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特開2019-103400イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2019-103400(P2019-103400A)
(43)【公開日】2019年6月27日
(54)【発明の名称】イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20190607BHJP
C07K 14/37 20060101ALI20190607BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20190607BHJP
C12P 17/04 20060101ALI20190607BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 A
C07K14/37ZNA
C12N1/15
C12P17/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】34
(21)【出願番号】特願2017-236406(P2017-236406)
(22)【出願日】2017年12月8日
(71)【出願人】
【識別番号】000004477
【氏名又は名称】キッコーマン株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504205521
【氏名又は名称】国立大学法人 長崎大学
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】荒木 康子
(72)【発明者】
【氏名】北 潔
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AC12
4B064AC13
4B064AC17
4B064AE45
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA58X
4B065AA58Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA05
4B065CA18
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA15
4H045EA20
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】本発明が解決しようとする課題は、従来技術に比べて、アスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びそれらの誘導体といったイソプレノイドを高収量で安定生産することができることから、工業的規模でのイソプレノイドの製造を可能にする、イソプレノイドの製造方法を提供することにある。
【解決手段】
上記課題は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法などによって解決される。
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有する、ＡｓｃＡタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ａ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項2】
下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列であって、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＡ。
（Ａ）請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（Ｂ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列
（Ｃ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（Ｄ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列からなる遺伝子と８０％以上の同一性を有する塩基配列
（Ａ）請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（Ｂ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列
（Ｃ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（Ｄ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列からなる遺伝子と８０％以上の同一性を有する塩基配列
【請求項3】
アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、請求項１に記載のＡｓｃＡタンパク質又は請求項２に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法。
【請求項4】
イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
請求項２に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
【請求項6】
前記形質転換体は、宿主生物がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項7】
アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、請求項１に記載のＡｓｃＡタンパク質又は請求項２に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
【請求項8】
請求項５〜６のいずれか１項に記載の形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
【請求項9】
イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アスコフラノン、アスコクロリン、イリシコリンＡといったイソプレノイドを合成するための遺伝子並びに該遺伝子を利用したイソプレノイドの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
人口が密集した地域が点在する日本国を含む先進国及び開発途上国においては、ウイルスや原虫などによる感染症がたびたび問題となる。また、２型糖尿病、高コレステロール血症、癌及びこれらの疾患に起因する合併症などの生活習慣病は、医療費の増大及び労働力の低下などを招き、とりわけ日本国では深刻な問題となっている。
【0003】
そこで、これらの疾患の治療や予防に対して有効とされる物質の開発が望まれている。そのような物質の一つとして、イソプレノイド系の生理活性物質であるアスコクロリン及びアスコフラノンが知られている。アスコクロリン及びアスコフラノンは、電子伝達系を阻害して細胞内ＡＴＰ濃度を低下することにより、例えば、ツエツエバエによって媒介される原虫トリパノソーマによる原虫感染症であるアフリカ睡眠病の治療や予防に際して有望視されている（例えば、特許文献１を参照）。
【0004】
アフリカ睡眠病に罹患すると、感染初期に原虫が血流中で増殖する。慢性期に入ると中枢神経が侵されて、精神錯乱や全身の痙攣などの症状を呈し、最終的には嗜眠状態に陥って死に至る。アフリカ睡眠病によるアフリカでの死者は、年間１万人以上であり、潜在的に感染のリスクがある人口は７，０００万人以上といわれている。現在のところ、アフリカ睡眠病に対してワクチンによる予防方法はなく、その治療は薬剤療法に頼っている。しかし、アフリカ睡眠病に対して効果的な治療薬は副作用が強いなどの問題点がある。
【0005】
そこで、アスコクロリンやアスコフラノンにより、トリパノソーマの電子伝達系を特異的に阻害することによる、アフリカ睡眠病の予防や治療が期待されている。原虫は哺乳類体内に侵入すると、主にグリコソーム内の解糖系でＡＴＰ合成を行い、これにはトリパノソーム・オルターネイティブ・オキシダーゼ（ＴＡＯ）が触媒するＮＡＤ＋の再生が必要であるところ、アスコクロリンやアスコフラノンはこのＴＡＯの働きを阻害する。感染した哺乳類はＴＡＯと同様の酵素を有していないことから、トリパノソーマを特異的に駆除することが可能となる。なお、特にアスコフラノン及びその誘導体は非常に低濃度であってもＴＡＯを阻害することが報告されている。
【0006】
また、アスコクロリン、アスコフラノン及びそれらの誘導体には、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用などが存在することが知られている（例えば、特許文献２を参照）。さらに、アスコクロリンやアスコフラノンの生合成経路の中間体にあるイリシコリンＡ（ＬＬ−Ｚ１２７２α）もまた、高い抗原虫剤（特許文献３）や、免疫抑制剤、リウマチ治療剤、抗癌剤、拒絶反応治療薬、抗ウイルス薬、抗Ｈ．ピロリ薬および糖尿病治療薬等（特許文献４）の、新たな医薬品の有効成分として期待されている。さらに、イリシコリンＡはアスコクロリンやアスコフラノンのみならず他のイソプレノイドの生合成の中間体としても知られており、それらの原料としても有用な化合物である。
【0007】
イソプレノイドのうち、アスコフラノン及びアスコクロリンの製造方法としては、アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）糸状菌を培養し、菌糸中に蓄積したアスコフラノン及びアスコクロリンを分離採取する方法が知られている（例えば、特許文献５及び６を参照）。なお、アスコフラノンの生産株として知られていたアスコキタ・ビシア（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｖｉｃｉａｅ）は、正しくは、アクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）であることが非特許文献１によって報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開平０９−１６５３３２号公報
【特許文献2】特開２００６−２１３６４４号公報
【特許文献3】国際公開第２０１２／０６０３８７号
【特許文献4】国際公開第２０１３／１８０１４０号
【特許文献5】特公昭５６−２５３１０号公報
【特許文献6】特公昭４５−９８３２号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ）. ２０１６ Ｎｏｖ ２. Ｒｅ−ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｃｏｆｕｒａｎｏｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｕｓ Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｖｉｃｉａｅ ａｓ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
特許文献５及び６に記載の方法のような、アスコクロリンやアスコフラノンを生産することが知られている糸状菌を用いる方法によれば、これらの物質の収率は使用する糸状菌に大きく依存することになる。しかし、これまでに知られている微生物におけるアスコクロリンやアスコフラノンの含有量は工業生産としては少ないこと、さらに生産量が僅かな培養条件の違いで大きく異なってくることから、既存の方法では大量のアスコクロリンやアスコフラノンの安定生産が実現できないという課題がある。
【0011】
例えば、アスコクロリン、アスコフラノン及びそれらの中間体であるイリシコリンＡ並びにそれらの誘導体といったイソプレノイドの大量生産を実現するためには、イソプレノイドを高濃度で安定的に生産する野生株を単離又は育種することや生物工学技術を駆使してイソプレノイドの生合成に関与する遺伝子を挿入した形質転換株を構築することが考えられる。しかし、イソプレノイドを高濃度で安定的に生産する野生株についてはこれまでにほとんど知られておらず、さらにイソプレノイドの生合成経路については不明な部分が依然として多い。
【0012】
また、イソプレノイドのうち、アスコクロリン、アスコフラノン及びイリシコリンＡの生合成遺伝子についても、未だ不明な部分が多い。
【0013】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、従来技術に比べて、アスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びそれらの誘導体といったイソプレノイドを高収量で安定生産することができることから、工業的規模でのイソプレノイドの製造を可能にする、イソプレノイドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、糸状菌の一種であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ）において、アスコクロリンの生合成に関与する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子群（遺伝子ａｓｃＢ〜遺伝子ａｓｃＨの７遺伝子）に続いて、アスコフラノンの生合成に関与する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子群（遺伝子ａｓｃＩ〜遺伝子ａｓｃＫの３遺伝子）を特定することに成功した。
