特開 2016-214265 スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びこれらの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-214265(P2016-214265A)

(43)【公開日】2016年12月22日

(54)【発明の名称】スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びこれらの用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161125BHJP

   C07K 14/415 20060101ALI20161125BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20161125BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20161125BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20161125BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20161125BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20161125BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20161125BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/415

   C12N5/10

   A01H1/00 A

   C12P21/02 C

   A61K37/02

   A61K39/00 H

   A61P37/08

【審査請求】有

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2016-176943(P2016-176943)

(22)【出願日】2016年9月9日

(62)【分割の表示】特願2011-538487(P2011-538487)の分割

【原出願日】2010年10月28日

(31)【優先権主張番号】特願2009-249919(P2009-249919)

(32)【優先日】2009年10月30日

(33)【優先権主張国】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000183484

【氏名又は名称】日本製紙株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】110002147

【氏名又は名称】特許業務法人酒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】高岩 文雄

(72)【発明者】

【氏名】高木 英典

(72)【発明者】

【氏名】若佐 雄也

(72)【発明者】

【氏名】藤井 裕二

(72)【発明者】

【氏名】新屋 智崇

(72)【発明者】

【氏名】笠原 さおり

【テーマコード（参考）】

2B030

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB04

2B030AD08

2B030CA17

2B030CB02

2B030CD07

2B030CD09

4B064AG31

4B064CA11

4B064CA19

4B064CC03

4B064CC06

4B064CC24

4B064CD02

4B064CD07

4B064CD09

4B064CD13

4B064DA01

4B065AA88X

4B065AA88Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA03

4B065BB03

4B065BB08

4B065BB12

4B065BB16

4B065BB20

4B065BB29

4B065BC03

4B065BC09

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA06

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA02

4C084BA21

4C084BA22

4C084CA13

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZB072

4C084ZB132

4C085AA03

4C085BB11

4C085CC01

4C085CC07

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG08

4H045AA11

4H045BA10

4H045CA30

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】本発明は、ほぼすべての患者に優れたスギ花粉治療効果を奏し、また食品としての摂取が可能なタンパク質の提供を目的とする。
【解決手段】すなわち、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、或いは前記配列中に変異を有するアミノ酸配列を含む、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含むベクター；前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含む形質転換体；前記タンパク質、前記ポリヌクレオチド、前記形質転換体の用途、を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質

【請求項2】

以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項3】

以下の（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｅ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質

【請求項4】

以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項5】

以下の（ｐ）〜（ｒ）からなる群より選ばれる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
（ｐ）配列番号５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｑ）配列番号６〜８のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｒ）配列番号５に記載の塩基配列、及び配列番号６〜８のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド

【請求項6】

請求項２及び／又は請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項7】

請求項２及び／又は請求項４に記載のポリヌクレオチド、もしくは請求項６に記載のベクターが導入された形質転換体。

【請求項8】

前記形質転換体が、植物である請求項７に記載の形質転換体。

【請求項9】

前記形質転換体が、イネ科植物である請求項７に記載の形質転換体。

【請求項10】

請求項７に記載の形質転換体において前記ポリヌクレオチドを発現させて、産生されたタンパク質を採取することを含む、請求項１又は請求項３に記載のタンパク質の生産方法。

【請求項11】

請求項２及び／又は請求項４に記載のポリヌクレオチドを植物に導入することにより、植物にスギ花粉の免疫原性を付与する方法。

【請求項12】

請求項２及び／又は請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを作製すること、前記ベクターを植物器官、植物組織又は植物細胞に導入し形質転換体を得ること、並びに前記形質転換体から植物体を生育させること、を含むスギ花粉の免疫原性を有する植物体の作出方法。

【請求項13】

請求項１又は３に記載のタンパク質及び請求項７に記載の形質転換体から選ばれる１又は２以上を有効成分として含むスギ花粉症の治療又は予防剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、スギ花粉の免疫原性を有する新規なタンパク質及び当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。

【背景技術】

【0002】

花粉症とは、体内に入った花粉により起こるアレルギー症状を言い、その患者は増加の一途をたどっている。原因である花粉の代表的なものがスギ花粉である。スギ花粉のアレルゲンとして、２種類のタンパク質、すなわちＣｒｙｊ１（特許文献１及び非特許文献１参照）及びＣｒｙｊ２（特許文献２、非特許文献２、及び非特許文献３）が存在することが知られている。スギ花粉症患者のほとんどは、Ｃｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２、或いはこれらのいずれかに対しアレルギー反応を起こすことが分かっている。

【0003】

花粉症の治療法の一つとして、アレルゲンのうちＴ細胞エピトープからなるペプチドを患者に投与するペプチド免疫療法がある。ペプチド免疫療法は、アレルゲン自体を患者に投与する減感作療法と比較して、アナフィラキシーのような危険な副作用が起こらない、短期間で症状緩和効果が得られるといったメリットがある。

【0004】

特許文献３及び４には、スギ花粉アレルゲン由来の異なる複数のヒトＴ細胞エピトープを含むペプチドが、前記免疫療法に用いられ得ることが記載されている。特許文献４には、前記ペプチドが、スギ花粉症患者のうち５７％程度のヒトについて効果を奏することが示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第９３／０１２１３号公報

【特許文献2】特表平８−５０５２８４号公報

【特許文献3】特開平１０−３５９１９８号公報

【特許文献4】特開２０００−３２７６９９号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７１，７７−８６，１９８３

【非特許文献2】Ｔａｎｉａｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２３９，３２９−３３２，１９８８

【非特許文献3】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，４５，３０９−３１２，１９９０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかし、特許文献３及び特許文献４に記載のペプチドは、すべてのスギ花粉症患者に対し効果を奏するものではない点で花粉症治療効果が充分とはいえなかった。

【0008】

本発明は、ほぼすべての患者に優れたスギ花粉治療効果を奏し、また食品としての摂取が可能なタンパク質の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２のアミノ酸配列に着目し、それぞれの改変を試みた。その結果、それぞれに特定の改変を加えて得られるアミノ酸配列を含むタンパク質は、スギ花粉の免疫原性を維持しながらも、スギ花粉抗原とは相異なる立体構造を有するのでＩｇＥとの結合性が低減され、安全性が高いことを見出した。さらに、前記タンパク質をコードする遺伝的情報の解析も行い、前記タンパク質及び前記タンパク質を含む植物体の大量生産も実現可能であることを見出した。本発明は係る知見に基づくものである。

