特開 2016-168020 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた遺伝子検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-168020(P2016-168020A)

(43)【公開日】2016年9月23日

(54)【発明の名称】刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた遺伝子検査方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160826BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2015-51077(P2015-51077)

(22)【出願日】2015年3月13日

(71)【出願人】

【識別番号】507219686

【氏名又は名称】静岡県公立大学法人

(71)【出願人】

【識別番号】311002067

【氏名又は名称】ＪＮＣ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】関川 貴寛

(72)【発明者】

【氏名】謝 小毛

(72)【発明者】

【氏名】大西 徳幸

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR52

4B063QS25

(57)【要約】

【課題】被検試料の種別を問わず、また慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに簡便に標的の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の回収を行うことができ、且つ、得られた核酸試料を、その後の核酸分離または核酸精製等の煩雑な工程を必要とすることなく、そのまま逆転写反応及び／又は核酸増幅を行っても悪影響を与えない、新規な遺伝子検査方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、被検試料中の核酸を回収し、核酸増幅を行う遺伝子検査方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む遺伝子検査方法に関する。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
（４）回収した結合体を、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行う工程
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検試料中の核酸を回収し、核酸増幅を行う遺伝子検査方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む遺伝子検査方法。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
（４）回収した結合体を、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行う工程

【請求項2】

前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体である請求項１に記載の遺伝子検査方法。

【請求項3】

前記ポリオキシエチレン誘導体が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート及びポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１である請求項２に記載の遺伝子検査方法。

【請求項4】

前記核酸増幅を行う工程における、前記非イオン性界面活性剤の濃度が、０．１〜５質量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。

【請求項5】

前記核酸増幅を行う工程で使用する核酸増幅酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、又はＡａｃポリメラーゼのいずれかであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた遺伝子検査方法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸を含む試料から核酸を精製することによって、遺伝子の解析や同定をすることは、衛生検査、臨床検査、および研究の分野において頻繁に行われている。

【0003】

例えば、種々の動物の消化管に寄生する原虫であるクリプトスポリジウムのオーシストは強い塩素耐性を示すためにしばしば水道を介した集団下痢症を引き起こしている。このことからクリプトスポリジウムは、臨床上あるいは公衆衛生学的に現在最も注目される原虫となっている。

【0004】

クリプトスポリジウムの検出は、通常、顕微鏡下での目視により行われているが、かかる方法は、操作が煩雑で迅速性が低く、かつ検出率も低いため、検出に多大な労力を必要とする。
従って、近年、クリプトスポリジウムの研究にも遺伝子学的手法が用いられるようになり、種の同定や型別を比較的容易に行うことができるようになってきている。

【0005】

また、近年、遺伝子工学の発展により種々の生物の遺伝子配列が解明されつつあり、これら解明された遺伝子の機能、生物学的な役割を解明することは重要である。このような遺伝子の機能解析において、生物の各組織内でいかなる遺伝子が発現されているかを知ることは極めて重要である。例えば、こうした組織内での遺伝子発現を解析する手法の一つとして、組織からｍＲＮＡを回収し、そのｍＲＮＡを解析すること等が行われている。

【0006】

従来、環境・生体試料等からの核酸を分離する方法として磁気ビーズ法が用いられている（特許文献１、非特許文献１，２）。磁気ビーズ法に用いられる磁性微粒子は、磁気ビーズに磁気分離能を持たせるために、粒径をマイクロサイズに設計した磁性微粒子（例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標））が用いられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開平９−１９２９２号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】クリプトスポリジウム症を中心とした原虫性下痢症の診断マニュアル，平成１５年度，国立感染症研究所

【非特許文献2】水道における指標菌及びクリプトスポリジウム等の検査方法について（平成２４年３月２日付け健水発０３０２号 厚生労働省健康局水道課長通知）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、特許文献１に記載の磁性微粒子を用いて磁気ビーズ法を利用して核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の回収をした場合、核酸増幅を実施する前に、核酸と磁性微粒子とを分離することにより核酸の精製を行う必要があり、作業が煩雑となっていた。

【0010】

そこで本発明は、被検試料の種別を問わず、また慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに簡便に標的の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の回収を行うことができ、且つ、得られた核酸を、その後の核酸分離または核酸精製等の煩雑な工程を必要とすることなく、そのまま逆転写反応及び／又は核酸増幅を行うことができる、新規な遺伝子検査方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、標的の核酸に対する親和性物質が結合している刺激応答性磁性ナノ粒子を用いて核酸を回収し、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行うことで、刺激応答性磁性ナノ粒子を含んだ状態で逆転写反応及び／又は核酸増幅試験に課すことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。