【0015】
次に、本発明者らは、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現するためのＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで得られたＤＮＡコンストラクトを宿主生物として、糸状菌の一種であるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物に導入して形質転換することによって、上記遺伝子群にコードされるタンパク質を過剰発現する形質転換糸状菌を作製することに成功した。
【0016】
上記形質転換糸状菌は、通常の糸状菌を培養する方法に準じて培養することができ、その増殖速度などについても宿主生物と格別相違がないものであった。そして、上記形質転換糸状菌を用いればアスコクロリン、アスコフラノン及びイリシコリンＡを生産し得ることがわかった。
【0017】
一方で、アスコクロリン生合成遺伝子クラスターにある遺伝子ａｓｃＡは、転写因子であると考えられるため、遺伝子ａｓｃＡを導入して発現させなくとも、アスコクロリンの生合成には影響しないと考えられた。実際に、上記したとおり、遺伝子ａｓｃＡを有していないアスペルギルス属微生物に、遺伝子ａｓｃＢ〜遺伝子ａｓｃＨの７遺伝子を導入した形質転換糸状菌を用いれば、アスコクロリンを生合成し得ることがわかっている。
【0018】
かかる事実があるにもかかわらず、本発明者は、アスコクロリンやアスコフラノンの生合成遺伝子を有するアクレモニウム・スクレロティゲナムに遺伝子ａｓｃＡを導入することにより、遺伝子ａｓｃＡを強発現する形質転換糸状菌を作製することに成功した。そして、驚くべきことに、この遺伝子ａｓｃＡを強発現する形質転換糸状菌を用いることにより、アスコクロリンだけではなく、アスコフラノンもまた大量に生産することができることを見出した。本発明はこのような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。
【0019】
したがって、本発明の一態様によれば、下記のタンパク質、遺伝子、形質転換体及び方法が提供される。［１］下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有する、ＡｓｃＡタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列表の配列番号４０に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
［２］下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの塩基配列であって、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、遺伝子ａｓｃＡ。
（Ａ）［１］に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列
（Ｂ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列
（Ｃ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（Ｄ）配列表の配列番号３７に記載の塩基配列からなる遺伝子と８０％以上の同一性を有する塩基配列
［３］アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、［１］に記載のＡｓｃＡタンパク質又は［２］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法。
［４］イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、［３］に記載の方法。
［５］［２］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体（ただし、ヒトを除く）。
［６］前記形質転換体は、宿主生物がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物である、［５］に記載の形質転換体。
［７］アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、［１］に記載のＡｓｃＡタンパク質又は［２］に記載の遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
［８］［５］〜［６］のいずれか１項に記載の形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法。
［９］イソプレノイドは、アスコフラノン、アスコクロリン及びイリシコリンＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、［７］又は［８］に記載の方法。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、高収量のアスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡといったイソプレノイドを製造することができる。その結果、本発明によれば、工業的規模で、イソプレノイドを製造することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図8】図８は、後述する実施例に記載されているとおりの、Ａｓ−Ｆ反応液、Ａｓ−ＦＩ反応液、Ａｓ−ＦＩＪ反応液、Ａｓ−ＦＩＫ反応液、Ａｓ−ＦＪＫ反応液、Ａｓ−ＩＪＫ反応液及びＡｓ−ＦＩＪＫ反応液をそれぞれ用いた場合の反応物のＬＣ／ＭＳ解析結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下、本発明の一態様であるタンパク質、遺伝子、形質転換体及び方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。また、本発明の技術的範囲は、本明細書における、いかなる憶測や推論に拘泥されるわけではない。
【0023】
（イソプレノイド）本明細書における「イソプレノイド」は、通常知られているとおりのイソプレンを構成単位とする化合物であれば特に限定されず、例えば、イリシコリン酸Ｂ、イリシコリン酸Ａ、ＬＬ−Ｚ１２７２β、イリシコリンＡ（ＬＬ−Ｚ１２７２α）、イリシコリンＡエポキシド、イリシコリンＣ、アスコクロリン、アスコフラノン及びこれらの誘導体などが挙げられる。ただし、本明細書では、主として、アスコフラノン、イリシコリンＡ及びアスコクロリン並びにこれらの誘導体のことを「イソプレノイド」とよぶ場合がある。
【0024】
（ＡｓｃＡタンパク質）本発明の一態様のＡｓｃＡタンパク質は、アスコクロリン生合成遺伝子、アスコフラノン生合成遺伝子又はこれらの両方の生合成遺伝子の発現を増強する活性を有する、タンパク質である。ＡｓｃＡタンパク質は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強することによって、これらの遺伝子を含む生物体におけるイソプレノイドの生合成が促進し、もって該生物体によるイソプレノイドの産生が増大する。ＡｓｃＡタンパク質はアスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子の正の転写因子として機能し得る。なお、ＡｓｃＡタンパク質をコードする遺伝子は、アスコクロリン生合成遺伝子又はアスコフラノン生合成遺伝子に含まれ得る。
【0025】
ＡｓｃＡタンパク質は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。
【0026】
例えば、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有するＡｓｃＡタンパク質の一態様として配列番号４０に示すアミノ酸配列がある。
【0027】
配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するＡｓｃＡタンパク質は、アクレモニウム属糸状菌の一種であるアクレモニウム・スクレロティゲナムに由来するものである。また、配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するＡｓｃＡタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号３７に示す塩基配列である。
【0028】
配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するＡｓｃＡタンパク質は、アクレモニウム属の染色体ＤＮＡ上に存在するＡｓｃＡタンパク質をコードする遺伝子によってコードされるものである。このような由来生物の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子及び該遺伝子によってコードされるタンパク質を、それぞれ「野生型遺伝子」及び「野生型タンパク質（酵素）」と本明細書ではよぶ場合がある。
【0029】
ＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有するものであれば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【0030】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【0031】
野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【0032】
ＡｓｃＡタンパク質を入手する方法は特に限定されないが、例えば、後述する遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体を培養し、次いで培養物中のＡｓｃＡタンパク質を回収することを含む方法などが挙げられる。培養物中からＡｓｃＡタンパク質を回収する手段は特に限定されず、例えば、常法に従って、不純物を取り除いた培養物上清から、硫安沈殿などによりＡｓｃＡタンパク質を含むタンパク質濃縮液を得て、次いでＡｓｃＡタンパク質の分子量を指標としたゲルろ過クロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いることによって、ＡｓｃＡタンパク質を単離することができる。なお、配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するＡｓｃＡタンパク質の理論分子量は、約５５，０００である。
【0033】
（遺伝子ａｓｃＡ）本発明の一態様の遺伝子ａｓｃＡは、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有するＡｓｃＡタンパク質が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであれば特に限定されない。ＡｓｃＡタンパク質をコードする遺伝子が生物体内で発現することによりＡｓｃＡタンパク質が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が本来の機能や活性、特に酵素活性を有する態様で生産されることを意味する。また、「遺伝子の発現」には、遺伝子の高発現、すなわち、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素が生産されることを包含する。
【0034】
遺伝子ａｓｃＡは、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由してＡｓｃＡタンパク質を生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずにＡｓｃＡタンパク質を生成し得る遺伝子であっても、どちらでもよい。後述する遺伝子ａｓｃＢ〜遺伝子ａｓｃＫについても同様である。
【0035】
遺伝子ａｓｃＡは、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
【0036】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
【0037】
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
【0038】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ） 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ） Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、一晩（８〜１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１〜０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
