特開 2021-132593 ヒマ由来のリパーゼ及びそれをコードするＤＮＡ、ベクター、形質転換植物体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-132593(P2021-132593A)

(43)【公開日】2021年9月13日

(54)【発明の名称】ヒマ由来のリパーゼ及びそれをコードするＤＮＡ、ベクター、形質転換植物体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20210816BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210816BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20210816BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/55ZNA

   C12N15/63 Z

   A01H5/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2020-32310(P2020-32310)

(22)【出願日】2020年2月27日

(71)【出願人】

【識別番号】000118556

【氏名又は名称】伊藤製油株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100094190

【弁理士】

【氏名又は名称】小島 清路

(74)【代理人】

【識別番号】100151644

【弁理士】

【氏名又は名称】平岩 康幸

(74)【代理人】

【識別番号】100151127

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 勝雅

(72)【発明者】

【氏名】金井 雅武

(72)【発明者】

【氏名】真野 昌二

(72)【発明者】

【氏名】駒澤 謙史

【テーマコード（参考）】

2B030

【Ｆターム（参考）】

2B030AD07

2B030CA17

(57)【要約】      （修正有）

【課題】リシノール酸含量の向上に寄与するリパーゼ、そのリパーゼをコードするＤＮＡ、ベクター、形質転換植物体を提供する。
【解決手段】本発明のリパーゼは、ヒマ由来のものであり、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、またリパーゼをコードするＤＮＡは、特定の塩基配列のＤＮＡであり、ベクターはそのＤＮＡを有するもの、形質転換植物体はそのＤＮＡが導入されたものである。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ

【請求項2】

請求項１に記載のＤＮＡを有するベクター。

【請求項3】

請求項１に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。

【請求項4】

下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、
ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ

【請求項5】

請求項４に記載のＤＮＡを有するベクター。

【請求項6】

請求項４に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。

【請求項7】

ヒマ由来のリパーゼであって、
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド

【請求項8】

ヒマ由来のリパーゼであって、
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒマ由来のリパーゼ、及びそのリパーゼをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを有するベクター、前記ＤＮＡが導入された形質転換植物体に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）の種子から搾油されるひまし油はヒドロキシ脂肪酸の1種であるリシノール酸を８０〜９０％程度含み、植物由来の機能性プラスチック原材料として大きな位置を占め、工業用途で有用視されている。
一方、ヒマ種子は毒性の高いリシンと呼ばれるタンパク質を含み、限られた地域でのみ栽培されている。そのため、リシノール酸の生産量を高める目的として、ヒマ以外の作物によるリシノール酸生産が研究されている。その上で、リシノール酸を合成する遺伝子を同定し、他の植物に導入することにより、リシノール酸生産を増大させることを目的とし、ヒマにおけるリシノール酸合成経路が研究されてきた。
そして、リシノール酸の生産に関して、リシノール酸の前駆体であるオレイン酸に水酸基を付加し、リシノール酸を合成する酵素をコードするヒマの遺伝子ＦＡＨ１２が同定され、ヒマを代替する形質転換植物体を作出するには、リシノール酸を合成するヒマ由来の酵素の遺伝コードとしてＦＡＨ１２遺伝子の導入が有用であることが分かった（特許文献１参照）。尚、ヒマについては、ドラフトゲノムのＤＮＡの解析結果が開示されている（非特許文献１参照）。
また、植物種子の貯蔵脂質は大部分がトリアシルグリセロールであり、ヒマ種子においても合成されたリシノール酸はグリセロールと結合し、トリアシルグリセロールとして貯蔵される。高濃度にリシノール酸を蓄積する形質転換植物を作出するために、ヒマにおける脂肪酸合成経路およびＴＡＧ合成経路の詳細な研究が進められ、脂肪酸合成経路においては、水酸基を付加するＦＡＨ１２の導入に加えて、脂肪酸の伸長酵素であるＦＡＥ１および脂肪酸不飽和化酵素ＦＡＤ２、ＦＡＤ３を欠損させることでシロイヌナズナ種子におけるリシノール酸含量を向上させることが報告されている（非特許文献２参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００４−３２１１８９号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Agnes et.al. Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis，NATURE BIOTECHNOLOGY，VOLUME 28，NUMBER 9，SEPTEMBER 2010:951-959

【非特許文献2】Mark A.Smith et.al. Heterologous expression of a fatty acid hydroxylase gene in developing seeds of Arabidopsis thaliana，Planta(2003) 217:507-516

