特開 2015-223165 認知症のバイオマーカー及び認知症の治療薬のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-223165(P2015-223165A)

(43)【公開日】2015年12月14日

(54)【発明の名称】認知症のバイオマーカー及び認知症の治療薬のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20151117BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20151117BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2014-111685(P2014-111685)

(22)【出願日】2014年5月29日

(71)【出願人】

【識別番号】000006116

【氏名又は名称】森永製菓株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】内田 裕子

(72)【発明者】

【氏名】梅原 将洋

(72)【発明者】

【氏名】西村 栄作

(72)【発明者】

【氏名】斎 政彦

【テーマコード（参考）】

4B024

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B024AA11

4B024CA11

4B063QA01

4B063QQ52

4B063QR90

4B063QS25

4B063QS34

(57)【要約】

【課題】マイクロＲＮＡを用いた認知症の治療用医薬のスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】本発明にかかる認知症のバイオマーカーは、miR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、又はmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有するマイクロＲＮＡからなる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

miR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、 miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有するマイクロＲＮＡからなる、認知症のバイオマーカー。

【請求項2】

認知症のバイオマーカーの測定方法であって、
認知症の非ヒト動物に被検物質を投与する工程と、
前記被検物質を投与した前記非ヒト動物から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有する１又は２以上のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、を有する方法。

【請求項3】

前記非ヒト動物がマウスである、請求項２に記載の認知症のバイオマーカーの測定方法。

【請求項4】

認知症の治療薬のスクリーニング方法であって、
被検物質を投与した認知症の非ヒト動物から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有する１又は２以上のマイクロＲＮＡの第１の発現レベルと、前記被検物質を投与していない認知症の非ヒト動物から採取した試料中の前記マイクロＲＮＡの第２の発現レベルとを比較する工程と、
前記第１の発現レベルが、前記第２の発現レベルよりも低い場合に、前記被検物質を認知症の治療に有効であると判断し、前記第１の発現レベルが、前記第２の発現レベルと同じか、より高い場合に、前記被検物質を認知症の治療に有効でないと判断する工程と、を有する方法。

【請求項5】

前記非ヒト動物がマウスである、請求項４に記載の認知症のバイオマーカーの測定方法。

【請求項6】

被験者から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有する１又は２以上のマイクロＲＮＡの第１の発現レベルを測定し、認知症の患者から採取した試料中の前記マイクロＲＮＡの第２の発現レベルよりも前記第１の発現レベルが低い場合には、前記被験者から採取した試料が認知症のヒトから採取した試料ではなく、前記第１発現レベルが前記第２の発現レベルと同じか、より高い場合には、前記被験者から採取した試料が認知症のヒトから採取した試料であるという基準で、前記第１の発現レベルを前記第２の発現レベルと比較することにより、前記試料が、認知症患者から採取した試料であるか、健康人から採取した試料であるかを判定する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロＲＮＡ（以下ｍｉＲＮＡとも記す）からなる認知症のバイオマーカー及びｍｉＲＮＡを用いた認知症の治療薬のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する長さ２０から２５塩基ほどのＲＮＡであり、現在までにヒトのｍｉＲＮＡとして２０００個近く報告されている。他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているが、機能が明らかになっているものはごく一部である。例えば、いくつかのｍｉＲＮＡは神経変成やアルツハイマー疾患等の神経変性疾患に関係していることが知られている（非特許文献１参照）が、認知症症状に伴って発現レベルの変動するｍｉＲＮＡはまだ知られていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Simona Maciottaら, “The involvement of microRNAs in neurodegenerative diseases”, Front. Cell. Neurosci., 19 December 2013, doi: 10.3389/fncel.2013.00265

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、ｍｉＲＮＡからなる認知症のバイオマーカー及び当該ｍｉＲＮＡを用いた認知症の治療用医薬のスクリーニング方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上記課題を解決するために、本発明者らは、認知症の原因となる因子としてｍｉＲＮＡに着目して研究を行った。そして、鋭意研究の結果、本発明者らは、ｍｉＲＮＡからなる認知症のバイオマーカーを特定することに成功し、本発明に到った。

