特開 2017-39668 破骨細胞形成および／または機能抑制剤、破骨細胞形成および／または機能促進剤並びに破骨細胞形成および／または機能を抑制または促進する薬剤のスクリーニング法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-39668(P2017-39668A)

(43)【公開日】2017年2月23日

(54)【発明の名称】破骨細胞形成および／または機能抑制剤、破骨細胞形成および／または機能促進剤並びに破骨細胞形成および／または機能を抑制または促進する薬剤のスクリーニング法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/32 20150101AFI20170203BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20170203BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20170203BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170203BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20170203BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20170203BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170203BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170203BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20170203BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/32

   C12Q1/68 AZNA

   A61K31/7105

   A61K48/00

   A61P19/10

   A61P19/08

   A61P43/00 105

   C12N15/00 A

   C12N15/00 G

【審査請求】未請求

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2015-162851(P2015-162851)

(22)【出願日】2015年8月20日

(71)【出願人】

【識別番号】000185983

【氏名又は名称】小野薬品工業株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100086771

【弁理士】

【氏名又は名称】西島 孝喜

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(72)【発明者】

【氏名】吉子 裕二

(72)【発明者】

【氏名】竹井 悠一郎

(72)【発明者】

【氏名】南崎 朋子

(72)【発明者】

【氏名】吉岡 広陽

(72)【発明者】

【氏名】越智 保夫

【テーマコード（参考）】

4B024

4B063

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024BA80

4B024CA11

4B024CA20

4B024DA02

4B024EA01

4B024EA02

4B024EA03

4B024EA04

4B024GA11

4B024GA12

4B024GA13

4B024GA14

4B024HA17

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR35

4B063QR42

4B063QR50

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR66

4B063QR77

4B063QS03

4B063QS25

4B063QS28

4B063QS34

4B063QS36

4B063QS39

4B063QX01

4B063QX02

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA96

4C084ZA97

4C084ZB21

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

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4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA96

4C086ZA97

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB46

4C087BB65

4C087NA13

4C087ZA96

4C087ZA97

4C087ZB21

(57)【要約】

【課題】本発明の目的は、破骨細胞形成および／または機能抑制剤、および破骨細胞形成および／または機能促進剤を提供することである。本発明の別の目的は、骨リモデリングを制御する薬剤のスクリーニング法を提供することである。
【解決手段】
ｍｉＲ−１２５ｂが、基質小胞によって骨芽細胞から破骨細胞前駆細胞または破骨細胞へと運ばれ、破骨細胞の形成および／または機能を抑制することが見出された。本発明により、新たな破骨細胞形成および／または機能抑制剤、および破骨細胞形成および／または機能促進剤が提供される。また、本発明によれば、骨リモデリングを制御する薬剤のスクリーニング法が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

骨芽細胞由来の基質小胞を含む、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤。

【請求項2】

ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体を含む、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤。

【請求項3】

ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体によりトランスフェクトされ、ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体がトランスフェクト前よりも多量に包含している骨芽細胞由来の基質小胞を含む、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤。

【請求項4】

ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤を含む、破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤、若しくは破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤を含む、骨疾患の予防および／または治療をするための医薬組成物。

【請求項6】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤を含む、骨量の低下によって特徴付けられる障害を予防および／または治療するための医薬組成物。

【請求項7】

請求項４に記載の破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤を含む、破骨細胞の機能低下に起因する疾患を予防および／または治療するための医薬組成物。

【請求項8】

骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を被験物質の存在下および非存在下にて培養すること、および両条件下における前記細胞のｍｉＲ−１２５ｂ量を測定することを含み、前記ｍｉＲ−１２５ｂの量の増加または減少を、前記被験物質の破骨細胞形成を抑制若しくは促進する作用および／または破骨細胞機能を抑制若しくは促進する作用の指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質若しくは促進する物質のスクリーニング方法。

【請求項9】

骨芽細胞を被験物質の存在下および非存在下にて培養すること、および両条件下における基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量を測定することを含み、前記ｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の増加または減少を、前記被験物質の破骨細胞形成を抑制若しくは促進する作用および／または破骨細胞機能を抑制若しくは促進する作用の指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質若しくは促進する物質のスクリーニング方法。

【請求項10】

破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を被験物質の存在下および非存在下にて培養すること、前記破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を基質小胞で処理すること、および両条件下における前記破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量を測定することを含み、前記破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の増加または減少を、前記被験物質の破骨細胞形成を抑制または促進する作用および／または破骨細胞機能を抑制若しくは促進する作用の指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質若しくは促進する物質のスクリーニング方法。

【請求項11】

骨芽細胞にｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体をトランスフェクトし、前記骨芽細胞から基質小胞を単離することを含む、前記基質小胞を含む破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤の製造方法。

【請求項12】

ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体を人工基質小胞内に挿入することを含む、前記人工基質小胞を含む破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤の製造方法。

【請求項13】

破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤の製造のための、（ｉ）骨芽細胞由来の基質小胞、または（ｉｉ）ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体、の使用。

【請求項14】

破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能促進剤の製造のための、ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤、破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤、並びに骨リモデリングの新規制御機構に基づく薬剤のスクリーニング法を提供する。

【背景技術】

【0002】

骨を構成する細胞である、破骨細胞、骨芽細胞および骨細胞は、細胞間情報伝達によって骨リモデリングを制御する。骨リモデリングのバランスが崩れると、関節リウマチ、骨粗鬆症などの骨代謝異常や、骨硬化症、骨大理石病などをひき起こす。したがって、骨リモデリングの制御機構の解明は、様々な骨疾患を理解する上で重要な鍵となる。これまでに、骨芽細胞および骨細胞に発現するＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢ（ＲＡＮＫ）ｌｉｇａｎｄ）が、破骨細胞前駆細胞上の受容体ＲＡＮＫと結合し破骨細胞分化を促進することや（非特許文献１参照）、骨芽細胞から産生されるオステオプロテゲリンがＲＡＮＫＬの可溶性デコイ受容体として破骨細胞の分化を負に制御することが報告されている（非特許文献２参照）。また、破骨細胞が産生するセマフォリン４Ｄが骨芽細胞に発現する受容体であるプレキシンＢ１に結合し、骨芽細胞の分化に必要なＩＧＦ−１シグナルを阻害することで分化を抑制することが報告されている（非特許文献３参照）。しかしながら、骨リモデリングの制御機構の全容は未だ明らかにされていない。
基質小胞は、骨芽細胞や軟骨細胞などから出芽的に分泌される細胞外小胞である。基質小胞は主に硬組織や軟骨基質に分泌され、石灰化の開始を促す。そのため小胞にはＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）やアネキシン等の、ヒドロキシアパタイトの結晶成長のための調節分子が豊富に含まれる。また、ＩＧＦ−１やＴＧＦ−β₁は基質小胞に取り込まれて分泌され、不活性型として骨基質中に蓄積されるが、破骨細胞による骨吸収の際に放出され活性化される。活性化されたＩＧＦ−１は、間葉幹細胞や骨芽細胞前駆細胞の遊走を促進し、ＴＧＦ−β₁のコントロール下でリクルートされた前駆体を骨芽細胞へと分化させる（非特許文献４、５参照）。このように、基質小胞は石灰化だけでなく骨芽細胞形成においても重要な働きを果たしている。
マイクロＲＮＡは、２０〜２５ヌクレオチドからなる小分子非翻訳ＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡに結合してそのタンパク質への翻訳を阻害する。マイクロＲＮＡは、様々な細胞に発現しており、種々の疾患や病態に関与することが知られている。骨においては、例えば、ｍｉＲ−３４ａの強制発現が破骨細胞の形成を抑制することが報告されている（非特許文献６参照）。また、ｍｉＲ−１２５ｂを間質細胞株ＳＴ２に強制発現させると細胞増殖が抑制され、その結果、ＢＭＰ−４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）依存性の骨芽細胞分化が抑制されると報告されている（非特許文献７参照）。一方で、ｍｉＲ−１２５ｂは骨芽細胞分化には何ら影響しないという報告もある（非特許文献８参照）。マイクロＲＮＡは、発現した細胞内で機能するのみならずエキソソーム等の細胞外小胞によって細胞外に分泌され、他の細胞に取り込まれて標的遺伝子に作用することが多数報告されている（例：非特許文献９参照）。細胞外小胞の一種である基質小胞については、血管石灰化病態の重要なプロセスと考えられている血管平滑筋細胞の骨芽細胞様細胞への分化転換において、骨芽細胞様細胞が産生する基質小胞にマイクロＲＮＡが含まれている可能性が推測されている（非特許文献１０参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１１年、１７巻、１０号、１２３１−１２３４頁

