特開 2016-108250 アジュバント組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-108250(P2016-108250A)

(43)【公開日】2016年6月20日

(54)【発明の名称】アジュバント組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/39 20060101AFI20160523BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20160523BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160523BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160523BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/39

   A61K39/00 Z

   A61P35/00

   C12N15/00 AZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2014-244421(P2014-244421)

(22)【出願日】2014年12月2日

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】瀬谷 司

(72)【発明者】

【氏名】松本 美佐子

【テーマコード（参考）】

4B024

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024BA31

4B024CA01

4B024CA04

4B024CA09

4B024CA11

4B024CA20

4B024DA02

4B024EA02

4B024EA04

4B024GA11

4B024HA01

4B024HA08

4B024HA17

4C085AA03

4C085AA38

4C085BB01

4C085DD86

4C085EE06

4C085FF12

4C085FF17

(57)【要約】

【課題】強いアジュバント活性と高い安全性を有し、かつ、化学合成により製造可能な核酸を含有するアジュバント組成物、および当該アジュバント組成物と抗原または抗原性成分を含むワクチン組成物を提供すること。
【解決手段】配列番号１に示される塩基配列およびその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡと、配列番号２に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡとが結合している核酸を含有するアジュバント組成物、および当該アジュバント組成物と抗原または抗原性成分を含むワクチン組成物。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３に示される塩基配列からなる一本鎖核酸Ａと、配列番号４に示される一本鎖核酸Ｂにより形成されている二本鎖核酸を含有することを特徴とするアジュバント組成物。

【請求項2】

一本鎖核酸Ａおよび一本鎖核酸Ｂが化学合成されていることを特徴とする請求項１に記載のアジュバント組成物。

【請求項3】

一本鎖核酸Ａおよび一本鎖核酸Ｂが、化学合成された複数のフラグメントをライゲーションにより連結させて作製されていることを特徴とする請求項１または２に記載のアジュバント組成物。

【請求項4】

一本鎖核酸Ａおよび一本鎖核酸Ｂのいずれの末端にもリン酸基が結合していないことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアジュバント組成物。

【請求項5】

一本鎖ＤＮＡを構成するヌクレオチドの全部がホスホロチオエート修飾されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアジュバント組成物。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原または抗原性成分を含むワクチン組成物。

【請求項7】

前記抗原ががん抗原である請求項６に記載のワクチン組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規なアジュバント組成物およびそれを含有するワクチン組成物に関するものである。

【背景技術】

【0002】

がん免疫療法はがん抗原としてペプチドワクチンを投与する方法が主流であるが、有効率を上げる方法として、がん抗原の投与と同時に、樹状細胞を活性化させるアジュバントを同時投与する方法が提唱されている。本発明者らは、がん免疫療法に用いるアジュバントについて研究を進めており、麻疹ウイルス由来のｄｉＲＮＡ（defective interference RNA）が、アジュバントの機能を有することを見出した。具体的には、当該ｄｉＲＮＡは、ヒト細胞に対してＩＦＮ−β発現を誘導し、ＮＫ細胞のＮＫ活性を増強させ、Ｂ１６メラノーマ細胞を移植した担がんマウスに対してがん抗原エピトープと共に投与すると顕著な腫瘍退縮効果を示したことを見出した（特許文献１）。また、本発明者らは、ポリＩＣのＴＬＲ３を介したＩＦＮ−β発現誘導を阻害するオリゴＤＮＡを見出し、当該オリゴＤＮＡは、ポリＩＣと共通のレセプターを介して細胞内に取り込まれ、取り込まれたオリゴＤＮＡの一部がＴＬＲ３に局在することを報告している（非特許文献１）。さらに、本発明者らは、非特許文献１に記載のオリゴＤＮＡと特許文献１に記載のｄｉＲＮＡに基づいて設計した新規な核酸が、エンドソーム上のＴＬＲ３に到達し、強いアジュバント活性を有することを見出した（特許文献２）。

【0003】

一方、アジュバント活性を有する核酸を医薬品として供給するためには、ＧＭＰ基準を遵守して製造する必要があるため、化学合成により核酸を製造することが不可欠である。しかしながら、１００ｍｅｒを超えるような長鎖ＲＮＡを化学合成する技術は未だ確立されておらず、専らインビトロ転写により合成されている。それゆえ、ヒトに適用する医薬品としてのアジュバント製剤を開発するためには、強いアジュバント活性と高い安全性を有し、かつ、化学合成により製造可能な核酸の創製が強く求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開ＷＯ２００８／０６５７５２号

【特許文献2】国際公開ＷＯ２０１２／０１４９４５号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】The Journal of Immunology, 2008, 181: 5522-5529

