ホーム > 特許ランキング > シティ・オブ・ホープ
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ シティ・オブ・ホープの特許一覧 ▶ カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2022-500070(P2022-500070A)
(43)【公表日】2022年1月4日
(54)【発明の名称】プログラム可能なｓｉＲＮＡ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20211203BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20211203BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20211203BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20211203BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20211203BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20211203BHJP
C12N 5/12 20060101ALN20211203BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 ZZNA
A01K67/027
C12N5/10
A61K31/7105
A61K48/00
A61P43/00 111
C12N5/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
【全頁数】56
(21)【出願番号】特願2021-531622(P2021-531622)
(86)(22)【出願日】2019年8月10日
(85)【翻訳文提出日】2021年4月9日
(86)【国際出願番号】US2019046075
(87)【国際公開番号】WO2020033938
(87)【国際公開日】20200213
(31)【優先権主張番号】62/811,183
(32)【優先日】2019年2月27日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/717,686
(32)【優先日】2018年8月10日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT
(71)【出願人】
【識別番号】598004424
【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ
(71)【出願人】
【識別番号】592102168
【氏名又は名称】カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジー
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100108855
【弁理士】
【氏名又は名称】蔵田 昌俊
(74)【代理人】
【識別番号】100103034
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信久
(74)【代理人】
【識別番号】100179062
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 正
(74)【代理人】
【識別番号】100199565
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 茂
(74)【代理人】
【識別番号】100219542
【弁理士】
【氏名又は名称】大宅 郁治
(74)【代理人】
【識別番号】100153051
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 直樹
(74)【代理人】
【識別番号】100162570
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 早苗
(72)【発明者】
【氏名】ハン、シ−ピン
(72)【発明者】
【氏名】ゴダード、ザ・サード・ウィリアム・エー．
(72)【発明者】
【氏名】ハジサーラフ、マルワ・ベン
(72)【発明者】
【氏名】シェーラー、リサ・ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ロッシ、ジョン・ジェイ．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA05
4C084AA13
4C084NA14
4C084NA15
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086NA14
4C086NA15
4C086ZC41
(57)【要約】
この明細書は、プログラム可能な、条件的に活性化されたｓｉＲＮＡ構築物（Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ）及びそれを作製し、治療的薬剤として使用する方法を開示する。Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、互いに連結したセンサー二重鎖及びＲＮＡｉ二重鎖を形成して単一構造を形成するようにクロスオーバーするセンサー鎖、コア鎖及びガイド鎖を含む。インプット鎖のセンサー鎖への結合の際に、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは活性化され、所望の遺伝子を標的化するＲＮＡｉを放出する。【特許請求の範囲】
【請求項1】
センサー鎖、コア鎖及びガイド鎖を含む、プログラム可能な、条件的に活性化可能なｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ）構築物であって、
（ｉ）前記センサー鎖及び前記コア鎖が、センサー二重鎖を形成し、
（ｉｉ）前記ガイド鎖及び前記コア鎖が、ＲＮＡｉ二重鎖を形成し、かつ、
（ｉｉｉ）前記センサー二重鎖が、前記ＲＮＡｉ二重鎖に連結して、単一構造を形成する、
Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
（ｉ）前記センサー鎖及び前記コア鎖が、センサー二重鎖を形成し、
（ｉｉ）前記ガイド鎖及び前記コア鎖が、ＲＮＡｉ二重鎖を形成し、かつ、
（ｉｉｉ）前記センサー二重鎖が、前記ＲＮＡｉ二重鎖に連結して、単一構造を形成する、
Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項2】
前記センサー鎖は前記コア鎖に対して相補的でないオーバーハングを有し、前記センサー鎖のオーバーハングは、インプット鎖と相補的に結合して足掛かりを形成し、それによって、前記センサー鎖の前記コア鎖からの置換を引き起こすことが可能である、請求項１に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項3】
以下のＡ〜Ｄの化学的改変の１つ以上：
Ａ．強調した領域Ａが以下のａ〜ｄの特徴の１つ以上を有するセンサー鎖の使用：
ａ．骨格結合の５０％以下がホスホロチオエート（ＰＳ）結合である；
ｂ．塩基の５０％以上が、ヌクレアーゼ分解に抵抗するように又は二重鎖の融解温度（Ｔｍ）が上昇するように、化学的に改変されている；
ｃ．塩基の１００％が、ヌクレアーゼ分解に抵抗し、かつＴｍが上昇するように、化学的に改変されている；
ｄ．塩基の約１０％〜５０％が、ロック核酸（ＬＮＡ）、又は前記Ｔｍを実質的に上昇させる２’−４’架橋を有する他の化学的に改変された塩基である；
Ｂ．前記コア鎖の５’末端及び３’末端が以下のａ〜ｉの特徴の１つ以上を有する：
ａ．５’上の末端塩基が、2'-Ｆ塩基、2'-O-メチル塩基、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である；
ｂ．３’上の末端塩基が、2'-Ｆ塩基、2'-O-メチル塩基、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である；
ｃ．５’上の３つの末端塩基が、パターンＭＲＭであり、ここで、Ｍは改変された塩基（2'-O-メチル塩基、2'-Ｆ塩基）で、ＲはＲＮＡ塩基である；
ｄ．３’上の３つの末端塩基が、パターンＭＲＭであり、ここで、Ｍは改変された塩基（2'-O-メチル塩基、2'-Ｆ塩基）で、ＲはＲＮＡ塩基である；
ｅ．３’及び５’上の３つの末端塩基が、連続したＰＳ骨格改変を有さない；
ｆ．前記センサー鎖と塩基対形成する前記コア鎖の部分が、交互の化学的改変パターン（ＭＲ）ｎである；
ｇ．上記の特徴であって、Ｍが、等価なＲＮＡ塩基と比較した場合に二重鎖のＴｍを低下させない化学的に改変された塩基である特徴；
ｈ．前記コア鎖の５’末端及び３’末端が、ａ〜ｇの特徴の少なくとも１つを有する、任意の組合せである；
ｉ．前記センサー鎖と塩基対形成する前記コア鎖の３’及び５’領域が、
（ａ）パターン（Ｍ）ｎであり、Ｍは2'-O-メチル塩基若しくは2'-Ｆ塩基である、又は
（ｂ）この領域中の塩基の少なくとも５０％が、2'-O-メチル塩基若しくは2'-Ｆ塩基であり、かつ
骨格結合の３０％、５０％、８０％又は１００％以下が、ホスホロチオエートではない；
Ｃ．前記ガイド鎖の３’末端と塩基対形成した３つの塩基が以下のａ〜ｇの特徴の１つ以上を有するコア鎖：
ａ．Ｍ＊＋＊Ｍパターンであって、Ｍは２’改変された塩基（例えば2'-O-メチル塩基又は2'-Ｆ塩基）、＊はＰＳ結合、＋はＬＮＡ塩基又は他の２’−４’架橋した塩基である、パターン；
ｂ．Ｍ＊＋＊＋パターンであって、Ｍ、＊及び＋はａで定義したとおりである、パターン；
ｃ．＋＊＋＊＋パターン；
ｄ．Ｒ＊＋＊Ｍパターンであって、ＲはＲＮＡ塩基である、パターン；
ｅ．Ｒ＊＋＊＋パターン；
ｆ．＋＊Ｍ＊Ｍパターン；
ｇ．ａ〜ｆのパターンであって、＊はＰＳ結合又は未改変の（ホスホジエステル）結合のいずれかであってもよい、パターン；
Ｄ．以下のａ〜ｇの特徴の１つ以上を有するガイド鎖：
ａ．塩基の３０％〜９５％が化学的に改変された塩基（2'-O-メチル塩基、2'-Ｆ塩基、ＬＮＡ、２’−４’架橋した塩基）である；
ｂ．５’上の２つの末端塩基が化学的に改変されている；
ｃ．５’上の２つの末端塩基が少なくとも１つのＬＮＡを有する
ｄ．５’上の２つの末端塩基がＰＳ結合している；
ｅ．３’上の２つの末端塩基が共に化学的に改変されている；
ｆ．骨格結合の約５％〜５０％がＰＳである；
ｇ．Ｄｉｃｅｒ切断部位に隣接する塩基が化学的に改変されていない
を含む、請求項１又は２に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
Ａ．強調した領域Ａが以下のａ〜ｄの特徴の１つ以上を有するセンサー鎖の使用：
ａ．骨格結合の５０％以下がホスホロチオエート（ＰＳ）結合である；
ｂ．塩基の５０％以上が、ヌクレアーゼ分解に抵抗するように又は二重鎖の融解温度（Ｔｍ）が上昇するように、化学的に改変されている；
ｃ．塩基の１００％が、ヌクレアーゼ分解に抵抗し、かつＴｍが上昇するように、化学的に改変されている；
ｄ．塩基の約１０％〜５０％が、ロック核酸（ＬＮＡ）、又は前記Ｔｍを実質的に上昇させる２’−４’架橋を有する他の化学的に改変された塩基である；
Ｂ．前記コア鎖の５’末端及び３’末端が以下のａ〜ｉの特徴の１つ以上を有する：
ａ．５’上の末端塩基が、2'-Ｆ塩基、2'-O-メチル塩基、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である；
ｂ．３’上の末端塩基が、2'-Ｆ塩基、2'-O-メチル塩基、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である；
ｃ．５’上の３つの末端塩基が、パターンＭＲＭであり、ここで、Ｍは改変された塩基（2'-O-メチル塩基、2'-Ｆ塩基）で、ＲはＲＮＡ塩基である；
ｄ．３’上の３つの末端塩基が、パターンＭＲＭであり、ここで、Ｍは改変された塩基（2'-O-メチル塩基、2'-Ｆ塩基）で、ＲはＲＮＡ塩基である；
ｅ．３’及び５’上の３つの末端塩基が、連続したＰＳ骨格改変を有さない；
ｆ．前記センサー鎖と塩基対形成する前記コア鎖の部分が、交互の化学的改変パターン（ＭＲ）ｎである；
ｇ．上記の特徴であって、Ｍが、等価なＲＮＡ塩基と比較した場合に二重鎖のＴｍを低下させない化学的に改変された塩基である特徴；
ｈ．前記コア鎖の５’末端及び３’末端が、ａ〜ｇの特徴の少なくとも１つを有する、任意の組合せである；
ｉ．前記センサー鎖と塩基対形成する前記コア鎖の３’及び５’領域が、
（ａ）パターン（Ｍ）ｎであり、Ｍは2'-O-メチル塩基若しくは2'-Ｆ塩基である、又は
（ｂ）この領域中の塩基の少なくとも５０％が、2'-O-メチル塩基若しくは2'-Ｆ塩基であり、かつ
骨格結合の３０％、５０％、８０％又は１００％以下が、ホスホロチオエートではない；
Ｃ．前記ガイド鎖の３’末端と塩基対形成した３つの塩基が以下のａ〜ｇの特徴の１つ以上を有するコア鎖：
ａ．Ｍ＊＋＊Ｍパターンであって、Ｍは２’改変された塩基（例えば2'-O-メチル塩基又は2'-Ｆ塩基）、＊はＰＳ結合、＋はＬＮＡ塩基又は他の２’−４’架橋した塩基である、パターン；
ｂ．Ｍ＊＋＊＋パターンであって、Ｍ、＊及び＋はａで定義したとおりである、パターン；
ｃ．＋＊＋＊＋パターン；
ｄ．Ｒ＊＋＊Ｍパターンであって、ＲはＲＮＡ塩基である、パターン；
ｅ．Ｒ＊＋＊＋パターン；
ｆ．＋＊Ｍ＊Ｍパターン；
ｇ．ａ〜ｆのパターンであって、＊はＰＳ結合又は未改変の（ホスホジエステル）結合のいずれかであってもよい、パターン；
Ｄ．以下のａ〜ｇの特徴の１つ以上を有するガイド鎖：
ａ．塩基の３０％〜９５％が化学的に改変された塩基（2'-O-メチル塩基、2'-Ｆ塩基、ＬＮＡ、２’−４’架橋した塩基）である；
ｂ．５’上の２つの末端塩基が化学的に改変されている；
ｃ．５’上の２つの末端塩基が少なくとも１つのＬＮＡを有する
ｄ．５’上の２つの末端塩基がＰＳ結合している；
ｅ．３’上の２つの末端塩基が共に化学的に改変されている；
ｆ．骨格結合の約５％〜５０％がＰＳである；
ｇ．Ｄｉｃｅｒ切断部位に隣接する塩基が化学的に改変されていない
を含む、請求項１又は２に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項4】
前記センサー鎖の二重鎖ドメインが、ＬＮＡ改変、2'-O-メチル改変、又はそれら両者を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項5】
前記センサー鎖の二重鎖ドメインが、ホスホロチオエート（ＰＳ）改変を有さない、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項6】
前記コア鎖のいずれかの末端又は両方の末端が、ＰＳ改変又は2'-O-メチル塩基のいずれかを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項7】
ＬＮＡ改変、2'-O-メチル改変、ＰＳ改変、又はそれらの組合せを含む前記化学的改変が、足掛かりドメイン中にある、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項8】
前記センサー二重鎖が２３ｂｐで、前記ＲＮＡｉ二重鎖が２３ｂｐである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物。
【請求項9】
合成ＲＮＡｉを活性化する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物を対象に投与することを含み、インプット鎖が前記センサー鎖に結合して、前記センサー鎖の前記Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡからの置換を引き起こし、それによって、前記Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物中のＲＮＡｉを活性化する、方法。
【請求項10】
前記インプット鎖が細胞内のＲＮＡ転写物である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
疾患又は状態を処置する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物を、それを必要とする対象に投与することを含み、インプット鎖が前記センサー鎖に結合して、前記Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡからの前記センサー鎖の置換を引き起こし、それによって、前記Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物中のＲＮＡｉを活性化し、前記ＲＮＡｉが前記疾患又は状態を標的化する、方法。
【請求項12】
前記インプット鎖が細胞内のＲＮＡ転写物である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張本出願は、2018年8月10日に出願の米国仮特許出願第62/717,686号及び2019年2月27日に出願の米国仮特許出願第62/811,183号に対する優先権を主張し、それらの内容は、図面を含め、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の所有権の陳述本発明は、National Science Foundation（ＮＳＦ）によって授与された助成金番号NSF EFRI-ODISSEI 1332411及びCMMI-SNM 1120890の下で、政府の支持によって部分的になされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
核酸ナノテクノロジー1-3及び生体分子計算４の積年の目的は、特定の遺伝子の細胞発現を検出しそれに応答することができる条件的に活性化されたオリゴヌクレオチド治療薬の開発である3,4。足掛かり（toehold）媒介性の鎖置換に基づく核酸スイッチ5,6は、論理演算を実行し、細菌細胞7と哺乳動物細胞3,8でＲＮＡ転写物を検出したが、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ転写物によるオリゴヌクレオチド薬物の条件的活性化は、説得力を持って実証されていない。顕著な課題には、あまり抑制されないバックグラウンド薬物活性、弱いオン状態の薬物効力、インプット及びアウトプット配列重複、高い設計複雑性、短いデバイス寿命（＜２４時間）並びに要求される高いデバイス濃度（＞１０ｎＭ）が含まれる。
【0004】
過去１０年間にわたり、合成ＲＮＡｉトリガー、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）10は、生物学的研究においておなじみのツールになっており、広範な基礎及び臨床開発の試みは、最近、最初のＲＮＡｉ薬物であるオンパットロのＦＤＡ承認に至った11。急成長する薬物開発パイプライン並びにリガンドを標的化する賦形剤及び送達技術の広範な概要9にもかかわらず、疾患関連細胞の特定の集団にＲＮＡｉ薬剤を送達することの困難さが、ＲＮＡｉ治療の潜在力を制限し続けている。鎖置換スイッチに基づくプログラム可能な、条件的に活性化されたＲＮＡｉ薬剤を開発するための過去１５年間の度重なる試み12-15は、著しい進歩にもかかわらず、意図した効果を説得力を持って実証していない3,8,16-19。したがって、新たな条件的に活性化されたｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ：conditionally activated siRNA）が、当該分野の問題を克服するために本明細書において提供される。
