特開 2020-78250 低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2020-78250(P2020-78250A)

(43)【公開日】2020年5月28日

(54)【発明の名称】低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20200501BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20200501BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200501BHJP

   G01N 33/533 20060101ALI20200501BHJP

   C12Q 1/6841 20180101ALI20200501BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20200501BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/06ZNA

   G01N33/50 P

   G01N33/53 M

   G01N33/533

   C12Q1/6841 Z

   C12N5/078

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2018-212052(P2018-212052)

(22)【出願日】2018年11月12日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 平成３０年７月２４日にＲＡＤＩＡＴＩＯＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ 第１９０巻 第４号 第４２４〜４３２頁にて発表

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】田代 聡

(72)【発明者】

【氏名】時 林

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CB01

2G045DA13

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ60

4B063QR56

4B063QS32

4B063QS34

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA92X

4B065AC20

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】低線量の放射線被ばくを測定できる方法を開発し、その方法を用いて低線量放射線被ばくに対する個体の感受性を判定できるようにする。
【解決手段】低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法は、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて対象の個体から得られた細胞で生じた染色体異常の量を測定するステップ（ａ）と、 前記ステップ（ａ）の後に、前記個体又は前記個体から得られた細胞に対して低線量の放射線を曝露するステップ（ｂ）と、前記ステップ（ｂ）の後に、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて前記低線量の放射線が曝露された個体から得られた細胞又は前記低線量の放射線が曝露された細胞で生じた染色体異常の量を測定するステップ（ｃ）と、前記ステップ（ａ）の測定結果と前記ステップ（ｃ）の測定結果とを比較するステップ（ｄ）とを備えている。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて対象の個体から得られた細胞で生じた染色体異常の量を測定するステップ（ａ）と、
前記ステップ（ａ）の後に、前記個体又は前記個体から得られた細胞に対して低線量の放射線を曝露するステップ（ｂ）と、
前記ステップ（ｂ）の後に、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて前記低線量の放射線が曝露された個体から得られた細胞又は前記低線量の放射線が曝露された細胞で生じた染色体異常の量を測定するステップ（ｃ）と、
前記ステップ（ａ）の測定結果と前記ステップ（ｃ）の測定結果とを比較するステップ（ｄ）とを備えていることを特徴とする低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法。

【請求項2】

前記ステップ（ｂ）において、ＣＴ装置を用いて前記個体又は前記個体から得られた細胞に対して低線量の放射線を曝露することを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記低線量は、ＤＬＰで１６００ｍＧｙ・ｃｍ以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記個体から得られた細胞は、末梢血リンパ球であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法は、染色体のセントロメア及びテロメアをそれぞれ異なる色の蛍光色素で標識されたペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブで標識することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、低線量放射線被ばくに対する感受性を判定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来から放射線被ばくは、染色体やＤＮＡを損傷させてそれらの異常を誘導することが知られており、染色体やＤＮＡの異常は、白血病やがんの原因となると考えられている。特に高線量の放射線被ばくでは、多数の染色体及びＤＮＡの異常が誘導され、染色体及びＤＮＡ異常と被ばく線量とは相関が認められるため、末梢血リンパ球の染色体及びＤＮＡ解析は放射線災害での生物学的な被ばく線量の推定として最も重要な検査として確立されている。

【0003】

染色体の解析は、例えば、対象の個体から末梢血リンパ球を採取し、その細胞分裂中期のサンプルを作製し、染色体をギムザ染色することにより行われる。染色された染色体の形態を、顕微鏡を用いて観察することにより環状染色体や二動原体染色体といった染色体異常の頻度を評価することができて、これにより被ばく線量を推定できる。

【0004】

ところで、近年、ＣＴ検査は、その機器の改良によって撮影時間が短くなり、また解像度も向上しているため、種々の疾患の診断やスクリーニングのための極めて重要な診断方法となっている。ＣＴ検査による医療放射線被ばくは、１００ｍＳｖ以下であるが、小児では白血病やがんのリスクが増大する可能性が報告されており、小児や妊娠した女性では、慎重な放射線診断が行われている。小児以外でも、免疫不全症等の遺伝性疾患の一部の患者では、放射線に対する感受性が高く、染色体異常率、並びに白血病及びがんの罹患率が高いことが知られている。一方、現在のところ、一般の健常人においては、ＣＴ検査等による低線量の放射線被ばくに対する影響がどの程度であるかについては明らかではなく、低線量の放射線被ばくへの感受性を測定する方法の開発が望まれている。