【0012】

１．被検試料中の核酸を回収し、核酸増幅を行う遺伝子検査方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む遺伝子検査方法。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
（４）回収した結合体を、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行う工程
２．前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体である前記１に記載の遺伝子検査方法。
３．前記ポリオキシエチレン誘導体が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート及びポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１である前記２に記載の遺伝子検査方法。
４．前記核酸増幅を行う工程における、前記非イオン性界面活性剤の濃度が、０．１〜５質量％である、前記１〜３のいずれか１に記載の遺伝子検査方法。
５．前記核酸増幅を行う工程で使用する核酸増幅酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、又はＡａｃポリメラーゼのいずれかであることを特徴とする、前記１〜４のいずれか１に記載の遺伝子検査方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、被検試料の種別を問わず、また慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに簡便に標的の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の回収を行うことができ、且つ、得られた核酸を、その後の核酸分離または核酸精製等の煩雑な工程を必要とすることなく、そのまま逆転写反応及び／又は核酸増幅を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、本発明の一実施形態に係る方法における吸着材の概略構成図である。

【図2】図２は、非イオン性界面活性剤添加による、ＴＭ−ＡＣの濃度がＰＣＲ阻害軽減効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の一実施形態について説明する。
本発明は、被検試料中の核酸を回収し、核酸増幅を行う遺伝子検査方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む遺伝子検査方法である。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
（４）回収した結合体を、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行う工程

【0016】

以下各工程について説明する。
（１）刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程

【0017】

本発明の遺伝子検査方法は、被検試料から核酸を回収し、当該核酸を増幅することにより、遺伝子検査を行うものである。本発明においては、まず、被検試料から核酸を回収する工程を有する。本工程は、核酸回収の第１段階として、吸着材と核酸の結合体を生成させる工程である。

【0018】

（被検試料）
被検試料としては特に限定されず、例えば、動物（ヒトを含む）、植物、微生物（原虫、原生動物等も含む）等の生物を対象とすることが可能である。また、被検試料としては、例えば、クリプトスポリジウムのようなオーシストを形成した原虫等であっても、本発明の被検試料として適用することができる。被検試料としては他にも、ウイルス、細菌、真菌等が挙げられる。

【0019】

（核酸）
本発明における、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体を含む概念として用いられているものである。
例えば、動物由来の被検試料からの核酸としては、血清、血漿等の血液成分からの血中遊離ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等のＤＮＡ、血中遊離メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等のＲＮＡ、原虫・細菌由来のＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ等が挙げられる。

【0020】

（吸着材）
本発明において吸着材は、核酸を回収するために用いることができる。吸着材は、刺激応答性磁性ナノ粒子及び核酸に対する親和性物質を有し、両者が結合してなるものである。

【0021】

（刺激応答性磁性ナノ粒子）
本発明においては、被検試料を含む水溶液中の核酸の回収に刺激応答性磁性ナノ粒子を使用する。刺激応答性磁性ナノ粒子を使用することによって、後述する核酸増幅の際に、核酸と刺激応答性磁性ナノ粒子とを分離することによる核酸の精製を行う必要がなく、簡易に検出対象の検出を行うことができる。

【0022】

本発明で用いられる刺激応答性磁性ナノ粒子は、刺激応答性ポリマーと磁性物質（磁性微粒子）とを用いて得られる。この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる磁性ナノ粒子である。刺激は、特に限定されないが、温度、光、酸、塩基、ｐＨ若しくは電気等の様々な物理的、または化学的信号であってよい。

【0023】

特に、刺激応答性ポリマーとしては、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーが利用できる。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」とも称する）を有するポリマーが挙げられる。

【0024】

本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、例えば、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、例えば、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーが挙げられる。また、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが挙げられる。

【0025】

（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。

【0026】

本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、例えば、アクロイルグリシンアミド、アクロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが挙げられる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド、アクロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。

【0027】

また、本発明では刺激応答性ポリマーとして、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。
このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、例えば、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが挙げられる。より具体的には、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンゼンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドまたはこれらの塩を共重合成分として含むポリマーが挙げられる。

【0028】

磁性物質である磁性微粒子は、例えば、多価アルコールとマグネタイトとで構成される。

【0029】

多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体であれば特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール及びシクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８号公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。

【0030】

このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。また、磁性微粒子の平均粒径が前記範囲であることによって、液体中での分散性が良好となる結果、核酸増幅試験の際に反応液中で磁性微粒子が沈降せず適度に分散し、効率よく逆転写反応や核酸増幅試験を行うことができる。