【0010】

〔１〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
〔２〕以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔３〕 以下の（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｅ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
〔４〕 以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔５〕 以下の（ｐ）〜（ｒ）からなる群より選ばれる、上記〔４〕に記載のポリヌクレオチド。
（ｐ）配列番号５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｑ）配列番号６〜８のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｒ）配列番号５に記載の塩基配列、及び配列番号６〜８のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
〔６〕 上記〔２〕、〔４〕及び〔５〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔７〕 上記〔２〕、〔４〕及び〔５〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、もしくは〔６〕に記載のベクターが導入された形質転換体。
〔８〕 前記形質転換体が、植物である上記〔７〕に記載の形質転換体。
〔９〕 前記形質転換体が、イネ科植物である上記〔７〕に記載の形質転換体。
〔１０〕 上記〔７〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の形質転換体において前記ポリヌクレオチドを発現させて、産生されたタンパク質を採取することを含む、上記〔１〕又は〔３〕に記載のタンパク質の生産方法。
〔１１〕 上記〔２〕、〔４〕及び〔５〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを植物に導入することにより、植物にスギ花粉の免疫原性を付与する方法。
〔１２〕 上記〔２〕、〔４〕及び〔５〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを作製すること、前記ベクターを植物器官、植物組織又は植物細胞に導入し形質転換体を得ること、並びに前記形質転換体から植物体を生育させること、を含むスギ花粉の免疫原性を有する植物体の作出方法。
〔１３〕 上記〔１〕又は〔３〕に記載のタンパク質及び上記〔７〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の形質転換体から選ばれる１又は２以上を有効成分として含むスギ花粉症の治療又は予防剤。
〔１４〕 上記〔１〕又は〔３〕に記載のタンパク質及び上記〔７〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の形質転換体から選ばれる１又は２以上をヒトに投与する、スギ花粉症の治療又は予防方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明により提供されるスギ花粉の免疫原性を有するタンパク質は、スギ花粉症患者のほぼすべてにおいて、スギ花粉の免疫原性を発揮するにもかかわらず花粉特異的ＩｇＥ抗体との結合性が低く、生体においてアナフィラキシー反応を引き起こすことがない可能性が低い。Ｃｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２に対し、スギ花粉症患者のほぼ全員が免疫原性を示すことから、本発明のタンパク質は、スギ花粉症患者を網羅するスギ花粉症治療又は予防剤として有用であるといえる。よって、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質は、それ自体、或いは、これを含む植物体などとして、スギ花粉症の治療に有用である。

【0012】

また、本発明によりスギ花粉の免疫原性を有するタンパク質の遺伝的情報が提供されるので、これを元にスギ花粉の免疫原性を有するタンパク質の大量生産、該タンパク質を含む形質転換体の大量生産、該形質転換体の子孫（イネなど）の大量生産も可能である。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、Ｔ細胞の増殖活性を示す図である。

【図2】図２は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩＬ−４の産生量を示す図である。

【図3】図３は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩＬ−５の産生量を示す図である。

【図4】図４は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩＬ−６の産生量を示す図である。

【図5】図５は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩＬ−１０の産生量を示す図である。

【図6】図６は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩＬ−１３の産生量を示す図である。

【図7】図７は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩＦＮ−γの産生量を示す図である。

【図8】図８は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩｇＥ抗体の産生量を示す図である。

【図9】図９は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ＩｇＧ抗体の産生量を示す図である。

【図10】図１０は、Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子を経口投与した実験群の、ヒスタミンの産生量を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明のタンパク質は、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質である。スギ花粉の免疫原性とは、スギ花粉抗原特異的Ｔ細胞により抗原として認識されることを意味し、スギ花粉アレルゲンが備える性質である。スギ花粉アレルゲンには、Ｃｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２がある。本発明のタンパク質はこのようなスギ花粉の免疫原性を有するものであり、その活性はＣｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２のいずれか、或いは両方が奏する免疫原性と同等であることが好ましい。

【0015】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質としては、例えば、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げ得る。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２のアミノ酸配列のシャッフリングにより設計されたものである。すなわち、Ｃｒｙｊ２のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて、９３−３８８番目の部分、５９−９２番目の部分及び１−５８番目の部分をこの順に連結したものである。（Ａ）タンパク質は、スギ花粉の免疫原性を有し、好ましくはＣｒｙｊ２と同等の免疫原性を有する。

【0016】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質としてはまた、例えば、（Ｄ）配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列から選ばれる１又は２以上を含むタンパク質も挙げ得る。配列番号２〜４のそれぞれに示されるアミノ酸配列は、Ｃｒｙｊ１を３断片化して設計されたものである。すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列の、Ｎ末端側から数えて１−１４４番目の部分に相当する。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて１２６−２５７番目の部分に相当する。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて２３１−３５３番目の部分に相当する。（Ｄ）タンパク質は、スギ花粉の免疫原性を有し、好ましくはＣｒｙｊ１と同等の免疫原性を有する。

【0017】

（Ｄ）タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号３に示されるアミノ酸配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかを有していればよいが、これらの２つ以上を組み合わせて有していてもよく、全てを有することが好ましい。２つ以上のアミノ酸配列を有する場合の連結の順番は特に限定されないが、３つ全てを有する場合には、配列番号３に示されるアミノ酸配列、配列番号２に示されるアミノ酸配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の順序で連結していることが好ましい。

【0018】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質としてはさらに、例えば、（Ｇ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、及び配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質も挙げ得る。（Ｇ）タンパク質は、スギ花粉の免疫原性を有し、好ましくはＣｒｙｊ１及びＣｒｙｊ２と同等の免疫原性を有する。（Ｇ）タンパク質においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列のほかに、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号３に示されるアミノ酸配列、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列から選ばれる１又は２以上のアミノ酸配列を含んでいればよく、好ましくは配列番号２〜４に示されるすべてのアミノ酸配列を含むものである。

【0019】

（Ｇ）タンパク質において、配列番号１に示されるアミノ酸配列、及び配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列、のそれぞれの連結の順序に制限はないが、Ｎ末端側から、配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列、の順に連結していることが好ましい。また、（Ｇ）タンパク質において、配列番号２〜４に示されるすべてのアミノ酸配列を含む場合、これらの配列の連結の順序も特に制限されないが、配列番号３に示されるアミノ酸配列、配列番号２に示されるアミノ酸配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の順番に連結していることが好ましい。

【0020】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質の起源、及び、該タンパク質を得る方法は、いずれも特に限定されるものではない。すなわち、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質としては、例えば、天然のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えポリヌクレオチド等から発現させたタンパク質、及び化学合成により得られるタンパク質が挙げられる。そして、例えば、（Ａ）タンパク質は、スギ花粉アレルゲンタンパク質Ｃｒｙｊ２をシャッフリングすることにより得ることができる。また例えば（Ｄ）タンパク質は、それぞれスギ花粉アレルゲンタンパク質Ｃｒｙｊ１を３断片化（Ｆ１（ｆｒａｇｍｅｎｔ １：１ａａ−１４４ａａ)、Ｆ２（１２６ａａ−２５７ａａ）、Ｆ３（２３１ａａ−３５３ａａ））することにより得ることができる。さらに例えば（Ｉ）タンパク質は、スギ花粉アレルゲンタンパク質Ｃｒｙｊ２をシャッフリングすることにより得るタンパク質と、スギ花粉アレルゲンタンパク質Ｃｒｙｊ１を３断片化して得られるタンパク質とを連結して得ることができる。