【発明の概要】
【0005】
一側面では、本開示は、オフ状態にある、プログラム可能な、条件的に活性化されたｓｉＲＮＡ構築物に関し、この構築物は、センサー鎖、コア鎖及びガイド鎖を含み、センサー鎖及びコア鎖は相補的に結合してセンサー二重鎖を形成し、ガイド鎖及びコア鎖は相補的に結合してＲＮＡｉ二重鎖を形成し、センサー二重鎖及びＲＮＡｉ二重鎖は互いに連結して単一構造を形成する。一部の態様では、センサー二重鎖及びＲＮＡｉ二重鎖は、コア鎖を介して互いに連結する。一部の態様では、センサー鎖はコア鎖の５’上の断片及び３’上の断片に相補的に結合してセンサー二重鎖を形成し、ガイド鎖はコア鎖の中央部の断片に相補的に結合してＲＮＡｉ二重鎖を形成し、中央部の断片は、センサー二重鎖及びＲＮＡｉ二重鎖が、コア鎖の２つの異なる断片を介して互いに連結するように、コア鎖の５’配列も３’配列も含まない。一部の態様では、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物のセンサードメインは、センサー鎖とコア鎖の３’断片及び５’断片との相補的結合によって形成されたセンサー二重鎖、並びにコア鎖とは対にならないセンサーオーバーハングを含む。センサーオーバーハングは、センサー鎖の３’末端又は５’末端のいずれかにある。一部の態様では、センサー鎖、コア鎖及びガイド鎖は、互いの接触の際の自己アセンブルを介して、単一の構築物を形成する。一部の態様では、センサー二重鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０塩基対を含む。一部の態様では、ＲＮＡｉ二重鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０塩基対を含む。
【0006】
一部の態様では、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、オフ状態の安定性及び／又はインプット鎖との接触の際にオンにされた場合の解離効率をさらに改善するように、化学的に改変されている。例えば、二重鎖領域中のセンサー鎖の塩基は、ＬＮＡ改変、2'-O-メチル改変若しくはそれら両者によって改変されているが、ホスホロチオエート（ＰＳ）改変によっては改変されていない；コア鎖のいずれかの末端若しくは両方の末端は、ＰＳ改変、2’-O-メチル改変若しくはそれらの末端によって改変されている；又は、センサー鎖の一本鎖オーバーハングは、ＬＮＡ改変、2'-O-メチル改変、ＰＳ改変若しくはそれらの任意の組合せによって改変されている。一部の態様では、センサードメイン及びＲＮＡｉドメインは、異なる化学的改変によって改変されている。
【0007】
上記オフ状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、オフ状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡをインプット鎖と接触させることによって活性化され又はオンにされ、ここで、インプット鎖の一方の末端は、センサー鎖オーバーハングと共に足掛かりを形成して、インプット鎖とセンサー鎖との相補的結合を介してコア鎖からのセンサー鎖の置換を誘導して廃棄二重鎖を形成し、それによって、ＲＮＡｉ二重鎖はこの構築物から完全に解離する。
【0008】
本出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1a】図１は、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの概念的設計、動作及び分子動力学シミュレーションを示す。図１ａは、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの概念的二次構造及び三次構造を示す。ジアルジア（Giardia）属のＤｉｃｅｒの（Ｘ線により解析された）結晶構造へのＲＮＡｉ二重鎖のドッキングは、センサー二重鎖とＤｉｃｅｒとの間の大きな立体衝突（steric clash）を示す。
【図1b-d】図１は、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの概念的設計、動作及び分子動力学シミュレーションを示す。図１ｂは、鎖置換によるＲＮＡｉの活性化を示す。相補的なインプットＲＮＡがＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡに遭遇すると（Ｉ）、インプット鎖は、センサー鎖上の３’又は５’一本鎖オーバーハングと足掛かりを形成し（ＩＩ）、鎖置換をもたらす（ＩＩＩ）。置換はＲＮＡｉ二重鎖からセンサー鎖を分離する（ＩＶ）。細胞ヌクレアーゼがＲＮＡｉ二重鎖上のコア鎖オーバーハングを除去し（Ｖ）、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングのための活性なＲＮＡｉトリガーを残す（ＶＩ）。図１ｃ及び１ｄは、構築物Ｉ．１及び構築物ＩＩＩ．１の分子動力学（ＭＤ）最適化モデルを示す。緑の矢印はセンサー鎖の３’及び５’末端からの鎖置換の方向を示す。
【図2】図２は、化学的に改変された一本鎖オーバーハングの細胞内分解を示す。ノーザンブロットは、試験構築物上のホスホロチオエート（ＰＳ）保護された５’オーバーハングの段階的分解を示す。ＨＣＴ１１６細胞中に、試験構築物（セグメント化されたパッセンジャー鎖及びさまざまな５’オーバーハングを有するＤｉｃｅｒ基質）を２４時間かけてトランスフェクトした。全てのＲＮＡを抽出しノーザンブロットで分析した。類似のサンプルの２つのセットを分析したところ、異なるローディング濃度において類似の結果が示された。
【図4】図４ａ及び４ｂは、ＨＣＴ １１６細胞におけるインプットＲＮＡのノーザンブロットを示す。４８時間後にＨＣＴ １１６細胞から回収されたｔａｔ／ｒｅｖ及びＡＭＬインプットＲＮＡをプローブするノーザンブロットアッセイ。図４ａは、それらの共通のリーダー配列にマッチする変異体ｔＲＮＡＬｙｓ３でプローブしたｔａｔ／ｒｅｖ ＲＮＡ転写物を示す。レーン：（Ｌ）Ambion decadeマーカー；（０）モックトランスフェクション由来のＲＮＡを用いた陰性対照；（１）完全にマッチするインプットＲＮＡ；（２）５’ミスマッチしたインプットＲＮＡ；（３）完全にミスマッチしたインプットＲＮＡ；（４）二重鎖ミスマッチしたアクチベーター（使用せず）；（５）３’ミスマッチしたアクチベーター。インプットＲＮＡの予想されたサイズは、１４５〜１５０ｎｔであった。図４ｂは、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１ ＲＮＡ転写物を示す。レーン：（０）モックトランスフェクション；（１）ｔａｔ／ｒｅｖ完全マッチインプットＲＮＡ（比較のため）；（２）ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１融合物；（３）ＭＹＨ１１親；（４）ＭＹＨ１１親。連続するパネルは、変異体ｔＲＮＡＬｙｓ３プローブ、ＭＹＨ１１プローブ及びＣＢＦβプローブでプローブした同じサンプルを示す。インプットＲＮＡの発現量は、全てのコホートで同等であった。
【図5a-f】図５ａ〜ｆは、構築物Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩバリアントのアセンブリ、鎖置換、ＲＮＡｉ活性並びにＲＮＡｉ活性化を示す。図５ａ、５ｄは、構築物Ｉ及びＩＩアセンブリの非変性ＰＡＧＥ並びに１×ＰＢＳ緩衝液中３７℃での等温鎖置換を示す。構築物Ｉ及びＩＩは、そのそれぞれのインプット鎖によってディスアセンブルされ、ミスマッチしたインプット鎖によっては影響を受けない。対照レーンは、Ｉ＝インプット鎖、Ｃ＝構築物、Ｐ＝ＲＮＡｉ二重鎖、Ｗ＝廃棄二重鎖である。図５ｂ、５ｅは、ミスマッチしたインプット鎖の存在下又はインプット鎖の不存在下での構築物、及びミスマッチしたインプット鎖の存在下でのオン状態の構築物のＲＮＡｉ活性を示す。図５ｃ、５ｆは、示したインプット鎖を発現する細胞におけるオフ状態の構築物のＲＮＡｉ活性を示す。
【図5g-j】図５ｇ、５ｈは、ミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞における構築物ＩＩバリアントのオフ及びオン状態のＲＮＡｉ活性を示す。図５ｉ、５ｊは、ミスマッチした又はマッチするインプット鎖のいずれかを発現する細胞における、異なるコア鎖改変を有するオフ状態の構築物ＩＩ及びＩＩＩバリアントのＲＮＡｉ活性を示す。
【図6】図６は、予め活性化されたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物のＤｉｃｅｒによるプロセシングを示す。４８時間後にＨＣＴ １１６細胞から回収されたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡガイド鎖をプローブするノーザンブロットアッセイ。レーンは、以下のとおりである：（Ｌ）Ambion decadeマーカー；（０）モックトランスフェクションした細胞由来のＲＮＡ；（１）及び（２）この明細書には開示していない第３のプロトタイプＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡからのガイド鎖；（３）及び（４）オフ及びオン状態のプロトタイプＨＩＶ構築物；（５）及び（６）オフ及びオン状態のＡＭＬ構築物。矢印はＤｉｃｅｒ切断されたガイド鎖の位置を示す。Ｄｉｃｅｒ切断の産物（約２１ｎｔのガイド鎖断片）は、オン状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞から抽出されたＲＮＡ材料で検出されたが、オフ状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞から抽出されたＲＮＡ材料では検出されなかった。
【図7】図７は、各らせん中の２３塩基対の塩基対パラメーターが、ｘ３ＤＮＡ43を使用して５ｐｓ毎に測定し、ヒートマップとしてプロットされたことを示す。塩基対を上（１）から下（２３）まで番号付けした。塩基対パラメーターの定義は、ウェブサイトx3dna.org/articles/seeing-is-understanding-as-well-as-believingに示されている。
【図8a】図８ａは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のツイスト（twist）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8b】図８ｂは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のライズ（rise）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8c】図８ｃは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のロール（roll）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8d】図８ｄは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のスライド（slide）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8e】図８ｅは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のシフト（shift）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8f】図８ｆは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のプロペラ（propeller）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8g】図８ｇは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のシア（shear）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8h】図８ｈは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のスタッガー（stagger）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8i】図８ｉは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のストレッチ（stretch）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8j】図８ｊは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のティルト（tilt）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8k】図８ｋは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のバックル（buckle）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8l】図８ｌは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のオープニング（opening）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図9a-b】図９ａ〜９ｂは、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１を感知するＭＣＬ−１標的化Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性、センサー鎖設計及び配列を示す。図９ａは、無関係な転写物、融合アクチベーター、ＭＹＨ１１又はＣＢＦβ転写物を発現する細胞における構築物ＩＶバリアントのＲＮＡｉ活性を示す。図９ｂは、各転写物上のセンサー鎖結合位置を示す。
【図9c】図９ｃは、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１を感知するＭＣＬ−１標的化Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性、センサー鎖設計及び配列を示す。図９ｃは、ＩＶ．３の配列マップを示す。黄色の強調は、最適化された化学的改変モチーフを有する領域（領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を示す。
【図10】図１０ａ〜１０ｂは、異なるインプットＲＮＡ（構築物Ｉ．１（図１０ａ）及び構築物ＩＩＩ．１（図１０ｂ））の相対的ＲＮＡｉ活性を示す。図５ｃ及び５ｆの標的発現データを、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたが、完全にミスマッチしたインプット鎖を発現している細胞の発現量に対して再標準化した。結果は、マッチするインプット鎖を発現する細胞における標的発現量が、ミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞における標的発現量よりも低かったことを示している。図１０ａ：構築物Ｉ．１について、５’ミスマッチした及び完全にマッチしたインプット鎖を発現する細胞は、標的発現を減少した。図１０ｂ：ＩＩＩ．１について、融合したインプット鎖を発現する細胞は、標的発現を減少した。
【図11】図１１は、ＨＣＴ１１６細胞中に１ｎＭ濃度で２４時間トランスフェクトした以前の世代のＲＮＡｉトリガー設計のノーザンブロットを示す。トリガーの二次構造を図示する。緑の点は2'-O-メチルＲＮＡ塩基を示す。青の点はＤＮＡを示す。白の点はＲＮＡを示す。黒の矢印はＤｉｃｅｒ産物を示す。結果は、隣接する2'-O-メチル改変された二重鎖を有する二重鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒ産物を低減したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
詳細な説明プログラム可能な、条件的に活性化されたｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ）を開発するためのアプローチが、本明細書で開示される。これらの単純なリボスイッチは、哺乳動物サイトゾルにおいて数日間にわたってその完全性を維持することができ、足掛かり媒介性の鎖置換を介して、特定のインプット鎖の遺伝子からの細胞内のＲＮＡ転写物を検出することができる。インプット鎖検出の際に、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、インプット鎖から完全に独立した配列を有する特定された標的遺伝子をサイレンシングする強力なＲＮＡｉトリガー９を放出することができる。実施例において実証されるように、数十のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡバリアントのスイッチング活性をヒト接着細胞において試験して、多様なインプット：アウトプットの組合せにわたる良好なデバイス性能を可能にする必要かつ十分な化学的改変モチーフを同定した。一部の最適化されたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、配列マッチしたＲＮＡ転写物を発現する細胞において、標的遺伝子の９０％を超えるサイレンシング（ベースラインと比較したタンパク質発現）を達成し、ミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞において、強く抑制されたバックグラウンドＲＮＡｉ活性（＜２５％ノックダウン）を達成した。したがって、生きた哺乳動物細胞における鎖置換スイッチの性能を実質的に改善する方法が本明細書において提供される。Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡテクノロジーは、遺伝子発現により活性化されたＲＮＡｉスマートドラッグ（smart drug）のための実用的かつ多用途のプラットフォームを提供する。
【0011】