【0031】

（親和性物質）
本発明で用いられる親和性物質としては、核酸に対して結合するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、核酸、アプタマー、カチオン性官能基を有する物質（例えば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基またはグアニジノ基を有する物質）、アニオン性官能基を有する物質、標的物質と相互作用する蛋白質（例えば、酵素、レセプター）、キレート剤などが挙げられる。

【0032】

（刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質との結合）
刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質との結合方法は、特に限定されないが、例えば、刺激応答性磁性ナノ粒子側（例えば刺激応答性ポリマー部分）及び親和性物質側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、ビオチン及びストレプトアビジンまたはアビジン）を結合させ、これら物質を介して刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質を結合させる。

【0033】

具体的には、刺激応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開第０１／０９１４１号に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行い、そこにストレプトアビジンを固定化する。また、親和性物質へのビオチン等の標識は常法に従って行う。ビオチンで標識された親和性物質とストレプトアビジン固定化刺激応答性ポリマーとを混合すると、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して、刺激応答性ポリマー及び親和性物質が結合する。

【0034】

具体的には、図１に示されるように、刺激応答性磁性ナノ粒子１は微粒子状の磁性物質２を含み、この磁性物質２の表面に刺激応答性ポリマー３が結合されている。刺激応答性ポリマー３にはストレプトアビジン４が結合しており、ビオチン５を介して検出対象７に対する親和性物質６が結合する。

【0035】

なお、本明細書では、刺激応答性ポリマーと微粒子状の磁性物質とが結合した材料を刺激応答性磁性ナノ粒子と記し、その刺激が熱の場合には、熱応答性磁性ナノ粒子と記している。

【0036】

微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。

【0037】

（水溶液中における吸着材と前記検出対象の結合体の生成）
上述した吸着材と核酸との結合体は、水溶液中で吸着材と核酸を任意の方法で混合させることによって、吸着材中の親和性物質と核酸が結合し、吸着材と核酸の結合体が生成する。親和性物質と核酸との結合は、特異的な結合ないし吸着を意味し、必ずしも共有結合である必要はなく、イオン的、生化学的親和性（アフィニティー）を利用した結合であってもよい。混合操作は、適当なバッファー中で、吸着材と核酸が接触し得るならば制限はない。例えば、核酸を含む被検試料及び吸着材が供されたチューブを軽く転倒撹拌または振とうさせる程度で十分であり、例えば市販のボルテックスミキサー等を用いて混合する操作等が挙げられる。

【0038】

（２）刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、結合体を凝集させる工程
本工程は核酸回収の第２段階として、工程（１）において核酸と吸着材の結合体が得られた後、刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、結合体を凝集させる工程である。

【0039】

刺激応答性ポリマーが凝集する条件とするには、例えば熱応答性ポリマーを用いた場合、混合物の入った容器を熱応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。熱応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度を有するポリマーと、下限臨界溶液温度を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合物の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、熱応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合物の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、熱応答性ポリマーを凝集させることができる。

【0040】

ここで、下限臨界溶液温度及び上限臨界溶液温度は例えば以下のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。ＵＣＳＴの場合は、１℃／分の速度で試料を冷却し、以下、ＬＣＳＴ同様の方法で求める。

【0041】

また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合物の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散している混合物の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合物の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合物の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることがさらに好ましい。

【0042】

また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合物の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０〜８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１〜１０００ｍＷ／ｃｍ^２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。

【0043】

（３）凝集した結合体を磁石で回収する工程
本工程は検出対象回収の最終段階として、工程（２）で凝集した結合体を磁石で分離し、検出対象を回収する工程である。磁性粒子を含有する結合体に磁力を付加することで、凝集した結合体を混合液中から分離し、回収する。これにより、結合体が非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離され、検出対象の回収が可能となる。

【0044】

例えば、核酸と吸着材との結合を適当なチューブ内で行った場合、チューブの側壁に磁石を外側から近づけることによって吸着材をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を排出することによって、核酸が結合した吸着材を分離することができる。

【0045】

核酸が結合した吸着材の分離に用いる磁石等の磁力は、用いる磁性物質の有する磁力の大きさによって異なる。磁力は、目的の磁性物質を磁集可能な程度の磁力を適宜使用できる。磁石の素材としては、例えば、上述した磁性物質の素材で構成されたものを使用することができる。例えば、ネオジム磁石（株式会社二六製作所製）等が利用できる。ネオジム磁石の磁力は、３８００ガウス以上がより好ましい。