【0039】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ−Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」ともよぶ。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
【0040】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【0041】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数１００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１から４０個、好ましくは１から３５個、好ましくは１から３０個、好ましくは１から２５個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１５個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４又は５個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【0042】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するものである。
【0043】
また、遺伝子ａｓｃＡは、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードするタンパク質が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含むものであってもよい。コドン改変が施された塩基配列としては、例えば、宿主生物において発現し易いようにコドン改変が施された塩基配列であることが好ましい。
【0044】
（アスコクロリン・アスコフラノン生合成遺伝子がコードする酵素（１）乃至（１０））本発明者らがこれまでに得た知見によれば、アスコクロリン生合成遺伝子は遺伝子ａｓｃＢ、遺伝子ａｓｃＣ、遺伝子ａｓｃＤ、遺伝子ａｓｃＥ、遺伝子ａｓｃＦ、遺伝子ａｓｃＧ及び遺伝子ａｓｃＨの７遺伝子である。同様に、本発明者らがこれまでに得た知見によれば、アスコフラノン生合成遺伝子は遺伝子ａｓｃＩ、遺伝子ａｓｃＪ及び遺伝子ａｓｃＫの３遺伝子である。ただし、アスコフラノン生合成遺伝子としては、イリシコリンＡエポキシドを生合成するまでの遺伝子ａｓｃＢ、遺伝子ａｓｃＣ、遺伝子ａｓｃＤ、遺伝子ａｓｃＥ及び遺伝子ａｓｃＦを包含し得る。また、上記したとおりに、遺伝子ａｓｃＡは、アスコクロリン生合成遺伝子及びアスコフラノン生合成遺伝子の両方に含まれ得る。
【0045】
遺伝子ａｓｃＢは、ｏ−オルセリン酸からイリシコリン酸Ｂを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（１）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0046】
遺伝子ａｓｃＣは、イリシコリン酸ＢからＬＬ−Ｚ１２７２βを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（２）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0047】
遺伝子ａｓｃＤは、アセチルＣｏＡからｏ−オルセリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（３）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0048】
遺伝子ａｓｃＥは、ＬＬ−Ｚ１２７２β からイリシコリンＡを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（４）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0049】
遺伝子ａｓｃＦは、イリシコリンＡのエポキシ化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（５）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0050】
遺伝子ａｓｃＧは、イリシコリンＡエポキシドの環化反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（６）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0051】
遺伝子ａｓｃＨは、イリシコリンＡからＡｓｃＦタンパク質及びＡｓｃＧタンパク質の反応によって生成した化合物の脱水素化によりアスコクロリンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（７）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0052】
遺伝子ａｓｃＩは、イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応を触媒する活性を有する酵素（以下、「酵素（８）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。イリシコリンＡエポキシドの一原子酸素添加反応とは、イリシコリンＡエポキシドの水素原子（−Ｈ）をヒドロキシ基（−ＯＨ）に置換する反応をいう。
【0053】
遺伝子ａｓｃＪ及びａｓｃＫは、イリシコリンＡエポキシドからＡｓｃＩタンパク質の反応によって生成した化合物からアスコフラノンを生成する反応を触媒する活性を有する酵素（以下、それぞれ「酵素（９）」及び「酵素（１０）」ともよぶ。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【0054】
酵素（１）はプレニル・トランスフェラーゼと同様の機能を有し；酵素（２）はオキシドリダクターゼと同様の機能を有し；酵素（３）はポリケチド・シンターゼと同様の機能を有し；酵素（４）はハロゲナーゼと同様の機能を有し；酵素（５）はエポキシダーゼとしてのｐ４５０／ｐ４５０リダクターゼと同様の機能を有し；酵素（６）はテルペン・サイクラーゼと同様の機能を有し；酵素（７）はデヒドロゲナーゼとしてのｐ４５０と同様の機能を有し；酵素（８）はモノオキシゲナーゼとしてのｐ４５０と同様の機能を有し；酵素（９）はテルペン・サイクラーゼと同様の機能を有し；及び酵素（１０）はデヒドロゲナーゼと同様の機能を有する蓋然性がある。ただし、後述する実施例に記載があるとおり、酵素（９）及び酵素（１０）は、これらの酵素をコードする遺伝子の両方が発現することにより、ＡｓｃＩタンパク質の反応物からアスコフラノンを合成し得る。本明細書では、具体的な作用機序にかかわらず、２種の酵素をコードする遺伝子が発現することにより特定の反応が生じる場合において、一方の酵素は他方の酵素と「共役する」とよぶ。
【0055】
酵素（１）乃至（１０）は、上記した酵素活性を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。
【0056】
例えば、上記した酵素活性を有する酵素（１）の一態様として配列番号１１に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（２）の一態様として配列番号１２に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（３）の一態様として配列番号１３に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（４）の一態様として配列番号１４に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（５）の一態様として配列番号１５に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性する酵素（６）の一態様として配列番号１６に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（７）の一態様として配列番号１７に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（８）の一態様として配列番号１８に示すアミノ酸配列；上記した酵素活性を有する酵素（９）の一態様として配列番号１９に示すアミノ酸配列があり；上記した酵素活性を有する酵素（１０）の一態様として配列番号２０に示すアミノ酸配列がある。
【0057】
配列番号１１〜２０に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてアクレモニウム・スクレロティゲナムに由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＤ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ、ＡｓｃＨ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫタンパク質と名付けられる。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１〜１０に示す塩基配列である。
【0058】
（アスコクロリン・アスコフラノン生合成遺伝子）遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＧ、ａｓｃＨ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫ（以下、これらを総称して「酵素（１）乃至（１０）をコードする遺伝子」とよぶ場合がある。）は、上記した酵素活性を有する酵素（１）乃至（１０）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであれば特に限定されない。酵素（１）乃至（１０）をコードする遺伝子が生物体内で発現することにより酵素（１）乃至（１０）が生産される。
【0059】
酵素（１）乃至（１０）をコードする遺伝子は、遺伝子ａｓｃＡと同様に、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含むものであってもよい。このような野生型遺伝子の塩基配列に対してコドン改変が施された塩基配列としては、例えば、配列番号２１〜２４及び２８〜３０に記載の塩基配列などが挙げられる。
【0060】
（配列同一性を算出するための手段）塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
【0061】
２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
【0062】
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版 ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５−１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
【0063】
（遺伝子ａｓｃＡの由来）遺伝子ａｓｃＡは、例えば、イソプレノイドの生産能がある生物種やＡｓｃＡタンパク質の発現が見られる生物種などに由来する。遺伝子ａｓｃＡの由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられる。微生物の中でも糸状菌はイソプレノイド生産能があることが知られている菌種が多いことから好ましい。アスコクロリン生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）糸状菌、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）糸状菌、シリンドロカルポン属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）糸状菌、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）糸状菌、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）糸状菌などが挙げられ；アスコフラノン生産能を有する糸状菌の具体例としては、アクレモニウム属糸状菌、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）糸状菌、バーティシリウム属糸状菌などが挙げられる。より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ペシロマイセス・バリオッティ（Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉｉ）、バーティシリウム・ヘミプタリゲナム（Ｖ．ｈｅｍｉｐｔｅｒｉｇｅｎｕｍ）などが挙げられる。
