】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ Ｇａ０２２４４１５＿１００４８７９２：

【化80-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化80-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0156】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ １６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４：

【化81】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0157】

ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質の例示的なダイレクトリピート配列は、配列ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ １６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４（配列番号１１２）を含み得るまたはそれからなり得、これは、核酸配列：ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ ＤＲ：

【化82】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0158】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ ２５０ｔｗｉｎｓ＿３５８３８＿ＧＬ０１１０３００：

【化83-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化83-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0159】

例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ ２５０ｔｗｉｎｓ＿３６０５０＿ＧＬ０１５８９８５：

【化84】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0160】

Yan et al.(2018) Mol Cell. 70 (2): 327-339（doi:10.1016/j.molcel.2018.02.2018）およびKonermann et al.(2018)Cell 173 (3): 665-676（doi:10.1016/j.cell/2018.02.033）には、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質について記載されており、これらはどちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0161】

その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ公開第ＷＯ２０１８／１８３７０３号（ＣａｓＭ）および同第ＷＯ２０１９／００６４７１号（Ｃａｓ１３ｄ）も参照されたい。

【0162】

本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：

【0163】

Ｃａｓ１３ｄ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２）配列：

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0164】

本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：

【0165】

Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６）：

【化86】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0166】

Ｃａｓ１３ｄの例示的なダイレクトリピート配列（コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６）（配列番号４６）は、核酸配列：Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６）ダイレクトリピート配列）：ＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＣＣＴＴＡＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＡＣ（配列番号４７）を含むまたはそれからなる。

【0167】

本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：

【0168】

Ｃａｓ１３ｄ（１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４）：

【化87】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0169】

Ｃａｓ１３ｄの例示的なダイレクトリピート配列（１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４）（配列番号４８）は、核酸配列：

【0170】

Ｃａｓ１３ｄ（１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４）ダイレクトリピート配列：

【化88】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0171】

本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：

【0172】

Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）：

【化89-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化89-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含み得るまたはそれからなり得る。

【0173】

Ｃａｓ１３ｄの例示的なダイレクトリピート配列（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）（配列番号５０）は、核酸配列：Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）ダイレクトリピート配列：

【化90】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0174】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、配列ＵＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＵＣＣＣＣＣＡＡＡ（配列番号１）、ＧＵＵＵＧＧＧＧＧＡＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＡ（配列番号２）、ＣＣＣＵＣＡＣＵＧＣＵＧＧＧＧＡＧＵＣＣ（配列番号３）、ＧＧＡＣＵＣＣＣＣＡＧＣＡＧＵＧＡＧＧＧ（配列番号４）、ＧＣＡＡＣＵＧＧＡＵＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧ（配列番号５）、ＧＣＡＧＣＡＡＡＵＵＧＡＵＣＣＡＧＵＵＧＣ（配列番号６）、ＧＣＡＵＵＣＵＵＡＵＣＵＧＧＵＣＡＧＵＧＣ（配列番号７）、ＧＣＡＣＵＧＡＣＣＡＧＡＵＡＡＧＡＡＵＧ（配列番号８）、ＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号９）、ＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧ（配列番号１０）、ＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣ（配列番号１１）、またはＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣ（配列番号１２）、ＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧ（配列番号７４）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧ（配列番号７５）、ＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧ（配列番号７６）、ＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣ（配列番号７７）、ＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣ（配列番号７８）、またはＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧ（配列番号７９）を含むまたはそれからなる。

【0175】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。

【0176】

一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、配列ＧＵＧＡＵＡＡＧＵＧＧＡＡＵＧＣＣＡＵＧ（配列番号１４）、ＣＵＧＧＵＧＡＡＣＵＵＣＣＧＡＵＡＧＵＧ（配列番号１５）、またはＧＡＧＡＴＡＴＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号１６）を含むまたはそれからなる。

【0177】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、配列ＣＵＧ（配列番号１８）、ＣＣＵＧ（配列番号１９）、ＣＡＧ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号８１）またはこれらの任意の組合せの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのリピートを含む配列を含むまたはそれからなる。

【0178】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質に特異的に結合する足場配列をさらに含む。一部の実施形態では、足場配列は、ステムループ構造を含む。一部の実施形態では、足場配列は、９０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、９３ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、配列ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、配列ＧＧＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ（配列番号１７）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、配列ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号８２）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号８３）を含むまたはそれからなる。

【0179】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子内の第２の配列に結合しないまたは選択的には結合しない。

【0180】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームは、ＲＮＡ分子を含む。

【0181】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分をコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性は阻害されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。

【0182】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性は阻害されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。

【0183】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３ｄポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性は阻害されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。

【0184】

一部の実施形態では、標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質ではなく、したがって、対応するｇＲＮＡ配列を有さない標的ＲＮＡに結合することができる少なくとも１つのＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む。そのようなガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドとしては、限定することなく、ＰＵＦ（ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦホモロジーファミリー）である少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分が挙げられる。この型のＲＮＡ結合性ポリペプチドを、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓなどのｇＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質の代わりに使用することができる。本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分は、ＰＵＦ（ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦホモロジーファミリー）である。ｍＲＮＡの安定性および翻訳の媒介に関与するＰＵＦタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＰｕｍｉｌｉｏおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｆｅｍ−３結合因子に由来する）の独特のＲＮＡ認識方式は当技術分野で周知である。同じく当技術分野で公知のヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは同族ＲＮＡ配列に密接に結合し、また、その特異性は改変することができる。ヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは、８つの連続したＲＮＡ塩基を認識する８つのＰＵＦリピートを含有し、各リピートが一塩基を認識する。各リピート内の２つのアミノ酸側鎖が対応する塩基のワトソン・クリック端を認識し、そのリピートの特異性を決定するので、ＰＵＦドメインを、大半の８ｎｔのＲＮＡに特異的に結合するように設計することができる。Wang et al., Nat Methods. 2009; 6(11): 825-830。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０６８６２７も参照されたい。

【0185】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分は、ＰＵＭＢＹ（Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ）タンパク質である。ＲＮＡを標的とするためにネイティブな形態および改変された形態で広く使用されているＲＮＡ結合性タンパク質ＰｕｍＨＤ（ＰＵＦファミリーのメンバーであるＰｕｍｉｌｉｏ相同性ドメイン）が操作されて、それぞれが１つのＲＮＡ塩基を標的とする４つの標準的なタンパク質モジュールのセットがもたらされた。これらのモジュール（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリに関してはＰｕｍｂｙ）を、所望の標的ＲＮＡに結合するように様々な組成および長さの鎖に連結することができる。そのようなＰｕｍｂｙ−ＲＮＡ相互作用の特異性は高く、Ｐｕｍｂｙ鎖の、標的配列から３つまたはそれよりも多くのミスマッチを有するＲＮＡ配列への結合は検出不可能である。Katarzyna et al., PNAS, 2016; 113(19): E2579-E2588。

【0186】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ１タンパク質は、

【化91】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ３タンパク質は、

【化92】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ４タンパク質は、

【化93-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化93-2】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ５タンパク質は、

【化94】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ６タンパク質は、

【化95】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ７タンパク質は、

【化96】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ８タンパク質は、

【化97-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化97-2】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ９タンパク質は、

【化98】

[この文献は図面を表示できません]

のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

【0187】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分は、ＰＰＲタンパク質である。ＰＰＲタンパク質（植物に由来するペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）モチーフを有するタンパク質）は、核にコードされ、ＲＮＡレベルで、細胞小器官（葉緑体およびミトコンドリア）、切り取り、翻訳、スプライシング、ＲＮＡの編集、ＲＮＡ安定性に特異的に作用する遺伝子を排他的に制御する。ＰＰＲタンパク質は、一般には、３５アミノ酸のモチーフであり、ＰＰＲモチーフが約１０個の連続したアミノ酸である構造を有する。ＰＰＲモチーフの組合せをＲＮＡへの配列選択的結合に使用することができる。ＰＰＲタンパク質は、多くの場合、約１０リピートドメインのＰＰＲモチーフで構成される。ＰＰＲドメインまたはＲＮＡ結合性ドメインは、触媒として不活性になるように構成することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５８４０４。

【0188】

本開示の組成物の一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含み、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドも第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドも有意なＤＮＡヌクレアーゼ活性を含まず、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドと第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは同一ではなく、かつ、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドはＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。

【0189】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。

【0190】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性は阻害されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。

【0191】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰＰＲ（ペンタトリコペプチドリピート）タンパク質を含む。

【0192】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質を含まない。

【0193】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まず、またそれに選択的に結合しない。

【0194】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームは、ＲＮＡ分子を含む。

【0195】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、端点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む。

【0196】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃ末端にＮＬＳを含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第１のＮＬＳをコードする第１の配列および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳをコードする配列は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳを含む。

【0197】

ＲＮＡ結合性エンドヌクレアーゼ
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡを切断する様式でＲＮＡと会合する。

【0198】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。

【0199】

融合タンパク質が第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むものを含めた本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ１をコードする配列は、

【化99】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ４を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ４をコードする配列は、

【化100】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ６をコードする配列は、

【化101】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ７を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ７をコードする配列は、

【化102】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ８を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ８をコードする配列は、

【化103】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ２をコードする配列は、

【化104】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６ＰＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ６ＰＬをコードする配列は、

【化105】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＬをコードする配列は、

【化106】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２をコードする配列は、

【化107】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ１１をコードする配列は、

【化108】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２様を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２様をコードする配列は、