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、強いアジュバント活性と高い安全性を有し、かつ、化学合成により製造可能な核酸を含有するアジュバント組成物、および当該アジュバント組成物と抗原または抗原性成分を含むワクチン組成物を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］配列番号３に示される塩基配列からなる一本鎖核酸Ａと、配列番号４に示される一本鎖核酸Ｂにより形成されている二本鎖核酸を含有することを特徴とするアジュバント組成物。
［２］一本鎖核酸Ａおよび一本鎖核酸Ｂが化学合成されていることを特徴とする前記［１］に記載のアジュバント組成物。
［３］一本鎖核酸Ａおよび一本鎖核酸Ｂが、化学合成された複数のフラグメントをライゲーションにより連結させて作製されていることを特徴とする前記［１］または［２］に記載のアジュバント組成物。
［４］一本鎖核酸Ａおよび一本鎖核酸Ｂのいずれの末端にもリン酸基が結合していないことを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のアジュバント組成物。
［５］一本鎖ＤＮＡを構成するヌクレオチドの全部がホスホロチオエート修飾されていることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載のアジュバント組成物。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原または抗原性成分を含むワクチン組成物。
［７］前記抗原ががん抗原である前記［６］に記載のワクチン組成物。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、化学合成で製造され、強いアジュバント活性と高い安全性を有する核酸を含有するアジュバント組成物を提供することができる。当該核酸は、インビトロ転写により製造された核酸と比較して安定性が高く、副作用が少ないので、ヒトに適用するためのアジュバントとして非常に有用である。また、当該アジュバント組成物と抗原または抗原性成分とを組み合わせることにより、優れたワクチン組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】（Ａ）はｃＭ３６２−１４０の構造を示す図であり、（Ｂ）はｃＭ３６２−１４０のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを７％尿素含有８％ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。

【図2】ｃＭ３６２−１３９の構造を示す図である。

【図3】ｃＭ３６２−１４０およびｃＭ３６２−１３９の、血清を添加したＰＢＳに対する安定性を検討した結果を示す図であり、（Ａ）はｃＭ３６２−１４０の結果、（Ｂ）はｃＭ３６２−１３９の結果である。

【図4】ｃＭ３６２−１４０およびｃＭ３６２−１３９の、血清を添加したＲＮａｓｅフリー水に対する安定性を検討した結果を示す図である。

【図5】ｃＭ３６２−１４０によるＩＦＮ−βプロモーター活性化を、レポーターアッセイにより評価した結果を示す図である。

【図6】野生型マウスおよびＴＬＲ３ノックアウトマウス由来の脾臓樹状細胞を用いて、ｃＭ３６２−１４０によるサイトカイン産生誘導をインビトロで評価した結果を示す図である。

【図7】野生型マウスおよびＴＬＲ３ノックアウトマウスにｃＭ３６２−１４０を腹腔内投与し、サイトカイン産生誘導をインビボで評価した結果を示す図である。

【図8】ＥＧ７細胞の担がん野生型マウスを用いて、ｃＭ３６２−１４０および／またはＯＶＡによる退縮効果を評価した結果を示す図である。

【図9】ＥＧ７細胞の担がん野生型マウスにｃＭ３６２−１４０および／またはＯＶＡを投与し、脾臓細胞のＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を検出した結果を示す図である。

【図10】ＥＧ７細胞の担がん野生型マウスにｃＭ３６２−１４０および／またはＯＶＡを投与し、脾臓細胞のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。

【図11】Ｂ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｄ８）担がんマウス（野生型マウスまたはＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス）を用いてｃＭ３６２−１４０による退縮効果を評価した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

〔アジュバント組成物〕
本発明は、配列番号１に示される塩基配列およびその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡと、配列番号２に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡとが結合している核酸を含有するアジュバント組成物を提供する。本発明のアジュバント組成物に含有される核酸（以下、「本発明の核酸」と記す）は、配列番号１に示される塩基配列およびその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡと、配列番号２に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡとが結合している核酸であればよい。本発明の核酸の二本鎖ＲＮＡ部分はＴＬＲ３活性化能を有しており、一本鎖ＤＮＡ部分は樹状細胞のエンドソームに送達されることが確認されている。したがって、本発明の核酸は、樹状細胞のエンドソームに効率よく送達され、ＴＬＲ３を活性化することにより免疫機能を賦活化することができる。