本明細書において開示するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物は、コア鎖の２つの断片によって互いに連結された２つのドメイン、センサードメイン及びＲＮＡｉドメインを含む。この構造は、センサー二重鎖を形成するセンサー鎖とコア鎖の３’断片及び５’断片との相補的結合、並びにＲＮＡｉ二重鎖を形成するガイド鎖とコア鎖の中央部断片との相補的結合によって得られる。図１に示すように、コア鎖の配列全体がセンサー鎖又はガイド鎖に相補的に結合するわけではない。むしろ、センサー鎖に結合する３’断片とガイド鎖に結合する中央部断片との間の、コア鎖中の第１の断片は、センサードメインの第１の末端とＲＮＡｉドメインの第１の末端を接続する第１の「架橋」を形成するように、一本鎖のままである。同様に、センサー鎖に結合する５’断片とガイド鎖に結合する中央部断片との間の、コア鎖中の第２の断片は、センサードメインの第２の末端とＲＮＡｉドメインの第２の末端を接続する第２の「架橋」を形成するように、一本鎖のままである。
【0012】
本明細書では、用語「相補的結合」又は「相補的に結合する」は、２つの一本鎖が互いに塩基対を形成し、二重鎖を形成することを意味する。しかし、２つの一本鎖間の特定のパーセンテージのミスマッチは、安定な二重鎖が形成される限り許容される。例えば、一部の態様では、センサー二重鎖又はＲＮＡｉ二重鎖は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％又は約５０％のミスマッチを有する。
【0013】
Ａ．インプット鎖Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのためのインプット鎖は、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのスイッチをオンにする「トリガー」であり、通常、標的化細胞（例えばがん細胞）においては比較的高い発現量で存在し、非標的化細胞（例えば正常細胞）においては比較的低い発現量で存在する、細胞内のＲＮＡ転写物である。開示されたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物の設計に基づいて、標的化細胞においてのみＲＮＡｉはオンにされる；一方、非標的化細胞においては、ＲＮＡｉはオフ状態のままである。標的化細胞においては、インプット鎖は、非標的化細胞中よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍高いレベルで発現される。あるいは、標的化細胞においては、インプット鎖は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個の転写物のレベルで発現される；非標的化細胞においては、インプット鎖は、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満又は１０個未満の転写物のレベルで発現される。好ましくは、非標的化細胞は、インプット鎖の検出可能な発現を有さない。
【0014】
インプット鎖には、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は非コードＲＮＡ、例えば長い非コードＲＮＡ、ＲＮＡ断片若しくはウイルスのＲＮＡ転写物が含まれる。治療的使用のために、インプットＲＮＡは、通常、疾患の進行を引き起こしており、したがって、ＲＮＡｉ治療のために標的化される細胞において発現されるＲＮＡ転写物である。非標的化細胞は、通常、ＲＮＡｉ標的のサイレンシングが副作用を引き起こす可能性がある細胞である。インプットＲＮＡが標的化細胞において過剰発現する疾患又は状態を処置するために、Ｃｏｎｄ-ＲＮＡｉは、センサー鎖がインプットＲＮＡ配列に対して相補的な配列を有するように設計される。Ｃｏｎｄ-ＲＮＡｉの投与により、インプットＲＮＡとセンサー鎖の結合が標的化細胞におけるセンサー二重鎖からのＲＮＡｉ二重鎖の解離を誘導し、それによって、疾患又は状態を標的化するＲＮＡｉを活性化する。非標的化細胞では、Ｃｏｎｄ-ＲＮＡｉは不活性のままである。
【0015】
Ｂ．構築物設計本明細書に開示するように、以下に例示される反復プロトコールを使用して、インプット鎖及び標的の特異的な塩基対形成のためのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物を設計する：
１．以前に確証されたｓｉＲＮＡ、文献又はｓｉＲＮＡ設計ツールから、ＲＮＡｉドメインのためのガイド鎖配列を得る。一部の態様では、ガイド鎖は、２１ｎｔのサイズを有する。
２．４つのＧ／Ｃリッチ塩基をガイド鎖の５’に付加することによって、選択されたガイド鎖からＤｉｃｅｒ基質を創出する。一部の態様では、Ｄｉｃｅｒ基質は、２３ｂｐのサイズを有する。Nupack（ＲＮＡ鎖、Mathewsら 1999のパラメーター、ある程度のダングル処理（some dangle treatment））を使用して、１ｎＭ濃度のガイド（アンチセンス）鎖及びセンス鎖において、９５％を超える確率でＲＮＡｉ二重鎖が形成されることを確認する。
３．インプットバイオマーカーの配列から、インプット鎖に対してアンチセンスである全ての可能なセンサーセグメントのリストを生成する。一部の態様では、センサーセグメントは、サイズが３１〜３３ｎｔである。ＣＢＦβ（ＣＢＦＢ）−ＭＹＨ１１融合配列について、図３ｂに示すパラメーターをおよそ満たすセンサーセグメントのみを検討した。
４．NCBI BLASTを使用して、標的動物のトランスクリプトームにおけるユニークさについて、センサー配列をランク付けする。ヒトがん細胞株について、BLASTnアルゴリズムを使用して、ヒト転写物及びゲノムコレクションに対して配列を確認した。可能な場合、既知の又は予測されたＲＮＡ転写物に対して１７塩基を超える配列相補性を有し、完全なオーバーハング相補性を有するセンサーセグメントを排除する。
５．最もユニークなセンサーセグメントから出発して、コア鎖配列を、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのための所望の構造パラメーターに従って構築する。コア鎖は、形態５’−Ｂ−Ｃ３−Ｐ−Ｃ３−Ａ−３’の配列を有し、式中、Ａ及びＢはセンサー鎖の推定二重鎖ドメインの５’末端及び３’末端に対して相補的で、Ｐは推定ガイド鎖に対して相補的で、Ｃ３はＣ３リンカーである。
６．Nupackを使用して、センサー鎖セグメントとそれらの対応する５’及び３’コア鎖オーバーハングとの間で形成される二重鎖の熱力学的安定性をランク付けする。ＲＮＡ鎖、Mathewsら 1999のパラメーター、ある程度のダングル処理ありを使用する。理想的には、９５％を超える鎖が、１ｎＭの鎖濃度で塩基対を形成するはずである。コア鎖が、程度が大きな内部二次構造を有さないことも検証する。
７．工程１〜６で生成された最良の構築物（ガイド鎖、コア鎖及びセンサー鎖の配列）を選択する。
８．本明細書で開示する化学的改変を付加する。
９．オリゴヌクレオチド設計ツール、例えば「LNA Oligo Tm Prediction」（www.qiagen.com/us/service-and-support/learning-hub/technologies-and-research-topics/lna/custom-lna-design-and-applications/lna-design-tools-calculators/lna-oligo-tm-prediction/）又は「LNA Oligo Optimizer」（www.qiagen.com/us/service-and-support/learning-hub/technologies-and-research-topics/lna/custom-lna-design-and-applications/lna-design-tools-calculators/lna-oligo-optimizer/）を使用して、ＬＮＡ改変の配置を最適化する。ＬＮＡ改変を、センサー鎖に、３〜４塩基毎におよそ１つのＬＮＡで付加する。「LNA Oligo Optimizer」ツールを使用して、使用するＬＮＡのパターンが６０を超えるスコアの二次構造も自己塩基対形成の相互作用ももたらさないことを確認する。自己相補性スコア及び自己塩基対形成スコアを、可能な限り最小化する。「LNA Tm Prediction」ツールを使用して、ＲＮＡと塩基対を形成した場合のＬＮＡ改変オリゴのＴｍを確認する。「LNA Oligo Optimizer」ツールを使用して、６０を超えるスコアの自己塩基対形成の相互作用及び二次構造を回避しつつＴｍを最大化する配置を選択する。
【0017】
コア鎖の５’及び３’末端は、以下の特徴の１つ以上を有する：ａ．５’上の末端塩基は、2’-Ｆ、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である。
ｂ．３’上の末端塩基は、2’-Ｆ、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である。
ｃ．５’上の３つの末端塩基は、パターンＭＲＭを有し、式中、Ｍは、改変された塩基（2'-O-メチル、2'-Ｆ）であり、Ｒは、ＲＮＡ塩基である。
ｄ．３’上の３つの末端塩基は、パターンＭＲＭを有し、式中、Ｍは、改変された塩基（2'-O-メチル、2'-Ｆ）であり、Ｒは、ＲＮＡ塩基である。
ｅ．３’及び５’上の３つの末端塩基は、連続したＰＳ骨格改変を有さない。
ｆ．センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の部分は、交互の化学的改変パターン（ＭＲ）ｎを有する。
ｇ．上記において、Ｍは、等価なＲＮＡ塩基と比較した場合に二重鎖のＴｍを減少させない化学的に改変された塩基である。
ｈ．コア鎖の５’末端及び３’末端が、ａ〜ｇの特徴の少なくとも１つを有する、上記の任意の組合せ。
ｉ．センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の３’及び５’領域Ｉ及びＩＩＩが、以下である：
（ａ）パターン（Ｍ）ｎで完全にできており、式中、Ｍは、2'-O-メチル又は2'-Ｆ改変された塩基である、あるいは
（ｂ）この領域中の塩基の少なくとも５０％は、2'-O-メチル又は2'-Ｆであり、かつ
骨格結合の３０％、５０％、８０％又は１００％以下は、ホスホロチオエートではない。
【0018】
コア鎖（３つの塩基がガイド鎖の５’末端と塩基対形成した）の５’末端のエキソヌクレアーゼ遮断領域Ｉは、以下の特徴の１つ以上を有する：ａ．Ｍ＊＋＊Ｍパターンであって、式中、Ｍが、２’改変された塩基（例えば2'-O-メチル又は2'-Ｆ）であり、＊が、ＰＳ骨格結合であり、＋が、ＬＮＡ塩基又は他の２’−４’架橋した塩基である、パターン、
ｂ．上で定義したとおりの、Ｍ＊＋＊＋パターン、
ｃ．＋＊＋＊＋パターン、
ｄ．Ｒ＊＋＊Ｍパターンであって、式中、Ｒが、ＲＮＡ塩基である、パターン、
ｅ．Ｒ＊＋＊＋パターン、
ｆ．＋＊Ｍ＊Ｍパターン、及び
ｇ．ａ〜ｆのパターンであって、式中、＊が、ＰＳ結合又は未改変の（ホスホジエステル）結合のいずれかであることができる、パターン。
【0019】
コア鎖のエキソヌクレアーゼ遮断領域ＩＩは、以下の特徴の１つ以上を有する：ａ．Ｍ＊Ｒパターンであって、式中、Ｍが、２’改変された塩基（例えば2'-O-メチル又は2'-Ｆ）であり、＊が、ＰＳ結合であり、Ｒが、ＬＮＡ塩基又は他の２’−４’架橋した塩基である、パターン、
ｂ．上で定義したとおりの、Ｍ＊Ｍパターン、
ｃ．＋＊Ｍパターン、
ｄ．＋＊Ｒパターンであって、式中、Ｒが、ＲＮＡ塩基である、パターン、
ｅ．＋＊＋パターン、
ｆ．Ｍ＊＋パターン、及び
ｇ．ａ〜ｆのパターンであって、式中、＊が、ＰＳ結合又は未改変の（ホスホジエステル）結合のいずれかであることができる、パターン。
【0020】
本明細書では、「ＬＮＡ」は、当該分野で広く使用されるロック核酸を意味する。例えば、www.glenresearch.com/products/dna-rna-nucleosides-analogs-and-supports/backbone-modification/locked-analog-phosphoramidites.html及びen.wikipedia.org/wiki/Locked_nucleic_acidを参照のこと。ＬＮＡ改変、2'-O-メチル改変及び2'-Ｆ改変に加え、塩基改変の他の技術が、当該技術分野において公知である。例えば、www.glenresearch.com/browse/nucleoside-analog-phosphoramiditesを参照のこと。一部の態様では、グリコール核酸が使用することができる61,62。
【0022】
センサー鎖の塩基は、以下の特徴の１つ以上を有する：（１）塩基の少なくとも２５％が、ＲＮＡでもＤＮＡでもない、（２）塩基の少なくとも５０％が、ＲＮＡでもＤＮＡでもない、（３）塩基の少なくとも７５％が、ＲＮＡでもＤＮＡでもない、（４）塩基の１００％が、ＲＮＡでもＤＮＡでもない、（５）塩基の少なくとも１つが、ＬＮＡ又はＬＮＡアナログである、（６）３つの末端塩基の少なくとも１つが、ＬＮＡ又はＬＮＡアナログである、（７）塩基の１０％〜５０％が、ＬＮＡ又はＬＮＡアナログである、（８）塩基の２５％〜１００％が、ＬＮＡ又はＬＮＡアナログである、（９）ＬＮＡではない塩基が、以下の１つ以上である：（ａ）2’-o-メチル、（ｂ）2’-フルオロ、（ｃ）2’-ＭＯＥ、（ｄ）グリコール核酸61,62、及び（ｅ）www.glenresearch.com/browse/nucleoside-analog-phosphoramidites中に示される他のバリアント。
【0023】
ホスホロチオエート結合は、さまざまな場所、例えば５’若しくは３’末端塩基と末端から２番目の塩基との間、末端と末端からの３番目の塩基の間、末端と末端からの５番目の塩基の間、末端と末端からの８番目の塩基の間、骨格結合の５０％上、全ての塩基の間、並びに／又は領域ＩとＩＩとの間及び領域ＩＩとＩＩＩとの間の結合部、に存在することができる。
【0024】
５’末端、３’末端、又はそれら両者における末端改変には、以下の１つ以上が含まれる：（１）トリエチレングリコールスペーサー又はヘキサエチレングリコールスペーサー、（２）Ｃ３スペーサー、（３）逆位ｄＴ（inverted dT）、（４）アミンリンカー、（５）当該分野で公知の他のリンカー又は末端改変、例えばeu.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/oligo-modifications及びwww.glenresearch.com/browse/labels-and-modifiersにおいて列挙されたもの、並びに（６）改変は、他の化学的部分（例．抗体、金又は他の金属ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、デンドリマーナノ粒子、小分子、単一鎖又は分枝脂肪酸、ペプチド、タンパク質、アプタマー、及び他の核酸鎖及び核酸ナノ構造）に、３’及び５’末端を連結するために使用してもよい。
【0025】
図３に示されるように、センサー鎖の領域Ｃは、以下の特徴の１つ以上を有する：（１）骨格結合の５０％以下が、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合である、（２）塩基の５０％以上が、ヌクレアーゼ分解に抵抗するように、又は二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を増加させるように、化学的に改変されている、（３）塩基の１００％が、ヌクレアーゼ分解に抵抗しかつＴｍを増加させるように、化学的に改変されている、（４）塩基の約１０％〜５０％が、ＬＮＡ、又はＴｍを実質的に増加させる２’−４’架橋を有する他の化学的に改変された塩基である。例えば、www.glenresearch.com/products/dna-rna-nucleosides-analogs-and-supports/backbone-modification/locked-analog-phosphoramidites.html及びen.wikipedia.org/wiki/Locked_nucleic_acidを参照のこと。
【0026】
一部の態様では、非ＬＮＡ改変には、2’-O-メチル及び2’-Ｆ、並びにwww.glenresearch.com/browse/nucleoside-analog-phosphoramidites中に開示された他の改変が含まれる。一部の態様では、グリコール核酸が使用することができる61,62。
【0027】
一側面では、本明細書で開示するプログラム可能な、条件的に活性化されたＲＮＡｉ（例えばＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ）は、当該分野で公知の他のＲＮＡｉ分子の１０ｎＭを超えるトランスフェクション濃度と比較して、哺乳動物細胞において、０．１ｎＭ未満のトランスフェクション濃度を有する。Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、延長された期間、例えば少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間又は少なくとも９６時間にわたって活性である。一部の態様では、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、３０日間以下、６０日間以下又は９０日間以下にわたって活性である。
【0028】
本明細書では、用語「プログラム可能な」は、この明細書で開示するＣｏｎｄ-ＲＮＡｉ構築物が、構築物の二次構造及び三次構造が実質的に変化することなく、インプット鎖の配列の変化を可能にするように設計されることを意味する。さらなる設計原理は、米国特許第9,115,355号に開示されており、その内容は本明細書に組み込まれる。
【0029】
一部の態様では、インプット鎖−センサー二重鎖からのＲＮＡｉ二重鎖の解離は、コア鎖とセンサー鎖との間のミスマッチ又はゆらぎ対によって増加する。ＲＮＡｉトリガーは、強力なＲＮＡｉ活性を有するためには、インプットＲＮＡとセンサー鎖とによって形成される廃棄二重鎖から完全に解離する必要がある。条件的ＲＮＡｉのための以前のスキームは、Watson-Crick塩基対形成を介してインプットシグナル（例えばｍＲＮＡ）と結合したままの活性化されたＲＮＡｉトリガーを特徴とする場合が多かった14,15,17,18,37。条件的ＲＮＡｉトリガーの開発の間に、隣接する化学的に保護された二重鎖ＲＮＡドメインへのＤｉｃｅｒ基質の接続が、ＲＮＡｉ活性を著しく低下することが見いだされた（図２）。これについての考えられる原因は、Ｄｉｃｅｒ阻害性タンパク質、例えばＰＡＣＴ38の、伸長した二重鎖への結合である可能性がある。いずれにしても、インプット鎖−センサー二重鎖からのＲＮＡｉ二重鎖の解離が、オフ状態のＲＮＡｉ抑制及びオン状態のＲＮＡｉ効力の同時の最適化を可能にする際に重要であった。
【0030】
一部の態様では、本明細書で開示するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ二重鎖に連結したセンサー二重鎖を含む単一構築物設計を有する。条件的ＲＮＡｉトリガー及び他のＤＮＡ回路についての既存の設計は、インプット鎖の配列を独立したアウトプット配列にトランスレートするための単一構築物14,15,39又はマルチ構築物17スキームのいずれかを特徴付けてきた。単一構築物トランスレーターは、理論的には、シグナルの検出及び伝達において、固有により効率的であるはずである。しかし、短所は、ＲＮＡｉトリガーが構築物内に隠されていなければならず、構築物分解に起因する誤ったＲＮＡｉの活性化の機会を生み出すことである。
【0031】
