特開 2015-209376 腫瘍特異的免疫増強剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-209376(P2015-209376A)

(43)【公開日】2015年11月24日

(54)【発明の名称】腫瘍特異的免疫増強剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20151027BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20151027BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20151027BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20151027BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20151027BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20151027BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20151027BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20151027BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20151027BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 T

   A61K45/00

   A61K48/00

   A61K31/7105

   A61P35/00

   A61P43/00 121

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

   G01N33/574 D

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2014-89806(P2014-89806)

(22)【出願日】2014年4月24日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）平成２５年１１月１８日 特定非営利活動法人日本免疫学会 発行 「日本免疫学会総会・学術集会記録 第４２巻 プロシーディングス 第１２頁Ｓ７−４」、及び平成２５年１２月１２日 特定非営利活動法人日本免疫学会 「日本免疫学会総会・学術集会２０１３」に発表 （２）平成２５年１２月６日 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｋｕｄａｉ．ａｃ．ｊｐ （３）平成２５年１２月５日 Ｍｕｈａｍｍａｄ Ｂａｇｈｄａｄｉ、米田明弘、山階維騎、永尾宗子、菰原義弘、永井重徳、秋葉久弥、Ｍａｒｃ Ｆｏｒｅｔｚ、吉山裕規、木下一郎、秋田弘俊、竹屋元裕、Ｂｅｎｏｉｔ Ｖｉｏｌｌｅｔ、八木田秀雄、地主将久 「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９，１０７０−１０８１頁」に発表

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(71)【出願人】

【識別番号】502285457

【氏名又は名称】学校法人順天堂

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】地主 将久

(72)【発明者】

【氏名】八木田 秀雄

(72)【発明者】

【氏名】秋葉 久弥

【テーマコード（参考）】

2G045

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045BB20

2G045CB02

2G045DA36

2G045DA80

2G045FB03

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZB261

4C085AA14

4C085BB01

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

(57)【要約】

【課題】新たながん治療手段の提供。
【解決手段】１）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、
２）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＡＭＰＫα１の機能阻害作用を有する薬物、又は
３）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのオートファジー活性化を抑制する薬物、を有効成分とする、マクロファージにおける腫瘍抗原提示能低下を抑制することに基づく腫瘍特異的免疫増強剤。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、
２）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＡＭＰＫα１の機能阻害作用を有する薬物、又は
３）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのオートファジー活性化を抑制する薬物、を有効成分とする、マクロファージにおける腫瘍抗原提示能低下を抑制することに基づく腫瘍特異的免疫増強剤。

【請求項2】

Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージ存在下で腫瘍細胞傷害性抗がん剤と併用するとき、抗腫瘍効果が増強される腫瘍特異的免疫増強剤である請求項１記載の腫瘍特異的免疫増強剤。

【請求項3】

有効成分が、抗Ｔｉｍ−４抗体である請求項１又は２記載の腫瘍特異的免疫増強剤。

【請求項4】

抗Ｔｉｍ−４抗体が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８０３のハイブリドーマより産生される抗体、そのヒト化抗体またはその抗原結合性断片である請求項３記載の腫瘍特異的免疫増強剤。

【請求項5】

有効成分が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃまたはその誘導体である請求項１又は２記載の腫瘍特異的免疫増強剤。

【請求項6】

請求項１又は２記載の有効成分が、ＡＭＰＫαの特異的ｓｉＲＮＡである請求項１又は２記載の腫瘍特異的免疫増強剤。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれかに記載の腫瘍特異的免疫増強剤と、薬学的に許容可能な担体を含む腫瘍特異的免疫増強用の医薬組成物。

【請求項8】

請求項１〜６のいずれかに記載の腫瘍特異的免疫増強剤と、腫瘍細胞傷害性抗がん剤を含有するがん治療用キット製剤。

【請求項9】

１）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用の阻害、
２）ＡＭＰＫα１機能阻害、
３）オートファジーの活性化阻害、
４）抗原提示能の増強、又は
５）Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージ存在下で細胞傷害性抗がん剤との相乗効果
を指標に薬物を選択する、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージにおける腫瘍抗原提示能低下を抑制することに基づく腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。

【請求項10】

腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞を貪食させたＴｉｍ−４陽性マクロファージを用いて、Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１の局在を評価することによる、請求項９記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。

【請求項11】

腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞又はグルコース飢餓のがん細胞を用いて、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージ、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージ及び腹腔内マクロファージに、それらを貪食させた場合のＡＭＰＫα１のリン酸化活性を評価することによる、請求項９記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。

【請求項12】

腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞を貪食させたＴｉｍ−４陽性マクロファージを用いて、オートファジー活性の指標であるＬＣ３顆粒状変化を指標に評価することによる、請求項９記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。

【請求項13】

腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞を貪食させたＴｉｍ−４陽性マクロファージで刺激されたＯＴ−１細胞からのＩＮＦγ産生量を指標として評価することによる、請求項９記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。

【請求項14】

腫瘍内にＴｉｍ−４陽性マクロファージを有する担癌動物で、腫瘍細胞傷害性抗がん剤との併用効果を評価することによる、請求項９記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。

【請求項15】

ＭＣ３８大腸癌を移植したＡｔｇ５ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘキメラマウスにおいて、腫瘍細胞傷害性抗がん剤との併用効果を評価することによる、請求項１４記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。

【請求項16】

腫瘍細胞傷害性抗がん剤に対する抵抗性を予測診断するために、腫瘍内Ｔｉｍ−４陽性のマクロファージおよび／又は樹状細胞の存在比率を評価することによるＴｉｍ−４陽性細胞の検査法。

【請求項17】

抗Ｔｉｍ−４抗体を用いて評価する、請求項１６記載の検査法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんの治療に有用な腫瘍特異的免疫増強剤に関する。

【背景技術】

【0002】

抗がん剤治療の主な副作用として免疫抑制が知られているが、この免疫抑制の発現メカニズムの詳細や抗がん剤の治療効果への影響などについては知られていない。この免疫抑制の発現メカニズムを解明することは、抗がん剤治療の副作用軽減手段の開発だけでなく、抗がん剤治療効果を向上させるうえでも重要である。

【0003】

ところで、Ｔｉｍ（Ｔ細胞イムノグロブリン及びムチンドメイン）遺伝子ファミリーは、喘息を含む免疫機能不全に関与する遺伝子として同定された（特許文献１）。Ｔｉｍ遺伝子ファミリーとしては、Ｔｉｍ−１、Ｔｉｍ−３及びＴｉｍ−４が知られており、悪性腫瘍、その診断等に有用であることが知られている（特許文献１及び２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００７−１４６号公報

【特許文献2】国際公開第２０１３／００６２２７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、Ｔｉｍファミリーのうち、Ｔｉｍ−４がどのようにして腫瘍免疫に作用しているのかその詳細については知られていない。
本発明の課題は、Ｔｉｍ−４の免疫機能への作用機序の詳細を解明し、新たな抗がん剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