【0011】

配列番号１に示される塩基配列は、馴化麻疹ウイルス株であるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（ＥＤ）株由来のｄｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列（配列番号５）の第１位〜第１４０位の塩基配列である。その相補配列は、配列番号４に示される塩基配列である。配列番号２に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＲＮＡのいずれの鎖に連結していてもよい。一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＲＮＡは直接連結していてもよく、他の核酸（例えば、リンカー核酸）を介して連結していてもよいが、直接連結していることが好ましい。また、一本鎖ＤＮＡの３’がＲＮＡ鎖の５’側と結合していてもよく、一本鎖ＤＮＡの５’側がＲＮＡ鎖の３’側と結合していてもよい。一本鎖ＤＮＡの３’末端がＲＮＡ鎖の５’末端と直接共有結合していることがより好ましく、一本鎖ＤＮＡの３’末端がＲＮＡセンス鎖（配列番号１）の５’末端と直接共有結合していることがさらに好ましい。すなわち、本発明の核酸は配列番号３に示される塩基配列からなる一本鎖核酸Ａ（一本鎖ＤＮＡとＲＮＡセンス鎖とのキメラ核酸）と、配列番号４に示される一本鎖核酸Ｂ（ＲＮＡアンチセンス鎖）により形成されていることが好ましい。

【0012】

一本鎖ＤＮＡを構成するヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾（「Ｓ化修飾」とも称される）されていることが好ましい。ホスホロチオエート修飾されているヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡを構成するヌクレオチドの一部でもよく、全部でもよいが、全部がホスホロチオエート修飾されていることがより好ましい。ホスホロチオエート修飾により、ヌクレアーゼ耐性を示すとともに、エンドソームへの送達性が向上する。

【0013】

本発明の核酸は、化学合成により製造された二本の核酸鎖により形成されていることが好ましい。すなわち、上記一本鎖核酸Ａおよび一本鎖核酸Ｂが化学合成された核酸鎖であることが好ましい。通常、長鎖ＲＮＡの合成にはインビトロ転写法が用いられるが、本発明の核酸は、インビトロ転写法を用いず、化学合成により配列特異的に製造することにより、例えば、凍結乾燥状態で安定に提供されるほか、合成された塩基配列が正確であるなどの点で有用性が高い。核酸の化学合成法は特に限定されず、公知の一般的な化学合成法を好ましく用いることができる。例えばホスホロアミダイト法などが挙げられる。

【0014】

各一本鎖核酸は、全長を一度に化学合成してもよく、いくつかのフラグメントに分けて合成した後、各フラグメントをライゲーションにより連結させてもよい。フラグメントの長さ（塩基数）は特に限定されないが、約３０〜約８０ｍｅｒが好ましく、約３５〜約７０ｍｅｒがより好ましく、約４０〜約６０ｍｅｒがさらに好ましい。ライゲーションには、公知のライゲーション方法を用いることができるが、例えばＭｏｏｒｅら（Moore MJ, & Sharp PA. Site-specific modification of pre-mRNA: the 2’-hydroxyl groups at the splice sites. Science 256: 992-997 (1992)）、Ｊｉｎｇら（Jing Xu, Lapham J, & Crothers DM. Determining RNA solution structure by segmental isotopic labeling and NMR: Application to Caenorhabditis elegans spliced leader RNA 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 44-48 (1996)）等に記載のスプリントＤＮＡによって媒介されるライゲーション反応を用いることが好ましい（実施例１参照）。

【0015】

本発明の核酸を形成する各一本鎖核酸は、いずれの末端にもリン酸基が結合していないことが好ましい。インビトロ転写により合成されたＲＮＡ鎖の５’末端には、３リン酸が付加されるが、本発明の核酸は化学合成により製造することができるので、５’末端および３’末端のいずれにもリン酸基が結合していない一本鎖核酸を用いて製造することができる。５’末端にリン酸基が残っていると、生体内での大量投与により細胞質内ＲＩＧ−Ｉ経路を活性化し、大量のサイトカイン産生が誘導され副作用の原因となることから（Robinson RA, DeVita VT, Levy HB, Baron S, Hubbard SP, Levine AS. A phase I-II trial of multiple-dose polyriboinosic-polyribocytidylic acid in patieonts with leukemia or solid tumors. J Natl Cancer Inst. 1976 Sep;57(3):599-602）、本発明の核酸を用いれば、安全性の高いアジュバント組成物を提供することができる。

【0016】

また、本発明の核酸は、ポリＩＣと異なり、ＴＬＲ３下流のＴＩＣＡＭ−１を介するシグナル伝達系を選択的に活性化し、ＴＬＲ３以外の細胞内ＲＮＡセンサー活性化しないので、サイトカインストームを引き起こす懸念がない点で、安全性が高いことが確認されている（実施例５，７等参照）。さらに、本発明の核酸は、インビトロ転写により合成されたＲＮＡ鎖を用いて形成された類似構造の核酸と比較して、安定性に優れていることが確認されている（実施例２参照）。