【0005】

これまでは、低線量の放射線被ばくであっても、上記のような染色体異常の発生と被ばく線量とが相関するか否かについても明らかになっていないため、上記ギムザ染色を利用した方法を利用できるか否か明らかでない。仮に、低線量の放射線被ばくであっても被ばく線量と染色体異常の発生頻度とが相関し、上記ギムザ染色を利用した方法を利用できるとしても、低線量では染色体異常の発生が少ないと考えられるため、上記ギムザ染色を利用した方法では、正確なデータを得るために多くの細胞について解析を行う必要がある。しかしながら、このような染色体の解析には多大な手間と時間を要するため、被ばく線量の測定方法として効率的な方法とはいえない。

【0006】

上記ギムザ染色を利用して染色体異常を観察する方法の他に、細胞核において放射線被ばくにより損傷が生じた部分に局在するγ‐Ｈ２ＡＸを測定することによって、放射線被ばく量を測定する方法が非特許文献１に開示されている。当該方法では、γ‐Ｈ２ＡＸの発生及び局在を免疫染色法によって簡便に評価することができ、さらに、比較的低線量であっても、被ばく線量とγ‐Ｈ２ＡＸの検出量とが相関する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】PNAS, Vol.107, no.32, August 10 (2010),p14205-14210.

【非特許文献2】RADIATION RESEARCH, Vol.177, no.5,May 2012, p533-538.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、非特許文献１に開示の方法では、放射線被ばくを受けた後、ＤＮＡ損傷修復タンパク質等により染色体及びＤＮＡ異常が修復すると、γ‐Ｈ２ＡＸを検出することができなくなるため、放射線被ばくを受けた直後に測定用サンプルを作製してγ‐Ｈ２ＡＸを測定する必要がある。すなわち、測定のために時間的制限があり、被験者及び測定者にとって好ましくない。

【0009】

また、上述の通り、低線量の放射線被ばくでは、上記環状染色体や二動原体染色体といった染色体の構造異常と被ばく線量とが相関するか否かについては、現在のところ明らかとなっておらず、染色体の構造異常の頻度により被ばく線量を推定する方法を用いることができるか否か不明である。

【0010】

本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、低線量の放射線被ばくを測定できる方法を開発し、その方法を用いて低線量放射線被ばくに対する個体の感受性を判定できるようにすることにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、多数の細胞に対して簡便且つ短時間で染色体異常の検出ができる方法としてＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を見出し、さらに、これを用いることにより、健常人においても低線量の放射線被ばくが染色体に影響し、その影響の大きさには個人差があることを見出して本発明を完成した。

【0012】

具体的に、本発明に係る低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法は、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて対象の個体から得られた細胞で生じた染色体異常の量を測定するステップ（ａ）と、前記ステップ（ａ）の後に、前記個体又は前記個体から得られた細胞に対して低線量の放射線を曝露するステップ（ｂ）と、前記ステップ（ｂ）の後に、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて前記低線量の放射線が曝露された個体から得られた細胞又は前記低線量の放射線が曝露された細胞で生じた染色体異常の量を測定するステップ（ｃ）と、前記ステップ（ａ）の測定結果と前記ステップ（ｃ）の測定結果とを比較するステップ（ｄ）とを備えていることを特徴とする。

【0013】

ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法は、別々の色の蛍光色素によって標識され、それぞれ染色体の動原体（セントロメア）と染色体の末端（テロメア）とに特異的に結合する２種類のペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを用いて、二動原体染色体や環状染色体といった染色体異常を検出する方法である（非特許文献２を参照）。具体的に、上記のようなＰＮＡプローブで染色体のセントロメア及びテロメアを標識すると、異常がない染色体であれば染色体の中央付近にセントロメアを標識する蛍光が一箇所認められ、染色体の両端にテロメアを標識する蛍光が認められる。一方、二動原体染色体の場合、染色体の末端以外の２箇所にセントロメアを標識する蛍光が認められ、染色体の両端にテロメアを標識する蛍光が認められる。また、環状染色体では、セントロメアを標識する蛍光のみが認められ、テロメアを標識する蛍光が認められない。このため、認められる蛍光パターンによって、簡便且つ迅速に染色体異常を評価することができる。