そこで本発明者は、Ｔｉｍファミリーのうち、Ｔｉｍ−４に着目し、その発現部位、その作用発現メカニズムについて検討してきたところ、Ｔｉｍ−４が腫瘍内マクロファージ特異的に発現すること、さらにＴｉｍ−４は、腫瘍内マクロファージ特異的にＡＭＰ活性化キナーゼα１（ＡＭＰＫα１）と相互作用することにより、ＡＭＰＫα１リン酸化及びＵＬＫ１（Ａｔｇ１）リン酸化を誘導し、オートファジー応答活性化に繋がることを見出した。さらに検討した結果、ＡＭＰＫα１とＴｉｍ−４の相互作用を阻害する薬物、例えばＡＭＰＫα１とＴｉｍ−４との相互作用を阻害する抗Ｔｉｍ−４抗体を用いれば、Ｔｉｍ−４によるＡＭＰＫα１の活性化が阻害され、ひいては腫瘍内マクロファージ特異的にオートファジーが不活性化されること、さらには腫瘍内マクロファージ特異的抗原提示能を促進することを見出した。さらには、当該抗Ｔｉｍ−４抗体と、腫瘍細胞傷害性抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の作用が増強され、抗がん治療抵抗性を克服できることを見出した。言い換えると、腫瘍細胞傷害性抗がん剤にさらされた事例では、当該腫瘍内にＴｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージが高発現すること、そのＴｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージにおいては「ＴＩＭ-4−ＡＭＰＫα１−オートファジー経路」が活性化し、当該マクロファージの抗原提示能を低下させ、ひいては抗腫瘍免疫の低下・癌化学療法の効果の減弱をもたらしていることを見出した。また、Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージ存在下で、当該Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、ＡＭＰＫα１の機能を阻害する薬物、又は腫瘍内マクロファージ特異的オートファジーの機能を阻害する薬物と、腫瘍細胞傷害性抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の作用が増強され、抗がん治療抵抗性を克服できることを見出した。
さらには、ＡＭＰＫα１とＴｉｍ−４との相互作用を阻害する薬剤も含めた、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージにおける「ＴＩＭ-4−ＡＭＰＫα１−オートファジー経路」に依存する抗原提示能のいずれかのプロセスに作用する薬剤をスクリーニングすることにより、新規なメカニズムによる優れた腫瘍特異的免疫増強剤をスクリーニングできることを見出した。
さらにはまた、腫瘍内マクロファージのＴｉｍ−４陽性率を評価することにより、腫瘍細胞傷害性抗がん剤への抵抗性を予測できることを見出した。

【0007】

すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕１）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、
２）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＡＭＰＫα１の機能阻害作用を有する薬物、又は
３）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのオートファジー活性化を抑制する薬物、を有効成分とする、マクロファージにおける腫瘍抗原提示能低下を抑制することに基づく腫瘍特異的免疫増強剤。
〔２〕Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージ存在下で腫瘍細胞傷害性抗がん剤と併用するとき、抗腫瘍効果が増強される腫瘍特異的免疫増強剤である〔１〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤。
〔３〕有効成分が、抗Ｔｉｍ−４抗体である〔１〕又は〔２〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤。
〔４〕抗Ｔｉｍ−４抗体が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８０３のハイブリドーマより産生される抗体、そのヒト化抗体またはその抗原結合性断片である〔３〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤。
〔５〕有効成分が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃまたはその誘導体である〔１〕又は〔２〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤。
〔６〕〔１〕又は〔２〕記載の有効成分が、ＡＭＰＫαの特異的ｓｉＲＮＡである〔１〕又は〔２〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の腫瘍特異的免疫増強剤と、薬学的に許容可能な担体を含む腫瘍特異的免疫増強用の医薬組成物。
〔８〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の腫瘍特異的免疫増強剤と、腫瘍細胞傷害性抗がん剤を含有するがん治療用キット製剤。
〔９〕１）Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでのＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用の阻害、
２）ＡＭＰＫα１機能阻害、
３）オートファジーの活性化阻害、
４）抗原提示能の増強、又は
５）Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージ存在下で細胞傷害性抗がん剤との相乗効果
を指標に薬物を選択する、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージにおける腫瘍抗原提示能低下を抑制することに基づく腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。
〔１０〕腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞を貪食させたＴｉｍ−４陽性マクロファージを用いて、Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１の局在を評価することによる、〔９〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。
〔１１〕腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞又はグルコース飢餓のがん細胞を用いて、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージ、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージ及び腹腔内マクロファージに、それらを貪食させた場合のＡＭＰＫα１のリン酸化活性を評価することによる、〔９〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。
〔１２〕腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞を貪食させたＴｉｍ−４陽性マクロファージを用いて、オートファジー活性の指標であるＬＣ３顆粒状変化を指標に評価することによる、〔９〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。
〔１３〕腫瘍細胞傷害性抗がん剤による死滅がん細胞を貪食させたＴｉｍ−４陽性マクロファージで刺激されたＯＴ−１細胞からのＩＮＦγ産生量を指標として評価することによる、〔９〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。
〔１４〕腫瘍内にＴｉｍ−４陽性マクロファージを有する担癌動物で、腫瘍細胞傷害性抗がん剤との併用効果を評価することによる、〔９〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。
〔１５〕ＭＣ３８大腸癌を移植したＡｔｇ５ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘキメラマウスにおいて、腫瘍細胞傷害性抗がん剤との併用効果を評価することによる、〔１４〕記載の腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法。
〔１６〕腫瘍細胞傷害性抗がん剤に対する抵抗性を予測診断するために、腫瘍内Ｔｉｍ−４陽性のマクロファージおよび／又は樹状細胞の存在比率を評価することによるＴｉｍ−４陽性細胞の検査法。
〔１７〕抗Ｔｉｍ−４抗体を用いて評価する、〔１６〕記載の検査法。

【発明の効果】

【0008】

本発明の腫瘍細胞特異的免疫増強剤の作用点であるＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用は腫瘍内マクロファージに特異的であり、他のＴｉｍ−４陽性細胞には認められない分子機構である。従って、本発明の医薬を用いれば悪性腫瘍特異的な免疫を増強できるとともに、抗がん剤の副作用を軽減し、かつ抗がん剤の治療抵抗性を克服することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A】Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ腫瘍形成マウスにおけるマクロファージでのＴｉｍ−４発現の検証を示す。腫瘍所属リンパ節、および脾臓に比較して、腫瘍内マクロファージで高いＴｉｍ−４発現を認める。

【図1B】抗がん剤治療により死滅した腫瘍細胞由来のＤＡＭＰｓは、骨髄マクロファージ上へのＴｉｍ−４発現の誘導に貢献することを示す。ＡＴＰ阻害剤（Ａｐｙｒａｓｅ）、抗ＨＭＧＢ１中和抗体、ＨＳＰ９０阻害剤（１７−ＡＡＧ）の単剤、あるいは３者すべて（Ａｌｌ）の添加により、死滅がん細胞上清によるＴｉｍ−４誘導は有意に抑制される。

【図1C】ヒトのマクロファージまたは樹状細胞におけるＴｉｍ−４陽性細胞の分布を示す。健常人（ＨＶ：図中ではＨＤと記載。）の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）や癌患者（ＰＴ）のＰＢＬに比べ、腫瘍内に特異的にＴｉｍ−４陽性細胞が高い比率で分布している。