【非特許文献2】セル（Ｃｅｌｌ）、１９９８年、９３巻、２号、１６５−１７６頁

【非特許文献3】ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１１年、１７巻、１１号、１４７３−１４８０頁

【非特許文献4】ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２００９年、１５巻、７号、７５７−７６５頁

【非特許文献5】ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１２年、１８巻、７号、１０９５−１１０１頁

【非特許文献6】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１４年、５１２巻、４３１−４３５頁

【非特許文献7】バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、２００８年、３６８巻、２６７−２７２頁

【非特許文献8】ブラジリアン・ジャーナル・オブ・メディカル・アンド・バイオロジカル・リサーチ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年、４６巻、８号、６７６−６８０頁

【非特許文献9】ネイチャーセルバイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００７年、９巻、６号、６５４−６５９頁

【非特許文献10】セルズ（Ｃｅｌｌｓ）、２０１４年、３巻、９６３−９８０頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤、並びに破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤を提供することである。また、本発明の別の目的は、骨リモデリングを制御する薬剤のスクリーニング法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、ｍｉＲ−１２５ｂが、基質小胞内に高濃度に存在しており、基質小胞によって骨芽細胞から骨基質に輸送された後、あるいは直接破骨細胞前駆細胞または破骨細胞へと運ばれ、破骨細胞の形成や機能を抑制することを見出した。これまで、骨芽細胞から分泌された基質小胞が破骨細胞前駆細胞または破骨細胞に取り込まれ、分化や機能を抑制することは知られていない。また、ｍｉＲ−１２５ｂの破骨細胞に関する報告はなく、ましてやｍｉＲ−１２５ｂが基質小胞内に高濃度に存在し、基質小胞を介して破骨細胞前駆細胞または破骨細胞に取り込まれて作用を発揮することは全く知られていない。

【0006】

本発明は上記知見に基づきなされたものであり、以下を提供する。
〔１〕骨芽細胞由来の基質小胞を含む、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤。
〔２〕ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体を含む、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤。
〔３〕ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体によりトランスフェクトされ、ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体がトランスフェクト前よりも多量に包含している骨芽細胞由来の基質小胞を含む、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤。
〔４〕ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤を含む、破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤。
〔５〕前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤、若しくは破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤を含む、骨疾患の予防および／または治療をするための医薬組成物。
〔６〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤を含む、骨量の低下によって特徴付けられる障害を予防および／または治療するための医薬組成物。
〔７〕前記〔４〕に記載の破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤を含む、破骨細胞の機能低下に起因する疾患を予防および／または治療するための医薬組成物。
〔８〕骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を被験物質の存在下および非存在下にて培養すること、および両条件下における前記細胞のｍｉＲ−１２５ｂ量を測定することを含み、前記ｍｉＲ−１２５ｂの量の増加または減少を、前記被験物質の破骨細胞形成を抑制若しくは促進する作用および／または破骨細胞機能を抑制若しくは促進する作用の指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質若しくは促進する物質のスクリーニング方法。
〔９〕骨芽細胞を被験物質の存在下および非存在下にて培養すること、および両条件下における基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量を測定することを含み、前記ｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の増加または減少を、前記被験物質の破骨細胞形成を抑制若しくは促進する作用および／または破骨細胞機能を抑制若しくは促進する作用の指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質若しくは促進する物質のスクリーニング方法。
〔１０〕破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を被験物質の存在下および非存在下にて培養すること、前記破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を基質小胞で処理すること、および両条件下における前記破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量を測定することを含み、前記破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の増加または減少を、前記被験物質の破骨細胞形成を抑制または促進する作用および／または破骨細胞機能を抑制若しくは促進する作用の指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質若しくは促進する物質のスクリーニング方法。
〔１１〕骨芽細胞にｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体をトランスフェクトし、前記骨芽細胞から基質小胞を単離することを含む、前記基質小胞を含む破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤の製造方法。
〔１２〕ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体を人工基質小胞内に挿入することを含む、前記人工基質小胞を含む破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤の製造方法。
〔１３〕破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤の製造のための、（ｉ）骨芽細胞由来の基質小胞、または（ｉｉ）ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体、の使用。
〔１４〕破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能促進剤の製造のための、ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤の使用。

【発明の効果】

【0007】

本発明により、新たな破骨細胞形成および／または機能抑制剤、並びに破骨細胞形成および／または機能促進剤が提供される。また、本発明により、ｍｉＲ−１２５ｂ量、基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量、または破骨細胞前駆細胞若しくは破骨細胞への基質小胞の取り込み量を指標とした、骨リモデリングを制御する薬剤のスクリーニング法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭｓ）の破骨細胞形成に及ぼす基質小胞の作用を示す。図中、縦軸は破骨細胞と判定された各ウェルの細胞数を示し、ＭＶｓは基質小胞を示す。基質小胞の濃度は０．８μｇ／ｍｌタンパク質である。ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ処理グループ（−）はコントロール（−）に対し、１％水準で有意であった。ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ処理グループにおいて、ＭＶｓ＋はＭＶｓ−に対し５％水準で有意であった。なお有意差検定は分散分析とＴｕｒｋｅｙの多重比較検定により行った（以下同じ）。

【図2】ＲＡＷ−Ｄ細胞の破骨細胞形成に及ぼす基質小胞の作用を示す。図中、縦軸は破骨細胞と判定された各ウェルの細胞数を示し、ＭＶｓは基質小胞を示す。また、横軸の数値は基質小胞の濃度を示し、単位はμｇ／ｍｌタンパク質である。ＲＡＮＫＬ処理グループ（−）は、コントロール（−）に対し、１％水準で有意であった。ＲＡＮＫＬ処理グループにおいて、ＭＶｓ−に対し、ＭＶｓ０．４は５％水準で、またＭＶｓ０．８、ＭＶｓ１．６はそれぞれ１％水準で有意差があった。

【図3】骨吸収に及ぼす基質小胞の作用を示す。図中、縦軸は骨吸収窩（ピット）の面積を示し、ＭＶｓは基質小胞を示す。基質小胞の濃度は０．８μｇ／ｍｌタンパク質である。ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ処理グループ（−）はコントロール（−）に対し１％水準で有意であった。ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ処理グループにおいて、ＭＶｓ＋はＭＶｓ−に対し５％水準で有意であった。