【0006】

すなわち、本発明の一実施態様は、miR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有するマイクロＲＮＡからなる、認知症のバイオマーカーである。

【0007】

本発明の他の実施態様は、認知症のバイオマーカーの測定方法であって、認知症の非ヒト動物に被検物質を投与する工程と、前記被検物質を投与した前記非ヒト動物から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有する１又は２以上のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、を有する方法である。前記非ヒト動物がマウスであってもよい。

【0008】

本発明の他の実施態様は、認知症の治療薬のスクリーニング方法であって、被検物質を投与した認知症の非ヒト動物から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有する１又は２以上のマイクロＲＮＡの第１の発現レベルと、前記被検物質を投与していない認知症の非ヒト動物から採取した試料中の前記マイクロＲＮＡの第２の発現レベルとを比較する工程と、前記第１の発現レベルが、前記第２の発現レベルよりも低い場合に、前記被検物質を認知症の治療に有効であると判断し、前記第１の発現レベルが、前記第２の発現レベルと同じか、または高い場合に、前記被検物質を認知症の治療に有効でないと判断する工程と、を有する。前記非ヒト動物がマウスであってもよい。

【0009】

被験者から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる配列を有する１又は２以上のマイクロＲＮＡの第１の発現レベルを測定し、認知症の患者から採取した試料中の前記マイクロＲＮＡの第２の発現レベルよりも前記第１の発現レベルが低い場合には、前記被験者から採取した試料が認知症のヒトから採取した試料ではなく、前記第２の発現レベルと同じか、または高い場合に、前記被験者から採取した試料が認知症のヒトから採取した試料であるという基準で、前記第１の発現レベルを前記第２の発現レベルと比較することにより、前記試料が、認知症患者から採取した試料であるか、健康人から採取した試料であるかを判定する。

【発明の効果】

【0010】

本発明によって、ｍｉＲＮＡからなる認知症のバイオマーカー及び当該ｍｉＲＮＡを用いた認知症の治療用医薬のスクリーニング方法を提供することが可能になった。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＳＡＭＲ１及びＳＡＭＰ８のステップスルーテストの結果を示す棒グラフである。

【図2】ＥＧＣＣＡを投与していないＳＡＭＰ８とＥＧＣＣＡを投与したＳＡＭＰ８のステップスルーテストの結果を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

【0013】

＝＝バイオマーカー＝＝
本発明にかかるバイオマーカーのｍｉＲＮＡおよびその代表例を表１に示す。

【0014】

【表1】

本発明のバイオマーカーを用いた検査対象となる認知症とは、後天的な脳の障害によって病的に知能が低下する症状のことをいい、例えば、アルツハイマー症候群や脳血管障害などによる神経変性疾患や、代謝・栄養障害、甲状腺機能低下などが、その原因疾患となる。

【0015】

本発明にかかるバイオマーカーは、ヒトまたは非ヒト動物から採取した試料中でmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる１又は２以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することによって、使用することができる。ここで、非ヒト動物は、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハムスター、マウスおよびラットなどの哺乳動物を含む。

【0016】

この測定方法は、例えば、以下に説明する認知症の診断方法や認知症の治療薬のスクリーニング方法に応用することができる。

【0017】

＝＝認知症の診断方法＝＝
本発明の一実施態様は、認知症の診断方法であって、被検体から採取した試料中のバイオマーカーであるmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる１又は２以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを、健常体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する工程を含む。前記被検体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、前記健常体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い場合は、前記被検体を認知症と判断し、前記被検体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、前記健常体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと同じか、より低い場合は、前記被検体を認知症でないと判断する。以下に本実施態様を説明する。