【化109】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0200】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。

【0201】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）ポリペプチドは、

【化110】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0202】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、

【化111】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0203】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、

【化112】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0204】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、

【化113】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0205】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、

【化114】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。

【0206】

一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、

【化115】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0207】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ））ポリペプチドは、

【化116】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0208】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、

【化117】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。

【0209】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＮＯＢ１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。ＮＯＢ１ポリペプチドをコードする配列が、

【化118】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる、請求項１０１に記載の組成物。

【0210】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、エンドヌクレアーゼを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、エンドヌクレアーゼＶ（ＥＮＤＯＶ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＶをコードする配列は、

【化119】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0211】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＧをコードする配列は、

【化120】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0212】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、エンドヌクレアーゼＤ１（ＥＮＤＯＤ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＤ１をコードする配列は、

【化121-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化121-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0213】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ヒトフラップエンドヌクレアーゼ−１（ｈＦＥＮ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＦＥＮ１をコードする配列は、

【化122】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0214】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ヒトＳｃｈｌａｆｅｎ１４（ｈＳＬＦＮ１４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＳＬＦＮ１４をコードする配列は、

【化123】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0215】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ヒトベータ−ラクタマーゼ様タンパク質２（ｈＬＡＣＴＢ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＬＡＣＴＢ２をコードする配列は、

【化124】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0216】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、脱プリン／脱ピリミジン部位（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２をコードする配列は、

【化125】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0217】

一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２をコードする配列は、

【化126】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0218】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＮＧをコードする配列は、

【化127】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0219】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、熱応答性タンパク質１２（ＨＲＳＰ１２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＨＲＳＰ１２をコードする配列は、

【化128】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0220】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａをコードする配列は、

【化129】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａをコードする配列は、

【化130】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0221】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、反応性中間体イミンデアミナーゼＡ（ＲＩＤＡ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＩＤＡをコードする配列は、

【化131】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0222】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ホスホリパーゼＤファミリーメンバー６（ＰＤＬ６）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＤＬ６をコードする配列は、

【化132】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0223】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ様タンパク質１（ＮＴＨＬ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＮＴＨＬをコードする配列は、

【化133】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0224】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ミトコンドリアリボヌクレアーゼＰ触媒サブユニット（ＫＩＡＡ０３９１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＫＩＡＡ０３９１をコードする配列は、

【化134】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0225】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、脱プリンまたは脱ピリミジン部位リアーゼ（ＡＰＥＸ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ１をコードする配列は、

【化135】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0226】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、アルゴノート２（ＡＧＯ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＧＯ２をコードする配列は、

【化136】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0227】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ミトコンドリアヌクレアーゼＥＸＯＧ（ＥＸＯＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＸＯＧをコードする配列は、

【化137】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0228】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｄ（ＺＣ３Ｈ１２Ｄ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ｄをコードする配列は、

【化138】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0229】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、小胞体から核へのシグナル伝達（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｔｏ ｎｕｃｌｅｕｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）２（ＥＲＮ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＮ２をコードする配列は、

【化139】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0230】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ペロタｍＲＮＡサーベイランスおよびリボソームレスキュー因子（ｐｅｌｏｔａ ｍＲＮＡ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｒｅｓｃｕｅ ｆａｃｔｏｒ）（ＰＥＬＯ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＥＬＯをコードする配列は、

【化140】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0231】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＹＢＥＹメタロペプチダーゼ（ＹＢＥＹ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＹＢＥＹをコードする配列は、

【化141】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0232】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、切断およびポリアデニル化特異的因子４様（ＣＰＳＦ４Ｌ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＣＰＳＦ４Ｌをコードする配列は、

【化142】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0233】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１をコードする配列は、

【化143】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0234】

一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１をコードする配列は、

【化144】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0235】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、除去修復交差相補群（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ)１（ＥＲＣＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ１をコードする配列は、

【化145-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化145-2】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0236】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１アイソフォーム（ＲＡＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＣ１をコードする配列は、

【化146】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0237】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、リボヌクレアーゼＡＡ１（ＲＡＡ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＡ１をコードする配列は、

【化147】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0238】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、Ｒａｓ関連タンパク質（ＲＡＢ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＢ１をコードする配列は、

【化148】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0239】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡ２をコードする配列は、

【化149】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0240】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ３５２２０をコードする配列は、

【化150】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0241】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ１３１７３をコードする配列は、

【化151】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0242】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼＸＰＦ（ＥＲＣＣ４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ４をコードする配列は、

【化152】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、テニューリン膜貫通タンパク質１（ＴＥＮＭ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ１をコードする配列は、

【0243】

【化153】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0244】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、テニューリン膜貫通タンパク質２（ＴＥＮＭ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ２をコードする配列は、

【0245】

【化154】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。

【0246】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドをコードする配列は、

【化155】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドをコードする配列は、

【化156】

[この文献は図面を表示できません]

を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼポリペプチドをコードする配列は、

【化157】

[この文献は図面を表示できません]

【0247】

ガイドＲＮＡ
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）という用語と単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）という用語は、本開示全体を通して互換的に使用される。

【0248】

本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、スペーサー配列および足場配列で構成され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、連続したスペーサー配列および足場配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、スペーサー配列および足場配列は連続していない。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡをコードする配列は、リンカー配列によって分離されたスペーサー配列と足場配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得る。

【0249】

本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする配列は、改変または合成されたＲＮＡヌクレオチドを含むまたはそれからなる。例示的な改変されたＲＮＡヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、および７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ヒポキサンチン、キサンチン、キサントシン、７−メチルグアニン、５、６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシトシン（hydropxymethylcytosine）、イソグアニン、およびイソシトシンが挙げられる。

【0250】

本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変されたＲＮＡに結合し得る。標的配列内で、本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、改変されたＲＮＡに結合し得る。例示的なエピジェネティック的にまたは転写後に改変されたＲＮＡとしては、これだけに限定されないが、２’−Ｏ−メチル化（２’−ＯＭｅ）（リボース部分の遊離の２’−ＯＨの酸素に２’−Ｏ−メチル化が生じる）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、および５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）が挙げられる。

【0251】

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、非コードＣ／Ｄボックス核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列をコードする少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、ＲＮＡ分子の標的配列は、少なくとも１つの２’−ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列は、ボックスＣモチーフ（ＲＵＧＡＵＧＡ）およびボックスＤモチーフ（ＣＵＧＡ）を含む。

【0252】

本開示のスペーサー配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に結合する。本開示のスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み得る。本開示のスペーサー配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に選択的に結合するのに十分な、その標的配列に対する相補性を有する配列を含むまたはそれからなる。ＲＮＡ分子の標的配列に結合すると、スペーサー配列は、足場配列および融合タンパク質の１つまたは複数をＲＮＡ分子へガイドし得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に選択的に結合するのに十分な、その標的配列に対する相補性を有する配列は、標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ同一性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に選択的に結合するのに十分な、その標的配列に対する相補性を有する配列は、標的配列に対して１００％の同一性を有する。

【0253】

本開示の足場配列は、本開示の第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに結合する。本開示の足場配列は、トランス作用性ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。本開示の足場配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に選択的に結合するのに十分な、その標的配列に対する相補性を有する配列を含むまたはそれからなる。ＲＮＡ分子の標的配列に結合すると、足場配列は、融合タンパク質をＲＮＡ分子へガイドし得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に選択的に結合するのに十分な、その標的配列に対する相補性を有する配列は、標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ同一性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に選択的に結合するのに十分な、その標的配列に対する相補性を有する配列は、標的配列に対して１００％の同一性を有する。その代わりに、またはそれに加えて、一部の実施形態では、本開示の足場配列は、本開示の融合タンパク質の第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、二次構造または三次構造を含む。例示的な二次構造としては、これだけに限定されないが、へリックス、ステムループ、バルジ、テトラループおよびシュードノットが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、Ａ形態のへリックス、Ｂ形態のへリックス、およびＺ形態のへリックスが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったステムループが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったシュードノットが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、少なくとも１つの二次構造または少なくとも１つの三次構造を含む。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、１つまたは複数の二次構造または１つまたは複数の三次構造を含む。

【0254】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、本開示のＲＮＡ分子内のテトラループモチーフに選択的に結合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、テトラループモチーフを含む。一部の実施形態では、テトラループモチーフは、ＧＡＡＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＡＡまたはＧＡＧＡである配列の１つまたは複数を含むまたはそれからなる「ＧＲＮＡ」モチーフである。

【0255】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、ＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に共有結合により結合する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に非共有結合により結合する。

【0256】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、端点を含めて、１０個から１００個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、端点を含めて、１０個から３０個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、端点を含めて、１０個から１００個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７６個、８０個、８７個、９０個、９５個、１００個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、端点を含めて、８５個から９５個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、８５ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、９０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、９３ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。

【0257】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含まない。

【0258】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相補的な配列を含まない。

【0259】

本開示の治療用組成物または医薬組成物は、ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、必要に応じて、非治療用組成物または非医薬組成物は、ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドを含み得る。

【0260】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサーフランキング配列（ＰＦＳ）と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、ＰＦＳと相補的な配列を含まない。

