特開 2020-162487 セレン還元菌を含むセレン汚染試料を用いたセレンの還元処理方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2020-162487(P2020-162487A)

(43)【公開日】2020年10月8日

(54)【発明の名称】セレン還元菌を含むセレン汚染試料を用いたセレンの還元処理方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20200911BHJP

   C02F 3/34 20060101ALI20200911BHJP

   C02F 11/04 20060101ALI20200911BHJP

   C02F 11/00 20060101ALI20200911BHJP

   A62D 3/02 20070101ALI20200911BHJP

   B09B 3/00 20060101ALI20200911BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20200911BHJP

   A62D 101/47 20070101ALN20200911BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/00 RZNA

   C02F3/34 ZZAB

   C02F11/04 Z

   C02F11/00 J

   A62D3/02

   B09B3/00 C

   C12N15/11 Z

   A62D101:47

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2019-66412(P2019-66412)

(22)【出願日】2019年3月29日

(71)【出願人】

【識別番号】000000240

【氏名又は名称】太平洋セメント株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】岸森 智佳

(72)【発明者】

【氏名】森 喜彦

(72)【発明者】

【氏名】早川 隆之

(72)【発明者】

【氏名】肥後 康秀

(72)【発明者】

【氏名】松山 祐介

(72)【発明者】

【氏名】守屋 政彦

(72)【発明者】

【氏名】羽部 浩

(72)【発明者】

【氏名】堀 知行

(72)【発明者】

【氏名】青柳 智

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 由也

(72)【発明者】

【氏名】稲葉 知大

【テーマコード（参考）】

4B065

4D004

4D040

4D059

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065BA23

4B065BB02

4B065CA56

4D004AA02

4D004AA32

4D004AA36

4D004AA41

4D004CA18

4D004CC07

4D004CC12

4D004CC15

4D004DA03

4D004DA06

4D004DA20

4D040DD03

4D040DD20

4D059AA11

4D059BA11

4D059BA22

4D059BA48

4D059BJ00

4D059DA39

4D059DB02

4D059DB08

4D059DB31

4D059EB06

4D059EB16

(57)【要約】      （修正有）

【課題】新規なセレン還元菌を含むセレン汚染試料を利用したセレンの還元処理方法の提供。
【解決手段】セレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌する、セレン汚染試料のセレンの還元処理方法であって、セレン還元菌が、特定の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、別の特定の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ、さらに別の特定の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、及びさらに別の特定の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄからなる群から選択される少なくとも１種である、方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

セレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌する、セレン汚染試料のセレンの還元処理方法であって、セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ、配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、及び配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄからなる群から選択される少なくとも１種である、方法。

【請求項2】

嫌気的条件の下で１０〜４０℃で、１２時間以上静置又は撹拌する工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ及び配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂの少なくとも一方を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ及び配列番号：３との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

セレン還元菌が、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される１種以上をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

処理されるセレン汚染試料が、セレンを含む掘削ずり、土砂、汚泥、水、焼却灰及び工場廃水から選ばれる１種以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

処理されるセレン汚染試料にリン酸、有機酸、アルコール類及び糖類から選ばれる１種以上を加える工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

セレン汚染試料のセレン還元化能を評価する方法であって、試料中の配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ及び配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される少なくとも１種の存在を確認する工程を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規セレン還元菌を含むセレン汚染試料を用いたセレンの還元処理方法に関する。

【背景技術】

【0002】

セレンは自然界に存在する元素であり、硫化物又は硫黄の鉱床に含有されている。当該元素は人体にとって必須元素の一つである一方、多量に摂取した場合には健康被害をもたらすことから、環境基本法の水質汚濁に係る環境基準や土壌汚染対策法の第二種特定有害物質に指定されている。そのため、基準値以上の汚染地下水やセレンが溶出する汚染土壌への対策として、原位置における汚染水の浄化処理や不溶化処理の措置が取られる場合がある。自然由来のセレンが問題となるケースの一つとして、トンネル工事において発生する掘削ずりや、涌水等により発生するトンネルの廃水処理、搬出や運搬及び保管中に掘削ずりから飛散や流出したことによる周辺土壌や地下水及び河川の汚染対策、産廃処理場や汚泥処理等のプラントで処理する際の廃水の処理が挙げられる。しかし、既存の処理材のセレンに対する効果は低く、また汚染水を浄化するためには煩雑な処理設備が必要となるため、セレン汚染試料に対する効果の高い処理技術が求められている。