【図2A】Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでは、抗がん剤処理により死滅したがん細胞貪食によりオートファジー活性が認められる。図２Ａは、当該活性の指標であるＬＣ３顆粒状変化を示す。それに対してアミノ酸飢餓によるオートファジー活性はＴｉｍ−４に依存しない。

【図2B】Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでは、死滅がん細胞を取り込む二重膜構造を有するオートファジー小胞体が多数出現することを示す。一方、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージは、死滅がん細胞貪食によるオートファジー小胞体形成に乏しい。

【図3A】腫瘍内マクロファージのＴｉｍ−４はＡＭＰＫα１との相互作用を有し、死滅ＥＧ７がん細胞貪食により、その相互作用は増強することを示す。

【図3B】腫瘍内ＴＩＭ−４陽性マクロファージは、抗がん剤処理により死滅したＥＧ７がん細胞貪食によりＡＭＰＫα１リン酸化活性を誘導することを示す。その一方、Ｔｉｍ−４陰性マクロファージや腹腔内マクロファージでは、死滅がん細胞貪食時においてＡＭＰＫα１リン酸化活性を認めない。陽性コントロールであるグルコース飢餓では、細胞種に関わらず、ＡＭＰＫα１リン酸化活性を示す。

【図3C】腫瘍内マクロファージでは、死滅がん細胞貪食に伴いＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１の細胞内共局在を認めるのに対して、腹腔内マクロファージではＴｉｍ−４は細胞表面に留まることで、ＡＭＰＫα１との相互作用を認めないことを示す。

【図4A】死滅ＥＧ７がん細胞を貪食した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭｓ）により刺激されたＯＴ−１細胞でのＩＦＮγ産生を指標に、ＡＭＰＫα特異的ｓｉＲＮＡの効果、および抗Ｔｉｍ−４抗体の効果を示す。特に、死滅ＥＧ７がん細胞貪食したＴｉｍ−４陽性マクロファージにおいては、ＡＭＰＫα特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたマクロファージおよび抗Ｔｉｍ−４抗体で処理されたマクロファージにおいては、コントロールマクロファージで刺激された場合比較し、ＯＴ-１細胞での顕著に高いＩＦＮγ産生が認められ、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージにおける抗原提示能は、少なくてもＴｉｍ−４およびＡＭＰＫαの両機能に依存していることを示している。

【図4B】死滅ＥＧ７がん細胞を貪食した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭｓ）の抗原提示能におけるＡＭＰＫ阻害剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ）の効果を示す。すなわち、ＡＭＰＫの阻害剤として知られているＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｃで処理したＴｉｍ−４陽性ＢＭＤＭｓでＯＴ−１細胞を刺激した場合、非処理マクロファージにより刺激されたＯＴ−１細胞に比べ高いＩＦＮγ産生が認めら、ＡＭＰＫ阻害剤が「ＴＩＭ-４−ＡＭＰＫα１−オートファジー経路」を介した腫瘍抗原提示能の低下を抑制することを示している。

【図5A】Ｔｉｍ−４欠損あるいは野生型マウスとマクロファージ特異的Ａｔｇ５欠損マウス由来骨髄細胞を致死性放射線で処置した野生型マウスに１：１で混合移植したキメラモデルを作成した。さらに、このキメラマウスに対して、ＯＶＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞移入とＯＶＡ発現Ｂ１６メラノーマを移植することで、ＯＶＡ特異的なＴ細胞免疫の関与を生体内で検証することが可能であることを示す。

【図5B】上記骨髄キメラモデルを対象にして、抗がん剤（シスプラチン）の抗腫瘍効果に及ぼす役割を検証した図である。野生型−マクロファージ特異的Ａｔｇ５欠損マウス由来骨髄キメラマウス（ＬｙｓＭ−Ａｔｇ５^-/-／ＷＴ）では、シスプラチン非投与群（図中の印：●）と比較し、シスプラチン投与群では抗腫瘍効果は認められるものの不十分であった（図中の印：■）。それに対して、Ｔｉｍ−４欠損−Ａｔｇ５欠損マウス由来骨髄キメラマウス（ＬｙｓＭ−Ａｔｇ５^-/-／ＴＩＭ４−ＫＯ）においては、シスプラチン非投与群（図中の印：〇グレー）に比べ、シスプラチン単独で充分な抗腫瘍効果が発揮されていた（図中の印：□グレー）。

【図6A】ＭＣ３８大腸癌を移植したＡｔｇ５^flox/floxキメラマウス、およびＬｙｓＭ-Ａｔｇ５^-/-キメラマウスでの抗Ｔｉｍ−４抗体とＣＤＤＰとの併用効果の有無を示す。Ａｔｇ５^flox/floxマウスにおいてはＣＤＤＰとコントロール抗体の併用投与群（図中の印：・・・●・・・）での腫瘍増殖は、非投薬群（ＮＴ）と同様で、抗腫瘍効果が殆ど認められなかった。一方、抗Ｔｉｍ−４中和抗体との併用群（図中の印：・・・〇・・・）では、顕著な腫瘍縮小効果が認められた。一方、ＬｙｓＭ-Ａｔｇ５^-/-マウスでは、ＣＤＤＰとコントロール抗体の併用投与群とＣＤＤＰと抗ＴＩＭ-４抗体の併用投与群とでは、抗腫瘍効果に差異は認められなかった。

【図6B】ＩＣＤを誘導する抗がん剤（ＣＤＤＰ等）と、ＩＣＤを誘導しない（ｎｏｎ−ＩＣＤ）抗がん剤（ＯＸＰ等）とのＴＩＭ-４−オートファジー経路に与える影響を示す。いずれの群の抗がん剤においても、死滅がん細胞にさらされたＴＩＭ-４陽性マクロファージで刺激されたＯＴ-１細胞からのＩＮＦ-γの産生は、抗ＴＩＭ-４抗体の添加により、ＴＩＭ-４陰性マクロファージの場合と同様のレベルまで上昇することが示唆された。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明のマクロファージにおける腫瘍抗原提示能低下を抑制することに基づく腫瘍特異的免疫増強剤の有効成分は、１）Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、２）ＡＭＰＫα１の機能を阻害する薬物、または３）腫瘍内マクロファージのオートファジー機能を阻害する薬物である。１）の薬物の例としてはＮＩＴＥ Ｐ−０１８０３のハイブリドーマより産生される抗Ｔｉｍ−４モノクローナル抗体が挙げられる。
当該抗Ｔｉｍ−４抗体はＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害し、腫瘍特異的免疫制御作用を示す。

【0011】

ＡＭＰＫα１とＴｉｍ−４との相互作用を阻害する薬物としては、前記のモノクローナル抗体に限定されず、ポリクローナル抗体でもよい。医療用としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はそれらの抗原結合性断片が望ましく、それらも本発明に含まれる。また同様の活性を有するタンパク質、ペプチド、核酸（例：ｓｉＲＮＡ）、低分子化合物、及びそれらの誘導体でもよい。