【0014】

本発明に係る低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法によると、このようなＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いるため、上記のように簡便且つ迅速に染色体異常を評価することができ、その結果、低線量の放射線被ばく前後における染色体異常の量の差を容易に評価することができる。このため、低線量の放射線被ばく前後における染色体異常の量の差が大きい場合は低線量放射線被ばくに対する感受性が高く、反対にその差が小さい場合は低線量放射線被ばくに対する感受性が低いと判定することができる。

【0015】

本発明に係る方法では、ステップ（ｂ）において、ＣＴ装置を用いて前記個体又は前記個体から得られた細胞に対して低線量の放射線を曝露することが好ましい。

【0016】

例えば、患者が実際にＣＴ検査を受ける際に本発明に係る方法を行えば、患者が別途本発明に係る方法のために低線量の放射線を受ける必要がなく、患者の負担を低減できる。

【0017】

本発明に係る方法において、低線量とは、ＤＬＰ（ｄｏｓｅ ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｄｕｃｔ）で１６００ｍＧｙ・ｃｍ以下であることが好ましい。

【0018】

本発明に係る方法において、個体から得られた細胞は、末梢血リンパ球であることが好ましい。末梢血リンパ球は、一般的な採血で得ることができ、容易に採取可能であるため有用である。

【発明の効果】

【0019】

本発明に係る低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法によると、低線量の放射線被ばく前後における染色体異常の量の差を容易に評価することができるため、個々の低線量放射線被ばくに対する感受性を容易に判定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】染色体異常の形態を示すモデル図である。

【図2】染色体異常の形態を示す写真である。

【図3】実施例１の結果を示すグラフである。

【図4】実施例２の結果を示すグラフである。

【図5】実施例３の結果を示すグラフである。

【図6】実施例４の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0022】

本発明は、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて、低線量放射線被ばくの前後における対象個体の染色体異常の量の差を比較する方法であり、その結果から対象個体の低線量放射線被ばくに対する感受性を容易に判定することができる方法である。

【0023】

ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法は、上述の通り、別々の色の蛍光色素によって標識され、それぞれ染色体のセントロメアと染色体のテロメアとに特異的に結合する２種類のＰＮＡプローブを用いて、二動原体染色体や環状染色体といった染色体異常を検出する方法である。より具体的には、対象となる個体から採取された細胞の細胞分裂中期サンプルを作製し、当該サンプルにおける染色体に対して、上記２種類のＰＮＡプローブをハイブリダイズさせ、さらに染色体全体をＤＡＰＩやＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２等の核染色液により染色する。このようにすると、染色体中のセントロメア及びテロメアの位置及び数を容易に検出することが可能となる。

【0024】

異常がない染色体であれば染色体の中央付近にセントロメアを標識する蛍光が一箇所認められ、染色体の両端にテロメアを標識する蛍光が認められるが、染色体異常がある場合は、染色体中の蛍光標識の数が異なる。図１及び図２に示すように、二動原体染色体の場合、染色体の末端以外の２箇所にセントロメアを標識する蛍光（図２の細い実線矢印）が認められ、染色体の両端にテロメアを標識する蛍光（図２の細い点線矢印）が認められる。また、三動原体染色体の場合、染色体の末端以外の３箇所にセントロメアを標識する蛍光（図２の細い実線矢印）が認められ、染色体の両端にテロメアを標識する蛍光（図２の細い点線矢印）が認められる。また、環状染色体では、染色体全体の形態が円状に見られ、セントロメアを標識する１箇所の蛍光（図２の細い実線矢印）のみが認められ、テロメアを標識する蛍光が認められない。二動原体環状染色体ではセントロメアを標識する２箇所の蛍光（図２の細い実線矢印）のみが認められる。このため、認められる蛍光パターンによって、簡便且つ迅速に染色体異常を評価することができる。