【0064】
上記のとおり、遺伝子ａｓｃＡの由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現されるａｓｃＡタンパク質は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、活性を示すことが好ましい。そこで、遺伝子ａｓｃＡの由来生物は、遺伝子ａｓｃＡを挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
【0065】
（遺伝子工学的手法による遺伝子ａｓｃＡのクローニング）遺伝子ａｓｃＡは、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、遺伝子ａｓｃＡを含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。遺伝子ａｓｃＡの取得方法や、遺伝子ａｓｃＡの塩基配列、ＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。遺伝子ａｓｃＡのクローニングの一例を非限定的に後述する。
【0066】
遺伝子ａｓｃＡをクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、ＡｓｃＡタンパク質の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【0067】
例えば、遺伝子ａｓｃＡは、該遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。遺伝子ａｓｃＡの由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、アクレモニウム・スクレロティゲナムなどを挙げることができる。例えば、アクレモニウム・スクレロティゲナムを培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
【0068】
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【0069】
遺伝子ａｓｃＡを取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて遺伝子ａｓｃＡを構築することが可能である。
【0070】
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などの市販のキット；ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌 ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）や大腸菌 ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを用いて精製する。
【0071】
該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０−７８、１９８３）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ ＭＯＤＥＬ ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社製）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、ＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列を知り得る。
【0072】
（遺伝子ａｓｃＡを含む組換えベクターの構築）遺伝子ａｓｃＡを含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、遺伝子ａｓｃＡのいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、遺伝子ａｓｃＡの発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で遺伝子ａｓｃＡのいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社製）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
【0073】
（形質転換体の作製方法）形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、遺伝子ａｓｃＡが発現する態様で宿主生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、遺伝子ａｓｃＡのいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで遺伝子ａｓｃＡを含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、遺伝子ａｓｃＡを過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−目的遺伝子−ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【0074】
遺伝子ａｓｃＡが発現する態様で宿主生物に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
【0075】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。
【0076】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主生物を常法により形質転換することができる。
【0077】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主生物中でＡｓｃＡタンパク質を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【0078】
ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【0079】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｐｙｒＧ３、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で遺伝子ａｓｃＡを過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーター、ｇｐｄプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【0080】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、遺伝子ａｓｃＡの発現制御配列は、挿入する遺伝子ａｓｃＡを含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【0081】
ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、遺伝子ａｓｃＡの上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【0082】
ＤＮＡコンストラクトにはマーカーリサイクリングに必要な相同配列が含まれていてもよい。例えばｐｙｒＧマーカーは、ｐｙｒＧマーカーの下流に挿入部位（５’相同組み換え領域）の上流の配列と相同な配列を付加すること、又はｐｙｒＧマーカーの上流に挿入部位（３’相同組み換え領域）の下流の配列と相同な配列を付加することで、５−フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含んだ培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることが可能となる。マーカーリサイクリングに適した該相同配列の長さは０．５ｋｂ以上が好ましい。
【0083】
ＤＮＡコンストラクトの一態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーターであるＰｔｅｆ、遺伝子ａｓｃＡ、ｔｅｆ１遺伝子ターミネーターであるＴｔｅｆ及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【0084】
相同組み換えにより遺伝子を挿入する場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、遺伝子ａｓｃＡ、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【0085】
相同組み換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、遺伝子ａｓｃＡ、ａｌｐ遺伝子ターミネーター、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【0086】
宿主生物が糸状菌である場合、糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。
【0087】
また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えを利用して、宿主生物が本来染色体上に有する遺伝子ａｓｃＡのプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１−２３９６８１号公報に記載の実施例や図１を参照して、遺伝子ａｓｃＡの上流領域−形質転換マーカー遺伝子−高発現プロモーター−遺伝子ａｓｃＡの全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、遺伝子ａｓｃＡの上流領域及び遺伝子ａｓｃＡの全部又は部分が相同組換えのために利用される。遺伝子ａｓｃＡの全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
【0088】
形質転換体が作製されたことの確認は、ＡｓｃＡタンパク質が有するアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子の発現を増強する活性が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで培養後に得られた培養物における目的産物、例えば、イソプレノイドが検出されること、又は検出された目的産物の量が、同じ条件下で培養した宿主生物の培養物における目的産物の量よりも多いことを確認することにより行うことができる。
【0089】
また、形質転換体が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。この場合、例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【0090】
相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
【0091】
（宿主生物）宿主生物としては、遺伝子ａｓｃＡを含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、イソプレノイドを生産することができる生物であれば特に限定されず、例えば、微生物や植物などが挙げられ、微生物としては、アスペルギルス属微生物、アクレモニウム属微生物、ネオネクトリア属微生物、フザリウム属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属微生物、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属微生物、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属微生物、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属微生物、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属微生物、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属微生物、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属微生物、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属微生物、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属微生物、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属微生物、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属微生物、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属微生物、