【0012】

また、ＡＭＰＫα１の機能を阻害する薬物としては、その機能タンパク質に対する抗体、または機能タンパク質のペプチド断片等のタンパク質またはペプチド、上記機能タンパク質をコードする遺伝子のｓｉＲＮＡ（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（カタログ番号：ｓｃ-４５３１２）、Ａｍｂｉｏｎ（カタログ番号：４３９０８２））等も含めた核酸、また、本実施例で述べる低分子化合物（例えば、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ（ＣＡＳ番号：ＣＡＳ ８６６４０５−６４−３））、それらの誘導体、および、ぞれら化合物のＤＤＳ化物等が含まれる。

【0013】

更に、腫瘍内マクロファージのオートファジーの機能を阻害する薬物としては、腫瘍内マクロファージで本機能をコードする遺伝子に対する特異的ｓｉＲＮＡ、オートファジー阻害物として報告されているルカントン（J Biol Chem. 2011 vol.286, p6602（ＣＡＳ ４７９−５０−５））、それらの誘導体、および、それら化合物のＤＤＳ化物等が挙げられる。

【0014】

本明細書中で用いる用語「抗体」とは、キメラ、ヒト化、または単一鎖抗体の断片を含めた抗体の抗原結合性断片（例えば、Fab断片）をも含む。これらの抗体の種々の部分は常法の遺伝子工学技術によって組み替え作製することが可能である。例えば、キメラまたはヒト抗体を生産する技術としては、例えば、特許第２５９４９００号、特許第２８２８３４０号、特許第２９１２６１８号、および、特許第３１６２０５５号等に掲載されており、げっ歯類由来の抗体からキメラ抗体、ヒト化抗体を作製することは容易である。
また低分子化合物も、ある基本構造から各種誘導体を常法の技術で作製し、それらの中から後述のスクリーニング方法を活用すれば、抗がん剤の治療抵抗性を克服するような新規な腫瘍特異的免疫増強剤を見出すことも容易である。

【0015】

本発明者は、後記実施例に記載のように、腫瘍内に浸潤するマクロファージや樹状細胞にＴｉｍ−４が高発現すること、一方、腫瘍細胞を含めた上皮系細胞、繊維芽細胞や血管内細胞、Ｔリンパ球など他のリンパ系細胞では発現しないことを見出した。ヒトにおいても癌患者の腫瘍にＴｉｍ−４陽性マクロファージまたは樹状細胞が高発現していることを見出した。また、抗がん剤処理により腫瘍細胞から放出されるＨＭＧＢ−１、ＡＴＰ、Ｓ１００Ａ８、尿酸−ナトリウムなどのＤＡＭＰｓが、Ｔｉｍ−４発現誘導に寄与していることも見出した。
さらに、腫瘍内マクロファージに発現するＴｉｍ−４の機能を検討した結果、Ｔｉｍ−４はリソゾーム活性による死がん細胞の分化・消化を促進する機能を有すること、その死がん細胞分解機構がＴｉｍ−４陽性腫瘍マクロファージでは、死がん細胞貪食により特異的に、オートファジー活性が認められることを同定した。さらに、Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１は相互作用して、ＡＭＰＫα１リン酸化及びＵＬＫ１（Ａｔｇ１）リン酸化を誘導し、オートファジー活性化に寄与することを明らかにした。このＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用は、腫瘍内マクロファージに特異的で、腹腔内マクロファージなど他のＴｉｍ−４陽性細胞では認められなかった。
さらに、マクロファージに発現するＴｉｍ−４は、ＡＭＰＫα１によるオートファジー活性化を介して、腫瘍抗原提示能を負に制御することも明らかにした。そして、これらのＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用により生じる腫瘍特異的免疫抑制は、例えば本発明に用いる抗Ｔｉｍ−４抗体により改善されることを見出した。

【0016】

また、シスプラチン単独で十分な抗腫瘍効果が得られなかったモデルマウスにおいて、シスプラチンに加えて、前記抗Ｔｉｍ−４抗体を投与したところ、抗腫瘍効果が顕著に増強されることを見出した。

【0017】

従って、Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、例えば前記抗Ｔｉｍ−４抗体は、腫瘍特異的免疫増強剤として有用である。より詳細には、当該薬物は、腫瘍内マクロファージ特異的免疫増強剤、腫瘍内マクロファージのオートファジー不活性化剤、腫瘍抗原提示能促進剤として有用である。ここで腫瘍抗原提示細胞としては、マクロファージ、樹状細胞、単球が挙げられるが、腫瘍内マクロファージが好ましい。
また、Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージ存在下で、Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、ＡＭＰＫα１の機能を阻害する薬物、又は腫瘍内マクロファージのオートファジー機能を阻害する薬物と、腫瘍細胞傷害性抗がん剤とを併用すれば、腫瘍細胞傷害性抗がん剤の抗がん効果が増強し、抗がん剤として有用である。
また、前記Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、ＡＭＰＫα１の機能を阻害する薬物、又は腫瘍内マクロファージのオートファジー機能を阻害する薬物は、Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージ存在下で腫瘍細胞傷害性抗がん剤と併用するとき、腫瘍細胞傷害性抗がん剤の抵抗性克服剤および／または抵抗性化予防剤として有用である。より好ましくは、前記Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、ＡＭＰＫαの機能を阻害する薬物、腫瘍内マクロファージのオートファジー機能を阻害する薬物、又は腫瘍内マクロファージの抗原提示機能を阻害する薬物は、Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージが約５０％以上の存在下で腫瘍細胞傷害性抗がん剤と併用するとき、腫瘍細胞傷害性抗がん剤の抵抗性克服剤および／または抵抗性化予防剤として有用である。