【0025】

染色体異常の検出は、例えば蛍光顕微鏡を用いて目視により、正常な染色体と異常が生じている染色体との数をカウントして、染色体異常の発生比率を算出してもよい。その他に、撮像装置やイメージングソフトウェア等を利用して、自動的に二動原体染色体や環状染色体等の染色体異常を検出し、さらに、検出された正常な染色体と異常が生じている染色体との数から自動的に染色体異常の発生比率を算出してもよい。

【0026】

本発明に係る方法では、対象個体から細胞を採取して、採取された細胞に対して上記ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いて染色体異常を測定する。当該細胞は特に限定されないが、例えば末梢血リンパ球を用いることが好ましい。

【0027】

また、本発明に係る方法では、対象となる個体自身に低線量の放射線を曝露してもよいし、当該個体から得られた細胞に低線量の放射線を曝露してもよい。個体自身に低線量の放射線を曝露する場合、例えば、当該個体（患者）がＣＴ検査等の放射線検査を受ける際に、本発明に係る方法を並行して行うことができるため、別途放射線被ばくさせる必要が無いため患者の負担を低減できて好ましい。

【0028】

本発明に係る方法において、個体や細胞に低線量の放射線を曝露するのに用いられる機器は限定されないが、例えばＣＴ装置等の放射線検査機器を用いることができる。

【0029】

上記のような本発明に係る方法を用いることにより、低線量放射線被ばくの前後における対象個体の染色体異常の量を測定でき、それらの差を比較することができる。さらに、それらの差を比較した結果、それらの差が大きい場合は、対象個体は低線量放射線被ばくの感受性が高く、反対にそれらの差が小さい場合は、対象個体は低線量放射線被ばくの感受性が低いと判定することができる。

【実施例】

【0030】

以下に、本発明に係る低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法について詳細に説明するための実施例を示す。

【0031】

［実施例１：体外（インビトロ）でのＣＴ装置による放射線照射後の健常人ＰＢＬの染色体異常の測定］
まず、４名の健常人（被験者）の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いて、インビトロでのＣＴスキャンによる低線量被ばくでの影響を評価した。以下にその方法及び結果を説明する。

【0032】

（サンプルの作製）
まず、シリンジを用いて被験者の末梢血を採取し、非イオン性造影剤（ＯＭＮＩＰＡＱＵＥ−３００，第一三共）を７．２ｍｇＩ／ｍｌの濃度で混合したものと、しないものとを作製した。その後、当該末梢血を含むシリンジを人体ファントム（Ｍａｇｅｎ Ｐｈａｎｔｏｍ ＢＭＵ−１，京都科学）の中心の穴に挿入し、この人体ファントムに対してＣＴスキャン（Ａｑｕｉｌｉｏｎ ＯＮＥ，東芝メディカルシステムズ）を行って、低線量の放射線（ＤＬＰで１６００ｍＧｙ・ｃｍ）を末梢血に曝露した。スキャンパラメータは、以下の通りである。
・１００ｋＶｐ
・回転時間：０．２７５秒
・プリセットノイズ値：２２
・検出器コンフィギュレーション：３２０×０．５ｍｍ

【0033】

血液サンプルへの放射線曝露後に、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ，Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を用いて血液サンプルからＰＢＬを分離し、ＲＰＭＩ１６４０培地（２０％ウシ血清、２％フィトヘマグルチニン、０．０５μｇ／ｍＬコルセミド含有）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で４８時間培養した。その後、ＨＡＮＡＢＩ Ｍｅｔａｐｈａｓｅ Ｓｐｒｅａｄｅｒ（ＡＤＳＴＥＣ Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＰＢＬから細胞分裂中期染色体のサンプルスライドを調製した。このサンプルスライドは、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、３．７％ホルマリン含有ＰＢＳで固定した。その後、ＰＢＳで５分間の洗浄を３回繰り返した後に、乾燥させた。