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属微生物、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属微生物、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属微生物、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属微生物、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属微生物、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属微生物、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属微生物、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属微生物、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属微生物、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属微生物、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属微生物、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属微生物、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属微生物、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属微生物、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属微生物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属植物などが挙げられ、微生物及び植物が好ましい。宿主生物は遺伝子ａｓｃＡをゲノムＤＮＡ上に有する生物であってもよい。
【0092】
宿主生物は、イソプレノイドの生産能が認められる生物である。したがって、宿主生物がアスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子を有さないことなどにより、イソプレノイドの生産能が認められない場合は、遺伝子ａｓｃＡだけではなく、アスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子により形質転換する。すなわち、アスコクロリン生合成遺伝子やアスコフラノン生合成遺伝子を導入して、イソプレノイドを異種発現するように形質転換した形質転換体、例えば、形質転換糸状菌も宿主生物として利用可能である。ただし、どのような場合であっても、宿主生物からヒトは除かれる。
【0093】
イソプレノイドの生産能が認められる生物としては、アクレモニウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、フザリウム属糸状菌、シリンドロカルポン属糸状菌、バーティシリウム属糸状菌、ネクトリア属糸状菌、ペシロマイセス属糸状菌などが挙げられ、より具体的にはアクレモニウム・スクレロティゲナム、ペシロマイセス・バリオッティ、バーティシリウム・ヘミプタリゲナムなどが挙げられる。
【0094】
糸状菌の中では、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａ．ｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）などのアスペルギルス属微生物などが好ましい。
【0095】
なお、アクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物をはじめとして糸状菌は相同組換え頻度が低いことから、相同組換えで形質転換体を作製する場合には、非相同組換え機構に関与するＫｕ７０、Ｋｕ８０などのＫｕ遺伝子が抑制された形質転換糸状菌を使用することが好ましい。
【0096】
このようなＫｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができるが、例えば、Ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用したＫｕ遺伝子を破壊することや、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することなどによって達成可能である。こうして得られる形質転換アスペルギルス属微生物は、Ｋｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元のアスペルギルス属微生物と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約５０倍上昇している。
【0097】
（遺伝子ａｓｃＡの具体例）アクレモニウム・スクレロティゲナム由来の遺伝子ａｓｃＡとしては、例えば、配列番号３７に記載の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。なお、配列番号３７に記載の塩基配列を有するＤＮＡがコードするＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列は配列番号４０に記載のアミノ酸配列である。
【0098】
アクレモニウム・スクレロティゲナム及びアクレモニウム・スクレロティゲナム以外の生物から遺伝子ａｓｃＡを得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ａｓｃＡの塩基配列（配列番号３７）に基づいて、対象生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ａｓｃＡの塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、対象生物の総タンパク質を基に、ＡｓｃＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４０）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。
【0099】
アクレモニウム・スクレロティゲナムから得られた遺伝子ａｓｃＡ、又は遺伝子ａｓｃＡと配列同一性を有する酵素をコードする遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス属微生物やアクレモニウム属微生物等の任意の宿主細胞に導入して形質転換することができる。
【0100】
（形質転換体）形質転換体の一態様は、糸状菌や植物などを宿主生物として、遺伝子ａｓｃＡが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体である。宿主生物が本来的に遺伝子ａｓｃＡを含むアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する生物である場合は、挿入された遺伝子ａｓｃＡは恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることなどして、遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体であることが望ましい。このような形質転換体は、発現したＡｓｃＡタンパク質の作用によって宿主生物では実質的に生産しない、又は生産したとしても微量であるイソプレノイドを検出可能又はそれ以上に生産することができる。
【0101】
（方法）本発明の一態様の方法は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、該糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる工程を含む、糸状菌によるイソプレノイドの産生を増大させる方法である。本発明の別の一態様の方法は、アスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌において、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。本発明の別の一態様の方法は、遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体を培養することにより、イソプレノイドを得る工程を含む、イソプレノイドの製造方法である。
【0102】
ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段は特に限定されないが、例えば、使用する糸状菌として、遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体を用いること；遺伝子ａｓｃＡを含むアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌について、培養条件を調整することや他の転写因子を導入するなどして、該糸状菌が本来有する遺伝子ａｓｃＡの発現を増強することなどの手段が挙げられる。
【0103】
糸状菌によるイソプレノイドの産生が増大しているか否かは、例えば、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段を講じていないアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌のイソプレノイドの産生量と、ＡｓｃＡタンパク質又は遺伝子ａｓｃＡの発現を増強する手段を講じたアスコクロリン生合成遺伝子及び／又はアスコフラノン生合成遺伝子を有する糸状菌のイソプレノイドの産生量とを比較することにより確認することができる。
【0104】
遺伝子ａｓｃＡの発現が増強するように形質転換された形質転換体の培養は、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で形質転換体を培養することなどが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、宿主生物が糸状菌である場合は、通気又は非通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。
【0105】
以下では、主として宿主生物や野生型生物が糸状菌である場合の製造方法について記載するが、本発明の各態様の方法は下記記載に限定されない。
【0106】
培地は、宿主生物や野生型生物（以下では、これらを総称して「宿主生物等」ともよぶ。）を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物等がアクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＧＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。
【0107】
形質転換体の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物等の培養条件を採用すればよく、例えば、宿主生物等が糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１〜７日間、より好ましくは２〜４日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アクレモニウム属微生物やアスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＧＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３〜５日間の振盪培養が挙げられる。
【0108】
培養終了後に培養物から目的産物（イソプレノイド）を抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
【0109】
抽出溶媒は目的産物が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながら目的産物を抽出する。
【0110】
また、上記加温処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。
【0111】
得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより目的産物を精製することができる。
【0112】
定性的分析又は定量的分析は、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳなどにより行うことができる。これらの分析の条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
【0113】
本発明の各態様の製造方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【0114】
