特開 2018-179946 Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2018-179946(P2018-179946A)

(43)【公開日】2018年11月15日

(54)【発明の名称】Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性評価方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20181019BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20181019BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20181019BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   C12Q1/04

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2017-84803(P2017-84803)

(22)【出願日】2017年4月21日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 〔ウェブサイトによる公開〕 電気通信回線発表：平成２８年１０月２５日 掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｂｓｊ２０１６／ 掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｈｙｓ．ｊｐ／ｄｌ／ｐｒｏ／５４ｔｈ＿ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．ｐｄｆ（予稿集Ｗｅｂ版，Ｓ１９２頁） 〔刊行物による公開〕 刊行物名 ：第５４回日本生物物理学会年会予稿集 発行日 ：平成２８年１０月２５日 発行人 ：一般社団法人 日本生物物理学会 該当頁 ：第Ｓ８７頁、１Ｐｏｓ１０４ 〔集会での発表による公開〕 研究集会名 ：第５４回日本生物物理学会年会 主催者名 ：一般社団法人 日本生物物理学会 公開日 ：平成２８年１１月２５日 公開場所 ：つくば国際会議場 文書の種類 ：ポスター

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「医療分野研究成果展開事業・先端計測分析技術・機器開発プログラム」「細胞内１分子スクリーニングシステムの開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】柳川 正隆

(72)【発明者】

【氏名】佐甲 靖志

(72)【発明者】

【氏名】廣島 通夫

(72)【発明者】

【氏名】安井 真人

(72)【発明者】

【氏名】上田 昌宏

(72)【発明者】

【氏名】冨樫 祐一

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QR77

4B063QS03

4B063QS15

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を標的とした薬物評価方法を提供することを目的とする。
【解決手段】GPCRを細胞膜上に発現する細胞と目的物質とを接触させる工程と、前記細胞膜上におけるGPCRの拡散動態を決定する工程とを含む、GPCRの活性評価方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を細胞膜上に発現する細胞と目的物質とを接触させる工程と、
前記細胞膜上におけるGPCRの拡散動態を決定する工程と、
を含む、GPCRの活性評価方法。

【請求項2】

GPCRがそのC末端に蛍光標識を含む、請求項１記載の方法。

【請求項3】

拡散動態を、平均二乗変位又は平均拡散係数として決定する、請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

陰性対照と比較して拡散動態が遅いことは、目的物質がGPCRアゴニストであることを示し、又は陰性対照と比較して拡散動態が速いことは、目的物質がGPCRインバースアゴニストであることを示す、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Gタンパク質共役型受容体(以下、「GPCR」と称する)の活性評価方法に関する。

【背景技術】

【0002】

GPCRは、創薬の標的として主要な位置を占める膜タンパク質の総称である。現時点で33％の低分子薬は何らかのGPCRを標的としており、年間20兆円規模の市場を形成しているが、標的になっている受容体はヒトが持つ約800種のGPCRのうち6％に過ぎない(非特許文献１及び２)^1,2。特に、創薬の標的として高い潜在性をもつ300種のGPCRのうち、100種程度は生理的リガンドが未知のオーファン受容体である。効率よくオーファンGPCRのリガンドを同定できれば、各オーファンGPCRに対するファーストインクラスとなる化合物創出につながる。

【0003】

従来において、GPCRを標的とした培養細胞レベルでの薬効評価は、Ca²⁺やcAMPの増減といったGPCRの下流の細胞応答を指標として行われてきた(非特許文献３)³。しかしながら、オーファンGPCRのほとんどは下流のシグナル伝達経路が未知であり、何を指標に薬効評価すればよいのか分からない場合が多い。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Tang, X.L., Wang, Y., Li, D.L., Luo, J. & Liu, M.Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacol Sin 33, 363-71 (2012).

【非特許文献2】Santos, R. et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nat Rev Drug Discov 16, 19-34 (2017).

【非特許文献3】Zhang, R. & Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin 33, 372-84 (2012).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、上述の実情に鑑み、GPCRを標的とした効率的な薬物評価方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、生細胞表面上の分子を1分子のレベルでイメージングする技術を応用してGPCR分子の拡散動態を定量することで、様々なGPCRに対する薬効評価が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0007】

すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）GPCRを細胞膜上に発現する細胞と目的物質とを接触させる工程と、前記細胞膜上におけるGPCRの拡散動態を決定する工程とを含む、GPCRの活性評価方法。
（２）GPCRがそのC末端に蛍光標識を含む、（１）記載の方法。
（３）拡散動態を、平均二乗変位又は平均拡散係数として決定する、（１）又は（２）記載の方法。
（４）陰性対照と比較して拡散動態が遅いことは、目的物質がGPCRアゴニストであることを示し、又は陰性対照と比較して拡散動態が速いことは、目的物質がGPCRインバースアゴニストであることを示す、（１）〜（３）のいずれか１記載の方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、GPCRを標的とした薬物を効率的に同定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】mGluRの活性化モデル、1分子蛍光画像及びMSD-Δtプロットを示す。(ａ) mGluRの活性化モデル：mGluR1のECDのX線結晶構造(不活性状態 青: 1EWT, 活性状態 赤: 1EWK)をPyMol (http://www.pymol.org/)を用いて描画した。膜貫通領域(TMD)は共に4OR2を描画に用いた。(ｂ) TMR標識したmGluR3の全反射蛍光顕微鏡画像例(左: 細胞の全体像, 右: 左パネルの点線部の拡大図)：1分子追跡(SMT)解析結果のmGluR3の軌跡を右パネルに黄色で示した。(ｃ−ｅ) 様々なリガンド条件下におけるmGluR3の軌跡のMSD-Δt プロット：インバースアゴニスト(LY341495)濃度依存的変化を(ｃ)に示した。100 nM LY314195存在下におけるアゴニスト(LY379268)依存的変化を(ｄ)に示した。(ｄ)のリガンド条件に加え、さらに1 μM MNI137を添加した際のプロットを(ｅ)に示した。全てのデータは平均値±標準誤差(n=20細胞)で表示した。^*リガンド濃度5条件間での各ΔtにおけるMSDの有意な変化(p < 0.01; one-way ANOVA)。

【図2】HaloTag融合mGluR3へのTMRリガンドの飽和結合実験を示す。(ａ) 異なる濃度のHaloTag TMRリガンドの蛍光スペクトル。(ｂ) (ａ)の蛍光スペクトルの584 nmの輝度に基づくTMRの濃度推定用の回帰直線。(ｃ) 細胞可溶化上清中のTMR濃度から見積もられるHaloTag融合mGluR3へのTMRリガンドの特異的結合と細胞膜への非特異的結合。細胞膜に結合したTMRリガンドの濃度は(ｂ)の回帰直線から推定した。1分子イメージングには300 nM TMRリガンドを用いた(垂直の点線)。回帰曲線(EC₅₀: 63 nM, Hill coefficient: 1.9)から、同条件下では約95％のmGluR3が標識されていると推定される。(ｄ) 全反射蛍光顕微鏡画像におけるHEK293細胞又はカバーガラスへのTMRリガンドの非特異的結合の確認。画像は図１ｂと同様の処理を行ったものを表示した。

【図3】HaloTag融合のmGluR3の機能への影響の評価を示す。(ａ) C末端にHaloTagを融合したmGluR3(cHalo)と野生型mGluR3(WT)を発現した細胞膜画分のウェスタンブロット解析。メルカプトエタノール(ME)不含のSDSサンプルバッファーで可溶化した際、二量体のバンドが認められる(左パネル)。MEを含むSDSサンプルバッファーで可溶化した際はmGluR3のECD間を架橋するジスルフィド結合が還元され、単量体のバンドが検出される(右パネル)。(ｂ, ｃ) HaloTag融合の有無によるmGluR3のリガンド結合能の比較。[³H]-LY341495の飽和結合実験(ｂ)においても、[³H]-LY341495とLY379268の競合阻害実験(ｃ)においてもHaloTagの有無による有意な差は認められなかった。(ｄ) HaloTag融合の有無によるmGluR3のGタンパク質活性化能の比較。リガンド非存在下、1 μM LY341495、100 μM LY379268存在下のいずれにおいてもWTとcHaloの間で有意な差は認められなかった。(ｂ‐ｄ)のデータは平均値±標準誤差(n = 3)で表示した。