【0034】

（ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いた染色体異常の検出）
ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法に用いるＰＮＡプローブとして以下のものを用いた。なお、両方ともＰａｎａｇｅｎｅ社（韓国）から購入した。
・Ｃｙ３標識セントロメア認識用プローブ（Ｃｅｎｔ−Ｃｙ３）
５’−ＡＡＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴ−３’（配列番号１）
・ＦＡＭ標識テロメア認識用プローブ（ＴｅｌＣ−ＦＡＭ）
５’−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ−３’（配列番号２）

【0035】

２５ｎＭのＣｅｎｔ−Ｃｙ３、２００ｎＭのＴｅｌＣ−ＦＡＭ、７０％ホルムアミド及び１０％ブロッキングタンパク質（ｒａｉｎｂｏｗ ＦＩＳＨ，Ｃａｍｂｉｏ）を含む２０％マレイン酸緩衝液からなるハイブリダイズ用プローブ溶液を調製した。調製したプローブ溶液を上記サンプルスライド上に滴下し、その後、核ＤＮＡを８０℃で３０分間処理して変性させた。続いて、サンプルスライドを暗室において室温で１時間静置した後、室温においてスライドを７０％ホルムアミドを含むＴＥバッファで１５分間、２回洗浄し、さらに、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＥバッファで１５分間、２回洗浄した。その後、核染色液であるＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封止した。

【0036】

その後、サンプルスライドの写真を、Ｍｅｔａｆｅｒソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）により制御されたＣｏｏｌＣｕｂｅ１カメラ（Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ）で撮影した。Ｉｓｉｓイメージングソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、１つのサンプルスライドにおいて、１０００個の細胞分裂中期リンパ球について、二動原体染色体や環状染色体といった染色体異常の数を検出した。

【0037】

測定結果を図３に示す。図３は、４名の被験者（Ａ〜Ｄ）のそれぞれのＣＴスキャン前後の１０００細胞当たりの環状染色体及び二動原体染色体の数を示し、造影剤処理の有無についても比較して示す。図３に示す通り、いずれの被験者においても、ＣＴスキャン前（○）よりもＣＴスキャン後（△）では、染色体異常が有意に増加した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。このため、本願発明に係る方法は、例えばＰＢＬに対する体外でのＣＴ装置を用いた放射線照射を行った場合でも適用可能であることが分かる。また、血液に造影剤を添加した場合であっても、同様にＣＴスキャンを受けた後に染色体異常は増大した。従って、例えば、実施にＣＴスキャンによる検査を受ける患者に対して、並行して本発明に係る方法を適用することもできることが示唆された。

【0038】

［実施例２：個体へのＣＴ装置による放射線照射後に個体から採取されたＰＢＬの染色体異常の測定］
次に、個体自身にＣＴスキャンを行った場合の、ＣＴスキャン前後の染色体異常を測定した。以下にその方法及び結果を示す。

【0039】

（サンプルの作製）
サンプルスライドの作製のために、ＣＴスキャンの前後において６０名の被験者（３９名の心房細動患者、２１名の肝炎患者）に対して採血を行った。

【0040】

心房細動患者に対するＣＴスキャンは以下の通りに行った。ＣＴスキャン装置としては東芝メディカルシステムズ社のＡｑｕｉｌｉｏｎＯＮＥ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄ ＶＣＴを用いた。また、retrospective ECG gating及びautomatic tube current modulationを利用した。Ａｑｕｉｌｉｏｎ ＯＮＥでは、スキャンモードをvolume scan（table fixed serial scan）とし、スキャンパラメータは上記と同様にし、回転時間は患者の心拍に従って回転時間は０．２７５秒から０．３５０秒とした。ＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄＶＣＴでは、スキャンモードをｈｅｒｉｃａｌにし、スキャンパラメータを以下のようにした。なお、患者への線量は各患者によって異なるが、ＤＬＰで概ね５００〜３０００ｍＧｙ・ｃｍとした（図４Ｂを参照）。
・管電圧：１２０ｋＶｐ
・回転時間：０．３５０秒
・プリセットノイズ値：０．６２５ｍｍのスライス厚で２０ＨＵ
・検出器コンフィギュレーション：６４０×０．６２５ｍｍ
全ての被験者には、１２秒で３００ｍｇＩ／ｍＬ／ｋｇ（体重）の非イオン性造影剤を投与した。