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１におけるＦＡＨ１２遺伝子が導入された形質転換植物由来の種子においてもリシノール酸含量は低く、より高濃度のリシノール酸を蓄積する形質転換体が求められている。また、非特許文献２におけるＦＡＨ１２遺伝子の導入に加えて、脂肪酸の伸長酵素であるＦＡＥ１及び脂肪酸不飽和化酵素ＦＡＤ２、ＦＡＤ３を欠損させる場合でも、十分な結果が得られない場合があった。
そこで、本願の発明者等は、リシノール酸を高濃度に蓄積させるには、脂肪酸合成だけでなく、脂質分解に関与するヒマ由来のリパーゼについても検討し、特定のリパーゼによりＴＡＧを分解させることによって、リシノール酸の含有量を向上させることを見出した。
本発明の目的は、リシノール酸含量の向上に寄与するリパーゼ、そのリパーゼをコードするＤＮＡ、ベクター、形質転換植物体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記従来の問題点を解決する手段として、本発明は以下に示される。
１．下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
２．上記１．に記載のＤＮＡを有するベクター。
３．上記１．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
４．下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
５．上記４．に記載のＤＮＡを有するベクター。
６．上記４．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
７．ヒマ由来のリパーゼであって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
８．ヒマ由来のリパーゼであって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、リシノール酸含量の向上に寄与するリパーゼ、そのリパーゼをコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）、ベクター、形質転換植物体を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】ＴＡＧリパーゼに係る分子系統樹。

【図2】遺伝子発現量を示すグラフ。

【図3】リシノール酸含量を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明のＤＮＡ（遺伝子）は、植物体のヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）から調整したゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡであり、脂質の分解に関与するリパーゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡである。
上記脂質は、１分子のグリセロールに、１〜３分子の脂肪酸がエステル結合したものであれば、特に限定されない。この脂質として、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールが挙げられる。
上述の脂質の中でも１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合したトリアシルグリセロール、特に３分子の脂肪酸のうち少なくとも１分子がリシノール酸であり、残りがリノール酸であるトリアシルグリセロールは、種子中におけるリシノール酸の含有量の向上に大きく寄与する。このため、本発明のリパーゼは、トリアシルグリセロールに関与するトリアシルグリセロールリパーゼが好ましい。

【0010】

尚、本明細書においては、トリアシルグリセロールを「ＴＡＧ」ともいうものとし、トリアシルグリセロールリパーゼを「ＴＡＧリパーゼ」ともいう。
また、本明細書において、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡによる「ＴＡＧリパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＡ」、配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡによる「ＴＡＧリパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＢ」ともいう。
尚また、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢは、本発明のＤＮＡのＴＡＧリパーゼ遺伝子から転写と翻訳により合成されたタンパク質を基にして構成されるポリペプチドからなる。

【0011】

本発明のＤＮＡ（ＤＮＡ断片）は、以下の（ａ）〜（ｄ）の態様で示されるＤＮＡのうちの一種である。
（ａ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。

【0012】

上記態様（ｂ）における、本発明におけるＤＮＡの塩基配列の同一性については、リパーゼをコードする機能、特にはＴＡＧリパーゼＡ又はＢをコードする機能を発揮すればよく、７０％以上の同一性を有する塩基配列であればよく、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡである。

【0013】

塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Karlin S and Altschul SF (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268; (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えば、score=100、wordlength=12とする。

【0014】

上記態様（ｃ）における本発明のＤＮＡは、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢをコードする機能を有するものであれば、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡでも構わない。この場合、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列において、その３’末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを含むものや、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢのコード機能を失うことなく、その５’末端を欠失したものも含まれる。

【0015】

上記態様（ｄ）におけるＤＮＡは、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡである。この「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
そのような条件の例としては、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５の配列と相同性の高いＤＮＡが、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、それより低い相同性のＤＮＡが相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズしない条件が挙げられる。
本明細書でいう相同性が高いとは、相同性が７０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５%以上を意味する。
ストリンジェントな条件の具体例としては、６０℃−７０℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。

【0016】

本発明におけるＤＮＡはＴＡＧリパーゼＡ又はＢをコードしている。本発明のＤＮＡによるＴＡＧリパーゼＡ又はＢは、脂質であるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のエステル結合の加水分解能を有し、特定のＴＡＧを分解させることによって、種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる効果を発揮する。種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる作用機構については、ＴＡＧ中のオレイン酸に係るエステル結合を選択的に加水分解し、オレイン酸を遊離させることが推定され、これにより、リシノール酸がグリセロールと結合して為るＴＡＧが貯蔵されて、リシノール酸含量が増加するものと考えられる。