【図4】mGluR3の拡散係数・リガンド結合能・Gタンパク質活性化能の比較を示す。(ａ, ｂ) D_Avのリガンド濃度依存的変化：他のリガンドがない条件下におけるLY341495-(■)及びLY379268-(●)濃度依存的変化を(ａ)に示した。100 nM LY341495存在下且つMNI137非存在下(●)、又は100 nM LY341495存在下且つ1 μM MNI137存在下(■)におけるLY379268濃度依存性を(ｂ)に示した。全てのデータは平均値±標準誤差(n=20細胞)で表示した。^*(ａ)の各曲線内で最も左の点に対する有意差が認められた点 (p < 0.01; t-test, two-tailed)。^**(ｂ)の2曲線間(1 μM MNI137存在・非存在下)において有意差が認められた点(p < 0.01; t-test, two-tailed)。(ｃ, ｄ) [³H]-LY341495結合量のリガンド濃度依存性：[³H]-LY341495の飽和結合(ｃ, □)。MNI137非存在下(ｃ, ｄ, 〇)又は1 μM MNI137存在下(ｄ, □)における、mGluR3への100 nM [³H]-LY341495結合のLY379168濃度依存的な競合阻害の定量結果。全てのデータは平均値±標準誤差(n=3)で表示した。同日に調製したmGluR3発現膜画分の解析結果を同一のパネルに表示した。^*(ｃ)の各曲線内で最も左の点に対する有意差が認められた点 (p < 0.01; t-test, two-tailed)。(ｄ)において1 μM MNI137の有無による有意な差は認められなかった(p > 0.05; t-test, two-tailed)。(ｅ, ｆ) mGluR3発現膜画分によるGタンパク質活性化効率のリガンド濃度依存性：他のリガンドがない条件下におけるLY341495-(■)及びLY379268-(●)濃度依存的変化を(ｅ)に示した。100 nM LY341495存在下且つMNI137非存在下(●)、又は100 nM LY341495存在下且つ1 μM MNI137存在下(■)におけるLY379268濃度依存性を(ｆ)に示した。〇と□はmockトランスフェクションした形質膜画分によるGタンパク質活性化効率を同リガンド条件下で測定したネガティヴコントロールである。全てのデータは平均値±標準誤差(n=3-5)で表示した。^*, ^#(ｅ)の各曲線内で最も左の点に対する有意差が認められた点(^* p < 0.01, ^# p < 0.03; t-test, two-tailed). ^**(ｆ)の2曲線間(1 μM MNI137存在・非存在下)において有意差が認められた点(p < 0.01; t-test, two-tailed)。(ｇ) 一定濃度の各リガンドの有無(+/-)によるD_AvとGタンパク質活性化効率の比較(+: 100 μM LY379268, 100 nM LY341495, 1 μM MNI137)。100 nM LY341495存在下且つ他のリガンドがない条件を0％として、100 μM LY379268存在下且つ他のリガンドがない条件を100％として全てのデータを規格化した。全てのデータは平均値±標準誤差(D_Av: n = 20細胞, Gタンパク質活性化効率: n=3-5)で表示した。

【図5】mGluR3の軌跡のVB-HMM解析を示す。(ａ) 図１ｂの軌跡の各ステップを4つの拡散状態で分類した。immobile, slow, medium, fastの各拡散状態を青、黄、緑、赤でそれぞれ示した。(ｂ) 全軌跡の30.5 ms間の変位のヒストグラム(黒棒; 28,092ステップ・573軌跡)が、VB-HMM解析の結果4つの拡散状態に分類された。immobile, slow, medium, fastの各拡散状態をそれぞれ示した。各状態の変位のヒストグラムは方法の式6によってフィッティングした。(ｃ, ｄ) 各拡散状態の割合のリガンド濃度依存的変化。LY341495濃度依存的変化を(ｃ)に示した。100 nM LY314195存在下におけるLY379268濃度依存的変化を(ｄ)に示した。immobile, slow, medium, fastの各拡散状態をそれぞれ示した。全てのデータは平均値±標準誤差(n=20細胞)で表示した。^*各曲線内で最も左の点に対する有意差が認められた点(p < 0.01; t-test, two-tailed)。(ｅ) 不活性(1 μM LY314195)・活性(100 μM LY379268, 100 nM LY341495)リガンド条件下におけるmGluR3の4つの拡散状態間の遷移ダイアグラム。各拡散状態の拡散係数と割合を円の隣に記載した。円の大きさは割合を反映している。また、標準誤差(n=20細胞)は括弧内に記載した。各状態間の矢印の長さは図７の時定数から計算した速度定数を反映している。図７において2条件間で時定数に有意な差が認められた状態遷移については太字の矢印で図示した。^*不活性なリガンド条件に対して、有意な変化が認められた拡散係数と割合(p < 0.01; t-test, two-tailed)。

【図6】mGluR3の軌跡のVB-HMM 解析例を示す。(ａ) mGluR3分子1軌跡における各フレーム間の変位の時系列変化(tracking data)を2, 4, 6状態モデルでクラスタリング解析した結果をそれぞれ示す。(ｂ) 同一細胞のデータを異なる状態数でクラスタリング解析した時の尤度比較。最も高い変分下限を示す状態数が、VB-HMM解析では最も確からしいと推定される。インセットに3-6状態モデルでクラスタリング解析した際の拡大図を示す。4状態モデルが最も高い変分下限を示した。(ｃ-ｆ) 図５ａ, ｂと同じ細胞のデータの各拡散状態のMSD-Δtプロット。(ｃ) fast及び(ｄ) medium状態ではプロットが直線的であり、受容体の運動の平均としては自由拡散と区別がつかない。一方、(ｅ) slow及び(ｆ) immobile状態では上に凸の形状を示し、受容体が制限拡散をしていることが示唆される。データは平均値±標準誤差(immobile: 7760ステップ, slow: 5278ステップ, medium: 7009ステップ, fast: 4708ステップ)で表示した。(ｇ) mGluR3と同条件下で計測したTMR標識CD86の輝度分布: 単量体のコントロール。(ｈ) 図５ａ, ｂと同一細胞におけるTMR標識mGluR3の輝度分布。immobile, slow, medium, fastの各拡散状態及び全軌跡のデータをそれぞれ示した。(ｇ,ｈ)の輝度分布ヒストグラムはガウス関数の和でフィッティングした(方法、式7)。

【図7】拡散状態間遷移の時定数のリガンド濃度依存的変化を示す。VB-HMM解析の1フレーム間(30.5 ms)での状態遷移確率から拡散状態間の遷移の時定数を推定した。(ａ, ｂ) LY341495濃度依存性及び(ｃ, ｄ) 100 nM LY314195存在下におけるLY379268濃度依存性。(ａ, ｃ) より遅い拡散状態からより速い拡散状態への遷移の時定数。(ｂ, ｄ) (ａ, ｃ)の逆反応の時定数。全てのデータは平均値±標準誤差(n = 20細胞)で示した。^*各曲線内で最も左の点に対する有意差が認められた点 (変化率が3％以上且つp < 0.01; t-test, two-tailed)。

【図8】各拡散状態の拡散係数のリガンド濃度依存的変化を示す。VB-HMM解析の1フレーム間(30.5 ms)の変位から推定した各拡散状態の拡散係数。LY341495濃度依存性を（ａ）fast, (ｂ) medium, (ｃ) slow, (ｄ) immobileの状態ごとに示した。100 nM LY314195存在下におけるLY379268濃度依存性を(ｅ) fast, (ｆ) medium, (ｇ) slow, (ｈ) immobileの状態ごとに示した。全てのデータは平均値±標準誤差(n = 20細胞)で示した。^*各曲線内で最も左の点に対する有意差が認められた点 (p < 0.01; t-test, two-tailed)。