【図4】破骨細胞前駆細胞および破骨細胞における基質小胞の取り込みを示す。図４Ａは、タイムラプスイメージングにより取得した画像データである。上図は破骨細胞前駆細胞における結果を示す。ＲＡＷ−Ｄ細胞を播種し、翌日に標識した基質小胞を０．８μｇ／ｍｌの濃度で添加し、タイムラプスイメージングにより基質小胞の取り込みを評価した。また、下図は破骨細胞における結果を示す。ＲＡＷ−Ｄを播種し、ＲＡＮＫＬを添加して３〜４日後、破骨細胞（多核）を認めた後、上記同様標識した基質小胞を添加し、タイムラプスイメージングにより基質小胞の取り込みを評価した。図４Ｂは、上記試験を２回繰り返したそれぞれの結果であり、横軸においてＲＡＮＫＬ（−）で表される、ＲＡＷ−Ｄ細胞を使用した試験では２４時間後の全細胞に対する標識された細胞数の割合を示し、ＲＡＮＫＬ（＋）で表される、ＲＡＮＫＬ添加により破骨細胞へと分化したＲＡＷ−Ｄ細胞を使用した試験では２４時間後の多核細胞の総数に対する標識された多核細胞の割合を示す。

【図5】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における各ｍｉＲＮＡの細胞と基質小胞中の相対量を示す。図中、縦軸は各ｍｉＲＮＡの相対量を示し、横軸の２１はｍｉＲ−２１を、１２５ｂはｍｉＲ−１２５ｂを、１９９ａはｍｉＲ−１９９ａを示す。また、Ｃｅｌｌｓは細胞全体を、ＭＶｓは基質小胞を示す。１２５ｂおよびＬｅｔ７−ｃでは、ＭＶｓはＣｅｌｌｓに対し５％水準で有意差があった。

【図6】ｍｉＲ−１２５ｂをトランスフェクションしたＲＡＷ−Ｄ細胞におけるＲＡＮＫＬ誘導性の破骨細胞形成の結果を示す。図中、縦軸は破骨細胞と判定された各ウェルの細胞数を示し、１２５ｂはｍｉＲ−１２５ｂをトランスフェクションした細胞を示す。ＲＡＮＫＬ処理グループ（−）はコントロール（−）に対し、０．１％水準で有意であった。ＲＡＮＫＬ処理グループにおいて、１２５ｂ＋は１２５ｂ−に対し１％水準で有意であった。

【図7】ｍｉＲ−１２５ｂインヒビターの組換えレンチウイルスを感染させたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞から採取した基質小胞のＲＡＷ−Ｄ細胞におけるＲＡＮＫＬ誘導性の破骨細胞形成に対する影響を示す。図中、縦軸は破骨細胞と判定された各ウェルの細胞数を示す。また、横軸のＮＣはコントロール、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒはｍｉＲ−１２５ｂの機能を抑制した細胞から得られた基質小胞を示し、ＭＶｓは基質小胞を示す。ＲＡＮＫＬ処理ＮＣはＮＣに対し、１％水準で有意であった。ＲＡＮＫＬ処理グループにおいて、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒはＮＣに対し５％水準で有意差があった。

【図8】マウスＬＰＳ惹起骨融解モデルにおけるｍｉＲ−１２５ｂの破骨細胞形成抑制作用を示す。図中、縦軸はＴＲＡＰ陽性細胞を示す。また、横軸の１２５ｂはｍｉＲ−１２５ｂを示す。ＬＰＳはコントロール（−）に対し、１％水準で有意であった。ＬＰＳ処理グループにおいて、１２５ｂ＋は１２５ｂ−に対し５％水準で有意であった。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本発明を詳細に説明する。
１．骨芽細胞由来の基質小胞を含む破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤
本発明の第１の態様は、骨芽細胞由来の基質小胞を含む、破骨細胞形成および／または機能抑制剤である。
本明細書において、破骨細胞形成抑制剤および／または破骨細胞機能抑制剤を、破骨細胞形成および／または機能抑制剤とも記載する。
骨芽細胞「由来」の基質小胞とは、骨芽細胞から分泌または産生される基質小胞を意味する。基質小胞は、骨芽細胞から出芽的に分泌される細胞外小胞で、骨基質石灰化の起点となることを特徴とする。骨芽細胞は哺乳類のものが好ましく、更にヒトまたはマウスのものが好ましい。スクリーニング方法に関して後述する骨芽細胞も使用することができる。
基質小胞を破骨細胞形成および／または機能抑制剤において用いる場合には、特にｍｉＲ−１２５ｂを含む基質小胞が好ましい。
天然由来の基質小胞は、例えば骨芽細胞の培養物から抽出して得ることができる。

【0010】

２．ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体を含む、破骨細胞形成および／または機能抑制剤
本発明の第２の態様は、ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体を含む、破骨細胞形成および／または機能抑制剤である。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡとも記載する）は、ｍｉＲＮＡ前駆体に転写されるゲノム上に存在する遺伝子から生成される。まず、遺伝子から一次転写産物であるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが転写され、次いで、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが核内でＤｒｏｓｈａと呼ばれるＲＮａｓｅ ＩＩＩによりプロセシングされ、約７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが生成される。その後、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは細胞質に輸送され、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅ ＩＩＩによりプロセシングされて、約２０−２５塩基の成熟型ｍｉＲＮＡが生成される。

【0011】

本明細書において、ｍｉＲＮＡの「前駆体」は、前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの両方を意味する。したがって、「ｍｉＲ−１２５ｂの前駆体」はｐｒｉ−ｍｉＲ−１２５ｂおよびｐｒｅ−ｍｉＲ−１２５ｂの両方を意味し、ｍｉｒ−１２５ｂとも記載される。ｍｉＲ−１２５ｂの前駆体は、生体に投与されると、上記のとおり生体内でプロセシングされてｍｉＲ−１２５ｂを生じ、ｍｉＲ−１２５ｂと同じ機能を発揮する。

【0012】

ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−１２５ｂの前駆体の配列の例を以下に示すが、これらに限定されるものではない。また、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２５ｂはｍｉＲ−１２５ｂを含んだ配列であればよく、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２５ｂはｐｒｅ−ｍｉＲ−１２５ｂを含んだ配列であればよい。

【0013】

ヒトおよびマウスｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ：ucccugagacccuaacuuguga（配列番号１）
ヒトｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ：acggguuaggcucuugggagcu（配列番号２）
ヒトｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ：ucacaagucaggcucuugggac（配列番号３）
マウスｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ：acggguuaggcucuugggagcu（配列番号４）
マウスｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ：acaagucagguucuugggaccu（配列番号５）
マウスｍｉｒ−１２５ｂ−１；ugcgcuccccucagucccugagacccuaacuugugauguuuaccguuuaaauccacggguuaggcucuugggagcug（配列番号：６）
マウスｍｉｒ−１２５ｂ−２；gccuagucccugagacccuaacuugugagguauuuuaguaacaucacaagucagguucuugggaccuaggc（配列番号：７）
ヒトｍｉｒ−１２５ｂ−１；ugcgcuccucucagucccugagacccuaacuugugauguuuaccguuuaaauccacggguuaggcucuugggagcugcgagucgugcu（配列番号：８）
ヒトｍｉｒ−１２５ｂ−２；accagacuuuuccuagucccugagacccuaacuugugagguauuuuaguaacaucacaagucaggcucuugggaccuaggcggagggga（配列番号：９）

