特開 2019-41715 栄養強化食品の製造方法、ユーグレナ含有食品組成物及び食品の栄養強化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2019-41715(P2019-41715A)

(43)【公開日】2019年3月22日

(54)【発明の名称】栄養強化食品の製造方法、ユーグレナ含有食品組成物及び食品の栄養強化方法

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/10 20160101AFI20190222BHJP

   A23L 11/00 20160101ALI20190222BHJP

   A23L 2/38 20060101ALI20190222BHJP

   A23L 2/02 20060101ALI20190222BHJP

   A23L 9/10 20160101ALI20190222BHJP

   A23L 5/43 20160101ALI20190222BHJP

   C12N 1/12 20060101ALI20190222BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20190222BHJP

【ＦＩ】

   A23L33/10

   A23L11/00 104

   A23L11/00 109Z

   A23L2/38 D

   A23L2/02 F

   A23L2/02 E

   A23L2/02 A

   A23L9/10

   A23L2/38 F

   A23L5/43

   C12N1/12 C

   C12N1/20 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2017-170589(P2017-170589)

(22)【出願日】2017年9月5日

(71)【出願人】

【識別番号】506141225

【氏名又は名称】株式会社ユーグレナ

(71)【出願人】

【識別番号】000125370

【氏名又は名称】学校法人東京理科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088580

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 敦

(74)【代理人】

【識別番号】100111109

【弁理士】

【氏名又は名称】城田 百合子

(72)【発明者】

【氏名】山下 恭平

(72)【発明者】

【氏名】徳永 英司

(72)【発明者】

【氏名】山田 康嗣

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 健吾

【テーマコード（参考）】

4B018

4B020

4B025

4B065

4B117

【Ｆターム（参考）】

4B018LB03

4B018LB04

4B018LB06

4B018LB08

4B018MC01

4B018MD52

4B018MD53

4B018MD58

4B018MD72

4B018MD86

4B018MD89

4B018ME02

4B018MF13

4B020LB02

4B020LB13

4B020LB18

4B020LC05

4B020LG05

4B020LG06

4B020LK17

4B020LK18

4B020LP18

4B020LQ06

4B020LR10

4B020LY10

4B025LB17

4B025LG52

4B025LG56

4B025LK07

4B025LP19

4B065AA83X

4B065BB26

4B065BB27

4B065BC01

4B065CA42

4B117LC04

4B117LG05

4B117LG08

4B117LG09

4B117LG11

4B117LK22

4B117LL09

4B117LP05

(57)【要約】

【課題】ユーグレナを食品中で培養することによりユーグレナを分離、回収、乾燥することなく、ユーグレナ含有食品として利用することが可能な、栄養強化食品の製造方法及びユーグレナ含有食品組成物を提供する。
【解決手段】ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、を行うことを特徴とする栄養強化食品の製造方法により解決される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、
前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、
前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、
を行うことを特徴とする栄養強化食品の製造方法。

【請求項2】

前記ゲル状食品は、豆腐、卵黄プディングから選択されることを特徴とする請求項１に記載の栄養強化食品の製造方法。

【請求項3】

前記野菜飲料はトマトジュースであることを特徴とする請求項１に記載の栄養強化食品の製造方法。

【請求項4】

前記果実飲料はブドウ果汁又はプルーン果汁を含有することを特徴とする請求項１に記載の栄養強化食品の製造方法。

【請求項5】

前記大豆食品は、豆乳飲料、納豆、豆腐を含む群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の栄養強化食品の製造方法。

【請求項6】

前記食品は、納豆と、
海苔又は煮干から選択される少なくとも一方と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の栄養強化食品の製造方法。

【請求項7】

請求項１乃至６の何れか一項に記載の栄養強化食品の製造方法で得られることを特徴とするユーグレナ含有食品組成物。

【請求項8】

ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、
前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、
前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、
を行うことを特徴とする食品の栄養強化方法。

【請求項9】

ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を含む培地を調製する培地調製工程と、
前記培地にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、
前記培地中で前記ユーグレナ細胞の培養を行う培養工程と、
を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法。

【請求項10】

野菜飲料及び果実飲料を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、
前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、
前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、
を行うことを特徴とするユーグレナの染色方法。

【請求項11】

野菜又は果実由来の色素を細胞内に含有することを特徴とするユーグレナ。

【請求項12】

納豆と、
海苔又は煮干から選択される少なくとも一方と、を含み、
ユーグレナの培養のために用いられることを特徴とするユーグレナ用培地組成物。

【請求項13】

豆乳と、植物性乳酸菌と、ユーグレナ細胞を混合して原料混合物を調整する工程と、
前記原料混合物を発酵させる工程と、を行うことを特徴とする植物性発酵食品の製造方法。

【請求項14】

豆乳と、
植物性乳酸菌と、
ユーグレナ細胞と、
を含有することを特徴とする植物性発酵食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、栄養強化食品の製造方法、ユーグレナ含有食品組成物及び食品の栄養強化方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ユーグレナ（属名：Ｅｕｇｌｅｎａ、和名：ミドリムシ）は、食糧、飼料、燃料等としての利用が有望視されている生物資源として注目されている。
ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントや食品としての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。

【0003】

また、ユーグレナを培養する際に、培養液に食品を利用する試みがなされており、例えば、特許文献１には、ビールや清酒などの醸造酒を含む液体中でユーグレナを培養する技術が記載されている。従来の技術は、ユーグレナを培養する際の栄養源として食品を利用するものであり、生きたユーグレナを含有する食品を製造する意図を有するものではなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１４−０５４２４０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

従来、サプリメントを含むユーグレナ含有食品は、ユーグレナの乾燥粉末を加工・調理したものが大半であった。また、一般的な微細藻類の大量生産には、大型プール等の大規模な設備が必要であり、培養後に微細藻類の細胞を分離、回収、乾燥する工程にコストが必要であった。

【0006】

したがって、ユーグレナを分離、回収、乾燥することなく、食品として利用する技術が実現できれば、ユーグレナ含有食品のバリエーションを増加させることができるとともに、生産コストの削減、及びバイオアベイラビリティ（生体利用効率）が高い食品を提供することが可能となる。

【0007】

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ユーグレナを食品中で培養することによりユーグレナを分離、回収、乾燥することなく、ユーグレナ含有食品として利用することが可能な、栄養強化食品の製造方法、ユーグレナ含有食品組成物及び食品の栄養強化方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ユーグレナ細胞を特定の食品または食品原料を用いて培養すると、ユーグレナ細胞が良好に生育し、食品の栄養を強化できること、栄養強化食品を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0009】

従って、前記課題は、本発明の栄養強化食品の製造方法によれば、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、を行うことにより解決される。
このとき、前記ゲル状食品は、豆腐、卵黄プディングから選択されるとよい。
このとき、前記野菜飲料はトマトジュースであるとよい。
このとき、前記果実飲料はブドウ果汁又はプルーン果汁を含有するとよい。
このとき、前記大豆食品は、豆乳飲料、納豆、豆腐を含む群から選択されるとよい。
このとき、前記食品は、納豆と、海苔又は煮干から選択される少なくとも一方と、を含むとよい。
また、前記課題は、本発明によれば、前記栄養強化食品の製造方法で得られることを特徴とするユーグレナ含有食品組成物により解決される。

【0010】

本発明の栄養強化食品の製造方法によれば、食品中でユーグレナ細胞の培養を行うことで、食品に含まれる栄養成分を強化することができる。また、ユーグレナを分離、回収、乾燥することなく、栄養成分が強化されたユーグレナ含有食品組成物を提供することができる。

【0011】

また、前記課題は、本発明の食品の栄養強化方法によれば、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、を行うことにより解決される。
本発明の食品の栄養強化方法によれば、食品中でユーグレナ細胞の培養を行うことで、食品に含まれる栄養成分を強化することができる。

【0012】

また、前記課題は、本発明のユーグレナの培養方法によれば、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を含む培地を調製する培地調製工程と、前記培地にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記培地中で前記ユーグレナ細胞の培養を行う培養工程と、を行うことにより解決される。
本発明のユーグレナの培養方法によれば、食品に含まれる栄養成分を利用してユーグレナ細胞の培養を行うことができる。

【0013】

また、前記課題は、本発明のユーグレナの染色方法によれば、野菜飲料及び果実飲料を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、を行うことにより解決される。
また、前記課題は、本発明のユーグレナによれば、野菜又は果実由来の色素を細胞内に含有することにより解決される。
本発明のユーグレナの染色方法によれば、野菜又は果実由来の色素、具体的には、アントシアニンなどのポリフェノールやカロテノイドを細胞内に含有したユーグレナを提供することができる。所望の色彩に対応した色素を含有する野菜又は果実を選択することで、ユーグレナ細胞を所望の色彩に染色することができる。

【0014】

また、前記課題は、本発明のユーグレナ用培地組成物によれば、納豆と、海苔又は煮干から選択される少なくとも一方と、を含み、ユーグレナの培養のために用いられることにより解決される。
本発明のユーグレナ用培地組成物は、ユーグレナの生育に適した培地として利用可能であり、特に納豆と海苔の組合せの培地組成物で生育したユーグレナは、非動物性食品のみから構成されるため、厳格なベジタリアン（ヴィーガン）食において欠乏しがちなビタミンＢ_１２（Ｖ．Ｂ_１２）の供給源とすることができる。