一部の態様では、本明細書で開示するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、化学的に改変されている。鎖置換センサー鎖について、センサー鎖の二重鎖ドメインは、ＬＮＡ改変、2'-O-メチル改変、又はそれら両者を有する。一部の態様では、センサー鎖の二重鎖ドメインは、ホスホロチオエート（ＰＳ）改変を有さない。一部の態様では、コア鎖若しくは保護鎖のいずれかの末端又は両方の末端は、ＰＳ又は2'-O-メチルのいずれかで改変されている。一部の態様では、熱力学的に安定化する改変は、一般に、バックグラウンド活性化の抑制を改善するが、熱力学的に不安定化する改変、例えばＰＳ骨格は、二重鎖領域において広範に使用される場合、誤った活性を増加させる可能性がある。一部の態様では、ＬＮＡ改変、2'-O-メチル改変、ＰＳ改変、又はそれらの組合せを含む化学的改変は、足掛かりドメイン中にある。足掛かりドメイン中のこれらの改変は、一本鎖オーバーハングの塩基対形成の親和性及びヌクレアーゼ抵抗性を改善する。
【0032】
本明細書では、センサー鎖に対する結合パートナーは「保護鎖」と呼ぶこともできる。保護鎖はインプット鎖に対して相同な鎖である。保護鎖はコア鎖であることができる。センサー鎖はインプット鎖に対して相補的な鎖である。センサー鎖へのインプット鎖の結合は保護鎖を置換する。
【0033】
一部の態様では、化学的改変には、以下が含まれる：（ｉ）センサー鎖が、ＬＮＡ及び2'-O-メチルで改変されており、ここで、一本鎖足掛かり領域はＰＳ骨格改変を有するが、塩基対形成した二重鎖領域はＰＳ骨格改変を有さない、（ｉｉ）保護鎖のいずれかの末端又は両方の末端が2'-O-メチル改変を有する、あるいは（ｉ）と（ｉｉ）の両者。
【0034】
一部の態様では、コア鎖の３’及び５’末端領域は、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物が、センサー鎖と塩基対形成した場合には高度に安定であるが、塩基対形成しない場合には分解に対して脆弱であるように、ＰＳ改変されている又は2'-ＯＭｅ改変されている。一本鎖オーバーハングの分解は、エキソヌクレアーゼ遮断ドメインによって二重鎖の末端において停止させることができる。
【0035】
細胞特異的生化学的シグナルに応答してＲＮＡｉ活性を活性化又は非活性化することができる自己調節性「スマートドラッグ」による標的化された薬物送達の補完は、現在の制限を克服するための手段を提供する。例えば、ウイルスＲＮＡ転写物を検出しそれに応答することができるＲＮＡｉスマートドラッグは、生存に必須な宿主遺伝子の、ウイルスＲＮＡ活性化されたサイレンシングを介して、ウイルス感染細胞を死滅させることによって、持続性のウイルス感染を潜在的に消失させることができた。この薬動力学中心のアプローチは、足掛かり媒介性の鎖置換に基づく核酸スイッチの適用に十分適しているが、それは、これらのスイッチが、インプット鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ中の特定の塩基配列を感知しそれに応答することができるからである3。
【0036】
一側面では、本明細書で開示するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、図１ａ、１ｃ及び１ｄに示されるように、センサー鎖、ガイド鎖及びコア鎖から構成される自己アセンブルした分子機械的トランスデューサーである。これら３つの鎖は塩基対を形成し、２３塩基対（ｂｐ）のＲＮＡｉ二重鎖と連結した２３ｂｐのセンサー二重鎖からなる二重クロスオーバー構築物20を形成する。構築物中で、センサー鎖は、ＲＮＡｉ二重鎖の酵素的プロセシングを阻害し、それによって、哺乳動物のサイトゾル中で、ＲＮＡｉ活性をスイッチオフの状態に保つ（図１ａ）。
【0037】
一部の態様では、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物は、それらのスイッチング性能が改善されるように、化学的改変によってさらに改変される。具体的には、本明細書で開示するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、構築物がそのオフ状態にある場合には、低減された望まれないＲＮＡｉ活性を有し、正確な配列を有する細胞内のＲＮＡ転写物の存在下では、オフ状態からオン状態へのスイッチングを改善した。
【0038】
ＲＮＡｉ二重鎖の酵素的プロセシングの阻害は、組み合わせると相乗的である複数の方法で生じる。例えば、センサー二重鎖が占める空間は、ＲＮＡｉ二重鎖がＤｉｃｅｒのｄｓＲＢＤと結合し、また、エンドヌクレアーゼドメインと結合するのに必要とする空間と、大きく重複する（図１ａ、右）21。別の例では、ＤｉｃｅｒのＰＡＺドメインは、カノニカルｄｓＲＮＡトリガーの末端上の５’末端リン酸及び３’二塩基オーバーハングとの、安定化性の相互作用を有する22。アセンブルされたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、これらの相互作用を防止するが、それは、コア鎖の５’末端及び３’末端が、ＲＮＡｉ二重鎖の末端を通過してセンサー二重鎖の中央部へと伸びるからである（図１ｃ、１ｄ）。ＲＮＡｉ二重鎖は２３ｂｐの長さである。この長さでは、代替経路によるＲＮＡｉローディングのために、ＲＮＡｉ二重鎖をＤｉｃｅｒが切断するには長すぎる23。さらに、代替のローディングに必要なＲＮＡｉ経路タンパク質（ＴＲＢＰ及びアルゴノート（１〜４）21）との相互作用も、構築物の異常な三次構造によって妨げられる可能性がある。さらに、センサー二重鎖の早すぎる分解又はＲＮＡｉ二重鎖からのセンサー鎖の意図しない分離を防止するために、センサー鎖全体及び構築物上の他の重要な部位は、広範な化学的改変によって、熱力学的に安定化され、ヌクレアーゼ活性から保護される24（図１ｃ、１ｄ）。
【0039】
ＲＮＡｉ二重鎖を放出及び活性化するために、細胞内のＲＮＡ転写物は、足掛かり媒介性の鎖置換を介した、コア鎖からのセンサー鎖の分離を誘導する（図１ｂ）。一部の態様では、細胞内のＲＮＡ転写物は、対象の内部供給源、例えば代謝産物由来である。置換は、センサー鎖の３’又は５’末端の足掛かりから始まることができる。インプット鎖検出の配列特異性は、足掛かり安定性に対する鎖置換速度論の強い依存25によって、足掛かり領域において強化され、完全に相補的なコア鎖を置換する必要性によって、二重鎖領域において強化される。
【0040】
コア鎖がセンサー鎖と二重鎖を形成していた領域は、センサー鎖の分離後、ＲＮＡｉ二重鎖から伸びる３’及び５’オーバーハングとなる。これらのオーバーハングは、サイトゾルヌクレアーゼ26によって分解され（図１ｂのＶ及び図２）、これは、化学的に改変されたヌクレアーゼ遮断ドメイン（図３ａ、構築物Ｉ．１中の黄色の強調）で、ＲＮＡｉ二重鎖の末端において停止する。これは、Ｄｉｃｅｒによるプロセシング及びＲＩＳＣローディングのための活性なＲＮＡｉトリガーを残す（図１ｂのＶＩ、ｓｉＲＮＡ）。
【0041】
化学的に改変された一本鎖オーバーハングの細胞内分解において使用される鎖の組成は、以下のとおりであった：配列（５’−＞３’）
ガイド鎖Ａ：ｍＣｍＧ ＣＧＵＣＵＧＡＧＧＧＡＵＣＵＣＵＡＧＵ ＵＡＣＣＵＵ
ガイド鎖Ｂ：ｍＣｍＧ＋ＣＧＵＣＵＧＡＧＧＧＡＵＣＵＣＵＡＧＵ＋ＴＡＣＣＵＵ
３’パッセンジャーセグメント：ｃｃｃｕｃａｇａｃｇ ｍｃ＊ｍｇ＊ ９ｓ ｉｄＴ
５’パッセンジャーセグメント
０（対照）：ｃ３ ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ
１：Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ Ｕ Ｃ Ａ Ｕ Ｃ Ａ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ
２：１８ｓ ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ
３：１８ｓ ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ Ｕ Ｃ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ
４：１８ｓ ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ Ｕ Ｃ Ａ Ｕ Ｃ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ
ノーザンプローブ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴＡＣＣ
Ｌ：Ambion decadeマーカー
【0042】
略語：９ｓ：トリエチレングリコールスペーサー
１８ｓ：ヘキサエチレングリコールスペーサー
Ｃ３：Ｃ３スペーサー
ｉｄＴ：逆位ｄＴ
＊：ホスホロチオエート結合。
【0043】
図２に示すように、ガイド鎖Ａを有するサンプルは、全てのバンドを可視化するのに十分なローディング及び曝露を有した。レーン０は、オーバーハングを有さない対照鎖（１５ヌクレオチド）である。パッセンジャー１は、約１５ｎｔにおける単一の検出可能なバンドを有し、全長パッセンジャー鎖の量が減少しており、これは、オーバーハングの急速でプロセッシブ（processive）な分解を示す。パッセンジャー２及び３は、サイズ１５〜２７ｎｔの至る所に複数のバンドを有し、これは、オーバーハング全体のＰＳ結合の存在に一致する、ヌクレオチドの緩徐で非プロセッシブ（non-processive）な喪失を示している。パッセンジャー４は、１５ｎｔ近傍の２つのバンドを伴い、レーン０と比較してより多くの全長産物を示し、これは、５’末端の保護が失われた場合のオーバーハングの急速でプロセッシブな分解の前の、末端が保護されていることによる緩徐な初期分解を示す。
【0044】
いくつかのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡを、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び他のオリゴヌクレオチド治療薬24を保護するために使用したものと類似の化学的改変モチーフを用いて設計した。構築物Ｉ．１（図３ａ）を、保存されたＨＩＶ（ｔａｔ／ｒｅｖ）ｍＲＮＡ遺伝子配列27を検出するようにプログラムした。構築物Ｉ及びＩＩのためのアクチベーター配列は、以下の表１に示される。センサー鎖とアラインするように意図された領域は、太字かつイタリックである；足掛かりとアラインするように意図された領域は、下線付きである；センサー鎖に対して相補的なセグメントは、大文字である；センサー鎖とミスマッチしたセグメントは、小文字である。
【0045】
【表1】
【0046】
構築物ＩＩＩ．１（図３ａ）を、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）関連融合癌遺伝子配列（ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１）28,29を検出するようにプログラムした。構築物ＩＩＩ及びＩＶのためのアクチベーター配列は、以下の表２に示される。センサー鎖とアラインするように意図された領域は、太字かつイタリックである；足掛かりとアラインするように意図された領域は、下線付きである；センサー鎖に対して相補的なセグメントは、大文字である；センサー鎖とミスマッチしたセグメントは、小文字である。
【0047】
【表2】
【0048】
ＲＮＡｉ活性の直接的読み出しを可能にするために、構築物Ｉ．１及び構築物ＩＩＩ．１は、その３’ＵＴＲ中に生物学的に無関係の標的配列（ＨＩＶのＵ５領域由来）を保有するウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡを標的化した。
【0049】
現実的な分子コンフォメーションを予測するために、Ｉ．１及びＩＩＩ．１の全原子分子動力学（ＭＤ）シミュレーション30を、本発明者らの設計において使用した化学的改変を記述するために、以前に公開されたパラメーターの組合せを使用するハイブリッドＡｍｂｅｒ力場31-33を使用して、陽溶媒（explicit solvent）中で実施した。両者の構築物のＭＤ最適化されたモデル（図１ｃ、１ｄ）は、理想的なＡ形態のＲＮＡらせんパラメーターと比較して、センサー二重鎖及びＲＮＡｉ二重鎖中に構造的ゆがみが存在することを示している（図４）。このゆがみは、（１）広範な化学的改変、及び（２）二重クロスオーバーモチーフに固有の構造的ひずみが原因である（図１ｃ、１ｄ、４、並びに表３ａ及び３ｂ）。以下の表３ａ及び３ｂは、５ナノ秒の分子動力学軌跡にわたる、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の平均塩基対パラメーターを示す。各々の二重鎖についての各塩基対パラメーターの平均及び標準偏差の値は、図４に示されるデータから計算した。比較のために、平均及び標準偏差を、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物中のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同じ配列組成を有する未接続のＲＮＡ二重鎖についても計算した（両者の構築物は、ｓｉＲＮＡ二重鎖中に同じ配列を有した）。
【0050】
【表3a】
【0051】
【表3b】
【0052】
ゆがみにもかかわらず、全ての意図した塩基対が、シミュレーションの間中ずっと維持され、両者のモデルにおけるセンサー二重鎖及びＲＮＡｉ二重鎖の相対的な整列は、Ｄｉｃｅｒ切断からの立体保護と一致した。
【0053】
構築物の経験的試験のために、成分鎖を市販の供給者から購入し、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡを、１×ＰＢＳ中での熱的アニーリングを使用してアセンブルした。高い純度でアセンブルした両者の構築物が、インプットＲＮＡを配列特異的に検出することが可能で、１×ＰＢＳ緩衝液中３７℃での等温鎖置換によりＲＮＡｉ二重鎖を放出できたことが、非変性ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析により示された（図５ａ、５ｄ）。
【0054】
オフ（ガイド、コア及びセンサー鎖）状態及びオン（ガイド及びコア鎖のみ）状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を、二重ルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。変動する量の構築物を、（ａ）二重ルシフェラーゼレポーター、及び（ｂ）センサー鎖に対して相補的な（マッチした）又は非相補的な（ミスマッチした）短いインプットＲＮＡ配列（表１及び２）、をコードするＤＮＡベクターの固定量と共に、ＨＣＴ１１６細胞中に共トランスフェクトした。
【0055】
インプット鎖を発現しない細胞又は完全にミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞において、オフ状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ活性が有意に低下した一方で、オン状態の構築物は、強力なＲＮＡｉトリガーであることが証明された（ノーザンブロットアッセイの結果である図６によって裏付けられた図５ｂ及び図５ｅ）。ＲＮＡｉの活性化のために、オフ状態の構築物を、マッチするインプット鎖又はミスマッチのインプット鎖を発現する細胞中にトランスフェクトした（図５ｃ、５ｆ）。インプットＲＮＡの発現量をノーザンブロットにより評価した（図４）。バックグラウンド（オフ状態）ＲＮＡｉ活性の変動は、データをトランスフェクトｓｉＲＮＡを有さない細胞における標的発現に対して標準化した場合、見かけの統計的有意性が低下したが（図５ｃ及び５ｆ）、マッチするインプット鎖とミスマッチのインプット鎖を直接比較する別の分析によれば、マッチするインプット鎖ではＲＮＡｉ活性が有意に増加したことが示唆された（図１０）。
【0056】
Ｉ．１及びＩＩＩ．１の異なるセンサー鎖の設計は、ＲＮＡｉの活性化においていくらかの機能的差異を生じるようであった。構築物Ｉ．１は、５ヌクレオチドの５’及び３’センサー鎖オーバーハングを有した。ＲＮＡｉの活性化は、５’オーバーハングに対するインプット鎖のミスマッチによって影響を受けなかったが、３’オーバーハングに対するミスマッチによって完全に排除された（図５ｃ、５ｆ及び１０）。したがって、３’センサーオーバーハングのみが、鎖置換のための足掛かりとして機能的であった。ＭＤシミュレーションでは、構築物Ｉ．１の５’足掛かりからの鎖置換は、最初は、構築物の内側に向かって進行するが、３’足掛かりからの置換は、外側に向かって進行する（図１ｃ、１ｄ）。したがって、立体障害は、５’足掛かりからの鎖置換を防止する際に役割を果たす可能性がある。他の因子、例えばインプットＲＮＡ上の結合部位へのアクセス可能性又は５’足掛かりと３’足掛かりとの間の塩基対形成の安定性における差異が、５’足掛かりからの鎖置換の防止に寄与してもよい。
【0057】
構築物ＩＩＩ．１は、同様に強力なオン状態のＲＮＡｉトリガーを有しているにもかかわらず（図５ｂ、５ｅ）、構築物Ｉ．１（図５ｃ）よりも高いＲＮＡｉの活性化（図５ｆ）を示した。もっともらしい説明は、ＩＩＩ．１の８塩基の３’足掛かりのより高い熱力学的安定性が、より速い鎖置換速度論を生じるということである。
【0058】
構築物の重要な領域における化学的改変のさらなる最適化を行った（図３ａ、強調した領域）。構築物ＩＩバリアントのオフ及びオン状態のＲＮＡｉ活性が、コア鎖の３’末端及び５’末端（図３ｂ、領域Ａ、センサー二重鎖中の中央のニックに隣接する）、並びにＲＮＡｉ二重鎖のエキソヌクレアーゼ遮断ドメイン（図３ａ、領域Ｂ）で、異なるパターンの化学的改変で測定された（図７、８、構築物ＩＩ．１〜５）。
【0059】
領域Ｂについて、結果は、ＲＮＡｉ二重鎖の末端における熱力学的安定性が、オフ状態のＲＮＡｉ活性の抑制にとって重要であってもよいことを示した。ヌクレアーゼ遮断モジュールの中央における2'-ＯＭｅ塩基のロック核酸（ＬＮＡ）による置換（図９ｃの領域Ｃ）は、ＲＮＡｉ効力を損なうことなく、バックグラウンドＲＮＡｉ活性を低減した（図５ｇ、ＩＩ．１対ＩＩ．２）。
【0060】
領域Ａについて、オフ状態のＲＮＡｉ活性を停止させるために、コア鎖の３’及び５’末端を化学的に改変して保護する必要がある。ＰＳ骨格連結をホスホジエステル連結によって置きかえた場合、バックグラウンドＲＮＡｉ活性が有意に増加し（図５ｇ、ＩＩ．２は３つの連続した末端ＰＳを有し、ＩＩ．３は２つの交互のＰＳを有し、ＩＩ．４は単一の末端ＰＳを有する）、ＲＮＡｉ活性を制御する能力は、未改変の末端によって完全に失われた（ＩＩ．０）。
【0061】
領域ＡにおけるＰＳ連結の使用に関する問題は、各ＰＳが、２つの可能なエナンチオマーコンフォメーションを有する立体中心であることである。残念ながら、よりヌクレアーゼ抵抗性のＳｐコンフォメーションは、ＲＮＡの塩基対形成に対して不安定化性である34。センサー二重鎖の熱力学的安定性を改善し、ラセミ不均一性を低減させるために、ＰＳ骨格改変を、2'-ＯＭｅ塩基改変で置きかえた（図５ｈ、８ｃの構築物ＩＩ．５〜７）。各コア鎖末端における３つの連続した（ＩＩ．５）、２つの交互の（ＩＩ．６）、又は１つの末端（ＩＩ．７）2'-ＯＭｅ塩基の使用は、全て、バックグラウンドＲＮＡｉ活性を有意に低減した。さらに、３つ全てのモチーフが、ＰＳ改変されたアナログを超えて、オン状態のＲＮＡｉ効力を増加した（図５ｈ、ＩＩ．５〜７対ＩＩ．２、オン状態）。