（用途）本発明の一態様のタンパク質、遺伝子、形質転換体及び方法を利用して得られたイソプレノイドは、抗原虫活性、抗腫瘍活性、血糖低下作用、血中脂質低下作用、糖化阻害作用、抗酸化作用などの種々の生理活性を有することが期待できる機能性生体物質であるとともに、その特徴を活かして、医薬品、医薬部外品などやこれらの製品を製造するための原料として利用可能である。
【0115】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【0116】
（アスコクロリン生合成遺伝子の探索）アスコフラノン産生菌であるアクレモニウム・スクレロティゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｕｍ Ｆ−１３９２株；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．７０：３０４−３０７（２０１６）参照）を用いて、アスコフラノンの産生量が４００倍以上異なる２つの培養サンプルを取得した。
【0117】
それらのサンプルから、５０〜１００ｍｇの菌体を回収し、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、標準プロトコールに従って全ＲＮＡを回収した。
【0118】
回収した全ＲＮＡから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｍＲＮＡを単離し、トランスクリプトームライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー）をＩｏｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ−ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて構築した。
【0119】
なお、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの品質及びトランスクリプトームライブラリーの濃度測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ ｐｉｃｏ ｋｉｔ及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｉｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ともにＡｇｉｌｅｎ社製）を用いて確認した。
【0120】
得られたｃＤＮＡライブラリーのＲＮＡシーケンス解析をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシステムを用いて以下のように行った。
【0121】
得られたｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ２０ｐｍｏｌ／Ｌに希釈し、Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ ２を用いてエマルジョンＰＣＲによってライブラリーの増幅を行った。増幅したライブラリーは、Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ ＥＳを用いて濃縮し、Ｉｏｎ ＰＧＭ ｓｙｓｔｅｍによってＲＮＡシーケンス解析を行った。Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ ２にはＩｏｎ ＰＧＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＯＴ２ ２００ Ｋｉｔを用い、Ｉｏｎ ＰＧＭにはＩｏｎ ＰＧＭ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ２００ Ｋｉｔ ｖ２を用いた。
【0122】
ＲＮＡシーケンスにはＩｏｎ ＰＧＭ Ｉｏｎ ３１６ ｖ２チップを使用した。得られたシーケンス情報をアクレモニウム・スクレロティゲナムのゲノム配列データベースにマッピングし、２つのサンプル間における遺伝子の発現量の違いを解析した。
【0123】
マッピングされたｃＤＮＡのリード数をそれぞれの遺伝子の長さで補正した値（ＲＰＫＭ: ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ）を基に、高生産サンプルと低生産サンプルとの間の発現倍率を計算した。
【0124】
高生産サンプルの遺伝子のうち、低生産サンプルのものと比較して３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子の探索を行った結果、２遺伝子以上が連続しており、３００倍以上の倍率で高発現している遺伝子が集中した唯一の領域を見出すことができた。これがアスコフラノン生合成遺伝子クラスターであると予測し、３００倍以上の倍率で高発現していた遺伝子をａｓｃＡ〜Ｈと名付けた（図１を参照）。
【0125】
また、それぞれの遺伝子のコードするタンパク質について、ｂｌａｓｔ検索やＰｆａｍによるドメイン検索を行った結果、ＡｓｃＡ〜Ｈは表１のような機能を持つことが予測された。このうち、ＡｓｃＡは、転写因子であると考えられたため、アスコフラノンの生合成には遺伝子ａｓｃＢ〜Ｈ（配列番号１〜７）がコードするＡｓｃＢ〜Ｈタンパク質（配列番号１１〜１７）が関与すると予想された。
【0126】
【表1】
【0127】
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥ発現形質転換体の作製）麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ＮＲＲＣ４２３９株）のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株に、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２１〜２４の遺伝子ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットを導入した。
【0128】
具体的には、各ａｓｃ遺伝子を発現させるための発現カセットとして、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号２５）をプロモーターとして用い、及びアルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号２６）をターミネーターとして用いた。また、選択マーカーとしてはウラシル／ウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５,３５ｂｐを含む１，８３８ｂｐ、配列番号２７）を用いた。
【0129】
例えば、ユーンらの文献（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００９ Ｍａｒ;８２（４）:６９１−７０１. ｄｏｉ: １０．１００７／ｓ００２５３−００８−１８１５−５. Ｅｐｕｂ ２００８ Ｄｅｃ ２４. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｉｎｔｕｐｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ.）で報告されているように、形質転換に用いるＤＮＡ中に遺伝子挿入位置（相同組み換え領域）の上流又は下流の配列と相同な配列が含まれている場合、５−フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含む培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることができ、何度もｐｙｒＧマーカーを使用すること（マーカーリサイクリング）が可能となる。よって、５’相同組み換え配列（５’ａｒｍ）、Ｐｔｅｆ、ａｓｃ遺伝子、Ｔａｌｐ、マーカーリサイクリング用相同配列（下流遺伝子との相同配列；ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ）、ｐｙｒＧ、３’相同組み換え配列（３’ａｒｍ）の順に連結したものを形質転換用ＤＮＡとして用いることでｐｙｒＧのマーカーリサイクルを行い、各ａｓｃ遺伝子の発現カセットをアスペルギルス・ソーヤの染色体上へａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＥの順に挿入した。
【0130】
また、それぞれのＤＮＡの連結にはＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用した。例えば、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとを連結させる場合には、Ｐｔｅｆは配列番号３１及び３２のプライマーを、ａｓｃＤは配列番号３３及び３４のプライマーを用いてＰＣＲ反応によりそれぞれのＤＮＡ断片を増幅させた。このとき、遺伝子ａｓｃＤ用のフォワードプライマーには、５’末端にＰｔｅｆと相同な配列が１５ｂｐ付加されているため、Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により、Ｐｔｅｆと遺伝子ａｓｃＤとの連結が可能となる。
【0131】
以上のようにして調製した５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＤ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍ、５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＢ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍ、５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＣ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍ、５’ａｒｍ−Ｐｔｅｆ−ａｓｃＥ−Ｔａｌｐ−ｌｏｏｐ ｏｕｔ ｒｅｇｉｏｎ−ｐｙｒＧ−３’ａｒｍの形質転換用ＤＮＡを用いて、アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株／ｋｕ７０破壊株を形質転換することで、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、及びａｓｃＥのいずれかを含む発現カセットのそれぞれを順に１コピーずつ導入したＡｓ−Ｄ株、Ａｓ−ＤＢ株、Ａｓ−ＤＢＣ株及びＡｓ−ＤＢＣＥ株を取得した。
【0132】
次に、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）にＡｓ−Ｄ株、Ａｓ−ＤＢ株、Ａｓ−ＤＢＣ株及びＡｓ−ＤＢＣＥ株を植菌し、３０℃で４日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除いた。
【0133】
回収した菌体をアセトンに１晩浸漬し、フィルター処理することでＡｓ−ＤＢＣＥ株のアセトン抽出物を取得した。得られたアセトン抽出物を濃縮乾固し、メタノールに溶解した後、ＨＰＬＣ解析及びＭＳ解析（ネガティブモード）を行ったところ、Ａｓ−Ｄ株では宿主株（ＮＢＲＣ４２３９株）では見られなかった新たなピークがｏ−オルセリン酸の標準品と同じ溶出位置に確認された。また、Ａｓ−ＤＢ株ではＡｓ−Ｄ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はイリシコリン酸Ｂに相当する３７１であることがわかった。また、Ａｓ−ＤＢＣ株ではＡｓ−ＤＢ株では見られなかった新たなピークが確認され、ＭＳ解析の結果、該ピークのｍ／ｚ値はＬ−Ｚ１２７２βに相当する３５５であることがわかった。さらに、Ａｓ−ＤＢＣＥ株ではＡｓ−ＤＢＣ株では見られなかった新たなピークがわずかながら確認され、該ピークはイリシコリンＡ（ｉｌｉｃｉｃｏｌｉｎ Ａ）標準品と同じ溶出位置に見られた（図２を参照）。
【0134】
なお、図２のＨＰＬＣは、メタノール：水：酢酸（４５０：５０：１０）を移動相（１ｍｌ／ｍｉｎ）とし、粒子径３μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ（ＴＯＳＯＨ社製）のＯＤＳカラムを用いて実施した。
【0135】
さらに、特願２０１６−２０９１７８号明細書に記載のｐｙｒＧ３遺伝子（配列番号４１）を用いて、遺伝子ａｓｃＤ、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ及びａｓｃＥをそれぞれ多コピーで導入したＡｓ−ＤＢＣＥ−ｍｕｌｔｉ−ｃｏｐｙ株では、イリシコリンＡが多く蓄積していることがわかった（図２を参照）。なお、ｐｙｒＧ３遺伝子は、糸状菌において、任意の遺伝子を多コピーで染色体に組み込むための、ｐｙｒＧ内のプロモーター領域を改変し、発現量を低下させた選択マーカー遺伝子である。
【0136】