【0018】

ここで腫瘍細胞傷害性抗がん剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬、ホルモン剤、生物製剤等が挙げられる。アルキル化剤としては、例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、プロカルバジン、ラニムスチン等が挙げられる。代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、クラドリビン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリン等が挙げられる。微小管阻害剤としては、例えば、ビンクリスチン等のアルカロイド系抗がん剤、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗がん剤が挙げられる。抗生物質抗がん剤としては、例えば、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマー等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としてはトポイソメラーゼＩ阻害作用を有するＣＰＴ−１１、イリノテカン、ノギテカン、トポイソメラーゼＩＩ阻害作用をもつエトポシド、ソブゾキサンが挙げられる。白金製剤としては、例えば、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等が挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、アストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、レトロゾール、エストラムスチン、トレミフェン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン等が挙げられる。生物製剤としては、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン２、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ等が挙げられる。分子標的薬としては、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、テムシロリムス、ベバシズマブ、ＶＥＧＦ ｔｒａｐ、スニチニブ、ソラフェニブ、トシツズマブ、ボルテゾミブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タミバロテン、トレチノイン等が挙げられる。ここに特定する分子標的薬以外にも、ヒト上皮性増殖因子受容体２阻害剤、上皮性増殖因子受容体阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、血管内皮増殖因子受容体２阻害剤（α−ＶＥＧＦＲ−２抗体）等の血管新生を標的にした阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤などの各種チロシンキナーゼ阻害剤、サイトカインを標的とした阻害剤、プロテアソーム阻害剤、抗体―抗がん剤配合体等の分子標的薬なども含めることができる。これら阻害剤には抗体も含む。上記の薬剤の他にも、以下の医薬も併用し得る；サリドマイド、エベロリムス、エルプラット、ＡＢＩ−００７、イキサベピロン、ミリプラチン、ラパチニブ、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ、クラドリビン、リポソーマルドキソルビシン、Ｚ−１００、ハイカムチン、バンデダニブ、ＺＤ４０５４、アナストロゾール、ＧＳＫ１５７２９３２Ａ、パゾパニブ、デノスマブ、Ｓ−１、モテサニブ、トラスツズマブ、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、イムシスト、ＮＩＫ−３３３、アキシチニブ、ボスチニブ、Ｅ７０８０、ソブリドチン、デガレリクス、フルベストラント、ゾラデックス、セディラニブ、エリブリン、ＴＳＵ−６８、ＴＡＣ−１０１、ＴＡＳ−１０８、ＮＫ９１１、ＮＫ１０５、エロチニブ、ＬＢＨ５８９、ＭＫ−０４５７、タミバロテン、レナリドミド、ＢＮＰ１３５０、ＡＺＤ０５３０、ＡＺＤ１１５２、ＡＺＤ２２８１、ＡＺＤ４８７７、ＡＢＴ−８６９、ＯＮＯ−４５３８、ＯＴＳ１０２、ＫＷ−０７６１、ＡＲＱ１９７、オファツムマブ、ＡＭＧ６５５、ＴＡＫ−７００、ＴＡＫ−６８３、ＴＡＫ−４４８、ＣＢＰ５０１、ＴＡＫ−２８５、ＴＡＫ−５９３、ＭＬＮ８０５４、ＭＬＮ４９２４、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｒ１５０７、ＮＫ０１２、ＢＩＢＦ１１２０、ＢＩＢＷ２９９２、Ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅ、ＭＫ−２４６１、ＣＰ７５１，８７１、ＰＦ−００２９９８０４、サトラプラチン、ＣＭＣ−５４４、ＹＭ１５５、ＧＰＩ２１０１６、ＹＨＯ−１３３５１。
これらの抗がん剤のうち、細胞傷害活性を特徴とするアルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬等が特に好ましい。具体的には、ゲムシタビン、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ダカルバジン、ドキソルビシン、ベバシズマブ、セツキシマブ、抗血管内皮増殖因子受容体２阻害抗体、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤等が特に好ましい。

【0019】

前記Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、ＡＭＰＫα１の機能を阻害する薬物、又は腫瘍内マクロファージのオートファジー機能を阻害する薬物、例えば抗Ｔｉｍ−４抗体と細胞傷害性抗がん剤は、一の製剤として用いてもよいし、それぞれ別の製剤の形態で用いてもよい。別の製剤にする場合、例えば注射剤と経口剤のように、投与ルートの異なる製剤の組み合せであってもよい。また、これらは同時に投与してもよいし、いずれか一方を先に投与し、他方を後に投与してもよい。
ところで、本発明の腫瘍特異的免疫増強用医薬組成物及びがん治療用医薬組成物としては、様々な剤型にすることができる。例えば、注射剤、経口剤、経鼻剤、および坐剤などの剤型が含まれる。従って、本医薬組成物で使用される「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合可能な任意の、または全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、安定化剤および吸収遅延剤などが含まれる。

【0020】

本発明のがん治療用医薬組成物は、ヒトを含む哺乳類の、多岐にわたるがんに対して有効であり、例えば咽頭癌、喉頭癌、舌癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、悪性黒色腫、甲状腺癌などの上皮がん；骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、繊維肉腫、白血病や悪性リンパ腫、骨髄腫などの非上皮がんが挙げられる。

【0021】

前記抗Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との相互作用を阻害する薬物、ＡＭＰＫα１の機能を阻害する薬物、又は腫瘍内マクロファージのオートファジー機能を阻害する薬物、例えばＴｉｍ−４抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ〜５００ｍｇであるのが好ましい。また、腫瘍細胞傷害性抗がん剤の投与量は、それぞれの抗がん剤の有効量またはその有効量の０．０１〜１倍までが好ましい。

【0022】

更に、本発明は、ＡＭＰＫα１とＴｉｍ−４との相互作用を阻害する新たな薬剤を見出す方法を提供し、新規な、優れた抗腫瘍免疫増強剤の発見に大きく寄与するものであると共に、癌化学療法に新たな展開をもたらすものであり、ＡＭＰＫα１とＴｉｍ−４との相互作用の阻害、それらの直接的な結合阻害、ＡＭＰＫα１の機能阻害、オートファジーの活性化阻害、抗原提示能の増強、および、抗がん剤との相乗効果を指標に実施する腫瘍特異的免疫増強剤のスクリーニング法は、「ＴＩＭ-４−ＡＭＰＫα１−オートファジー経路」のいずれかの工程をブロックする新たな腫瘍特異的免疫増強剤を見出すものであり、それらスクリーニング法も本発明に含まれる。具体的には、下記のような方法が挙げられるが、それに制限されるものではない。

【0023】

（Ａ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニング系
Ａ１）Ｔｉｍ−４とＡＭＰＫα１との結合：
・Ｔｉｍ−４陽性腫瘍内マクロファージに対して、抗がん剤（例えば、ＣＤＤＰ）で処理された死滅ＥＧ７がん細胞貪食後におけるＴＩＭ−４とＡＭＰＫα１の局在を、共焦点顕微鏡にて可視化することにより腫瘍特異的免疫増強物質を検出する方法（実施例３、図３Ａ参照）。
Ａ２）ＡＭＰＫα１の活性：
・死滅ＥＧ７がん細胞又はグルコース飢餓（ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ：ＧＳ）のＥＧ７がん細胞を用いて、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージ、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージ及び腹腔内マクロファージにそれらを貪食させた場合のＡＭＰＫα１のリン酸化活性を評価する方法（実施例３、図３Ｂ）
Ａ３）オートファジー活性：
・Ｔｉｍ−４陽性マクロファージを用い、抗がん剤（例えば、ＣＤＤＰ）処理により死滅したがん細胞貪食によりオートファジー活性の指標であるＬＣ３顆粒状変化を評価することにより腫瘍特異的免疫増強物質を検出する方法（実施例２、図２Ａ参照）。
・Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでは、死滅したがん細胞を取り込む二重膜構造を有するオートファジー小胞体が多数出現するが、この系を用いて腫瘍特異的免疫増強物質を検出する方法（実施例２、図２Ｂ参照）。
Ａ４）腫瘍抗原提示能：
・死滅ＥＧ７がん細胞を貪食させたＴｉｍ−４陽性マクロファージで刺激されたＯＴ−１細胞からのＩＮＦγ産生量を、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージまたはＡＭＰＫ特異的ｓｉＲＮＡでその発現が阻害されたマクロファージで刺激されたＯＴ-１細胞をコントロールとして、腫瘍抗原提示能を評価する方法（実施例４、図４Ｂ参照）。

【0024】

（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニング系
Ｂ１) ＭＣ３８大腸癌を移植したＡｔｇ５^flox/floxキメラマウスでの抗Ｔｉｍ−４抗体と抗腫瘍剤（例えば、ＣＤＤＰ）との併用効果（実施例６、図６Ａ参照）

