特開 2020-115757 ニワトリ胸肉の剪断力価に関与する量的形質遺伝子座の指標となるＳＮＰマーカーおよびその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2020-115757(P2020-115757A)

(43)【公開日】2020年8月6日

(54)【発明の名称】ニワトリ胸肉の剪断力価に関与する量的形質遺伝子座の指標となるＳＮＰマーカーおよびその利用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20200710BHJP

   A01K 67/02 20060101ALI20200710BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20200710BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68ZNA

   A01K67/02

   C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2019-7597(P2019-7597)

(22)【出願日】2019年1月21日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日： 平成３０年１０月１７日 ウェブサイトのアドレス： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／３０３２９１０７ 公開者： Ｔａｋａｓｈｉ Ｏｎｏ，Ｔｏｍｏｍｉ Ｋｏｕｇｕｃｈｉ，Ａｋｉｒａ Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ａｔｓｕｓｈｉ Ｊ．Ｎａｇａｎｏ，Ａｔｓｕｓｈｉ Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ，Ｔａｋｅｓｈｉ Ｉｇａｗａ，Ｍａｓａｏｋｉ Ｔｓｕｄｚｕｋｉ 公開された発明の内容： 上記公開者が、上記ウェブサイトで公開された論文にて、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与する量的形質遺伝子座の指標となるＳＮＰマーカーおよびその利用について公開した。

(71)【出願人】

【識別番号】000229519

【氏名又は名称】日本ハム株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100198018

【弁理士】

【氏名又は名称】取違 絵理

(74)【代理人】

【識別番号】100210907

【弁理士】

【氏名又は名称】大津 雅央

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】西川 友美

(72)【発明者】

【氏名】都築 政起

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ42

4B063QQ79

4B063QS10

4B063QS14

(57)【要約】

【課題】ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標となるマーカー、およびそれを利用したニワトリの生産方法等を提供する。
【解決手段】ニワトリ（Gallus gallus var. domesticus）のＺ染色体上にある第１ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand）の6283268番目の塩基、および／または第２ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand）の8103237番目の塩基を利用したニワトリの鑑定方法であって、鑑定の対象とするニワトリ（被験ニワトリ）、所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ（基準ニワトリ）それぞれにおける前記第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧかＡかの照合（第１照合）、および／または被験ニワトリ、基準ニワトリそれぞれにおける前記第２ＳＮＰマーカーの塩基がＣかＴかの照合（第２照合）を行う工程、および前記第１照合および／または前記第２照合において情報が一致する場合に、前記被験ニワトリは前記基準ニワトリの、前記第１ＳＮＰマーカーおよび前記第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬを保有していると判定する工程を含む、鑑定方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ニワトリ（Gallus gallus var. domesticus）のＺ染色体上にある
第１ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand）の6283268番目の塩基、
および／または
第２ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand）の8103237番目の塩基
を利用したニワトリの鑑定方法であって、
鑑定の対象とするニワトリ（以下「被験ニワトリ」と呼ぶ。）における前記第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧかＡかの情報と、所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「基準ニワトリ」と呼ぶ。）における前記第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧかＡかの情報の照合（以下「第１照合」と呼ぶ。）、
および／または
被験ニワトリにおける前記第２ＳＮＰマーカーの塩基がＣかＴかの情報と、基準ニワトリにおける前記第２ＳＮＰマーカーの塩基がＣかＴかの情報の照合（以下「第２照合」と呼ぶ。）を行う工程と、
前記第１照合および／または前記第２照合において前記被験ニワトリと前記基準ニワトリの情報が一致する場合に、前記被験ニワトリは前記基準ニワトリの、前記第１ＳＮＰマーカーおよび前記第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬを保有していると判定する工程と
を含む、鑑定方法。

【請求項2】

請求項１に記載の鑑定方法により、基準ニワトリの前記胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬを保有していると判定された被験ニワトリ、またはその後代を、交配に用いる、ニワトリの生産方法。

【請求項3】

ニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の推定方法であって、
基準ニワトリにおける、請求項１で定義した第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する遺伝子に関連する塩基配列を、基準ニワトリとは異なる胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「参照ニワトリ」と呼ぶ。）における、対応する部位の塩基配列と比較する工程と、
前記比較の結果、前記基準ニワトリの前記塩基配列と前記参照ニワトリの前記塩基配列との間に、統計学的な有意差を持って相違している塩基が存在する場合に、前記遺伝子は胸肉の剪断力価に関与する遺伝子であると推定する工程と
を含む、推定方法。

【請求項4】

前記第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する前記遺伝子がＫＩＦ２４である、請求項３に記載の推定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ニワトリ胸肉の剪断力価に関与する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）の指標として利用できる一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーおよびその利用方法に関する。より詳しくは、本発明は、当該ＳＮＰマーカーを利用したニワトリの生産・育種方法、およびニワトリ胸肉の剪断力価に関与する遺伝子などに関する。

【背景技術】

【0002】

今日流通している鶏肉のほとんどは、「ブロイラー肉」と呼ばれる、白色コーニッシュ雄と白色プリマスロック雌を交配して得られる雑種第一世代（Ｆ₁）の肉である。この一般ブロイラーは、成長速度が極めて速く３９〜５６日齢で出荷されるため、安価かつ大量に供給が可能である。わが国では１９６０年代より導入され漸次その利用量が増加して来た。しかし、成長速度に特化した育種改良の結果、肉質は水っぽく、締りや旨みが少ないといった欠点が目立つ。そこで１９８０年代より「歯ごたえとコク」のある高品質な鶏肉の需要が高まり、特殊肉用鶏の作出が全国各地で行われ始めた。しかし、特殊肉用鶏のほとんどは、日本在来品種と外国品種との交配により作出した雑種を利用しているに過ぎず、「歯ごたえとコク」については一定の評価を得ているものの、成長スピードや飼料効率については既存の一般ブロイラーには遠く及ばない。「歯ごたえとコク」のある肉を産出するニワトリの真の育種改良を考える場合、成長スピード、産肉量および「旨さ」を兼ね備えた純粋品種もしくは系統の作出、あるいは雑種生産用の種鶏となる品種や系統の作出が必要になる。