【0021】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質は、スギ花粉の免疫原性を有する限り、上記（Ａ）タンパク質、（Ｄ）タンパク質及び（Ｇ）タンパク質のように、配列番号１に記載のアミノ酸配列そのもの及び配列番号２〜配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列そのものを有するもののみならず、これと相同のタンパク質、すなわちそれぞれのアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。

【0022】

（Ａ）タンパク質のアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を含むタンパク質としては、下記の（Ｂ）及び（Ｃ）のタンパク質が例示される。
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質

【0023】

（Ｄ）タンパク質に改変を加えたアミノ酸配列を含むタンパク質としては、例えば、（Ｅ）及び（Ｆ）のタンパク質が挙げられる。
（Ｅ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質

【0024】

（Ｅ）タンパク質においては、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号３に示されるアミノ酸配列、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか、或いは２種類以上が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含んでいればよく、それ以外に置換等の対象でない配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有していてもよい。（Ｆ）タンパク質においても、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号３に示されるアミノ酸配列、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか、或いは２種類以上が９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいればよく、それ以外に置換等の対象でない配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有していてもよい。

【0025】

（Ｇ）タンパク質のアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を含むタンパク質としては、（Ｈ）〜（Ｏ）のタンパク質が例示される。
（Ｈ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｊ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｋ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｌ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｍ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｎ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｏ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質

【0026】

上記タンパク質のそれぞれにおいては、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸残基の個数は、上述の通り１個もしくは数個である。通常、１〜１５個であり、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜７個であり、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。一般に、アミノ酸配列に１個もしくは数個の変異を導入して、元のアミノ酸と同様の性質を有するタンパク質を作製する手法は、当業者に周知である。通常、タンパク質において、アミノ酸を同様の性質を有するアミノ酸への置換（塩基性アミノ酸同士の置換、酸性アミノ酸同士の置換、極性アミノ酸同士の置換、疎水性アミノ酸同士の置換、芳香族アミノ酸同士の置換など）を行った場合、置換前後のタンパク質を比較すると同様の性質を有することが多い。

【0027】

上記タンパク質のそれぞれにおいては、上述の通り、同一性が９０％以上である。好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、中でも好ましくは９９％以上である。アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のアルゴリズムを使用して、適宜検索条件を設定することにより決定され得る。

【0028】

本発明のポリヌクレオチドは、スギ花粉アレルゲンタンパク質免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。

【0029】

ポリヌクレオチドとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡが挙げられる。このうちＤＮＡが好ましい。また、ポリヌクレオチドの起源、製法は特に限定されず、天然由来であってもよいし、組換えポリヌクレオチド、化学合成により得られるポリヌクレオチドであってもよい。

【0030】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが例示される。具体的には、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が例示される。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【0031】

また、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが例示される。具体的には、下記の（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）が例示される。
（ｄ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【0032】

さらに、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、下記の（ｇ）〜（ｒ）も例示される。
（ｇ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、及び配列番号２〜４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号２〜４から選ばれるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列とを含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｏ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【0033】

一方、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、塩基配列の面からは下記の（ｐ）〜（ｒ）が例示される。
（ｐ）配列番号５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｑ）配列番号６〜８のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｒ）配列番号５に記載の塩基配列、及び配列番号６〜８のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド

【0034】

配列番号５に記載の塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列である。また、配列番号６〜８に記載の塩基配列は、それぞれ配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列である。

【0035】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５に記載の塩基配列自体及び配列番号６〜８に記載の塩基配列自体を含まなくても、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質を発現するポリヌクレオチドの全てを含む。スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の（ｓ）〜（ｚ）が挙げられる。

【0036】

（ｓ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｔ）配列番号５に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｕ）配列番号５に示される塩基配列において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｖ）配列番号６〜８のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｗ）配列番号６〜８のいずれかに示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｘ）配列番号６〜８のいずれかに示される塩基配列において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｙ）配列番号５に示される塩基配列において上記（ｓ）、（ｔ）及び（ｕ）のいずれかの変異を含む塩基配列と、配列番号６〜８のいずれかに示される塩基配列とを有するポリヌクレオチド
（ｚ）配列番号５に示される塩基配列と、配列番号６〜８のいずれかに示される塩基配列において上記（ｖ）、（ｗ）及び（ｘ）のいずれかの変異を含む塩基配列とを有するポリヌクレオチド

【0037】

上記ポリヌクレオチドにおいて、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、（例１）４２℃、５×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件、（例２）５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で洗浄する条件、（例３）６５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件が例示され、このうち、（例２）又は（例３）であることが好ましく、（例３）がより好ましい。

【0038】

上記ポリヌクレオチドにおいては、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基の個数は、１個もしくは数個である。通常、１〜１５個であり、例えば、１〜１０個、１〜７個であり、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。また、上記ポリヌクレオチドにおいては、同一性が９０％以上であり、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、中でも好ましくは９９％以上である。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のアルゴリズムを使用して、適宜検索条件を設定することにより決定され得る。

【0039】

ポリヌクレオチドを取得する方法は特には限定されないが、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質のアミノ酸配列の一部や、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部をもとに、公知の技術を利用して、生物などから単離することができる。公知の技術としては、クローニング、遺伝子組換え、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、部位特異的突然変異、変異剤処理、制限酵素処理等が例示される。また、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列を人工的に作製してもよい。さらに、後述の形質転換体を利用してポリヌクレオチドを産生してもよい。

【0040】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質は、種々の生物において発現され得る。タンパク質を生物において発現させる方法は特に限定されないが、ポリペプチドの発現を制御する因子を利用することができる。ポリペプチドの発現を制御する因子としては、プロモーター、ターミネーター、シグナル配列が例示される。

【0041】

プロモーターとしては、宿主において発現可能なプロモーターであればよい。このうち、植物（例えばイネ科植物）で発現可能なプロモーターが好ましく、中でも種子の貯蔵組織で発現可能なプロモーター（種子特異的プロモーター）がより好ましく、コメ（イネ種子）で発現するプロモーターがさらに好ましく、コメ（イネ種子）で特異的に発現するプロモーターがさらにより好ましい。種子特異的プロモーターとしては、グルテリン、プロラミン、グロブリンなど種子貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターが例示される。グルテリンのプロモーターとしては、ＧｌｕＢ１プロモーター（例えば、配列番号１１に記載の塩基配列を有する）、ＧｌｕＢ４プロモーター（例えば、配列番号１２に記載の塩基配列を有する）が例示される。プロラミンのプロモーターとしては、１６ｋＤａプロラミンプロモーター（例えば、配列番号１３に記載の塩基配列を有する）、１０ｋＤａプロラミンプロモーター（例えば、配列番号１４に記載の塩基配列を有する）が例示される。もっとも、本発明において用い得るプロモーターは、上記種子特異的プロモーターに限定されるものではなく、これ以外のプロモーター、例えば植物ウイルス由来のプロモーター等であってもよい。