【0041】

肝炎患者に対するＣＴスキャンは以下の通りに行った。ＣＴスキャン装置としてはＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄＶＣＴを用いた。肝臓の上部からヘリカルを開始し、肝臓全体のヘリカル画像を得た。スキャンパラメータは以下のようにした。
・回転時間：０．４５秒
・ビームコリメーション：０．６２５×６４ｍｍ
・断面厚さ及び間隔：５．０ｍｍ
・ヘリカルピッチ（ビームピッチ）：０．９３８
・テーブル移動速度：９３．８ｍｍ／秒
・視野：５０ｃｍ
・電圧：１２０ｋＶｐ
・オートｍＡ（ノイズインデックス１０）
なお、６００ｍｇＩ／ｋｇ（体重）の造影剤を、２２ｇの静脈カテーテルを用いて肘脈に３０秒間注入した。

【0042】

上記のようなＣＴスキャンの前後に患者から採血し、実施例１と同様にＰＢＬを採取、培養した後にサンプルスライドを作製した。

【0043】

（ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いた染色体異常の検出）
実施例１と同様に、作製したサンプルスライドを用いて、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法によってそれぞれの染色体異常を測定した。その結果を図４に示す。

【0044】

図４のＡ及びＢは、６０名の個体のＣＴスキャン前と後とにおける各１０００個の細胞分裂中期リンパ球中の二動原体染色体や環状染色体といった染色体異常の数を比較するグラフである。Ａは各個人のＣＴスキャン前後の１０００細胞中の染色体異常数を示しており、Ｂは各個人の受けた放射線被ばく量を併せて示すグラフである。図４のＡに示すように、ＣＴスキャン前では平均で５．６±３．６個／１０００細胞の染色体異常が見られ、一方、ＣＴスキャン後では平均で７．２±３．７個／１０００細胞の染色体異常が見られ、それらに有意な差が認められた（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。なお、図示はしないがＣＴスキャンの１５分後及び１６時間後のサンプルで染色体異常の数に変化は認められず、また、心房細動患者と肝炎患者との間にも顕著な差は認められなかった。しかしながら、図４のＢに示すように、同一のＤＬＰ又は実効線量であっても各個体において、ＣＴスキャン後における染色体異常が誘導される程度は異なることが認められた。

【0045】

［実施例３：体外（インビトロ）での低線量放射線被ばくによるＰＢＬの染色体異常の測定］
次に、より低線量の放射線被ばくであっても染色体異常の誘導を検出できるかについて検討した。以下にその方法及び結果を示す。

【0046】

（サンプルの作製）
サンプルスライドの作製のために、１５名の健常人から実施例１と同様に血液を採取し、採取した血液に対してセシウム‐１３７（^１３７Ｃｓ）放射線装置（産業科学株式会社）を用いて０．６６７ｍＧｙ／分の線量率で１５、４０又は８０ｍＧｙの放射線を曝露した。その後、実施例１と同様にＰＢＬを採取し培養した後にサンプルスライドを作製した。

【0047】

（ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いた染色体異常の検出）
実施例１と同様に、作製したサンプルスライドを用いて、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法によってそれぞれの染色体異常を測定した。その結果を図５に示す。

【0048】

図５のＡ及びＢは、１５名の個体から得られたサンプルの放射線曝露前（０ｍＧｙ）及び１５、４０又は８０ｍＧｙの放射線曝露後における各１０００個の細胞分裂中期リンパ球中の二動原体染色体や環状染色体といった染色体異常の数を示すグラフである。Ａは１５名の平均を示しており、Ｂは１５名それぞれの結果についてポアソン回帰を用いて示すグラフである。図５のＡに示すように、放射線曝露前では約１．８個／１０００細胞の染色体異常の数が、放射線量依存的に増加することが明らかとなった。また、図５のＢに示すように、各個人間において、放射線曝露による染色体異常の数の増加の程度が異なることも明らかとなった。

【0049】

以上の結果から、健常人において非常に低線量の放射線被ばくであっても、染色体異常に影響があること、また、その影響の大きさは個人差があること、さらに、その染色体異常はＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いることによって測定可能であることが明らかとなった。