【0261】

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡをコードする配列は、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、構成的プロモーターをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、誘導性プロモーターをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、ハイブリッドまたは組換えプロモーターをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、ガイドＲＮＡを哺乳動物細胞において発現させることができるプロモーターをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、ガイドＲＮＡをヒト細胞において発現させることができるプロモーターをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、ガイドＲＮＡを発現させ、ガイドＲＮＡを細胞の核に制限することができるプロモーターをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、ヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列またはヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列をコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、Ｕ６プロモーターをコードする配列またはＵ６プロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、ヒトｔＲＮＡプロモーターをコードする配列またはヒトｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列をコードする配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、ヒトバリンｔＲＮＡプロモーターをコードする配列またはヒトバリンｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列をコードする配列を含む。

【0262】

本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列は、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列を含むベクターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、調節エレメントは、ガイドＲＮＡの発現を増強するものである。例示的な調節エレメントとしては、これだけに限定されないが、エンハンサーエレメント、イントロン、エクソン、またはこれらの組合せが挙げられる。

【0263】

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ガイドＲＮＡをコードする配列、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターをコードする配列および調節エレメントをコードする配列のうちの１つまたは複数を含む。本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、本開示の融合タンパク質をコードする配列をさらに含む。

【0264】

融合タンパク質
融合タンパク質は、本開示の組成物に関しては、第１のＲＮＡ結合性タンパク質および第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して５’側に位置する。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。

【0265】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に選択的に結合することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しないまたはいかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の切断を誘導することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の切断を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しない、または、いかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の切断を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合せず、その切断も誘導しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合せず、その切断も誘導しない、または、いかなるＤＮＡ分子にも結合せず、その切断も誘導しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。

【0266】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有さないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。

【0267】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であって、本開示の組成物をＲＮＡ分子と接触させるかまたは本開示の細胞もしくは対象に導入したときにＤＮＡヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ分子の切断が誘導されない、哺乳動物ＤＮＡ分子の切断が誘導されない、またはいかなるＤＮＡ分子の切断も誘導されない、タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。

【0268】

本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であって、ＤＮＡヌクレアーゼ活性が不活化されており、本開示の組成物をＲＮＡ分子と接触させるかまたは本開示の細胞もしくは対象に導入したときにＤＮＡヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ分子の切断が誘導されない、哺乳動物ＤＮＡ分子の切断が誘導されない、またはいかなるＤＮＡ分子の切断も誘導されない、タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を本開示の組成物をＲＮＡ分子と接触させるかまたは本開示の細胞もしくは対象に導入したときにＤＮＡヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ分子の切断が誘導されない、哺乳動物ＤＮＡ分子の切断が誘導されない、またはいかなるＤＮＡ分子の切断も誘導されないレベルまで不活化するまたは低下させる変異を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を不活化するまたは低下させる変異を含み、変異は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする核酸配列またはアミノ酸配列に対する置換、逆位、転位、挿入、欠失、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む。

【0269】

一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、少なくとも２つのＲＮＡ結合性ポリペプチド間のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１つまたは複数のリピートを含む。他の実施形態では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ｃｏ−ポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。

【0270】

一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＲＮＡ結合性タンパク質を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、端点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む。

【0271】

一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質の少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、ＲＮＡ結合性タンパク質に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＬＳをＣ末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、第１のＮＬＳをコードする第１の配列および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳは、ＲＮＡ結合性タンパク質に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳをＣ末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＥＳ（核外輸送シグナル）または他のペプチドタグまたは分泌シグナルをさらに含む。

【0272】

一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質として少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質を含み、それと共に、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。

【0273】

一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドのＣ末端において第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドのＮ末端において第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。例えば、そのような例示的な融合タンパク質の１つは、ＲＮＡｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ１９Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ）がＳｐｙＣａｓ９のＮ末端に位置するように構成されたＥ９９であり、別の例示的な融合タンパク質、Ｅ１００は、ＲＮＡｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ１９Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ）がＳｐｙＣａｓ９のＣ末端に位置するように構成されている。

【0274】

ｇＲＮＡ標的配列
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、ＲＮＡ結合性タンパク質および／または複数のＲＮＡ結合性タンパク質および／またはその融合タンパク質に対応する配列モチーフを含む。

【0275】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、配列モチーフは、疾患または障害のシグネチャーである。

【0276】

本開示の配列モチーフは、ゲノム配列内に見いだされる外来または外因性配列の配列から単離し得るまたはそれに由来し得、したがって、本開示のｍＲＮＡ分子または本開示のＲＮＡ配列内に見いだされる外来もしくは外因性配列の配列に翻訳される。

【0277】

本開示の配列モチーフは、疾患または障害を引き起こす、内因性配列内の変異を含み得るまたはそれからなり得る。変異は、配列の置換、逆位、欠失、挿入、転位、またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。

【0278】

本開示の配列モチーフは、リピート配列を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リピート配列は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）に関連し得る。１つまたは複数の遺伝子座におけるＭＳＩは、本開示の細胞のＤＮＡミスマッチ修復機構が損なわれたことに起因する。ＤＮＡの超可変配列は、超可変配列を含むまたはそれからなる標的配列を含む本開示のｍＲＮＡに転写され得る。

【0279】

本開示の配列モチーフは、バイオマーカーを含み得るまたはそれからなり得る。バイオマーカーは、疾患または障害が発生するリスクを示すものであり得る。バイオマーカーは、健康な遺伝子（疾患または障害が発生することの確定可能なリスクが低いまたはリスクがない）を示すものであり得る。バイオマーカーは、編集された遺伝子を示すものであり得る。例示的なバイオマーカーとしては、これだけに限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、配列バリエーションまたは変異、エピジェネティックマーク、スプライスアクセプター部位、外因性配列、異種配列、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。

【0280】

本開示の配列モチーフは、二次構造、三次構造または四次構造を含み得るまたはそれからなり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性または天然に存在するものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、誘導されたまたは天然に存在しないものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性配列、外因性配列、または異種配列にコードされるものであり得る。

【0281】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、端点を含めて、２個から１００個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、端点を含めて、２個から５０個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、端点を含めて、２個から２０個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。

【0282】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は連続している。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は連続していない。例えば、ＲＮＡ分子の標的配列は、標的配列のヌクレオチド間に１つまたは複数の断続的なヌクレオチドが位置することに起因して連続していない１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基を含み得るまたはそれからなり得る。

【0283】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、天然に存在するものである。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、天然に存在しないものである。例示的な天然に存在しない標的配列は、配列バリエーションまたは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組換え配列、改変もしくは合成されたヌクレオチドを含む配列またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。

【0284】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示のガイドＲＮＡに結合する。

【0285】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第１のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する。

【0286】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する。

【0287】

ＲＮＡ分子
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、少なくとも１つの標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、１つまたは複数の標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、２つまたはそれよりも多くの標的配列を含む。

【0288】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、天然に存在するＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、天然に存在しない分子である。例示的な天然に存在しないＲＮＡ分子は、配列バリエーションまたは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組換え配列、改変もしくは合成されたヌクレオチドを含む配列またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。

【0289】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、ウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。

【0290】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、原核生物から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、古細菌の種もしくは株または細菌の種もしくは株から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。

【0291】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、真核生物から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、原生動物、寄生生物、原生生物、藻類、真菌、酵母、アメーバ、蠕虫、微生物、無脊椎動物、脊椎動物、昆虫、齧歯類、マウス、ラット、哺乳動物、または霊長類の種から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、ヒトから単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。

【0292】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、生物体またはウイルスのゲノム由来のコード配列に由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、一次ＲＮＡ転写物、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、プロセシングされていない遺伝子産物（例えば、転写物）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、転写後プロセシングを受けた遺伝子産物（例えば、５’キャップおよび３’ポリアデニル化シグナルを含む転写物）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、選択的スプライシングを受けた遺伝子産物（例えば、スプライスバリアント）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、非コード配列および／またはイントロン配列の除去を受けた遺伝子産物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を含むまたはそれからなる。

【0293】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、非コード配列（例えば、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ））に由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、リボソームＲＮＡを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、小さなｎｃＲＮＡ分子を含むまたはそれからなる。本開示の例示的なスモールＲＮＡ分子としては、これだけに限定されないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外またはエキソソームＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、および低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、長いｎｃＲＮＡ分子を含むまたはそれからなる。本開示の例示的な長いＲＮＡ分子としては、これだけに限定されないが、Ｘ−不活性特異的転写物（Ｘｉｓｔ）およびＨＯＸ転写物アンチセンスＲＮＡ（ＨＯＴＡＩＲ）が挙げられる。

【0294】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞内空間内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞質ゾル空間内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を核内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を小胞、細胞の膜に結合した区画、または細胞小器官において接触させる。

【0295】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞外空間内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物をエキソソーム内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物をリポソーム、ポリマーソーム、ミセルまたはナノ粒子内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞外マトリックス内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を液滴中で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物をマイクロ流体液滴中で接触させる。

【0296】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、一本鎖配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、二本鎖配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、二本鎖配列は、２つのＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、二本鎖配列は、ＲＮＡ分子１つとＤＮＡ分子１つを含む。二本鎖配列がＲＮＡ分子１つとおよびＤＮＡ分子１つを含む場合を含めた一部の実施形態では、本開示の組成物は、ＲＮＡ分子に選択的に結合し、必要に応じて、それを選択的に切断する。