【0062】
2'-ＯＭｅ改変が細胞内のＲＮＡ転写物によるＲＮＡｉの活性化を可能にするかどうかを決定するために、ＩＩ．１、ＩＩ．２、ＩＩ．６及びＩＩ．７についてのＲＮＡｉの活性化を、二工程トランスフェクションプロトコールで比較した（図５ｉ）。ＩＩ．６及びＩＩ．７は、有意に低減したバックグラウンドＲＮＡｉ活性を示し、ミスマッチしたＲＮＡ転写物による活性化を拒絶し、センサー鎖に対して配列マッチしたインプット鎖を発現した細胞においてウミシイタケルシフェラーゼ標的の増加したＲＮＡｉノックダウンを示した（図５ｉ、２ｎＭのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ濃度における標的発現の約５０％の低減）。
【0063】
領域Ａ最適化を一般化するために、構築物ＩＩＩの2'-ＯＭｅ保護されたコア鎖末端を有するバージョンを作製し（図８ｄ、ＩＩＩ．２）、細胞内のＲＮＡ転写物によるその活性化を試験した（図５ｊ）。元のＰＳ保護されたバリアント（ＩＩＩ．１）と比較して、ＩＩＩ．２は、ミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞において、有意に低減したバックグラウンドＲＮＡｉ活性を示し、正しいインプット鎖を発現する細胞において、より良いＲＮＡｉ活性化を有した（図５ｊ、ＩＩＩ．１対ＩＩＩ．２）。特に、コア鎖末端（ＩＩＩ．３、コア鎖の３’オーバーハング）の一方のみからの末端2'-ＯＭｅ改変の除去は、ＲＮＡｉ活性に対する制御をほぼ破壊した（図５ｊ、ＩＩＩ．３）。
【0064】
コア鎖を最適化すると、センサー鎖も改善される。初期構築物（Ｉ．１、ＩＩ．１、ＩＩＩ．１）は、全ての領域において、ＰＳ、ＬＮＡ及び2'-ＯＭｅ改変で完全に改変されたセンサー鎖を使用した。センサー鎖の二重鎖領域中のＰＳ改変は、塩基対形成の安定性を低減させることによって、誤った活性化を増加する場合がある。また、他の研究者らは、哺乳動物細胞における動作のために鎖置換スイッチを安定化するために、ＬＮＡを用いることなく、2'-ＯＭｅ改変単独を使用した8,19。2'-ＯＭｅ保護されたコア鎖（領域Ａ）を、センサー鎖の二重鎖領域中にＬＮＡ＋2'-ＯＭｅ＋ＰＳ（図５ｋ、８ｅ、ＩＩＩ．２、ＩＩＩ．４）、ＬＮＡ＋2'-ＯＭｅ（ＩＩＩ．５）、2'-ＯＭｅのみ（ＩＩＩ．６）又は改変なし（ＩＩＩ．７）のいずれかを有するセンサー鎖と組み合わせた、本明細書で開示する一連の構築物ＩＩＩバリアントを試験した。結果は、ＲＮＡバージョン（ＩＩＩ．７）及び2'-ＯＭｅのみのバージョン（ＩＩＩ．６）のセンサー鎖が、意図しないＲＮＡｉ活性を抑制できなかったことを示した（図５ｋ）。最適なバリアントはＩＩＩ．５で、これは、二重鎖領域中に、ＬＮＡ及び2'-ＯＭｅ塩基を有したが、ＰＳ改変はなかった。２ｎＭのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ濃度において、構築物ＩＩＩ．５は、ミスマッチしたインプットＲＮＡを発現する細胞において、バックグラウンドＲＮＡｉ活性はわずか２０％で、正しいインプットＲＮＡを発現する細胞において、ウミシイタケ標的の９０％を超えるノックダウンを達成した（マッチしたものとミスマッチしたものとの間で、標的発現における約１０×の低減）。統計的に有意なＲＮＡｉの活性化は、わずか８０ｐＭのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡまで下がるように見えた。
【0065】
構築物ＩＩＩについてＣＢＦβ−ＭＹＨ１１センサー鎖の最適化から得られた洞察を使用して、構築物ＩＶを開発した。構築物ＩＶは、ＡＭＬ細胞（二重ルシフェラーゼ実験に使用したＨＣＴ１１６細胞ではなく）の生存にとって極めて重要な内因性アポトーシス阻害剤であるＭＣＬ−１35を標的化するＲＮＡｉドメインを有する、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１を感知するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡである。３つのバージョンの構築物ＩＶを、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１、ＣＢＦβ又はＭＹＨ１１配列を有する転写物に応答したＲＮＡｉの活性化について試験した。センサー鎖が融合配列を活性化し続けることを確実にするために、センサー鎖（構築物ＩＩＩ中で使用したものと同じ）を、その足掛かり形成領域においてＭＹＨ１１配列に対して相補的で、かつその二重鎖領域においてＣＢＦβ配列に対して相補的となるように設計した（図９ｂ）。３つのバージョンの構築物ＩＶを試験した（図８ｆ）。ＩＶ．１は、プロトタイプ構築物ＩＩＩ．１と類似した改変パターンを有した；構築物ＩＶ．２は、最適化された領域Ａ、Ｂ及びセンサー鎖モチーフを有した。ＩＶ．３は、ＲＮＡｉ効力に対して小さい影響を有することが以前に見いだされたパターン36を使用して、ガイド鎖中にさらなる2'-O-メチル改変を有した。驚くべきことに、ＩＶ．２及びＩＶ．３は、ＩＶ．１と比較して、バックグラウンドＲＮＡｉ活性の抑制を著しく改善し、ＲＮＡｉスイッチングを改善した（図９ｃ）。ＩＶ．２は、融合配列発現細胞において、２ｎＭのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡにおいて、ウミシイタケ読み出し標的における約６０％の低減をもたらすバックグラウンドＲＮＡｉを有したが、ウミシイタケにおける約９０％の低減を示した。ＩＶ．３は、検出可能なバックグラウンドＲＮＡｉをほとんど有さなかったが、より低い活性化されたＲＮＡｉ活性（２ｎＭにおけるウミシイタケにおける約６０％の低減）もまた有した。
【0066】
一部の態様では、本明細書で開示するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物の化学的改変は、以下の１つ以上を含む：Ａ．図３ａ中の強調された領域Ｃ、「化学的改変のスクリーニングのための領域」が、以下の特徴の１つ以上を有する、センサー鎖の使用：
ａ．骨格結合の５０％以下が、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合である
ｂ．塩基の５０％以上が、ヌクレアーゼ分解に抵抗するように、又は二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を増加させるように、化学的に改変されている
ｃ．塩基の１００％が、ヌクレアーゼ分解に抵抗しかつＴｍを増加させるように、化学的に改変されている
ｄ．塩基の約１０％〜５０％が、ロック核酸（ＬＮＡ）、又はＴｍを実質的に上昇させる２’−４’架橋を有する他の化学的に改変された塩基である。
Ｂ．コア鎖の５’及び３’末端が、以下の特徴の１つ以上を有する：
ａ．５’上の末端塩基が、2'-Ｆ、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である
ｂ．３’上の末端塩基が、2'-Ｆ、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である
ｃ．５’上の３つの末端塩基が、パターンＭＲＭを有し、式中、Ｍが、改変された塩基（2'-O-メチル、2'-Ｆ）であり、Ｒが、ＲＮＡ塩基である
ｄ．３’上の３つの末端塩基が、パターンＭＲＭを有し、式中、Ｍが、改変された塩基（2'-O-メチル、2'-Ｆ）であり、Ｒが、ＲＮＡ塩基である
ｅ．３’及び５’上の３つの末端塩基が、連続したＰＳ骨格改変を有さない
ｆ．センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の部分が、交互の化学的改変パターン（ＭＲ）ｎを有する
ｇ．Ｍが、等価なＲＮＡ塩基と比較した場合に二重鎖のＴｍを減少させない化学的に改変された塩基である、上記の特徴
ｈ．コア鎖の５’末端及び３’末端が、ａ〜ｇの特徴の少なくとも１つを有する、任意の組合せ
ｉ．センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の３’及び５’領域が、以下である：
（ａ）パターン（Ｍ）ｎで完全にできており、式中、Ｍが、2'-O-メチル又は2'-Ｆ改変された塩基である、あるいは
（ｂ）この領域中の塩基の少なくとも５０％が、2'-O-メチル又は2'-Ｆであり、かつ
骨格結合の３０％、５０％、８０％又は１００％以下が、ホスホロチオエートではない。
Ｃ．ガイド鎖の３’末端と塩基対形成した３つの塩基が、以下の特徴の１つ以上を有する、コア鎖：
ａ．Ｍ＊＋＊Ｍパターンであって、式中、Ｍが、２’改変された塩基（例えば2'-O-メチル又は2'-Ｆ）であり、＊が、ＰＳ結合であり、＋が、ＬＮＡ塩基又は他の２’−４’架橋した塩基である、パターン
ｂ．上で定義したとおりの、Ｍ＊＋＊＋パターン
ｃ．＋＊＋＊＋パターン
ｄ．Ｒ＊＋＊Ｍパターンであって、式中、Ｒが、ＲＮＡ塩基である、パターン
ｅ．Ｒ＊＋＊＋パターン
ｆ．＋＊Ｍ＊Ｍパターン
ｇ．ａ〜ｆのパターンであって、式中、＊が、ＰＳ結合又は未改変の（ホスホジエステル）結合のいずれかであることができる、パターン。
Ｄ．以下の特徴の１つ以上を有するガイド鎖：
ａ．塩基の３０％〜９５％が、化学的に改変された塩基（2'-O-メチル、2'-Ｆ、ＬＮＡ、２’−４’架橋した塩基）である
ｂ．５’上の２つの末端塩基が、化学的に改変されている
ｃ．５’上の２つの末端塩基が、少なくとも１つのＬＮＡを有する
ｄ．５’上の２つの末端塩基が、ＰＳ結合している
ｅ．３’上の２つの末端塩基が共に、化学的に改変されている
ｆ．骨格結合の約５％〜５０％が、ＰＳである
ｇ．Ｄｉｃｅｒ切断部位に隣接する塩基が、化学的に改変されていない。
【0067】
まとめると、プログラム可能な、条件的に活性化されたｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ）を本明細書で開示する。このデバイスは、異なるインプット遺伝子からのＲＮＡ転写物の検出の際にのみ、標的遺伝子に対する活性なＲＮＡ干渉トリガーをアウトプットする。鎖置換センサー鎖の改善された性能及び条件的に活性化されたＲＮＡｉの実現は、５つの重要な設計原理に一部帰せられる。
【0068】
第１に、ＲＮＡｉトリガーは、強力なＲＮＡｉ活性を有するために、インプットＲＮＡとセンサー鎖とによって形成される廃棄二重鎖から完全に解離する必要がある。条件的ＲＮＡｉのための以前のスキームは、Watson-Crick塩基対形成を介してインプットシグナル（例えばｍＲＮＡ）が結合したままの活性化されたＲＮＡｉトリガーを特徴とする場合が多かった15,17,18,37,60。以前の世代の条件的ＲＮＡｉトリガーの開発の間に、隣接する2'-O-メチル改変された二重鎖ＲＮＡドメインへのＤｉｃｅｒ基質の接続が、ＲＮＡｉ活性を著しく低下することが見いだされた（図１１）。これについての考えられる原因は、Ｄｉｃｅｒ阻害性タンパク質、例えばＰＡＣＴ38の、伸長した二重鎖への結合である可能性がある。しかし、インプット鎖−センサー二重鎖からのＲＮＡｉ二重鎖の解離が、オフ状態のＲＮＡｉ抑制及びオン状態のＲＮＡｉ効力の同時の最適化を達成するために必要であった。
【0069】
図１１の構築物で使用した配列は、以下のとおりである：
【0070】
【表4】
【0071】
第２に、条件的ＲＮＡｉトリガー及び他のＤＮＡ回路についての過去の設計は、インプット配列を独立したアウトプット配列へとトランスレートするための単一構築物15,16又はマルチ構築物17スキームのいずれかを特徴付けてきた。単一構築物トランスレーターは、理論的には、シグナルの検出及び伝達において、固有により効率的であるはずである。しかし、短所は、ＲＮＡｉトリガーが構築物内に隠されていなければならず、構築物分解に起因する誤ったＲＮＡｉの活性化の機会を生み出すことである。開示されたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ設計の成功は、単一構築物トランスレーターの利点が、誤った活性化のリスクを効果的に制御しつつ利用できることを示している。
【0072】
第３に、広範な化学的改変は、鎖置換センサー鎖、ひいてはＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの適切な機能にとって重要である。最適化実験の実施例は、以下であることを示している：１）センサー鎖の二重鎖ドメインは、ＬＮＡと2'-O-メチル改変の両者を有することが必要であるが、ＰＳ改変を有する必要はない；２）保護鎖の末端は、ＰＳ又は2'-O-メチルのいずれかで改変される必要がある；３）熱力学的に安定化する改変は、一般に、バックグラウンド活性化の抑制を改善するが、熱力学的に不安定化する改変、例えばＰＳ骨格は、二重鎖領域において広範に使用される場合、誤った活性を実際に増加させる可能性がある；４）足掛かりドメインにおける化学的改変は試験しなかったが、ＬＮＡ、2'-O-メチル及びＰＳ改変の組合せは、一本鎖オーバーハングの塩基対形成の親和性及びヌクレアーゼ抵抗性を改善するので、有益である。
【0073】
第４に、内因性ＲＮＡ分解機械は、構築物スイッチングのための有効なツールであることができる。実施例に示されるように、コア鎖の化学的に改変された３’及び５’末端領域は、センサー鎖と塩基対形成した場合には高度に安定であったが、塩基対形成しない場合には分解に対して脆弱であった。ヌクレアーゼ活性に対するこの示差的感受性は、ＰＳ改変された末端で達成することができるが、2'-ＯＭｅ改変を用いた方がより有効であるようであった。本明細書において実証するように、一本鎖オーバーハングの分解は、エキソヌクレアーゼ遮断ドメインによって、二重鎖の末端において停止させることができる。このスキームを使用する開示されたＲＮＡｉ二重鎖のトリミングは、ＤＸ二次構造から強力なＲＮＡｉトリガーを生じた。類似のスキームが、他の核酸ナノ構造の動的認識において有用であってもよい。
【0074】
最後に、２つの別個の二重鎖でのセンサードメイン及びＲＮＡｉドメインの分離は、細胞内安定性、プログラム可能性及び技術開発の容易さにとって重要であった。第１に、２つのドメイン間に塩基対形成の重複が存在せず、競合する二次構造コンフォメーションが存在しない。このことは、熱力学的安定性の大きなマージンを確保し、新しいインプット及びアウトプット配列のプログラミングが簡素化された。第２に、二重鎖の寸法及びクロスオーバーポイントにおける連結化学を、三次構造におけるひずみを最小化するように構成した（図１ｃ）。このことは、熱力学的安定性をさらに増強した。第３に、二重鎖は重複しなかったので、化学的改変は、ＲＮＡｉドメインの適合性を損なうことなく、センサードメインに適用することができる。
【0075】
以下の例は、特許請求された本発明をより良く示すために提供されるのであって、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。特定の材料が言及される範囲において、これは、単に例示を目的としており、本発明を限定する意図はない。さまざまな均等物、変化及び改変を本発明の範囲から逸脱することなく行ってもよいことが、当業者に明らかであり、かかる均等な態様がこの明細書に含まれることが理解される。さらに、この開示において引用された全ての参考文献は、本明細書に完全に示されているかのように、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0076】
実施例１：構築物設計インプット鎖及び標的に対して特異的な塩基対を形成するためのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡを、反復プロトコールにより設計した。以前に確認されたｓｉＲＮＡ、文献又はｓｉＲＮＡ設計ツールから、ＲＮＡｉドメインとして適切な２１ｎｔのガイド鎖配列を得た。前記ガイド鎖の５’に４つのＧ／Ｃリッチ塩基を付加することによって、２３ｂｐのＤｉｃｅｒ基質を創出した。１ｎＭのガイド（アンチセンス）鎖及びセンス鎖において、ＲＮＡｉ二重鎖が９５％を超える確率で形成することを、Nupack（ＲＮＡ鎖、Mathews59が開示したパラメーター、ある程度のダングル処理）を使用して確認した。
【0077】
インプットバイオマーカーの配列から、全ての可能な３１〜３３ｎｔのセンサーセグメント（インプット鎖に対してアンチセンス）のリストを生成した。ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１融合配列について、図９ｂに示されるパラメーターをおよそ満たすセンサーセグメントのみを検討した。NCBI BLASTを使用して、標的動物のトランスクリプトームにおけるユニークさに関して、センサー配列をランク付けした。BLASTnアルゴリズムを使用して、ヒト転写物＋ゲノムコレクションに対してヒトがん細胞株の配列を確認した。可能な場合、既知の又は予測されたＲＮＡ転写物に対して１７塩基を超える配列相補性及び完全なオーバーハング相補性を有するセンサーセグメントを排除した。
【0078】
最もユニークなセンサーセグメントから出発して、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡに望ましい構造パラメーターに従うコア鎖配列を選択した。例えば、コア鎖の配列は、５’−Ｂ−Ｃ３−Ｐ−Ｃ３−Ａ−３’（Ａ及びＢは、センサー鎖の推定二重鎖ドメインの５’及び３’末端に対して相補的、Ｐは推定ガイド鎖に対して相補的、Ｃ３はＣ３リンカー）である。センサー鎖セグメントと対応するコア鎖の５’及び３’オーバーハングとの間で形成される二重鎖の熱力学的安定性を、Nupackを使用してランク付けした。Mathewsら59が開示するパラメーターを有するＲＮＡ鎖を、ある程度のダングル処理し使用した。理想的には、１ｎＭの鎖濃度において、９５％を超える鎖が塩基対を形成するはずである。コア鎖についても、それが大きな内部二次構造を有していないことを確認した。
【0079】
設計した最良のガイド鎖、コア鎖及びセンサー鎖を選択し、化学的に改変した。Exiqonのオリゴヌクレオチド設計ツール（www.exiqon.com/oligo-tools）を使用して、ＬＮＡ改変の位置を最適化した。センサー鎖では、３〜４塩基毎におよそ１つのＬＮＡ改変を行った。LNA Oligo Optimizerツールを使用して、このＬＮＡパターンが、６０を超えるスコアの二次構造も自己塩基対形成の相互作用ももたらさなかったことを確認した。自己相補性スコア及び自己塩基対形成スコアを、可能な限り最適化した。
【0080】
実施例２：鎖の合成ＬＮＡ塩基を有する鎖は、Exiqon Inc（現在はQiagenの一部門）が合成した。ＬＮＡのない鎖は、GE Life Sciences Dharmacon（現在はHorizon Discovery Groupの一部門）が合成した。全ての鎖は、製造業者による薦めに従って、ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣによる精製も行うよう発注した。
【0081】