また、ＬＣ／ＭＳ解析により、該ピークの化合物がイリシコリンＡ標準品と同じｍ／ｚ値３８９（ｎｅｇａｔｉｖｅモード）を示すこと、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析においてもイリシコリンＡ標準品と同様のピークパターンを示したことから、発現したＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ及びＡｓｃＥタンパク質によって、イリシコリンＡが生合成されていることがわかった。なお、図２中で、約７分の溶出位置で見えているピークは、Ａｓ−ＤＢＣ株で確認されたピークと溶出位置が一致しており、ＭＳ解析の結果、ＬＬ−Ｚ１２７２βのｍ／ｚ値と一致していることがわかった。
【0137】
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨ発現形質転換体の作製）Ａｓ−ＤＢＣＥ株と同様にして、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２８〜３０の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨのいずれかを含む発現カセットを順次導入することで、ＡｓｃＦ発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦ株；ＡｓｃＦ及びＡｓｃＧの発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦＧ株；及び、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨの発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦＧＨ株を作製した。これらの株を上記と同様にして培養し、ＨＰＬＣ解析を行った。
【0138】
なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０〜１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．２５ｍｌ/ｍｉｎで、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のＯＤＳカラムを用いて解析を行った。
【0139】
図３に示すとおり、Ａｓ−ＤＢＣＥＦ株ではＡｓ−ＤＢＣＥ株では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ−ＤＢＣＥＦＧ株ではＡｓ−ＤＢＣＥＦ株では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、Ａｓ−ＤＢＣＥＦＧＨ株ではＡｓ−ＤＢＣＥＦＧ株では見られなかった新たなピークが確認された。
【0140】
このことから、イリシコリンＡ以降は、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用して反応が進むことがわかった。
【0141】
（粗酵素液を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ解析）アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株に対し、麹菌発現用にコドンを改変した配列番号２８〜３０の遺伝子ａｓｃＦ、ａｓｃＧ及びａｓｃＨの発現カセットのいずれかを多コピーで導入したＡｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｇ株及びＡｓ−Ｈ株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ｐｔｅｆ−ａｓｃ遺伝子−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ３をｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮＡを形質転換用ＤＮＡとして用いた。
【0142】
アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株（野生株）、Ａｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｇ株及びＡｓ−Ｈ株のそれぞれをＧＰＹ培地で１日培養し、培養後の菌体の水分を取り除いた後、液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。粉砕した菌体に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を加えることで野生株、Ａｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｇ株及びＡｓ−Ｈ株の粗酵素液を抽出した。
【0143】
得られた粗酵素液（菌体５〜１０ｍｇ分）を用いて以下の反応液（１）〜（４）を調製した：（１）野生株反応液：野生株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（２）Ａｓ−Ｆ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（３）Ａｓ−ＦＧ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｇ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（４）Ａｓ−ＦＧＨ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｇ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｈ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
【0144】
上記反応液（１）〜（４）をそれぞれ室温で一晩反応させた。次いで、それぞれの反応液に対して、酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮乾固した後に、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。
【0145】
ＬＣ解析は、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のカラムを用いて、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０％〜１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＭＳ解析はｎｅｇａｔｉｖｅモードで行った。
【0146】
その結果、図４Ａに示すとおり、Ａｓ−Ｆ反応液ではｍ／ｚ値４２３において野生株反応液では見えなかった新たなピークが確認された。また、図４Ｂに示すとおり、Ａｓ−ＦＧ反応液ではｍ／ｚ値４０５においてＡｓ−Ｆ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。さらに、図５に示すとおり、Ａｓ−ＦＧＨ反応液ではｍ／ｚ値４０３においてＡｓ−ＦＧ反応液やＡｓ−ＦＧ反応液では見られなかった新たなピークが確認された。また、Ａｓ−ＦＧＨ反応液で確認されたピークはアスコクロリン標準品のピークと溶出時間が一致し、さらにアスコクロリンのｍ／ｚ値は４０３であることから、これらの結果よりイリシコリンＡからＡｓｃＦ、ＡｓｃＧ及びＡｓｃＨタンパク質が順次作用することによりアスコクロリンが生合成されることがわかった。
【0147】
以上のように、アスコフラノン生合成に関与すると予測した遺伝子クラスターは、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターであることがわかった。予想されるアスコクロリンの生合成スキームを図６に示す。図６に示すとおり、アスコクロリンの生合成経路は、アスコフラノンの生合成経路とは、一部重複があるものの、全く別異なものであることがわかった。このことより、アスコクロリンの生合成遺伝子クラスターを導入した形質転換体により生産されるものは、アスコクロリンであってアスコフラノンではないことがわかった。
【0148】
（アスコフラノン生合成遺伝子の探索）図６に示すとおり、イリシコリンＡエポキシドによりアスコフラノンが生合成されるためには、一原子酸素添加反応が必要であると想定し、この反応にはＡｓｃＦ以外の別のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが関与していると予測した。そこで、上記のＲＮＡシーケンス解析の結果を用いて、アスコフラノン高生産サンプルにおいて高発現しているＰ４５０遺伝子を探索した。その結果、アスコフラノン高生産サンプルにおいて、ＡｓｃＦの約６割の発現量を有し、且つ低生産サンプルではほとんど発現していないＰ４５０遺伝子を新たに見出した。また、該Ｐ４５０遺伝子の隣接する２つの遺伝子も同様にアスコフラノン高生産サンプルでのみ高発現していることがわかり、これら３つの遺伝子がクラスターを形成していることが示唆された（図７を参照）。該Ｐ４５０遺伝子に隣接する２つの遺伝子のコードするタンパク質について、ｂｌａｓｔ検索やＰｆａｍによるドメイン検索を行った結果、一方は機能未知のタンパク質であり、もう一方はデヒドロゲナーゼであることがわかった。
【0149】
（粗酵素液を用いたアスコフラノン合成）上記にようにして見出した３つの遺伝子、Ｐ４５０遺伝子（配列番号８）、機能未知遺伝子（配列番号９）及びデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号１０）を、それぞれａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫと名付けた。また、これらの遺伝子がそれぞれコードするＡｓｃＩタンパク質（配列番号１８）、ＡｓｃＪタンパク質（配列番号１９）及びＡｓｃＫタンパク質（配列番号２０）がアスコフラノンの生合成に関与する酵素であるかをｉｎ ｖｉｔｒｏ解析で確認することにした。
【0150】
アスペルギルス・ソーヤ ＮＲＲＣ４２３９株のｐｙｒＧ破壊株に対し、配列番号８〜１０の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫの発現カセットのいずれかを導入したＡｓ−Ｉ株、Ａｓ−Ｊ株及びＡｓ−Ｋ株を作製した。これらの株の作製にあたっては、Ｐｔｅｆ−ａｓｃ遺伝子−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧをｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮＡを形質転換用ＤＮＡとして用いた。
【0151】
Ａｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｉ株、Ａｓ−Ｊ株及びＡｓ−Ｋ株のそれぞれをＧＰＹ培地で１日培養し、培養後の菌体の水分を取り除いた後、液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した。粉砕した菌体に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を加えることでＡｓ−Ｆ株、Ａｓ−Ｉ株、Ａｓ−Ｊ株及びＡｓ−Ｋ株の粗酵素液を抽出した。
【0152】
得られた粗酵素液（菌体５〜７．５ｍｇ分）を用いて以下の反応液（１）〜（７）を調製した：（１）Ａｓ−Ｆ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（２）Ａｓ−ＦＩ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｉ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（３）Ａｓ−ＦＩＪ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｊ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（４）Ａｓ−ＦＩＫ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（５）Ａｓ−ＦＪＫ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｊ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（６）Ａｓ−ＩＪＫ反応液：Ａｓ−Ｉ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｊ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｋ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
（７）Ａｓ−ＦＩＪＫ反応液：Ａｓ−Ｆ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｇ株の粗酵素液、Ａｓ−Ｈ株の粗酵素液、イリシコリンＡの標準品、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＡＴＰ及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液