【0003】

鶏肉の「歯ごたえ」、すなわち鶏肉における「硬さ（弾力）」は、美味しさを決める要因の一つであり、その評価には剪断力価が広く用いられている。剪断力価は連続的な変異を示すため、体重や産卵量と同様に、量的形質であると考えられる。量的形質は、飼育場の形状や飼料の種類、あるいは飼育温度といった環境要因によって、その形質発現に影響を受ける。量的形質は複数の遺伝子座によって支配されており、その遺伝子座を量的形質遺伝子座（Quantitative Trait Loci：ＱＴＬ）と呼ぶ。

【0004】

統計遺伝学の発達ならびにコンピューターの性能の発達により、近年では、環境要因の補正を行い遺伝能力のみを評価し選抜するBest Linear Unbiased Prediction（ＢＬＵＰ）法を用いることが選抜育種の主流になっている。このＢＬＵＰ法の登場により、環境要因の予測が可能になり遺伝能力の推定が可能になりはしたが、この方法は家畜の測定値（表現型値）を利用するものであって、家畜の生産形質に関与する優良遺伝子そのものの情報を利用するわけではない。選抜育種はより正確であることが望ましい。従って、表現型値だけに頼るのではなく、形質に関連する優良遺伝子の情報も選抜育種に利用できれば、より正確に家畜の育種改良を行うことができる。

【0005】

優良遺伝子の発見に先立ち、まずその遺伝子が染色体上のどこに存在するか把握する必要がある。この位置を把握するための解析法としてＱＴＬ解析がある。ＱＴＬ解析を行い、優良遺伝子の染色体上の位置が明らかになれば、そのＱＴＬ近傍のＤＮＡマーカーを利用することにより、表現型値にとらわれないマーカーアシスト育種（さらに解析を進めた場合には、ジーンアシスト育種）が可能になる。

【0006】

ニワトリに関係するＱＴＬとして、特許文献１には卵殻強度の改善に関連するＱＴＬについて記載されており、特許文献２には、鶏肉および／または鶏卵中の長鎖高度不飽和脂肪酸の含量の向上に関連するＱＴＬについて記載されている。非特許文献１には、大シャモとホワイトレグホンを交配させて、肉の色に関連するＱＴＬのマッピングを行ったこと
が記載されている。

【0007】

一方、鶏肉の剪断力価の評価や比較については、現在、特殊肉用鶏を中心に日本各地で研究が行われているが（非特許文献２〜５）、剪断力価を支配しているＱＴＬの染色体上の位置については世界的に報告例がない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開２００９／１４４８０９号

【特許文献2】特開２０１４−５０３２９号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Yoshida et al., Journal of Poultry Science, 50(3), 198-205, 2013.

【非特許文献2】作田 敦, 垪和 靖俊, 生井 和夫, 御幡 壽 (2003) 高品質特殊鶏肉生産技術確立試験 茨城県畜産センター研究報告 35: 105-109.

【非特許文献3】宮腰雄一, 本間紀之, 鈴木ひろみ (2005) 蜀鶏を活用した「にいがた地鶏」の作出. 新潟県畜産研究センター研究報告第 15.

【非特許文献4】松井 繁幸, 池谷 守司 (2012) 新銘柄地鶏「フジ小軍鶏」の肉質評価. 静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター研究報告 5: 14-19.

【非特許文献5】小嶋禎夫, 三枝弘育 (2013) 烏骨鶏肉の理化学特性−肉用鶏との比較. 東京農総研研報 8: 11-18.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬ解析により、そのＱＴＬの指標となるマーカーを特定すること、さらにそのマーカーを利用して、ＱＴＬに関与する遺伝子を推定する方法や、歯ごたえのある胸肉を持つニワトリを生産する方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、ニワトリのＺ染色体上にある特定の２つのＳＮＰの塩基が、ニワトリの胸肉の剪断力価がそれぞれ高い品種および低い品種の代表である、大シャモおよび白色プリマスロックの間で相違していることなどから、その２つのＳＮＰをニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標となるマーカーとして利用できることなどを見出した。なお、２つのＳＮＰマーカーの一つ（第１ＳＮＰマーカー）は、存在は公知であったが、ニワトリの胸肉の剪断力価のＱＴＬとの関係性については全く知られておらず、もう一つのＳＮＰマーカー（第２ＳＮＰマーカー）は存在自体が本発明を通じて初めて見出されたものである。