【0297】

ベクター
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを少なくとも１つ含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを１つまたは複数含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを２つまたはそれよりも多く含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示の融合タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質と第２のＲＮＡ結合性タンパク質とを含む。

【0298】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、第１のベクターが本開示のガイドＲＮＡを含み、第２のベクターが本開示の融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを少なくとも１つ含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを１つまたは複数含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを２つまたはそれよりも多く含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質と第２のＲＮＡ結合性タンパク質とを含む。一部の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターは同一である。一部の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターは同一ではない。

【0299】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ベクターは、（ａ）本開示のＲＮＡ標的化融合タンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズするまたはそれに結合するＲＮＡ配列（またはスペーサー配列）を５’末端に含み、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に結合することまたはそれと会合することができるＲＮＡ配列（または足場配列）を３’末端に含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列とを含む「２成分ＲＮＡ標的化系」の成分であるかまたはそれを含み、２成分ＲＮＡ標的化系は、ＰＡＭｍｅｒの非存在下で細胞内の標的ＲＮＡを認識し、それを変更する。一部の実施形態では、２成分系の配列は、単一のベクター内に存在する。一部の実施形態では、２成分系のスペーサー配列は、ＣＵＧ、ＣＣＵＧ、ＣＡＧ、およびＧＧＧＧＣＣからなる群から選択されるリピート配列を標的とする。

【0300】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたものである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的である。

【0301】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、もしくはＡＡＶ１２であるＡＡＶから単離されたもしくはそれに由来する末端逆位反復配列もしくはカプシド配列を含む、または、ベクターおよび／もしくは成分は、これだけに限定することなく、Ａｎｃ８０ ＡＡＶ（ＡＡＶ１、２、６、８および９の祖先）などの合成ＡＡＶ血清型に由来するものである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたもの（ｒＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である。

【0302】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックスまたはデンドリマーを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組換え発現系である。本明細書で使用される場合、「組換え発現系」という用語は、組換えによって形成されたある特定の遺伝子材料を発現させるための遺伝子構築物を指す。

【0303】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、発現制御エレメントを含む。「発現制御エレメント」は、本明細書で使用される場合、遺伝子などのコード配列の発現を調節する任意の配列を指す。例示的な発現制御エレメントとしては、これだけに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、マイクロＲＮＡ、転写後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル配列、およびイントロンが挙げられる。発現制御エレメントは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節性タンパク質および分子が結合することができる遺伝子エレメントを含有し得る。一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、組織特異的である。非限定的な例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＣＡＧ、Ｃｂｈ、ＥＦ−１ａ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＵＣＯＥ、ｈＡＡＴ、ＴＢＧ、デスミン、ＭＣＫ、Ｃ５−１２、ＮＳＥ、シナプシン、ＰＤＧＦ、ＭｅｃＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ｎβ２、ＰＰＥ、ＥＮＫ、ＥＡＡＴ２、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、およびＵ６プロモーターが挙げられる。「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して、転写の尤度または頻度を増加させることができるＤＮＡの領域である。非限定的な例示的なエンハンサーおよび転写後調節エレメントとしては、ＣＭＶエンハンサーおよびＷＰＲＥが挙げられる。

【0304】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、「マルチシストロン性」または「ポリシストロン性」または「バイシストロン性」または「トリシストロン性」構築物の構成（configuration）のためのＩＲＥＳまたは２Ａペプチド部位を含む、すなわち、二重もしくは三重もしくは多重のコード領域またはエクソンなどのベクターエレメントを有し、したがって、単一の構築物から、ｍＲＮＡから２つまたはそれよりも多くのタンパク質を発現させる能力を有する。マルチシストロン性ベクターは、同じｍＲＮＡから２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質を同時に発現させる。マルチシストロン性配置を構築するために最も広く使用されている２つの戦略は、ＩＲＥＳまたは２Ａ自己切断部位を使用することである。「ＩＲＥＳ」は、ポリシストロニックベクター構築物に使用される、ウイルス、原核生物、または真核生物を起源とする配列内リボソーム進入部位またはその一部を指す。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、キャップ依存的に翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。「自己切断ペプチド」または「自己切断ペプチドをコードする配列」または「２Ａ自己切断部位」という用語は、リボソームスキッピングを促進するため、したがって、単一のプロモーターから２つのポリペプチドを生成するための部位を組み入れるためにベクター構築物内に使用される連結配列を指す。そのような自己切断ペプチドとしては、これだけに限定することなく、Ｔ２Ａペプチド、およびＰ２Ａペプチドまたは自己切断ペプチドをコードする配列が挙げられる。

【0305】

一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス／レトロウイルスキメラベクター、単純ヘルペスウイルスＩもしくはＩＩベクター、パルボウイルスベクター、細網内皮症ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または２つまたはそれよりも多くのウイルスベクターの好都合な側面が組み入れられた任意のハイブリッドもしくはキメラベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結した１つまたは複数の発現制御エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは低毒性を有する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは宿主ゲノム内に組み入れられず、それにより、挿入変異誘発が引き起こされる確率が低くなる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、４．５ｋｂから４．７５ｋｂまでの範囲の総ポリヌクレオチドをコードし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１ベクター、改変ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、改変ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、改変ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、改変ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、改変ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、改変ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、改変ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、および改変ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターおよび任意の組合せまたはその等価物を挙げることができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子プラスミドベクターならびに関連するプラスミド（例えば、パッケージングプラスミド、ｒｅｖ発現プラスミド、エンベローププラスミド）と併せた導入遺伝子プラスミドベクターならびにウイルスまたはウイルス様侵入機構によって外因性核酸を細胞に導入することができるレンチウイルスに基づく粒子を指し得る。レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知である（例えば、Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin HeidelbergおよびDurand et al. (2011) Viruses 3 (2): 132-159 doi: 10.3390/v3020132を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なレンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＳＭ）ベクター、改変スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＳＭ）ベクター、アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＡＧＭ）ベクター、改変アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＡＧＭ）ベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、改変ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、改変ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、改変ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、改変ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、または改変ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を挙げることができる。

【0306】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはリポプレックス、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、ポリプレックスまたはデンドリマーを含むまたはそれからなる。
核酸

【0307】

本明細書に記載の遺伝子移入および発現技法における使用のための、本明細書に開示される融合タンパク質をコードする核酸配列が本明細書に提示される。必ずしも明記されていないが、本明細書に提示される配列を使用して、同じ生物学的性質を有するタンパク質を生じさせる発現産物ならびに実質的に同一の配列をもたらすことができることが理解されるべきである。これらの「生物学的に等価の」または「生物活性ある」または「等価の」ポリペプチドは、本明細書に記載の等価のポリヌクレオチドによってコードされる。これらは、デフォルトの条件下で実行される配列同一性方法を使用して比較した場合に、参照ポリペプチドに対して少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％あるいは少なくとも９８％同一の一次アミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態の例として特定のポリペプチド配列が提示されている。同様の電荷を有する代替のアミノ酸を用いたアミノ酸への配列の改変。さらに、等価のポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである、またはポリペプチドに関しては、参照コードポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。あるいは、等価のポリペプチドまたはタンパク質は、等価のポリヌクレオチドから発現されるものである。

【0308】

本明細書に開示される核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）は、当技術分野で周知の技法であるコドン最適化がなされたものであり得る。本明細書に開示される一部の実施形態では、例えば配列番号４６（Ｃａｓ１３ｄ）などの例示的なＣａｓ配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。コドン最適化は、異なる細胞では特定のコドンの使用が異なるという事実を指す。このコドンの偏りは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的な存在量の偏りに対応する。配列内のコドンを対応するｔＲＮＡの相対的な存在量と釣り合うように変更することにより、発現を増加させることが可能である。対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが分かっているコドンを故意に選択することによって発現を低減させることも可能である。哺乳動物細胞に関して、ならびに種々の他の生物体に関してコドン使用表が当技術分野で公知である。遺伝暗号に基づいて、例えばＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を生成することができる。一部の実施形態では、そのような配列を、例えば、Ｃａｓタンパク質を発現する宿主細胞または開示されている方法が実施される細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞など）を使用するなど、宿主または標的細胞における発現に関して最適化する。特定の種についてのコドンの選好およびコドン使用表を使用して、その特定の種のコドン使用選好性（codon usage preference）を活用する、Ｃａｓタンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば、その対応する野生型タンパク質に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有するタンパク質をコードするものなど）を操作することができる。例えば、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質を、目的の特定の生物体によって優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。一実施例では、Ｃａｓ核酸配列は、例えば、その対応する野生型または起源核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するものなど、ヒト細胞における発現に関して最適化されたものである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣａｓタンパク質（ベクターの一部であり得る）をコードする単離された核酸分子は、真核細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列、またはヒト細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列を含む。一実施形態では、そのようなコドン最適化されたＣａｓコード配列は、その対応する野生型または起源配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有する。別の実施形態では、真核細胞のコドン最適化された核酸配列は、その対応する野生型または起源タンパク質に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有するＣａｓタンパク質をコードする。別の実施形態では、配列は異なるが同じＣａｓタンパク質配列をコードする核酸などの、機能的に等価の核酸を含有する種々のクローンを常套的に生成することができる。コード配列内のサイレント変異は、１つよりも多くのコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る遺伝暗号の縮退（すなわち、重複性）に起因する。したがって、例えば、ロイシンはＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされ得る；セリンはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされ得る；アスパラギンはＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされ得る；アスパラギン酸はＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされ得る；システインはＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされ得る；アラニンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされ得る；グルタミンはＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされ得る；チロシンはＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされ得る；およびイソロイシンはＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされ得る。標準の遺伝暗号を示す表は、種々の供給源に見いだすことができる（例えば、Stryer, 1988, Biochemistry,3.sup.rd Edition, W.H. 5 Freeman and Co., NYを参照されたい）。