【図9】PTX処理がmGluR3の拡散動態に与える影響を示す。(ａ) PTX処理がGPCR/ G_i/oタンパク質間相互作用に与える影響のスキーム図。PTX処理がない場合、不活性状態においても一定量のGPCRはG_i/oタンパク質とプレカップルしている。GPCRの活性化に伴い、G_i/oタンパク質のGDP/GTP交換反応が促進され、G_i/oがGPCRから解離する。GPCRが活性状態にある間は、複数のG_i/oとの一次的な結合・解離を繰り返し、酵素反応を促進する。一方、PTX処理後は、G_i/oタンパク質がADPリボシル化されることで、不活性・活性条件の両方でGPCR/ G_i/oタンパク質間相互作用の一切が阻害されてしまう。図中の結晶構造(GPCR : 4OR2, 三量体Gタンパク質: 1GP2, Gαサブユニット: 1GIA, PTX: 1PRT)はPyMolを使って描画した。(ｂ‐ｅ) PTX処理の有無によるmGluR3の軌跡のMSD-Δtプロットの比較。不活性なリガンド条件(100 nM LY314195)と活性なリガンド条件(100 μM LY379268)におけるMSD-Δtプロットを(ｂ),(ｃ)にそれぞれ示した。同リガンド条件下においてPTX Bオリゴマー処理の有無によるMSD-Δtプロットの比較を(ｂ),(ｃ)にそれぞれ示した。^*vehicle処理時と比較してMSDに有意差が見られた点 (p < 0.01; t-test, two-tailed)。(ｆ, ｇ) (ｂ‐ｅ)と同一の軌跡においてVB-HMM解析から推定された拡散状態の割合の比較。不活性なリガンド条件下での比較を(ｆ)に、活性なリガンド条件下での比較を(ｇ)に示す。^* vehicle処理時と比較して割合に有意差が見られた点(p < 0.01; t-test, two-tailed)。(ｂ‐ｇ)の実験結果は全て平均値±標準誤差(n=20細胞)で表示した。

【図10】mGluR3とCLCの共局在解析を示す。(ａ) mGluR3がCCPにおいてクラスターを形成しエンドサイトーシスされるスキーム図。(ｂ) TMR標識したmGluR3(赤)とGFP標識したCLC(緑)の共局在の代表例。0.34秒以降にmGluR3がCLCとの共局在が確認される。(ｃ) (ｂ)の赤と緑の矢印で示した粒子の輝度変化。TMR標識mGluR3の輝度がGFP標識CLCと共局在するのと同期して輝度が急速に高まり、4.5秒以降にTMR・GFPの輝度が同時に下がる。(ｄ) VB-HMM解析から推定された拡散状態の割合の比較。不活性なリガンド条件(100 nM LY314195)と活性なリガンド条件(100 μM LY379268)におけるmGluR3の全軌跡から推定した各拡散状態の割合を網掛け棒グラフでそれぞれ示した。CLCと共局在しているmGluR3の軌跡から推定した各拡散状態の割合を黒塗り又は白抜き棒グラフでそれぞれ示した。(ｅ) 不活性なリガンド条件(100 nM LY314195)と活性なリガンド条件(100 μM LY379268)において、CLCと共局在しているmGluR3の軌跡の全軌跡に対する割合を示した。(ｆ, ｇ) 不活性なリガンド条件(LY341495)と活性なリガンド条件(LY379268)において、mGluR3とCLCの共局在時間の累積度数分布を比較した。(ｆ)のカーブは2成分の指数関数(方法、式8)でフィッティングし、時定数と成分比(inset)を(ｇ)に示した。ｄ−ｇの全てのデータは平均値±標準誤差(不活性条件: n=15細胞, 活性条件: n=18細胞)で表示した。^*各条件間の有意差 (p < 0.01; t-test, two-tailed)。

【図11】アゴニスト刺激によるGPCRの軌跡のMSD-Δtプロットの変化を示す。HEK293細胞においてSTELLA Fluo 650標識をした(ａ) ADRB2, (ｂ) HTR2A, (ｃ) HRH1, (ｄ) ADORA2A, (ｅ) FFAR4, (ｆ) CXCR4, (ｇ) F2R, (ｈ) GCGRのMSD-Δtプロット。各受容体においてアゴニスト添加時のプロットを■で、vehicle添加時のプロットを●で示す。全てのデータは平均値±標準誤差(n = 20細胞)で示した。^*, ^#各Δtにおいて刺激依存的な有意差が認められた点(^*p < 0.01, ^#p < 0.03; t-test, two-tailed)。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0011】

本発明に係るGPCRの活性評価方法(以下、「本方法」と称する)は、GPCRを細胞膜上に発現する細胞と目的物質とを接触させる工程と、該細胞膜上におけるGPCRの拡散動態を決定する工程とを含むものである。本発明は、GPCRの活性状態と細胞膜上におけるGPCRの拡散動態とが相関することを見出したことに基づくものである。本方法によれば、GPCR自体の運動を指標にするため、下流が未知のオーファンGPCRであっても薬効評価が可能である。また、本方法によれば、各GPCRが関連する疾患に対する予防又は治療剤を同定することができる。本発明を、候補物質の中からGPCRを標的とする薬物をスクリーニングするために使用することができる。

【0012】

本明細書において「Gタンパク質共役型受容体」（「GPCR」ともいう）とは、Gタンパク質と共役して細胞内に外界からのシグナルを伝達する受容体を指す。GPCRは細胞膜を7回貫通する共通した構造を有し、GPCRスーパーファミリーを構成する。GPCRはアミノ酸配列や機能の類似性に基づいてA〜Fの6つのクラスに分類されている。GPCRは、例えば哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトに由来する。

【0013】

GPCRとしては、GPCRスーパーファミリーに属するいずれのGPCRであって良く、例えば下記の表１に示すGPCRのように系統樹において離れた進化的に多様なGPCRを標的とすることができる。また、Gタンパク質の共役特異性も問わないため、複数のシグナル伝達系を駆動するF2R等のGPCRについても単一の指標で薬効を評価できる。

【0014】

本方法では、先ずGPCRを細胞膜上に発現する細胞を準備する。細胞としては、GPCRを細胞膜上に発現できるものであれば任意の細胞を用いることができるが、細胞は例えば真核生物由来、好ましくは脊椎動物由来、より好ましくは哺乳動物由来、さらに好ましくは霊長類由来、最も好ましくはヒト由来である。また、発現させようとするGPCRを発現しておらず、かつ共役するGタンパク質を発現している細胞が好ましく用いられる。例えばHEK293細胞等のヒト由来の細胞株や初代細胞等が挙げられる。また、GPCRは、1分子イメージングのため、蛍光標識を含むことが好ましい。蛍光標識はGPCRの任意の位置に付加することができるが、好ましくはC末端に付加される。蛍光標識としては、例えばmEGFP等の蛍光タンパク質を用いることができ、あるいは、タグ配列（例えば、HaloTag・SNAP-tag・CLIP-tag）を付加して蛍光リガンドを共有結合させることもできる。蛍光タンパク質または蛍光リガンドが共有結合したタグ配列を蛍光標識として使用する場合には、N末端からC末端の方向にGPCRと蛍光タンパク質またはタグ配列とを含む融合タンパク質を細胞膜上に発現させる。C末端に蛍光標識した場合、発現した融合タンパク質における蛍光タンパク質またはタグ配列は、細胞膜内側に存在する。

【0015】

例えば、GPCRと蛍光タンパク質またはタグ配列とを含む融合タンパク質をコードする遺伝子又は当該遺伝子を含む発現ベクターを、常法により細胞にトランスフェクトし、当該融合タンパク質を細胞膜上に発現させる。ここで、発現量が過剰であると、発現した標識GPCRのうち一部のみがシグナル伝達に関与し、それ以外が目的物質との接触に際して応答を示さず、結果として正確な拡散動態の観察が困難になることから、発現レベルは低レベルにすることが好ましい。例えば、細胞内において数nM以下の発現レベルとすることが好ましい。発現レベルはトランスフェクト時に添加する発現ベクターの量および発現ベクターのプロモーター強度で調整する。低発現ベクターとしては、例えばpFC15ベクター (Promega)等のCMVプロモーター改変ベクターが使用できる。

【0016】

次いで、GPCRを細胞膜上に発現する細胞と目的物質とを接触させる。接触に際してGPCRの活性に及ぼす効果を調べようとする目的物質としては、任意の物質を用いることができ、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、合成化合物、微生物の培養上清、植物由来の天然成分、植物抽出物、動物組織抽出物等が挙げられる。また、接触とは、GPCR活性に目的物質が影響を及ぼすことが可能な状態、好ましくは目的物質がGPCRに結合可能な状態を意味する。例えば、GPCR発現細胞用培地に目的物質を添加するだけでもよい。あるいは、目的物質をある種のキャリアー物質(タンパク質や脂質等)と共にGPCR発現細胞用培地に添加してもよい。また、GPCR発現細胞にマイクロインジェクション等で目的物質を直接導入してもよい。