【0003】

自然環境中のセレンの形態は４価の亜セレン酸（ＳｅＯ_３^２-）或いは６価のセレン酸（ＳｅＯ_４^２-）であり、自然環境下では混在しているケースが多い。このうち６価セレンの還元処理が難しいことが、セレンの処理を困難にしていると考えられている。６価セレンを処理する場合、まず４価セレンに還元してから処理する方法が一般的であるが（例えば特許文献１）、二段階の処理が必要になるため、いずれの価数にも効果的な還元処理方法が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１７−２０５６９７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、新規なセレン還元菌を含むセレン汚染試料を利用したセレンの還元処理方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、セレンの還元処理について鋭意検討を行ったところ、新規なセレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌することにより、極めて低い相対存在量（％）である当該セレン還元菌が活動することで、４及び６価のセレンを還元できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成させるに至った。

【0007】

すなわち、本発明は以下の１）〜８）に係るものである。
１）セレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌する、セレン汚染試料のセレンの還元処理方法であって、セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ、配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、及び配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄからなる群から選択される少なくとも１種である、方法。
２）嫌気的条件の下で１０〜４０℃で、１２時間以上静置又は撹拌する工程を含む、１）に記載の方法。
３）セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ及び配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂの少なくとも一方を含む、１）又は２）に記載の方法。
４）セレン還元菌が、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ及び配列番号：３との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃを含む、１）〜３）のいずれかに記載の方法。
５）セレン還元菌が、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される１種以上をさらに含む、１）〜４）のいずれかに記載の方法。
６）処理されるセレン汚染試料が、セレンを含む掘削ずり、土砂、汚泥、水、焼却灰及び工場廃水から選ばれる１種以上である、１）〜５）のいずれかに記載の方法。
７）処理されるセレン汚染試料にリン酸、有機酸、アルコール類及び糖類から選ばれる１種以上を加える工程を含む、１）〜６）のいずれかに記載の方法。
８）セレン汚染試料のセレン還元化能を評価する方法であって、試料中の配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ及び配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される少なくとも１種の存在を確認する工程を含む、方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、セレン汚染試料中のセレン還元菌に基づくセレン還元力を利用することにより、処理材を用いることなくセレンの還元処理が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】セレン汚染試料中のセレン濃度の減少を示す図。

【図2】セレン汚染試料中の微生物の相対存在量を示す図。

【図3】セレン汚染試料中のファーミキューテス（Firmicutes）門に属する微生物（７種）の相対存在量を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作及び物性等の測定は室温ｃｖ（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。

【0011】

後述する実施例に記載のとおり、異なる２箇所のトンネル建設現場から採掘された掘削ずりにおける微生物群集の状態と４及び６価セレンの還元活性との関係を検討したところ、微生物群集から、セレンの還元に関与する新規な４菌種を含む７種の微生物（セレン還元菌）が同定された。これらのセレン還元菌は、微生物群集全体に対して、極めて低い相対存在量（例えば１％以下）であったが、その相対存在量が増加することにより、当該掘削ずりのセレン還元活性が上昇することが見出された。
したがって、７種のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、セレン還元能を有していると考えられ、試料中の当該セレン還元菌のセレン還元力を利用することによりセレンの還元処理が可能となる。また、試料中のセレン還元菌の存在を指標として、当該試料のセレン還元能を評価することができる。

【0012】

［セレン還元菌］
本発明において、セレン還元菌とは、４及び６価セレンを電子受容体基質として還元できる菌を意味する。
本発明に係るセレン還元菌としては、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ａ（本明細書中、単に「セレン還元菌Ａ」とも称す）、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ｂ（本明細書中、単に「セレン還元菌Ｂ」とも称す）及び配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ｃ（本明細書中、単に「セレン還元菌Ｃ」とも称す）からなる群から選択される少なくとも１種の他、配列番号：４〜７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌Ｄ〜Ｇ（本明細書中、それぞれ「セレン還元菌Ｄ」、「セレン還元菌Ｅ」、「セレン還元菌Ｆ」、「セレン還元菌Ｇ」とも称す）から選択された菌が挙げられる。

【0013】

本発明において、塩基配列との同一性とは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。すなわち、同一性（％）＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(1990)403-410に記載されるＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム（例えばＢＬＡＳＴＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷなど）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメータは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。