【0017】

本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを有するベクターである。上記ベクターとしては、本発明のＤＮＡを安定に保持するものであり、そのＤＮＡが有するＴＡＧリパーゼ遺伝子を好適に発現させることができるものであれば、その構造や種類等に特に制限はない。このようなベクターとして、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ＹＡＣ等が挙げられるが、汎用性の観点からプラスミドが好適である。
ベクターは、周知の方法により、本発明のＤＮＡがベクターへ担持（挿入）されることで構築される。ベクターには、本発明のＤＮＡの他に、エンハンサー領域（配列）やターミネーター領域（配列）、薬剤耐性遺伝子や選択マーカー遺伝子等といった周知の要素が組み込まれていてもよい。

【0018】

ベクターは、通常、好適に担持（挿入）された本発明のＤＮＡを、宿主細胞へ導入する場合に用いられる。
例えば、宿主に大腸菌を用いるのであれば、薬剤耐性遺伝子や選択マーカー遺伝子が組み込まれた市販のベクター（プラスミド）や、クローニング用ベクターとして市販されている種々のベクター（プラスミド）を利用することができる。

【0019】

上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞が挙げられるが、作業性及び汎用性等から、大腸菌が好適である。
宿主細胞へのベクター導入は、塩化カルシウム水溶液等を使用して、カルシウム存在下で大腸菌（コンピテントセル）に取り込ませる方法や、その他、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション方法等の公知の方法で行うことができる。

【0020】

また、植物体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のベクターを、例えば、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である。植物体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。

【0021】

本発明の形質転換植物体は、本発明のＤＮＡが導入されたものであり、本発明のＤＮＡを利用して、導入したＴＡＧリパーゼの塩基配列の発現により、植物体を形質転換したものである。
形質転換植物体の作製は、本発明のベクターやＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム等の手法を用い、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入して、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることで行われる。この形質転換に要する期間は、従来のような交雑による遺伝子移入に比較して極めて短期間である。また、他の形質の変化を伴わない点で有利である。
形質転換の手法の一つの具体例として、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、細菌のＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）システムが侵入したウィルスのＤＮＡをバラバラにしてその中で特定の塩基配列をもつ断片を細菌自身のゲノムに取り込み、記憶して、ウィルスの再侵入時には、記憶したＤＮＡから転写されたＲＮＡがウィルスのＤＮＡを照合して見つけ出し、ＲＮＡにガイドされた酵素（Ｃａｓタンパク質）が、ウィルスのＤＮＡを切断する仕組みを利用するものである。
また、形質転換植物体に用いられる植物細胞としては特に限定されない。具体的には、シロイヌナズナ等が挙げられるが、本発明のＤＮＡを発現可能なものであれば、特に制限はなく、何れが用いられてもよい。

【0022】

本発明のリパーゼは、植物体のヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）に由来するリパーゼであり、タンパク質を基にして構成されるポリペプチドからなる。このリパーゼは、脂質分解に関与することで、種子中におけるリシノール酸含量の向上に寄与するリパーゼである。
上述したように、リパーゼが分解対象とする脂質として、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールが挙げられ、これらの中でもトリアシルグリセロールは、種子中におけるリシノール酸の含有量の向上に大きく寄与する。このため、本発明のリパーゼは、ＴＡＧリパーゼが好ましい。

【0023】

尚、本明細書において、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによる「リパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＡ」、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによる「リパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＢ」ともいう。

【0024】

本発明のリパーゼは、以下の（ａ）〜（ｃ）の態様で示されるポリペプチドのうちの一種である。
（ａ）配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【0025】

上記態様（ｂ）における、本発明におけるポリペプチドのアミノ酸配列の同一性については、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢがリシノール酸含量の向上に寄与する機能を発揮すればよく、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよく、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

【0026】

アミノ酸配列の同一性は、既存のアルゴリズムを用いて計算することができる。このアルゴリズムとして、例えば、以下が挙げられる。
Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）
ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）
通常は、上記のようなアルゴリズムが組み込まれた解析プログラムが開発されており、こうした解析プログラムを用いてアミノ酸配列の同一性（％）を解析する。
この解析プログラムとして、例えば、以下が挙げられる。
ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch（J Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）のアルゴリズム。
遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムに組み込まれた、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）により、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として算出。