【0017】

次いで、細胞膜上におけるGPCRの拡散動態(拡散運動)を決定する。好ましくは、GPCRに付加した蛍光標識を指標に拡散動態を決定する。蛍光標識としてHaloTagを使用した場合には、HaloTag TMR ligand(Promega)やSTELLA Fluo 650 HaloTag ligand (Goryo Chemical)等により染色する。GPCRの拡散動態の決定には任意の公知の方法を用いることができるが、本発明の目的のためにはGPCRの拡散動態を1分子のレベルで追跡する必要があるため、1分子イメージングが可能な方法が用いられる。具体的には、蛍光顕微鏡下、全反射照明を用いて目的物質接触後の細胞の細胞膜上のGPCRに付加した蛍光標識を励起し、1分子イメージングを行う。次いで、撮影した蛍光画像から、GPCRの拡散動態を求める。具体的には、撮影した蛍光画像に対して、2次元ガウス関数フィッティング法などの輝点検出アルゴリズムを用いて、GPCR分子の輝点の位置・輝度情報を取得する。さらに、時系列画像について一定の閾値下で最近接に位置する輝点をつなぐなどして、各輝点の軌跡の情報を取得する。さらに、下記の実施例の「３−４．1分子イメージング画像の解析」の節に示す式により、各細胞におけるGPCR分子の軌跡の平均二乗変位(MSD)又は平均拡散係数(D_Av)を計算して拡散動態を表す。細胞膜上におけるGPCRの拡散動態が遅いことは、GPCRの活性状態を意味し、一方、GPCRの拡散動態が速いことは、GPCRの不活性状態を意味する。従って、陰性対照(例えば、目的物質と非接触の細胞やvehicleと接触させた細胞)と比較して、細胞膜上におけるGPCRの拡散動態(MSD又はD_Av)が遅いことは、目的物質がGPCRアゴニストであることを示し、また、陰性対照と比較して、細胞膜上におけるGPCRの拡散動態が速いことは、目的物質がGPCRインバースアゴニストであることを示すと判断することができる。対照との平均拡散係数の差異は10〜50%程度が見込まれるが、好ましくは統計的有意性に基づいて判断される。この目的のためにはより多くの細胞についての結果を得ることが好ましいが、一方、多数の目的物質について評価する場合は収集するデータの量は少ない方が好都合である。例えば10〜100細胞、好ましくは15〜50細胞、より好ましくは20〜30細胞についてGPCRの拡散動態を調べる。二群間の拡散係数の平均値の差の判定基準としてt検定でp<0.05、より好ましくはp<0.01の有意差が慣習的に用いられる。

【実施例】

【0018】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0019】

１．結果
１−１．mGluR3の平均拡散係数・リガンド親和性・Gタンパク質活性化能の連関
本実施例ではまず、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR3)をモデルとして、生細胞膜上のGPCRの拡散係数と活性の連関を検証した。mGluRはClass C GPCRの一員であり、N末端に大きな細胞外リガンド結合領域(ECD)を持ち、常に2量体を形成して機能する(図１ａ)。C末端にHaloTagを融合したmGluR3をHEK293細胞に発現させ、全反射蛍光顕微鏡を用いて生細胞膜上での蛍光標識mGluR3分子の輝点の運動を計測した(図１ｂ)。本実験条件下では、約95％のHaloTag融合mGluR3がtetramethylrhodamine(TMR)標識されていると推定された(図２)。なお、mGluR3に対するHaloTag融合が二量体化・リガンド結合能・Gタンパク質活性化能に影響を与えないことは生化学的に確認済であった(図３)。

【0020】

様々なリガンド条件下で20細胞ずつ同様の1分子イメージングを行い、各受容体分子の輝点を追跡した。さらに、各受容体分子の軌跡から「平均二乗変位-時間間隔プロット(MSD-Δtプロット)」を作成し、リガンド濃度依存的な受容体の拡散範囲の平均値の変化を解析した(図１ｃ−ｅ)。その結果、インバースアゴニストLY341495濃度依存的にmGluR3のMSDが上昇したのに対し(図１ｃ)、アゴニストLY379268濃度依存的にMSDの低下が認められた。さらに、ネガティヴアロステリックリガンドMNI137⁴存在下ではLY379268依存的なMSDの低下が抑制された(図１ｅ)。

【0021】

上記のMSD-Δt plotからmGluR3分子の拡散係数の平均値D_Avを計算し、各リガンド濃度に対してプロットした(図４ａ, ｂ)。他のリガンドがない時、D_AvはLY341495濃度依存的に上昇し、LY379268濃度依存的に低下した(図４ａ)。また、100 nM LY341495存在下においては、LY379268濃度依存的なD_Avの低下はより著明に認められた。一方で、さらに1 μM MNIを添加した条件下ではLY379268濃度依存的なD_Avの低下は抑制され、有意な変化は認められなかった(図４ｂ)。続いて、D_Avの変化の濃度依存性とリガンド親和性の関係を検証するために、mGluR3を発現したHEK293膜画分を用いて同様のリガンド条件下で[³H]-LY341495結合実験を行った。LY341495依存的なD_Avの変化のEC₅₀ (28.2 ± 0.9 nM in 図４ａ, mean ± SEM, n = 20 cells)は[³H]-LY341495の結合親和性 (47.4 ± 1.7 nM in 図４ｃ, n = 3)と近い値を示した。また、LY379268依存的なD_Avの変化のIC₅₀は100 nM LY341495の有無にかかわらず同程度の値を示したが(1.19 ± 0.02 and 1.03 ± 0.08 μM in 図４ａ and図４ｂ, respectively, n = 20 cells)、これらの値はLY379268と100 nM [³H]-LY341495の競合結合実験から推定されるLY379258のmGluR3への親和性(0.55 ± 0.08 μM in 図４ｃ, n = 3)と2倍も違わない値であった。従って、mGluR3のD_Avのリガンド濃度依存性はリガンド結合親和性によく対応していた。また、1 μM MNI137はLY379268の結合親和性に影響を及ぼさなかった(図４ｄ)。

【0022】

続いて、mGluR3を発現したHEK293膜画分と精製したG_oタンパク質を用いて [³⁵S]-GTPγS結合実験を行い、mGluR3のGタンパク質活性化能のリガンド濃度依存性を解析した(図４ｅ, ｆ)。その結果、mGluR3はリガンドがない条件下でも非常に高いGタンパク質活性化能を示し、この構成的活性はLY341495濃度依存的に抑制されることがわかった(図４ｅ)。この結果は、mGluR3のECDに塩化物イオンが結合することが高い構成的活性の要因となっているという過去の知見と一致した^5,6。従って、図４ａで見られたリガンド依存的なD_Avの変化は、生細胞膜上におけるmGluR3分子の不活性状態と活性状態の割合のリガンド依存的な変化を反映したものであると考えられた。さらに、1 μM MNI137はLY379268依存的なGタンパク質活性化能上昇を抑制することが確認されており(図４ｆ)、これは1 μM MNI137添加によるD_Avの変化抑制(図４ｂ)とよく対応した。

【0023】

一方、LY341495依存的なmGluR3のGタンパク質活性化能の抑制のIC₅₀ (2.11 ± 0.18 nM in 図４ｅ, n = 3)は、上記のD_Avの変化の濃度依存性やリガンド親和性と比べて1桁低い値を示した。また、他のリガンドがない条件下では、LY379268依存的なmGluR3のGタンパク質活性化能の上昇のEC₅₀ (0.025 ± 0.0029 μM in 図４ｅ, n = 3)は、上記のD_Avの変化の濃度依存性やリガンド親和性と比べて2桁低い値を示した。一般に、受容体の下流の変化を計測する従来の手法のリガンド濃度依存性(EC₅₀/IC₅₀)はリガンド親和性と比べて低い値を示す場合が多い⁷。これはシグナル伝達の各過程で増幅が生じるため、ごくわずかの受容体にリガンドが結合しただけで、細胞応答が飽和してしまうことに由来する。従って、従来の手法では細胞応答からリガンドの占有率を推定することは困難であった。一方、1分子動態解析では受容体分子自体の拡散係数の変化を定量するため増幅がなく、不活性状態・活性状態の割合の変化を捉えることができるため、そのEC₅₀/IC₅₀はリガンド親和性と近い値を示したと考えられた。

【0024】

１−２．リガンド依存的なmGluR3の拡散状態分布の変化
1分子計測の大きな利点は、上述の拡散係数の平均値の比較だけではなく、個々の受容体分子の運動や輝度を定量し、その分布を比較できるところにある。そこで、本発明者は変分ベイズ法-隠れマルコフモデル(VB-HMM)に基づき、mGluR3分子の各軌跡の拡散状態のクラスタリング解析を行った^8,9。その結果、生細胞膜中のmGluR3分子の運動は異なる4つの拡散状態(immobile, slow, medium, fast)に分類されることが示唆された(図５及び６)。さらに、各拡散状態において輝度分布ヒストグラムを作成、混合ガウス関数で外挿することで見かけ上の多量体サイズを推定した。TMR1分子あたりの蛍光強度は、単量体で存在することが知られる膜タンパク質CD86¹⁰を同様にHEK293細胞に発現させ、TMR標識した細胞の計測結果から推定した(図６ｇ)。その結果、mGluR3の輝度分布ヒストグラムの最大値を与える輝度は、CD86の約2倍と見積もられ、mGluRの多くは二量体で存在することが確認された(図６ｈ)。さらに、mGluR3のimmobile状態の輝度分布ヒストグラムは他の拡散状態と比べて右にシフトしており、高次多量体が拡散係数の減少と連関して生じることが推測された(図６ｈ)。