【0014】

配列番号：１〜７の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌を表１に示す。これらのセレン還元菌は、後述する「セレン還元菌を同定」で示した方法により同定された菌である。下記表１において、「相同性（％）」は、配列番号：１〜７の塩基配列について、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ）の塩基配列データベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定した。

【0015】

【表1】

【0016】

配列番号：６及び配列番号：７の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌（ＯＴＵ７０９１及びＯＴＵ４６５７）は、それぞれデサルフォスポロサエナス・フラクトシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｉｖｏｒａｎｓ）及びデサルフォスポロサエナス・ブルネンシス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｂｕｒｅｎｓｉｓ）であると考えられる。デサルフォスポロサエナス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ）属の微生物は、嫌気性の硫酸還元菌である。

【0017】

配列番号：５の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌（ＯＴＵ１０７１）は、単環芳香族炭化水素の分解に伴って鉄（ＩＩＩ）を還元する嫌気性微生物として知られるデサルフィトバクテリウム・アロマティシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）に対して、配列相同性が９７．６％であり、デサルフィトバクテリウム・アロマティシボランスの近縁種であると考えられる。

【0018】

配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４の塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌（ＯＴＵ８４８９、ＯＴＵ２０５０１、ＯＴＵ１８２５０及びＯＴＵ２１９）は、データベース上で最も近縁な微生物種に対して、配列相同性がそれぞれ８７．７％、８８．６％、８９．０％及び９０．９％である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた解析では、既知種と相同性９７％以上を示す場合、同種であると定義できる。つまり、これらのセレン還元菌は、既知の微生物種とは種が異なる微生物であると考えられる。

【0019】

本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、その微生物群集中に、上記のセレン還元菌を含むものである。
本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、本発明のセレン還元菌を含む限りその由来は限定されないが、当該セレン還元菌の生育に適した環境、すなわちセレンを含有し嫌気状態が維持され得る地下水、地盤や岩盤等の土壌（具体的にはトンネル等の地中構造物を建設する際の掘削ずり）、及び地下構造物の建設工事で発生する土砂や汚泥、廃水が挙げられる。本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、上記セレン還元菌を含む微生物群集を含んでいれば、細菌に加えて糸状菌、原生動物が混在していてもよい。

【0020】

本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料は、一態様として、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｂ、配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｃ、及び配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄからなる群から選択される少なくとも１種を含む。

【0021】

また、好ましい実施形態として、セレン汚染試料は、セレン還元能の観点から、セレン還元菌Ａ及びセレン還元菌Ｂの少なくとも一方を含み、より好ましくはセレン還元菌Ａ、セレン還元菌Ｂ及びセレン還元菌Ｃをすべて含むものが挙げられる。

【0022】

また、さらに好ましい実施形態として、セレン汚染試料は、上記実施形態のセレン還元菌に加えて、セレン還元能の観点から、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｅ、及び配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｆ、及び配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するセレン還元菌Ｇからなる群から選択される１種以上をさらに含むものが挙げられる。

【0023】

本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料には、約４，０００種〜約５，０００種の微生物種が含まれ、これらの微生物種において、本発明の上記セレン還元菌の相対存在量は特に制限されず、微生物種全体に対して、極めて低くてもよい。セレン還元菌の相対存在量（％）は、微生物群集全体に対して、例えば０．００１％以下〜０．８％である。相対存在量の値は、実施例に記載の方法により求めた値である。

【0024】

なお、上記セレン還元菌は、試料中の存在量が極めて少ないため、これらを単離することは、技術的理由により困難である。そのため、寄託機関に寄託を行っていない。しかし、本出願人は、本発明に係るセレン還元菌を含むセレン汚染試料について、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の順守を条件に、第三者に分譲することを保証する。

【0025】

［セレン還元菌の同定］
複数の微生物を含む試料（例えばセレン汚染土壌）中のセレン還元菌の同定は、以下に示す工程Ａ〜Ｃによって行うことができる。
工程Ａ：セレンを含有する未培養の試料から核酸を回収すること；及び、当該核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（１）を求める工程、
工程Ｂ：４及び６価セレンの存在下で前記試料の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；及び、当該核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（２）を求める工程、
工程Ｃ：前記相対存在量（２）が前記相対存在量（１）より多い微生物をセレン還元菌であると判断する工程。