【0015】

また、前記課題は、本発明の植物性発酵食品の製造方法によれば、豆乳と、植物性乳酸菌と、ユーグレナ細胞を混合して原料混合物を調整する工程と、前記原料混合物を発酵させる工程と、を行うことにより解決される。
また、前記課題は、本発明の植物性発酵食品によれば、豆乳と、植物性乳酸菌と、ユーグレナ細胞と、を含有することにより解決される。
本発明の植物性発酵食品の製造方法によれば、植物性乳酸菌として、豆乳ヨーグルトに含まれる植物性乳酸菌を用いているため、ヴィーガンを対象とした、完全非動物性Ｖ．Ｂ_１２含有ローフードとして利用可能な植物性発酵食品を提供することができる。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、ユーグレナを食品中で培養することによりユーグレナを分離、回収、乾燥することなく、食品として利用することが可能な、栄養強化食品の製造方法、ユーグレナ含有食品組成物及び食品の栄養強化方法を提供することができる。
したがって、本発明によれば、大規模な培養設備、回収、乾燥、加工工程に必要となるコストを削減し、かつユーグレナの持つ栄養素を活かした、食品や栄養補助食品を提供することができる。

【0017】

また、本発明によれば、適切な食品を選択し、ユーグレナの培養を行うことで、ユーグレナの増殖に必要な栄養素を供給して効果的にユーグレナを増殖させることや、食品の栄養を強化できること、栄養強化食品を製造することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の一実施形態に係る栄養強化食品の製造方法、食品の栄養強化方法及びユーグレナの染色方法を示すフロー図である。

【図2】本発明の一実施形態に係るユーグレナの培養方法を示すフロー図である。

【図3】試験で用いたユーグレナ細胞が生育不良を起こしたＣＭ培地に、ＣＭ培地に当初含有されている量のＶ.Ｂ_１およびＶ.Ｂ_１２を再添加した後（左）、Ｖ.Ｂ_１２のみを再添加した後（中）、Ｖ.Ｂ_１のみを再添加した後（右）の写真である。

【図4】試験１において検討を行った納豆を含有する培養液を用いたユーグレナ細胞の生育状態を示す写真である。納豆のみ（左）、納豆および煮干（中）、納豆および海苔（右）。

【図5】試験１において検討を行った納豆を含有する培養液を用いた定常期における各サンプルのユーグレナ細胞密度を示すグラフである。

【図6】試験１において検討を行った納豆を含有する培養液を用いた場合における各サンプルの生育曲線を示すグラフである。

【図7】試験２において検討を行った牛乳及びヨーグルト（クレモリス菌を含有するカスピ海ヨーグルト）を用いて９日間培養を行った後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真である。図中の数字は、水：牛乳の比率（体積比）を示している。

【図8】試験２において検討を行った豆乳及び豆乳ヨーグルト（植物性乳酸菌を含有）を用いて２４日間培養を行った後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真である。図中の数字は、豆乳：水の比率（体積比）を示している。

【図9】試験３において検討を行ったトマトジュースを用いて８日間培養を行った後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真である。

【図10】試験３において検討を行ったトマトジュースに煮干を添加してユーグレナ細胞の培養を行った際の色相の変化を示す写真である（各写真は１日おきに撮影した）。

【図11】試験３において検討を行ったブドウジュースまたはプルーンジュースを用いて培養を行った後のユーグレナ細胞の染色を示す顕微鏡写真である（左：ブドウジュース、右：プルーンジュース）。

【図12】試験３において検討を行ったトマトジュースを含有する培養液を用いて９日間培養を行った後の各サンプルのユーグレナ細胞密度を示すグラフである。

【図13】試験３において検討を行ったトマトジュースを含有する培養液を用いた場合における生育曲線を示すグラフである。

【図14】試験４において検討を行った卵黄プディングを用いて培養を行った後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真（右）、「豆乳：水＝１：９」の溶液に０．２％寒天、及び０．１％ゼラチンを含有するゲル培地（左）、または同様液に０．２％寒天のみを含有するゲル培地（中）を用いて培養した後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真である。

【図15】試験４において検討を行った豆腐を用いて培養を行った後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真（左）、豆腐を割った状態の写真（右）である。

【図16】ユーグレナ、トマト、納豆、ヨーグルトにおける各食品中の総アミノ酸量に対する各アミノ酸の割合（％）を示すグラフである。

【図17】試験５において検討を行った、各種飲料を用いて培養を行った後のユーグレナ細胞の密度を示すグラフである。

【図18】試験５において検討を行った、各種飲料を用いて定常期まで暗所培養条件で培養を行った後、及び光培養照射条件に切り替えて培養を行った後のユーグレナ細胞の密度を示すグラフである。

【図19】試験５において検討を行った、各種飲料を用いて定常期まで光照射培養条件で培養を行った後、及び暗所培養条件に切り替えて培養を行った後のユーグレナ細胞の密度を示すグラフである。

【図20】試験６において検討を行った、各種飲料を所定の条件で用いて培養を行った後のユーグレナ細胞の密度を示すグラフである。

【図21】試験７において検討を行ったワイン又はブドウジュースを含有する培養液を用いた場合における生育曲線を示すグラフである。

【図22】試験７において検討を行ったワインを含有する培養液を用いて９日間培養を行った後の各サンプルのユーグレナ細胞密度を示すグラフである。

【図23】試験８において検討を行ったブドウジュースを用いて培養を行った後のユーグレナ細胞の染色を示す顕微鏡写真である。

【図24】試験９において検討を行った赤パプリカ搾汁液を用いて６日間培養を行った後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真である。

【図25】試験９において検討を行った赤パプリカ搾汁液を用いてユーグレナ細胞の培養を行った際の色相の変化を示す写真である（各写真は３日目から１日ごとに撮影した）。

【図26】試験９において検討を行った赤パプリカ搾汁液を用いて１２日間培養を行った後のユーグレナ細胞の生育状態を示す写真である。

【図27】試験９において検討を行った赤パプリカ搾汁液を用いて１２日間培養を行った後の定常状態でのユーグレナ細胞密度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の実施形態について、図１乃至２７を参照しながら説明する。
本実施形態は、栄養強化食品の製造方法、ユーグレナ含有食品組成物、食品の栄養強化方法、ユーグレナの培養方法、ユーグレナ植物性発酵食品の染色方法、ユーグレナ用培地組成物、植物性発酵食品の製造方法、植物性発酵食品に関するものである。

【0020】

＜ユーグレナ＞
実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。

【0021】

ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astaia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。

【0022】

ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。

【0023】

ユーグレナ細胞の培養において、培養液としては、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、改変Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ／ｌ，ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，Ｆｅ_２（ＳＯ_２）_３・７Ｈ_２Ｏ ３ｍｇ／ｌ，ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ １．８ｍｇ／ｌ，ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １．５ｍｇ／ｌ，ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．４ｍｇ／ｌ，Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ，ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ_１） ０．１ｍｇ／ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ_１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４やＮＨ_３ａｑに変換することも可能である。また、そのほか、ユーグレナ 生理と生化学（北岡正三郎編、（株）学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のＨｕｔｎｅｒ培地，Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地を用いてもよい。

【0024】

培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制できる。
ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用する培養装置を用いる方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行っても良い。
また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行っても良い。
ユーグレナ細胞の分離は、例えば培養液の遠心分離，濾過又は単純な沈降によって行うことが可能だが、本実施形態では細胞を分離しなくても良い。

【0025】

＜栄養強化の対象となる食品または培地に用いる食品＞
本実施形態において、栄養を強化する対象となる食品、ユーグレナを培養する培地として用いる食品、ユーグレナを培養する培地に添加する食品は、ユーグレナの細胞が増殖可能な食品であれば特に限定されず、例えば、液体状食品、ゲル状食品、ゾル状食品、固形状食品が挙げれられ、野菜飲料又は果実飲料である液体状食品、ゲル状食品、大豆食品であることが好ましい。

【0026】

（液体状食品）
液体状食品とは、例えば、野菜飲料、果実飲料、牛乳、豆乳、ライスミルク、コーヒー、茶飲料等の飲料、コーンスープなど各種スープ、汁粉等の液体状の冷菓や、その他の液体食品を指し、喫食時に液体状である食品を指す。
野菜飲料の例としては、トマト、ニンジン、ホウレンソウ、ケールなどの緑黄色野菜を含有する飲料が例として挙げられる。
果実飲料としては、ブドウジュース、プルーンジュース、パインジュース、オレンジジュース、リンゴジュース、アーモンドミルク、ココナッツミルク、アセロラなどの果汁を含有する飲料が例として挙げられる。

【0027】

野菜飲料や果実飲料は、市販されている飲料に限定されず、野菜や果実を絞ったり、すりおろしたり、粉砕したりすることで得られる果汁を用いることも可能である。また、野菜及び果実の絞り汁を混合した混合液を用いることも可能である。

【0028】

（ゲル状食品）
ゲル状食品とは、増粘剤およびゲル化剤のゲル化能によってゲル状に固めた食品を指し、ゼリー状食品、半固体状食品ともいう。例えば、豆腐、ゲルプリン、ゼリー、水羊羹、煮こごり、寒天やゼラチンを他の食品と共に凝固させたものなどが挙げられる。

【0029】

（ゾル状食品）
ゾル状食品とは、室温（２５℃）において、保形性を有さず、流動性の物性を有する食品を指し、粘性液体状又は粘稠性液体状の食品であり、例えば、ヨーグルトなどが挙げられる。

【0030】

（固形状食品）
固形状食品とは、例えば、納豆、煮干し、海苔などの固形食品を指し、喫食時に固体形状を有する食品を指す。

【0031】

（大豆食品）
大豆食品とは、大豆を原料として製造される食品をいい、例えば、豆乳飲料、納豆、豆腐、味噌、醤油などが挙げられる。

【0032】

＜栄養強化食品の製造方法＞
本実施形態に係る栄養強化食品の製造方法は、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、を行うことを特徴とする。
以下、各工程について図１を参照して詳細に説明する。