【0025】

リガンド依存的な拡散状態の割合の変化を解析したところ、LY341495濃度依存的にfast状態の割合が増加し、immobile・slow状態の割合が減少することが示された(図５ｃ)。一方で、LY379268濃度依存的には、immobile・slow状態の増加とfast状態の減少が有意に認められた。各拡散状態間の遷移の時定数をVB-HMM解析の遷移行列から推定したところ、より遅い拡散状態からより速い拡散状態への遷移においてリガンド依存的な変化が認められた(図５ｅ, 図７)。これは活性化したmGluR3が何らかの膜ドメインに捕捉されることにより、より遅い拡散状態に留まりやすくなっている可能性を示唆する結果であった。また、各拡散状態において平均拡散係数のリガンド濃度依存性を解析したところ、medium・slow状態において活性化依存的な平均拡散係数の低下が認められた(図５ｅ, 図８)。以上を総合すると、図４ａ, ｂに示したリガンド依存的なD_Avの変化は、fast状態とslow・immobile状態の割合の逆方向の変化とmedium・slow状態の平均拡散係数の変化に由来していると考えられた。

【0026】

１−３．mGluR3の拡散動態への百日咳毒素の影響
Gタンパク質と相互作用しているmGluR3の拡散状態が上記の4状態のいずれと連関するのかを検証するために、百日咳毒素(PTX)を用いたG_i/oタンパク質阻害実験を行った(図９ａ)。PTX処理によりG_i/oタンパク質を阻害した時、100 nM LY341495または100 μM LY379268存在下のいずれにおいてもmGluR3の拡散範囲の平均値は有意に低下した(図９ｂ, ｃ)。また、VB-HMM解析の結果、この平均値の変化はfast状態の減少とimmobile状態の増加に起因することが推定された(図９ｆ, ｇ)。このPTX処理の影響がG_i/oタンパク質とmGluR3の相互作用の阻害に起因することを確認するため、ネガティヴコントロールとしてPTXのBオリゴマーの影響を解析した。PTXはAプロトマー(S1サブユニット)とBオリゴマー(S2-S5サブユニット)から構成される(図９ａ)。Bオリゴマーは細胞膜上のガングリオシドの糖鎖に結合してAプロトマーを細胞内に取り込ませる役割を担うが、Bオリゴマー自体もGタンパク質非依存的なシグナル伝達経路を活性化することが知られている¹¹。一方、細胞内に取り込まれたAプロトマーはG_i/o αサブユニットをADPリボシル化して、受容体とG_i/oタンパク質の結合を阻害する¹¹。上記のPTX処理で認められたmGluR3の拡散範囲・拡散状態の割合の変化はBオリゴマーのみの処理では生じなかった(図９ｄ−ｇ)。従って、AプロトマーによるG_i/oのADPリボシル化がmGluR3の拡散を遅くする要因であることが推定された。以上の結果は、G_i/oと相互作用しているmGluR3分子はfast状態に多く存在し、PTX処理によってその画分が減少することで上記の拡散範囲の低下が生じていることを示唆するものであった。PTX依存的なmGluR3の拡散変化がアゴニスト存在下だけではなく、インバースアゴニスト存在下でも検出されたため、不活性状態においてもmGluR3はG_i/oと相互作用していると推測された。不活性状態のGPCRとGタンパク質のプレカップリングは過去にもいくつかの受容体で報告されており、リガンド刺激後の素早い細胞応答に重要な役割を果たすと考えられている^12-14。mGluR3の活性化は、不活性状態においてプレカップルしているG_i/oの乖離を促進するが、これはG_i/oと結合するmGluR3の割合が減少するという点で、PTX処理によるmGluR3とG_i/oの結合阻害の影響と類似している(図９ａ)。従って、活性化依存的なmGluR3のD_Av低下の要因のひとつにG_i/oと相互作用しているmGluR3の割合が減少するとのことが推定された。

【0027】

１−４．2色同時1分子イメージングによるクラスリンとmGluR3の相互作用解析
つづいて、mGluR3が活性化した際に増えるimmobile状態がどのような生理機能と対応しているのかを検証した。mGluR3を長時間1分子計測したところ、拡散が遅い明るい輝点が形成された後、速い方向性のある運動を伴って一度に消える様子が観察された。これはmGluR3がクラスターを形成後、エンドサイトーシスにより細胞内へと輸送される際に全反射照明の範囲からはずれたため輝点が見えなくなったことに由来するのではないかと推測された。GPCRの一般的なエンドサイトーシスの機構として、クラスリン被覆小胞(CCV)依存的な経路が知られているため(図１０ａ)、クラスリン軽鎖(CLC)をGFPで、mGluR3をTMRでそれぞれ標識し、2色同時1分子イメージングにより共局在を観察した。その結果、mGluR3がCLCと共局在した後、TMRの蛍光強度が急速に上昇し、数秒間共局在した後にTMRとGFPの蛍光強度が同時に大きく減少する様子が確認された(図１０ｂ, ｃ)。これはmGluR3のクラスターがクラスリン被覆ピット(CCP)に集積した後、CCVとなってエンドサイトーシス様子を捉えていると考えられた。同様のエンドサイトーシスは同じ領域で繰り返し起こることが観察されており、CCPが生じやすい特定の膜ドメインが存在する可能性が示唆された。

【0028】

次に、本発明者はCLCと共局在しているmGluR3分子（mGluR3/CLC）の拡散状態の割合を解析し、全mGluR3分子(mGluR3/total)の拡散状態の割合と比較した(図１０ｄ)。その結果、mGluR3/CLCはmGluR3/totalと比べて有意にimmobile状態の割合が高いことが示された。従って、クラスリン結合に伴いmGluR3分子の拡散は遅くなることが分かった。また、不活性状態(100 nM LY341495刺激時)と活性状態(100 μM LY379268刺激時)の比較を行ったところ、活性状態では不活性状態に比べてmGluR3/CLCのimmobile状態の割合が上昇することが分かった(図１０ｄ)。さらに、mGluR3とCLCの共局在確率と共局在時定数が活性化に伴い有意に上昇することが明らかになった(図１０ｅ−ｇ)。mGluR3とCLCの共局在時間の累積度数分布をdouble exponential関数で外挿し、ShortとLongの2つの時定数とその割合を推定した(図１０ｆ, ｇ)。Shortの時定数は活性化依存的な変化が認められたかったため、mGluR3がCLCの近傍に偶然に位置した画分を含んでいると推測された。一方、Longの時定数は活性化に伴い約2倍上昇した(図１０ｇ)。活性化依存的にShortとLongの比率は変化しなかったため(図１０ｇ, inset)、図１０ｅに示した約1.6倍の共局在確率の上昇は主に共局在時間の上昇に由来すると考えられた。以上の結果を総合すると、活性化に伴うmGluR3のimmobile状態の増加は、クラスリンと相互作用するmGluR3分子が増えたことが一因となっていると明らかになった。