【0042】

ターミネーターとしては、宿主において発現可能なターミネーターであればよい。このうち、植物（例えばイネ科植物など）で発現可能なターミネーターが好ましく、中でも種子の貯蔵組織で発現可能なターミネーターがより好ましく、コメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））種子）で発現するターミネーターがさらに好ましく、コメ（イネ種子）で特異的に発現するターミネーターがさらにより好ましい。ターミネーターとしては、例えば、ポリペプチドをイネで発現させる場合、植物貯蔵タンパク質であるグルテリンの０．６ｋｂ ＧｌｕＢ１ターミネーター（例えば、配列番号１８に記載の塩基配列を有する）、ＧｌｕＢ４ターミネーター（例えば、配列番号１９に記載の塩基配列を有する）、１０ｋＤａ プロラミンターミネーター（例えば、配列番号２１に記載の塩基配列を有する）、１６ｋＤａ プロラミンターミネーター（例えば、配列番号２０に記載の塩基配列を有する）、グロブリンターミネーター等が使用できる。その他にも、ノパリン合成酵素のターミネーター、オクトピン合成酵素のターミネーターをはじめ、ＤＮＡデーターベースに登録されている植物遺伝子のターミネーターを種々選択して使用することができる。

【0043】

シグナル配列をコードするポリヌクレオチドとしては、宿主の細胞内で発現するものであれば特に限定されないし、発現させたいポリヌクレオチドの５´末端及び３´末端のどちらに付加するものであってもよい。中でも、植物（例えばイネ科植物）で発現可能なシグナル配列、中でも種子の貯蔵組織で発現可能なシグナル配列が好ましく、コメ（イネ種子）で発現するシグナル配列がより好ましく、コメ（イネ種子）で特異的に発現するシグナル配列がさらにより好ましい。このようなシグナル配列としては、特開２００４−３２１０７９号公報に例示されたものを用い得る。このうち、貯蔵タンパク質シグナルや、小胞体係留シグナル（例えば、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）が好ましい。貯蔵タンパク質シグナル配列は、本発明のタンパク質を小胞体へ以降させる働きを有する。また、小胞体係留シグナル配列によれば、種子の貯蔵部位において、本発明のタンパク質の集積量を向上させる機能を有する。

【0044】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質を発現させる方法は特には限定されないが、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いる方法が好ましい。ベクターは、発現させたい植物の種類を適宜考慮して公知の種々のベクターから選択でき、本遺伝子構成を安定に保持するものであれば特に制限されない。ベクターへの目的のポリヌクレオチドの挿入は、常法に従って行うことができ、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。ベクターは目的のポリヌクレオチドの他に、必要に応じて、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点等の発現調節因子；選抜マーカー遺伝子を含み得る。プロモーター及びターミネーターの挿入部位は通常それぞれ、ポリヌクレオチドの５´末端側、３´末端側である。

【0045】

選抜マーカー遺伝子としては、例えば抗生物質ハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン又はゲンタマイシンへの耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、除草剤であるホスフィノスリシンへの耐性を付与するアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、除草剤であるピリミノバックへの耐性を付与する変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ）等が挙げられる。選抜マーカー遺伝子が導入されたベクターを用いることにより、目的のポリヌクレオチドが導入されたサンプルの選抜が容易となる。

【0046】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入するにあたっては、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと共に挿入してもよい。これにより、ベクターを形質転換させる際に、目的のタンパク質を含む融合タンパク質として発現させることができ、他のタンパク質の選択いかんにより、発現部位、発現量等を調節することができる。他のタンパク質としては、形質転換の宿主がイネの場合には、イネの種子で安定的に高発現するタンパク質が好ましく、グルテリンがより好ましい。ポリヌクレオチドを他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと共に挿入する方法は特に限定されず、他のタンパク質の可変領域に、任意のＤＮＡ配列を挿入できるようなサイト（例えば他のタンパク質がグルテリンの場合はＣｆｒ９Ｉサイトなど）を付加しておき、このサイトを利用して挿入する方法が例示される。

【0047】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質を発現させる方法としては、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を利用することが好ましい。これにより、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質を発現する遺伝子組換え体（例えば遺伝子組換え植物体、好ましくは遺伝子組換えイネ）を効率よく得ることができる。また、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質を効率よく複製し大量生産につなげることができる。さらに、ベクターの保存も容易となる。

【0048】

形質転換体の作製方法は特に限定されず、前記ベクターを、必要に応じて発現調節因子と共に、宿主細胞に導入して形質転換させる方法が例示される。ベクターの宿主組織又は細胞への導入方法は、特に限定されない。例えば、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへベクターを導入する方法、電気パルスによりプロトプラストへベクターを導入する方法、パーティクルガン法により細胞へベクターを直接導入する方法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、及びアグロバクテリウムを介してベクターを導入する方法など、いくつかの技術が既に確立し、当技術分野において広く用いられており、本発明においてもこれらのいずれかを利用し得る。

【0049】

ベクターを導入する宿主は、特に限定されず、必要に応じて適宜選択できる。

【0050】

一つの例として、スギ花粉の免疫原性を有する植物体の作出を目的として形質転換体を作製する場合の宿主としては、植物体に再生可能なあらゆる植物が含まれる。植物としては、例えば、葉、根、茎、花、種子中の胚盤等の植物器官；該植物器官のそれぞれを構成する植物細胞；維管束等の植物組織；カルス、懸濁培養細胞等の植物培養細胞；が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、植物体の植物種も特に限定されないが、食用の植物がより好ましく、イネ科植物の細胞がさらに好ましい。イネ科植物としてはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）が例示される。

【0051】

他の例として、ベクターの保存、複製等を目的として形質転換体を作製する場合には、宿主は、必ずしも植物である必要はなく、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞等であってもよい。

【0052】

選抜マーカー遺伝子が導入されたベクターを用いて形質転換を行う際には、該ベクターを導入した宿主細胞は、該ベクターと共に導入されたマーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養することにより、形質転換体の選抜が容易となり得る。また、選抜マーカー遺伝子が導入されていなくても、ポリヌクレオチドが導入されたベクターとは別に、選抜マーカー遺伝子が導入されたプラスミドベクターを用意し、これらを宿主細胞に導入することにより、同様の選抜が可能となりうる。

【0053】

免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを作製し、該ベクターを、宿主細胞としての植物器官、植物組織又は植物細胞に導入し形質転換体を得て、この形質転換体から植物体を生育（再分化）させることにより、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質を発現可能な植物体が作製され得る。植物体の生育（再分化）は、植物細胞の種類に応じて公知の方法で行うことが可能である。

【0054】

形質転換体から１代目の植物体が得られれば、該植物体を生育し、さらに有性生殖又は無性生殖させて、本発明のタンパク質を発現可能な、子孫としての、植物体を順次得ることが可能である。また、該形質転換体、その子孫、及びこれらのクローンのいずれかから、繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に、さらにスギ花粉の免疫原性を有するタンパク質を発現可能な植物体を作出し、量産することも可能である。