【0033】

食品を用意する工程では、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する（ステップＳ１）。このとき用意する食品は、製品として完成した食品に限定されず、製造途中の食品であってもよい。また、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（ＣＭ培地）やＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地（ＫＨ培地）など、ユーグレナを培養する際に通常用いられる培地を食品に添加することや、これらの培地に含まれる成分を適宜選択して食品に添加することも可能である。

【0034】

細胞添加工程では、前記食品を用意する工程で用意した前記食品にユーグレナ細胞を添加する（ステップＳ２）。このとき、食品に添加されるユーグレナ細胞の添加量は、食品の種類やその性質（固体であるか液体であるか、粘度、ｐＨ、組成、含有成分など）に応じて、適宜選択すればよい。

【0035】

培養工程では、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する（ステップＳ３）。温度、期間、光照射、振盪の有無などの培養条件は、食品の種類やその性質、所望する食品の最終的な状態に応じて適宜選択すればよい。

【0036】

本実施形態に係る栄養強化食品の製造方法によれば、栄養成分が強化されたユーグレナ含有食品組成物を提供することができる。また、ユーグレナを分離、回収、乾燥することなく、栄養成分が強化されたユーグレナ含有食品組成物を提供することができる。

【0037】

＜食品の栄養強化方法＞
本実施形態に係る食品の栄養強化方法は、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する培養工程と、を行うことを特徴とする。
以下、各工程について図１を参照して詳細に説明する。

【0038】

食品を用意する工程では、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する（ステップＳ１）。このとき用意する食品は、製品として完成した食品に限定されず、製造途中の食品であってもよい。また、ＣＭ培地やＫＨ培地など、ユーグレナを培養する際に通常用いられる培地を食品に添加することや、これらの培地に含まれる成分を適宜選択して食品に添加することも可能である。

【0039】

細胞添加工程では、前記食品を用意する工程で用意した前記食品にユーグレナ細胞を添加する（ステップＳ２）。このとき、食品に添加されるユーグレナ細胞の添加量は、食品の種類やその性質（固体であるか液体であるか、粘度、ｐＨ、組成、含有成分など）に応じて、適宜選択すればよい。

【0040】

培養工程では、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する（ステップＳ３）。温度、期間、光照射、振盪の有無などの培養条件は、食品の種類やその性質、所望する食品の最終的な状態に応じて適宜選択すればよい。

【0041】

本実施形態に係る食品の栄養強化方法によれば、食品に含まれるの栄養成分を強化することができる。

【0042】

＜ユーグレナの染色方法＞
本実施形態に係るユーグレナの染色方法は、野菜飲料及び果実飲料を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する工程と、前記食品にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記ユーグレナ細胞前記食品とともに培養する培養工程と、を行うことを特徴とする。
以下、各工程について図１を参照して詳細に説明する。

【0043】

食品を用意する工程では、野菜飲料及び果実飲料を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を用意する（ステップＳ１）。このとき用意する食品（野菜飲料や果実飲料）は、製品として完成した食品に限定されず、製造途中の食品（野菜や果実の絞り汁）であってもよい。ＣＭ培地やＫＨ培地など、ユーグレナを培養する際に通常用いられる培地を食品に添加することや、これらの培地に含まれる成分を適宜選択して食品に添加することも可能である。

【0044】

細胞添加工程では、前記食品を用意する工程で用意した前記食品にユーグレナ細胞を添加する（ステップＳ２）。このとき、食品に添加されるユーグレナ細胞の添加量は、食品の種類やその性質（粘度、ｐＨ、組成、含有成分など）に応じて、適宜選択すればよい。

【0045】

培養工程では、前記ユーグレナ細胞を前記食品とともに培養する（ステップＳ３）。温度、期間、光照射、振盪の有無などの培養条件は、食品の種類やその性質、所望するユーグレナの染色度合に応じて適宜選択すればよい。

【0046】

本実施形態に係るユーグレナの染色方法によれば、野菜又は果実由来の色素、具体的には、アントシアニンなどのポリフェノールやカロテノイドを細胞内に含有したユーグレナを提供することができる。所望の色彩に対応した色素を含有する野菜又は果実を選択することで、ユーグレナ細胞を所望の色彩に染色することができる。

【0047】

＜ユーグレナの培養方法＞
本実施形態に係るユーグレナの培養方法は、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を含む培地を調製する培地調製工程と、前記培地にユーグレナ細胞を添加する細胞添加工程と、前記培地中で前記ユーグレナ細胞の培養を行う培養工程と、を行うことを特徴とする。
以下、各工程について図２を参照して詳細に説明する。

【0048】

培地調製工程では、ゲル状食品、野菜飲料、果実飲料、大豆食品を含む群から選択される少なくとも一種以上の食品を含む培地を調製する（ステップＳ１１）。このとき用意する食品は、製品として完成した食品に限定されず、製造途中の食品であってもよい。また、調整される培地は、食品以外の一般的な培地成分を用いて調製される。

【0049】

細胞添加工程では、前記培地調製工程で調製した前記培地にユーグレナ細胞を添加する（ステップＳ１２）。このとき、培地に添加されるユーグレナ細胞の添加量は、培地の性質（固体であるか液体であるか、粘度、ｐＨ、組成、含有成分など）に応じて、適宜選択すればよい。

【0050】

培養工程では、前記培地中で前記ユーグレナ細胞の培養を行う（ステップＳ１３）。温度、期間、光照射、振盪の有無などの培養条件は、培地の性質などに応じて適宜選択すればよい。

【0051】

本実施形態に係るユーグレナの培養方法によれば、食品に含まれる栄養成分を利用してユーグレナ細胞の培養を行うことができる。

【0052】

＜ユーグレナ用培地組成物（固形食品含有培地組成物）＞
本実施形態に係るユーグレナ用培地組成物（固形食品含有培地組成物）は、納豆と、海苔又は煮干から選択される少なくとも一方と、を含み、ユーグレナの培養のために用いられることを特徴とする。
本実施形態に係るユーグレナ用培地組成物（固形食品含有培地組成物）は、ユーグレナの生育に適した培地として利用可能であり、特に納豆と海苔の組合せの培地組成物で生育したユーグレナは、非動物性食品のみから構成されるため、厳格なベジタリアン（ヴィーガン）食において欠乏しがちなＶ.Ｂ_１２の供給源とすることができる。

【0053】

＜植物性発酵食品の製造方法＞
本実施形態に係る植物性発酵食品の製造方法は、豆乳と、植物性乳酸菌と、ユーグレナ細胞を混合して原料混合物を調整する工程と、前記原料混合物を発酵させる工程と、を行うことを特徴とする。
本実施形態に係る植物性発酵食品の製造方法によれば、植物性乳酸菌として、豆乳ヨーグルトに含まれる植物性乳酸菌を用いているため、ヴィーガン（厳格なベジタリアン）を対象とした、完全非動物性Ｖ.Ｂ_１２含有ローフードとして利用可能な植物性発酵食品を提供することができる。

【実施例】

【0054】

以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例では、様々な食品を用いてユーグレナの培養を行い、ユーグレナ細胞の生育状態を検討した。

【0055】

＜試験に用いたユーグレナ＞
試験で使用したユーグレナ・グラシリス（Ｅ. ｇｒａｃｉｌｉｓ）は、表１に示す組成のＫＨ培地（Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地）で維持した細胞を用いて、１ヶ月以上の期間にわたり、表２に示すＣＭ培地（Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地）を用いて独立栄養状態で前培養をしたものを用いた（白色蛍光灯常時照射４０〜６０μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２４〜２７℃（概ね２６℃）、静置培養）。ＣＭ培地は、その中の成分であるビタミンＢ_１（Ｖ.Ｂ_１）、及びビタミンＢ（Ｖ.Ｂ_１２）は必須であることが知られる。例えば、当該培養液のオートクレーブ処理を繰り返すことにより、培養液中のビタミンＢ_１（Ｖ.Ｂ_１）、ビタミンＢ（Ｖ.Ｂ_１２）が破壊されている培養液を用いて１か月程度にわたり植え継ぎを繰り返しユーグレナの培養を行うと、定常期細胞密度が小さく、色が黄緑色となり、ほぼ全ての細胞が沈殿する。
上記のように準備したユーグレナ細胞を食品に植継ぐ際には、ユーグレナの細胞懸濁液を植継先となる食品の体積比で１％ｖ／ｖ以下に調整するか、滅菌水で植継元の懸濁液中の栄養成分を洗浄することにより、ユーグレナにとって負荷がかかる生育条件を採用した。

【0056】

【表1】

【0057】

【表2】

【0058】

なお、ビタミン不足によりユーグレナ細胞が生育不良を起こしたＣＭ培地に、ＣＭ培地に当初含有されている量のＶ.Ｂ_１、Ｖ.Ｂ_１２を再度添加すると、翌日には浮遊するユーグレナ細胞が多く見られ、３日後には目視で確認できるほど深い緑色を呈した（図３左）。ただし、Ｖ.Ｂ_１、Ｖ.Ｂ_１２の一方のみを添加した場合には、顕著な細胞の運動性回復、及び増殖は観察されなかった（図３中央、右）。Ｖ.Ｂ_１２のみを添加した場合は浮遊細胞の増加は確認されたが、色は薄い黄緑色のままであった（図３中央）。Ｖ.Ｂ_１のみの添加では、細胞の回復が全く見られなかった（図３右）。