【0025】

また、本発明は、腫瘍細胞傷害性抗がん剤の抵抗性になった癌患者を診断する手段を提供するものであり、例えば、抗Ｔｉｍ-4抗体を用いた腫瘍内Ｔｉｍ−４陽性マクロファージの存在率の検出は、腫瘍細胞傷害性抗がん剤抵抗性を予測するために有用な方法である。Ｔｉｍ-４陽性の検出は、抗体以外にもＰＣＲを用いる方法等もあり、本実施例で採用した方法に限定されず、高感度でかつ再現性良くＴｉｍ-４陽性細胞の存在割合を評価できる方法であれば、いずれの方法でもよい。

【実施例】

【0026】

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。詳細は、Ｍｕｈａｍｍａｄ，Ｂ, ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３， ｐ１０７０−１０８１および、そのＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを参照。
なお、以下に示す実施例で使用した実験動物、細胞、および評価方法等に関してあらかじめ概説する。

【0027】

（１）実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、日本エスエルシー株式会社から購入した。Ｔｉｍ−４欠損（Ｔｉｍｄ４^-/-）マウス、ＯＴ−１マウス、Ｐ８５α^-/-マウス、ＧＦＰ−ＬＣ３マウス、ＡＭＰＫα１−欠損（Ｐｒｋａａ１^-/-）マウス、ＡＭＰＫα２−欠損（Ｐｒｋａａ２^-/-）マウス、ＬｙｓＭ−Ｐｒｋａａ１^flox/floxおよびＬｙｓＭ−Ａｔｇ５^flox/floxマウスなどは、既に報告されている下記の文献に従って作成した。

【0028】

（２）ヒト由来サンプルの取得：北海道大学病院の倫理委員会の承認を得たプロトコールに従って、インフォームド・コンセントを取得後、癌患者および健常人から細胞を採取した。

【0029】

（３）腫瘍細胞：各種腫瘍細胞（Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ、ＭＣ３８大腸癌、３ＬＬ肺癌、ＥＬ４胸腺腫、およびＥＧ７胸腺腫）は、ＡＴＣＣから入手した。Ｂ１６−ＯＶＡ細胞は、下記の文献に従って作成した。また、マイコプラズマの汚染の有無を公益財団法人実験動物中央研究所（川崎市、日本）の検査を受け使用した。

【0030】

（４）Ｔｉｍ−４発現：マクロファージ上のＴｉｍ−４発現の有無は、ＣＤ６８陽性細胞上のＴｉｍ−４の有無をフローサイトメトリー法で測定した。その際の検出プローブには、マウス由来Ｔｉｍ−４に対する抗Ｔｉｍ−４抗体（ＲＭＴ４−５３）およびヒト由来Ｔｉｍ−４に対する抗Ｔｉｍ−４抗体（Ｃｌｏｎｅ３４４８２３；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。

【0031】

（５）マウスでの抗腫瘍効果の評価においては、抗Ｔｉｍ−４抗体の投与は、２５０μｇ／マウス／ｄａｙ；ｄａｙｓ８、１０および１２で腹腔内投与で実施された。

【0032】

（６）下記の実施例で使用された主要な薬剤の入手先および（カタログ番号又は製品番号）を以下に記載する。
１）Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ：ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（１７１２６０-１ＭＧ）
２）ＡＭＰＫα ｓｉＲＮＡ：Ａｍｂｉｏｎ（４３９０８２７）

【0033】

実施例１：Ｔｉｍ−４陽性マクロファージおよび樹状細胞分布の腫瘍特異性
（１）Ｔｉｍ−４陽性細胞群は主に腹腔内マクロファージ、ＣＤ８α陽性樹状細胞など、一部のミエロイド細胞に限局するという特徴を有する。そこで、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ腫瘍形成マウスを用いてマクロファージＴｉｍ−４発現をフローサイトメトリー法により検証した。尚、腫瘍組織としては、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下にＢ１６−Ｆ１０メラノーマを１×１０⁵細胞移植、腫瘍が十分形成されたものを使用した。マウス細胞でのＴｉｍ−４陽性細胞の検出には、抗マウスＴｉｍ−４抗体（ＲＭＴ４-５３）を使用し、フロー・サイトメトリーで分析した。その結果、腫瘍所属リンパ節、および脾臓に比較して、腫瘍内マクロファージで高いＴｉｍ−４発現を認めた（図１Ａ）。

【0034】

（２）その一方、腫瘍内マクロファージの起源とされる骨髄前駆細胞や炎症性単球などはＴｉｍ−４発現を認めないため、腫瘍内でＴｉｍ−４発現を誘導する仕組みが作動しているものと想定される。そこで、抗がん剤など様々な刺激（ＣＤＤＰ、Ｘ線）を受けた腫瘍細胞株の培養上清を刺激したうえで、Ｔｉｍ−４陰性骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるＴｉｍ−４誘導能を検証したところ、抗がん剤刺激により細胞死に陥った腫瘍細胞上清の刺激によるＴｉｍ−４誘導は、無治療腫瘍細胞上清に比較して３〜４倍のＴｉｍ−４誘導活性を有することが判明した。この誘導能の差に寄与する因子を検索したところ、抗がん剤処理（ＣＤＤＰ）により腫瘍細胞より放出されるＨＭＧＢ−１、ＡＴＰ、Ｓ１００Ａ８、Ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｕｒａｔｅなど多様なＤＡＭＰｓが、Ｔｉｍ−４発現誘導に重要な役割を果たしていることを明らかとした（図１−Ｂ）。
（３）更にまた、健常人（ＨＶ）の末梢血（ＰＢＬ）、ならびにステージＩＶの癌患者の末梢血、および当該癌組織由来のマクロファージおよび樹状細胞において、それらの中でのＴｉｍ−４陽性細胞の存在割合を調べた。尚、癌組織及び癌患者の末梢血は、インフォームド・コンセントを得たステージＩＶの３人の癌患者（非小細胞肺癌、大腸癌、および胃癌）から採取した。その中からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅによる密度勾配遠心処理等で、マクロファージ（Ｍφ）および樹状細胞（ＤＣ）を取得。Ｔｉｍ−４陽性細胞の検出には、抗ヒトＴｉｍ−４抗体（Ｃｌｏｎｅ ３４４８２３）を使用し、フロー・サイトメトリーで分析した。その結果、ヒトの場合においても明らかに癌組織由来のマクロファージまたは樹状細胞においてＴｉｍ−４陽性細胞の存在比率が非常に高い（約８０％）ことが判明した（図１Ｃ）。

【0035】

（４）以上より、腫瘍内自然免疫応答を司る重要な因子であるＤＡＭＰｓは、免疫抑制因子であるＴｉｍ−４発現誘導に寄与することによって、腫瘍内炎症応答のＮｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋに関与している可能性がある。

【0036】

実施例２：Ｔｉｍ−４陽性マクロファージにおけるオートファジー小胞体の存在
（１）この腫瘍内マクロファージに発現するＴｉｍ−４の機能的意義を明らかにするため、我々は野生型マウスおよびＴｉｍ−４遺伝子欠損マウスから腫瘍内マクロファージを各々分離し、抗がん剤処理後アポトーシス細胞死を誘導した腫瘍細胞（以後死がん細胞）の貪食活性を比較検証したところ、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージは野生型マクロファージ同様に、死がん細胞の貪食に貢献することを見出した。その一方で、リソゾームによるがん細胞の消化分解能は、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージで明らかに劣っていた。これらの結果から、Ｔｉｍ−４は、リソゾーム活性による死がん細胞の分化・消化を促進する機能を有することが明らかとなった。