【0014】

本明細書において、ｍｉＲ−１２５ｂまたはその前駆体の「変異体」には、ｍｉＲ−１２５ｂまたはその前駆体の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、ｍｉＲ−１２５ｂの機能を保持するＲＮＡ分子が含まれる。また、ｍｉＲ−１２５ｂまたはその前駆体を模倣するように合成された、それらの類似物質も含まれる。例えば、前記ｍｉＲ−１２５ｂ類似物質は、Ａｍｂｉｏｎ社などから入手可能である。
「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の配列は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ））で提供されるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等のプログラムを用いて算出することができる。または、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標） ｖｅｒ． １２）を用いて求めることもできる。また、ｍｉＲ−１２５ｂまたはその前駆体の「変異体」には、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２５ｂ、またはｐｒｅ−ｍｉＲ−１２５ｂの配列において、１個から数個、好ましくは１〜３個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列を有し、ｍｉＲ−１２５ｂの機能を保持するＲＮＡ分子が含まれる。

【0015】

本明細書において、「ｍｉＲ−１２５ｂ若しくはその前駆体、またはそれらの変異体」を「本発明のｍｉＲＮＡ」とも記載する。
本発明のｍｉＲＮＡは、公知の方法を用いて合成することができる。本発明のｍｉＲＮＡを構成する核酸は、天然の核酸であっても、安定性の向上した核酸誘導体などの非天然の核酸であってもよい。核酸誘導体としては、例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、スルホン、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋型ホスホラミデート、架橋型メチレンホスホネート、架橋型ホスホロチオエート、ジメチレン−スルフィド、ジメチレン−スルホキシド、ジメチレン−スルホン、２’−Ｏ−アルキル、または２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）などが挙げられる。また、核酸誘導体には、２’または３’糖修飾を含む核酸、例えば２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）化ヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチド、または２’−フルオロ、ジフルオロトルイル、５−Ｍｅ−２’−ピリミジン、５−アリルアミノ−ピリミジン、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセタミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−ヒドロキシヌクレオチド、ホスホロチオエート、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、または２’−アラ−フルオロヌクレオチドなどを含む核酸が含まれる。

【0016】

本発明のｍｉＲＮＡは、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸等と塩を形成してもよく、それら塩形態は本発明のｍｉＲＮＡの好ましい態様の１つである。塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましい。上記無機塩基との塩の例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。上記有機塩基との塩の例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。上記無機酸との塩の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。上記有機酸との塩の例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。

【0017】

また、上記本発明のｍｉＲＮＡを発現する発現ベクター（以下では、「本発明の発現ベクター」とも記載する）も、本発明のｍｉＲＮＡの好ましい態様の１つである。本発明の発現ベクターは、ウイルスベクターであっても、非ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ニワトリポックスウイルス、ＳＶ４０を代表とするパポバウイルス等に由来するベクターが例示される。好ましくは、ベクターはアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスである。非ウイルスベクターとしては、Ｐｏｌ Ｉプロモーター、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、バクテリオファージ（Ｔ４ファージやＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ認識配列）のプロモーター等を有するベクターが挙げられる。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーターやβ−グロブリンプロモーターなどを、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターとしては、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、７ＳＫプロモーター、７ＳＬプロモーター、Ｙ３プロモーター、５Ｓ ｒＲＮＡプロモーター、Ａｄ２ ＶＡＩおよびＶＡＩＩプロモーターなどが例示される。これらのプロモーターを有するベクターは市販されており、容易に入手可能である。

【0018】

本発明のｍｉＲＮＡは、患者にそのまま投与してもよく、リポソーム、アテロコラーゲン、自己組織化ペプチド、ナノパーティクル、カチオンポリマーおよびデンドリマーなどを担体として投与してもよい。また、基質小胞に含有されて投与されてもよい。基質小胞は天然由来でもよいし、合成品でもよい。合成された人工基質小胞は、例えばリポソーム、ブロックコポリマーミセル等から構成される。人工基質小胞のサイズとしては直径１００ｎｍから３００ｎｍのものが好ましい。リポソームとしては、Ｎ−［２，３−（ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが例示される。

【0019】

３．ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体によりトランスフェクトされ、ｍｉＲ−１２５ｂ、若しくはその前駆体、またはそれらの変異体をトランスフェクト前よりも多量に包含している骨芽細胞由来の基質小胞を含む、破骨細胞形成および／または機能抑制剤、並びにその製造方法
本発明の第３の態様は、本発明のｍｉＲＮＡをトランスフェクトした骨芽細胞由来の基質小胞を含む、破骨細胞形成および／または機能抑制剤である。前記基質小胞は、本発明のｍｉＲＮＡを、トランスフェクト前よりも多量に包含していることを特徴とする。
また、本発明の第４の態様は、骨芽細胞に本発明のｍｉＲＮＡをトランスフェクトし、前記骨芽細胞から基質小胞を単離することを含む、前記基質小胞を含む破骨細胞形成および／または機能抑制剤の製造方法を含む。
トランスフェクション方法としては、従来公知の方法、例えばリポフェクション法、リポソーム法、ポリアミン法、エレクトロポレーション法、ビーズ法等を用いることができる。トランスフェクション試薬としては、ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ（バイオラッド社）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（ライフテクノロジーズ）、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。本発明のｍｉＲＮＡをトランスフェクトした骨芽細胞から、基質小胞を単離することにより、本発明のｍｉＲＮＡをトランスフェクト前よりも多量に包含する基質小胞を得ることができる。この基質小胞を用いて破骨細胞形成および／または機能抑制剤を製造することができる。

【0020】

本発明の第５の態様は、本発明のｍｉＲＮＡを、人工基質小胞内に挿入することを含む、人工基質小胞を含む破骨細胞形成および／または機能抑制剤の製造方法である。
例えば、リポソーム、ブロックコポリマーミセル等から構成される人工基質小胞内へ、本発明のｍｉＲＮＡを挿入することにより製造することができる。

【0021】

４．ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤を含む、破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤
本発明の第６の態様は、ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤を含む、破骨細胞形成および／または機能促進剤である。
本明細書において、破骨細胞形成促進剤および／または破骨細胞機能促進剤を破骨細胞形成および／または機能促進剤とも記載する。
本発明において、ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤とは、ｍｉＲ−１２５ｂと相補的な配列をもち、ｍｉＲ−１２５ｂの活性および／または発現を阻害する作用を有する阻害剤である。例えば、ＬＮＡ^TM ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ）、Ｔｏｕｇｈ Ｄｅｃｏｙ ＲＮＡ（Ｌｅｎｔｉ ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（シグマアルドリッチ））などが挙げられる。例えば、ｍｉＲ−１２５ｂアンチセンス阻害剤は、前記骨芽細胞でのｍｉＲ−１２５ｂの機能または発現を減少させることにより、基質小胞に含まれるｍｉＲ−１２５ｂの減少または機能不全を引き起こし、破骨細胞の形成および／または機能を促進する。

【0022】

５．破骨細胞形成および／または機能抑制剤、若しくは破骨細胞形成および／または機能促進剤を含む、骨疾患の予防および／または治療するための医薬組成物
本発明の第７の態様は、上述した破骨細胞形成および／または機能抑制剤、若しくは破骨細胞形成および／または機能促進剤を含む、骨疾患の予防および／または治療するための医薬組成物（本発明の医薬組成物とも記載する）である。
本発明の医薬組成物は、本発明のｍｉＲＮＡに加えて、医薬上許容される担体（例えば、滅菌水、生理食塩水など）、安定剤（例えば、ヌクレアーゼ阻害剤など）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）、およびその他の助剤を含んでもよい。
本発明の医薬組成物の投与方法としては、経口投与および非経口投与が挙げられるが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与などが例示される。