【0026】

４及び６価セレンを還元したセレン還元菌は、還元が起こる前に比べて相対存在量が大きくなる。すなわち、未培養時点の試料と４及び６価セレンによる培養した試料とを用意し、それぞれの試料から得られたＤＮＡの解析・比較を行う。未培養時点の試料のＤＮＡにおける相対存在量よりも、４及び６価セレンによる培養後の試料における相対存在量が大きい微生物は、４及び６価セレンを還元して生育した微生物であると解される。これにより、４及び６価セレンを還元する微生物（セレン還元菌）を同定することができる。

【0027】

工程Ａ及び工程Ｂにおいて、セレン含有試料中の微生物の相対存在量を求めるには、以下の３つの工程が行われる。
（ｉ）４及び６価セレンをセレン含有試料に追添加して、試料に含まれる微生物を培養すること；
（ｉｉ）未培養時点と４及び６価セレンによる培養後のそれぞれの試料から核酸（例えばＤＮＡ）を回収すること；
（ｉｉｉ）回収した核酸に存在する標的遺伝子（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析すること。

【0028】

以下、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）について具体的に説明する。
（ｉ）４及び６価セレンをセレン含有試料に添加して、試料に含まれる微生物を培養すること
培養に用いるセレン含有試料は、微生物と４及び６価セレンとの反応性を良くするとの観点から、水分を添加するのが好ましい。
微生物の培養は、還元的な雰囲気、すなわち嫌気的条件を形成するとの観点から、ＣＯ_２／Ｎ_２、又はＮ_２で曝気をした後に、気密容器内で行われる。これにより生物学的なセレン還元が誘導される。

【0029】

微生物の培養は、セレン含有試料と４及び６価セレンとを混合して、４及び６価セレンの存在下で行う。
微生物の培養は、微生物群集の状態を維持できるとの観点から、セレン含有試料に対して、４及び６価セレンを添加して培養することが挙げられるが、必要に応じて、リン酸等その他の成分を適宜添加してもよい。特に、リン酸（リン酸水素カリウム等）、有機酸（乳酸等）、アルコール類（エタノール等）、糖類（グルコース等）を添加することがセレン還元菌の増殖に好ましい。

【0030】

４及び６価セレンは、実環境での濃度変動（０．００００１５〜０．０４ｍＭ）を踏まえて、適宜調整することができる。本発明の一実施形態では、０．０００１２７〜０．０２ｍＭの４及び６価セレンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始することが挙げられる。未培養の時点において、前記４及び６価セレンの濃度が０．０００１２７ｍＭ以上であることにより、セレン還元菌が下記の好ましい培養時間においても、４及び６価セレンを還元できる。前記４及び６価セレンの濃度が０．０２ｍＭ以下であることにより、微生物群集の状態変化を抑制できる。よって、本発明のセレン還元菌を同定する方法において、０．０００１２７〜０．０２ｍＭの前記４及び６価セレンの存在下で前記の微生物の培養を開始することが好ましい。

【0031】

微生物の培養温度は、実環境での年間温度変化を踏まえて、設定すればよい。微生物の培養温度は、実環境で活動するセレン還元菌を検出できるとの観点から、好ましくは１０〜４０℃の範囲、より好ましくは２０〜３０℃である。培養温度が１０℃以上であることにより、４及び６価セレンの還元を確認できる。培養温度が４０℃以下であることにより、微生物群集の変化を抑制できる。

【0032】

微生物を培養する間、培養液を静置又は撹拌してもよい。微生物の培養には、従来公知の培養器具を用いることができる。
微生物の培養時間は、例えば１２時間以上であり、好ましくは２４時間以上である。

【0033】

（ｉｉ）培養物から核酸を回収すること
（ｉ）で得られた培養物から核酸を回収する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。回収する核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよい。
ＤＮＡを回収する方法としては、例えば、ビーズ（ガラスビーズ、ジルコニアとシリカの混合ビーズなど）による物理的破砕方法、超音波処理による破砕方法、フレンチプレスによる破砕方法、液体窒素で凍結した試料を乳鉢と乳棒とで破砕する方法などを用いて、微生物細胞を破壊し、その後、従来公知の方法（フェノール・クロロホルム抽出など）を用いて、タンパク質を除去し、ＲＮａｓｅを用いてＲＮＡを消化し、ＤＮＡを回収することが挙げられる。