実施例３：Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのアセンブリ１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での熱的アニーリングにより、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡをアセンブルした。構築物は、精製を行っても、行わなくてもよい。１×ＴＢＥ、１０％〜１５％ＰＡＧＥを用いる４℃での非変性ゲル電気泳動により、構築物の品質を評価することができる。
【0082】
精製を行わない場合、１．１対１．００対１．１のモル比のセンサー鎖、コア鎖及びガイド鎖を、ｐＨ約７．０で、１×ＰＢＳ中５０ｎＭ又は１００ｎＭの濃度で混合した。わずかに過剰なセンサー鎖及びガイド鎖を使用することで、構成的なＲＮＡｉ活性を有するガイド鎖とコア鎖の二重鎖の産生を防止した。ＰＣＲサーモサイクラーを、以下の条件で使用した：・蓋を１０５℃に加熱する
・８５℃で３０秒間維持し、鎖を変性する
・０．１℃／秒で５０℃まで冷却する
・５０℃で４５分間維持する
・０．０２℃／秒で３７℃まで冷却する
・４℃まで急速に冷却し、維持する。
【0083】
精製を行う場合、上記アニーリング条件で、センサー鎖、コア鎖及びガイド鎖を混合し、１×ＰＢＳ中１ｕＭの設定濃度でアセンブルした。次いで、構築物を、ＴＢＥ緩衝液を用いBio-Rad mini protean １０％ネイティブＰＡＧＥゲルにロードして、１２５Ｖ、４℃で約４５分間泳動した。Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡに対応するバンドを、ＵＶランプ照明下で可視化し切り出した。
【0084】
Harvard Apparatus Electroprepシステムを製造業者の指示に従って使用する電気溶出により、切り出したバンドを抽出した。ゲル片を、１００Ｋ ＭＷＣＯフィルター膜及び２Ｋ ＭＷＣＯフィルター膜によって密封した０．５ｍＬチャンバー中に配置した。構築物を、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を介して溶出させ、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜及び第２の２Ｋ ＭＷＣＯ膜によって形成された隣接する０．５ｍＬチャンバー中で捕捉した。溶出は、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＯＰ４緩衝液（約ｐＨ７．０）中、４℃で約４５分間行った。電力は、６５Ｖの電圧カットオフで１５ｍＡの定電流を維持するように設定した。
【0085】
精製された構築物の濃度を、Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Imagerで定量化し、非変性ＰＡＧＥ上でのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色によって、既知の濃度のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ標準と比較して計算した。
【0086】
アセンブリ又は精製直後の構築物が最良の状態である。構築物は、分割して−８０℃で無期限に貯蔵することもできる。しかし、凍結解凍サイクルは構築物の品質を損ない、構築物のディスアセンブリを生じた。ディスアセンブルした構築物は、アッセイ直前に熱的アニーリングを繰り返すことによって再度アセンブルすることができる。
【0087】
アセンブリの収量は高く、必ずしも精製によって構築物の性能が改善するという訳ではなかったので、さまざまな試験では未精製の構築物を使用した。
【0088】
実施例４：鎖置換アッセイ構築物を５０ｎＭの設定濃度で調製し、ＰＢＳ緩衝液中３７℃で５０ｎＭのオリゴヌクレオチドアクチベーター（又は対照としてのＰＢＳ）と１：１で合わせて、２５ｎＭのインプットシグナル及び構築物を有する混合物を得た。次いで、構築物−インプット鎖の組合せを、ＰＣＲサーモサイクラー中、３７℃で４時間インキュベートした。サンプルを回収し、直ちに１×ネイティブＰＡＧＥローディング色素中で−８０℃に凍結した。実験の最後に、全てのサンプルを迅速に解凍し、非変性ＰＡＧＥで分析した。
【0089】
実施例５：二重ルシフェラーゼレポーター及びアクチベータープラスミドの生成標準的な分子生物学のプロトコールを使用して、特定の挿入物のためにＤＮＡオリゴをアニーリングし、次いで、親ベクターの指定された部位にライゲーションさせることによって、全てのクローンを製造した。ＤＮＡの配列決定により、全ての構築物の正確さを検証した。
【0090】
実施例６：ＰｓｉＣＨＥＣＫ二重ルシフェラーゼレポーター以下に示すＤＮＡオリゴをアニーリングし、psiCHECK 2（Promega）二重ルシフェラーゼレポーターのＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位にライゲーションした。太字のヌクレオチドはセンス標的配列である。小文字のヌクレオチドは、制限部位５’オーバーハングを示す。
【0091】
【化1】
【0092】
実施例７：シグナル活性化実験のためのインプットＲＮＡ転写物アクチベーター配列をキメラｔＲＮＡ転写物の一部として発現した。第１の部分は、以下にその全体を示す成熟配列、３’末端にＣＣＡを有する改変された5 ｔＲＮＡＬｙｓ３からなる。ＣＣＡはｐｒｅ−ｔＲＮＡプロセシング酵素ｔＲＮＡｓｅ Ｚによるエンドヌクレアーゼ様切断を防止する。ｔＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは内部プロモーターで、ｔＲＮＡｍｐＤＮＡのコード配列内に含まれた。
【0093】
ｔＲＮＡＬｙｓ３の最初の６９ヌクレオチドを含む親プラスミドをクローニングするために、ＮｒｕＩ制限部位48で終結した。ＮｒｕＩによる親プラスミドの消化は、ヌクレオチドｔＲＮＡ ６９の直後に平滑末端を生成する。アニーリングされた重複するオリゴは、残りの改変されたｔＲＮＡヌクレオチドとそれに続く特定の活性化配列をコードする。各活性化配列は、１２塩基のテトラループ（ＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣ）とそれに続くＰｏｌ ＩＩＩ終結配列をコードするＴ６ランで終結する。Ｕ４＋ＲＮＡ転写物配列を以下に列挙する。
【0094】
構築物Ｉ及びＩＩについて、ｔＲＮＡＬｙｓ３リーダー配列、５’−＞３’：
【0095】
【化2】
【0096】
太字の配列はノーザンブロットプローブに対する結合部位である。アクチベーター配列を表１及び表２に列挙する。表５にノーザンブロットプローブを列挙する。
【0097】
【表5】
【0098】
実施例８：組織培養ＨＣＴ １１６結腸直腸癌細胞を利用して全ての分析を行った。抗生物質を添加せず、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１．５ｍＭ L-グルタミン（Irvine Scientific, USA）及び１０ｍＭピルベート（Irvine Scientific, USA）を添加したＭｃＣｏｙの５Ａ基本培地（Irvine Scientific, USA）を用い、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で細胞を維持した。
【0099】
実施例９：ノーザンブロット分析アクチベーター発現の分析を、２５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ及び２５０μＬの１：５０希釈Lipofectamine 2000に２μｇのプラスミドＤＮＡを加え、６ウェルプレートを用いて行った。製造業者の指示に従ってリポソームを形成し、２ｍＬの新鮮な完全培地と共に細胞に加えた。１８時間後、その後は毎日少なくとも１回、及びＲＮＡ回収の６時間前に、培地を交換した。オフ状態のｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ及び予め活性化された（オン）状態のｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの分析を、同様に行った；示された量のＲＮＡｉ複合体を、２５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中の２μｇのpBluescriptプラスミド（担体）に添加した。
【0100】
１０００μＬのＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Tel-Test, Inc）を使用して全てのＲＮＡを回収し、沈降前に１：１のフェノール：クロロホルム抽出を使用する２回目の有機抽出の追加を伴って、製造業者の指示に従って処理した；ＲＮＡペレットを、７０％エタノールで２回洗浄し、その後、過剰のエタノールを蒸発させ、ＲＮＡｓｅフリーのＴＥ、ｐＨ６．８中に再懸濁した。
【0101】
ノーザン分析のために、１５μｇの全てのＲＮＡを、３２Ｐ標識したAmbion decadeマーカーと共に、８％（アクチベーターの場合）又は１２％（ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの場合）の尿素−ＰＡＧＥゲル（１５ｃｍ）で泳動した。ゲルを、Ｈｙｂｏｎｄ ＸＬ（GE Healthcare Life Sciences）にエレクトロブロットし、プレハイブリダイズさせ、Sigma Perfect Hyb Plusを使用して３７℃でハイブリダイズさせ、５〜１０ピコモルのＰ３２−５’末端標識したオリゴプローブとハイブリダイズさせた。ブロットを、２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳの４〜５回の交換によって、３７℃で洗浄した。連続ハイブリダイゼーションを用いて、古いオリゴプローブを製造業者の指示に従って膜から除去し、特に明記しない限り、再ハイブリダイゼーションの前に再曝露によって確認した。Ｕ６ ｓｎＲＮＡのハイブリダイゼーションを対照として使用した。クローニング手順、オリゴ及び全てのプローブ配列を、表中に列挙する。
【0102】
実施例１０：二重ルシフェラーゼアッセイ二重ルシフェラーゼアッセイを、製造業者の指示に従ってPromega Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを使用して実施した。ＲＮＡｉ標的配列を、psiCHECK-2（Promega）ベクター上のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中にクローニングし、ホタルルシフェラーゼを対照として使用した。
【0103】
細胞を、４８ウェルクラスタープレート中でインキュベートし、トランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの１日前に播種し、５０％のコンフルエンシーでトランスフェクトした。各実験を少なくとも３回反復して、生物学的複製物を得た。図５ｂ〜５ｈは単一工程トランスフェクションプロトコール、図５ｉ〜５ｋ及び図９ａは二工程トランスフェクションプロトコールによる。
【0104】
単一工程コトランスフェクションプロトコール：各実験について、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific）中のpsiCHECK（Promega Corporation）レポータープラスミドのマスターミックスを調製した。このマスターミックスを分割し、pBluescript（Agilent）対照又はアクチベータープラスミドのいずれかを添加した。次いで、新たな混合物を、変動する濃度でのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ複合体の添加のために、さらにもう一度分割した。最後に、１：５０希釈のLipofectamine 2000（Ｌ２Ｋ）をプラスミド＋Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ混合物に１：１の体積比で添加して製造業者が推奨する１：１００希釈のＬ２Ｋを達成し、製造業者の推奨に従って室温でインキュベートした。
【0105】
各実験条件（特定の濃度でのアクチベーター及びｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの組合せ）で十分な混合物（３．３×量が必要）を調製し、技術的複製物として、３つの別々のウェルでトランスフェクトした。
【0106】
したがって、４８ウェルプレート中の各ウェルに、１６μＬ（ＯｐｔｉＭＥＭ中のpsiCHECK及びアクチベータープラスミド）、４μＬ（１×ＰＢＳ緩衝液中の５０×Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ）及び２０μＬ（１：５０希釈Ｌ２Ｋ）からなる４０μＬのトランスフェクション混合物を加えた。ＰＢＳは、全てのＲＮＡｓｅ活性を除去するためにＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）で処理された、カルシウムもマグネシウムも含まないリン酸緩衝食塩水であった。
【0107】
トランスフェクトの直前に各ウェル中の培地を１６０μＬの新鮮な培地に交換し、次いで、４０ｎｇのpsiCHECK-2二重ルシフェラーゼレポータープラスミド、１２０ｎｇのpBluescript又はアクチベーター発現プラスミド及び示された濃度のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ複合体を有し、２００μＬ／ウェルの最終体積になるように、４０μＬのトランスフェクション混合物を添加した。
【0108】
二工程トランスフェクションプロトコール：このプロトコールを使用して、図５ｉ〜５ｋ及び図９ａのデータを得た。
標的及びアクチベータープラスミドによるトランスフェクション１、時間 − ８時間。
【0109】
二工程トランスフェクションのために、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific）中のpsiCHECK（Promega Corporation）レポータープラスミドのマスターミックスを調製した。このマスターミックスを分割し、次いで、pBluescript（Agilent）対照又はアクチベータープラスミドのいずれかを添加した。１：５０希釈のLipofectamine 2000（Ｌ２Ｋ）をプラスミド混合物と１：１の体積比で添加して製造業者が推奨する１：１００希釈のＬ２Ｋを達成し、製造業者の推奨に従って室温でインキュベートして、リポプレックスを形成させた。
【0110】
各実験条件で、十分な混合物を調製し、技術的複製物として、３つの別々のウェルでトランスフェクトした。したがって、４８ウェルプレート中の各ウェルに、２０μＬ（ＯｐｔｉＭＥＭ中のpsiCHECK及びアクチベータープラスミド）及び２０μＬ（１：５０希釈Ｌ２Ｋ）からなる４０μＬのトランスフェクション混合物を加えた。
【0111】
トランスフェクトの直前に各ウェル中の培地を１６０μＬの新鮮な培地に交換し、次いで、４０μＬのトランスフェクション混合物を、４０ｎｇのpsiCHECK-2二重ルシフェラーゼレポータープラスミド及び１２０ｎｇのpBluescript又はアクチベーター発現プラスミドを含み、２００μＬ／ウェルの最終体積になるように添加した。
【0112】
トランスフェクション混合物を除去し、６時間後に約２時間にわたって培地で穏やかに洗浄した。１６０ｕｌの新鮮な培地を各ウェルに添加し、細胞インキュベーションを、第２のトランスフェクションまで継続した。
【0113】
Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ複合体によるトランスフェクション２、時間 − ０トランスフェクション１の８時間後に、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher）を使用する実験において、特定したとおりの変動する濃度でトランスフェクトした。各実験条件について、ＰＢＳ中の各標的／アクチベーターの組合せの実験を３回行うために、十分な量の各濃度のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡを調製した。各Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ希釈を、１：５０のＯｐｔｉＭＥＭ中ＲＮＡｉＭＡＸの等しい体積と混合し、室温でインキュベートして、製造業者の指示に従ってリポプレックスを形成させた。具体的には、４８ウェルプレート中の各ウェルに、１０×最終濃度の２０μＬのＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ（８μＬのＰＢＳ＋１２μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ）及び２０μＬの１：５０希釈ＲＮＡｉＭＡＸからなる４０μＬのトランスフェクション混合物を加えた。
【0114】
維持単一工程プロトコールでは、細胞にコトランスフェクション混合物を添加する時点を時間０とし、二工程プロトコールでは、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ複合体を添加（トランスフェクション番号２）する時点を時間０とする。トランスフェクションの１８時間後、その後は毎日少なくとも１回、そして、溶解物調製の６時間前に、培地を交換した。
【0115】
溶解物調製各実験について、指定された時点で４８ウェルプレートを取り出した。培地を各ウェルから注意深く吸引した。次いで、ウェルを１×ＰＢＳで１回洗浄し、吸引して乾燥した。１００μＬの１×Promega Passive Lysis Bufferを各ウェルに添加した。次いで、プレートをアルミホイルで覆い、−８０℃で凍結させたか、又は室温で約３０分間の穏やかな撹拌（約７０ｒｐｍ）のためにシェーカー上に配置した。凍結させた場合、二重ルシフェラーゼアッセイの前に、少なくとも３０分間の穏やかな撹拌によりシェーカー上で細胞を解凍した。ウェルの目視検査により細胞が十分に溶解したことを、アッセイ前に確認した。
【0116】
アッセイDual-Luciferase Reporter Assay Kit（Promega）を使用して製造業者の指示に従い、細胞溶解物をアッセイした。ウミシイタケルシフェラーゼ値を、各技術的複製物（各ウェル）において、ホタルルシフェラーゼに対して標準化した。３回の実験を平均して単一の生物学的複製物の値を得た。全てのグラフは、少なくとも３つの独立した生物学的複製物の実験の結果を示す。
【0117】
実施例１１：分子動力学シミュレーションＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの原子モデルを、Nucleic Acid Builder49及びカスタムスクリプトを使用して構築し、Accelrys（現在のBIOVIA、Dassault Systemsの一部門）Cerius45パッケージで編集して、適切な化学的改変を行った。
【0118】