【0055】

スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質、これをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体、及びスギ花粉の免疫原性を有するタンパク質が導入された植物体は、いずれも、ヒトを含む哺乳類のスギ花粉症患者或いはいわゆる花粉症予備軍を対象とするスギ花粉症の治療又は予防剤の有効成分として有用である。スギ花粉症の治療又は予防剤の、１日当りの用量、服用方法、及び剤形は、特に限定されず、対象者の健康状態、性別、体格等の諸条件に基づき、適宜定めることができる。本発明のスギ花粉症の治療又は予防剤は、医薬品、医薬部外品、食品、動物（実験動物、ペット等）用飼料としての利用が可能である。また、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質、これをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体、及びスギ花粉の免疫原性を有するタンパク質が導入された植物体は、ヒトを含む哺乳類の花粉症患者に対するいわゆるペプチド免疫療法において好適に用いられ得る。すなわち、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質、これをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体、及びスギ花粉の免疫原性を有するタンパク質が導入された植物体を、ヒトを含む哺乳類に投与することにより、花粉症の治療又は予防が可能である。

【実施例】

【0056】

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において分子生物学的手法の詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，１９８９）又は試薬製造業者の取り扱い説明書に従って行った。また、マウスやマウス由来の試料を対象とする免疫学的研究方法の詳細な実験操作は、特に記述する場合を除き、細胞工学別冊 マウス解剖イラストレイテッド（秀潤社）、生物化学実験法 ５０ 腸管細胞機能実験法（学会出版センター）、あるいは、試薬製造業者の取り扱い説明書に従って行った。

【0057】

［実施例１］
Ｉ．プラスミドｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２の作製
目的とするバイナリーベクターを作製するため、カルス特異的プロモーター（ＣＳＰ、クミアイ化学株式会社）に変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ、クミアイ化学株式会社）を連結し、下流には１０ｋＤａプロラミンターミネーターを連結した選抜マーカー遺伝子カセット、及びａｔｔＲ４−ａｔｔＲ３をトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）領域に含む、ｐＰＺＰ２００由来のデスティネーション・バイナリーベクター（ｐＣＳＰｍＡＬＳ ４３ＧＷ）を作製した。

【0058】

ｐＣＳＰｍＡＬＳ ４３ＧＷに遺伝子カセットを挿入するため、専用のエントリークローンを作製した。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋プラスミド（配列番号１０）のマルチクローニングサイトの両端に位置するＢｓｓＨＩＩに、以下の（１）〜（３）の３種の組み合わせのａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ及びオリジナルマルチクローニングサイト（配列番号９）からなるＤＮＡ断片を順次挿入し、それぞれｐＫＳ４−１ ＭＣＳ ＩＩ、ｐＫＳ２２１ ＭＣＳ ＩＩ、ｐＫＳ２−３ ＭＣＳ ＩＩと命名した。

【0059】

ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ（１）ａｔｔＬ４−ＡｓｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ−ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ−ａｔｔＲ１

【0060】

ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ（２）ａｔｔＬ１−ＡｓｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ−ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ−ａｔｔＬ２

【0061】

ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ（３）ａｔｔＲ２−ＡｓｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ−ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ−ａｔｔＬ３）

【0062】

なお、上記ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＬ３、ａｔｔＬ４、ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の製品を用いた。

【0063】

３種類の胚乳特異的プロモーター（１０ｋＤａ プロラミンプロモーター（配列番号１４）、ＧｌｕＢ４プロモーター（配列番号１２）、１６ｋＤａプロラミンプロモーター（配列番号１３））、予め可変領域に任意のＤＮＡ配列を挿入できるよう内部にＣｆｒ９Ｉサイトを付加した種子貯蔵タンパク質グルテリン（ＧｌｕＡ２（配列番号１５）、ＧｌｕＢ１（配列番号１６）、ＧｌｕＣ（配列番号１７））のコード領域、及びターミネーター（１０ｋＤａ プロラミンターミネーター（配列番号２１）、ＧｌｕＢ４ターミネーター（配列番号１９）、１６ｋＤａ プロラミンターミネーター（配列番号２０））をそれぞれ組み合わせて構成される遺伝子カセットを、ｐＫＳ４−１ ＭＣＳ ＩＩ、ｐＫＳ２２１ ＭＣＳ ＩＩ、ｐＫＳ２−３ ＭＣＳ ＩＩに挿入した。すなわち、１０ｋＤａプロラミンプロモーター：ＧｌｕＢ１コード領域：１０ｋＤａ プロラミンターミネーターからなる遺伝子カセットが挿入されたプラスミドであるｐＫＳ４−１を得た。また、ＧｌｕＢ４プロモーター：ＧｌｕＡ２コード領域：ＧｌｕＢ４ターミネーターからなる遺伝子カセットが挿入されたプラスミドであるｐＫＳ２２１を得た。さらに、１６ｋＤａプロラミンプロモーター：ＧｌｕＣコード領域：１６ｋＤａプロラミンターミネーターからなる遺伝子カセットが挿入されたプラスミドであるｐＫＳ２−３を得た。

【0064】

ｐＫＳ２２１のＧｌｕＡ２コード領域中のＣｆｒ９Ｉサイトに、配列番号６に示される塩基配列（配列番号２に示されるアミノ酸配列に対応）からなるポリヌクレオチドを挿入した。その結果ｐＫＳ２２１に含まれることになった、ＧｌｕＢ４プロモーター：ＧｌｕＡ２コード領域（配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む）：ＧｌｕＢ４ターミネーターからなる遺伝子カセットを、Ｃｒｙｊ１ Ｆ１発現型遺伝子カセットと名づけた。
ｐＫＳ４−１のＧｌｕＢ１コード領域中のＣｆｒ９Ｉサイトに、配列番号７に示される塩基配列（配列番号３に示されるアミノ酸配列に対応）からなるポリヌクレオチドを挿入した。その結果、ｐＫＳ４−１に含まれることになった、１０ｋＤａプロラミンプロモーター：ＧｌｕＢ１コード領域（配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む）：１０ｋＤａ プロラミンターミネーターからなる遺伝子カセットを、Ｃｒｙｊ１ Ｆ２発現型遺伝子カセットと名づけた。
ｐＫＳ２−３のＧｌｕＣコード領域中のＣｆｒ９Ｉサイトに、配列番号８に示される塩基配列（配列番号４に示されるアミノ酸配列に対応）からなるポリヌクレオチドを挿入した。その結果、ｐＫＳ２−３に含まれることになった、１６ｋＤａプロラミンプロモーター：ＧｌｕＣコード領域：１６ｋＤａプロラミンターミネーターからなる遺伝子カセットを、Ｃｒｙｊ１ Ｆ３発現型遺伝子カセットと名づけた。Ｃｒｙｊ１ Ｆ１発現型遺伝子カセット、Ｃｒｙｊ１ Ｆ２発現型遺伝子カセット及びＣｒｙｊ１ Ｆ３発現型遺伝子カセットをまとめて、Ｃｒｙｊ１全長発現型遺伝子カセット群と名づけた。