【0037】

（２）リソゾームによる細胞内器官や死細胞分解機構として、オートファジーの役割が注目されている。その他、オートファジーは発がん抑制、免疫応答修飾など多様な生体制御に影響を及ぼす点で重要な生理学的特性であると考えられている。我々は、Ｔｉｍ−４陽性腫瘍マクロファージでは、死がん細胞貪食により特異的に、オートファジー活性が認められることを同定した。すなわち、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでは、抗がん剤（ＣＤＤＰ）処理により死滅したがん細胞貪食によりオートファジー活性の指標であるＬＣ３顆粒状変化を呈する。それに対してアミノ酸飢餓によるオートファジー活性はＴｉｍ−４に依存しない（図２Ａ）。Ｔｉｍ−４陽性マクロファージでは、死滅細胞を取り込む二重膜構造を有するオートファジー小胞体が多数出現する。一方、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージは、死滅がん細胞貪食によるオートファジー小胞体形成に乏しい（図２Ｂ）。

【0038】

実施例３：オートファジー活性の「Ｔｉｍ−４−ＡＭＰＫα１相互作用」依存性
（１）このオートファジー活性は、Ｔｉｍ−４による死がん細胞の貪食反応に遅れること４５〜６０分で認められることから、細胞貪食に続くＴｉｍ−４活性がオートファジー応答の引き金となることが想定された。この応答を仲介する分子メカニズムとして、オートファジー応答制御に関わるＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲ経路に着目し、阻害剤によるスクリーニングを施行したところ、Ｔｉｍ−４がＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ−α１ （ＡＭＰＫα１）との相互作用を介して、ＡＭＰＫα１リン酸化およびＵＬＫ１（Ａｔｇ１）リン酸化を誘導し、オートファジー活性化に繋がることが明らかとなった。興味深いことに、このＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１相互作用は腫瘍内マクロファージに特異的で、腹腔内マクロファージなど他のＴｉｍ−４陽性細胞には認められない分子機構であった。
より詳細には、ＣＤＤＰで処理されたＥＧ７がん細胞を用いて、ＥＧ７がん細胞貪食の４時間後におけるＴＩＭ−４とＡＭＰＫα１の局在を、共焦点顕微鏡にて可視化することで検証した。その結果、腫瘍内マクロファージのＴｉｍ−４はＡＭＰＫα１との相互作用能を有し、死滅ＥＧ７がん細胞貪食により、その相互作用能は増強する（図３Ａ）。
また、ＣＤＤＰで処理されたＥＧ７がん細胞又はグルコース飢餓（ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ：ＧＳ）のＥＧ７がん細胞を用いて、Ｔｉｍ−４陽性マクロファージ、Ｔｉｍ−４欠損マクロファージ及び腹腔内マクロファージにおけるＡＭＰＫα１のリン酸化活性を検討した。その結果、腫瘍内ＴＩＭ−４陽性マクロファージは、抗がん剤処理により死滅したＥＧ７がん細胞貪食によりＡＭＰＫα１リン酸化活性を誘導する。その一方、Ｔｉｍ−４陰性マクロファージや腹腔内マクロファージでは、死滅がん細胞貪食時においてＡＭＰＫα１活性を認めない。陽性コントロールであるグルコース飢餓では、細胞種に関わらず、ＡＭＰＫα１活性を示す（図３Ｂ）。
また、腫瘍内マクロファージ及び腹腔内マクロファージのＡＭＰＫα１、Ｔｉｍ−４、及びそれらの結合体を測定した。その結果、腫瘍内マクロファージでは、死滅がん細胞貪食に伴いＴｉｍ−４とＡＭＰＫα１の細胞内共局在を認めるのに対して、腹腔内マクロファージではＴｉｍ−４は細胞表面に留まることで、ＡＭＰＫα１との相互作用を認めない（図３Ｃ）。

【0039】

（２）以上より、腫瘍内マクロファージによる免疫抑制メカニズムとして、Ｔｉｍ−４−ＡＭＰＫ相互作用を中心とした腫瘍微小環境に特異的な分子経路（以下、「ＴＩＭ-4−ＡＭＰＫα１−オートファジー経路」と称する。）の存在を明らかとした。

【0040】

実施例４：Ｔｉｍ−４陽性マクロファージにおける抗原提示能
（１）マクロファージをはじめとした抗原提示細胞は、ファゴゾームにて消化分解された死がん細胞から、免疫プロテアソームなど他の細胞分解経路を利用することで、がんに特異性の高い抗原・ペプチドを生成する仕組みを潜在的に備えていると想定できる。そこで、Ｔｉｍ−４−ＡＭＰＫα１相互作用を介したオートファジー活性が、死がん細胞貪食・分解経路による抗原提示機構に及ぼすインパクトを検証するため、死滅ＥＧ７癌細胞を貪食したＢＭＤＭｓで刺激されたＯＴ−１細胞でのＩＮＦγ産性能を指標に、ＡＭＰＫα特異的ｓｉＲＮＡの効果、もしくは抗Ｔｉｍ−４抗体の効果を調べた。死滅ＥＧ７がん細胞を貪食したＴＩＭ-４陽性マクロファージのコントロール群では、抗ＴＩＭ-４抗体の添加によりＩＮＦ-γの顕著な産生向上が認められ、抗原提示能が上昇し腫瘍特異免疫活性の向上が生じたことがうかがえる。一方、同じくＴＩＭ-４陽性マクロファージでもＡＭＰＫαのｓｉＲＮＡを添加した場合は、抗ＴＩＭ-４抗体添加の有無に係らず高いＩＮＦ-γの産生が認められており、ＴＩＭ-４-ＡＭＰＫαの系が抗原提示能に係っていること、すなわち、抗ＴＩＭ-４抗体はオートファジー活性化に負の影響を与えていることが示唆される（図４Ａ）。また、ＡＭＰＫの阻害剤であるＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｃの添加がＴｉｍ−４陽性ＢＭＤＭｓで刺激されたＴＣＲ-Ｖβ５陽性 ＯＴ−１細胞のＩＮＦγ産性能を増強することが示された（図４Ｂ）。これらのことからも、腫瘍特異的マクロファージにおける「ＴＩＭ-４−ＡＭＰＫα１−オートファジー経路」を介した腫瘍抗原提示システムの存在が示される。