ハイブリッド力場（ＦＦ）を、ＲＮＡ50、2'-O-メチル51、ＬＮＡ52及びホスホロチオエート53改変について報告された以前のＡｍｂｅｒ力場パラメーターを組み合わせることによって創出した。以前の報告は、ＬＮＡチミジンについてのパラメーターセットを提供しなかった。ＬＮＡ糖環のＦＦパラメーターをＬＮＡ力場から導出し、塩基のパラメーターをＡｍｂｅｒ０３力場から導出した。RESP ESP charge Derive（ＲＥＤ）サーバー（q4md-forcefieldtools.org/REDServer/）を使用して電荷を計算した。非ＤＮＡ成分、例えばＣ３リンカー、末端アミン改変及び末端ＰＥＧリンカーについてのＦＦパラメーターは、ＧＡＦＦ ＦＦ54から得た。全ての構造を各側面に１５Åの空間をあけた周期的ボックス中に配置し、次いで、ＴＩＰ３水で溶媒和した55。電荷の半分を中和するために最初にＭｇ２＋イオンを添加し、次いで、残りの半分を中和するためにＮａ＋を添加した。最後に、Ｎａ＋及びＣｌ−イオンを１５０ｍＭの濃度になるように添加した。
【0119】
nvidia K80 GPU上でLAMMPS13 GPU互換リリース（2016年12月21日）を使用して分子動力学シミュレーションを行った。構造を、最急降下で最初に最小化し、次いで、５００工程にわたる共役勾配アルゴリズムで最小化し、次いで、１ｆｓの時間工程を使用して１０ｐｓの過程にわたってＮＶＴアンサンブルを使用して、ＭＤシミュレーション３１０Ｋによって平衡化した。次いで、得られた構造に対して、３１０Ｋ、３５０ａｔｍで１０ｐｓのＮＰＴ ＭＤを行い、周期的ボックスを緩和させ、正味の陽圧を確実にした。ＮＶＴシミュレーションのために、Nose-Hooverサーモスタットを１００ｆｓの時定数で使用した。ＮＰＴシミュレーションのために、Nose-Hooverバロスタットを１ｐｓの時定数で使用した。次いで、平衡化された構造に対して、３１０°Ｋで２０ｎｓのＭＤを行った（ＮＶＴアンサンブル、１ｆｓの時間工程）。
【0120】
図９に示す構造を得るために、ＭＤ軌跡から最も低いポテンシャルエネルギーを有する構造を抽出し、共役勾配エネルギーの最小化を５００工程にわたって適用した。UCSF Chimeraパッケージ57を使用して構築物を可視化した。Ｘ３ＤＮＡ58を使用して、らせんパラメーターをシミュレーション軌跡から計算した。
【0121】
参考文献1. Seeman, N. C. DNA in a material world. Nature 421, 427-431 (2003).
2. Guo, P. The emerging field of RNA nanotechnology. Nat Nano 5, 833-842 (2010).
3. Chen, Y.-J., Groves, B., Muscat, R. A. & Seelig, G. DNA nanotechnology from the test tube to the cell. Nat Nano 10, 748-760, doi:10.1038/nnano.2015.195 (2015).
4. Benenson, Y. Biomolecular computing systems: principles, progress and potential. Nat Rev Genet 13, 455-468, doi: http://www.nature.com/nrg/journal/v13/n7/suppinfo/nrg3197_S1.html (2012).
5. Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C. & Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature 406, 605-608, doi:http://www.nature.com/nature/journal/v406/n6796/suppinfo/406605a0_S1.html (2000).
6. Srinivas, N. et al. On the biophysics and kinetics of toehold-mediated DNA strand displacement. Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkt801 (2013).
7. Green, A. A. et al. Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. Nature 548, 117-121, doi:10.1038/nature23271 http://www.nature.com/nature/journal/v548/n7665/abs/nature23271.html#supplementaryinformation (2017).
8. Groves, B. et al. Computing in mammalian cells with nucleic acid strand exchange. Nat Nano 11, 287-294, doi:10.1038/nnano.2015.278 http://www.nature.com/nnano/journal/v11/n3/abs/nnano.2015.278.html#supplementaryinformation (2016).
9. Setten, R. L., Rossi, J. J. & Han, S. P. The current state and future directions of RNAi based therapeutics Nature Reviews Drug Discovery, In press (2019).
10. Bobbin, M. L. & Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology 56, 103-122, doi:10.1146/annurev-pharmtox-010715-103633 (2016).
11. Adams, D. et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine 379, 11-21, doi:10.1056/NEJMoa1716153 (2018).
12. Benenson, Y., Gil, B., Ben-Dor, U., Adar, R. & Shapiro, E. An autonomous molecular computer for logical control of gene expression. Nature 429, 423-429,
doi:http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6990/suppinfo/nature02551_S1.html (2004).
13. Kumar, D., Kim, S. H. & Yokobayashi, Y. Combinatorially Inducible RNA Interference Triggered by Chemically Modified Oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society 133, 2783-2788, doi:10.1021/ja1107436 (2011).
14. Han, S. P., Barish, R. D. & Goddard, W. A. (Google Patents, 2015).
15. Han, S.-P., Goddard III, W. A., Scherer, L. & Rossi, J. J. Signal activatable constructs and related components compositions methods and systems. USA patent US9725715B2 (2015).
16. Hochrein, L. M., Ge, T. J., Schwarzkopf, M. & Pierce, N. A. Signal Transduction in Human Cell Lysate via Dynamic RNA Nanotechnology. ACS Synthetic Biology,
doi:10.1021/acssynbio.8b00424 (2018).
17. Hochrein, L. M., Schwarzkopf, M., Shahgholi, M., Yin, P. & Pierce, N. A. Conditional Dicer Substrate Formation via Shape and Sequence Transduction with Small Conditional RNAs. Journal of the American Chemical Society 135, 17322-17330, doi:10.1021/ja404676x (2013).
18. Bindewald, E. et al. Multistrand Structure Prediction of Nucleic Acid Assemblies and Design of RNA Switches. Nano Letters 16, 1726-1735, doi:10.1021/acs.nanolett.5b04651 (2016).
19. Chatterjee, G., Chen, Y.-J. & Seelig, G. Nucleic Acid Strand Displacement with Synthetic mRNA Inputs in Living Mammalian Cells. ACS Synthetic Biology, doi:10.1021/acssynbio.8b00288 (2018).
20. Li, X., Yang, X., Qi, J. & Seeman, N. C. Antiparallel DNA Double Crossover Molecules As Components for Nanoconstruction. Journal of the American Chemical Society 118, 6131-6140, doi:10.1021/ja960162o (1996).
21. Ha, M. & Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 509, doi:10.1038/nrm3838 (2014).
22. MacRae, I. J. et al. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science (New York, N.Y.) 311, 195-198, doi:10.1126/science.1121638 (2006).
23. Kim, D.-H. et al. Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nat Biotech 23, 222-226, doi:http://www.nature.com/nbt/journal/v23/n2/suppinfo/nbt1051_S1.html (2005).
24. Khvorova, A. & Watts, J. K. The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nat Biotech 35, 238-248, doi:10.1038/nbt.3765 (2017).
25. Srinivas, N. et al. On the biophysics and kinetics of toehold-mediated DNA strand displacement. Nucleic Acids Research 41, 10641-10658, doi:10.1093/nar/gkt801 (2013).
26. ORBAN, T. I. & IZAURRALDE, E. Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome. RNA (New York, N.Y.) 11, 459-469, doi:10.1261/rna.7231505 (2005).
27. Hope, T. J. & Trono, D. Structure, Expression, and Regulation of the HIV Genome, <http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-00&doc=kb-02-01-02> (2000).
28. Kundu, M. & Liu, P. P. Function of the inv(16) fusion gene CBFB-MYH11. Current Opinion in Hematology 8, 201-205 (2001).
29. Look, A. T. Oncogenic Transcription Factors in the Human Acute Leukemias. Science (New York, N.Y.) 278, 1059-1064, doi:10.1126/science.278.5340.1059 (1997).
30. Plimpton, S. Fast Parallel Algorithms for Short-Range Molecular Dynamics. Journal of Computational Physics 117, 1-19, doi:http://dx.doi.org/10.1006/jcph.1995.1039 (1995).
31. Condon, D. E. et al. Optimization of an AMBER Force Field for the Artificial Nucleic Acid, LNA, and Benchmarking with NMR of L(CAAU). The Journal of Physical Chemistry B 118, 1216-1228, doi:10.1021/jp408909t (2014).
32. Lind, K. E., Sherlin, L. D., Mohan, V., Griffey, R. H. & Ferguson, D. M. in Molecular Modeling of Nucleic Acids Vol. 682 ACS Symposium Series Ch. 3, 41-54 (American Chemical Society, 1997).
33. Aduri, R. et al. AMBER Force Field Parameters for the Naturally Occurring Modified Nucleosides in RNA. Journal of Chemical Theory and Computation 3, 1464-1475, doi:10.1021/ct600329w (2007).
34. Iwamoto, N. et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nat Biotech advance online publication, doi:10.1038/nbt.3948 http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/abs/nbt.3948.html#supplementaryinformation (2017).
35. Glaser, S. P. et al. Anti-apoptotic Mcl-1 is essential for the development and sustained growth of acute myeloid leukemia. Genes & Development 26, 120-125, doi:10.1101/gad.182980.111 (2012).
36. Collingwood, M. A. et al. Chemical Modification Patterns Compatible with High Potency Dicer-Substrate Small Interfering RNAs. Oligonucleotides 18, 187-200, doi:10.1089/oli.2008.0123 (2008).
37. Yin, P. & Pierce, N. A. Triggered RNAi. USA patent US8318921B2 (2008).
38. Lee, H. Y., Zhou, K., Smith, A. M., Noland, C. L. & Doudna, J. A. Differential roles of human Dicer-binding proteins TRBP and PACT in small RNA processing. Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkt361 (2013).
39. Han, S. P., Goddard, W. A., SCHERER, L. & Rossi, J. J. (Google Patents, 2015).
40. Silverman, S. K. Control of macromolecular structure and function using covalently attached double-stranded DNA constraints. Molecular BioSystems 3, 24-29, doi:10.1039/B614116A (2007).
41. Engelen, W., Janssen, B. M. G. & Merkx, M. DNA-based control of protein activity. Chemical Communications 52, 3598-3610, doi:10.1039/C5CC09853J (2016).
42. Mukherjee, P., Leman, L. J., Griffin, J. H. & Ghadiri, M. R. Design of a DNA-Programmed Plasminogen Activator. Journal of the American Chemical Society 140, 15516-15524, doi:10.1021/jacs.8b10166 (2018).
43. Colasanti, A. V., Lu, X.‐J. & Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. e4401, doi:doi:10.3791/4401 (2013).
44. Zadeh, J. N. et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry 32, 170‐173, doi:10.1002/jcc.21596 (2011).
45. Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. & Turner, D. H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure11 Edited by I. Tinoco. Journal of Molecular Biology 288, 911‐940, doi:https://doi.org/10.1006/jmbi.1999.2700 (1999).