【0029】

１−５．他のGPCRにおけるアゴニスト依存的な拡散動態変化の一般性
GPCRの活性化と拡散動態変化の関係の一般性を検証するために、他のファミリーに属する8種のGPCRについてもC末端側を蛍光標識して1分子イメージングを行った。各GPCRのアゴニスト存在・非存在下で20細胞ずつ1分子イメージングを行い、各受容体分子の輝点を追跡、MSD-Δt plotを比較した(図１１)。さらに、MSD-Δt plotからD_Avを計算し、下記の表１に一覧を作成した。その結果、検証した全てのGPCRでアゴニスト依存的な拡散係数の低下が有意に認められた(図１１, 表１)。従って、1分子拡散動態に基づくGPCRの活性推定は、受容体の分子系統的位置やリガンドの化学的性質、共役するGタンパク質のサブタイプ特異性によらず一般に適用可能であると考えられた。リガンド非存在下において、mGluR3のD_Av (0.047μm²/s)は他のGPCRのD_Av (0.06-0.09 μm²/s)と比べて低く、後者の値は1 μM LY341495存在下におけるmGluR3のD_Av (0.064μm²/s)に近かった。従って、リガンド非存在下でのmGluR3の拡散が遅い主な理由は、図４ｅに示した高い構成的活性にあると考えられた。アゴニスト存在下では、GPCRのD_Avは0.04-0.07μm²/sの範囲であった。各GPCRのD_Avのアゴニスト依存的な低下率は13〜44％であるが、Welch’s t-test (n = 20 cells, two-tailed)により8.7 × 10^-11 < p < 9.1 × 10^-3 のp値で検出可能であり、同手法を用いることで様々なGPCRに対する薬剤の効果を高精度に検出できると期待された。(従って、リガンド条件間で20細胞ずつ計測した場合、13％程度の違いがあれば、Welch’s t-test (two-tailed) に基づきp<0.01の有意水準で変化を検出可能であると考えられた。) D_Avの絶対値はGPCRの種類によって様々であるが、mGluR3のD_Avは不活性・活性状態共に他のGPCRと比べて低いため、二量体化もGPCRの拡散を遅くする一要因になっているかもしれない。

【0030】

【表1】

【0031】

２．考察
本実施例では、GPCRの生細胞膜上における1分子拡散動態を定量することで薬効を評価する新規手法を開発した。先ず、本発明者はClass C GPCRのmGluR3をモデルとして、1分子イメージング解析に基づく薬効評価のコンセプトを実証した。その結果、mGluR3の構成的活性・アゴニスト依存的活性化・インバースアゴニスト依存的不活性化・ネガティヴアロステリックリガンド依存的な活性化抑制の全てについてD_Avを指標として定量できることが明らかになった(図４)。これらのD_Avのリガンド依存的変化はmGluR3の4つの拡散状態の割合及び各状態における拡散係数の変化に起因することがVB-HMM解析から示唆された(図５ｅ)。PTX処理によるGタンパク質阻害実験から、fast状態にmGluR3とGタンパク質が結合した状態が含まれること示唆された(図９)。さらに、クラスリンとmGluR3の共局在解析から、immobile状態にmGluR3とクラスリンと結合した状態が多く含まれることが示された(図１０)。以上の結果は、活性化依存的なGタンパク質とのプレカップリングの解消やクラスリンとの結合といったmGluR3の機能状態の変化が、拡散状態の変化と連関して生じることを示唆するものであった。膜タンパク質の拡散範囲を規定する要因として、アクチンに裏打ちされた膜骨格の存在が過去の1分子イメージング解析から示されている¹⁵。過去にM1-ムスカリン受容体¹⁶、β-アドレナリン受容体¹⁰、GABA_B受容体¹⁰の1分子イメージング解析において、MSD-Δt plotはいずれも平均としては直線的であり、自由拡散を支持している。一方、本実施例では、mGluR3の軌跡のMSD-Δt plotは上に凸の形状を示し、受容体分子の拡散が部分的には膜骨格によって制限を受けていることを示唆する結果であった(図１ｃ−ｅ)。さらにVB-HMM解析の結果、immobile・slow状態においてはMSD-Δt plotは明確に上に凸の形状をしており、一部のmGluR3分子はCCPをはじめとする膜ドメインに拡散が制限されていることが明らかになった。

【0032】

上述の通り、PTX処理の実験によりmGluR3のfast状態がGタンパク質の結合と関連していることが示唆されたが、本結果は実験前に予期していた結果と異なるものであった。もし、mGluR3が活性状態の時にだけGタンパク質と結合する場合、PTX処理の影響はインバースアゴニスト存在下では認められず、アゴニスト存在下でのみ変化が生じると考えていたからである。しかしながら、実際にはむしろインバースアゴニスト存在下において、PTX処理に伴うmGluR3のfast状態の減少がより顕著に観察された(図９)。この結果は、不活性状態のmGluR3がGタンパク質とプレカップルしていることを示唆しており、1分子拡散動態からも過去の知見が裏付けられたと言える。GPCRとGタンパク質のプレカップルはアドレナリン受容体やムスカリン性アセチルコリン受容体といったClass Aの受容体で過去に報告されている。リガンド非存在下でGPCRとGタンパク質の結合を仮定すれば、アゴニストに対して高親和性を持つ受容体の存在を説明できるとしてternary complex model¹⁷が20年以上前に提案されて以来、モデルは拡張を重ねられ、現在では幅広いGPCRで受け入れられている。しかしながら、GPCRの構成的活性化に伴うGタンパク質との相互作用と不活性状態でのプレカップルを明確に区別することは生化学的手法では困難であった。その後、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用したGPCRとGタンパク質の結合の細胞生物学的な解析が行われ、インバースアゴニストが飽和濃度存在する不活性な条件下でも、両者の結合が有意に生じることが示されプレカップルが確認された^12,13。本実施例の結果は、プレカップル状態の方がむしろ活性状態におけるternary complexよりも安定であることを示唆した過去のモデルと一致していた。なぜGタンパク質との結合がmGluR3の拡散を速めるのかは現時点では不明である。過去に、アストロサイトにおいてはmGluR5のC末端部位における細胞質側のタンパク質との相互作用が、細胞体と樹状突起を隔てる拡散障壁を乗り越えるのに重要な役割を担っていることが示されている。GPCRとGタンパク質のプレカップルにおいても受容体のC末端部位が重要な役割を担うことが示されており¹⁴、上記のmGluR5の例と似た理由で膜ドメインを裏打ちする拡散障壁を乗り越える確率を高めていることが推測された。

【0033】

また、CCPに対するGPCRの集積は、GPCRのファミリーを超えて共通に認められるエンドサイトーシスの過程である。2色同時1分子イメージングによるクラスリンとmGluR3の共局在解析では、mGluR3のimmobile状態がクラスリンの結合に応じて上昇することが示された。GPCRが不活性化される過程で、受容体のC末端部位はGRKによってリン酸化を受け、リン酸化部位へのアレスチンの結合が生じる¹⁸。さらに、GPCR-アレスチン複合体はアレスチンとクラスリン・AP2との相互作用によってCCPへと集積される¹⁸。過去に、アドレナリン受容体やオピオイド受容体といったClass AのGPCRで全反射蛍光顕微鏡を用いたクラスリン依存的なエンドサイトーシスの解析が報告されている。これらの報告では、受容体・クラスリンが高発現した細胞を用いているため受容体1分子の輝点を分解できていない点で本実施例とは異なるが、レーザー出力を下げた計測が可能なため、より長い時間領域が観察されている。CCP1粒子の形成からエンドサイトーシスされるまでの時定数の解析から、CCPに取り込まれるGPCRがCCPの細胞膜滞在時間を制御していることが明らかにされた^19,20。これらの知見は、アゴニスト刺激によってmGluR3とCLCの共局在時定数が長くなるという本実施例の結果と一致していた(図１０ｆ, ｇ)。1分子イメージングの動画からは既存のCCPにおいてmGluR3がクラスターを形成する様子が観察されている。mGluRの膜貫通領域間の直接的な相互作用がこのクラスター形成の原動力のひとつとなっている可能性が推測された。過去の生化学的な解析から、mGluR2が活性化すると二量体・多量体のインターフェースが変化し、高次多量体が増えることが示されている。GPCRを既存のCCPに集めてからエンドサイトーシスするのは、活性化した個々の受容体の周辺にCCPを作って逐次エンドサイトーシスさせるのに比べて細胞にとってエネルギーコストが低く、望ましいと考えられる。

【0034】

GPCRはファミリーを超えたアミノ酸配列の相同性はほとんど持たないにも関わらず、全てのGPCRは3つの細胞質ループ領域とC末端領域を持つ7回膜貫通領域という構造モチーフを共有し、共通のGタンパク質・GRK・アレスチンと相互作用する。本実施例で見出された受容体の拡散に影響を与える生理的現象はClass C GPCRに特異的に生じるものではない。もし、任意のGPCRに対する薬効をGPCRが共有する拡散動態の変化から推定できれば、下流が異なるGPCRやオーファン受容体に対しても共通の指標で薬効評価が可能になる。そこで、本実施例ではさらに、様々なファミリーのGPCRに対して同様の計測を行い、アゴニスト依存的な拡散動態変化の一般性を検証した。その結果、GPCRの下流のシグナル伝達経路に関わらず解析した8種GPCRに共通して活性化依存的な拡散係数の低下が確認された(表１, 図１１)。全反射蛍光顕微鏡を用いてGPCRの1分子拡散動態を計測・定量することは細胞膜に局在しさえすれば任意の受容体で可能であるため、本実施例で開発した手法は、約100種のオーファン受容体を含む他の多くのGPCRにとっても薬効評価に利用可能であると考えられた。