【0017】

このように、本発明の核酸は、樹状細胞のエンドソームに送達されてＴＬＲ３を活性化することができるので、種々の免疫反応を増強することができる。さらに、本発明の核酸は、安全性および安定性が高いので、アジュバント組成物の有効成分として非常に有用である。本発明のアジュバント組成物は、本発明の核酸および薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤、注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。

【0018】

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などに溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。

【0019】

このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。本発明のアジュバント組成物の投与量、投与頻度は、投与目的、投与対象の年齢、体重、性別、既往歴、投与方法などを考慮して、適宜設定することができる。

【0020】

〔ワクチン組成物〕
本発明は、上記本発明のアジュバント組成物と抗原または抗原性成分を含むワクチン組成物を提供する。抗原または抗原性成分としては、ウイルス抗原、細菌抗原、がん抗原、およびこれらの成分等が挙げられる。好ましくは、がん抗原である。がん細胞を皮下に移植して腫瘍を形成させたマウスに対して本発明の核酸とがん抗原を併用投与したところ、腫瘍を顕著に退縮させることができたことから、本発明のワクチン組成物は、がんワクチンとして非常に有用であることが確認されている。本発明のワクチン組成物は、上記本発明のアジュバント組成物に抗原または抗原性成分を添加することにより製造することができる。また、本発明のワクチン組成物は、上記本発明のアジュバント組成物と同様に製剤化して実施することができる。

【0021】

ウイルス抗原としては、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、海綿状ウイルス、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、風疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス等のウイルス抗原またはこれらの組み合わせが挙げられる。

【0022】

細菌抗原としては、例えば、バチルス属、エスケリキア属、リステリア属、ナイセリア属、ノカルジア属、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属等の細菌抗原またはこれらの組み合わせが挙げられる。

【0023】

がん抗原としては、例えば、白血病、リンパ腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、消化器系腫瘍、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、食道癌、胃癌、直腸癌、大腸癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発骨髄腫等のがん抗原またはこれらの組み合わせが挙げられる。

【0024】

本発明には、さらに以下の発明が含まれる。
（１）配列番号３に示される塩基配列からなる一本鎖核酸Ａと、配列番号４に示される一本鎖核酸Ｂにより形成されていることを特徴とする核酸。
（２）哺乳動物に対して、前記（１）に記載の核酸およびがん抗原を投与することを特徴とするがんの治療方法。
（３）がんの治療に使用するための前記（１）に記載の核酸。
（４）がん治療薬を製造するための前記（１）に記載の核酸使用。

【実施例】

【0025】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0026】

〔実施例１：核酸の作製〕
（１）ｃＭ３６２−１４０（化学合成核酸）の作製
表１に記載の各一本鎖核酸（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、ＡＳ１、ＡＳ２およびＡＳ３）は、株式会社ジーンデザインに委託して合成した。ＲＮＡ部分の化学合成にはｔＢＤＭＳ ＲＮＡ ａｍｉｄｉｔｅを、ＤＮＡ部分の化学合成には一般的なＤＮＡ ａｍｉｄｉｔｅを、Ｓ化（ホスホロチオエート）部分はＰＡＤＳを使用した。合成方法は固相担体を用いたホスホロアミダイト法（Scaringe, S. A.et al, ;J Am Chem 1998;120:11820-11821）を基本とし、最適化したパラメーターを用いて実行した。合成完了後、一般的な方法を用いて塩基部分および２’位に存在する保護基を除去し、逆相ＨＰＬＣにて精製を行った後脱塩し、各一本鎖核酸を得た。

【0027】

【表1】

【0028】

化学合成長鎖ＲＮＡであるｃＭ３６２−１４０は、スプリントＤＮＡによって媒介されるライゲーション反応（参考文献：Moore MJ, & Sharp PA. Site-specific modification of pre-mRNA: the 2’-hydroxyl groups at the splice sites. Science 256: 992-997 (1992)、Jing Xu, Lapham J, & Crothers DM. Determining RNA solution structure by segmental isotopic labeling and NMR: Application to Caenorhabditis elegans spliced leader RNA 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 44-48 (1996)）により作製した。