【0309】

「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式で存在する。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範囲にわたるプロセスのステップを構成し得る。

【0310】

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約２５℃〜約３７℃；ハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約０％〜約２５％；および洗浄溶液、約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣが挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約４０℃〜約５０℃；緩衝液濃度、約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約３０％〜約５０％；および洗浄溶液、約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣが挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、インキュベーション温度、約５５℃〜約６８℃；緩衝液濃度、約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約５５％〜約７５％；および洗浄溶液、約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は５分間から２４時間までであり、１回、２回、またはそれよりも多くの洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１分間、２分間、または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用したＳＳＣの等価物を使用することができることが理解される。

【0311】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めている場合、その分子は、その位置において相同である。配列間の相同性程度は、それらの配列が共有するマッチするまたは相同な位置の数に応じる。「関連しない」または「非相同的」配列は、本発明の配列の１つと４０％未満の同一性あるいは２５％未満の同一性を共有する。

【0312】

細胞
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、原核細胞である。

【0313】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、真核細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、生殖細胞系列細胞である。一部の実施形態では、本開示の生殖細胞系列細胞は、ヒト細胞ではない。

【0314】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、胚性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の胚性幹細胞は、ヒト細胞ではない。一部の実施形態では、本開示の細胞は、複能性幹細胞または多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、成体幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。

【0315】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、Ｔリンパ球である（本明細書ではＴ細胞とも称される）。本開示の例示的なＴ細胞としては、これだけに限定されないが、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマデルタＴ細胞が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、Ｂリンパ球である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、抗原提示細胞である。

【0316】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、筋芽細胞または筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞または平滑筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、横紋筋細胞である。

【0317】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、上皮細胞である。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方上皮細胞、円柱上皮細胞、重層上皮細胞、多列円柱上皮細胞または移行上皮細胞を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、松果体、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、アポクリン腺、ホロクリン腺、部分分泌腺、漿液腺、粘液腺および脂腺を含めた腺を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、肺、脾臓、胃、膵臓、膀胱、腸、腎臓、胆嚢、肝臓、喉頭または咽頭を含めた器官の外表面と接触している。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、血管または静脈の外表面と接触している。

【0318】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、神経細胞である。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、中枢神経系のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、脳または脊髄のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、網膜のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、脳神経または視神経のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、末梢神経系のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、神経膠細胞またはグリア細胞である。一部の実施形態では、本開示のグリア細胞は、これだけに限定されないが、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、およびミクログリアを含めた、中枢神経系のグリア細胞である。一部の実施形態では、本開示のグリア細胞は、これだけに限定されないが、シュワン細胞およびサテライト細胞を含めた、末梢神経系のグリア細胞である。

【0319】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、初代細胞である。

【0320】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、培養細胞である。

【0321】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。

【0322】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、自家細胞または同種異系細胞である。

【0323】

使用方法
本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子を、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合性タンパク質またはその融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性がもたらされるのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。

【0324】

本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子を、ガイドＲＮＡまたは融合タンパク質（またはそのＲＮＡ結合性部分）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性がもたらされるのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。

【0325】

本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合性タンパク質またはその融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性がもたらされるのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

【0326】

本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合性タンパク質またはその融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性がもたらされるのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

【0327】

本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子をＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、ＲＮＡ結合性タンパク質またはその融合タンパク質またはその一部によりＲＮＡ分子の切断が誘導され、また、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性がもたらされる、方法を提供する。

【0328】

本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子をＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、ＲＮＡ結合性タンパク質またはその融合タンパク質（またはその一部）によりＲＮＡ分子の切断が誘導され、また、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性がもたらされる、方法を提供する。

【0329】

本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変し、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性をもたらす方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、ＲＮＡ結合性タンパク質またはその融合タンパク質によりＲＮＡ分子の切断が誘導される、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡおよび本開示のＲＮＡ結合性タンパク質および本開示の変異型非切断型ＦａｓＬを含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

【0330】

本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、ＲＮＡ結合性タンパク質またはその融合タンパク質またはその一部によりＲＮＡ分子の切断が誘導される、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡ配列または単一ガイドＲＮＡおよび本開示のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列および本開示の変異型非切断型ＦａｓＬをコードする配列を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

【0331】

本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含む方法を提供する。

【0332】

本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含み、組成物が、本開示のガイドＲＮＡ配列、本開示のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列、および本開示の変異型非切断型ＦａｓＬをコードする配列を含むベクターを含み、組成物により本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルが改変され、また、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的な免疫遮蔽活性がもたらされる、方法を提供する。

【0333】

本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含み、組成物が、本開示の組成物を含む組成物を含むベクターを含む、方法を提供する。

【0334】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、遺伝子疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子疾患または障害は、単一遺伝子疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、常染色体優性疾患もしくは障害、常染色体劣性疾患もしくは障害、Ｘ染色体連鎖（Ｘ連鎖）疾患もしくは障害、Ｘ連鎖優性疾患もしくは障害、Ｘ連鎖劣性疾患もしくは障害、Ｙ連鎖疾患もしくは障害、またはミトコンドリア病もしくは障害である。一部の実施形態では、遺伝子疾患または障害は、多遺伝子疾患または障害である。一部の実施形態では、遺伝子疾患または障害は、多遺伝子疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、ハンチントン病、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、マルファン症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、遺伝性多発性外骨腫症、フォン・ヴィルブランド病、および急性間欠性ポルフィリン症を含めた常染色体優性疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、白皮症、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、脊髄性筋萎縮症、およびロバーツ症候群を含めた常染色体劣性疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、レット症候群、および血友病Ａを含めたＸ連鎖疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、レーベル遺伝性視神経症を含めたミトコンドリア障害である。

【0335】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、免疫疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、免疫疾患または障害は、これだけに限定されないが、Ｂ細胞欠損症、Ｔ細胞欠損症、好中球減少症、無脾症、補体欠損症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および医療介入に起因する免疫不全（医学的治療の故意の作用または有害作用としての免疫抑制）を含めた免疫不全症または障害である。一部の実施形態では、免疫疾患または障害は、これだけに限定されないが、アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索＆ニューロンニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）もしくは好酸性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合性クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹もしくは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、ライム病 慢性、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）もしくはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病、またはヴェグナー肉芽腫症を含めた自己免疫疾患または障害である。

【0336】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、炎症性疾患または障害が挙げられる。

【0337】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、代謝性疾患または障害が挙げられる。

【0338】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、変性または進行性疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、変性または進行性疾患または障害として、これだけに限定されないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、および老化が挙げられる。

【0339】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、感染性疾患または障害が挙げられる。

【0340】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、小児もしくは発達疾患または障害が挙げられる。

【0341】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、循環器の疾患または障害が挙げられる。

【0342】

本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、増殖性疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、増殖性疾患または障害は、がんである。一部の実施形態では、がんとして、これだけに限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（リンパ腫）、ＣＮＳ原発リンパ腫（リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、消化管カルチノイド腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系（脳がん）、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、癌、心臓（Ｃａｒｄｉａｃ）（心臓（Ｈｅａｒｔ））腫瘍、胚芽腫、胚細胞性腫瘍、ＣＮＳ原発リンパ腫、子宮頸がん、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、胚芽腫、子宮体がん（子宮がん）、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫（頭頸部がん））、ユーイング肉腫（骨がん）、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、眼がん、小児期眼内黒色腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨の悪性線維性組織球腫、および骨肉腫、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、小児期消化管間質腫瘍、胚細胞性腫瘍、小児期頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、卵巣胚細胞性腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛疾患、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）がん、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん（頭頸部がん）、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、腎臓（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭がん（頭頸部がん）、白血病、口唇・口腔がん（頭頸部がん）、肝がん、肺がん（非小細胞および小細胞）、小児期肺がん、リンパ腫、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌（皮膚がん）、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん（頭頸部がん）、ＮＵＴ遺伝子の変化を伴う正中線癌、口のがん（Mouth Cancer）（頭頸部がん）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔・副鼻腔がん（頭頸部がん）、鼻咽頭がん（頭頸部がん）、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口のがん（Oral Cancer）、口唇・口腔がんおよび中咽頭がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵がん、膵臓神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん（頭頸部がん）、褐色細胞腫、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳がん、中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、再発性がん、腎細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児期（軟部組織肉腫）、唾液腺がん（頭頸部がん）、肉腫、小児期横紋筋肉腫（軟部組織肉腫）、小児期血管腫瘍（軟部組織肉腫）、ユーイング肉腫（骨がん）、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、骨肉腫（骨がん）、子宮肉腫、セザリー症候群、リンパ腫、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、皮膚の扁平上皮癌、扁平上皮性頸部がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん（頭頸部がん）、鼻咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、腎細胞がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍（軟部組織肉腫）、外陰がん、ウィルムス腫瘍ならびに他の小児期腎腫瘍が挙げられる。