【0012】

すなわち、本発明は下記の事項を包含する。
［１］
ニワトリ（Gallus gallus var. domesticus）のＺ染色体上にある
第１ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand）の6283268番目の塩基、
および／または
第２ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand）の8103237番目の塩基
を利用したニワトリの鑑定方法であって、
鑑定の対象とするニワトリ（以下「被験ニワトリ」と呼ぶ。）における前記第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧかＡかの情報と、所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「基準ニワトリ」と呼ぶ。）における前記第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧかＡかの情報の照合（以下「第１照合」と呼ぶ。）、
および／または
被験ニワトリにおける前記第２ＳＮＰマーカーの塩基がＣかＴかの情報と、基準ニワトリにおける前記第２ＳＮＰマーカーの塩基がＣかＴかの情報の照合（以下「第２照合」と呼ぶ。）を行う工程と、
前記第１照合および／または前記第２照合において前記被験ニワトリと前記基準ニワトリの情報が一致する場合に、前記被験ニワトリは前記基準ニワトリの、前記第１ＳＮＰマーカーおよび前記第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬを保有していると判定する工程と
を含む、鑑定方法。
［２］
項１に記載の鑑定方法により、基準ニワトリの前記胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬを保有していると判定された被験ニワトリ、またはその後代を、交配に用いる、ニワトリの生産方法。
［３］
ニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の推定方法であって、
基準ニワトリにおける、請求項１で定義した第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する遺伝子に関連する塩基配列と、基準ニワトリとは異なる胸肉の剪断力価を有するニワトリ（以下「参照ニワトリ」と呼ぶ。）における、対応する部位の塩基配列を比較する工程と、
前記基準ニワトリの前記塩基配列と前記参照ニワトリの前記塩基配列が、統計学的な有意差を持って相違している場合に、前記遺伝子は胸肉の剪断力価に関与する遺伝子であると推定する工程と
を含む、推定方法。
［４］
前記第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する前記遺伝子がＫＩＦ２４である、項３に記載の推定方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明により特定された２つのＳＮＰマーカーが、胸肉の剪断力価に優れた品種と同じ塩基を有するかどうかの判定結果は、歯ごたえのある旨い胸肉を生産するための遺伝的因子を保有するニワトリの個体を効率的に選抜するために利用することができる。そのようにして選抜された個体を、成長速度や産肉量など他の形質に優れた個体と交配することにより、既存のものよりも肉質に優れた品種を育成することができるようになる。また、ＳＮＰマーカーを利用したマーカーアシスト育種に加え、将来的にはより効率的なジーンアシスト育種も可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明における第１ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand＝紙面上側の配列）の6283268番目の塩基の前後の塩基配列を示すゲノムマップ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/より）。第１ＳＮＰマーカーの塩基は、白色プリマスロックはゲノムマップ（NC_006127.5）と同じ「Ａ」であるが、大シャモは「Ｇ」である。

【図2】本発明における第２ＳＮＰマーカー：NC_006127.5（positive strand＝紙面上側の配列）の8103237番目の塩基の前後の塩基配列を示すゲノムマップ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/より）。第２ＳＮＰマーカーの塩基は、白色プリマスロックはゲノムマップ（NC_006127.5）と同じ「Ｔ」であるが、大シャモは「Ｃ」である。

【図3】本発明における２つのＳＮＰマーカーの間の領域にある遺伝子を示すゲノムマップ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/より）。

【図4】実施例で造成した、ニワトリの胸肉剪断力価に関するＱＴＬ解析のための、大シャモ（ＯＳ）および白色プリマスロック（ＷＰＲ）に基づくＦ₂資源家系の家系図。括弧書きの数字は個体番号を表す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明では、２つのＳＮＰマーカー（第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカー）の塩基の少なくとも一方、好ましくは両方情報を、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用する。なお、本明細書において、第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーを「本発明の２つのＳＮＰマーカー」、それらの塩基を「本発明の２つのＳＮＰ塩基」と呼ぶことがある。本発明の２つのＳＮＰマーカーは、胸肉の剪断力価が相違する品種間で、例えば大シャモと白色プリマスロックの間で、塩基の相違が見られる。

【0016】

ニワトリの性染色体はＺＷ型で、雄はホモ（ＺＺ）、雌はヘテロ(ＺＷ)であるが、２つのＳＮＰマーカーはＺ染色体上の１１ｃＭの位置にある。ニワトリのＺ染色体の塩基配列の情報は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）において、「NCBI Reference Sequence: NC_006127.5」（Gallus gallus breed Red Jungle Fowl isolate RJF #256 chromosome Z, GRCg6a）として公開されている。本明細書では、第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーのどちらも、「NC_006127.5」(Accession number/Version)の、positive strand（ポジティブストランド、＋鎖）の塩基配列における塩基の番号によって特定することとする。このようにして特定される第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーと同等の情報を、図１および図２のゲノムマップ、ならびに配列表の配列番号１（その４２番目の塩基）および配列番号２（その３５番目の塩基）によって開示する。当業者であれば、本明細書の記載に加え、図１および図２に示されたゲノムマップや配列番号１および配列番号２に示された塩基配列から、第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーそれぞれの塩基がどれか、さらに被験ニワトリ、基準ニワトリおよび参照ニワトリから得られたゲノム情報において第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーとして対比すべき塩基がどれかを、一義的に特定できる。また、本発明において、NC_006127.5のpositive strandの所定の位置（何番目か）の塩基に係る情報は、それと相補的なnegative strandの対応する位置の塩基に係る情報と実質的に同義であり、本明細書における前者に関する記載は後者に関する記載に適宜読み替えることができる。さらに、当業者であれば、ＮＣＢＩにおいて同じAccession numberの他のversionとして公開されている塩基配列情報（例えば、NCBI Reference Sequence: NC_006127.4：Gallus gallus isolate RJF #256 breed Red Jungle fowl, inbred line UCD001 chromosome Z, Gallus_gallus-5.0, whole genome shotgun sequence）や、ＮＣＢＩ以外の機関によって提供されている塩基配列情報（例えばGenBank）を参照したとしても、配列相同性やその他の情報を総合的に考慮して、どの塩基が本明細書に記載したＮＣＢＩのAccession number/Versionによって特定されている第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの塩基に相当するかを特定することが可能である。

【0017】

第１ＳＮＰマーカーは、NC_006127.5（positive strand）の6283268番目の塩基である。このＳＮＰマーカーは、NC_006127.4（positive strand）では6283335番目の塩基に相当し、「ｒｓ３１７１９０９０５」と命名されていた。第１ＳＮＰマーカーは、塩基Ｇ／Ａの多型であり、胸肉の剪断力価が高い品種はこの塩基がＧである頻度が高く、胸肉の剪断力価が低い品種はこの塩基がＡである頻度が高い、という傾向にある。例えば、前者の代表である大シャモの雄は、ゲノム中の２つのＺ染色体における第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧのホモであり（遺伝子型Ｇ／Ｇ）、後者の代表である白色プリマスロックの雌は、ゲノム中の１つのＺ染色体における第１ＳＮＰマーカーの塩基がＡである（遺伝子型Ａ／−）。第１ＳＮＰマーカーについて、NC_006127.5のpositive strandの6283268番目の塩基がＧかＡかという情報は、相補的な塩基配列を有するnegative strandの対応する位置にある塩基がＣかＴかという情報と同義である。