【0029】

ｃＭ３６２−１４０のセンス鎖ＲＮＡ（一本鎖核酸Ａ）は、二段階のライゲーション反応により作製した。第一のライゲーションとして、Ｓ２フラグメント（配列番号７、40 nmol）、Ｓ３フラグメント（配列番号８、40 nmol）およびライゲーション部位に特異的なスプリントＤＮＡ（配列番号１２、40-48 nmol）を混合し、９５℃で５分間加熱した後、４℃までゆっくり冷却し、ハイブリダイズさせた。続いてＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ）を添加して室温で１６〜２２時間インキュベートした。ライゲーション反応混合物は、１５．４μＭのアニール複合体、６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２，１０ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰおよび〜３１ｕｎｉｔ／μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む。第二のライゲーションとして、Ｓ１フラグメント（配列番号６、40 nmol）と第二のライゲーション部位に特異的なスプリントＤＮＡ（配列番号１３、40-48 nmol）を第一のライゲーション反応混合物に添加し、第一のライゲーションと同様にハイブリダイズさせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加して室温で１６〜２２時間インキュベートした。第二のライゲーション反応混合物は、８．９μＭのアニール複合体、６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ_２，１０ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰおよび〜３１ｕｎｉｔ／μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む。得られた全長１６５ｍｅｒのセンス鎖ＲＮＡ（一本鎖核酸Ａ）は、７Ｍの尿素を含む８％ＰＡＧＥで分離し、ＵＶ照射によって可視化した後、目的のバンドを切り出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウムで溶出した。溶出したＲＮＡはエタノール沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水に再懸濁した。ＲＮＡの大規模調製のために、電気溶出はＤ−チューブダイアライザーマキシ（Novagen社）を使用して実施し、溶出したＲＮＡを透析し、濃縮し、エタノールで沈殿させた。ＲＮＡの濃度は、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。収率は８〜１０％であった。

【0030】

ｃＭ３６２−１４０のアンチセンスＲＮＡ（一本鎖核酸Ｂ）を作製するために、３つのフラグメント、ＡＳ１（配列番号９、33 nmol）、ＡＳ２（配列番号１０、33 nmol）およびＡＳ３（配列番号１１、33 nmol）ならびに二箇所のライゲーション部位に特異的な二種類のスプリントＤＮＡ（配列番号１４および１５、各 33 nmol）を混合し、ハイブリダイズし、その後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加し室温で１６〜２２時間インキュベートした。ライゲーション反応混合物は、１５μＭのアニール複合体、６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ_２，１０ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰおよび〜３１ｕｎｉｔ／μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む。得られた全長１４０ｍｅｒのアンチセンスＲＮＡ（一本鎖核酸Ｂ）は、上記センスＲＮＡと同様の手順で精製した。収率は１５〜２２％であった。

【0031】

得られたセンスＲＮＡ（一本鎖核酸Ａ）およびアンチセンスＲＮＡ（一本鎖核酸Ｂ）をアニールさせて、ｃＭ３６２−１４０を得た。図１にｃＭ３６２−１４０の構造（Ａ）および合成された１６５ｍｅｒのセンスＲＮＡ（一本鎖核酸Ａ）および１４０ｍｅｒのアンチセンスＲＮＡ（一本鎖核酸Ｂ）を８％ＰＡＧＥに供した結果（Ｂ）を示した。センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡは、それぞれの塩基長に相当する位置に単一のバンドとして検出された。

【0032】

（２）対照核酸ｃＭ３６２−１３９の作製
ｃＭ３６２−１３９の構造を図２に、ｃＭ３６２−１３９を構成する核酸の塩基配列を表２に示す。

【表2】

【0033】

一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ＋リンカーＤＮＡ）は、株式会社ジーンデザインに委託して合成した。二本鎖ＲＮＡのテンプレートとして、馴化麻疹ウイルス株であるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（ＥＤ）株由来のｄｉＲＮＡ（defective interference RNA）を用いた。ＭＶゲノムのこの領域およびＴ7プロモーター配列をカバーするＤＮＡ断片は、プラスミドｐＣＲ−Ｔ７ＭＶを鋳型として用いたＰＣＲで増幅した。用いたプライマーを以下に示す。
ODN-139 sense RNA (5’ primer)
5’-tgtaatacgactcactatagggaccagacaaagctggga-3’（配列番号１９）
下線部はＴ７プロモーター配列
ODN-139 sense RNA (3’ primer)
5’-ggatacagtgccctgattaa-3’（配列番号２０）
ODN-139 antisense RNA (5’ primer)
5’-tgtaatacgactcactataggatacagtgccctgattaa-3’（配列番号２１）
下線部はＴ７プロモーター配列
ODN-139 antisense RNA (3’ primer)
5’-ccgtggtcatgctccgggaccagacaaagctggga-3’（配列番号２２）

【0034】

ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ^ＴＭＴ７転写キット（Epicentre Technologies）を用いて、製造業者のプロトコールに従い、ＰＣＲ産物からセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡをそれぞれインビトロ転写により作製した。得られた転写産物は、７Ｍ尿素を含む８％ＰＡＧＥで分離し、上記実施例１と同じ方法で精製した。最後に、一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ＋リンカーＤＮＡ）、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを混合し、アニールさせて、ｃＭ３６２−１３９を得た。