【0059】

以上より、加熱処理によってビタミンＢ（Ｖ.Ｂ_１、Ｖ.Ｂ_１２）は損傷を受けやすいことが確認され、調理において熱を加えない生食が最もバイオアベイラビリティの高い方法であることが示唆された。なお、一般的にＶ.Ｂ_１は熱に弱く、Ｖ.Ｂ_１２は比較的強いとされており、上記の結果と矛盾するように見受けられるが、これはＶ.Ｂ_１２が酸性（ｐＨ３．５）かつ光存在下で分解されることに起因するものであると考えられる。

【0060】

＜試験１ 納豆を利用した培養（１）＞
（試験１の試験方法）
試験１では、納豆を含有する培養液を用いてユーグレナ細胞の培養を行った。
Ｖ.Ｂ_１２がＣＭ培地と当量となるように、Ｖ.Ｂ_１２源としての煮干または海苔を納豆水溶液に添加した。また、Ｖ.Ｂ_１２源として添加した食品（煮干または海苔）中のＶ.Ｂ_１２と、納豆中のＶ.Ｂ_１２の合計値が、ＣＭ培地と等量となるように納豆の添加量を調整した（表３）。１００ｍＬの密閉容器を培養容器として用い、培地の総量が１００ｍＬとなるように精製水でメスアップした。各食品成分値は、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）を使用した。

【0061】

【表3】

【0062】

納豆は、挽き割り納豆（株式会社ｍｉｚｋａｎ製、製品名：金のつぶ国産ひきわり３Ｐ）を用い、温度２７．５℃、光源として白色蛍光灯を用い、光強度４０〜５０μｍｏｌ／ｍ^２・秒で常時照射を行い、ユーグレナの培養を行った。

【0063】

（試験１の結果と考察）
ユーグレナ細胞の植継ぎ後４日で、底部に沈殿した納豆の表面に細胞の増殖が目視確認できるようになり、植継ぎ後７日で定常期に達した。培養７日後の生育状況を示す写真を図４に示す。Ｖ.Ｂ_１２は植物性食品である納豆には含まれないため、納豆のみの培養液では生育が限定される要因となった（図４左）。Ｖ.Ｂ_１２高含有食品である煮干や海苔を適量添加することにより、ユーグレナ細胞は良好な生育を示した（図４中央、右）。納豆菌の静菌作用（ジピコリン酸等）により、クリーンベンチの外でユーグレナ細胞を植継いでも、他の微生物が、目視で確認できるほど生育してしまうことはなかった。

【0064】

納豆菌は、大豆中のタンパク質をはじめとする各種栄養素を、アミノ酸等の低分子などによってユーグレナが利用しやすい形に変換する。一方、植継元において無機培地で生育したユーグレナは光合成により、好気性細菌である納豆菌に酸素を供給する。このような共生系が実現されるため、培養容器を密閉して静置するだけで良好なユーグレナの生育が実現されたと考えられる。

【0065】

従来、ユーグレナの培養は、培地にポンプでＣＯ_２を供給・撹拌したり、複雑な組成の有機培地（ＫＨ培地）を用いたりしなければ実現できなかった。また、ユーグレナと同じ単細胞微細藻類の仲間であるクラミドモナスは、納豆菌を用いた培地では、ほぼ生育しないため、納豆菌の共生相手は選択性が高いことが判明した。

【0066】

また、培地における納豆の含有率を０．２質量％／ｍＬ（納豆０．１ｇに対して水５０ｍＬ）という極少量にしても、図４に示した例ほどではないが良好な生育が観察された。なお、納豆含有量が２０％ｗ／ｖ以上では、生育が抑制された。したがって、培地に添加する納豆の濃度は、０．２質量％／ｍＬ以上２０質量％／ｍＬ以下であることが好ましいことがわかった。

【0067】

培地に含まれる栄養源として、納豆と海苔の組合せで生育したユーグレナは、非動物性食品のみから構成されるため、厳格なベジタリアン（ヴィーガン）食において欠乏しがちなＶ.Ｂ_１２の供給源とすることができる。特に、Ｖ.Ｂ_１２の一種であるメチルコバラミンは、体内での活性が高く、付加価値が高いため、クロレラや海苔など他のＶ.Ｂ_１２含有食品よりも多く含まれる可能性もあり、Ｖ.Ｂ_１２補給用のサプリメントとして用いることが可能である。納豆と海苔の組合せで生育したユーグレナは、欧米の最先端の栄養学において主流になりつつある、プラントベース・ホールフードやローフードとして利用可能である。

【0068】

＜試験１−２ 納豆を利用した培養（２）＞
試験１−２では、納豆を含有する培養液を用いてユーグレナ細胞の培養を行う際に、光照射条件、Ｖ．Ｂ_１２源添加の有無、及びＶ．Ｂ_１２源の種類によるユーグレナ細胞の生育の差異を検討した。

【0069】

○実験１
ユーグレナ細胞をＣＭ培地（初発ｐＨ３．５）にて定常期まで生育させ、ユーグレナ細胞懸濁液を滅菌水にて２回洗浄した（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）。試験管（直口：φ１５×１０５ｍｍ、型番：Ａ−ワッセルマン）に、滅菌水を１０ｍＬ加え、表４のとおりＶ．Ｂ_１２源を添加した。なお、「納豆（ＣＭ培地）」のみ、水の代わりにＣＭ培地（ｐＨ３．５）を加えた。
ＣＭ培地はオートクレーブを用いて一度滅菌処理をしたものを用い、Ｖ．Ｂ_１２源は非滅菌のものを使用した。

【0070】

【表4】

【0071】

納豆は、「におわなっとう（ｍｉｚｕｋａｎ製）」を使用し、各０．４４ｇ添加した。
シアノコバラミン（和光純薬工業）は、０．１ｇ／Ｌ溶液を０．５５μＬ添加した。
海苔は、「きざみのり（大森屋）」を使用し、一片を幅２ｍｍ、長さ１０ｍｍ以下にして添加した。
「納豆（豆なし）」のサンプルは、滅菌水を加えてよく撹拌した後、豆粒を回収した。
「海苔のみ」には海苔のみを投入し、納豆は投入しなかった。

【0072】

各サンプルの試験管に、洗浄後のユーグレナ細胞懸濁液を１ｍＬずつ添加し、初期細胞密度は２．５×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬであった。
シリコンゴム栓（１号）で試験管を密閉した。
なお、一連の作業はクリーンベンチ外の非無菌的環境で行った。

【0073】

各サンプルを光照射培養条件または暗所培養条件で９日間静置培養した。
光照射培養条件では、白色蛍光灯常時照射、光量６０μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２４℃で、試験管を金属板上に水平にセットし、上方から光照射した。
暗所培養条件では、試験管を水平になるよう金属の箱に入れ、蓋をして光照射培養条件のサンプルの近傍に静置した。

【0074】

○結果１
培養９日後（定常期）の各サンプルの細胞密度を、プランクトン計数板（ＭＰＣ−２００、松浪硝子工業）を用いて測定した結果を図５に示す。塩化ベンザルコニウム溶液（大洋製薬）を水で２％に希釈した溶液を用いて、各サンプルを希釈して、ユーグレナ細胞の運動を固定させて計数を行った。

【0075】

○考察１
納豆を用いて培養を行う際に、ユーグレナ細胞の生育には光照射を行うこと必要であることがわかった。
海苔はＶ．Ｂ_１２源として、シアノコバラミンと同等の効果を示した。海苔の添加量（ＫＨ培地含有Ｖ．Ｂ_１２の１／１０の量（＝ＣＭ培地等量）に相当）を考慮すると、通常のＣＭ培地における生育の限定要因はＶ．Ｂ_１２だけでなく、他の有機的な栄養素であることが示唆された。
Ｖ．Ｂ_１２を含まない「納豆のみ」の培養液においても、本試験では良好な生育を示した。これは納豆の種類によっては、Ｖ．Ｂ_１２添加がなくてもある程度はユーグレナ増殖に寄与可能であることを示す。

【0076】

○実験２
ユーグレナ細胞をＣＭ培地（初発ｐＨ３．５）を用いて定常期まで生育させ、ユーグレナ細胞懸濁液を滅菌水にて３回洗浄した（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）。試験管（直口：
φ１８×１８０ｍｍ、型番：Ａ・１８）に、滅菌水を２９ｍＬ加え、表５に示す通りＶ．Ｂ_１２源を添加した。Ｖ．Ｂ_１２源は非滅菌のものを使用した。

【0077】

【表5】

【0078】

納豆は、「におわなっとう（ｍｉｚｕｋａｎ製）」を使用し、各１．２ｇ添加した。
シアノコバラミン（和光純薬工業）は、０．００１ｇ／Ｌ濃度溶液を１５μＬ添加した。
海苔は、「きざみのり（大森屋）」を使用し、一片を幅２ｍｍ、長さ１０ｍｍ以下にして添加した。

【0079】

各サンプルの試験管に、洗浄後のユーグレナ細胞懸濁液を１ｍＬずつ添加し、初期細胞密度は２．６×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬであった。
シリコンゴム栓（３号）で試験管を密閉した。
一連の作業はクリーンベンチ外の非無菌的環境で行った。

【0080】

各サンプルを白色蛍光灯常時照射、光量６０μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２４℃で、試験管を金属板上に水平にセットし、上方から光照射する光照射培養条件で、１１日間静置培養した。

【0081】

シリコンゴム栓にシリンジを刺してサンプルを数１０〜２００μＬ程度抜き取り、試験管内部を好気条件にせず、細胞計数板を用いて細胞密度を算出した。サンプル抽出の際は、７０％イソプロピルアルコールにて簡易消毒をしてクリーンベンチ外で行った。