【0027】

上記態様（ｃ）における本発明のリパーゼは、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢの機能を有するものであれば、配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドでも構わない。

【0028】

本発明におけるリパーゼとして、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢは、脂質、特にはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のエステル結合の加水分解能を有し、特定のＴＡＧを分解させることによって、種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる効果を発揮する。種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる作用機構については、ＴＡＧ中のオレイン酸に係るエステル結合を選択的に加水分解し、オレイン酸を遊離させることが推定され、これにより、リシノール酸がグリセロールと結合して為るＴＡＧが貯蔵されて、リシノール酸含量が増加するものと考えられる。

【実施例】

【0029】

以下、本発明をさらに具体化した実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0030】

［１］シロイヌナズナの播種及び生育
シロイヌナズナ種子を、滅菌液（次亜塩素酸ナトリウム２％、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（商品名、非イオン系界面活性剤）０．０２％の混合液）に５分間浸し、滅菌した。
滅菌したシロイヌナズナ種子を、滅菌した純水で５回洗浄した後、発芽培地に播種した。発芽培地には、１／２濃度のムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地用混合塩類に、スクロース（濃度１％）、２−モルホリノエタンスルホン（ＭＥＳ）緩衝剤（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）、寒天（濃度０．８％）を添加し、ｐＨ５．８としたものを使用した。
播種後は、温度２２℃で一定とした環境下において、明期を１６時間、暗期を８時間とし、明期に使用する光源を蛍光灯（光量子束密度、７０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓ）として、播種から１０日後に芽生えしたものを培養土に移植し、シロイヌナズナの生育を行った。そして、培養土に移植後、約２ヶ月間生育したシロイヌナズナから種子を収穫した。

【0031】

［２］ヒマの播種及び生育
ヒマ種子を、滅菌液（次亜塩素酸ナトリウム２％、「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００」（商品名、非イオン系界面活性剤）０．０２％の混合液）に５分間浸し、滅菌した。
滅菌したヒマ種子を、滅菌した純水で５回洗浄した後、滅菌水で湿潤させたキッチンペーパーで包み、プラスチック製の容器に入れて遮光し、該容器を、室温２２℃で一定とした培養室に５日間静置して、発根したヒマ種子を培養土に播種した。
播種後は、室温２８℃で一定とした人工気象室内において、明期を１６時間、暗期を８時間とし、明期に使用する光源をメタルハライドランプ（光量子束密度、１０００μｍｏｌ／ｍ^２／ｓ）として、ヒマの生育を行った。そして、培養土に播種後、約４ヶ月間生育したヒマから種子を収穫した。

【0032】

［３］分子系統樹の作成
ヒマと、ヒマの近縁種であるナンヨウアブラギリ（学名：Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ、以下「ヤトロファ」とも記載する）とについて、これらのゲノムにコードされるタンパク質の中で、ＴＡＧリパーゼに特徴的なドメインであるｃｌａｓｓ＿３ リパーゼ（ＰＦ０１７６４）を持つタンパク質を抽出した。この抽出には、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ１２〈ＵＲＬ：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html〉を利用した。
そして、抽出したタンパク質のアミノ酸配列を系統解析し、分子系統樹を作成した。この系統解析には、ＭＥＧＡ７〈ＵＲＬ：https://www.megasoftware.net/〉を利用し、ブートストラップ値は１０００回反復から決定された。
作成した分子系統樹を、図１に示す。
尚、図１では、ヒマ由来のタンパク質に○を、ヤトロファ由来のタンパク質に●を付した。

【0033】

［４］ＴＡＧリパーゼ遺伝子の探索
上記［３］で作成した分子系統樹から系統樹解析を行い、ヒマ及びヤトロファのゲノムにコードされるｃｌａｓｓ＿３ リパーゼ（ＰＦ０１７６４）ドメインを持つ遺伝子を抽出した。
ｃｌａｓｓ＿３ リパーゼドメインを持つ遺伝子がヒマゲノムには３９、ヤトロファゲノムには３１存在した。これらの中から、ヒマゲノムにのみ存在し、近縁種であるヤトロファゲノムには存在しないヒマ特異的リパーゼ遺伝子を探索して、28424.m000016、29900.m001596、29935.m000048、30183.m001305の４つの遺伝子を候補として選抜した（図１中に矢印で示す）。