【0343】

本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、疾患または障害の診断を受けている。一部の実施形態では、本開示の対象は、疾患または障害の徴候または症状を少なくとも１つ示している。一部の実施形態では、対象は、疾患または障害が発生するリスクが予測されるバイオマーカーを有する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子変異である。

【0344】

本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、女性である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、男性である。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹを有する。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹおよび第３の染色体、ＸまたはＹのいずれかを有する。

【0345】

本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、新生児、乳児、小児、成人、年配成人、または高齢成人である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１日齢、２日齢、３日齢、４日齢、５日齢、６日齢、７日齢、８日齢、９日齢、１０日齢、１１日齢、１２日齢、１３日齢、１４日齢、１５日齢、１６日齢、１７日齢、１８日齢、１９日齢、２０日齢、２１日齢、２２日齢、２３日齢、２４日齢、２５日齢、２６日齢、２７日齢、２８日齢、２９日齢、３０日齢または３１日齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１カ月齢、２カ月齢、３カ月齢、４カ月齢、５カ月齢、６カ月齢、７カ月齢、８カ月齢、９カ月齢、１０カ月齢、１１カ月齢または１２カ月齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、１００歳またはその間の任意の年齢または部分年齢である。

【0346】

本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、本開示の対象は、非ヒト哺乳動物である。

【0347】

本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、ヒトである。

【0348】

本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、単回用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、少なくとも１用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、１用量または複数用量の本開示の組成物を含む。

【0349】

本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状を排除するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。

【0350】

本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害を排除するものである。

【0351】

本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を防止するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を遅延させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、対象の予後を改善するものである。

【0352】

本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に全身的に投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に静脈内経路によって投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に注射または注入によって投与される。

【0353】

本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に局所的に投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に骨内、眼内、脳脊髄内または脊髄内経路によって投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、中枢神経系の脳脊髄液に直接投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、眼の組織または流体に直接投与され、眼構造の外側では生物学的利用能を有さない。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に注射または注入によって投与される。

【0354】

番号を付した実施形態
１．
（ａ）非自己目的ポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする配列、および
（ｂ）非切断型Ｆａｓリガンド（ＦＡＳＬ）をコードする配列
を含む組成物であって、
非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＰＯＩの発現に特異的なＭＨＣ媒介性免疫原性ペプチドおよびヘルパーＴ細胞が排除される、組成物。

【0355】

２．
（ａ）非自己ポリペプチドをコードする配列、および
（ｂ）非切断型ＦＡＳＬをコードする配列
を含む組成物であって、
非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞が選択的に排除され、ペプチドが、非自己ポリペプチドに由来するものである、組成物。

【0356】

３．
（ａ）治療用ポリペプチドをコードする配列、および
（ｂ）非切断型ＦＡＳＬをコードする配列
を含む組成物であって、
非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞が選択的に排除され、ペプチドが、治療用ポリペプチドに由来するものである、組成物。

【0357】

４．
ＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする配列、ならびに
（ａ）ヒトポリペプチドをコードする配列、および
（ｂ）非切断型ＦＡＳＬをコードする配列
を含む組成物
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物であって、
非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞が選択的に排除され、ペプチドが、ヒトポリペプチドおよび／またはＡＡＶカプシドポリペプチドに由来するものである、組成物。

【0358】

５．ヒトポリペプチドが自己ポリペプチドであり、ペプチドがＡＡＶカプシドポリペプチドに由来するものである、実施形態４に記載の組成物。

【0359】

６．
（ａ）ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む配列、
（ｂ）ＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列、および
（ｃ）非切断型ＦＡＳＬをコードする配列
を含む組成物であって、

【0360】

非切断型ＦＡＳＬの発現により、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するＴ細胞が選択的に排除され、ペプチドが、ＲＮＡ結合性ポリペプチドに由来するものである、組成物。

【0361】

７．（ａ）の配列および（ｂ）の配列がベクターに含まれる、実施形態１から５までのいずれか１つに記載の組成物。

【0362】

８．（ａ）の配列、（ｂ）の配列および（ｃ）の配列がベクターに含まれる、実施形態６に記載の組成物。

【0363】

９．ベクターが発現ベクターである、実施形態７または８に記載の組成物。

【0364】

１０．発現ベクターがプラスミドである、実施形態９に記載の組成物。

【0365】

１１．（ａ）の配列の発現がプロモーターにより駆動される、実施形態１から１０までのいずれか１つに記載の組成物。

【0366】

１２．（ｂ）の配列の発現がプロモーターにより駆動される、実施形態１から５までおよび７から１１までのいずれか１つに記載の組成物。

【0367】

１３．（ａ）の配列の発現が第１のプロモーターにより駆動され、（ｂ）の配列の発現が第２のプロモーターにより駆動される、実施形態６に記載の組成物。

【0368】

１４．（ｂ）の配列および（ｃ）の配列の発現が第２のプロモーターにより駆動される、実施形態１３に記載の組成物。

【0369】

１５．（ａ）の配列の発現が第１のプロモーターにより駆動され、（ｂ）の配列の発現が第２のプロモーターにより駆動される、実施形態１１に記載の組成物。

【0370】

１６．プロモーターをコードする１つまたは複数の配列が、Ｕ６プロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、実施形態１から１５までのいずれか１つに記載の組成物。

【0371】

１７．プロモーターをコードする１つまたは複数の配列が、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することができるプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、実施形態１から１５までのいずれか１つに記載の組成物。

【0372】

１８．プロモーターをコードする配列が、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リシンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、実施形態１７に記載の組成物。

【0373】

１９．プロモーターをコードする配列が、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、実施形態１７に記載の組成物。

【0374】

２０．送達ベクターに含まれる、実施形態１から３までまたは６から１９までのいずれか１つに記載の組成物。

【0375】

２１．送達ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態２０に記載の組成物。

【0376】

２２．ＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２であるＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、実施形態２０に記載の組成物。

【0377】

２３．ＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２であるＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、実施形態４または５に記載の組成物。

【0378】

２４．（ａ）の配列または（ｂ）の配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列または自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む、実施形態１から５まで、７から１４までまたは１６から２３までのいずれか１つに記載の組成物。

【0379】

２５．（ｂ）の配列または（ｃ）の配列が、ＩＲＥＳをコードする配列または自己切断ペプチドをコードする配列をさらに含む、実施形態６に記載の組成物。

【0380】

２６．ＩＲＥＳをコードする配列または自己切断ペプチドをコードする配列がベクターに含まれる、実施形態８から２３までのいずれか１つに記載の組成物。

【0381】

２７．ＩＲＥＳをコードする配列または自己切断ペプチドをコードする配列が、（ａ）の配列と（ｂ）の配列の間に位置する、実施形態２４または２６に記載の組成物。

【0382】

２８．ＩＲＥＳをコードする配列または自己切断ペプチドをコードする配列が、（ｂ）の配列と（ｃ）の配列の間に位置する、実施形態２５または２６に記載の組成物。

【0383】

２９．自己切断ペプチドが、２Ａ自己切断ペプチドを含む、実施形態２４から２８までのいずれか１つに記載の組成物。

【0384】

３０．非切断型ＦＡＳＬが、メタロプロテイナーゼ切断部位に変異を含む、実施形態１から２９までのいずれか１つに記載の組成物。

【0385】

３１．メタロプロテイナーゼ切断部位が、アミノ酸配列ＥＬＡＥＬＲを含む、実施形態３０に記載の組成物。

【0386】

３２．変異が、アミノ酸配列ＥＬＡＥＬＲの置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位のうちの１つまたは複数を含む、実施形態３１に記載の組成物。

【0387】

３３．非切断型ＦＡＳＬが、

【化158】

[この文献は図面を表示できません]

（配列中、Ｘ１はグルタミン酸（Ｅ）ではない、Ｘ２はロイシン（Ｌ）ではない、Ｘ３は、アラニン（Ａ）ではない、Ｘ４はグルタミン酸（Ｅ）ではない、Ｘ５は、ロイシン（Ｌ）ではない、またはＸ６はアルギニン（Ｒ）ではない）
のアミノ酸配列を含む、実施形態３０から３２までのいずれか１つに記載の組成物。

【0388】

３４．非切断型ＦＡＳＬが、

【化159】

[この文献は図面を表示できません]

（配列中、Ｘ１はグルタミン酸（Ｅ）ではなく、Ｘ２はロイシン（Ｌ）ではなく、Ｘ３は、アラニン（Ａ）ではなく、Ｘ４はグルタミン酸（Ｅ）ではなく、Ｘ５は、ロイシン（Ｌ）ではなく、かつ、Ｘ６はアルギニン（Ｒ）ではない）
のアミノ酸配列を含む、実施形態３０から３２までのいずれか１つに記載の組成物。

【0389】

３５．ｇＲＮＡを含む配列が、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む、実施形態６に記載の組成物。

【0390】

３６．スペーサー配列が、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する、実施形態３５に記載の組成物。

【0391】

３７．スペーサー配列が、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する、実施形態３５に記載の組成物。

【0392】

３８．スペーサー配列が、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態３５から３７までのいずれか１つに記載の組成物。

【0393】

３９．スペーサー配列が、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態３５から３７までのいずれか１つに記載の組成物。