【0050】

以上の通り、上記本発明に係る低線量放射線被ばくに対する感受性の判定方法を用いることで、低線量の放射線被ばく前後における染色体異常の量の差を容易に評価することができる。従って、本発明に係る方法は個々の低線量放射線被ばくに対する感受性を容易に判定することができて、極めて有用である。

【0051】

［実施例４：ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いた低線量被ばくの感受性測定と、従来のγ−Ｈ２ＡＸの検出を用いた低線量被ばくの感受性測定との対比］
次に、本発明に係る方法と、上記従来のγ−Ｈ２ＡＸの検出を利用した方法との検出感度を比較した。以下にその方法及び結果を示す。

【0052】

（放射線処理）
サンプルスライドの作製のために、肺ＣＴスキャンの前後において４９名の肺がん患者に対して採血を行った。肺がん患者に対するＣＴスキャンにおいて、ＣＴスキャン装置としては東芝メディカルシステムズ社のＡｑｕｉｌｉｏｎＯＮＥを用い、スキャンパラメータを以下のようにした。なお、各患者へ与える線量をＤＬＰで１００ｍＧｙ・ｃｍに調整した。
・管電圧：１２０ｋＶｐ
・回転時間：０．５０秒
・検出器コンフィギュレーション：８０×０．５ｍｍ

【0053】

（ＰＮＡ−ＦＩＳＨ用サンプルの作製）
上記のようなＣＴスキャンの前後に患者から採血し、実施例１と同様にＰＢＬを採取、培養した後にサンプルスライド（３３例）を作製した。

【0054】

（ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法を用いた染色体異常の検出）
実施例１と同様に、作製したサンプルスライドを用いて、ＰＮＡ−ＦＩＳＨ法によってそれぞれの染色体異常を測定した。その結果を図６のＡに示す。図６のＡは、３３名の個体のＣＴスキャン前と後とにおける各１０００個の細胞分裂中期リンパ球中の二動原体染色体や環状染色体といった染色体異常の数を比較するグラフである。図６のＡに示すように、ＣＴスキャン前では平均で約７個／１０００細胞の染色体異常が見られ、一方、ＣＴスキャン後では平均で約１２個／１０００細胞の染色体異常が見られ、それらに有意な差が認められた（Ｐ＜０．０００１）。

【0055】

（核内γ−Ｈ２ＡＸの検出用サンプルの作製）
血液サンプルへの放射線曝露後に、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ，Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を用いて血液サンプルからＰＢＬを分離し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ ４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてスライドガラスに付着させた（４５例）。その後、ＰＢＬを４％パラフォルムアルデヒドで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した後、１０００倍希釈した抗ヒストンＨ２ＡＸ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｅｒ１３９）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に３７℃、３０分反応させた。その後、２００倍希釈したＣｙ３標識抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）に３７℃、３０分反応させた。その後、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ包埋剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，）を用いてスライドを封入し、サンプルスライドを作製した。

【0056】

（核内γ−Ｈ２ＡＸの検出）
作製したサンプルスライドに対して、Ｍｅｔａｆｅｒ４（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）を装備したＡｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて１０００細胞以上のＣｙ３に基づく蛍光画像の自動解析を行った。その結果を図６のＢに示す。図６のＢは、４５名の個体のＣＴスキャン前と後とにおける細胞１個あたりの核内γ−Ｈ２ＡＸの平均検出数を示すグラフである。図６のＢに示すように、ＣＴスキャン前後で、その検出数に有意な差は認められなかった。

【0057】

それぞれの結果を対比して明らかなように、従来の核内γ‐Ｈ２ＡＸの検出方法では、低線量被ばく前後でその検出数に有意な差が認められず、すなわち低線量被ばくの感受性の評価に用いることができないが、一方、本発明に係る方法では低線量の被ばくであっても被ばく前後で染色体異常数に有意な差が認められるため、低線量被ばくに対する感受性の測定が可能となる。以上の通り、本発明に係る方法は、個々の低線量放射線被ばくに対する感受性を容易に判定することができるため、極めて有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]