【0082】

○結果と考察２
各サンプルの生育曲線を図６に示す。なお、培養６日目から７日目にかけて、９時間ほど暗所培養条件で培養を行った。

【0083】

海苔を添加したサンプルは、シアノコバラミンを添加した培地とほぼ等しい生育曲線を示した。海苔は食品成分表においてＶ．Ｂ_１２を含有することになっているが、実際には擬似的なＶ．Ｂ_１２が検出された結果である。擬似的なＶ．Ｂ_１２はヒトの体内で実際にはＶ．Ｂ_１２の働き（メチルマロン酸代謝）を担うことができないため、海苔はＶ．Ｂ_１２源とはならない。一方でユーグレナが蓄積するＶ．Ｂ_１２は、ヒトが利用可能な形態のものが含まれることが知られる。生育にＶ．Ｂ_１２を必須ビタミンとして要求するユーグレナが海苔添加培地において、Ｖ．Ｂ_１２添加培地とほぼ同等の良好な生育を示したことから、ユーグレナが海苔の擬似的なＶ．Ｂ_１２を利用可能な形態のＶ．Ｂ_１２に変換していることを示唆する。この場合、ユーグレナを用いることで、海苔にＶ．Ｂ_１２源としての付加価値を付与することができる。ユーグレナは海苔に密集して育つため、ユーグレナを海苔表面で生育させて乾燥させることで、ユーグレナ海苔を製造することが可能である。

【0084】

１０^６オーダー程度の高い細胞密度において、光を遮断することは細胞に大きなストレスを与える。また、光照射を再開しても２８時間程度は細胞が減少し続けることが分かった。細胞密度の回復は「納豆＋Ｖ．Ｂ_１２」に比べて、「納豆＋海苔」の方が良好であった。このことから、高細胞密度環境下では光合成を維持しなければならないことが示唆された。海苔が添加されているサンプルにおいて、良好な回復を示したのは、光合成や生育に必要なビタミン・ミネラル類が多く含まれていたためであると考えられる。
一方、１０^５オーダー程度の低い細胞密度においては、光遮断による生育阻害は受けないことがわかった。

【0085】

実験２においても、必須ビタミンであるＶ．Ｂ_１２源を含まない「納豆のみ」の培養液において良好な生育が得られた（ただし生育速度はＶ．Ｂ_１２源ありのものと比べて遅かった）。この原因として、納豆菌の培養に「肉汁」を使用していること可能性が考えられる。
食品成分表（日本食品標準成分表２０１５年版（七訂））における糸引き納豆（普通の粒納豆）のＶ．Ｂ_１２含有量は「Ｔｒ」、挽き割り納豆は「０」となっている。Ｔｒ（トレース）は含まれているが最小記載量に達していないこと、０は食品成分表の最小記載量の１／１０未満又は検出されなかったことを表すため、普通の粒納豆にＶ．Ｂ_１２が極微量ではあるが含まれており、他の有機的な栄養素の補助があることも関係して、ユーグレナ細胞の生育が可能であったと考えられる。したがって、納豆として挽き割り納豆よりも糸引き納豆を用いることが好ましい。

【0086】

ユーグレナにおけるＶ．Ｂ_１２が要求される主な理由としては、メチオニン合成に必須であるとされ、培地中への微量のメチオニン添加によりＶ．Ｂ_１２欠乏状態を緩和可能である。一方で、培地中に多量のメチオニンが存在すると、逆に増殖を阻害することも知られる。このため、納豆を培養液に含ませることにより、適量のメチオニン、もしくはメチオニン含有ペプチドが培養液に溶出し、それによりＶ．Ｂ_１２欠乏下での増殖促進が達成された可能性も考えられる。

【0087】

なお、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓはＣｂｌ（コバラミン）制限培地（０．０５μｇＣｂｌ／ｍＬ培地（Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｎｔｅｒ培地）)で生育させると、容易にＣｂｌ制限細胞（１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬ）となり、培地中のＣｂｌ濃度に比例した生育を示すことが知られている（北岡正三郎、「ユーグレナ」、学会出版センター、１９８９年）。

【0088】

＜試験２ ヨーグルトを利用した培養＞
（試験２の試験方法）
試験２では、ヨーグルトを用いてユーグレナ細胞の培養を行った。
本試験ではＫＨ培地で生育したユーグレナ細胞をサンプルとして使用した。試験管に総量１０ｍＬとなるように、精製水を用い、無調整牛乳または無調整豆乳を１０ｖｏｌ％刻みで各々希釈分注した。ユーグレナ細胞を含む培養液１００μＬ、Ｖ.Ｂ_１ ２μＬ、Ｖ.Ｂ_１２ ０．５μＬを各試験管に添加した。スターターとして、カスピ海ヨーグルト（おいしいカスピ海：グリコ社）または豆乳ヨーグルト（マルサンアイ株式会社製、製品名：豆乳グルト）を０．２ｇ程度ずつ滴下し、シリコンゴム栓で密閉後、よく混合して２７℃、光源として蛍光灯を用い、光強度３５〜５０μｍｏｌ／ｍ^２・秒で常時照射を行い、ユーグレナ細胞の生育の様子を観察した。

【0089】

（試験２の結果と考察）
ユーグレナは酸耐性があるため、乳酸菌との共生が可能である。乳酸菌が作り出す乳酸によって周囲環境のｐＨが低下する（ｐＨ４．１〜４．３）ため、保存性が高まると同時に、タンパク質の変性による凝固が起こる。図７は、牛乳を基質としてカスピ海ヨーグルト（クレモリス菌）をスターターとした培地に、ユーグレナを植継いで９日経過した後の様子を示す写真である。図７中の数字は、水：牛乳の比率（体積比）を示しており、左から右に向かって基質（牛乳）濃度が高くなっている。生育と牛乳の濃度には相関があり、牛乳濃度が３０〜５０ｖｏｌ％（水：牛乳が３：７〜５：５）の範囲において、ユーグレナ細胞の生育速度と生育量のバランスが良かった。また、当該牛乳濃度の範囲では、ヨーグルト飲料である、飲むヨーグルト程度の硬さに仕上がるため、ヨーグルト飲料として利用することが可能である（より高い基質濃度では通常のヨーグルトと同じ硬さに仕上がる）。ユーグレナはヨーグルト中でも、通常の液体培地で育てたときと同様の細胞形態（桿状）と運動性を示した。

【0090】

また、基質として豆乳を用い、スターターを豆乳ヨーグルト（植物性乳酸菌）とした場合も、ユーグレナ細胞の良好な生育が観察された（図８は植継２４日後の様子、図中の数字は、豆乳：水の比率（体積比）を示す）。ただし、豆乳の大豆固形成分は８〜１０％が適しており、１４％では固くなりすぎて、ユーグレナ細胞が試験管の底面に留まったままであった。ユーグレナ、豆乳及び豆乳ヨーグルトを用いて得られる植物性発酵食品は、ヴィーガンを対象とした、完全非動物性Ｖ.Ｂ_１２含有ローフードとして用いることが可能である。また、豆乳を基質とした場合、牛乳を基質とした場合と比べて、ユーグレナ細胞の定常期における色が鮮やかであり、深い緑色を呈し、その状態が長く維持された。

【0091】

カスピ海ヨーグルトに含まれるクレモリス菌の生育至適温度は、３０℃程度（ユーグレナの生育温度に近い）であるため、スターターとしてクレモリス菌を用いることが好ましい。クレモリス菌を用いた場合、基質は１日足らずで凝固が完了するのに対し、他の高温乳酸菌（至適温度４０〜４５℃）は、基質が凝固するまでに３日以上を要した（基質濃度が高いほど凝固速度が速かった）。なお、４０〜４５℃の温度領域においてヨーグルトの発酵を行った場合は、１日で凝固したが、ユーグレナは生育しなかった。

【0092】

ヨーグルトを用いた培地で生育を行う際、過剰に細胞濃度が高くなった場合や、長時間常温環境に置かれた場合に、不快臭を呈するようになった。不快臭の発生は、ユーグレナ細胞の生育を適切な段階で止めるか（低温で保存）、適切な香料を用いることで防止された。具体的には、バナナやコーヒー風味の豆乳を用いて生育させることで、臭いは抑制された。また、培地に含まれるヨーグルトが劣化すると、その色が白色から黄土色に変色した（図８）が、冷蔵庫のような低温環境に置くことで長期間にわたり培地の劣化を防ぐことができた。冷蔵庫内（１０〜１５℃）で光照射を行って培養（光強度１．５〜３５μｍｏｌ／ｍ^２・秒）すると、ユーグレナ細胞の生育速度が極めて遅く、培地の劣化も遅くなるため、品質管理（生育の管理）が可能であった。なお、ＫＨ培地の代わりにＣＭ培地で生育したユーグレナ細胞の懸濁液をサンプルとして、培養を行った試験においても、ユーグレナ細胞の生育を確認した。

【0093】

＜試験３ 野菜飲料または果実飲料を利用した培養＞
○実験１
実験１では、野菜飲料または果実飲料を用いてユーグレナ細胞の培養を行った。
野菜飲料であるトマトジュース（株式会社伊藤園製、製品名：理想のトマト）を用いた培養液の組成及び培養条件は表６のとおりである。また、Ｖ．Ｂ_１２源として、煮干または海苔をトマトジュースに添加した。

【0094】

【表6】

【0095】

また、酸性を呈する果実飲料として、ブドウジュース、プルーンジュース、パイナップルジュース、オレンジジュース、リンゴジュースを用い、Ｖ.Ｂ_１、Ｖ.Ｂ_１２を添加した。