【0035】

３．方法
３−１．試薬
[³H]-LY341495 (1.28 TBq/mmol), LY341495, LY379268, NMI137, NECA, serotoninはTocris Cooksonから購入した。IsoproterenolはSanta Cruz Biotechnologyから購入した。DHAはSigma-Aldrichから購入した。CXCL12はThermo Fisher Scientificから購入した。TRAP-6はBachemから購入した。GlucagonはCedarlaneから購入した。[³⁵S]-GTPγS (37 TBq /mmol)はPerkinElmer Life Sciencesから購入した。Histamine, PTX, B oligomerはWako Chemicalsから購入した。Human CD86 cDNAはOriGeneから購入した。

【0036】

３−２．cDNA作製
HaloTag7 (Promega)をコードするDNA配列をPCRで増幅し、マウスmGluR3のC末端配列にIn-Fusion HD Cloning Kit (Clontech)を用いて融合した。ウェスタンブロッティング法でHaloTag融合mGluR3の発現量を定量するために、ウシロドプシンのC末端を認識するモノクローナル抗体Rho 1D4のエピトープ配列をHaloTag配列の直後に付加した。mGluR3のcDNAsはpCAG-GS vector²¹に挿入した。他のGPCRs (ADRB2, HTR2A, HRH1, ADORA2A, FFAR4, CXCR4, F2R, GCGR)のcDNAはPromegaから購入した。各GPCRをコードするDNA配列はpFC14K HaloTag CMV Flexi Vectorに挿入した。CD86 (M1-R277)をコードするDNA配列はPCRで増幅し、pEGFP-N1 mammalian expression vector (Clontech)に挿入した。また、同ベクターのEGFPのDNA配列をHaloTag7に置換したものを作成した。GFP融合CLCのcDNAは過去に報告したものを用いた²²。

【0037】

３−３．1分子イメージング
HEK293細胞は37 ℃, 5％ CO₂環境下で15 mM HEPES (pH 7.3), 29 mM NaHCO₃, 10％ FBSを添加したDMEM/F12 (Gibco)培地中で培養した。観察の前日に、カバーガラス(Matsunami)を載せた60 mm dish (IWAKI)上のHEK293細胞にHaloTag融合mGluR3のプラスミドDNA(pDNA)をLipofectamine 3000 (Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション試薬とpDNA(pDNA (0.1 μg), P3000 reagent (0.2 μL), Lipofectamine 3000 reagent (2.5 μL), Opti-MEM (120 μL, Gibco))を混合した後、15分間室温で静置し、DMEM/F12 (3 mL)を入れた60 mm dish上のHEK293細胞に添加した。2色同時1分子計測の際は、GFP融合CLCのpDNA 0.02 μgをHaloTag融合mGluR3と同時にトランスフェクションした。37 ℃, 5％ CO₂環境下で3時間培養後、培地をフェノールレッド不含、10％ FBS含有のDMEM (3 mL, Sigma)に置換した。一晩培養後、培地を300 nM HaloTag TMR ligand (Promega)を含み、フェノールレッド・FBS不含のDMEM培地3mlと置換し、37 ℃, 5％ CO₂環境下で30分静置することでHEK293細胞にしたHaloTag融合mGluR3を特異的に染色した。他のGPCRの染色には、TMR ligandの代わりに30 nM STELLA Fluo 650 HaloTag ligand (Goryo Chemical)を用いた。STELLA Fluor 650は輝度・安定性がより高い膜透過性の色素であり、1分子イメージングの画質が向上した。阻害剤実験を行う際は、終濃度5 nM PTX, 5 nM B oligomer又はvehicleをDMEM培地に添加し、6時間37 ℃, 5％ CO₂環境下で培養後、顕微鏡観察を行った。1分子イメージングの際は、カバーガラスを金属のチャンバー(Invitrogen)に入れ、Hanks’ balanced salt solution (HBSS (Sigma); 15 mM HPEPS (pH 7.1)含有, NaHCO₃不含) 400 μLで5回繰り返し洗浄し、室温(25℃)で観察した。倒立蛍光顕微鏡(TE2000, Nikon)上で全反射照明を用いてHEK293細胞の細胞膜上のTMR標識したmGluR3を励起し、1分子イメージングを行った。TMRの励起光源として559 nm, 100 mW laser (WS-0559-050, NTT Electronic)を、GFPの励起光源として488 nm, 200 mW laser (Sapphire 488-200, Coherent)を、STELLA Fluo 650の励起光源として637 nm, 140 mW laser (OBIS 637, Coherent)を用いた。また、対物レンズはPlanApo 60×, NA 1.49 (Nikon)を用い、TMR/GFPの観察にはダイクロイックミラーFF493/574 (Semrock)を、STELLA Fluo 650の観察にはET Cy5 filter set (Chroma)をそれぞれ用いた。TMRとGFPの蛍光は2光路分岐システム(M202J, Nikon)においてダイクロイックミラー59004b (Chroma)よって波長依存的に分離し、バンドパスフィルター(GFP: ET525/50m, TMR: ET605/70m, Chroma)を通した後、2つのEM-CCDカメラ(ImagEM, Hamamatsu)によって同時に撮影した。4倍のリレーレンズを2光路分岐システムに入れることで画像を拡大し、ピクセルサイズが67 nm/pixel (512×512 pixels)になるよう調整した。蛍光画像はイメージングソフトImagEM HRD (Hamamatsu)により、パラメータ設定(露光時間: 30.5 ms, EMゲイン: 200, スポットノイズリデュース: on)で撮影した。TMR標識したmGluR3とGFP標識したCLCの1分子計測における位置精度を評価するために細胞を固定して計測する際は、過去に報告される方法を用いた²³。カバーガラス上のHEK293細胞に4％ PFA/0.2％ glutaraldehyde/PBSを添加し、30分室温で処理した後、5回 HBSSで繰り返し洗浄し、顕微鏡観察を行った。

【0038】

３−４．1分子イメージング画像の解析
上記の1分子イメージングにより撮影した画像はmultiple TIFF files (16 bit)で保存され、ImageJを用いて以下の通り画像処理を行った。Rolling ball radiusを25 pixelsに設定してバックグラウンド除去を行った後、Running_ZProjector plugin (Vale Lab homepage, http://valelab.ucsf.edu/〜nstuurman/ijplugins/)を用いて2フレーム移動平均処理を行った。2カメラ同時撮影の画像については、GridAligner plugin (Vale Lab homepage)を用いて2チャンネル間の位置の誤差を補正した。60 nm金粒子をカバーガラス上に撒いた試料の散乱像を1分子計測と同日に撮影し、2チャンネル間の位置合わせ用の基準点として用いた。蛍光色素1分子あたりの輝度を画像間で一定に保つため、明るさとコントラストの設定を一定値(minimum: 0, maximum: 1800)に設定した後、スタック画像を非圧縮でavi (8 bit)に変換した。1分子追跡(SMT)解析は2次元ガウスフィッティング法に基づいて作成されたG-count software (G-angstrom)を用いて行った。VB-HMM解析は過去に報告されたアルゴリズム^8,9,24に従ってLabView上で作成したプログラムを用いて行った。

【0039】

SMT・VB-HMM解析の結果から各種パラメータの抽出、カーブフィッティング、図の作成はIgor Pro 6 (WaveMetrix)を用いて下記の通り行った。時間間隔nΔtにおける各軌跡のMSDは以下の式により計算した²⁵。

【0040】

【数1】

【0041】

ここで、nはフレーム長, Δtはフレームレート(30.5 ms), Nは軌跡の全フレーム長である。また、D_Avは2次元拡散方程式に基づき下記の式で計算した。

【0042】

【数2】

【0043】

ここで、MSD_jはj番目の軌跡のMSDを指し、Mは全軌跡数を指す。本実施例において、D_Avは刺激依存的な変化を高精度に検出可能なn = 6 (nΔt = 183 ms)の値から算出した。リガンド濃度依存的なD_Avの変化のEC₅₀及びIC₅₀は式3, 4でそれぞれフィッティングして算出した。