【0035】

〔実施例２：核酸の安定性〕
（１）血清を添加したＰＢＳ中の安定性
ｃＭ３６２−１４０およびｃＭ３６２−１３９をそれぞれ、血清を含まないＰＢＳ、１０％熱不活化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１０％ＭＳ（マウス血清）または１０％ＨＳ（ヒト血清）を含むＰＢＳに２０μｇ／ｍＬの濃度で溶解し、３７℃または４２℃で６０分間インキュベートした。インキュベート開始前（０分、血清を含まないＰＢＳのみ）、５分後、１５分後、３０分後および６０分後に、０．１μｇの核酸が含まれるように溶液を取り、１０×ローディングダイ（タカラバイオ）と混合し、臭化エチジウムを含む４％アガロースゲル（Nusieve 3:1 Agarose, Ronza）で電気泳動した。
結果を図３に示した。（Ａ）がｃＭ３６２−１４０の結果、（Ｂ）がｃＭ３６２−１３９の結果である。３７℃３０分のインキュベーションでは、どちらの核酸も安定であったが、４２℃３０分のインキュベーションでは、インビトロ転写により作製したｃＭ３６２−１３９は、血清（ＦＢＳ、ＭＳ、ＨＳ）を含むＰＢＳ中で少し分解した。

【0036】

（２）血清を添加したＲＮａｓｅフリー水中の安定性
ＰＢＳに代えてＲＮａｓｅフリー水を用い、電気泳動に３％アガロースゲルを用いたこと以外は上記と同じ条件で安定性を検討した。
結果を図４に示した。（Ａ）がｃＭ３６２−１４０の結果、（Ｂ）がｃＭ３６２−１３９の結果である。ｃＭ３６２−１４０はいずれの条件下でも安定であったが、ｃＭ３６２−１３９は、血清（ＦＢＳ、ＭＳ、ＨＳ）存在下では部分的な分解が見られた。
以上の結果から、ｃＭ３６２−１３９よりｃＭ３６２−１４０のほうが安定性に優れていることが明らかになった。

【0037】

〔実施例３：ＩＦＮ−βプロモーター活性化〕
ＨＥＫ２９３細胞（8×10⁵cells/well）を６穴培養プレートに播種した。ヒトＴＬＲ３発現ベクター（400ng/well）または空ベクター（400ng/well）を、レポータープラスミドｐ−１２５（400ng/well）および内部コントロールベクターのｐｈＲＬ−ＴＫ（20ng/well、Promega）と共に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ヒトＩＦＮ−βプロモーター（-125〜+19）を含むレポータープラスミドｐ−１２５は、東京大学の谷口博士から提供された。培地には、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Invitrogen）および抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen）を用いた。

【0038】

トランスフェクションから２４時間後に細胞を回収し、培地に再懸濁して９６穴培養プレートに播種した。核酸濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにｃＭ３６２−１４０、ｃＭ３６２−１３９、ポリＩＣ（Amersham）またはｃＭ３６２−１４０の二本鎖ＲＮＡ部分（ｄｓＲＮＡ１４０）を以下の条件で添加した。
（Ａ）ヒトＴＬＲ３発現ＨＥＫ２９３細胞の培地に核酸を直接添加
（Ｂ）ヒトＴＬＲ３発現ＨＥＫ２９３細胞の培地に核酸とＤＯＴＡＰリポソーム型トランスフェクション試薬（Roche）を添加
（Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞の培地に核酸とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）を添加
ルシフェラーゼ活性の測定には、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いた。上記（Ａ）および（Ｂ）は核酸添加から６時間後に、上記（Ｃ）は核酸添加から２４時間後に、それぞれルシフェラーゼ活性の測定を行った。

【0039】

結果を図５に示した。左が上記（Ａ）、中央が上記（Ｂ）、右が上記（Ｃ）の結果である。データはｎ＝３の平均値および標準偏差で示した。ヒトＴＬＲ３発現ＨＥＫ２９３細胞の外（培地）にｃＭ３６２−１４０を単純添加した場合（Ａ）、およびヒトＴＬＲ３発現ＨＥＫ２９３細胞のエンドソームにｃＭ３６２−１４０を送達した場合（Ｂ）のいずれも、ｃＭ３６２−１４０はｃＭ３６２−１３９と同様に、ＩＦＮ−βプロモーターを効率的に活性化した（図５左および中央）。一方、ヒトＴＬＲ３を発現していないＨＥＫ２９３細胞の細胞質にｃＭ３６２−１４０を送達した場合（Ｃ）には、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化しなかった。この結果から、ｃＭ３６２−１４０は、ＴＬＲ３を介してＩＦＮ−βプロモーターを活性化し、他のＲＮＡ／ＤＮＡセンサーを介したＩＦＮ−βプロモーター活性化は誘導しないことが示された。