【0018】

第２ＳＮＰマーカーは、NC_006127.5（positive strand）の8103237番目の塩基である。このＳＮＰマーカーは、NC_006127.4（positive strand）では8103304番目の塩基に相当する。第２ＳＮＰマーカーは、塩基Ｃ／Ｔの多型であり、胸肉の剪断力価が高い品種はこの塩基がＣである頻度が高く、胸肉の剪断力価が低い品種はこの塩基がＴである頻度が高い、という傾向にある。例えば、前者の代表である大シャモの雄は、ゲノム中の２つのＺ染色体における第２ＳＮＰマーカーがＣのホモであり（Ｃ／Ｃ）、後者の代表である白色プリマスロックの雌は、ゲノム中の１つのＺ染色体における第２ＳＮＰマーカーの塩基がＴである（Ｔ／−）。第２ＳＮＰマーカーについて、NC_006127.5のpositive strandの8103304番目の塩基がＣかＴかという情報は、相補的な塩基配列を有するnegative strandの対応する位置にある塩基がＧかＡかという情報と同義である。

【0019】

このような相関性から、本発明の２つのＳＮＰマーカーのいずれか一方または両方の情報を、具体的には、第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧかＡか（Ｚ染色体をホモで持つ雄のニワトリについては、Ｇ／Ｇか、Ｇ／Ａか、Ａ／Ａか；Ｚ染色体をヘテロで持つ雌のニワトリについては、Ｇ／−か、Ａ／−か）、および／または第２ＳＮＰマーカーの塩基がＣかＴか（Ｚ染色体をホモで持つ雄のニワトリについては、Ｃ／Ｃか、Ｃ／Ｔか、Ｔ／Ｔか；Ｚ染色体をヘテロで持つ雌のニワトリについては、Ｃ／−か、Ｔ／−か）の情報を、胸肉の剪断力価に関するＱＴＬの指標として利用することができる。

【0020】

本発明の２つのＳＮＰ塩基の情報をニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用することにより、目的に応じた様々な方法への応用が可能となる。応用方法は特に限定されるものではないが、例えば、第１の応用として「ニワトリの鑑定方法」が挙げられ、第２の応用として「ニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の特定方法」が挙げられる。

【0021】

本発明によるニワトリの鑑定方法（本発明のＳＮＰ塩基の情報の第１の応用）は、次の２つの工程を含む方法である。本発明の鑑定方法の第１工程は、鑑定の対象とするニワトリ（本明細書において「被験ニワトリ」と称する。）における本発明の２つのＳＮＰ塩基の少なくとも一方、好ましくは両方の情報と、所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ（本明細書において「基準ニワトリ」と称する。）における本発明の２つのＳＮＰ塩基の少なくとも一方、好ましくは両方の情報とを照合する工程（本明細書において「照合工程」と呼ぶ。）である。

【0022】

本発明の鑑定方法の第２工程は、第１照合および／または第２照合において情報が一致する場合に、被験ニワトリは基準ニワトリの、第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬを保有していると判定する工程である。第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーはそれぞれ、それらに挟まれた領域に含まれている遺伝子と実質的に連鎖しているとみなせる。したがって、第１照合および第２照合において、少なくとも一方の、好ましくは両方の情報が一致すれば、被験ニワトリは基準ニワトリと同じ、胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬ、すなわち胸肉の剪断力価に関与すると推定される遺伝子を含むＤＮＡ領域を保有していると推定することができる。例えば、胸肉の剪断力価が高いことが知られている大シャモを基準ニワトリとして選択した場合、その基準ニワトリと同じ遺伝子型を有する被験ニワトリは、胸肉の剪断力価を向上させるのに適した遺伝的因子を保有していると推定できる。「所定の胸肉の剪断力価を有するニワトリ」は、典型的には、ニワトリの品種間で比較したときに相対的に高い剪断力価を有する品種のニワトリであるが、目的によっては、相対的に低い剪断力価を有する品種のニワトリ、または中間の剪断力価を有する品種のニワトリであってもよい。

【0023】

被験ニワトリおよび基準ニワトリの品種は、ニワトリ（Gallus gallus var. domesticus）に含まれる様々な品種の中から選択することができ、特に限定されるものではない。ニワトリは一般的に、用途によって肉用種、卵用種および卵肉兼用種に分類することができるが、本発明は鶏肉のおいしさに影響する胸肉の剪断力価のＱＴＬに関係するものであることから、被験ニワトリおよび／または基準ニワトリとして、肉用種または卵肉兼用種を用いることが好ましい。肉用種の例には、軍鶏、白色コーニッシュ、ブラマ、コーチンなどが挙げられる。卵肉兼用種の例には、横斑プリマスロック、白色プリマスロック、ロードアイランドレッド、ニューハンプシャーレッド、名古屋などが挙げられる。

【0024】

基準ニワトリとしては、例えば、日本で作出され、日本を原産とする品種で、通常は昭和初期くらいまでに作出されたものを指す「日本鶏」（日本在来鶏）を用いることができる。日本鶏は、「観賞用品種」（肉質に優れる品種も含まれている）と「実用品種」に大別でき、観賞用品種は「天然記念物」（１５品種＋２グループ）および「天然記念物以外」に分類できる。観賞用品種のうち天然記念物としては、例えば、次の１５品種と、「地鶏グループ」（４品種）および「軍鶏グループ」（７品種）の２グループ、合計２６品種が挙げられる：１５品種＝声良鶏、比内鶏、蜀鶏、蓑曳鶏、河内奴鶏、小国鶏、矮鶏、烏骨鶏、黒柏鶏、土佐のオナガドリ、東天紅鶏、蓑曳矮鶏、鶉矮鶏、地頭鶏、薩摩鶏；地鶏グループ＝土佐地鶏、三重地鶏、岐阜地鶏、岩手地鶏；軍鶏グループ＝大軍鶏（大シャモ）、小軍鶏、八木戸鶏、大和軍鶏、金八鶏、南京軍鶏、越後南京軍鶏。観賞用品種のうち天然記念物以外としては、例えば次の品種が挙げられる：会津地鶏、愛媛地鶏、雁鶏、久連子鶏、佐渡髭地鶏、芝鶏、徳地地鶏、チャーン。実用品種としては、例えば次の品種が挙げられる：土佐九斤、宮地鶏、名古屋、三河、出雲、熊本。