【0034】

（ｉｉｉ）回収した核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析すること
セレン還元菌を同定するために用いる標的遺伝子としては、大規模な系統解析に適するとの観点から、好ましくは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域である。
次世代シークエンサーとは、サンガー法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーである「第１世代シークエンサー」と対比させて用いられている用語であり、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼによる逐次的ＤＮＡ合成法を用いて、数千万から数億のＤＮＡ断片に対して数十〜数千ｂｐのリード長の断片を網羅的に解析することによって超並列的に塩基配列を決定するための装置を意味する。次世代シークエンサーでは、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの伸長を止めるサンガー法を用いた第１世代シークエンサーと異なるシーケンシング原理が用いられている。このような原理として、合成シーケンシング法、パイロシーケンシング法、リガーゼ反応シーケンシング法などが挙げられる。これまでに、多くの企業や研究機関などから、多様な次世代シークエンサーが提供されており、例えば、ＨｉＳｅｑ２５００（イルミナ株式会社）、ＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）、５５００ｘｌ ＳＯＬｉＤ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、Ｉｏｎ ＰＧＭ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＧＳ ＦＬＸ＋（ロシュ・ダイアグノスティックス社）などが挙げられる。
次世代シークエンサーによる解析方法としては、付属説明書に従って実施することができる。これにより、数万から数十万の微生物種（ＯＴＵ）を同定、及び各微生物種の相対存在量（％）を解析できる。

【0035】

工程Ｃのセレン還元菌であるとの判断は、未培養の時点における微生物の相対存在量（１）と４及び６価セレンによる培養後における微生物の相対存在量（２）とを対比することで行うことができる。
例えば、ＯＴＵのうち、セレン還元が観察された培養物において、培養後で培養開始時点よりも３００倍以上に上昇している微生物を特定する。
４及び６価セレン還元が観察された培養物において、未培養の時点よりも３００倍以上に上昇している微生物は、４及び６価セレンを還元して生育したため、そのような微生物をセレン還元菌であると判断できる。

【0036】

［セレン汚染試料のセレンの還元処理]
本発明によれば、上記本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料を、嫌気的条件下で静置又は撹拌する工程を含む、セレン汚染試料のセレンの還元処理方法が提供される。
ここで、処理されるセレン汚染試料としては、前述したセレン還元菌を含むセレン汚染試料自体であってもよく、それとは別のセレン汚染試料（例えば、セレン還元菌を含まない別のセレン汚染試料、本発明のセレン還元菌とは異なるセレン還元菌を含む別のセレン汚染試料）が含まれていてもよい。また、単離・抽出し培養した上記セレン還元菌を、セレン汚染試料（例えば、セレン還元菌を含まない別のセレン汚染試料、本発明のセレン還元菌とは異なるセレン還元菌を含む別のセレン汚染試料）に添加したものでもよい。
ここで、セレン汚染試料としては、セレンが含まれるものであれば特に限定されず、掘削ずり、土砂、汚泥、水、焼却灰等の廃棄物、工場廃水等いずれでもよい。

【0037】

処理条件は、本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料中のセレン還元菌が増殖し還元力を発揮できる条件であればよく、嫌気的条件下で静置又は撹拌すればよいが、好ましくは、嫌気槽中、１０〜４０℃で、１２時間以上、好ましくは２４時間以上静置又は撹拌することが挙げられ、また、好ましくは、４５００時間以下、より好ましくは１５００時間以下である。
また、上記セレン汚染試料には、セレン還元菌の還元力が発揮されやすいように、鉄塩や亜硫酸塩、シュウ酸、その他の還元剤を添加して、還元状態に変化させてもよい。

【0038】

例えば、本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料を嫌気槽中に収容し、１０〜４０℃で、１２時間以上静置又は撹拌することにより、当該試料中のセレンを還元処理できる。また、本発明のセレン還元菌を含むセレン汚染試料を収容した嫌気槽に、それとは別のセレン汚染試料を加えることで、当該別のセレン汚染試料についてもセレンの還元処理が可能である。

【0039】

また、当該還元処理には、必要に応じて、リン酸等その他の成分を適宜添加してもよい。特に、リン酸（リン酸水素カリウム等）、有機酸（乳酸等）、アルコール類（エタノール等）、糖類（グルコース等）の１種以上を添加する工程を含むのがセレン還元菌の増殖を促進する点から好ましい。