【0040】

〔実施例４：インビトロサイトカイン産生誘導〕
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型：ＷＴ）およびＴＬＲ３ノックアウトマウス（ＴＬＲ３ＫＯ、大阪大学の審良博士から提供された）からそれぞれ脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理を行った。フィルターを通過させ、溶血後、培地で洗浄し、ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いたＭＡＣＳ ｓｙｓｔｅｍ（miltenyi biotech）でＣＤ１１ｃ陽性細胞を単離し、脾臓ＤＣとした。培地には、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Invitrogen）および抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen）を用いた。なお、本明細書に記載の全ての動物実験は、北海道大学動物実験委員会が作成したガイドラインに従って実施された。
脾臓ＤＣを５×１０^５個／５００μＬ培地／ｗｅｌｌとなるように２４穴プレートに分注し、核酸（ｃＭ３６２−１４０、ｃＭ３６２−１３９、ポリＩＣ、またはｄｓＲＮＡ１４０）２０μｇ／ｍＬを（Ａ）単独で、（Ｂ）ＤＯＴＡＰリポソーム型トランスフェクション試薬（Roche）と共に、または（Ｃ）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）と共に添加して２４時間培養した。２４時間後、培養上精を回収し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＦＮ−βの産生量を測定した。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の測定にはＢＤ ＣＢＡ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。ＩＦＮ−βの測定には、マウスＩＦＮ−β用ＥＬＩＳＡキット（PBL Assay Science）を用いた。

【0041】

結果を図６に示した。左列が（Ａ）培地に核酸を単独で添加した場合、中央列が（Ｂ）培地に核酸とＤＯＴＡＰリポソーム型トランスフェクション試薬を添加した場合、右列が（Ｃ）培地に核酸とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を添加場合であり、上段がＴＮＦ−α、中段がＩＬ−６、下段がＩＦＮ−βである。データは独立した３回の試験の平均値および標準偏差で示した。左列の結果からわかるように、脾臓ＤＣの細胞外へのｃＭ３６２−１４０を単独で添加することにより、野生型マウス由来の脾臓ＤＣにおいて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＦＮ−βの産生がわずかに増加した。対照的に、中央列の結果からわかるように、ＤＯＴＡＰリポソーム型トランスフェクション試薬を用いてｃＭ３６２−１４０をエンドソームに送達すると、野生型マウス由来の脾臓ＤＣにおいて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＦＮ−βの産生量が増加した。一方、右列の結果からわかるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてｃＭ３６２−１４０を細胞質に送達した場合は、エンドソームに送達した場合よりＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＦＮ−βの産生量が減少した。いずれの場合もＴＬＲ３ＫＯマウスの脾臓ＤＣではｃＭ３６２−１４０によるサイトカイン産生は見られなかった。これらの結果から、ｃＭ３６２−１４０は、エンドソームのＴＬＲ３を標的とするが、細胞質のＲＮＡ／ＤＮＡセンサーを標的としないことが示された。

【0042】

〔実施例５：インビボサイトカイン産生誘導〕
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（９週齢、メス）またはＴＬＲ３ＫＯマウス（９週齢、メス）に、５０μｇのｃＭ３６２−１４０、ｃＭ３６２−１３９またはポリＩＣを腹腔内投与した。一群あたり３匹のマウスを用いた。各核酸溶液は、ＲＮａｓｅフリー水を用いて調製した。核酸投与後、１時間目、３時間目および６時間目に尾静脈から採血し、血清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を測定した。測定には、ＢＤ ＣＢＡ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。

【0043】

結果を図７に示した。左列がポリＩＣ、中央列がｃＭ３６２−１３９、右列がｃＭ３６２−１４０、上段がＴＮＦ−α、中段がＩＬ−６、下段がＩＬ−１０の結果である。データはｎ＝３の平均値±ＳＥで示した。図７から明らかなように、ｃＭ３６２−１４０はポリＩＣと比較して、インビボでのサイトカイン産生量が顕著に少ないことが示された。この結果から、ｃＭ３６２−１４０は、生体に投与した際にサイトカインストーム等の副作用の懸念がなく、安全性が高いと考えられた。

【0044】

〔実施例６：抗原特異的ＣＴＬの誘導〕
（１）腫瘍退縮効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背部を剃毛し、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ（ＰＢＳ）のＥＧ７細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胸腺種に由来するＥＬ４細胞にオボアルブミン抗原を発現させたがん細胞）を皮下に移植して腫瘍を形成させ、腫瘍体積（ｃｍ^３）（長径×短径^２×０．４）を経時的に測定した。移植後８日目（腫瘍体積：約０．６ｃｍ^３）に、ｃＭ３６２−１４０単独、ＯＶＡ単独、またはｃＭ３６２−１４０＋ＯＶＡを腫瘍周辺の皮下に投与した。対照としてＰＢＳ（−）のみを同様に投与した。一群あたり４匹のマウスを用いた。ｃＭ３６２−１４０の用量は５０μｇ、ＯＶＡの用量は１００μｇとし、いずれもＰＢＳ（−）に溶解して調製した。投与容量は５０μＬとした。一回目の投与から７日後（移植後１５日目）に二回目の投与を行った。ＯＶＡには、エンドトキシンフリーＯＶＡ（Hyglos）を用いた。