【0046】

（４）回収した結合体を、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行う工程
本工程は、上記工程で回収された結合体中の核酸を試料として核酸増幅を行う工程である。上述したように、吸着材中の刺激応答性磁性ナノ粒子は、反応液中の刺激応答性磁性ナノ粒子の濃度が高いと、逆転写反応や核酸増幅を阻害しうる。そのためこれまでは逆転写反応や核酸増幅試験の前に核酸と磁性微粒子とを分離することにより核酸の精製を行う必要があった。しかしながら本発明では、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行うことによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応及び核酸増幅の阻害を軽減することができる。

【0047】

上述したように、本工程では、検出対象の検出感度の向上のため、上記工程で回収された核酸をそのまま試料として核酸増幅を行うことが可能である。核酸がＲＮＡである場合には、逆転写反応を行いＤＮＡとしてから核酸増幅試験を行う。逆転写反応は、上記工程（１）〜（３）で得られたＲＮＡを鋳型として、従来の公知の任意の方法を採用することができる。

【0048】

また核酸増幅の方法としては、任意の方法を使用することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、ＬＡＭＰ法、鎖置換増幅、逆転写酵素鎖置換増幅、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ＬＡＭＰ法、核酸配列に基づく増幅、転写媒介性増幅およびローリングサークル型増幅法、ＳｍａｒｔＡｍｐ、法逆転写ＳｍａｒｔＡｍｐ法等が挙げられる。

【0049】

通常ＤＮＡの増幅は、ＰＣＲ法により行うことが一般的である。ＰＣＲの方法としては、上記工程で得られたＤＮＡ、またはＲＮＡの逆転写反応により得られるＤＮＡを鋳型として、従来の公知の任意のＰＣＲ方法を採用することができる。本発明においては、ＰＣＲ増幅時の核酸増幅酵素が、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、又はＡａｃポリメラーゼのいずれかである場合には、特に、好適に利用可能である。

【0050】

（非イオン性界面活性剤）
本工程では、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行うことによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応や核酸増幅の阻害を軽減することができる。

【0051】

非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行うことによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応や核酸増幅の阻害を軽減することができる詳細は定かではないが、刺激応答性磁性ナノ粒子表面のポリマーに非イオン性界面活性剤が作用して、ミセルを形成することによるものと推測される。

【0052】

本発明で使用できる非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等が挙げられる。中でも、粘性が低くて扱いやすいという観点から、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）が好ましい。また、逆転写反応や核酸増幅を行う際には、非イオン性界面活性剤の濃度を、好ましくは０．１〜５質量％、より好ましくは０．５〜５質量％とするように希釈する。上記範囲であることによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による核酸増幅阻害を軽減することができる。

【0053】

また、逆転写反応や核酸増幅試験を好適に行うため、核酸試料中に残存する刺激応答性ナノ粒子は、好ましくは０．１〜１質量％、より好ましくは０．１〜０．５質量％である。上記範囲であることによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による核酸増幅阻害を軽減することができる。

【実施例】

【0054】

本発明を以下の実施例等により説明するが、これらによって制限されるものではない。
但し、「％」は「質量％」を示す。

【0055】

［実施例１］
（１）オーシスト回収用磁性ナノ粒子（ＴＭ−ＡＣ）の作製
アビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＡ Ａｖｉｄｉｎ，４ｇ／ｌ，ＪＮＣ株式会社）１ｍｌとＣ．ｐａｒｖｕｍオーシストに特異的なビオチン化モノクローナル抗体（Ｃｒｙｐｔ−ａ−Ｇｌｏ ｂｉｏｔｉｎ ｒｅａｇｅｎｔキット（２０倍濃縮），Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ社）２０μｌを混合・結合させて、オーシスト回収用磁性ナノ粒子（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ−Ａｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ：ＴＭ−ＡＣ）を作製した。