【0018】

本実施態様においては、まず、ヒトまたは非ヒト動物である被検体から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097 、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる１又は２以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する。被検体から採取する試料は特に限定されないが、血液であることが好ましい。ここで、試料中に含まれるｍｉＲＮＡは、当業者に周知の方法を用いて、あるいは市販のｍｉＲＮＡのキットを用いて、抽出・精製することができる。そして、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えばマイクロアレイや、定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定することができる。

【0019】

次に、測定したｍｉＲＮＡの発現レベルを健常体のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する。健常体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルは、あらかじめ測定することもできるが、被検体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと同時に測定することもできる。ｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えば、マイクロアレイを用いる場合はトータルＲＮＡを揃えて標準化したり、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合は内在性コントロールに基づき標準化したりすることにより、比較することができる。内在性コントロールとしては、例えば、miR-191-3p、miR-103-3p、miR-106b-5p、miR-26b-5pなどを用いることができる。ここで、 健常体とは、認知症を発症していない個体のことであって、被検体と同一の動物種であることが好ましい。調べる健常体は、複数個体であることが好ましい。被検体と比較するｍｉＲＮＡの発現レベルは、範囲で表されてもよい。被検体と比較するｍｉＲＮＡの発現レベルの範囲は、例えば、各健常体に対する複数回の測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲としてもよく、平均値の下限値から上限値までの範囲としてもよく、特に限定されるものではない。健常体の発現レベルが範囲で表されている時、その上限より高い場合を、健常体の発現レベルより高いといい、下限より低い場合を、健常体の発現レベルより低いというものとする。

【0020】

本工程において、被検体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを、健常体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較した結果、被検体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、健常体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い場合は、前記被検体が認知症であると判断することができる。逆に、被検体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、健常体から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと同じか、より低い場合は、前記被検体が認知症でないと判断することができる。

【0021】

なお、この診断方法において、複数のバイオマーカーを用いて診断してもよく、既存の診断方法と組み合わせて診断してもよい。例えば、バイオマーカーを２種類用い、一方だけが認知症の可能性を示す発現レベルであれば、認知症の可能性があると診断してもよいが、両方とも認知症の可能性を示す濃度であれば、１種類の時より認知症の可能性は上昇する。

【0022】

＝＝認知症の治療薬のスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施態様は、認知症の治療薬のスクリーニング方法であって、被検物質を投与した認知症の非ヒト動物から採取した試料中のmiR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる１又は２以上のｍｉＲＮＡの第１の発現レベルと、前記被検物質を投与していない認知症の非ヒト動物から採取した試料中の前記ｍｉＲＮＡの第２の発現レベルとを比較する工程と、第１の発現レベルが、第２の発現レベルよりも低い場合に、前記被検物質を認知症の治療に有効であると判断し、第１の発現レベルが、第２の発現レベルと同じか、より高い場合に、前記被検物質を認知症の治療に有効でないと判断する工程と、を有する方法である。以下に本実施態様について説明する。

【0023】

本実施態様においては、まず、認知症の非ヒト動物に被検物質を投与する。動物に被検物質を投与する投与方法としては、特に限定されないが、例えば、非経口的又は経口的に行うことができる。非経口経路としては、例えば、静脈内投与、小動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、心室内投与、頭蓋内投与、鼻腔内投与、結腸内投与、経皮的投与などが挙げられる。

【0024】

次に、被検物質を投与した前記非ヒト動物から得た試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する。測定するｍｉＲＮＡは、miR-1983、let-7f-5p、miR-207、miR-122-5p、miR-1186b、miR-5097、miR-29b-3p、及びmiR-98-5pからなる群から選ばれる１又は２以上のからなる群から選ばれる。本工程において、一般的なｍｉＲＮＡの抽出・精製キットなどにより、試料中に含まれるｍｉＲＮＡを抽出・精製して、ｍｉＲＮＡを測定する。ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定方法は、例えばマイクロアレイを用いた測定法や、定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定することができる。