【0025】

被験ニワトリとしては、基準ニワトリと同様のニワトリ、または基準ニワトリと「その他のニワトリ」との交配種、あるいはその後代を用いることができる。

【0026】

「その他のニワトリ」は、胸肉の剪断力価以外の形質に優れた品種、例えば成長スピードと産肉量に優れている白色プリマスロックなどであり、育種の目的に応じて選択することができる。

【0027】

基準ニワトリまたは被験ニワトリとしては、日本在来鶏由来の血液百分率が５０％以上の国産銘柄鶏（地鶏、特殊肉用鶏）を用いることもできる。そのような国産銘柄鶏としては、例えば次のものが挙げられる〔https://ja.wikipedia.org/wiki/地鶏〕（国産銘柄鶏ガイドブック2007:2012）：北海地鶏（北海道）、中札内地鶏（北海道）、桜姫鶏（北海道）、青森シャモロック（青森県）、南部かしわ（岩手県）、やまがた地鶏（山形県）、川俣シャモ（福島県）、にいがた地鶏（新潟県）、奥久慈しゃも（茨城県）、やさとしゃも（茨城県）、筑波地鶏（茨城県）、栃木しゃも（栃木県）、上州地鶏（群馬県）、タマシャモ（埼玉県）、房総地どり（千葉県）、甲州地どり（山梨県）、信州黄金シャモ（長野県）、美濃地鶏（岐阜県）、奥美濃古地鶏（郡上地鶏）（岐阜県）、一黒シャモ（静岡県）、駿河シャモ（静岡県）、純系名古屋コーチン（愛知県）、熊野地どり（三重県）、松阪地どり（三重県）、伊勢二見ヶ浦夫婦地鶏（三重県）、近江しゃも（滋賀県）、京地どり（京都府）、地鶏 丹波黒どり（京都府）、京赤地どり（京都府）、葵之地鶏（大阪府）、丹波地どり（兵庫県）、松風地どり（兵庫県）、播州地どり（兵庫県）、但馬地どり（兵庫県）、大和肉鶏（奈良県）、紀州地鶏（和歌山県）、鳥取産大山地どり（大山シャモ）（鳥取県）、鳥取地どり ピヨ（鳥取県）、おかやま地どり（岡山県）、岡山桃太郎地どり（岡山県）、長州黒かしわ（山口県）、阿波尾鶏（徳島県）、讃岐コーチン（香川県）、地鶏 瀬戸赤どり（香川県）、伊予赤どり（愛媛県）、伊予路しゃも（愛媛県）、媛っこ地鶏（愛媛県）、奥伊予地鶏（愛媛県）、道後地鶏（愛媛県）、土佐はちきん地鶏（高知県）、土佐ジロー（高知県）、はかた地どり（福岡県）、つしま地どり（長崎県）、天草大王（熊本県）、熊本コーチン（熊本県）、豊のしゃも（大分県）、おおいた冠地どり（大分県）、みやざき地頭鶏（宮崎県）、さつま地鶏（鹿児島県）、さつま若しゃも（鹿児島県）。

【0028】

例えば、大シャモと白色プリマスロックとの間では、本発明の２つのＳＮＰ塩基が相違している。上記２品種を交配させて生まれた個体（Ｆ₁）、またはその後代（Ｆ₂以降）のＳＮＰ塩基が、大シャモと白色プリマスロックのどちらのＳＮＰ塩基と同じであるかを調べることによって、どちらの品種に由来する遺伝的因子を保有しているかを判定することができる。言い換えれば、上記Ｆ₁等を被験ニワトリ、大シャモを基準ニワトリとし、それらの間で本発明の２つのＳＮＰ塩基が一致するか否か、つまりは被験ニワトリにおける第１ＳＮＰマーカーの塩基がＧであるか否か、および／または被験ニワトリにおける第２ＳＮＰマーカーの塩基がＣであるか否かを判定し、少なくとも一方のＳＮＰ塩基、好ましくは両方のＳＮＰ塩基が一致する被験ニワトリを、大シャモに由来する遺伝的因子を保有している個体として選抜することができる。そのような判定により選抜された個体を交配に用いることにより、大シャモに由来する、胸肉の剪断力価を高めるのに適した遺伝的因子を保有するニワトリを産生し、さらにはそのような優れた遺伝的因子を備えた新たな品種を育成することができる。