【0394】

４０．スペーサー配列が、配列ＵＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＵＣＣＣＣＣＡＡＡ（配列番号１）、ＧＵＵＵＧＧＧＧＧＡＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＡ（配列番号２）、ＣＣＣＵＣＡＣＵＧＣＵＧＧＧＧＡＧＵＣＣ（配列番号３）、ＧＧＡＣＵＣＣＣＣＡＧＣＡＧＵＧＡＧＧＧ（配列番号４）、ＧＣＡＡＣＵＧＧＡＵＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧ（配列番号５）、ＧＣＡＧＣＡＡＡＵＵＧＡＵＣＣＡＧＵＵＧＣ（配列番号６）、ＧＣＡＵＵＣＵＵＡＵＣＵＧＧＵＣＡＧＵＧＣ（配列番号７）、ＧＣＡＣＵＧＡＣＣＡＧＡＵＡＡＧＡＡＵＧ（配列番号８）、ＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号９）、ＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧ（配列番号１０）、ＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣ（配列番号１１）、またはＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣ（配列番号１２）、ＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧ（配列番号７４）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧ（配列番号７５）、ＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧ（配列番号７６）、ＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣ（配列番号７７）、ＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣ（配列番号７８）、ＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧ（配列番号７９）を含む、実施形態３９に記載の組成物。

【0395】

４１．ｇＲＮＡを含む配列が、ＲＮＡ結合性タンパク質に特異的に結合する足場配列をさらに含む、実施形態６、１１、１３から１４まで、１７から２３まで、２５、および２８から４０までのいずれか１つに記載の組成物。

【0396】

４２．足場配列が、ステムループ構造を含む、実施形態４１に記載の組成物。

【0397】

４３．足場配列が、９０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態４１または４２に記載の組成物。

【0398】

４４．足場配列が、９３ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態４１または４２に記載の組成物。

【0399】

４５．足場配列が、配列ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３）を含む、実施形態４４に記載の組成物。

【0400】

４６．スペーサー配列が、配列ＧＵＧＡＵＡＡＧＵＧＧＡＡＵＧＣＣＡＵＧ（配列番号１４）、ＣＵＧＧＵＧＡＡＣＵＵＣＣＧＡＵＡＧＵＧ（配列番号１５）、またはＧＡＧＡＴＡＴＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号１６）を含む、実施形態４５に記載の組成物。

【0401】

４７．足場配列が、８５ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態４１または４２に記載の組成物。

【0402】

４８．足場配列が、配列ＧＧＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ（配列番号１７）を含む、実施形態４７に記載の組成物。

【0403】

４９．スペーサー配列が、配列ＣＵＧ（配列番号１８）、ＣＣＵＧ（配列番号１９）、ＣＡＧ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号８１）またはこれらの任意の組合せの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのリピートの配列を含む、実施形態４８に記載の組成物。

【0404】

５０．足場配列が、配列ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号８２）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号８３）を含む、実施形態４１または４２に記載の組成物。

【0405】

５１．ｇＲＮＡが、ＲＮＡ分子内の第２の配列に結合しないまたは選択的には結合しない、実施形態６、１１、１３から１４まで、１７から２３まで、２５、および２８から５０までのいずれか１つに記載の組成物。

【0406】

５２．ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームが、ＲＮＡ分子を含む、実施形態６、１１、１３から１４まで、１７から２３まで、２５、および２８から５１までのいずれか１つに記載の組成物。

【0407】

５３．ＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、ＰＵＦ、Ｐｕｍｉｌｉｏ、およびＰＰＲからなる群から選択される、実施形態６、１１、１３から１４まで、１７から２３まで、２５、および２８から５２までのいずれか１つに記載の組成物。

【0408】

５４．融合タンパク質が、ＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む、実施形態５３に記載の組成物。

【0409】

５５．融合タンパク質が、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列および第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドも第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドも有意なＤＮＡヌクレアーゼ活性を含まず、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドと第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが同一ではなく、かつ、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、実施形態５４に記載の組成物。

【0410】

５６．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む、実施形態５５に記載の組成物。

【0411】

５７．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である、実施形態５６に記載の組成物。

【0412】

５８．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む、実施形態５７に記載の組成物。

【0413】

５９．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である、実施形態５６に記載の組成物。

【0414】

６０．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む、実施形態５９に記載の組成物。

【0415】

６１．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である、実施形態５６に記載の組成物。

【0416】

６２．

【0417】

第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む、実施形態６１に記載の組成物。

【0418】

６３．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、実施形態５６から６２までのいずれか１つに記載の組成物。

【0419】

６４．ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性が、低下しているまたは阻害されている、実施形態６３に記載の組成物。

【0420】

６５．ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性が、増加しているまたは誘導されている、実施形態６３に記載の組成物。

【0421】

６６．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性が阻害されている、実施形態５６から６３までのいずれか１つに記載の組成物。

【0422】

６７．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、変異を含む、実施形態５６から６６までのいずれか１つに記載の組成物。

【0423】

６８．変異がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインに含まれる、実施形態６７に記載の組成物。

【0424】

６９．変異が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する、実施形態６７または６８に記載の組成物。

【0425】

７０．変異が、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む、実施形態６７から６９までのいずれか１つに記載の組成物。

【0426】

７１．変異が、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む、実施形態６７から６９までのいずれか１つに記載の組成物。

【0427】

７２．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む、実施形態５５に記載の組成物。

【0428】

７３．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む、実施形態７２に記載の組成物。

【0429】

７４．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない、実施形態５５から７３までのいずれか１つに記載の組成物。

【0430】

７５．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、多量体複合体の単量体ではない、実施形態５５から７４までのいずれか１つに記載の組成物。

【0431】

７６．多量体タンパク質複合体が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質を含まない、実施形態５５から７５までのいずれか１つに記載の組成物。

【0432】

７７．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する、実施形態５５から７６までのいずれか１つに記載の組成物。

【0433】

７８．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない、実施形態５５から７７までのいずれか１つに記載の組成物。

【0434】

７９．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まず、またそれに選択的に結合しない、実施形態５５から７８までのいずれか１つに記載の組成物。

【0435】

８０．ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームが、ＲＮＡ分子を含む、実施形態５５から７９までのいずれか１つに記載の組成物。

【0436】

８１．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、端点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む、実施形態５５から８０までのいずれか１つに記載の組成物。

【0437】

８２．第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む、実施形態５５から８１までのいずれか１つに記載の組成物。

【0438】

８３．核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する、実施形態８２に記載の組成物。

【0439】

８４．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃ末端にＮＬＳを含む、実施形態８２に記載の組成物。

【0440】

８５．第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列が、第１のＮＬＳをコードする第１の配列および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む、実施形態５５から８１までのいずれか１つに記載の組成物。

【0441】

８６．第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳをコードする配列が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する、実施形態８５に記載の組成物。

【0442】

８７．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳを含む、実施形態８５に記載の組成物。

【0443】

８８．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる、実施形態５５から８７までのいずれか１つに記載の組成物。

【0444】

８９．第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列が、ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる、実施形態８８に記載の組成物。

【実施例】

【0445】

（実施例１：非自己治療用導入遺伝子に対する適応免疫応答の防止）
非自己治療用導入遺伝子を標的組織にウイルス手段または非ウイルス手段によって送達する。この治療薬に対する適応免疫応答を防止するために、変異体ＦＡＳＬ（ｍＦＡＳＬ）をコードするＤＮＡを伴うベクターをＡＡＶによって共送達する。ｍＦＡＳＬ発現は、ＴＮＦαまたはＩＬ−６シグナル伝達により活性化されるプロモーターによって駆動される（図３Ａ）。このｍＦＡＳＬの調節された発現では、活性化Ｔ細胞の存在下でのみｍＦＡＳＬの発現が誘導される。次に、Ｔ細胞が、活性化された場合にのみｍＦＡＳＬ媒介性死に対して感受性になる。２種のＡＡＶ−９導入ベクター、１）Ｃａｓ１３ｄおよびガイドＲＮＡをコードするもの、および２）ＩＬ−６により調節されるプロモーターによって駆動されるｍＦＡＳＬをコードするものを作製した。以下のＩＬ−６により調節されるプロモーターを比較した：

【0446】

ｉ．ＣＡＬＣＢプロモーター：

【化160-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化160-2】

[この文献は図面を表示できません]

ｉｉ．ＢＣＡＲ３プロモーター：

【化161-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化161-2】

[この文献は図面を表示できません]

ｉｉｉ．ＣＣＡＲ６プロモーター：

【化162-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化162-2】

[この文献は図面を表示できません]

ｉｖ．ＣＯＬ６Ａ３プロモーター：

【化163-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化163-2】

[この文献は図面を表示できません]

ｖ．ＣＸＣＲ５プロモーター：

【化164-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化164-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0447】