【0153】
上記反応液（１）〜（７）をそれぞれ３０℃で１時間反応させた。次いで、それぞれの反応液に対して、酢酸エチルで抽出を行い、得られた抽出物を濃縮乾固した後に、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。
【0154】
ＬＣ解析は、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のカラムを用いて、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０％〜１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＭＳ解析はｎｅｇａｔｉｖｅモードで行った。ＬＣ／ＭＳ解析の結果を図８及び図１０に示し、ＭＳ／ＭＳ解析の結果を図９に示す。
【0155】
その結果、図８に示すとおり、（７）Ａｓ−ＦＩＪＫ反応液でのみアスコフラノンに相当するｍ／ｚ値４１９のピークがアスコフラノン標準品と同じ溶出時間に検出された。さらに、（７）で検出されたｍ／ｚ値４１９のピークについて、コリジョンエネルギー４５ｅｖでＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、図９で示すようにアスコフラノン標準品と同様のフラグメンテーションパターンを示した。
【0156】
また、図１０に示すとおり、（２）Ａｓ−ＦＩ反応液では、（１）Ａｓ−Ｆ反応液では見られなかったｍ／ｚ値４３９の新たなピークが検出され、さらに該ピークはＡｓｃＦ及びＡｓｃＩの両方ともが反応液中に存在するときにのみ検出された。つまり、このｍ／ｚ値４３９のピークは、イリシコリンＡを基質としてＡｓｃＦ及びＡｓｃＩが順に反応して生成した化合物（の加水分解産物）に由来すると考えられ、ｍ／ｚ値の差と、ＡｓｃＩがＰ４５０であることとから考慮すると、ＡｓｃＩは一原子酸素添加酵素（モノオキシゲナーゼ）として機能していることが強く示唆された。
【0157】
以上より、図１１に示すとおり、イリシコリンＡを基質として、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫが反応することにより、アスコフラノンが生成されることがわかった。
【0158】
（ＡｓｃＤ、ＡｓｃＢ、ＡｓｃＣ、ＡｓｃＥ、ＡｓｃＦ、ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ及びＡｓｃＫ発現形質転換体の作製）上記と同様にして、配列番号８〜１０の遺伝子ａｓｃＩ、ａｓｃＪ、ａｓｃＫ及び配列番号３５のＡ．ｓｏｊａｅ ＮＢＲＣ４２３９株由来Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子をそれぞれ含む発現カセットを、ｐｙｒＧマーカーリサイクリング後のＡｓ−ＤＢＣＥＦ株に順次導入することで、ＡｓｃＩ及びＰ４５０レダクターゼの発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株；ＡｓｃＩ、ＡｓｃＪ、ＡｓｃＫ及びＰ４５０レダクターゼの発現カセットを導入したＡｓ−ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株をそれぞれ作製した。これらの株を５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを添加したＧＰＹ培地で培養し、上記と同様にしてＨＰＬＣ解析を行った。
【0159】
なお、ＨＰＬＣは、アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＡ液、水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸をＢ液とし、Ａ液４０〜１００％（５０ｍｉｎ）のグラジエント条件下で、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２ ＯＤＳ（粒子径３μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ；化学物質評価研究機構社製）のＯＤＳカラムを用いて解析を行った。結果を図１２に示す。
【0160】
図１２に示すとおり、Ａｓ−ＤＢＣＥＦＩＪＫｒｅｄ株ではＡｓ−ＤＢＣＥＦＩｒｅｄ株では見られなかったｍ／ｚ値４１９のアスコフラノンに相当するピークが確認された。また、該ピークはアスコフラノン標準品のピークと溶出時間が一致した。これにより、ａｓｃＢ、ａｓｃＣ、ａｓｃＤ、ａｓｃＥ、ａｓｃＦ、ａｓｃＩ、ａｓｃＪ及びａｓｃＫはアスコフラノンの生合成遺伝子であることがわかった。
【0161】
したがって、図６で予想したとおり、アスコフラノン及びアスコクロリンの生合成については、ＡｓｃＤ、Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦまでの反応は両者で共通しており、イリシコリンＡエポキシド以降の反応が異なっていることがわかった。具体的には、イリシコリンＡエポキシドにＡｓｃＩが反応した場合はアスコフラノン生合成へ、イリシコリンＡエポキシドにＡｓｃＧが反応した場合はアスコクロリン生合成へつながることがわかった（図１１を参照）。
【0162】
（ＡｓｃＡ強制発現ベクターの作製）上記のとおり、遺伝子ａｓｃＢ〜遺伝子ａｓｃＨはアスコクロリンの生合成遺伝子であることがわかった。また、遺伝子ａｓｃＢ〜遺伝子ａｓｃＦ及び遺伝子ａｓｃＩ〜遺伝子ａｓｃＫはアスコフラノンの生合成遺伝子であることがわかった。次に、表１のクラスターに存在する転写因子をコードする遺伝子ａｓｃＡがアスコクロリンやアスコフラノンの生合成遺伝子の発現を制御しているのかを以下のとおりに検証した。
【0163】
ＲＮＡシーケンスの結果より、遺伝子ａｓｃＡはアスコフラノン高生産培地において高発現していたことから、アスコクロリン生合成遺伝子群やアスコフラノン生合成遺伝子群を正に制御するのではないかと考えた。そこで、アクレモニウム・スクレロティゲナムにおいて、遺伝子ａｓｃＡを強制発現させることでアスコクロリンやアスコフラノンの生産が誘導されるかどうかを調べるため、下記のようにしてＡｓｃＡ強制発現ベクターを作製した。
【0164】
まず、アクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ−１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、配列番号３６のｔｅｆ１遺伝子プロモーター（Ｐｔｅｆ）、配列番号３７の遺伝子ａｓｃＡ、配列番号３８のｔｅｆ１遺伝子ターミネーター（Ｔｔｅｆ）、配列番号３９のｐｙｒＧ遺伝子をクローニングし、Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ反応によりそれぞれを連結することで、Ｐｔｅｆ−ａｓｃＡ−Ｔｔｅｆ−ｐｙｒＧのａｓｃＡ強制発現カセットがｐＵＣ１９に挿入されたａｓｃＡ強制発現ベクターを作製した。
【0165】
なお、配列番号３７の遺伝子ａｓｃＡはイントロンを含んでいる塩基配列であるが、ＲＮＡシーケンスの結果、遺伝子ａｓｃＡにコードされているＡｓｃＡタンパク質は配列番号４０のアミノ酸配列からなることがわかった。
【0166】
（アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ−１３９２株のｐｙｒＧ破壊株の作製）アクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ−１３９２株において、任意の遺伝子を導入することを可能とするため、ｐｙｒＧ破壊株を作製することにした。アクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ−１３９２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ｐｙｒＧ ＯＲＦの上流３ｋｂのＤＮＡ断片（５’ｐｙｒＧ）；ｐｙｒＧ ＯＲＦの１４７塩基目から下流１．７ｋｂのＤＮＡ断片（３’ｐｙｒＧ）及びＴｔｅｆ（配列番号３８）を増幅した。ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇｒ）はＬｉｎｅａｒ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ社）を鋳型としてＰＣＲ反応を行い増幅させた。次に、増幅させた各ＤＮＡ断片をＩｎ ｆｕｓｉｏｎ反応により連結することで、５’ｐｙｒＧ−ｈｙｇｒ−Ｔｔｅｆ−３’ｐｙｒＧからなるｐｙｒＧ破壊株作製用ＤＮＡ断片を調製した。
【0167】
次に、アクレモニウム・スクレロティゲナムＦ−１３９２株のプロトプラストを文献ＣＹＴＯＬＯＧＩＡ，８２（３）：３１７−３２０ ＪＵＮ ２０１７に記載の方法に従い調製した。そして、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、文献Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９を参照）により、５’ｐｙｒＧ−ｈｙｇｒ−Ｔｔｅｆ−３’ｐｙｒＧを導入することでｐｙｒＧ破壊株を作製した。なお、ＰＥＧ処理後のプロトプラストは再生用寒天培地（３．５％ Ｃｚａｐｅｃｋ ｂｏｒｔｈ、１．２Ｍ ソルビトール、２０ｍＭ ウラシル、２０ｍＭ ウリジン、２％ Ａｇａｒ）上に重層し、２５℃で一晩培養した後、２ｍｇ／Ｌの５ＦＯＡ及び１００ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む再生用寒天培地（０．７％ Ａｇａｒ） ５ｍＬをさらに重層して、３０℃で２〜３週間培養した。
【0168】
（ＡｓｃＡ強制発現株におけるアスコクロリン生産性及びアスコフラノン生産性の評価）上記で作製したアクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ−１３９２株のｐｙｒＧ破壊株に対し、ＡｓｃＡ強制発現ベクターを導入することでＡｓｃＡ強制発現株を作製した。
【0169】
アクレモニウム・スクレロティゲナム Ｆ−１３９２株（野生株）と、作製したＡｓｃＡ強制発現株とを、それぞれＧＰＹ液体培地中で４日間、３０℃で培養し、上記と同様にしてＨＰＬＣ解析を行った。結果を図１３に示す。
【0170】
図１３に示すとおり、野生株はＧＰＹ培地中ではアスコクロリン及びアスコフラノンを全く生産しなかった。それに対して、ＡｓｃＡ強制発現株ではアスコクロリン及びアスコフラノンの両方の生産が確認された。
【0171】
これまで、野生株では限られた培地でしかアスコクロリン及びアスコフラノンが生産されず、僅かな培養条件の違いで生産量が大きく異なることが課題であった。しかし、ＡｓｃＡ強制発現株を使用すれば、所定の培養条件に設定せずとも、アスコクロリン及びアスコフラノンの生産が可能となり、アスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡといったイソプレノイドの安定的な工業生産が実現でき、産業上非常に有用である。
【0172】
配列表に記載の配列は、以下のとおりである：［配列番号１］ａｓｃＢ
［配列番号２］ａｓｃＣ
［配列番号３］ａｓｃＤ
［配列番号４］ａｓｃＥ
［配列番号５］ａｓｃＦ
［配列番号６］ａｓｃＧ
［配列番号７］ａｓｃＨ
［配列番号８］ａｓｃＩ
［配列番号９］ａｓｃＪ
［配列番号１０］ａｓｃＫ
［配列番号１１］ＡｓｃＢタンパク質
［配列番号１２］ＡｓｃＣタンパク質
［配列番号１３］ＡｓｃＤタンパク質
［配列番号１４］ＡｓｃＥタンパク質
［配列番号１５］ＡｓｃＦタンパク質
［配列番号１６］ＡｓｃＧタンパク質
［配列番号１７］ＡｓｃＨタンパク質
［配列番号１８］ＡｓｃＩタンパク質
［配列番号１９］ＡｓｃＪタンパク質
［配列番号２０］ＡｓｃＫタンパク質
［配列番号２１］コドン改変ａｓｃＢ
［配列番号２２］コドン改変ａｓｃＣ
［配列番号２３］コドン改変ａｓｃＤ
［配列番号２４］コドン改変ａｓｃＥ
［配列番号２５］Ｐｔｅｆ
［配列番号２６］Ｔａｌｐ
［配列番号２７］ｐｙｒＧ
［配列番号２８］コドン改変ａｓｃＦ
［配列番号２９］コドン改変ａｓｃＧ
［配列番号３０］コドン改変ａｓｃＨ
［配列番号３１］Ｐｔｅｆ−Ｆｗ
［配列番号３２］Ｐｔｅｆ−Ｒｖ
［配列番号３３］ａｓｃＤ−Ｆｗ
［配列番号３４］ａｓｃＤ−Ｒｖ
［配列番号３５］Ａ．ｓｏｊａｅ由来Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子
［配列番号３６］Ｐｔｅｆ
［配列番号３７］ａｓｃＡ
［配列番号３８］Ｔｔｅｆ
［配列番号３９］ｐｙｒＧ
［配列番号４０］ＡｓｃＡタンパク質
［配列番号４１］ｐｙｒＧ３
【産業上の利用可能性】
【0173】
本発明の一態様であるタンパク質、遺伝子、形質転換体及び方法は、アスコクロリン、アスコフラノン、イリシコリンＡといったイソプレノイドを大量に製造するために利用することができる。したがって、本発明は、イソプレノイドを工業的規模で製造するために利用可能である。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]