【0044】

【数3】

【0045】

また、MSD-Δt ploは式5でフィッティングした²⁶。

【0046】

【数4】

【0047】

Lは拡散制限距離、DはΔtを0に漸近させた際に算出される拡散係数である。

【0048】

Δt (30.5 ms)における変位：

【数5】

のヒストグラムは、拡散状態毎に式6でフィッティングした²⁷。

【0049】

【数6】

【0050】

輝度分布のヒストグラムはN個のガウス関数の和に基づく式7によりフィッティングした。

【0051】

【数7】

【0052】

ここで、nは多量体サイズ、I及びσは蛍光色素1分子の輝度分布の平均と標準偏差(SD)をそれぞれ示す。Nは赤池情報量基準を用いて決定した。TMR標識したCD86分子の計測から、TMR分子のI及びσはそれぞれ530と210と推定された。

【0053】

TMR標識したmGluR3とGFP標識したCLCの共局在は同フレームにおいて、それぞれの輝点が100 nm以内に入った軌跡として定義した。TMR標識したmGluR3とGFP標識したCLCの輝点追跡の位置精度は固定試料の計測から、それぞれ28 nm, 31 nmと推定された。これら値は、固定された分子を追跡した際の変位の1 SDに相当する。画像処理後、同一金粒子の位置の2チャンネル間の誤差は18 nmと推定された。従って、100 nmは全誤差を考慮した位置精度の約2 SDに相当する。共局在の時定数は累積度数分布(図９ｆ)を式8によりフィッティングして算出した。

【0054】

【数8】

【0055】

各成分の割合は、A₁とA₂の割合から算出した。

【0056】

３−５．In vitroの生化学的解析用の膜試料の調製
In vitroの生化学的解析用にmGluR3が発現した膜試料を下記の方法で調製した²⁸。100 mm dishに約40％コンフルエントに培養したHEK293細胞に対して、mGluR3のpDNA及びmockとして空のpCAG vectorをそれぞれ10 μg/dishでリン酸カルシウム法によりトランスフェクションした。トランスフェクション後、48時間10％ FBS含有DMEM/F12培地で培養した後、細胞を回収し、遠心後の沈殿を1 mL PBS(pH 7.4)で洗浄した。さらに遠心分離後、沈殿を1.5 mLチューブに移し、50％ スクロースを溶解したバッファーA (50 mM HEPES (pH 6.5), 140 mM NaCl)中においてペレットミキサーでホモゲナイズし、遠心により上清と沈殿に分離した。形質膜画分を多く含む上清を2倍量のバッファーAで希釈し、再度遠心分離した。形質膜画分を含む沈殿をバッファーAで洗浄し、-80℃に保存した。

【0057】

３−６．ウェスタンブロット法
mGluR3を含む膜画分をSDSサンプルバッファー(62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4％ SDS, 10％ glycerol, 0 or 2.5％ β-mercaptoethanol)で可溶化し、5.5％ SDS-PAGEを行った。電気泳動後のゲルからPVDF膜にタンパク質を転写し、Rho1D4抗体(1次抗体)とHRP結合抗マウスIgG(2次抗体, Cell Signaling #7076)で標識をした。抗体で標識されたタンパク質を発光試薬Amersham ECL prime Western blotting detection reagent (GE)で処理し、ImageQuant LAS 500 (GE)で発光を検出した。

【0058】

３−７．mGluR3の[³H]-リガンド結合実験
mGluR3を含む細胞膜画分を1分子計測で用いたものと同組成のHBSS (15 mM HEPES (pH 7.1)含有, NaHCO₃ 不含(Sigma))で再懸濁し、[³H]-LY341495の膜への結合を室温で測定した。一定量の膜画分(100 mm dishにコンフルエントなHEK293細胞から調製した膜の1/32量)を終濃度0-1 μM [³H]-LY341495になるようHBSSで希釈した溶液と混合し(混合液量: 20 μL)、30分間室温で静置した。その後、試料をドットブロット装置(FLE396AA, ADVANTEC)で[³H]-LY341495をニトロセルロース膜(0.45 μm HATF, Millipore)に通し、膜画分と溶液を分離した。膜画分が結合したニトロセルロース膜はHBSS (200 μL)で2回繰り返し洗浄し、1時間乾燥させた。ニトロセルロース膜の各ドット部分を切り出して、液体シンチレーションカウンター用のカクテル(Ultima Gold, PerkinElmer)に入れ、[³H]-LY341495の結合量をLS6500 (Beckman Coulter)で定量した。非特異的な[³H]-LY341495結合量はmockトランスフェクションし、同様に調製したHEK293膜画分への結合から推定した。K_dは上記の式3のEC₅₀をKdに置換した式によるフィッティング結果から算出した。また、LY379268による[³H]-LY341495結合の競合阻害も、同様の方法で計測した。膜画分を終濃度100 nM [³H]-LY341495, 0-100 μM LY341495及び0-1 μM MNI137となるようにHBSS中で混合し、30分室温で静置、上記と同様の方法で[³H]-LY341495の結合量を定量した。IC₅₀は式4に基づき算出した。

【0059】

３−８．[³⁵S]-GTPγS結合実験
mGluR3のGタンパク質活性化能は過去の文献に記載された方法を改変して定量した²⁹。mGluR3を含む膜画分(終濃度11 nM)を0.02％ n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DM; Dojindo)を含むバッファーB (50 mM HEPES (pH 6.5), 140 mM NaCl, and 3 mM MgCl₂)で可溶化し、様々な濃度のリガンドとブタ脳から精製したGoタンパク質と混合後、20℃で30分静置した。GDP/GTPγS交換反応を[³⁵S]-GTPγS添加により開始させた。最終混合液(20 μL)のリガンド以外の組成は、50 mM HEPES (pH 6.5), 140 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 0.01％ DM, 0.03％ sodium cholate, 5 nM [³⁵S]-GTPγS, 500 nM GTPγS (cold), 500 nM GDPであった。[³⁵S]-GTPγS添加後30秒で反応停止液 (200 μL, 20 mM Tris/Cl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 25 mM MgCl₂, 500 nM GTPγS (cold), and 500 nM GDP)を加えて、Gタンパク質への[³⁵S]-GTPγS取り込みを止め、すぐに上記のドットブロッターを用いてニトロセルロース膜に反応液全量を通過させ、Gタンパク質に結合した[³⁵S]-GTPγSを分離した。その後、ニトロセルロース膜をバッファーC(200 μL, 20 mM Tris/Cl (pH 7.4), 100 mM NaCl, and 25 mM MgCl₂)で3回繰り返し洗浄し、1時間乾燥させた。ニトロセルロース膜の各ドット部分を切り出して、液体シンチレーションカウンター用のカクテル(Ultima Gold, PerkinElmer)に入れ、[³⁵S]-GTPγSの結合量をLS6500(Beckman Coulter)で定量した。非特異的な結合量はmockトランスフェクションし、同様に調製したHEK293膜画分を用いて推定した。EC₅₀及びIC₅₀は式3,4をそれぞれ用いて算出した。

【0060】

３−９．HaloTag TMR ligandの飽和結合実験
上記のリポフェクション法によりHaloTag融合/非融合mGluR3のpDNA(1 μg/60 mm dish)を、約70％コンフルエントに増殖したHEK293細胞にそれぞれトランスフェクションした。一晩培養後、培地を0-2 μM HaloTag TMR ligandを含むDMEM(フェノールレッド・FBS不含)に置換し、37 ℃, 5％ CO₂環境下で30分静置した。TMR染色後、60 mm dishを3 mL HBSSで3回繰り返し洗浄し、バッファーC (500 μL, 10 mM HEPES (pH 7.5) and 140 mM NaCl, 4 mM KOH, 1 mM MgCl₂, and 1.5 mM CaCl₂)で細胞を懸濁し、1.5 mLチューブに回収した。遠心分離後、細胞沈殿を1％ TritonXを含むバッファーC 200 μLで可溶化した。再度遠心分離後、上清を回収、蛍光分光高度計(RF-5300PC, Shimadzu)を用いて可溶化された受容体に結合したTMRの濃度を定量した。試料は540 nmで励起し、O57カットオフフィルターを用いて励起光の散乱光を除去した後、蛍光スペクトルを計測した。標準試料として既知濃度のTMR ligandを用いた(図２ａ, ｂ)。非特異的な結合はHaloTag融合をしていないmGluR3を発現させた膜画分を用いて推定した(図２ｃ)。HaloTag融合mGluR3への特異的結合は、HaloTag融合mGluR3発現細胞への全結合量から非特異的結合を差し引いて算出した。特異的結合・非特異的結合は下記のHillの式(n: Hill係数)を用いてフィッティングした。

【0061】

【数9】

【0062】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】