【0025】

非ヒト動物から採取する試料は、特に限定されないが、脳組織や血液が好ましく、脳組織としては海馬組織が好ましい。

【0026】

次に、測定したｍｉＲＮＡの発現レベルを、被検物質を投与していない認知症の非ヒト動物から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する。被検物質を投与していない認知症の非ヒト動物から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルは、被検物質を投与した非ヒト動物から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと同様に測定することができる。ｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する方法は、例えば、マイクロアレイを用いる場合はトータルＲＮＡを揃えて標準化したり、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合は内在性コントロールに基づき標準化したりすることにより、比較することができる。内在性コントロールとしては、例えば、miR-191-3p、miR-103-3p、miR-106b-5p、miR-26b-5pなどの発現レベルを用いることができる。ここで、 健常体とは、認知症を発症していない個体のことであって、被検体と同一の動物種であることが好ましい。調べる健常体は、複数個体であることが好ましい。被検体と比較するｍｉＲＮＡの発現レベルは、範囲で表されてもよい。被検体と比較するｍｉＲＮＡの発現レベルの範囲は、例えば、各健常体に対する複数回の測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲としてもよく、平均値の下限値から上限値までの範囲としてもよく、特に限定されるものではない。健常体の発現レベルが範囲で表されている時、その上限より高い場合を、健常体の発現レベルより高いといい、下限より低い場合を、健常体の発現レベルより低いというものとする。

【0027】

被検物質を投与した非ヒト動物から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを、被検物質を投与していない非ヒト動物から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較した結果、被検物質を投与した非ヒト動物から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、被検物質を投与していない非ヒト動物から採取した試料中の対象とするｍｉＲＮＡの発現レベルよりも低い場合に、非ヒト動物に投与した被検物質を認知症の治療薬として有効であると判断することができる。逆に、被検物質を投与した非ヒト動物から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルが、被検物質を投与していない非ヒト動物から採取した試料中の対象とするｍｉＲＮＡの発現レベルと同じか、より高い場合に、非ヒト動物に投与した被検物質を認知症の治療薬として有効でないと判断することができる。

【0028】

＝＝そのほかの応用例＝＝
本発明のバイオマーカーを用いた診断方法の応用例として、認知症の治療薬のスクリーニング方法以外にも、以下のようなものがある。

【0029】

例えば、認知症の薬剤をテーラーメイド医療で用いる際、ある薬物が、その患者に有効かどうかについて、バイオマーカーを用いれば簡便に知ることができる。すなわち、認知症の薬剤を投与する前後で被検体から試料を採取し、投与前後で、バイオマーカーの発現レベルを比較する。投与後のバイオマーカーの発現レベルが投与前より低下したとき、この薬剤は、この患者に対して有効であると判断し、投与後のバイオマーカーの発現レベルが投与前と同じか、より高いとき、この薬剤は、この患者に対して無効であると判断することができる。

【0030】

この方法を繰り返し、複数の薬剤に対して結果を出して比較し、投与後のバイオマーカーの発現レベルが投与前より最も低下した薬剤を選択することによって、この患者に最も有効な薬剤を選択することも可能である。

【0031】

ここで用いる認知症の薬剤は、公知の薬剤以外に、（−）−エピガロカテキン−3−O−カフェオエイト（ＥＧＣＣＡ）であってもよい。ＥＧＣＣＡは、実施例で示すように、認知症モデル動物の症状を改善することができ、認知症の薬剤として有用である。

【実施例】

【0032】

〔実施例１〕記憶学習試験
本実施例では、特定のｍｉＲＮＡは、マウスの記憶学習能力が改善した場合に発現が減少することを示す。
１．実験方法について
（マウス）
老化促進マウスＳＡＭＰ８及びＳＡＭＰ８と同系統の老化抵抗マウスＳＡＭＲ１を実験に用いた。
（ステップスルーテスト）
仕切ドアで仕切られた明室および暗室が通路で接続され、前記仕切ドアを開けるとマウスが明室と暗室との間で移動でき、マウスの四つの足が暗室に入った際にマウスに電気刺激が与えられる装置をステップスルーテストに使用した。