【0065】

一方、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）のＣ末端に、小胞体係留シグナルＬｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕをコードするポリヌクレオチドを付加し、ポリヌクレオチドを得た。そのポリヌクレオチドの５’側にＧｌｕＢ１プロモーター（配列番号１１）、３’側にＫＤＥＬ配列とＧｌｕＢ１ターミネーター（配列番号１８）を連結し、得られる遺伝子カセットをＣｒｙｊ２全長発現遺伝子カセットと名づけた。その後、Ｃｒｙｊ２全長発現型遺伝子カセットを、Ｃｒｙｊ１ Ｆ３発現型遺伝子カセットを有するｐＫＳ２−３のＭｌｕＩサイトに挿入した。

【0066】

Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標） ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）の取扱説明書に従い、ＬＲ反応を行った。まず、Ｃｒｙｊ１ Ｆ２発現型遺伝子カセットを含むｐＫＳ４−１、Ｃｒｙｊ１Ｆ１発現型遺伝子カセットを含むｐＫＳ２２１、Ｃｒｙｊ１ Ｆ３発現型遺伝子カセットとＣｒｙｊ２全長発現型遺伝子カセットを含むｐＫＳ２−３の、３種類のエントリークローンの濃度を１０ｎｇ／μＬに合わせた。これらについて、インビトロジェン社のＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ ｐｌｕｓ ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ＩＩを用い、ＬＲ反応を２５℃で１６時間おこなった。反応液組成はエントリークローン各１０ｎｇ、デスティネーション・バイナリーベクター（配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号８７９４〜１０３２７の部分に代えて、ＣＳＰ：ｍＡＬＳ：１０ｋＤａＴｅｒ遺伝子カセット（クミアイ化学株式会社）が挿入されているもの）１００ｎｇ、ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ ｐｌｕｓ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ ＩＩ ２μＬ、ＴＥバッファーでトータル液量を１０μＬとした。反応終了後、２μｇのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを加え、３７℃で１０分間静置した。

【0067】

ＬＲ反応完了後、得られた発現クローンを大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ、ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ）に形質転換した。得られた大腸菌コロニー群から目的のクローン、すなわち上記の４種類の遺伝子カセットが導入されたバイナリーベクターを選抜した。ＬＲ反応の効率は極めて高く、コロニーＰＣＲによる一次スクリーニングでは、ほとんどのコロニーがポジティブである可能性を示した。候補クローンはＡＢＩ ＤＮＡシーケンサー Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３１３０を用いて塩基配列の最終確認を行い、これをｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２とした。

【0068】

ＩＩ．アグロバクテリウムへのｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２の導入
アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａ．ツメファシエンス）ＥＨＡ１０５株を、１０ｍＬのＹＥＢ液体培地（ビーフエキス５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、シュークロース５ｇ／Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した。培養液を、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した後、菌体を２０ｍＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した。次いで集菌された菌体を２００μＬのＹＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。

【0069】

０．５ｍＬチューブ内で、プラスミド導入用菌液５０μＬと３μＬのプラスミドｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２を混合し、これにエレクトロポレーション法（ジーンパルサーＩＩシステム［ＢＩＯＲＡＤ社］）を用いてプラスミドを導入し、次いで２００μＬのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で１時間振とうして培養した。この菌体を、１００ｍｇ／Ｌ スペクチノマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種して２８℃で２日間培養し菌コロニーを得た。さらに、この菌コロニーをＹＥＢ液体培地に移植して更に培養した後、その菌コロニー中の菌からアルカリ法でプラスミドを抽出し、Ａ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５株にプラスミドｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２が導入されていることを確認した。該菌をアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２）と名づけた。

【0070】

ＩＩＩ．感染材料の調製
遺伝子導入の対象として、イネ品種「コシヒカリ系統ａ１２３」を用い、その完熟種子の殺菌を、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ４ モデル植物の実験プロトコール（ｐ９３−９８）の方法に従い行った。殺菌された完熟種子を、Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／Ｌ シュークロース、２．８ｇ／Ｌ プロリン、０．３ｇ／Ｌ カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ＝５．８）に置床し、サージカルテープでシールして２８℃明所で培養して発芽させ、発芽種子を得た。この発芽種子を、下記ＩＶにおいて、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２）による感染材料とした。

【0071】

ＩＶ．ＥＨＡ１０５（ｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２）によるイネの形質転換及び形質転換イネの作製
ＹＥＢ寒天培地（ビーフエキス５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、シュークロース５ｇ／Ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１５ｇ／Ｌ 寒天）で培養したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２）を、ＹＥＢ培地で２５℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した。その後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心して集菌し、アセトシリンゴン（１０ｍｇ／Ｌ）を含むＮ６液体培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類（Ｃｈｕ Ｃ．Ｃ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ Ｐｅｋｉｎｇ，ｐｐ．４３−５０）、３０ｇ／Ｌ シュークロース、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、ｐＨ＝５．８）に、ＯＤ₆₃₀＝０．１５となるように菌体を懸濁し、感染用アグロバクテリウム懸濁液とした。

【0072】

上記ＩＩＩで調製した発芽種子を５０ｍＬチューブに入れ、そこに感染用アグロバクテリウム懸濁液を注ぎ発芽種子を浸漬した。１．５分間の浸漬後、アグロバクテリウム懸濁液を捨て、発芽種子を滅菌したろ紙の上に置いて余分な水分を除去した。その後、共存培養培地Ｎ６Ｃｌ２培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／Ｌ シュークロース、２．８ｇ／Ｌ プロリン、０．３ｇ／Ｌ カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、４ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ＝５．２）に置床し、サージカルテープでシールして２８℃暗所で３日間培養した。続いて、共存培養を行った発芽種子を、Ｎ６Ｃｌ２ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／Ｌ シュークロース、２．８ｇ／Ｌ プロリン、０．３ｇ／Ｌ カザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、4４００ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、１μＭ ピリミノバック、４ｇ／Ｌ ゲルライト）で１週間培養した後、発芽した芽を胚盤組織から切り出した。

【0073】

次いで、この芽をＮ６Ｃｌ４ＴＣＨ２５培地（Ｎ６無機塩類及びビタミン類、３０ｇ／Ｌ シュークロース、２．８ｇ／Ｌ プロリン、０．３ｇ／Ｌ カザミノ酸、４ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、４００ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、１μＭ ピリミノバック、４ｇ／Ｌ ゲルライト）で１週間培養した。更に、ＭＳＲＣ培地（ＭＳ無機塩類及びビタミン類（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．，１９６２ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３）、３０ｇ／Ｌ シュークロース、３０ｇ／Ｌ ｓｏｒｂｉｔｏｌ、２ｇ／Ｌ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、１μｇ／ｍＬ ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２μｇ／ｍＬ ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４００ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、４ｇ／Ｌ ゲルライト）で培養した。