【0029】

具体的には、例えば第１ＳＮＰマーカーを利用する実施形態において、遺伝子型Ｇ／Ｇの大シャモの雄（基準ニワトリ）と、遺伝子型Ａ／−の白色プリマスロックの雌を交配すると、生まれてくるＦ₁には、遺伝子型Ｇ／Ａの雄と、遺伝子型Ｇ／−の雌が生まれる。この具体例の場合、全てのＦ₁が少なくとも１つのＧをゲノム中に必ず有する。このＦ₁の雄（Ｇ／Ａ）と、白色プリマスロックの雌（Ａ／−）を交配（戻し交配）した場合、生まれてくるＢ₁には、遺伝子型Ｇ／Ａの雄、遺伝子型Ａ／Ａの雄、遺伝子型Ｇ／−の雌および遺伝子型Ａ／−の雌が含まれる。Ｂ₁を被験ニワトリとし、その第１ＳＮＰマーカーの塩基の遺伝子型を調べ、遺伝子型がＧ／Ａである、つまり基準ニワトリと同じ塩基（Ｇ）を有していると判定された被験ニワトリを選抜する。その選抜されたＢ₁（Ｇ／Ａ）と、白色プリマスロックの雌（Ａ／−）を用いて、再び戻し交配をし、遺伝子型Ｇ／Ａの雄のＢ₂を選抜する。このように、Ｚ染色体として第１ＳＮＰマーカーの塩基が基準ニワトリと同じＧであるものを保有しているかどうかに基づいて、個体の選抜と、それを用いた戻し交配とを複数回繰り返す。最終的に、Ｂ_n-1同士で、遺伝子型Ｇ／Ａの雄と、遺伝子型Ｇ／−の雌を交配し、生まれたＢ_nの中から、遺伝子型Ｇ／Ｇの雄と遺伝子型Ｇ／−の雌を選抜すると、これらから生まれるＢ_n+1は雄も雌も必ず、少なくとも１つの、基準ニワトリ（大シャモ）に由来するＳＮＰ塩基（Ｇ）を有する。このような育種方法により、胸肉の剪断力価を高める大シャモに由来する遺伝的因子を保有しつつ、それ以外の形質、例えば成長スピードや産肉量に関する遺伝的背景についてはほぼ白色プリマスロックと同じものを保有する、新たなニワトリの系統を作出することができる。もう一方の第２ＳＮＰマーカーを用いた場合も、または両方のＳＮＰマーカーを用いた場合も、上記と同様にして、本発明の育種方法を実施することができる。

【0030】

本発明の２つのＳＮＰ塩基の情報は、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの指標として利用することができるが、将来的にニワトリの胸肉の剪断力価に関与するＱＴＬの他の指標（例えば本発明の所定の２つ以外のＳＮＰマーカー、マイクロサテライトマーカーまたはその他のＤＮＡマーカー）が発見されれば、そのような新たな指標と本発明による指標とを組み合わせることで、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するより精度の高いＱＴＬを提供できる。

【0031】

本発明によるニワトリの胸肉の剪断力価に関与する遺伝子の推定方法（本発明のＳＮＰ塩基の情報の第２の応用）は、次の２つの工程を含む方法である。本発明の推定方法の第１工程は、基準ニワトリにおける本発明の２つのＳＮＰマーカー、第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの間の領域に存在する遺伝子に関連する塩基配列を、基準ニワトリとは異なる（統計学的に有意差のある）胸肉の剪断力価を有するニワトリ（本明細書において「参照ニワトリ」と呼ぶ。）における、対応する部位の塩基配列と比較する工程（本明細書において「比較工程」と呼ぶ。）である。なお、第１ＳＮＰマーカーおよび第２ＳＮＰマーカーの間の領域には複数の遺伝子が存在するが、比較する塩基配列の範囲は任意であり、特定の遺伝子に関する範囲に区切って塩基配列を比較してもよいし、複数の遺伝子に関する範囲をまとめて塩基配列を比較してもよい。

【0032】

本発明の特定方法の第２工程は、その比較の結果、基準ニワトリの塩基配列と参照ニワトリの塩基配列との間に、統計学的な有意差を持って相違している塩基が存在する（つまりその遺伝子が１つまたは複数の変異を含む）場合に、その遺伝子は胸肉の剪断力価に関与する遺伝子であると推定する工程（本明細書において「推定工程」と呼ぶ。）である。推定工程で見付けられた変異については、その遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列（すなわちタンパク質の作用の強さや機能）、発現量、その他の特性によって、胸肉の剪断力価に影響を及ぼしているかどうかを、さらに詳細に検証することが望ましい。上記のような影響が確認されれば、その遺伝子を、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与するものと特定することができる。このような方法により特定される遺伝子を用いることにより、２つのＳＮＰマーカーを用いるよりも直接的に、胸肉の剪断力価に関連する遺伝的因子を保有しているかどうかを判定できる。

【0033】

変異の有無を検出する対象となる「遺伝子に関連する塩基配列」は、遺伝子の転写領域、特にタンパク質を構成するエキソンの部分であってもよいし、非転写領域、特にタンパク質の発現量に大きく関係するプロモーターの部分であってもよい。「変異」は、塩基の置換、挿入、欠失などのいずれであってもよい。

【0034】

「参照ニワトリ」としては、例えば、前述した被験ニワトリの説明において基準ニワトリと交配させる「その他のニワトリ」として挙げた白色プリマスロックなどが挙げられる。

【0035】

本発明の２つのＳＮＰマーカーの間の領域には、４１個の遺伝子が存在しており（図３参照）、本発明の２つのＳＮＰマーカーはそれらの遺伝子と連鎖しているとみなすことができる。上記４１個の遺伝子の中には、例えば、キネシン−１３ファミリーに属するＫＩＦ２４遺伝子が含まれている。上記４１個の遺伝子の情報も公開されており、例えば米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供する情報にアクセスすることができる。上記４１個の遺伝子のうちの１つまたは複数は、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与している遺伝子の候補である。例えば、ＫＩＦ２４遺伝子は、キネシン−１３ファミリーに属し、微小管の解重合に関与しているＫＩＦ２４タンパク質の発現を支配しており（Ems-McClung and Walczak 2010; Kobayashi et al. 2010）、ニワトリの胸肉の剪断力価に関与している遺伝子の有力な候補である。本明細書において、上記４１個の遺伝子、好ましくはＫＩＦ２４遺伝子を「本発明の候補遺伝子」と呼ぶことがある。