【0040】

[セレン汚染試料のセレン還元化能の評価]
本発明の一実施形態によれば、セレン汚染試料のセレン還元化能を評価する方法であって、試料中の、セレン還元菌Ａ、セレン還元菌Ｂ、セレン還元菌Ｃ、セレン還元菌Ｄ、セレン還元菌Ｅ、セレン還元菌Ｆ、及びセレン還元菌Ｇからなる群から選択される少なくとも１種の存在を確認する工程を含む、方法が提供される。

【0041】

当該セレン還元菌の確認手段は、特に限定されないが、好適には、前述した菌叢ゲノムＤＮＡに含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、試料中に存在する菌種を解析する方法が挙げられる。
すなわち、上述したとおり、試料から核酸を回収し、当該核酸に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析することにより、相対存在量（％）を確認することが挙げられる。

【0042】

これにより、セレン汚染試料のセレン還元化能を評価することができる。ここで、試料のセレン還元化能とは、当該試料が有するセレン還元菌に基づくセレン還元能を意味する。

【実施例】

【0043】

以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0044】

＜セレン汚染試料の評価＞
セレン汚染試料のセレン溶出量は、環境庁告示第１８号「土壌溶出量調査に係る測定方法を定める件」に記載されている方法に準拠して検液作成を行い、「ＪＩＳ Ｋ ０１０２：２０１３（工場排水試験方法）」に準拠して測定した。

【0045】

実施例１ セレン還元菌の同定
（１）６価セレンによる汚染試料微生物群の培養
サンプルとして、建設工事で発生した産地が異なるトンネル掘削ずり２種を用いた。
具体的には、汚染試料５gを滅菌水またはリン酸（１ｍＭ）を添加した滅菌水で１０ｍｌ容量にして、５０ｍｌ容ガラスバイアル瓶に収容した。気相部分は窒素とした。汚染試料に対して、６価セレン溶液（亜セレン酸ナトリウム；和光純薬工業株式会社製）を６価セレンの終濃度０．０１２７ｍＭとなるように添加した。その後、２５℃、暗所にて静置培養を行った。

【0046】

（２）化学分析
培養開始時点及び６価セレン培養物において液相を採取し、上記の方法により化学分析に供した。
汚染試料１及び汚染試料２において、液相のセレン濃度はそれぞれ約０．０１３ｍＭの減少を示した（図１）。これは、添加した６価セレンが還元されたと考えられる。

【0047】

（３）微生物学解析
未培養時点及び６価セレンによる培養後の試料について、試料を遠心分離し、遠心沈殿物を得た。前記遠心沈殿物に対して、ジルコニアとシリカの混合ビーズ（Ｚｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ Ｂｅａｄｓ；平均粒子径０．１ｍｍ）を加え、シェイクマスターオート（株式会社バイオメディカルサイエンス製）を用いて固相中の微生物細胞を破砕した後、フェノールとクロロホルムとを用いた精製ステップを経ることで共存するタンパク質を除去した。その後、ＲＮａｓｅ Ａ（ベックマン社製）の処理を行うことでＲＮＡを消化し、ＤＮＡを精製した。
この精製ＤＮＡを鋳型に用い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域（約３００塩基対）を標的として、Ｑ５ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ・Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社）による遺伝子増幅反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［ＰＣＲ］）を行った。得られたＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ キット（ベックマン・コールター社製）及びＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（プロメガ社製）を用いて精製し、その濃度をＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ 試薬・キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と蛍光定量装置Ｎａｎｏｄｒｏｐ ３３００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）とにより測定した。

【0048】

最適量の精製産物をＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ キット３００サイクルと次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社製）を用いた大規模塩基配列解析に供した。各試料から遺伝子断片を数万リード解読し、ソフトウエアｍｏｔｈuｒ（ｖｅｒ １．３１．２）を用いて、非特異的配列を除去し、ソフトウエアＱＩＩＭＥ（ｖｅｒ １．６．０）を用いて、微生物系統解析を行い、微生物種（ＯＴＵ：Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ）の同定と相対存在量（％）の解析を行った。