【0033】

ステップスルーテストでは、まず、仕切ドアを閉じた状態の装置の明室にマウスを入れ、装置の仕切ドアを開けた。ここで、仕切ドアを開けてからマウスが暗室で電気刺激を受けるまでの時間（以下、明室滞在時間とよぶ）を測定した。この結果を各図中「獲得試行」として示す。その後２４時間が経過した後に、仕切ドアを閉じた装置の明室にマウスを戻し、仕切ドアを開けた。ここで、再度、明室滞在時間を測定した。この結果を各図中「再生試行」として示す。
（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−カフェオエイト：ＥＧＣＣＡの合成方法）
ＥＧＣＣＡ（１）は次のように合成した。（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ（２）、０．４１ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、トリエチルアミン（４．９４ｍｍｏｌ）と２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（ＮｓＣｌ、２．４７ｍｍｏｌ）を加え、塩化メチレンにより抽出し、濃縮後、シリカゲルに吸着させ、塩化メチレン／メタノール混合溶媒を用いて、５、７、３‘、４’、５‘−Ｎｓ−ＥＧＣ（３）を収率９０．６％（０．３７ｍｍｏｌ）で得た。引き続き、この化合物（０．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、Ｎ、Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（０．２０ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（０．２０ｍｍｏｌ）および別途合成した３、４−Ｎｓ−カフェ酸（４）（０．３６ｍｍｏｌ）を加え、反応後、Ｎ、Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（０．０８７ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（０．１３ｍｍｏｌ）および３、４−Ｎｓ−カフェ酸（０．０９５ｍｍｏｌ）を加えてさらに反応させ、反応物を塩化メチレンにより抽出し、濃縮後、ＯＤＳ−ＨＰＬＣにより５，７，３’、４‘、５’、３“、４” −Ｎｓ−ＥＧＣＣＡ（５）を収率６２．２％（０．１９ｍｍｏｌ）で得た。

【0034】

＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ２０×２５０ｍｍ（粒子径：５μｍ）関東科学株式会社製
検出波長：２１０ｎｍ
流速：５．０ｍＬ／ｍｉｎ
展開溶媒：２４％ Ｈ_２Ｏ＋５％ＡｃＯＨ／ＭｅＣＮ＋５％ＡｃＯＨ

引き続き、この化合物（０．１４ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、炭酸セシウム（０．０１３ｍｏｌ）と２−アミノチオフェノール（０．１８ｍｏｌ）を加え、酢酸エチルにより抽出し、濃縮後、ＯＤＳ−ＨＰＬＣによりＥＧＣＣＡ（１）を収率３８．７％（０．０５４ mmol）で得た。

【0035】

＜ＨＰＬＣの条件＞
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ２０×２５０ｍｍ（粒子径：５μｍ）関東科学株式会社製
検出波長：２１０ｎｍ
流速：５．０ｍＬ／ｍｉｎ
展開溶媒： Ｈ_２Ｏ＋５％ＡｃＯＨ／ＭｅＣＮ＋５％ＡｃＯＨ
グラディエント：

得られたＥＧＣＣＡは、^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲの測定、並びに、質量分析によって、目的物であると同定した。

【0036】

¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD): 2.81 (1H, dd, J = 17.4, 2.2 Hz), 2.95 (1H, dd, J = 17.4, 4.8 Hz), 4.93 (1H, bs), 5.44 (1H, m), 5.94 (1H, d, J = 2.4 Hz), 5.96 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.17 (1H, d, J = 15.8 Hz), 6.49 (2H, s), 6.72 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.89 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz), 6.98 (1H, d, J = 1.9 Hz), 7.41 (1H, d, J = 15.8 Hz); ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD): 26.7, 69.8, 78.4, 95.8, 96.5, 99.4, 106.8 (2C), 115.1, 115.2, 116.4, 123.1, 127.8, 130.7, 133.8, 146.6, 146.7 (2C), 147.2, 149.4, 157.1, 157.8, 157.9, 168.6.
MS（ESI） ：m/z : 467.6 (M^-)