46. Camacho, C. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics 10, 421‐421, doi:10.1186/1471‐2105‐10‐421 (2009).
47. Tolstrup, N. et al. OligoDesign: optimal design of LNA (locked nucleic acid) oligonucleotide capture probes for gene expression profiling. Nucleic Acids Research 31, 3758‐3762 (2003).
48. Scherer, L. J., Frank, R. & Rossi, J. J. Optimization and characterization of tRNA‐shRNA expression constructs. Nucleic acids research 35, 2620‐2628, doi:10.1093/nar/gkm103 (2007).
49. Macke, T. J. & Case, D. A. in Molecular Modeling of Nucleic Acids Vol. 682 ACS Symposium Series Ch. 24, 379‐393 (American Chemical Society, 1997).
50. Duan, Y. et al. A point‐charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed‐phase quantum mechanical calculations. Journal of Computational Chemistry 24, 1999‐2012, doi:10.1002/jcc.10349 (2003).
51. Aduri, R. et al. AMBER Force Field Parameters for the Naturally Occurring Modified Nucleosides in RNA. Journal of Chemical Theory and Computation 3, 1464‐1475, doi:10.1021/ct600329w (2007).
52. Condon, D. E. et al. Optimization of an AMBER Force Field for the Artificial Nucleic Acid, LNA, and Benchmarking with NMR of L(CAAU). The Journal of Physical Chemistry B 118, 1216‐1228, doi:10.1021/jp408909t (2014).
53. Lind, K. E., Sherlin, L. D., Mohan, V., Griffey, R. H. & Ferguson, D. M. in Molecular Modeling of Nucleic Acids Vol. 682 ACS Symposium Series Ch. 3, 41‐54 (American Chemical Society, 1997).
54. Wang, J., Wolf, R. M., Caldwell, J. W., Kollman, P. A. & Case, D. A. Development and testing of a general amber force field. Journal of Computational Chemistry 25, 1157‐1174, doi:10.1002/jcc.20035 (2004).
55. Mark, P. & Nilsson, L. Structure and Dynamics of the TIP3P, SPC, and SPC/E Water Models at 298K. The Journal of Physical Chemistry A 105, 9954‐9960, doi:10.1021/jp003020w (2001).
56. Plimpton, S. Fast Parallel Algorithms for Short‐Range Molecular Dynamics. Journal of Computational Physics 117, 1‐19, doi:http://dx.doi.org/10.1006/jcph.1995.1039 (1995).
57. Pettersen, E. F. et al. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry 25, 1605‐1612, doi:10.1002/jcc.20084 (2004).
58. Colasanti, A. V., Lu, X.‐J. & Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. e4401, doi: doi:10.3791/4401 (2013).
59. Mathews et al., Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure, J. Mol. Biol. (1999) 288: 911-940.
60. U.S. Patent No. 9,029,524.
61. Meggers, et al., Acc. Chem. Res. (2010) 43(8): 1092-1102.
62. Schlegel et al., J. Am. Chem. Soc. (2017) 139(25): 8537-8546.
【図1a】
【図1b-d】
【図2】
【図3a-1】
【図3a-2】
【図3b-1】
【図3b-2】
【図3c】
【図3d】
【図3e-1】
【図3e-2】
【図3f-1】
【図3f-2】
【図4】
【図5a-f】
【図5g-j】
【図5k】
【図6】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図8f】
【図8g】
【図8h】
【図8i】
【図8j】
【図8k】
【図8l】
【図9a-b】
【図9c】
【図10】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021年4月12日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0009】
【図1a】図１は、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの概念的設計、動作及び分子動力学シミュレーションを示す。図１ａは、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの概念的二次構造及び三次構造を示す。ジアルジア（Giardia）属のＤｉｃｅｒの（Ｘ線により解析された）結晶構造へのＲＮＡｉ二重鎖のドッキングは、センサー二重鎖とＤｉｃｅｒとの間の大きな立体衝突（steric clash）を示す。
【図1b-d】図１は、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの概念的設計、動作及び分子動力学シミュレーションを示す。図１ｂは、鎖置換によるＲＮＡｉの活性化を示す。相補的なインプットＲＮＡがＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡに遭遇すると（Ｉ）、インプット鎖は、センサー鎖上の３’又は５’一本鎖オーバーハングと足掛かりを形成し（ＩＩ）、鎖置換をもたらす（ＩＩＩ）。置換はＲＮＡｉ二重鎖からセンサー鎖を分離する（ＩＶ）。細胞ヌクレアーゼがＲＮＡｉ二重鎖上のコア鎖オーバーハングを除去し（Ｖ）、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングのための活性なＲＮＡｉトリガーを残す（ＶＩ）。図１ｃ及び１ｄは、構築物Ｉ．１及び構築物ＩＩＩ．１の分子動力学（ＭＤ）最適化モデルを示す。緑の矢印はセンサー鎖の３’及び５’末端からの鎖置換の方向を示す。
【図2】図２（配列番号７７及び１１３）は、化学的に改変された一本鎖オーバーハングの細胞内分解を示す。ノーザンブロットは、試験構築物上のホスホロチオエート（ＰＳ）保護された５’オーバーハングの段階的分解を示す。ＨＣＴ１１６細胞中に、試験構築物（セグメント化されたパッセンジャー鎖及びさまざまな５’オーバーハングを有するＤｉｃｅｒ基質）を２４時間かけてトランスフェクトした。全てのＲＮＡを抽出しノーザンブロットで分析した。類似のサンプルの２つのセットを分析したところ、異なるローディング濃度において類似の結果が示された。
【図4】図４ａ及び４ｂは、ＨＣＴ １１６細胞におけるインプットＲＮＡのノーザンブロットを示す。４８時間後にＨＣＴ １１６細胞から回収されたｔａｔ／ｒｅｖ及びＡＭＬインプットＲＮＡをプローブするノーザンブロットアッセイ。図４ａは、それらの共通のリーダー配列にマッチする変異体ｔＲＮＡＬｙｓ３でプローブしたｔａｔ／ｒｅｖ ＲＮＡ転写物を示す。レーン：（Ｌ）Ambion decadeマーカー；（０）モックトランスフェクション由来のＲＮＡを用いた陰性対照；（１）完全にマッチするインプットＲＮＡ；（２）５’ミスマッチしたインプットＲＮＡ；（３）完全にミスマッチしたインプットＲＮＡ；（４）二重鎖ミスマッチしたアクチベーター（使用せず）；（５）３’ミスマッチしたアクチベーター。インプットＲＮＡの予想されたサイズは、１４５〜１５０ｎｔであった。図４ｂは、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１ ＲＮＡ転写物を示す。レーン：（０）モックトランスフェクション；（１）ｔａｔ／ｒｅｖ完全マッチインプットＲＮＡ（比較のため）；（２）ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１融合物；（３）ＭＹＨ１１親；（４）ＭＹＨ１１親。連続するパネルは、変異体ｔＲＮＡＬｙｓ３プローブ、ＭＹＨ１１プローブ及びＣＢＦβプローブでプローブした同じサンプルを示す。インプットＲＮＡの発現量は、全てのコホートで同等であった。
【図5a-f】図５ａ〜ｆは、構築物Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩバリアントのアセンブリ、鎖置換、ＲＮＡｉ活性並びにＲＮＡｉ活性化を示す。図５ａ、５ｄは、構築物Ｉ及びＩＩアセンブリの非変性ＰＡＧＥ並びに１×ＰＢＳ緩衝液中３７℃での等温鎖置換を示す。構築物Ｉ及びＩＩは、そのそれぞれのインプット鎖によってディスアセンブルされ、ミスマッチしたインプット鎖によっては影響を受けない。対照レーンは、Ｉ＝インプット鎖、Ｃ＝構築物、Ｐ＝ＲＮＡｉ二重鎖、Ｗ＝廃棄二重鎖である。図５ｂ、５ｅは、ミスマッチしたインプット鎖の存在下又はインプット鎖の不存在下での構築物、及びミスマッチしたインプット鎖の存在下でのオン状態の構築物のＲＮＡｉ活性を示す。図５ｃ、５ｆは、示したインプット鎖を発現する細胞におけるオフ状態の構築物のＲＮＡｉ活性を示す。
【図5g-j】図５ｇ、５ｈは、ミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞における構築物ＩＩバリアントのオフ及びオン状態のＲＮＡｉ活性を示す。図５ｉ、５ｊは、ミスマッチした又はマッチするインプット鎖のいずれかを発現する細胞における、異なるコア鎖改変を有するオフ状態の構築物ＩＩ及びＩＩＩバリアントのＲＮＡｉ活性を示す。
【図6】図６は、予め活性化されたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡ構築物のＤｉｃｅｒによるプロセシングを示す。４８時間後にＨＣＴ １１６細胞から回収されたＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡガイド鎖をプローブするノーザンブロットアッセイ。レーンは、以下のとおりである：（Ｌ）Ambion decadeマーカー；（０）モックトランスフェクションした細胞由来のＲＮＡ；（１）及び（２）この明細書には開示していない第３のプロトタイプＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡからのガイド鎖；（３）及び（４）オフ及びオン状態のプロトタイプＨＩＶ構築物；（５）及び（６）オフ及びオン状態のＡＭＬ構築物。矢印はＤｉｃｅｒ切断されたガイド鎖の位置を示す。Ｄｉｃｅｒ切断の産物（約２１ｎｔのガイド鎖断片）は、オン状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞から抽出されたＲＮＡ材料で検出されたが、オフ状態のＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞から抽出されたＲＮＡ材料では検出されなかった。
【図7】図７は、各らせん中の２３塩基対の塩基対パラメーターが、ｘ３ＤＮＡ43を使用して５ｐｓ毎に測定し、ヒートマップとしてプロットされたことを示す。塩基対を上（１）から下（２３）まで番号付けした。塩基対パラメーターの定義は、ウェブサイトx3dna.org/articles/seeing-is-understanding-as-well-as-believingに示されている。
【図8a】図８ａは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のツイスト（twist）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8b】図８ｂは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のライズ（rise）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8c】図８ｃは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のロール（roll）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8d】図８ｄは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のスライド（slide）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8e】図８ｅは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のシフト（shift）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8f】図８ｆは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のプロペラ（propeller）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。本発明者らは、正常ＲＮＡ値からの顕著な逸脱を観察した。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8g】図８ｇは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のシア（shear）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8h】図８ｈは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のスタッガー（stagger）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8i】図８ｉは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のストレッチ（stretch）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8j】図８ｊは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。後続の塩基対に対する塩基対１〜２２のティルト（tilt）パラメーターを測定する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8k】図８ｋは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のバックル（buckle）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図8l】図８ｌは、センサー二重鎖及びｓｉＲＮＡ二重鎖の５ナノ秒間の分子動力学シミュレーションによる塩基対パラメーターを示す。塩基対１〜２３のオープニング（opening）パラメーターを定義する。各測定値のヒートスケールは、ＨＩＶ構築物及びＡＭＬ構築物のｓｉＲＮＡ二重鎖及びセンサー二重鎖と同一の塩基配列を有する４つの未改変ＲＮＡ二重鎖を５ナノ秒間測定した対照ＭＤ軌跡の平均値を中心にしている。ヒートスケールは、同じ対照の軌跡で測定した３標準偏差に及ぶ。これらのプロットにおいて、構築物１はＨＩＶ構築物で、構築物２はＡＭＬ構築物である。
【図9a-b】図９ａ〜９ｂ（配列番号７０〜７２）は、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１を感知するＭＣＬ−１標的化Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性、センサー鎖設計及び配列を示す。図９ａは、無関係な転写物、融合アクチベーター、ＭＹＨ１１又はＣＢＦβ転写物を発現する細胞における構築物ＩＶバリアントのＲＮＡｉ活性を示す。図９ｂは、各転写物上のセンサー鎖結合位置を示す。
【図9c】図９ｃ（配列番号７０〜７２）は、ＣＢＦβ−ＭＹＨ１１を感知するＭＣＬ−１標的化Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性、センサー鎖設計及び配列を示す。図９ｃは、ＩＶ．３の配列マップを示す。黄色の強調は、最適化された化学的改変モチーフを有する領域（領域Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を示す。
【図10】図１０ａ〜１０ｂは、異なるインプットＲＮＡ（構築物Ｉ．１（図１０ａ）及び構築物ＩＩＩ．１（図１０ｂ））の相対的ＲＮＡｉ活性を示す。図５ｃ及び５ｆの標的発現データを、Ｃｏｎｄ-ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたが、完全にミスマッチしたインプット鎖を発現している細胞の発現量に対して再標準化した。結果は、マッチするインプット鎖を発現する細胞における標的発現量が、ミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞における標的発現量よりも低かったことを示している。図１０ａ：構築物Ｉ．１について、５’ミスマッチした及び完全にマッチしたインプット鎖を発現する細胞は、標的発現を減少した。図１０ｂ：ＩＩＩ．１について、融合したインプット鎖を発現する細胞は、標的発現を減少した。
【図11】図１１は、ＨＣＴ１１６細胞中に１ｎＭ濃度で２４時間トランスフェクトした以前の世代のＲＮＡｉトリガー設計のノーザンブロットを示す。トリガーの二次構造を図示する。緑の点は2'-O-メチルＲＮＡ塩基を示す。青の点はＤＮＡを示す。白の点はＲＮＡを示す。黒の矢印はＤｉｃｅｒ産物を示す。結果は、隣接する2'-O-メチル改変された二重鎖を有する二重鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒ産物を低減したことを示す。
【図12a】図１２ａ（配列番号７３〜７５）は、本明細書で開示するＣｏｎｄ-ｓｉＲＮＡの一例を示す。図１２ａは、構築物の構造を示し、ここで、センサードメイン及びｓｉＲＮＡドメインには灰色の影をつけ、センサー二重鎖を囲み中に示す。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0041】
化学的に改変された一本鎖オーバーハングの細胞内分解において使用される鎖の組成は、以下のとおりであった：配列（５’−＞３’）
ガイド鎖Ａ：ｍＣｍＧ ＣＧＵＣＵＧＡＧＧＧＡＵＣＵＣＵＡＧＵ ＵＡＣＣＵＵ（配列番号７６）
ガイド鎖Ｂ：ｍＣｍＧ＋ＣＧＵＣＵＧＡＧＧＧＡＵＣＵＣＵＡＧＵ＋ＴＡＣＣＵＵ（配列番号７７）
３’パッセンジャーセグメント：ｃｃｃｕｃａｇａｃｇ ｍｃ＊ｍｇ＊ ９ｓ ｉｄＴ（配列番号７８）
５’パッセンジャーセグメント
０（対照）：ｃ３ ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ（配列番号７９）
１：Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ Ｕ Ｃ Ａ Ｕ Ｃ Ａ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ（配列番号８０）
２：１８ｓ ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ（配列番号８１）
３：１８ｓ ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ Ｕ Ｃ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ（配列番号８２）
４：１８ｓ ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ Ｕ Ｃ Ａ Ｕ Ｃ ｃ３ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ ＡＡＣＵｍＡＧＡｍＧＡｍＵ（配列番号８３）
ノーザンプローブ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴＡＣＣ（配列番号８４）
Ｌ：Ambion decadeマーカー
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0045】
【表1】
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0047】
【表2】
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0070】
【表4】
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0091】
【化1】
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0093】
ｔＲＮＡＬｙｓ３の最初の６９ヌクレオチドを含む親プラスミドをクローニングするために、ＮｒｕＩ制限部位48で終結した。ＮｒｕＩによる親プラスミドの消化は、ヌクレオチドｔＲＮＡ ６９の直後に平滑末端を生成する。アニーリングされた重複するオリゴは、残りの改変されたｔＲＮＡヌクレオチドとそれに続く特定の活性化配列をコードする。各活性化配列は、１２塩基のテトラループ（ＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣ）（配列番号１０７）とそれに続くＰｏｌ ＩＩＩ終結配列をコードするＴ６ランで終結する。Ｕ４＋ＲＮＡ転写物配列を以下に列挙する。【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0095】
【化2】
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0097】
【表5】
【国際調査報告】