【0056】

（２）リアルタイムＰＣＲの実施
ＴＭ−ＡＣの終濃度を０．１％に調製し、ＤＮＡ試料とともに、リアルタイムＰＣＲを行った。
＜ＤＮＡ試料＞
クリプトスポリジウムのＤＮＡ試料として、人工合成ＤＮＡ（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ，１９２ｂｐ）（ｔｔｔａ ｔｇｇａａｇｇｇｔｔ ｇｔａｔｔｔａｔｔａ ｇａｔａａａｇａａｃ ｃａａｔａｔａａｔｔ ｇｇｔｇａｃｔｃａｔ ａａｔａａｃｔｔｔａ ｃｇｇａｔｃａｃａｔ ｔａａａｔｇｔｇａｃ ａｔａｔｃａｔｔｃａ ａｇｔｔｔｃｔｇａｃ ｃｔａｔｃａｇｃｔｔ ｔａｇａｃｇｇｔａｇ ｇｇｔａｔｔｇｇｃｃ ｔａｃｃｇｔｇｇｃａ ａｔｇａｃｇｇｇｔａ ａｃｇｇｇｇａａｔｔ ａｇｇｇｔｔｃｇａｔ ｔｃｃｇｇａｇａｇｇ ｇａｇｃｃｔｇａ：配列番号１）が挿入されたＤＮＡプラスミド溶液（ユーロフィンジェノミクス社）を用いた。

【0057】

＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲはクリプトスポリジウム１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセット
ｆｏｒｗａｒｄ：５’− ＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号２）、ｒｅｖｅｒｓｅ：５’− ＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＡ−３（配列番号３）（各５μＭ）０．８μｌとＴａｑＭａｎプローブ：ＴＣＴＧＡＣＣＺＡＴＣＡＧＣＴＴ（配列番号４）（１μＭ）２．０μｌ、ＰＣＲ試薬Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）１０μｌ、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ製）、リアルタイムＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ，ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて行った。Ｔｗｅｅｎ２０は終濃度が５％となるよう調整した。陽生対照（５×１０^６ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）の添加量は２μｌ、ＰＣＲの反応液量は２０μｌで行った。
ＰＣＲ条件は「Ｈｏｌｄ；１ｃｙｃｌｅ（９５℃、３０ｓ），２Ｓｔｅｐ ＰＣＲ；４５ｃｙｃｌｅｓ（６０℃、３０ｓ，９５℃、１０ｓ）」で行った。Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ ソフトウェアで解析した。

【0058】

［比較例１］
比較例１は、ＰＣＲ時にＴｗｅｅｎ２０を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様に試験を行った。
［実施例２、比較例２］
実施例２は、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０．５％に調製したこと以外は、実施例１と同様に試験を行った。比較例２は、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０．５％に調製し、ＰＣＲ時にＴｗｅｅｎ２０を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様に試験を行った。
［対照例１、２］
対照例１は、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０％としたこと以外は、実施例１と同様に試験を行った。対照例２は、ＴＭ−ＡＣの終濃度を０％とし、ＰＣＲ時にＴｗｅｅｎ２０を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様に試験を行った。

【0059】

ＴＭ−ＡＣによるＰＣＲ阻害を評価した結果を図１（白四角：Ｔｗｅｅｎ２０添加なし）に示す。縦軸のＣｔ値はＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表している。ＰＣＲ増幅産物の量が多いほどＣｔ値は小さくなり、増幅されない場合は検出されない。比較例１のＴＭ−ＡＣ添加濃度０．１％のＣｔ値は対照例１（ＴＭ−ＡＣ添加０％）とほぼ同じであったことから、ＰＣＲが阻害されていないことがわかる。しかし、比較例２のＴＭ−ＡＣ添加０．５％では増幅速度が大幅に遅れＣｔ値は２５．２となった。この結果より、ＰＣＲチューブ（反応液２０μｌ）にＴＭ−ＡＣを０．１μｌ添加した場合（ＴＭ−ＡＣ終濃度０．５％）、ＰＣＲが阻害されることがわかる。

【0060】

ＴＭ−ＡＣとＴｗｅｅｎ２０（終濃度５％）をＰＣＲチューブに同時に添加した結果を図１（黒四角：Ｔｗｅｅｎ２０添加あり）に示す。対照例２のＴＭ−ＡＣ添加０％からわかるように、５％Ｔｗｅｅｎ２０によるＰＣＲ阻害はみられなかった。実施例２の０．５％ＴＭ−ＡＣと５％Ｔｗｅｅｎ２０を同時添加した時のＣｔ値は２１．０であることから、Ｔｗｅｅｎ２０がＰＣＲ阻害を軽減したことがわかる。この結果より、Ｔｗｅｅｎ２０を添加することによって、ＴＭ−ＡＣ ０．１μｌをＰＣＲチューブに直接投入（ＴＭ−ＡＣ終濃度０．５％）し、阻害なくＰＣＲを行うことができることがわかった。

【0061】

本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。

【符号の説明】

【0062】

１ 刺激応答性磁性ナノ粒子
２ 磁性物質
３ 刺激応答性ポリマー
４ ストレプトアビジン
５ ビオチン
６ 親和性物質
７ 検出対象

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]