【0096】

○結果と考察１
トマトジュースを用いた場合、Ｖ.Ｂ_１、Ｖ.Ｂ_１２を添加しなくても、ユーグレナ細胞は特に良好な生育を示した（図９）。トマトは食材として適用範囲が広いため、汎用性が高い培養方法である。また、トマトジュースを用いた場合、ユーグレナ細胞の対数増殖期（植継８日後）において、赤色から緑色への劇的な色相の変化が観察された。色相の変化は振盪培養した試料の方が、静置培養した試料よりも顕著であった。

【0097】

トマトジュースに煮干を添加した培地を用いた場合、赤色から黄色への色相の変化が観測され、その後２４時間以内に濃い緑色を呈するようになった（図１０）。

【0098】

また、酸性を呈する果実飲料であるパインジュース、オレンジジュース、リンゴジュースの中においても、Ｖ.Ｂ_１、Ｖ.Ｂ_１２を添加した場合、ユーグレナは良好な生育を示した。

【0099】

ブドウジュースやプルーンジュースを用いてユーグレナを培養すると、細胞が赤紫色に染まることが観察されたことから、ユーグレナはポリフェノールの一種であるアントシアニンによく染まることがわかった（図１１）。なお、カスピ海ヨーグルトに含まれる乳酸菌であるクレモリス菌も、アントシアニンによく染まるが、トマトのリコピンや、ニンジンのカロテンには目視できるほどは染まらなかった。

【0100】

ユーグレナは、野菜飲料や果実飲料の中で培養することにより、ポリフェノール等の抗酸化物質（色素）を積極的にその細胞内に蓄積させることができるため、栄養的付加価値の高いユーグレナを提供することができる。また、所望の色彩に対応した色素を含有する野菜又は果実を選択することで、ユーグレナ細胞を所望の色彩に染色することができる。

【0101】

さらに、アーモンドミルク、ココナッツミルク、アセロラジュース、プルーンジュース、甘酒、コーンスープ、ライスミルク、青汁、牛乳、豆乳、とろけるプリンの各種希釈溶液中においても、ユーグレナ細胞は良好な生育を示した（Ｖ.Ｂ_１、Ｖ.Ｂ_１２添加）。
一方、メープルウォーター（カエデ樹液）、ココナッツウォーター中ではユーグレナ細胞の顕著な増殖は観察されなかった。

【0102】

○実験２
ＣＭ培地（初発ｐＨ３．５）を用い、ユーグレナ細胞を定常期まで生育させ、ユーグレナ細胞懸濁液を滅菌水にて３回洗浄した（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）。
バイアル瓶（ＦＳメディアバイアル（φ５５×８５）、型番：Ｔ−１５０）中で、トマトジュースと水（滅菌水）を以下の表７に示す体積比（ｖｏｌ％）で混合したものを生育培地とした。水の体積には、洗浄後の細胞懸濁液も含まれている。総量は１００ｍＬとした。
トマトジュースは「カゴメ トマトジュース 食塩無添加」を使用し、トマトジュースの開封はクリーンベンチ内で行い、オートクレーブ処理は行わずにそのまま使用した。
初期細胞密度は２．９×１０^４（ｃｅｌｌ／ｍＬ）であった。

【0103】

【表7】

【0104】

各サンプルを、白色蛍光灯常時照射、光量４０μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２５℃、バイアル瓶の蓋を軽く緩めて好気条件にて、９日間静置培養した。

【0105】

○結果と考察２
培養９日目における対数増殖期細胞密度を図１２に示す。
全てのサンプルでＶ．Ｂ_１２を添加しないにも関わらず、１０^６オーダーの細胞密度となり、良好な生育が得られることがわかった。静置培養した際のユーグレナ細胞の生育の特徴として、瓶内にトマトジュースの沈殿層（下層）と水槽（上層）ができ、その境界を中心として細胞が増殖した。

【0106】

○実験３
バイアル瓶（５００ｍＬ）に、精製水１００ｍＬ、Ｖ．Ｂ_１、Ｖ．Ｂ_１２及び、撹拌子（φ８×３０ｍｍ、型式：Ｃ８×３０）を投入してオートクレーブ滅菌した。
Ｖ.Ｂ_１：０．５ｇ／Ｌ×１００μＬ＝５０μｇ（ＣＭ培地等量）
Ｖ.Ｂ_１２：０．００１ｇ／Ｌ×２５０μＬ＝０．２５μｇ（ＣＭ培地等量）

【0107】

トマトジュース（株式会社伊藤園製、製品名：理想のトマト）をクリーンベンチ内で開封し、滅菌後のバイアル瓶にトマトジュース１００ｍｌを注入した。
ＣＭ培地（初発 ｐＨ３．５）で定常期まで生育させたユーグレナ細胞を、遠心分離機を用いて沈殿させた（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）。上清を捨てた後、ユーグレナ細胞を滅菌水に懸濁してバイアル瓶に注入し、滅菌水にて５００ｍＬにメスアップした（基質食品：水＝２：８の体積比に相当）。初期細胞密度は３．４×１０^４（ｃｅｌｌ／ｍＬ）であった。 一連の作業はクリーンベンチ内の無菌環境にて行った。

【0108】

各サンプルを白色蛍光灯常時照射、光量１０〜１５μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２６℃、バイアル瓶の蓋を軽く緩めて好気条件で、スターラーで撹拌しながら１５日間培養した。
細胞計数のためのサンプル採取はクリーンベンチ内で行い、培養１０日まではバクテリア計算盤（サンリード硝子、型式Ａ−１６１）を用い、１１日以降はプランクトン計算板用いて計数を行った。

【0109】

○結果と考察３
図１３に生育曲線を示す。培養７日目までは増加を示したが、それ以降は細胞密度の変動があり安定しなかったが、培養日数の経過とともに良好な生育が観察された。

【0110】

＜試験４ ゲル状食品を利用した培養＞
（試験４の試験方法）
試験４では、ゲル状食品を用いてユーグレナ細胞の培養を行った。
具体的には、豆乳希釈液を寒天やゼラチンで凝固させたもの、卵黄を加熱して凝固させた卵黄プディング、豆腐を培地として用いてユーグレナ細胞の培養を行った。

【0111】

豆乳：水＝１：９（体積比）の豆乳希釈液を用い、寒天粉末０．２ｗｔ％とゼラチン粉末０．１ｗ％を添加した試料（図１４左）と、寒天粉末０．２ｗｔを添加した試料（図１４中央）を調製し、オートクレーブ滅菌後、ユーグレナ細胞の定常期ＣＭ培地懸濁液を５０μL添加して８日培養した。
また、卵黄液を牛乳:水＝７：３（体積比）混合液で希釈したものを加熱して卵黄プディング（図１４右）を調整し、オートクレーブ滅菌後、ユーグレナ細胞の定常期ＣＭ培地懸濁液を５０μL添加して５日培養した。

【0112】

（試験４の結果と考察）
寒天やゼラチン中（豆乳希釈液）では、試験１〜３の場合と比べてユーグレナ細胞の生育速度が遅く、定常期における細胞密度も小さかった。顕微鏡観察を行った結果、ユーグレナ細胞が球状となり運動性は見られないことがわかった。寒天やゼラチンは、食品としての適用範囲が広いため、利用価値は高いと考えられる。また、食品への応用を考えると、ユーグレナ細胞が生育しすぎることが好ましくないこともある。本試験では、寒天やゼラチン中に必須ビタミンを添加していなかったが、必須ビタミンを添加することで、ユーグレナ細胞の生育が促進される。

【0113】

図１４右は、卵黄のプディングに、ユーグレナ培養液をピペット刺突植継ぎしたもので、ピペットの軌跡と上面の液状部で良好な増殖が見られたが、卵黄プディング内（ゲル内）に浸透拡散して生育はしなかった。なお、卵黄を乳化剤としてアマニ油を乳化させたα-リノレン酸高含有マヨネーズ培地においても、良好な生育は観察されなかった（図１４左）。また、卵白希釈液を加熱によりゲル化した培地での生育も、同様に良好ではなかった（図１４中央）。

【0114】

豆腐を用いた培地では、周囲の水溶液、及び豆腐表面においてユーグレナ細胞の増殖が見られたが（図１５左）、豆腐を割るとその内部にも一様なユーグレナ細胞の増殖が観察された（図１５右）。納豆（試験１）、豆乳ヨーグルト（試験２）、豆乳（試験３）と同様に豆腐でもユーグレナ細胞が良好に生育し、鮮やかな緑色を呈したため、ユーグレナと大豆食品の相性は良好であることがわかった。

【0115】

＜試験１〜４の考察＞
各試験で取り扱った食品の中で、特に良好な生育を示したトマトジュース（無塩）、納豆（ひきわり納豆）、ヨーグルトの３食品について、ユーグレナのアミノ酸組成と比較した結果を図１６に示す。
図１６の横軸の番号は、１８種のアミノ酸を示し、下の表がその対応表である。図の縦軸は、各食品に含まれる１８種のアミノ酸の総重量に対する、その食品中の各種アミノ酸１８種個々の百分率を示す。（例：１５グルタミン酸におけるトマトの含有率は大きいが、トマトの総アミノ酸量に対してであるため、絶対量の比較では納豆に劣る）。ユーグレナのアミノ酸組成は、財団法人日本食品分析センターの分析結果を利用した（http://www.eu-glena.net/eiyou/）。他の食品は、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）のアミノ酸成分表編 第２章 第1表 可食部１００ｇ当たりのアミノ酸成分表を参照した。「納豆、豆腐、豆乳」または「ヨーグルト、普通乳」はそれぞれほぼ同じ組成比率を示したので、代表として「納豆」、「ヨーグルト」を使用した。試験１〜４では各食品ごとに、適当な濃度に希釈して使用した。