【0023】

本発明の医薬組成物の投与量および投与頻度は、使用目的、患者の年齢、体重、性別、既往歴、疾患の重篤度、有効成分の種類などを考慮して、適宜決定することができる。投与量は、例えば、ｍｉＲＮＡの場合、成人１回あたり１．０μｇ／ｋｇ〜１．０ｇ／ｋｇ、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、ウイルスベクターの場合、ウイルスの最終的な力価として１０⁷〜１０¹³ｐｆｕ／ｍＬ、好ましくは１０⁹〜１０¹²ｐｆｕ／ｍＬである。投与頻度は、例えば、１日１回〜数ヶ月に１回である。

【0024】

本発明において、骨疾患とは、破骨細胞の分化および／または成熟異常に起因する骨代謝異常であり、骨量の低下によって特徴付けられる障害（例えば、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症等）および破骨細胞の機能低下に起因する疾患（例えば、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化、骨化性筋炎等）を含む。
本発明の破骨細胞形成および／または機能抑制剤を含有する医薬は、骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬として用いることができる。すなわち、本発明は、上述の破骨細胞形成および／または機能抑制剤を含む、骨量の低下によって特徴付けられる障害を予防および／または治療するための医薬組成物を提供する。
本発明の破骨細胞形成および／または機能促進剤を含有する医薬は、破骨細胞の機能低下に起因する疾患に対する予防および／または治療薬として用いることができる。すなわち、本発明は、上述の破骨細胞形成および／または機能促進剤を含む、破骨細胞の機能低下に起因する疾患を予防および／または治療するための医薬組成物を提供する。
本発明において、分化と形成は同義である。例えば、破骨細胞分化と破骨細胞形成は同じ意味で用いられる。

【0025】

本発明の破骨細胞形成および／または機能抑制剤若しくは促進剤を含む、骨疾患の予防および／または治療薬は、投与対象となる個体に対して医薬として使用できる。具体的な投与対象となる個体としては、上述した骨疾患を伴う個体、骨疾患を発症する可能性がある個体等が好適な対象となる。また、個体としては哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）が好ましく、その中でもヒトが好ましく、特に骨疾患を伴う患者（ヒト）が好ましい。

【0026】

本発明の医薬組成物は治療および／または予防に有効な量の少なくとも一つの骨疾患治療薬と併用することができる。例えば、本発明の破骨細胞形成および／または機能抑制剤を含む医薬組成物と併用され得る骨疾患治療薬としては、ビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ、ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ、ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ、ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ、ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、またはｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、活性型ビタミンＤ３、カルシトニンおよびその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂまたはｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦα抗体または該抗体の抗原結合断片（例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体または該抗体の抗原結合断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（例えばａｎａｋｉｎｒａ）、抗ＩＬ−６レセプター抗体または該抗体の抗原結合断片（例えば、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体または該抗体の抗原結合断片（例えば、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、およびＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の医薬組成物と他の骨疾患治療薬とは、単一の製剤に含まれていても、別の製剤に含まれていてもよい。

【0027】

６．スクリーニング方法
本発明において、本発明者らは以下（１）〜（３）からなる骨リモデリングの新規制御機構を見出した。
（１）骨芽細胞においてｍｉＲ−１２５ｂは基質小胞中に選択的に取り込まれる。
（２）ｍｉＲ−１２５ｂを含む基質小胞は骨芽細胞から分泌され、選択的に破骨細胞前駆細胞または破骨細胞に取り込まれる。
（３）基質小胞内分子として破骨細胞前駆細胞または破骨細胞内に取り込まれたｍｉＲ−１２５ｂは分化（破骨細胞形成）および／または機能を抑制する。
本制御機構に基づいて新規のスクリーニング方法が提供される。

【0028】

６−１．第１のスクリーニング方法
本発明の１つの態様として、骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量の変化を指標とする、破骨細胞形成および／または機能を調節（抑制または促進）する物質、若しくは骨疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法が提供される。
より具体的には、本発明は、骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を被験物質の存在下および非存在下にて培養し、両条件下における細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量を測定、比較することを特徴とする、破骨細胞形成および／または機能を調節する物質、若しくは骨疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法を提供する。また、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を使用する場合は、好ましくは、上記条件に加え、さらに基質小胞を培地中に添加する。すなわち、本発明は、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を被験物質の存在下または非存在下にて培養した破骨細胞前駆細胞または破骨細胞に基質小胞を処置し、両条件下における細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量を測定、比較することを特徴とする、破骨細胞形成および／または機能を調節する物質、若しくは骨疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法を提供する。比較した結果、前記骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量の増加または減少があった場合には、これを指標として、前記被験物質が、破骨細胞形成および／または機能を抑制、若しくは促進する作用を有すると判断することができる。

【0029】

上記骨芽細胞としては、骨芽細胞に分化可能な細胞であれば、種や細胞株を問わず利用できる。また、骨芽細胞を含む組織（骨組織等）も利用可能である。例えば、個体より調製した初代培養細胞や樹立された細胞株が利用できる。具体的には、初代培養骨芽細胞（好ましくは、ヒト（例えばロンザジャパン、カタログ番号ＣＣ−２５３８、ＤＶ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、カタログ番号ＡＭ００５−ｆ）、サル、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等の組織から調製）、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、ＲＯＳ １７／２．８、ＵＭＲ−１０６、ＲＣＪ３．１、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、ＲＯＢ−Ｃ２６、Ｃ２Ｃ１２、ＳＴ−２、ＳＶ−ＨＦＯ、ｈＦＯＢｓ、ＭＧ−６３、Ｓａｏｓ−２、Ｕ２−ＯＳ、ＨＯＳ ＴＥ８５、ＨＢＤＣ（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ Ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ）、ｈＭＳ（ＯＢ）、ＳａＭ−１等が挙げられる。また、骨芽細胞様細胞へと形質転換可能な細胞（例えば、血管平滑筋細胞）や基質小胞を分泌する軟骨細胞も利用可能である。

【0030】

上記破骨細胞前駆細胞としては、破骨細胞に分化し得る単球・マクロファージ系細胞を含み、破骨細胞への分化が可能な破骨細胞前駆細胞であれば種や細胞株を問わず利用できる。また、破骨細胞前駆細胞を含む組織（骨組織等）も利用可能である。例えば、個体より調製した初代培養細胞や樹立された細胞株が利用できる。より具体的には、初代培養細胞（好ましくは、ヒト（例えばロンザジャパン、カタログ番号２Ｔ−１１０）、サル、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等の組織から調製）、ＲＡＷ２６４．７細胞またはＲＡＷ２６４．７細胞より樹立されたマクロファージ様細胞（ＲＡＷ−Ｄ細胞等）、ＭＯＣＰ−５細胞等が挙げられる。
上記破骨細胞としては、上記破骨細胞前駆細胞より分化誘導によって得られた細胞、または組織から単離した破骨細胞等が挙げられる。
被験物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。また、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー等も被験物質として挙げられる。

【0031】

骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞のｍｉＲ−１２５ｂ量の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。
骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を常法に従ってインビトロで培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後該細胞のｍｉＲ−１２５ｂ量を、公知の方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸アレイ、ノーザンブロット解析等の手法を用いて定量、解析する。
破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を使用する際は、被験物質に加えて基質小胞を培地中に添加してもよい。被験物質と基質小胞の添加タイミングは同じでも異なっていてもよい。

【0032】

・破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬の選択
骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量の測定の結果、被験物質によるｍｉＲ−１２５ｂ量の増加の変化と、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する作用、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療する活性とが相関付けられる。そして、骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞においてｍｉＲ−１２５ｂ量を増加させた前記被験物質を、破骨細胞形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）として選択することができる。すなわち、本発明の１つの態様として、骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量の増加を指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）のスクリーニング方法が提供される。