【0045】

結果を図８に示した。ｃＭ３６２−１４０の単独投与群では腫瘍がほとんど退縮しなかったが、ｃＭ３６２−１４０＋ＯＶＡ投与群では腫瘍が顕著に退縮した（*：p<0.05）。なお、データは平均値±ＳＥで示し、統計解析には一元配置分散分析およびボンフェローニテストを用いた。

【0046】

（２）テトラマーアッセイ
ｃＭ３６２−１４０のアジュバント活性を評価するために、ＥＧ７担がんマウスから脾臓細胞を調製し、テトラマーアッセイを行った。上記（１）において、ＰＢＳ、ｃＭ３６２−１４０単独、ＯＶＡ単独、またはｃＭ３６２−１４０＋ＯＶＡの二回目の投与から７日後（移植後２２日目）に、定法に従い脾臓細胞を調製した。得られた脾臓細胞をＦＩＴＣ−ＣＤ８α（BioLegend）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−７ＡＡＤ（BD Biosciences）、ＡＰＣ−ＣＤ３ε（BioLegend）およびＰＥ−ＯＶＡ−テトラマー（MBL）で染色し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（テトラマー^＋／ＣＤ８^＋／ＣＤ３^＋細胞）を検出し、その割合を求めた。

【0047】

結果を図９に示した。図９から明らかなように、ｃＭ３６２−１４０＋ＯＶＡ投与群は、他群と比較して、脾臓細胞中のＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合が有意に増加していた（**：p<0.01）。なお、統計解析には一元配置分散分析およびボンフェローニテストを用いた。

【0048】

（３）ＩＦＮ−γ産生
上記（２）で調製した脾臓細胞（2×10⁶cells/200μL/well）を９６穴培養プレートに播種し、ＯＶＡペプチド（ＳＬ８）１００ｎＭ存在下で３日間培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γ量をＢＤ ＣＢＡ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。
結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、ｃＭ３６２−１４０＋ＯＶＡ投与群は、他群と比較して、脾臓細胞のＩＦＮ−γ産生量が有意に増加していた（**：p<0.01）。なお、データは平均値±ＳＥで示し、統計解析には一元配置分散分析およびボンフェローニテストを用いた。

【0049】

（４）小括
実施例６の各結果から、ｃＭ３６２−１４０は抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の増殖と活性化を誘導し、がん抗原と併用することにより優れたアジュバント効果を奏することが明らかになった。

【0050】

〔実施例７：ＮＫ細胞の活性化による腫瘍退縮効果〕
Ｃ５７ＢＬ／６−Ｂ１６同系ＮＫ感受性腫瘍移植モデル（Akazawa T., T. Ebihara, M. Okuno, Y. Okuda, K. Tsujimura, T. Takahashi, M. Ikawa, M. Okabe, T. Ebihara, M, Shingai, N. Inoue, M. Tanaka-Okamoto, H. Ishizaki, J. Miyoshi, M. Matsumoto, and T. Seya. 2007. Antitumor NK activation induced by the Toll-like receptor3-TICAM-1 (TRIF) pathway in myeloid dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104: 252-257.）を用いて、ＮＫ細胞の活性化による移植がんの退縮効果を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型：ＷＴ）およびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス（ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯ、発明者らが作製）の背部を剃毛し、６×１０^５ｃｅｌｌｓ／２００μＬ（ＰＢＳ）のＢ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｄ８）を皮下に移植して腫瘍を形成させ、腫瘍体積（ｃｍ^３）（長径×短径^２×０．４）を経時的に測定した。移植後１２日目に、ｉｎ ｖｉｖｏ−ＪｅｔＰＥＩと混合した１５０μｇのｃＭ３６２−１４０または蒸留水（ＤＷ）を腫瘍周辺の皮下に投与した。一群あたり３匹のマウスを用いた。

【0051】

結果を図１１に示した。左が野生型マウス、右がＴＩＣＡＭ−１ ＫＯマウスの結果である。図１１から明らかなように、ｃＭ３６２−１４０は野生型マウスにおいて蒸留水（ＤＷ）投与と比較して顕著な腫瘍退縮効果を示したが、ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯマウスにおいては、腫瘍退縮効果を示さなかった。この結果から、本発明の核酸は、ＴＩＣＡＭ−１を介するシグナル伝達で効果を発揮することが示された。

【0052】

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]