【0036】

本発明の２つのＳＮＰマーカーおよびその間の候補遺伝子を含む領域の塩基（配列）は、ニワトリ（被験ニワトリ、基準ニワトリ、参照ニワトリ）から採取された試料に由来するＤＮＡから、公知の方法に従って決定することができる。試料は、ニワトリのＤＮＡの塩基配列を決定するための一般的なものであればよいが、例えば、ニワトリの体細胞を含む臓器、組織、血液等の体液、鶏卵などが挙げられ、好ましくは血液である。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡでも、ｃＤＮＡでもよい。ｃＤＮＡは、常法に従って、試料からｍＲＮＡを抽出、精製後、逆転写酵素によって合成することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当業者に公知の方法、例えばフェノール・クロロホルム法、市販のゲノムＤＮＡ抽出キット、ＲＮＡ抽出キット等を用いて抽出することができる。

【0037】

ＳＮＰマーカーおよび候補遺伝子の塩基（配列）を決定するための方法は特に限定されたものではなく、公知の方法を適用できるが、例えば、ＭＡＭＡ法（アレル特異的増幅法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型法）法、ＰＣＲＤＧＧＥ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＣＲ−ＲＤ法、ＰＣＲ−ＭＰＨ法、シークエンス法、ミニシークエンシング法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、一塩基伸長法、ＳＮａＰ ｓｈｏｔＴＭ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ法等が挙げられる。

【0038】

ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、検出したい変異部位を含む遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅し、変異部位を認識する制限酵素でそのＰＣＲ産物を消化し、電気泳動にかけ、制限酵素による切断の有無から変異の有無を検出する方法である。まず、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型にしてＳＮＰを含むＤＮＡ領域の増幅を行う。例えば、上記ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片にハイブリダイズするプライマーを用いて、ＤＮＡ試料を鋳型としたＰＣＲを実施する。ＰＣＲ法は、鋳型となるＤＮＡとその両端において相補的であり優先的にハイブリダイズする２個のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＤＮＡ鎖の熱変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなるプライマー伸長合成を行うサイクルを１０〜８０回繰り返す工程を含む。これらの操作は、通常、反応液及び耐熱性ポリメラーゼを含む市販の試薬キット、及び市販のＰＣＲ装置等を利用して簡便に実施できる。ＰＣＲ反応条件、試薬、プライマー、制限酵素等の条件についても、装置のマニュアル、実験又は経験によって、最適なものを容易に選定することができる。

【0039】

ＭＡＭＡ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）法では、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを、多型部位を含まない領域に対合できるように設計し、設計されたプライマーペアを用いてＤＮＡ増幅法を実施する。ＤＮＡ試料中に多型に該当するいずれかのアレルが存在すると増幅産物が得られ、これが存在しないと増幅産物が得られない。従って、増幅産物の有無を検出することによって、特定のアレルの有無を判定できる。

【0040】

本発明の２つのＳＮＰマーカーまたはその間の候補遺伝子を含む領域の塩基（配列）を決定するため、あるいはそれらの塩基（配列）の相違を検出するために用いられる、所定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）や、所定の塩基配列を有するゲノムまたは増幅産物を標識するためのプローブは、当業者であれば適切に作製し、適切な反応条件下で用いることができる。本発明の２つのＳＮＰマーカーおよびその近傍（上流側および下流側）の塩基配列やそれらに挟まれた領域の塩基配列、候補遺伝子およびその近傍の塩基配列に関する情報は前述のように公開されており、当業者であればそのような情報に基づいて、公知の設計手法や、必要に応じて市販のソフトウェア等を利用して、適切な塩基長および塩基配列を有するプライマーまたはプローブ設計することができる。商業的なサービスを利用してプライマーまたはプローブの設計および作製を行うことも可能である。プライマーまたはプローブとして用いるポリヌクレオチドは、例えば市販のポリヌクレオチド合成機により作製することができ、プローブであれば、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。

【0041】

本発明の２つのＳＮＰマーカーを含む塩基配列、または候補遺伝子に関連する領域を含む塩基配列を増幅するためのＰＣＲ用プライマーとしては、そのような標的とする塩基配列（本明細書において「標的配列」と呼ぶ。）またはそれと相補的な塩基配列と、好ましくはストリンジェント条件下で、ハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。ＰＣＲ用プライマーの塩基配列は、塩基配列が目的とするＳＮＰマーカー、候補遺伝子等の標的配列を含む場合に適切に増幅産物が生成されるものであれば特に限定されるものではなく、標的配列に対して完全に相補的である必要はない。ＰＣＲ用プライマーの塩基長は、通常１５〜１００であり、好ましくは１７〜３０である。

【0042】

ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件としては、例えば６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いる条件が挙げられる（例えば、サムブルックら， Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第2版, 1989参照）。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで所望のストリンジェンシーを実現することが可能である。

【0043】

本発明の２つのＳＮＰマーカーの塩基の相違、または候補遺伝子に関連する領域を含む塩基配列の相違を検出するためのプローブとしては、そのような標的配列と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。プローブの塩基配列は、目的とする相違（ＳＮＰ等）を含む標的配列が存在する場合に適切にシグナルを検出できるものであれば特に限定されるものではなく、標的配列に対して完全に相補的である必要はない。プローブの塩基長は、通常１５以上である。本発明の２つのＳＮＰマーカーの塩基の相違、または候補遺伝子に関連する領域を含む塩基配列の相違を直接的に検出の対象とするのではなく、それらの塩基または塩基配列と相補的なものにおける相違を検出の対象とする場合も同様である。

【0044】

プライマーおよびプローブは、用いる方法に応じて様々な形態のものとすることができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ法（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法など）によって標的配列の増幅産物を検出できるよう、プライマーの両末端をそれぞれ蛍光物質およびクエンチャーで修飾することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法と組み合わせてＳＮＰ等の所定の相違を検出する方法（例えばサイクリングプローブ法）に用いるために、プローブの両末端をそれぞれ蛍光物質およびクエンチャーで修飾することもできる。その他にも、プライマーおよびプローブは、³²Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、ビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませるなど、公知の手法に従って修飾等することができる。