ＡＡＶ−９調製物を標準の技法（三重トランスフェクション法）に従って生成し、ＩＤＸ勾配超遠心分離によって精製した。ＡＡＶをＰＢＳに対する透析後にｑＰＣＲによって滴定した。次に、上記の３つのＡＡＶバージョンのうち１つを野生型ＦＶＢ系統マウスの前脛骨筋に注射し（総体積３０μＬ、２＊１０^１０ｖｇ、１＊１０^１１ｖｇまたは４＊１０^１２ｖｇ）、その後、毎日の臨床的観察に供する（ベクター１とベクター２、３、またはＰＢＳのいずれかの対側性注射。各組合せ、１／２、１／３、１／ＰＢＳについてマウス４匹）。注射の１週間後、４週間後、および６週間後にマウスを屠殺する。各動物について、ＲＮＡ／タンパク質評価および遺伝子発現の変化のために前脛骨筋（注射部位）の近位半分、心臓、脾臓、肝臓（代表的な部分、すなわち、葉の一片）および腎臓を採取し、個別に（対の器官以外）クライオバイアルに入れ、液体窒素中で急速冷凍する。前脛骨筋の他方の半分はＯＣＴに包埋し、凍結させる。前脛骨筋を横断的に切断する。

【0448】

凍結組織からのＲＮＡ単離を、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコールに従って行う。ＲＮＡの質および濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して推定する。ｃＤＮＡ調製を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用し、ランダムプライマーを用い、製造者のプロトコールに従って行う。ｑＰＣＲを行って、３つのマウス群（ベクター１／２、１／３、１／ＰＢＳ）の間で組織におけるＣａｓ９のレベルを評価する。

【0449】

切片作製した前脛骨筋を用いた免疫蛍光法を行って、免疫細胞の浸潤を測定する（ＣＤ３およびＣＤ４５染色）。

【0450】

（実施例２：非自己治療用導入遺伝子に対する適応免疫応答の防止）
非自己治療用導入遺伝子を標的組織にウイルス手段または非ウイルス手段によって送達する。この治療薬に対する適応免疫応答を防止するために、変異体ＦＡＳＬ（ｍＦＡＳＬ）をコードするＤＮＡを伴うベクターをウイルス手段または非ウイルス手段によって共送達する。ｍＦＡＳＬ ｍＲＮＡは、ＦＡＳＬのコード配列を分割するイントロンを含有する（図３Ｂ）。このイントロンには、隣接するエクソンのスプライシングを妨げるイントロンと部分的に相補的な単一ガイドＲＮＡを伴うＲＮＡ結合性タンパク質Ｃａｓ１３ｄが結合している。Ｃａｓ１３ｄガイドＲＮＡは、発現がＴＮＦαまたはＩＬ−６シグナル伝達によって調節される遺伝子と完全に相補的であり、したがって、ＴＮＦαまたはＩＬ−６シグナル伝達の際にｍＦＡＳＬスプライシングが遮断から解放される。ガイドＲＮＡが以下の遺伝子にコードされるｍＲＮＡと完全に相補的である系を構築した：ＢＣＡＲ３、ＣＡＬＣＢ、ＣＣＲ６、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＲ５、ＤＨＲＳ９、ＦＬＴ１、ＦＮＢＰ１Ｌ、ＦＮＤＣ９、ＧＢＰ４、ＧＰＲ８７、ＧＺＭＢ、ＨＯＰＸ、ＨＳＤ１１Ｂ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＮＬ１、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２４、ＫＣＮＫ１８、ＭＡＦ、ＮＡＰＳＡ、ＰＡＬＬＤ、ＰＲＧ４、ＰＳＤ３、ＲＯＲＡ、ＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＳＨＺ２。２種のＡＡＶ−９導入ベクター、１）Ｃａｓ１３ｄおよびガイドＲＮＡをコードするもの、ならびに２）イントロンが介在するｍＦＡＳＬ構築物をコードするものを作製した。

【0451】

ＡＡＶ−９調製物を標準の技法（三重トランスフェクション法）に従って生成し、ＩＤＸ勾配超遠心分離によって精製した。ＡＡＶをＰＢＳに対する透析後にｑＰＣＲによって滴定した。次に、操作されたｍＦＡＳＬ構築物およびＣａｓ１３ｄを含有するベクターと共に、非自己導入遺伝子をコードするＡＡＶを、野生型ＦＶＢ系統マウスの前脛骨筋に注射し（総体積３０μＬ、２＊１０^１０ｖｇ、１＊１０^１１ｖｇまたは４＊１０^１２ｖｇ）、その後、毎日の臨床的観察に供した。ベクター１とベクター２、３、またはＰＢＳのいずれかの対側性注射。各組合せ、１／２、１／３、１／ＰＢＳについてマウス４匹）。注射の１週間後、４週間後、および６週間後にマウスを屠殺する。各動物について、ＲＮＡ／タンパク質評価および遺伝子発現の変化のために前脛骨筋（注射部位）の近位半分、心臓、脾臓、肝臓（代表的な部分、すなわち、葉の一片）および腎臓を採取し、個別に（対の器官以外）クライオバイアルに入れ、液体窒素中で急速冷凍する。前脛骨筋の他方の半分はＯＣＴに包埋し、凍結させる。前脛骨筋を横断的に切断する。

【0452】

凍結組織からのＲＮＡ単離を、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコールに従って行う。ＲＮＡの質および濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して推定する。ｃＤＮＡ調製を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用し、ランダムプライマーを用い、製造者のプロトコールに従って行う。ｑＰＣＲを行って、３つのマウス群（ベクター１／２、１／３、１／ＰＢＳ）の間で組織におけるＣａｓ９のレベルを評価する。

【0453】

切片作製した前脛骨筋を用いた免疫蛍光法を行って、免疫細胞の浸潤を測定する（ＣＤ３およびＣＤ４５染色）。

【0454】

（実施例３：筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）の処置）
本開示の組成物を、筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）を処置するために使用し、その場合、治療用導入遺伝子で構成されるＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ系（Ｃａｓ９またはＣａｓ１３ｄ、およびＤＭ１を引き起こすＣＵＧリピートを標的とする対応する単一ガイドＲＮＡ）を患者の筋肉または中枢神経系に送達する。ｍＦＡＳＬが存在することにより、Ｃａｓ９またはＣａｓ１３ｄに特異的であり、処置された細胞に対して潜在的に細胞傷害性であるＴ細胞の排除が引き起こされる。

【0455】

（実施例４：血友病の処置）
本開示の組成物を、血友病を処置するために使用する。血友病を処置するためには、第ＩＸ因子などの分泌型導入遺伝子を使用する。第ＩＸ因子の発現カセットをｍＦＡＳＬと共に有するベクターにより、第ＩＸ因子を発現する細胞に対する適応免疫応答が低減、排除、または防止される。

【0456】

（実施例５：非自己治療用導入遺伝子に対する適応免疫応答の防止と同時のＡＡＶ反復投与に対する免疫応答の防止）
本開示の組成物は、ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質の全部または一部で構成される発現したポリペプチドを含有するＡＡＶベクターを含み得る。ＡＡＶカプシドポリペプチドは、系を送達するために使用する血清型と同一である。このＡＡＶカプシドポリペプチドの同時発現により、ＡＡＶカプシドに特異的なＴ細胞の排除が上記の様式で引き起こされる。これにより、ＡＡＶカプシドに対する細胞性免疫および体液性免疫の両方を調節し得るＴ細胞の枯渇が引き起こされる。これにより、同じＡＡＶ血清型の反復投薬が可能になる。本開示の組成物の非存在下で、および、本開示の組成物の開発前に標準治療を使用すると、ウイルスカプシドに対する適応免疫応答の形成に起因して、個々のＡＡＶ血清型を患者において１回よりも多く使用することができない可能性がある。

【0457】

本開示の組成物は、遺伝子治療の第１の投与の間に不完全な治療的移入が起こる状況または第２の用量が望ましい状況において有用であり得る。この場合、第２の用量を超えたその後の用量が望ましい場合を除き、遺伝子治療の第２の用量にはｍＦＡＳＬおよびＡＡＶカプシドポリペプチドが存在する必要はない。１つの状況は、単回用量で筋肉に形質導入する必要があるウイルスの体積が極端に大きい骨格筋などの大きな器官の処置中であり得る。別の状況は、最初の処置では標的とされる細胞の十分な感染がもたらされない脳または脊椎への複雑な投与方法を伴う処置中であり得る。

【0458】

参照による組込み
あらゆる相互参照されるまたは関連する特許または出願を含めた、本明細書において引用されているあらゆる文書は、明白に排除されるまたは他のやり方で限定される場合を除き、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文書の引用も、それが本明細書に開示されるもしくは特許請求されるあらゆる発明に対して先行技術であること、または、単独で、もしくは任意の他の参考文献（複数可）との任意の組合せで、あらゆるそのような発明を教示、示唆もしくは開示するものであることを認めるものではない。さらに、本文書における用語のいずれかの意味または定義が参照により組み込まれる文書における同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する範囲では、本文書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が支配するものとする。

【0459】

他の実施形態
本開示の特定の実施形態を例示し、記載したが、種々の他の変化および改変を本開示の主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内に入るそのような変化および改変の全てを包含する。

【図1A】

[この文献は図面を表示できません]

【図1B】

[この文献は図面を表示できません]

【図2A】

[この文献は図面を表示できません]

【図2B】

[この文献は図面を表示できません]

【図3A】

[この文献は図面を表示できません]

【図3B】

[この文献は図面を表示できません]

【図3C】

[この文献は図面を表示できません]

【図3D】

[この文献は図面を表示できません]

【図3E】

[この文献は図面を表示できません]

【図3F】

[この文献は図面を表示できません]

【配列表】

2021533803000001.app

【国際調査報告】

[この文献は図面を表示できません]

[この文献は図面を表示できません]