【0074】

このようにして、感染種子とアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ｐＣＳＰｍＡＬＳ Ｃｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２）との共存培養開始後１ヶ月から２ヶ月の間に、感染種子から芽又は幼植物体が再分化した。再分化した芽又は幼植物体は発根培地に移植して生育させ、背丈２０ｃｍ程度の幼苗を得た。この幼苗より、染色体ＤＮＡを抽出し、サザンハイブリダイゼーションにて、幼苗中のＣｒｙｊ１Ｃｒｙｊ２遺伝子の存在を確認した。

【0075】

Ｖ．組換えイネの大量生産
上記ＩＶで得られた、形質転換体であるイネ（Ｔｇイネ）の発芽種子をウレタンへ播種後、特定網室内の育苗室（人工太陽光室）で育苗し、苗を得た。すなわち、苗をベッド全域に４９本／パネル定植後、約１２，０００本／棟を植栽した。

【0076】

特定網室内の栽培棟の中には、水耕ベッド（Ｍ式水耕研究所製、Ｈ：７３ｃｍ×Ｗ：１２０ｃｍ×Ｄ：２，９００ｃｍ）が、１棟あたり５台設置されている。各水耕ベッドの養液配管は一つに繋がっており、水耕養液は循環ポンプにより水耕ベッド間を循環するため、各水耕ベッド内の養液組成は同じである。水耕ベッド内には、各種センサー（ｐＨ計、電気伝導率（ＥＣ）計、水温計）があり、そのデータは１０分間隔で環境制御パソコン（ＰＣ）に自動保存されている。また、養液コントローラーにより、施肥及びｐＨ調整剤の添加制御がなされている。前記センサー、環境制御パソコン及び溶液コントローラーにより、水耕ベッド内の各種条件（ｐＨ、ＥＣ及び水温）の自動制御が可能である。

【0077】

肥料については、水耕養液中の硝酸性窒素とアンモニア性窒素の濃度測定結果に基づいて以下の市販水耕専用肥料（Ｍ式水耕研究所製）を使用した（Ｍ１：硝酸性窒素７％、アンモニア性窒素３％、水溶性リン酸８％、水溶性カリ２３％、水溶性マグネシウム４％、水溶性マンガン０．１％、水溶性ホウ素０．１％；Ｍ２：硝酸性窒素１１％；Ｍ５：アンモニア性窒素６％、水溶性カリ９％、水溶性マンガン１％、水溶性ホウ素１％）。水耕養液の液温は、２９℃に設定した。

【0078】

日長は、補光ランプと１００％遮光カーテンにより調整した（長日環境:明１２時間、暗１２時間、短日環境：明１１時間、暗１３時間）。内温度は、環境制御システムによる天窓側窓の開閉により自動制御した。但し、開花期については、花粉飛散を防止する目的で、エアコンを稼動させた上で窓非開放とした。本栽培法で、播種してから収穫まで１５０日間イネを栽培した。

【0079】

その結果、Ｔｇイネの発芽種子から発芽させた個体に関しては、全ての個体でＣｒｙｊ１遺伝子及びＣｒｙｊ２遺伝子の存在が確認された。さらに、該個体から収穫されたイネ種子（米）を分析したところ、０．１ｇ／米ｇの総タンパク質量を含有していること、及び、３断片化したスギ花粉アレルギー抗原Ｃｒｙｊ１（配列番号２〜４のそれぞれに示されるアミノ酸配列）とシャフリングしたＣｒｙｊ２（配列番号１に示されるアミノ酸配列）を含むこと、を確認した。

【0080】

ＶＩ．マウスへのイネ種子経口摂取による免疫寛容の誘導
５週令のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、日本チャールス・リバー株式会社より購入し、上記ＶでＴｇイネの発芽種子から収穫されたイネ種子（以下、Ｔｇイネ種子（Ｔｇ−ｒｉｃｅ、Ｔｇ−ｓｅｅｄ）と称する。）の経口摂取を開始した。まず、形質転換処理をしていないイネ種子（以下、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子（Ｎｏｎ−Ｔｇ ｒｉｃｅ、Ｎｏｎ−Ｔｇ ｓｅｅｄ）と称する。）及びＴｇイネ種子のそれぞれ（いずれも完熟種子玄米）を、フリッチュ・ジャパン株式会社製Ｐ−１４ ロータースピードミルを用いて、回転数約１０，０００ｒｐｍで微粉末状に破砕し、それぞれのイネ種子粉末を得た。次に、マウスを２群に分け、それぞれのイネ種子粉末を給餌瓶に入れ、２０日間、各群のマウスに自由摂取させた。イネ種子粉末の経口投与期間終了後に、各群についてイネ種子粉末の総摂取量を算出したところ、マウス１匹当たり約６グラムであると推定された。

【0081】

ＶＩＩ．スギ花粉アレルゲンによるチャレンジ
上述したＮｏｎ−Ｔｇイネの粉末あるいはＴｇイネ種子の粉末を経口摂取した全てのマウスに対して、イネ種子粉末の経口摂取最終日の翌日に、マウス１匹当たり、株式会社エル・エス・エル製スギ花粉抽出タンパク質（品番ＬＧ−５２８０）０．１ｍｇ、株式会社エル・エス・エル製アラム（水酸化アルミニュムゲル、品番ＬＧ−６０００）５ｍｇ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製マウスＩＬ−４（品番４０４−ＭＬ）０．１μｇの混合液を腹腔投与した。この１週後に、マウス１匹当たり、スギ花粉抽出タンパク質０．１ｍｇとアラム５ｍｇとの混合液を腹腔投与した。

【0082】

ＶＩＩＩ．Ｔ細胞増殖活性とサイトカイン産生量の測定
上記ＶＩＩで述べた２回目のスギ花粉抽出タンパク質とアラムとの混合液の腹腔投与から２週後に、マウスの脾臓から、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｋ．Ｋ．製ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（品番１３０−０４９−２０１)、及び、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｋ．Ｋ．製ａｕｔｏＭＡＣＳ^TM自動磁気細胞分離装置（品番１３０−０２０−１０１）を用いて、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を分離した。このＣＤ４⁺Ｔ細胞１×１０⁵個と、ナイーブＢＡＬＢ／ｃオスマウスの脾臓から調製した抗原提示細胞５×１０⁵個、及び、抗原として、２０μｇ／ｍＬのスギ花粉抽出タンパク質とを、細胞培養用９６穴プレート中に混合し、３７℃で５日間、培養した。

【0083】

細胞培養終了後に、プロメガ製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６^(R)ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ試薬（品番Ｇ３５８０）を用いた比色定量法により、生細胞数を測定した。図１に、Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群の、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖活性を、スギ花粉アレルゲン特異的なＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（Ｓ．Ｉ．）として示した。なお、抗原であるスギ花粉抽出タンパク質を添加せずに培養した時の増殖細胞数に対する、スギ花粉抽出タンパク質添加時の増殖細胞数の割合を、スギ花粉アレルゲン特異的なＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（Ｓ．Ｉ．）として表記した（図１）。