【実施例】

【0045】

ＱＴＬ解析を行うためには、解析用の資源家系を造成し、資源家系の各個体より表現型値および遺伝子型情報を収集する必要がある。資源家系とは、親世代、Ｆ₁世代およびＦ₂（もしくは戻し交配）世代から構成される１セットのことである。本実施例では、両親品種（親世代）に大シャモおよび白色プリマスロックを選定した。大シャモは代表的な日本鶏の１つであり、古くから闘鶏用に改良された品種である。闘鶏用品種のため筋肉質であり、その肉も極めて美味であるとの定評がある。そのため、特殊肉用鶏作出の際に雄系種鶏として頻用されている。一方、白色プリマスロックはアメリカ合衆国原産の本来卵肉兼用種であるが、肉用に特化した系統が作出され、一般ブロイラー生産やわが国での特殊肉養鶏の作出のための雌系種鶏として頻用されている。両品種は、外貌および性質が大きく異なっている（すなわち、両者の遺伝的背景は大きく異なっている）ため、この２品種を用いることにより、ＱＴＬ解析に用いるＤＮＡマーカーがより多く得られることが期待される。

【0046】

［方法］
Ｆ₂資源家系
資源家系は、大シャモ（ＯＳ）雄１個体、白色プリマスロック（ＷＰＲ）雌４個体に基づき造成された。親世代の雄１個体に対して雌４個体をそれぞれ交配させることによりＦ₁世代個体を得た。その後、Ｆ₁世代個体（雄４個体、雌１６個体）を全きょうだい交配することによりＦ₂世代２１５個体を作出した。本実施例で造成したＦ₂資源家系の家系図を図４に示す。

【0047】

動物飼育条件
孵化させた雛を常時点灯、不断給餌、自由給水の条件のもと、育雛機内で育成した。育雛機は温源部と非温源部で構成されており、温源部を３０℃に設定し、雛が自由に移動できる環境下で飼育した。孵化時から７週齢まで市販の初生雛用飼料（ＣＰ：２２％，ＭＥ：２９００Ｋｃａｌ／ｋｇ）を与えた。

【0048】

剪断力価測定
７週齢個体をＣＯ₂ガスで深麻酔した後、片側の頸動脈を切断し、放血屠殺を行った（１０分間）。放血後の個体を７５℃で３０秒間湯浸し、脱毛器（ＮＳ−１，南部工業株式会社）を用いて脱毛した。右側の胸肉を４℃の条件下で４８時間保存し、皮を剥ぎ取った後に、繊維方向と平行に６．０ｍｍコルクボウラーを用いて試料を採取した。この試料に対し、インストロン（５９４２型試験機，インストロン社）を用いて剪断力価を測定した。

【0049】

統計処理
ＪＭＰ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．２．０を用い、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ検定によって、大シャモ、白色プリマスロック、Ｆ₁世代ならびにＦ₂世代の４群における剪断力価を比較した。また、ＱＴＬ解析に先立ち、環境要因を排除するために、孵化日、性およびＦ₁雌親に関し、Ｆ₂世代が示した表現型値（剪断力価）の補正を行った。

【0050】

ＤＮＡマーカータイピング（遺伝子型情報の収集）
本研究では、全Ｆ₂世代個体２１５個体についてマーカータイピングを行った。ＤＮＡマーカーには、Restriction-site associated DNA sequence（ＲＡＤ−ｓｅｑ）法（Miller et al., 2007）により得られた、一塩基多型（Single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）マーカーを用いた。ＲＡＤ−ｓｅｑ法の手順はSakaguchi et al., 2015: Tree Genet. Genomes. 11:121の記載に従った。Ｆ₂個体の遺伝子型（ＳＮＰ）の判定は、資源家系の親個体である大シャモ雄１個体および白色プリマスロック雌４個体の遺伝子型（ＳＮＰ）が完全に異なるものについて行った。また、カイ二乗検定による適合度検定においてＰ＜０．０５の水準を満たさないマーカーや、遺伝子型（ＳＮＰ）が判定できなかった個体の割合が１マーカー当たり２０％を上回ったマーカーは、解析には用いなかった。最終的に、ＱＴＬ解析には５４５個のＳＮＰマーカーを用いた。

【0051】

連鎖地図の作製およびＱＴＬ解析
Ｍａｐ Ｍａｎａｇｅｒ ＱＴＸ２０ｂ ソフトウェア（Manly et al., 2001）を用いて、コサンビの地図関数（Kosambi, 1943）に基づき、５４５個のＳＮＰマーカーからなる遺伝連鎖地図を作製した（連鎖。次いで、Ｒ／ｑｔｌソフトウェア（Broman et al., 2003）を用いてsimple interval mapping法によりＱＴＬ解析を行った。有意差の閾値はpermutation testを２，０００回行うことにより求めた（Broman and Sen, 2009）。

【0052】

［結果］
表現型値の比較
大シャモ、白色プリマスロック、Ｆ₁およびＦ₂世代における胸肉の剪断力価を表１に示した。両親品種および各世代間で比較した場合、白色プリマスロックおよびＦ₂世代が同等の値を示し、その値は大シャモに対して有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）。また、Ｆ₁世代の値は両親品種の中間の値を示した。

【0053】

【表1】

【0054】

ＱＴＬ解析
ＱＴＬ解析の結果を表２に示す。Ｚ染色体上の１１ｃＭの位置にｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ＱＴＬが検出された（ＬＯＤスコア５．５３）。このＱＴＬの寄与率は１２．２４％であり、相加効果は雄で−０．３１、雌で−０．３４であった。本ＱＴＬが検出された領域は、それぞれ６．２８Ｍｂおよび８．１０Ｍｂの位置にある２つのＳＮＰに挟まれており、４１個の遺伝子が存在している。このような結果から、上記ＱＴＬが検出された領域に最も近い上記２つのＳＮＰを、胸肉の剪断力価に関与すると推定されるＱＴＬの指標となる、本発明の２つのＳＮＰとした。

【0055】

【表2】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]