【0116】

納豆とヨーグルトは、ユーグレナとほぼ等しいアミノ酸組成を示した。ユーグレナ自身のアミノ酸組成に近い食品である納豆やヨーグルトは、ユーグレナの増殖においてアミノ酸バランスがよい基質であるといえる。
一方、ユーグレナ細胞の生育が最も良好であったトマトは、グルタミン酸（１５番）含有率が突出して多い（他の食品の２倍）のに対し、その他のアミノ酸はあまり含まれていない。ユーグレナ細胞の生育において、グルタミン酸は炭素源としても、窒素源としても利用可能である。したがって、グルタミン酸が豊富に含まれていることは、ユーグレナ細胞の生育に有利であることを示している。さらに、ユーグレナ細胞の生育に対して、抑制的に作用するイソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン（１、２、６、７番）の含有率が少ないことも、トマトジュースを用いた培地において良好な生育を示した原因と考えられる。また、トマトに含まれるリコピンは対数増殖期に急速に分解され、その後長期に渡って培養液の色が良好に維持されたことから、リコピンがユーグレナ細胞の生育に及ぼす影響は大きいと考えられる。また、Ｖ.Ｂ_１２欠乏を補う何らかの物質がトマトの成分に存在していることが示唆された。

【0117】

以上、試験１〜４では、栄養素の少ないＣＭ培地で生育させたユーグレナ細胞を、培地となる食品の１％以下の割合になるよう植継いだサンプルにおける経過を観察した。これはユーグレナ細胞の生育に大きな負荷をかけた条件を採用することで、各食品中におけるユーグレナ細胞の生育様式の差を顕著にするという意図によるものであった。したがって、ユーグレナ細胞を培地となる食品へと植継ぐ量を適切に増加させることで、試験１〜４で得られた以上の生育速度でユーグレナ細胞を定常期へ成長させることが可能である。

【0118】

＜試験５ 飲料を利用した培養＞
試験５では、野菜飲料、果実飲料及びその他の飲料を用いてユーグレナ細胞の培養を行った。

【0119】

（試験５の試験方法）
（１）オートクレーブ滅菌したラボランスクリュー管瓶（Ｎｏ.５、２０ｍＬ）に、Ｖ.Ｂ_１（チアミン塩酸塩）およびＶ.Ｂ_１２(シアノコバラミン)を添加した。
Ｖ.Ｂ_１：０．５ｇ／Ｌ×３μＬ＝１．５μｇ（ＣＭ培地等量）
Ｖ.Ｂ_１２：０．１ｇ／Ｌ×０．７５μＬ＝０．０７５μｇ（ＫＨ培地等量）
各試薬は精製水に溶解し、熱による損傷を防ぐため、オートクレーブ滅菌は行わなかった。

【0120】

（２）スクリュー管瓶内に、基質となる各種飲料（非加熱）、精製水をオートクレーブした滅菌水、細胞懸濁液を投入した。
基質となる各種飲料と滅菌水の体積比は以下のとおりとした。
・トマトジュース：滅菌水＝４：６
・ココナッツウォーター：滅菌水＝１４：１
・メープルウォーター：滅菌水＝１４：１
・ブドウジュース（濃）：滅菌水＝７：３
・にんじんジュース（濃）：滅菌水＝７：３
・その他飲料：滅菌水＝３：７
滅菌水にはユーグレナ細胞懸濁液も含まれており、ユーグレナ細胞は滅菌水で２回洗浄した（遠心分離条件：６０００ｒｐｍ、５分、４℃）。

【0121】

基質となる飲料をスクリュー管瓶に注入し、滅菌水を総量の８分目程度まで入れて軽く撹拌した。洗浄済のユーグレナ細胞懸濁液を注入し、滅菌水で１５ｍＬにメスアップした。基質となる飲料が高濃度の場合、ユーグレナ細胞にダメージを与える可能性があるため、希釈した飲料を用いた。滅菌水でメスアップした後、スクリュー管瓶の蓋を閉めて軽く撹拌した。
各試料の初期細胞密度は１．６×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬとした。

【0122】

（３）作成した各試料のスクリュー管瓶の蓋を緩め、好気条件、で静置培養した。
光照射培養条件：白色蛍光灯常時照射、光量１００μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２６℃
暗所培養条件：暗所にて、温度２３℃

【0123】

上記（１）及び（２）の操作はクリーンベンチ内で行った。
植継元のユーグレナ細胞の培養はＣＭ培地（初発ｐＨ３．５）を用いて行った。対比例として用いたＣＭ培地のみの試料の初発ｐＨも３．５とした。

【0124】

（試験５の結果と考察）
各試料を光照射培養条件または暗所培養条件で培養し、定常期（培養を開始して１１日経過した時）における細胞密度を測定した結果を図１７に示す。

【0125】

ほぼ全ての試料において、光照射培養条件において、暗所培養条件よりもユーグレナ細胞の密度が高くなる傾向があった。特に、トマト、オレンジ、パイン、ブドウ、にんじん、グレープフルーツ、プルーンで良好な生育が確認された。
また、暗所培養条件で培養を行った場合、ユーグレナ細胞は緑色を呈さず白色を呈したことから、基質食品の色相を大きく変化させることなく、食品の栄養を強化できるというメリットがあることがわかった。

【0126】

次に、各試料の明暗条件を入れ替えて、培養を継続し、明暗条件を入れ替えて１５日経過した時の細胞密度を測定した。結果を図１８及び１９に示す。
図１８は、定常期まで暗所培養条件で培養を行った後に、光照射培養条件で培養を行った際の各種試料における細胞密度を示している。
光照射培養条件に切り替えて１．５日程度で各試料の色が白色から緑色に変化した。特に、柑橘系のパイン、オレンジ、グレープフルーツ、及びトマトでは緑色への変化が早かったが、リンゴではほとんど緑色を呈さなかった。トマトを用いた試料においてユーグレナ細胞が良い成長を示したが、トマトにはグルタミン酸やリコピンが豊富であることに起因すると考えられる。また、甘酒はＶ．Ｂ_１、Ｖ．Ｂ_２、グルコースが豊富である。

【0127】

図１９は、定常期まで光照射培養条件で培養を行った後に、暗所培養条件で培養を行った際の各種試料における細胞密度を示している。
光照射培養条件から暗所培養条件に切り替えることで、各試料の色が鮮やかな緑色からくすんだ緑色へと変化したが、白色にはならなかった。

【0128】

＜試験６ 滅菌飲料培地における培養＞
試験６では、オートクレーブ滅菌した飲料含有培地用い、「明もしくは暗」かつ、「開放もしくは密閉」の各組合せによる生育条件でユーグレナ細胞を定常期まで増殖させ、ユーグレナ細胞密度の計測と官能検査（テイスティング）を行い、光や、容器の気密性がユーグレナの生育に及ぼす影響を検討した。

【0129】

（試験６の試験方法）
（１）オートクレーブ滅菌したスクリュー管瓶（Ｎｏ．５，φ２７×５５ｍｍ）に、Ｖ.Ｂ_１（チアミン塩酸塩）およびＶ.Ｂ_１２(シアノコバラミン)を下記の量添加した（サンプル溶液総量は１５ｍＬとした）。
Ｖ.Ｂ_１：０．５ｇ／Ｌ×３μＬ＝１．５μｇ（ＣＭ培地等量）
Ｖ.Ｂ_１２：０．１ｇ／Ｌ×０．７５μＬ＝０．０７５μｇ（ＫＨ培地等量）
各試薬は精製水に溶解し、熱による損傷を防ぐため、オートクレーブ滅菌は行わなかった。

【0130】

（２）飲料は、ブドウジュース、パインジュース、リンゴジュース、甘酒、にんじんジュース、トマトジュース、オレンジジュース、プルーンジュースを用いた。
トマトジュースについては、滅菌水との体積比が、トマトジュース：滅菌水＝３：７と、トマトジュース：滅菌水＝４：６の２種類を用意した。
基質となる飲料を投入し、スクリュー管瓶に半分程度（１０ｍＬ）まで精製水を加え、スクリュー管瓶の蓋を締め、高圧蒸気滅菌器（アルプ株式会社製，型式：ＫＴ−２３２２）を用いて、１２１℃、２０分間、オートクレーブ滅菌した。ここで、オートクレーブ時に香気成分の散逸、及び混入を防ぐためにスクリュー管瓶の蓋を締めた。なお、他の試験においても、オートクレーブ滅菌処理は当該条件にて行った。

【0131】

（３）ユーグレナ細胞をＣＭ培地（初発ｐＨ３．５）にて定常期まで生育させた。ユーグレナ細胞懸濁液を、滅菌水を用いて２回洗浄した（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）。滅菌した各培地に洗浄した細胞を添加して、滅菌水で１５ｍＬにメスアップした。
初期細胞密度は１．１×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬであった。
一連の作業はクリーンベンチ内の無菌環境にて行った。

【0132】

（４）各サンプル毎に「光照射・開放」、「光照射・密閉」、「暗所・開放」、「暗所・密閉」４種類の生育条件にて、９日間静置培養した。
・光照射条件：白色蛍光灯常時照射、光量１００μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２６℃
・暗所培養条件：暗所にて、温度２３℃
・開放条件：スクリュー管瓶の蓋を軽く緩めた
・密閉条件：スクリュー管瓶蓋を固く締めた

【0133】

（試験６の結果と考察）
各サンプルを所定の条件で培養し、定常期（培養を開始して１１日経過した時）における細胞密度を測定した結果を図２０に示す。
図２０のグラフを図１７のグラフと比較すると、オートクレーブ滅菌処理の有無によって、定常期におけるユーグレナ細胞密度は大きく変わらないことがわかった。よって、衛生面を考慮して食品含有培地をオートクレーブ滅菌処理することは有益であるといえる。