２．認知症症状とｍｉＲＮＡの発現レベルについて
２８週齢のＳＡＭＲ１及びＳＡＭＰ８の記憶学習能力を示す。ＳＡＭＲ１及びＳＡＭＰ８に対するステップスルーテストの結果を図１に示す。

【0037】

図１に示すように、ＳＡＭＲ１の再生試行の明室滞在時間は、ＳＡＭＰ８の再生試行の明室滞在時間と比較して有意に長く、ＳＡＭＰ８は認知症症状を示す。

【0038】

次に、ＳＡＭＲ１及びＳＡＭＰ８から海馬組織を採取した。そして、海馬組織をＲＮＡｌａｔｅｒで１晩インキュベートして−８０度で保存した。そして、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。

【0039】

次に、各試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルをＥｘｉｑｏｎ社、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ^ＴＭ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔを用いて測定し、各試料間の同一のｍｉＲＮＡの発現レベルについて、比較解析を行った。その結果、mmu-miR-29b-3p、mmu-miR-1983、mmu-let-7f-5p、mmu-miR-207、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-1186b、mmu-miR-5097、及びmmu-miR-98-5pは、ＳＡＭＲ１の海馬組織における発現レベルと比較して、ＳＡＭＰ８の海馬組織における発現レベルが有意に高かった（Fold change＞１．２５、ｐ＜０．０５、ANOVA）。このように、mmu-miR-29b-3p、mmu-miR-1983、mmu-let-7f-5p、mmu-miR-207、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-1186b、mmu-miR-5097、及びmmu-miR-98-5pの発現レベルは、認知症症状の有無と相関している。
３．認知症症状の改善とｍｉＲＮＡの発現レベルについて
４匹のＳＡＭＰ８に対して１０週齢から４ヶ月間０．１２ｇ／ＬのＥＧＣＣＡを飲水投与した。その後、ステップスルーテストを行った。その結果を図２に示す。図２中、「ＳＡＭＰ８」はＥＧＣＣＡを投与していないＳＡＭＰ８の結果を示し、「ＳＡＭＰ８_ＥＧＣＣＡ」はＥＧＣＣＡを投与したＳＡＭＰ８についての結果を示す。図２に示されるように、ＥＧＣＣＡを投与していないＳＡＭＰ８と比較して、ＥＧＣＣＡを投与したＳＡＭＰ８の明室滞在時間は長くなり認知症症状が改善した。

【0040】

そこで、ＥＧＣＣＡを投与し、認知症状が改善したＳＡＭＰ８と、ＥＧＣＣＡを投与せず、認知症状を有するＳＡＭＰ８について、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを調べた。

【0041】

各マウスから海馬組織を摘出し、海馬組織をＲＮＡｌａｔｅｒで１晩インキュベートして−８０度で保存した。そして、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。

【0042】

各試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルをＥｘｉｑｏｎ社、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ^ＴＭ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔを用いて測定し、各試料間の同一のｍｉＲＮＡの発現レベルについて比較解析を行った。表２に、ＥＧＣＣＡを投与し認知症状が改善したＳＡＭＰ８から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルの、ＥＧＣＣＡを投与せず認知症状を有するＳＡＭＰ８から採取した試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルに対する比（fold change）を示す。

【0043】

【表2】

表２に示されるように、認知症状が改善したＳＡＭＰ８の海馬組織におけるmmu-miR-1983、mmu-let-7f-5p、mmu-miR-207、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-1186b、mmu-miR-5097、mmu-miR-29b-3p、及びmmu-miR-98-5pの発現レベルは、認知症状を有するＳＡＭＰ８の海馬組織におけるこれらのｍｉＲＮＡの発現レベルと比較して、有意に低い（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。

【0044】

このように、mmu-miR-1983、mmu-let-7f-5p、mmu-miR-207、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-1186b、mmu-miR-5097、mmu-miR-29b-3p、及びmmu-miR-98-5p の発現レベルは、認知症症状の改善に伴い減少する。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]