【0033】

・破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬の選択
骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量の測定の結果、被験物質によるｍｉＲ−１２５ｂ量の減少の変化と、破骨細胞の形成および／または機能を促進する作用、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患を予防および／または治療する活性とが相関付けられる。そして、ｍｉＲ−１２５ｂ量を減少させた前記被験物質を、破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）として選択することができる。すなわち、本発明の１つの態様として、骨芽細胞、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量の減少を指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）のスクリーニング方法が提供される。

【0034】

６−２．第２のスクリーニング方法
本発明の１つの態様として、基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み（輸送）の変化を指標とする、破骨細胞形成および／または機能を調節する物質、若しくは骨疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法が提供される。
より具体的には、本発明は、骨芽細胞を被験物質の存在下または非存在下にて培養し、両条件下における基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量を測定、比較することを特徴とする、破骨細胞の形成および／または機能を調節する物質、若しくは骨疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法を提供する。比較した結果、基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の増加または減少があった場合には、これを指標として、前記被験物質が、破骨細胞形成および／または機能を抑制若しくは促進する作用を有すると判断することができる。

【0035】

上記骨芽細胞としては、骨芽細胞に分化可能な細胞であれば、種や細胞株を問わず利用できる。また、骨芽細胞を含む組織（骨組織等）も利用可能である。例えば、個体より調製した初代培養細胞や樹立された細胞株が利用できる。具体的には、初代培養骨芽細胞（好ましくは、ヒト（例えばロンザジャパン、カタログ番号ＣＣ−２５３８、ＤＶ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、カタログ番号ＡＭ００５−ｆ）、サル、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等の組織から調製）、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、ＲＯＳ １７／２．８、ＵＭＲ−１０６、ＲＣＪ３．１、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、ＲＯＢ−Ｃ２６、Ｃ２Ｃ１２、ＳＴ−２、ＳＶ−ＨＦＯ、ｈＦＯＢｓ、ＭＧ−６３、Ｓａｏｓ−２、Ｕ２−ＯＳ、ＨＯＳ ＴＥ８５、ＨＢＤＣ（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ Ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ）、ｈＭＳ（ＯＢ）、ＳａＭ−１等が挙げられる。また、骨芽細胞様細胞へと形質転換可能な細胞（例えば、血管平滑筋細胞）や基質小胞を分泌する軟骨細胞も利用可能である。

【0036】

被験物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。また、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー等も被験物質として挙げられる。
基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み（輸送）の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。
骨芽細胞を常法に従ってインビトロで培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後該細胞の基質小胞を公知の方法により単離する（実施例またはＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０５３巻、１１５−１２４頁参照）。単離した基質小胞中のｍｉＲ−１２５ｂ量を、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸アレイ、ノーザンブロット解析等の手法を用いて定量、解析する。

【0037】

・破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬の選択
基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の測定の結果、被験物質による基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の増加の変化と、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する作用、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療する活性とが相関付けられる。そして、基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量を増加させた前記被検物質（ｍｉＲ−１２５ｂの基質小胞への輸送を促進する作用を有する物質）を、破骨細胞形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）として選択することができる。すなわち、本発明の１つの態様として、基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の増加を指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）のスクリーニング方法が提供される。

【0038】

・破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬の選択
基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の測定の結果、被験物質による基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の減少の変化と、破骨細胞の形成および／または機能を促進する作用、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患を予防および／または治療する活性とが相関付けられる。そして、基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量を減少させた前記被検物質（ｍｉＲ−１２５ｂの基質小胞への輸送を抑制する作用を有する物質）を、破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）として選択することができる。すなわち、本発明の１つの態様として、基質小胞へのｍｉＲ−１２５ｂの取り込み量の減少を指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）のスクリーニング方法が提供される。

【0039】

６−３．第３のスクリーニング方法
本発明の１つの態様として、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞による基質小胞の取り込みの変化を指標とする、破骨細胞形成および／または機能を調節する物質、若しくは骨疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法が提供される。
より具体的には、本発明は、被験物質の存在下または非存在下にて培養した破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を基質小胞により処置し、両条件下における破骨細胞前駆細胞または破骨細胞による基質小胞の取り込み量を測定、比較することを特徴とする、破骨細胞の形成および／または機能を調節する物質、若しくは骨疾患の予防および／または治療薬のスクリーニング方法を提供する。比較した結果、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の増加または減少があった場合には、これを指標として、前記被験物質が、破骨細胞の形成および／または機能を抑制若しくは促進する作用を有すると判断することができる。

【0040】

上記破骨細胞前駆細胞としては、破骨細胞に分化し得る単球・マクロファージ系細胞を含み、破骨細胞への分化が可能な破骨細胞前駆細胞であれば種や細胞株を問わず利用できる。また、破骨細胞前駆細胞を含む組織（骨組織等）も利用可能である。例えば、個体より調製した初代培養細胞や樹立された細胞株が利用できる。より具体的には、初代培養細胞（好ましくは、ヒト（例えばロンザジャパン、カタログ番号２Ｔ−１１０）、サル、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等の組織から調製）、ＲＡＷ２６４．７細胞またはＲＡＷ２６４．７細胞より樹立されたマクロファージ様細胞（ＲＡＷ−Ｄ細胞等）、ＭＯＣＰ−５細胞等が挙げられる。
上記破骨細胞としては、上記破骨細胞前駆細胞より分化誘導によって得られた細胞、または組織から単離した破骨細胞等が挙げられる。

【0041】

被験物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。また、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー等も被験物質として挙げられる。

【0042】

破骨細胞前駆細胞または破骨細胞による基質小胞の取り込みの測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
破骨細胞前駆細胞または破骨細胞を常法に従ってインビトロで培養する際に被験物質および標識された基質小胞を培地中に添加し、基質小胞の動態（取り込み）をリアルタイムイメージングによる手法を用いて定量、解析する。被験物質と基質小胞の添加タイミングは同じでも異なっていてもよい。

【0043】

・破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬の選択
破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の測定の結果、被験物質による破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の増加の変化と、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する作用、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療する活性とが相関付けられる。そして、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量を増加させた前記被検物質を、破骨細胞形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）として選択することができる。すなわち、本発明の１つの態様として、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の増加を指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を抑制する物質、若しくは骨量の低下によって特徴付けられる障害に対する予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）のスクリーニング方法が提供される。

【0044】

・破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬の選択
破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の測定の結果、被験物質による破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の減少の変化と、破骨細胞の形成および／または機能を促進する作用、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患を予防および／または治療する活性とが相関付けられる。そして、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量を減少させた前記被検物質を、破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）として選択することができる。すなわち、本発明の１つの態様として、破骨細胞前駆細胞または破骨細胞への基質小胞の取り込み量の減少を指標とする、破骨細胞の形成および／または機能を促進する物質、若しくは破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防および／または治療薬（またはそれらの候補物質）のスクリーニング方法が提供される。
本発明のスクリーニング方法において、ｍｉＲ−１２５ｂのかわりにその前駆体またはｍｉＲ−１２５ｂ若しくはｍｉＲ−１２５ｂの前駆体の変異体の発現量を測定することでも、ｍｉＲ−１２５ｂの発現変化は評価可能である。したがって、ｍｉＲ−１２５ｂの発現のかわりにｍｉＲ−１２５ｂの前駆体またはｍｉＲ−１２５ｂ若しくはｍｉＲ−１２５ｂの前駆体の変異体の発現を評価するスクリーニング方法も本発明には含まれる。