【0041】

実施例５：ＯＶＡ発現Ｂ１６メラノーマ移植マウスにおけるシスプラチンの抗腫瘍効果
抗がん剤による腫瘍細胞死の誘導は、炎症性ＤＡＭＰｓの産生亢進を介して、腫瘍内炎症応答の活性化をもたらすとともに、腫瘍内マクロファージによるＴｉｍ−４発現誘導に寄与することが判明している。以上より、抗がん剤はＤＡＭＰｓによるＴｉｍ−４発現制御を介して、マクロファージの腫瘍抗原提示能と特異的ＣＴＬ活性の抑制を引き起こし、宿主免疫応答を負に制御しているものと想定される。この仮説を検証するため、Ｔｉｍ−４欠損あるいは野生型マウスとマクロファージ特異的Ａｔｇ５欠損マウス由来骨髄細胞を致死性放射線で処置した野生型マウスに１：１で混合移植したキメラモデルを作成することで、マクロファージ特異的オートファジーによる機能にＴｉｍ−４が果たす役割を生体内で明らかにすることが可能となる。さらに、このキメラマウスに対して、ＯＶＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞移入とＯＶＡ発現Ｂ１６メラノーマ（Ｂ１６−ＯＶＡ）を移植することで、ＯＶＡ特異的なＴ細胞免疫の関与を生体内で検証できる系を構築した（図５Ａ）。

【0042】

上記骨髄キメラモデルを対象にして、抗がん剤（シスプラチン）の抗腫瘍効果に及ぼす役割を検証した。野生型−マクロファージ特異的Ａｔｇ５欠損マウス由来骨髄キメラマウス（ＬｙｓＭ−Ａｔｇ５^-/-／ＷＴ）では、シスプラチン単独による抗腫瘍効果は不十分であったが、Ｔｉｍ−４欠損−Ａｔｇ５欠損マウス由来骨髄キメラマウス（ＬｙｓＭ−Ａｔｇ５^-/-／ＴＩＭ４−ＫＯ）においては、シスプラチン単独で充分な抗腫瘍効果が発揮された。以上より、マクロファージＴｉｍ−４はオートファジー活性を介して抗腫瘍免疫応答を抑制することによって、抗がん剤による抗がん効果を負に制御している（図５Ｂ）。

【0043】

以上よりＴｉｍ−４陽性マクロファージは、ＡＭＰＫα１とオートファジー活性を介して腫瘍抗原の提示能や抗原特異的Ｔ細胞応答を負に制御することにより、抗がん剤の治療応答の抑制に大きな役割を果たしていることを明らかとした。

【0044】

実施例６：ＭＣ３８大腸癌移植マウスにおける癌化学療法剤と抗Ｔｉｍ−４抗体の併用効果
更に、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗Ｔｉｍ−４抗体（ＲＭＴ４-５３）の効果を調べるためにＭＣ３８大腸癌を移植したＡｔｇ５^flox/floxキメラマウスにおける抗腫瘍効果を、シスプラチンとコントロール抗体投与およびシスプラチンと抗Ｔｉｍ−４抗体の併用投与の場合で比較した（図６Ａ）。腫瘍組織としては、マウスの皮下にＭＣ３８大腸癌を１×１０⁵細胞移植、移植後８日目、１０日目、および１２日目に抗Ｔｉｍ−４抗体とＣＤＤＰを共に腹腔内投与し、経時的に腫瘍のサイズを計測、抗腫瘍効果を評価した。Ａｔｇ５^flox/floxマウスにおいてはＣＤＤＰとコントロール抗体の併用投与群での腫瘍増殖は、非投薬群（ＮＴ）と同様であり抗腫瘍効果が殆ど認められなかったが、抗Ｔｉｍ−４抗体とＣＤＤＰの併用投与群では、顕著な腫瘍縮小効果が認められた。一方、ＬｙｓＭ-Ａｔｇ５^-/-マウスでは、ＣＤＤＰとコントロール抗体の併用投与群とＣＤＤＰと抗ＴＩＭ-４抗体の併用投与群とでは、抗腫瘍効果に差異は認められなかった。すなわち、「ＴＩＭ-4-ＡＭＰＫα１−オートファジ経路」が機能しているＴＩＭ-４陽性マクロファージが腫瘍内に存在する担癌動物においては、抗Ｔｉｍ−４抗体は、ＣＤＤＰの抗腫瘍作用を増強する効果があることを明らかにした。

【0045】

尚、近年の研究により，オキサプラチン（ＯＸＰ）やドキソルビシン（ＤＯＸ）等の一部の腫瘍細胞傷害性抗がん剤は、免疫原性の高い細胞死（ｉｍｕｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：ＩＣＤ）を誘導することにより，自然免疫におけるシグナル伝達や抗腫瘍能を誘導することが報告されている。一方、ＣＤＤＰやマイトマイシン（ＭＭＣ）等は、ＩＣＤを誘導しない抗がん剤（ｎｏｎ−ＩＣＤ）群に属することが知られている。これら両者について、ＴＩＭ-４−オートファジー経路に与える影響に差異があるか否か調べた。図６Ｂに示すようにいずれの群の腫瘍細胞傷害性抗がん剤においても、死滅がん細胞にさらされたＴＩＭ-４陽性マクロファージで刺激されたＯＴ-１細胞からのＩＮＦ-γの産生は、抗ＴＩＭ-４抗体の添加により、同様に大幅に向上することが確認された。すなわち、これらの結果は、図６ＡのＣＤＤＰで示された抗ＴＩＭ-４抗体との併用投与における担癌動物での併用効果は、ＩＣＤ群のみならずｎｏｎ−ＩＣＤ群の腫瘍細胞傷害性抗がん剤においても同様であると考えられる。ちなみに、ＯＸＰでも同様の併用効果が確認された（Ｍｕｈａｍｍａｄ，Ｂ, ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３， ｐ１０７０−１０８１のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ中のＦｉｇ．Ｓ５-Ｃを参照。）

【0046】

なお、本実施例で用いた抗Ｔｉｍ−４抗体の調製方法は、次のとおりである。
ＩＣＲ−ｎｕ（Ｃｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１^nu）マウスに５００μＬの２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンを腹腔内投与する。３日後、３００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）に懸濁した１×１０⁷個ＲＭＴ４−５３ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ Ｐ−０１８０３）を腹腔内投与する。１・２週間後、腹水を採取。採取した腹水の２倍量の０．０６Ｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）を撹拌しながら少量ずつ加える。１Ｎ ＮａＯＨを適量加え、ｐＨを４．８に調整する。Ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄを３３０μＬ／腹水１０ｍＬの分量で撹拌しながら少量ずつ加える。室温で３０分撹拌。８，０００ｇ、室温３０分遠心。遠心上清を濾紙で濾過して、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）−１−ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を２０ｍＭ（４．７６６２ｍｇ／ｍＬ）になるように加える。ｐＨ７．４に調整。硫酸アンモニウムを３．１３ｇ／１０ｍＬになるように撹拌しながら少量ずつ加える。室温で３０分撹拌。８，０００ｇ、室温３０分遠心。遠心上清を捨て５ｍＬのＰＢＳで溶解後、孔径（ポアサイズ）５０ Ａｎｇｓｔｒｏｍｓ（分画分子量（ＭＷＣＯ）１４，０００）の透析チューブに入れ、２Ｌ ＰＢＳで５時間以上、５回以上繰り返し透析を行う。透析後、抗体を含む溶液は０．２μｍシリンジフィルターを通して、無菌状態にしてから使用する。
なお、本発明者らが作製した抗ＴＩＭ-４抗体（ＲＭＴ４−５３）を産生するハイブリドーマは、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に平成２６年２月２０日に寄託されており、その受託番号はＮＩＴＥ Ｐ−０１８０３である。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】