【0084】

その結果図１から明らかなように、Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群では、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群と比較して、スギ花粉アレルゲンの刺激によるＴ細胞の増殖活性が、有意に抑制された（Ｐ＜０．０１)。

【0085】

また、培養終了時点で、Ｔ細胞を培養した上清画分の一部を回収し、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて、各種のサイトカインの産生量を測定した。図２〜図７に、Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群の、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＩＦＮγの産生量を、それぞれ示す。

【0086】

その結果、Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群では、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群と比較して、スギ花粉アレルギーなどのＴｈ２型の免疫応答を誘導する各サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）の産生が、顕著に抑制された。さらに、別の各サイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ）の産生にも、抑制傾向が見られた（図２〜図７）。ＩＬ−５（図３）、ＩＬ−１０（図５）及びＩＦＮ−γ（図７）の産生量は、ｐ＜０．０５で各実験群の間に有意差があることが確認された。ＩＬ−４（図２）及びＩＬ−１３（図６）の産生量は、ｐ＜０．０１で各実験群の間に有意差があることが確認された。

【0087】

ＩＸ．スギ花粉アレルゲン特異的抗体、及び、ヒスタミン産生量の測定
上述した２回目のスギ花粉抽出タンパク質とアラムとの混合液の腹腔投与の２週後に、マウスの血清を採取し、スギ花粉アレルゲン特異的抗体の産生量及びヒスタミンの産生量を調査した。まず、スギ花粉アレルゲン特異的抗体の産生量を測定するため、９６穴プレートの各ウェルに、５０ｍＭ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍＬに希釈した、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の抗マウスＩｇＥ抗体、及び同様に希釈した抗マウスＩｇＧを、それぞれを加え、４℃で一晩、静置した。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製ブロックエース（品番ＵＫ−Ｂ８０）を添加し、２５℃で２時間ブロッキングを行った。

【0088】

次に、マウスから採取した血清を各ウェルに添加し、２５℃で２時間反応させた後、ビオチン化されたスギ花粉抽出タンパク質を各ウェルに添加し、２５℃で２時間反応させた。続いて、１／５０００に希釈されたＥｎｄｏｇｅｎ社製ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（品番Ｎ１００）を、各ウェルに添加し、２５℃で１時間反応させた後、ＨＲＰ酵素の基質であるＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ溶液（品番５５０５３６）を各ウェルに加えて発色させ、マイクロプレートリーダーを用いて、発色強度を測定した。また、ヒスタミンの産生量の測定については、ＮＥＯＧＥＮ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社製Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（品番４０９０１０）を用いた。図８〜図１０に、Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群と、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群の、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、及びヒスタミンの、各産生量を示す。

【0089】

その結果、Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群では、Ｎｏｎ−Ｔｇイネ種子の粉末を経口投与した実験群と比較して、スギ花粉アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の産生、スギ花粉アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体の産生及びヒスタミンの産生が、顕著に抑制された（図８〜図１０）。

【配列表フリーテキスト】

【0090】

配列番号１：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ２）免疫原性を有するタンパク質のアミノ酸配列（９３ａａ−３８８ａａ、５９ａａ−９２ａａ、１ａａ−５８ａａ）
配列番号２：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）の免疫原性を有するタンパク質のアミノ酸配列（１ａａ−１４４ａａ）
配列番号３：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）の免疫原性を有するタンパク質のアミノ酸配列（１２６ａａ−２５７ａａ）
配列番号４：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）の免疫原性を有するタンパク質のアミノ酸配列（２３１ａａ−３５３ａａ）
配列番号５：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ２）の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号６：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号７：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号８：スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号９：エントリークローンに含まれるオリジナルマルチクローニングサイトの塩基配列
配列番号１０：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋の塩基配列
配列番号１１：ＧｌｕＢ１プロモーターの塩基配列
配列番号１２：ＧｌｕＢ４プロモーターの塩基配列
配列番号１３：１６ｋＤａプロラミンプロモーターの塩基配列
配列番号１４：１０ｋＤａプロラミンプロモーターの塩基配列
配列番号１５：内部にＣｆｒ９Ｉサイトを付加したＧｌｕＡ２の塩基配列
配列番号１６：内部にＣｆｒ９Ｉサイトを付加したＧｌｕＢ１の塩基配列
配列番号１７：内部にＣｆｒ９Ｉサイトを付加したＧｌｕＣの塩基配列
配列番号１８：ＧｌｕＢ１ターミネーターの塩基配列
配列番号１９：ＧｌｕＢ４ターミネーターの塩基配列
配列番号２０：１６ｋＤプロラミンターミネーターの塩基配列
配列番号２１：１０ｋＤプロラミンターミネーターの塩基配列
配列番号２２：デスティネーション・バイナリーベクターの塩基配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2016年10月7日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個、２個もしくは３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質

【請求項2】

以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個〜１２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項3】

以下の（ｐ）又は（ｕ）であるポリヌクレオチド。
（ｐ）配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｕ）配列番号５に示される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、スギ花粉の免疫原性を有するポリヌクレオチド

【請求項4】

請求項２及び／又は請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項5】

請求項２及び／又は請求項３に記載のポリヌクレオチド、もしくは請求項６に記載のベクターが導入された形質転換体。

【請求項6】

ＧｌｕＢ１プロモーター、ＧｌｕＢ４プロモーター、１０ｋＤａプロラミンプロモーター及び１６ｋＤａプロラミンプロモーターからなる群より選ばれるプロモーターを更に含む請求項５に記載の形質転換体。

【請求項7】

前記形質転換体が、植物である請求項５又は６に記載の形質転換体。

【請求項8】

前記形質転換体が、イネ科植物である請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体。

【請求項9】

請求項６〜８のいずれか１項に記載の形質転換体において前記ポリヌクレオチドを発現させて、産生されたタンパク質を採取することを含む、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。

【請求項10】

請求項２及び／又は請求項３に記載のポリヌクレオチドを植物に導入することにより、植物にスギ花粉の免疫原性を付与する方法。

【請求項11】

請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを植物器官、植物組織又は植物細胞に導入し形質転換体を得ること、並びに前記形質転換体から植物体を生育させること、を含むスギ花粉の免疫原性を有する植物体の作出方法。

【請求項12】

請求項２及び／又は請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを作製すること、前記ベクターを植物器官、植物組織又は植物細胞に導入し形質転換体を得ること、並びに前記形質転換体から植物体を生育させること、を含むスギ花粉の免疫原性を有する植物体の作出方法。

【請求項13】

請求項１に記載のタンパク質及び請求項６〜８のいずれか１項に記載の形質転換体から選ばれる１又は２以上を有効成分として含むスギ花粉症の治療又は予防剤。