【0045】

本発明のスクリーニング方法における骨疾患とは、破骨細胞の分化および／または成熟異常に起因する骨代謝異常であり、骨量の低下によって特徴付けられる障害および破骨細胞の機能低下に起因する疾患を含む。
本発明のスクリーニング方法における骨量の低下によって特徴付けられる障害とは、例えば骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症等である。
本発明のスクリーニング方法における、破骨細胞の機能低下に起因する疾患とは、例えば、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化、骨化性筋炎等である。
本発明のスクリーニング方法により選択された物質は、前記した本発明の医薬組成物と同様にして製剤化することができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）に対して投与することができる。

【実施例】

【0046】

以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜細胞培養＞
マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は理研細胞バンクより、ヒト骨芽細胞（海綿骨由来）はＤＶ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社より入手した。マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ−Ｄ（細胞株ＲＡＷ２６４．７より樹立）は九州大学久木田教授より提供された。本発明で使用される細胞および組織（ヒト骨芽細胞以外）は、特に本明細書中に限定する主旨の記載がない限り、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）と抗生物質を添加したα−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ₂加湿インキュベーターで維持された。ヒト骨芽細胞の培養には、骨芽細胞用培地（ＤＶ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）が使用された。

【0047】

＜基質小胞の単離＞
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸存在下（分化誘導培地とも記載する）で３，０００細胞／ｃｍ²の密度で播種した。類骨様結節が形成されたら（２〜３週間）、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌコラゲナーゼ（２型、シグマアルドリッチ）で３７℃、１時間処置した。酵素処理後の消化物を回収し、２０，０００ｇで２０分間遠心分離し、遠心後細胞と細胞破片を除去した。その後、上清を１００，０００ｇで６０分間超遠心分離した。１００ｍＭマンニトール入り１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で沈殿物を再懸濁し、３５０，０００×ｇで３０分間超遠心分離した。基質小胞を含む沈殿物はＰＢＳで再懸濁され、使用に供されるまで−８０℃で保存された。

【0048】

実施例１：基質小胞による破骨細胞形成および機能抑制作用
実施例１.１：インビトロ破骨細胞形成アッセイ
破骨細胞前駆細胞として、マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭｓ）およびＲＡＷ−Ｄ細胞を使用した。
ＢＭＭｓは以下の方法により調製した。４〜６週齢の雄性ｄｄＹマウスの脛骨および大腿骨をフラッシュアウトすることにより骨髄を得て、そこから密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ^TM ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケア）によって単球／マクロファージ画分を回収した。２０ｎｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（組換えマウス、ぺプロテック）の存在下で一晩培養後、浮遊細胞を回収し、ＢＭＭｓとした。回収したＢＭＭｓを１２５，０００細胞／ｃｍ²の密度で播種後、１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（組換えヒト可溶性、ぺプロテック）および４０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの存在下または非存在下で培養した。
ＲＡＷ−Ｄ細胞は、非酵素的細胞ストリッパー溶液（メディアテック）を用いて回収し、２，２００細胞／ｃｍ²の密度で播種後、５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬの存在下または非存在下で培養した。
各細胞に基質小胞を処置する場合は、上記［基質小胞の単離］で単離した基質小胞を毎日各細胞に添加した。
播種６日後の各細胞を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を行い、５核以上のＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞として判定した（破骨細胞の判定は、以下の実験においても同様に行った）。

【0049】

基質小胞（０．８μｇ／ｍＬタンパク質）は、ＢＭＭｓ（図１）およびＲＡＷ−Ｄ（図２）において、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ（ＲＡＷ−Ｄ細胞はＭ−ＣＳＦ不要）依存的破骨細胞分化を抑制した。また、ＲＡＷ−Ｄ細胞を用い、基質小胞（０．４〜１．６μｇ／ｍＬタンパク質）の濃度依存性を確認した（図２）。

【0050】

実施例１.２：骨吸収窩（ピット）形成アッセイによる破骨細胞の機能解析
ＢＭＭｓを象牙片（和光純薬工業）をセットした９６ウエルプレートに１２５，０００細胞／ｃｍ²の密度で播種し、１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬおよび４０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの存在下または非存在下で２０日間培養した。基質小胞を処置する場合は、上記［基質小胞の単離］で単離した基質小胞（０．８μｇ／ｍＬタンパク質）を毎日細胞に添加した。培養後、骨吸収窩（ピット）形成を評価するため、象牙片をヘマトキシリンで染色し、イメージＪ１．４８ソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所）を用いて、骨吸収窩（ピット）の面積を測定した。その結果、基質小胞は、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ依存的骨吸収窩（ピット）形成を抑制した（図３）。

【0051】

実施例１.３：破骨細胞前駆細胞および破骨細胞における基質小胞の取り込みアッセイ
＜ラベル化基質小胞の単離＞
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）Ｄｉｌ ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｄ−２８２溶液（最終濃度５μＭ、ライフテクノロジーズ）を加えた培地で、３７℃、３０分間培養した。培養後、上記［基質小胞の単離］に従い、ラベル化基質小胞を単離した。
＜破骨細胞前駆細胞における基質小胞の取り込みアッセイ＞
ＲＡＷ−Ｄ細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュに２２００細胞／ｃｍ²の密度で播種し、１日培養後、上記で調製したラベル化基質小胞（０．８μｇ／ｍＬタンパク質）を添加した。添加後２４時間、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭシステム（エッセンバイオサイエンス）を用いてタイムラプスイメージングを行い、基質小胞の動態を観察した。
＜破骨細胞における基質小胞の取り込みアッセイ＞
ＲＡＷ−Ｄ細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュに２２００細胞／ｃｍ²の密度で播種後、ＲＡＮＫＬの存在下で３〜４日間培養し、破骨細胞（多核）を認めた後、上記で調製したラベル化基質小胞（０．８μｇ／ｍＬタンパク質）を添加した。添加後２４時間、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭシステム（エッセンバイオサイエンス）を用いてタイムラプスイメージングを行い、基質小胞の動態を観察した。

【0052】

その結果、基質小胞の時間依存的な蓄積（取り込み）がＲＡＷ−Ｄ細胞（破骨細胞前駆細胞）およびＲＡＷ−Ｄ細胞が分化した破骨細胞の両方において観察された。（それぞれの細胞の２４時間後のデータを図４に示す）。一方、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いてＲＡＷ−Ｄ細胞と同様の基質小胞取り込みアッセイを実施したが、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞では基質小胞の蓄積は観察されなかった（データは示していない）。これらの結果から、基質小胞の取り込みには細胞選択性があり、破骨細胞前駆細胞および破骨細胞が選択的に基質小胞を取り込む可能性が示唆された。
以上、実施例１から、基質小胞は破骨細胞前駆細胞または破骨細胞に取り込まれ、そこで破骨細胞形成抑制作用および破骨細胞機能抑制作用を発揮することが示された。

【0053】

実施例２：基質小胞に含まれるｍｉＲＮＡの網羅的解析
基質小胞に含まれるｍｉＲＮＡのプロファイリングを行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞由来の基質小胞中のｍｉＲＮＡは、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キット（アンビオン）を用いてキット添付の指示書に従い抽出された。抽出したｍｉＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈｙｂ ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー）およびＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｍｏｕｓｅ ｍｉＲＮＡマイクロアレイキット８×６０Ｋ Ｒｅｌ．１７．０（アジレント・テクノロジー）を用いてラベル化・ハイブリダイゼーションさせた。ｍｉＲＮＡプロファイリングは、アジレントＧ２５３９Ａマイクロアレイスキャナーおよび解析ソフトウェアＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸにより解析された。
その結果、１８００種のうち１７４種のｍｉＲＮＡが基質小胞に存在した。このうち、基質小胞での相対量が高く、ヒトおよびマウスに共通のｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１２５ｂおよびｌｅｔ−７ｃを選択した。