【0049】

得られたＯＴＵのうちセレン還元が観察された培養物において、培養後で未培養時点よりも３００倍以上に上昇している微生物を特定した。ＯＴＵの近縁種と遺伝子配列相同性をＮＣＢＩ塩基配列データベースのＢＬＡＳＴプログラムにより決定した。

【0050】

汚染試料１及び汚染試料２から６のライブラリを作成し、合計で約３３３４９７の遺伝子配列を解析した（５５３８３配列／ライブラリ）。次世代シークエンスデータを高次の微生物分類レベル（門又は綱）で系統解析した結果、セレン還元が観察された培養物では、培養開始時点に比べて微生物群集構造変化が顕著であった。特に、ファーミキューテス（Firmicutes）門に属する微生物群が汚染試料１及び汚染試料２において、培養開始時の約１６〜２３６０倍高い相対存在量を示した（図２）。

【0051】

次に、微生物種（ＯＴＵ）レベルで解析したところ、セレン還元が観察された培養物で培養開始時と比べ約２３〜３００倍に相対存在量が上昇するファーミキューテス（Firmicutes）門に属する７種の微生物を同定することができた（図３）。

【0052】

ＯＴＵ４６５７（セレン還元菌Ｆに属する）とＯＴＵ７０９１（セレン還元菌Ｇに属する）は、デサルフォスポロサエナス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ）属に属する既知の硫酸還元菌であるデサルフォスポロサエナス・ブルネンシス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｂｕｒｅｎｓｉｓ）及びデサルフォスポロサエナス・フラクトシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｉｖｏｒａｎｓ）と系統学的に同一又は近縁であった（それぞれ１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列相同性１００％と９９．２％とを示した）。

【0053】

ＯＴＵ１０７１（セレン還元菌Ｅに属する）は、単環芳香族炭化水素の分解に伴って鉄（ＩＩＩ）を還元する嫌気性微生物として知られるデサルフィトバクテリウム・アロマティシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）に近縁であった（遺伝子配列相同性：９７．６％）。

【0054】

ＯＴＵ２１９（セレン還元菌Ｄに属する）とＯＴＵ１８２５０（セレン還元菌Ｃに属する）は、データベース上で最も近縁な微生物種サーミコラ・カルボキシドフィラ（Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｐｈｉｌａ；ＮＲ０４３０１０）及びクロストリジウム・ノビィ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ；ＬＣ１９３８３４）に対して、低い配列相同性（９０．９％及び８９．０％）を示し、系統学的に新規な微生物であることが示唆された。

【0055】

ＯＴＵ２０５０１（セレン還元菌Ｂに属する）とＯＴＵ８４８９（セレン還元菌Ａに属する）は、データベース上で最も近縁な微生物種デサルフォスポロサエナス・フラクトシボランス（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｉｖｏｒａｎｓ；ＮＲ１５６９７６）及びスポロムーサ・シルバセティカ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ；ＮＲ０２６３７８）に対して、極めて低い配列相同性（８７．７％及び８８．６％）を示し、これまで報告されているいずれの微生物とも系統学的に異なり極めて新規な微生物であることが示唆された。

【0056】

汚染試料１及び汚染試料２の微生物群集において、セレン還元菌は、いずれも培養開始時点では相対存在量が１％以下（汚染試料１：０．００２％以下から０．０２％；汚染試料２：０．００２％以下から０．０８％）の稀少微生物種であることが明らかになった。

【0057】

汚染試料１では水のみのセレン添加試験区においてＯＴＵ７０９１が最大の相対存在量であった（全体に対し６３．０％）。続いてＯＴＵ１８２５０の相対存在量が大きかった（全体に対し６．９６％）。リン酸を添加した試験区ではＯＴＵ２１９が最大の相対存在量であった（全体に対し６４．７％）。続いてＯＴＵ２０５０１の相対存在量が大きかった（全体に対し１３．４％）。

【0058】

汚染試料２では水及びリン酸を添加した試験区においてＯＴＵ４６５７が最大の相対存在量であった（全体に対し４９．８％及び３５．８％）。続いて相対存在量が大きくなったのは、水ではＯＴＵ８４８９（全体に対し１１．２％）。リン酸ではＯＴＵ１０７１（全体に対し１８．１％）であった。

【0059】

以上から、嫌気的な雰囲気にした汚染試料中のセレン還元菌は、それぞれの試料及びリン酸の有無で劇的に増加し、４及び６価セレンの還元に関与していることが強く示唆される。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]