【0134】

トマト以外のサンプルでは、「光照射・密閉」条件においても「光照射・開放」条件とほぼ等しい良好な生育が得られた。トマトの「光照射・密閉」の細胞密度は、その値自体が他のサンプルに比べて大きいので、良好な生育が得られたと言える。
全てのサンプルにおいて、ユーグレナ細胞は運動性を示し、生存が確認されたため、ユーグレナ細胞が生きた状態で栄養が強化された食品組成物の提供が可能である。

【0135】

目視による培養液外観の細胞の色は、密閉もしくは開放に関わらず光照射条件で緑色、暗所条件で白色を呈していた。培養後の各サンプルの官能試験の結果、食味及び香りは共に不快なものではなく、食するに適していた。

【0136】

全てのサンプルに共通の傾向として、ユーグレナ細胞の増殖が進むにつれて、元の基質飲料と比べて酸味が弱くなり、角が取れたまろやかな甘さを呈するようになった。この傾向はユーグレナ細胞密度が大きくなる「光照射」の条件において顕著であった。基質となる飲料の香りによって、ユーグレナ藻体の臭いがマスクされたが、臭いのマスクは、ユーグレナ細胞密度が小さい「暗所・密閉」条件において顕著であった。

【0137】

培養後に基質飲料とは異なる香りを呈したサンプルとして、「光照射・密閉」条件におけるトマトは缶詰のみかんの香りを呈していた。また、甘酒はすずらんの花の香り、オレンジは金柑香りを呈していた。なおブドウとパインは基質飲料とほぼ同じ香りを呈していた。

【0138】

以上より、基質飲料（基質食品）の特性（色、食味、香り）を残したい場合は、「暗所・密閉」条件で培養を行うとよい。また、ユーグレナの特性やユーグレナの細胞密度を高めたい場合は、「光照射、密閉」条件で培養を行うとよい。

【0139】

食品を含有する培地をオートクレーブ滅菌処理しても、ユーグレナが適切に増殖したことから、他の微生物の増殖を防止することができる。
また、一般的な飲料製品で用いられている密閉容器においても、ユーグレナが適切に増殖したことから、生きたユーグレナ細胞を含有する栄養強化飲料製品を密閉容器の形態で提供することが可能である。

【0140】

＜試験７ ワイン又はブドウジュースを利用した培養＞
試験７では、ブドウ果汁を含有するワイン又はブドウジュースを含む培地を用いてユーグレナ細胞の培養を行った。

【0141】

（試験７の試験方法）
ワインは「おいしい酸化防止剤無添加ワイン（ふくよかで濃い）、ＫＩＲＩＮ製」を使用し、所定量のワインを培養容器に注入し、湯煎にてアルコールを除去した。
ブドウジュースは「赤葡萄（名古屋製酪株式会社製）」を使用した。
３０ｍＬサンプルの容器（スクリュー管Ｎｏ．６、φ３０×６５）、または５０ｍＬサンプルの容器（ＦＳメディアバイアル、φ４０×７５、型式：Ｔ−５０」を培養容器として使用した。
各培養容器にＶ．Ｂ_１（ＣＭ培地等量）、Ｖ．Ｂ_１２（ＫＨ培地等量）を添加し、水を５分目程度まで入れてオートクレーブした。
各サンプルの配合を表８に示す（表中の水には細胞懸濁液も含まれる）。

【0142】

【表8】

【0143】

ＣＭ培地（初発ｐＨ３．５）を用い、定常期まで生育させたユーグレナ細胞を、遠心分離機を用いて沈殿させた（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）。上清を捨てた後、ユーグレナ細胞を滅菌水に懸濁して培養容器に注入した。滅菌水にて所定の総量にメスアップした。初期細胞密度は１．５×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬであった。

【0144】

各サンプルを白色蛍光灯常時照射、光量４０μｍｏｌ／ｍ^２・秒、温度２６℃、バイアル瓶の蓋を軽く緩めて好気条件にて、静置培養した。
ワイン培地における細胞密度測定は、プランクトン計算板を用い、培養９日目に行った。

【0145】

（試験７の結果と考察）
各サンプルの生育曲線を図２１に、ワイン培地における培養９日目の細胞密度を図２２に示す。
アルコールを除去した場合、ワインを含有する培地においても、ブドウ果汁液同様の良好な生育が得られることがわかった。一方、ブドウジュースで培養を行うと、ワインのような芳香を呈し、藻体の臭いがマスクされた。
なお、ワインの濃度についてはワイン：水の体積比が３：７の場合に最も良い生育が得られ、他の果汁飲料と同様の傾向を示した。

【0146】

＜試験８ 果実飲料によるユーグレナ細胞の染色＞
試験８では、果実飲料としてブドウジュースを用いた培養液を用いてユーグレナ細胞を培養し、ユーグレナ細胞の色相を観察した。

【0147】

（試験８の試験方法）
培地として、ＣＭ培地、体積比がブドウジュース：水＝３：７の培地、体積比がブドウジュース：水＝７：３の培地を用い、ユーグレナ細胞の培養を１日間行った。
ブドウジュースを用いて培養したユーグレナ細胞の洗浄は、遠心分離条件８０００ｒｐｍ、５分、５℃にて、滅菌水で２回洗浄した。

【0148】

バクテリア計算盤（サンプル厚さ２０μｍ）を用いることで光路長を短くし、背景色の紫色が強調されないようにして、洗浄した後のユーグレナ細胞を観察した。
結果を図２３に示す。

【0149】

ブドウジュース：水＝３：７の培養液で培養を行った後のユーグレナ細胞では、洗浄前は紫色に染色された部分が細胞内に均一に分散していたが、洗浄（遠心分離）後の細胞では、染色部が局在化していたことから、染色部と非染色部で比重がことなっていることがわかった。どの細胞も形状は球もしくは楕円体で、ゆっくりとした伸縮運動をしていた。

【0150】

ブドウジュース：水＝７：３の培養液で培養を行った後のユーグレナ細胞では、細胞全体が染色されており、細胞は桿状で運動性が低下していた。
また、ＣＭ培地で培養を行った後のユーグレナ細胞は緑色を呈していた。

【0151】

以上の結果から、果実飲料を用いてユーグレナ細胞の培養を行うと、ブドウジュースに含まれるアントシアニンにより、細胞の染色を行うことが可能であることがわかった。

【0152】

＜試験９ 野菜搾汁液を用いた培養＞
試験９では、野菜搾汁液を用いた培養液を用いてユーグレナ細胞を培養した。
（試験９の試験方法）
（１）赤パプリカのへたと種を除去し、ホールスロージューサー（Ｋｕｖｉｎｇｓ製，型式：ＪＳＧ−６２１）を用いて搾汁した。茶漉しを用いて、赤パプリカ搾汁液の固形成分を除去した。
オートクレーブ滅菌したスクリュー管瓶（Ｎｏ．５，φ２７×５５ｍｍ）に、Ｖ.Ｂ_１（チアミン塩酸塩）およびＶ.Ｂ_１２(シアノコバラミン)を下記の量添加した（サンプル溶液総量は１５ｍＬとした）。
Ｖ.Ｂ_１：０．５ｇ／Ｌ×２μＬ＝１．０μｇ（ＣＭ培地等量）
Ｖ.Ｂ_１２：０．００１ｇ／Ｌ×５０μＬ＝０．０５μｇ（ＫＨ培地等量）

【0153】

赤パプリカ搾汁液を各スクリュー管瓶に注入した。総体積の１０％から１００％まで、１０％毎に異なる搾汁液濃度となるように調整した。
スクリュー管瓶の半分程度（１０ｍＬ弱）まで精製水を注入し、蓋を締めて、高圧蒸気滅菌器（アルプ株式会社製，型式：ＫＴ−２３２２）を用いて、１２１℃、２０分間、オートクレーブ滅菌した。

【0154】

（２）滅菌後の培養液に、ＣＭ培地で定常期まで生育させたユーグレナ細胞懸濁液を添加し、１０ｍＬに滅菌水でメスアップした。
初期細胞密度は６．３×１０^３ｃｅｌｌ／ｍＬであった。

【0155】

白色蛍光灯常時照射、光量４５μｍｏｌ／ｍ^２・秒の光照射条件、温度２６℃で１２日間静置培養した。

【0156】

（試験９の結果と考察）
図２４に、培養６日目における、ユーグレナ細胞の生育状態を示す（図中の数字は搾汁液：水の体積比を表している）。また、図２５は、培養３日目（左）から１日おきの培養液の色の変化を示している（サンプルは搾汁液：水＝１：９，２：８，３：７）。さらに、図２６において培養１２日後のユーグレナ生育状態を示す。図２７は培養１２日後の培養液中のユーグレナの細胞密度を示す。

【0157】

全てのサンプルでユーグレナ細胞の増殖が観察されたが、市販の飲料の場合と同様に「基質食品：水」の比率が「３：７」又は「４：６」において初期の良好な生育が得られた。一方で、より高濃度の搾汁液の方が最終細胞濃度は高くなった。従って、すぐに食品として提供する場合には基質食品（搾汁液）：水の比率が３：７〜４：６の範囲であることが特に好ましく、より提供までより長期間かかる場合には、４：６〜１０：０の範囲の濃度で搾汁液を調製することが好ましい。また、全ての搾汁液濃度でトマトと同様に培養液の劇的な色の変化が観察された。赤パプリカに含まれる赤い色素は、主にキサントフィル類のカプサンチンに由来し、トマトに含まれるリコピンと同様に高い抗酸化力を有するため、ユーグレナに含まれる栄養成分と併せて栄養強化食品組成物を提供可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】