【0054】

実施例３：ｍｉＲ−１２５ｂの基質小胞への選択的輸送
選択した４つのｍｉＲＮＡについて骨芽細胞と基質小胞の相対量を比較した。
分化誘導培地で１４日間培養されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞およびその基質小胞からトータルＲＮＡを抽出した。標的マイクロＲＮＡの定量には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイを用い、内部標準としてＵ６およびｍiＲ−１６−５Ｐを使用した。ラット骨芽細胞は、胎生２１日Ｗｉｓｔａｒラット頭蓋冠より調製し、分化誘導培地で１４日間培養したものを使用した。ヒト骨芽細胞は分化誘導培地で２１日間培養したものを使用した。その結果、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、ｍｉＲ−１２５ｂは、基質小胞での量が細胞に比べ高かった（図５）。ラット骨芽細胞およびヒト骨芽細胞においても同様の結果が得られた。
これらの結果から、骨芽細胞においてｍｉＲ−１２５ｂは基質小胞に選択的に取り込まれ、基質小胞中に高いレベルで存在することが示された。

【0055】

実施例４：基質小胞処置後の破骨細胞前駆細胞におけるｍｉＲ−１２５ｂレベル
基質小胞（０．８μｇ／ｍＬタンパク質）を２４時間処置したＲＡＷ−Ｄ細胞からトータルＲＮＡを単離し、上記と同様の方法でｍｉＲ−１２５ｂの相対量を算出した。その結果、細胞中のｍｉＲ−１２５ｂレベルは、処置前に比べ約２．５倍増加した。

【0056】

実施例５：ｍｉＲ−１２５ｂによる破骨細胞形成抑制作用
実施例５．１：ｍｉＲ−１２５ｂのトランスフェクション
ＲＡＷ−Ｄ細胞および器官培養した頭頂骨にｍｉＲ−１２５ｂをトランスフェクションし、破骨細胞の形成を確認した。
ＲＡＷ−Ｄ細胞を２，２００細胞／ｃｍ²の密度で播種し一晩培養した。その後、細胞に、ＲＮＡｉマックス試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて１０ｎＭのｍｉＲ−１２５ｂ ｍｉｍｉｃ（アンビオン）またはコントロールｍｉＲＮＡをトランスフェクションした。８時間後、ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地に交換し、さらに５日間培養した。その後、ＴＲＡＰ染色に供した。
頭頂骨へのトランスフェクションは以下の方法により実施した。５週齢雄性ｄｄＹマウスから頭頂骨を採取し、矢状縫合から１ｍｍの位置から２ｘ２ｍｍ²のサイズの骨片を切り出した。ランダムに選択された４骨片をそれぞれ、２４ウエルプレートの各ウェルに入れ、５００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ存在下または非存在下で５日間培養した。ｍｉＲ−１２５ｂまたはコントロールＲＮＡ（各２００ｐｍｏｌｅ）と５μｌのＡｔｅｌｏＧｅｎｅ（登録商標）（高研）との混合液を１日おきに各骨片に添加した。培養後、各骨片を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳにより４℃で１時間固定し、厚さ８μｍの凍結切片を作成し、ＴＲＡＰ染色に供した。

【0057】

その結果、ｍｉＲ−１２５ｂをトランスフェクションしたＲＡＷ−Ｄ細胞において、ＲＡＮＫＬ依存的破骨細胞形成の抑制が観察された（図６）。また、同様の結果が、頭頂骨器官培養を用いた実験からも得られた。

【0058】

実施例５．２：ｍｉＲ−１２５ｂインヒビター強制発現の影響
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を４８ウエルプレートに２，０００細胞／ｃｍ²の密度で播種した。５０％コンフリューエントに達したとき、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標） Ｌｅｎｔｉ ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（シグマアルドリッチ）を用いて、ｍｉＲ−１２５ｂ阻害剤（Ｔｏｕｇｈ Ｄｅｃｏｙ ＲＮＡ）またはネガティブコントロール１を感染多重度（ＭＯＩ）１０〜２０で一晩感染させた。２．５μｇ／ｍｌピューロマイシン含有培地に交換し、ｍｉＲ−１２５ｂインヒビターまたはコントロールＲＮＡを安定発現するクローンのセレクションを行った。また、定量ＰＣＲ分析で陽性と判断されたクローンについては、分化誘導培地で維持し、骨様結節の形成後基質小胞を回収した。

【0059】

両安定発現細胞間において、増殖および分化に際立った違いは見られなかった。一方、ｍｉＲ−１２５ｂインヒビターの強制発現は、基質小胞のＡＬＰ、アネキシンＶといったマーカータンパク質レベルは変化させずに、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲによるｍｉＲ−１２５ｂの検出レベルを約７０％減少させた。両細胞由来の基質小胞を用いて、破骨細胞形成アッセイを実施した。ｍｉＲ−１２５ｂインヒビター強制発現細胞由来またはコントロール細胞由来の基質小胞をそれぞれＲＡＷ−Ｄ細胞にＲＡＮＫＬ存在下または非存在下で４日間投与し、ＴＲＡＰ染色に供した。その結果、ｍｉＲ−１２５ｂインヒビター強制発現細胞由来の基質小胞を投与されたＲＡＷ−Ｄ細胞ではコントロール細胞由来の基質小胞を投与された細胞に比べて、破骨細胞数の形成が多かった（図７）。この結果から、ｍｉＲ−１２５ｂ機能欠損は、基質小胞がもつ破骨細胞形成抑制能力を低下させること、すなわち基質小胞による破骨細胞形成抑制効果は、基質小胞中のｍｉＲ−１２５ｂを介して発揮されることが示された。

【0060】

実施例５．３：ｉｎ ｖｉｖｏ破骨細胞形成アッセイ
マウスＬＰＳ（リポポリサッカライド）惹起骨融解モデルを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍｉＲ−１２５ｂの破骨細胞形成に対する抑制効果を検証した。本モデルは、ＬＰＳをマウス頭蓋冠に投与し、破骨細胞分化・骨破壊を誘導する動物モデルである。
ＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ体重）を８週齢雄性ｄｄＹマウス頭蓋冠上に１日おきに皮下投与した。０日目および３日目に、ｍｉＲ−１２５ｂまたはコントロールＲＮＡ（各７ｎｍｏｌｅ）と７０μｌのＡｔｅｌｏＧｅｎｅ（登録商標）との混合液をＬＰＳ投与箇所近傍に皮下注射した。また、１日目と５日目にカルセイン（１００μｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与した。ＬＰＳ投与から１週間後、頭蓋冠は、ホールマウントＴＲＡＰ染色に供された。

【0061】

その結果を図８に示す。ｍｉＲ−１２５ｂを投与されたマウス頭蓋冠ではコントロールＲＮＡを導入されたマウス頭蓋冠に比べてＴＲＡＰ陽性破骨細胞数が減少していた。本結果から、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、ｍｉＲ−１２５ｂの破骨細胞形成抑制作用が示された。
実施例５から、ｍｉＲ−１２５ｂは破骨細胞形成抑制作用を有すること、およびｍｉＲ−１２５ｂは基質小胞を介して破骨細胞前駆細胞または破骨細胞に運ばれてその作用を発揮することが示された。

【産業上の利用可能性】

【0062】

本発明によれば、破骨細胞形成および／または機能抑制剤、並びに破骨細胞形成および／または機能促進剤が提供される。また、本発明によれば、骨リモデリングを制御する薬剤のスクリーニング法が提供される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図4】

【配列表】

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