【0034】

［５］ヒマ由来遺伝子の単離
［５−１］ＲＮＡの抽出
上記［２］に従って生育した開花後３週間又は４週間のヒマ種子を採取し、ヒマのＲＮＡを抽出した。このＲＮＡの抽出は、以下（１）〜（３）に示す手順に従って行った。
（１）ヒマ種子をチューブ（容量：１．５ｍＬ、ポリプロピレン製）に収容し、液体窒素で凍結した後、ポリビニルピロリドン（分子生物学用、濃度：１ｗ／ｖ％）を添加したＲＮＡ抽出用の細胞溶解バッファー（以下、「ＰＶＰ添加バッファー」ともいう）１００μＬを加え、温度４℃、遠心力１０００×ｇで１分間、遠心分離し、モーターグラインダー及びステンレス鋼製の乳棒を用いて６０秒間均質化した。
（２）さらにＰＶＰ添加バッファー５５０μＬを加え、逆さまにしてＰＶＰ添加バッファーを混合し、２５℃で１０分間インキュベートした後、温度２５℃、遠心力８０００×ｇで５分間、遠心分離した。
（３）（２）の遠心分離後、上清５５０μＬを新しいチューブ（容量：１．５ｍＬ、ポリプロピレン製）に移し替え、温度２５℃、遠心力１００００×ｇで５分間、遠心分離した後、上清４５０μＬを新しいチューブ（容量：１．５ｍＬ、ポリプロピレン製）に移し替え、これをヒマＲＮＡの抽出物として使用した。

【0035】

［５−２］ｃＤＮＡの合成
上記［５−１］で抽出したヒマＲＮＡからｃＤＮＡ合成キット（「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（商品名）、タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。
合成したヒマのｃＤＮＡについて、このｃＤＮＡを鋳型として、上記［４］で選抜した４つの遺伝子について、表１に示したプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（「Prime STAR GXL」（商品名）、タカラバイオ社）とを使用したＰＣＲ法により増幅した。
プライマーセットについては、５’末端側のプライマーの塩基配列を配列番号１，４，７，１０とし、３’末端側のプライマーの塩基配列を配列番号２，５，８，１１とする。
そして、配列番号３で示される29935.m000048、配列番号６で示される30183.m001305、配列番号９で示される28424.m000016、配列番号１２で示される29900.m001596の４種の遺伝子を単離し、それぞれの塩基配列を常法に従って解析した。
また、上記４つの遺伝子の他、さらに配列番号１３で示される水酸基付加酵素（ＦＡＨ１２）を単離した。
ＰＣＲ法で用いたプライマー及び得られた遺伝子の関係を表１に示す。
なお、上記ＰＣＲ法による増幅は、ＤＮＡ二本鎖解離を９５℃で１分、アニーリングを９８℃で１０秒と６０℃で１５秒と６８℃で３分とを１サイクルとして３０サイクル、ＤＮＡ合成を６８℃で５分、を条件として行った。

【0036】

【表1】

【0037】

［６］遺伝子発現量の確認
上記［２］で得られたヒマの種子のうち、開花後２５日目の登熟種子、開花後３５日目の登熟種子、発芽直後の種子、及び、発芽後の芽生えの子葉、について、上記［４］で選抜した４つの遺伝子の遺伝子発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析法で定量した。その結果を、図２のグラフに示す。

【0038】

〔６−１〕定量的ＲＴ−ＰＣＲ法
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法の手順について、以下（１）〜（３）に示す。
（１）種子については、ＲＮＡ抽出キット（「ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（商品名）、ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
子葉については、ＲＮＡ抽出キット（「「ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（商品名）、ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
（２）（１）で抽出した２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ」（商品名）、タカラバイオ社）を使用し、ｃＤＮＡを合成した。
（３）定量ＰＣＲキット（「ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標） ＦＡＳＴユニバーサルキット」（商品名）、ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）と、リアルタイムＰＣＲシステム（「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） ７５００Ｆａｓｔ」（商品名）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と、を使用し、参照遺伝子にＥＬＦ３ｋ（真核生物翻訳開始因子３Ｋ）及びＭＡＰ２Ｂ（メチオニンアミノペプチダーゼ２Ｂ）を用いて、遺伝子発現量を定量した。

【0039】

〔６−２〕遺伝子発現量の定量結果
図２のグラフに示されるように、上記［４］で選抜した選抜した４つの遺伝子のうち、8424.m000016、29900.m001596は、登熟種子（開花後２５日目、３５日目）、発芽直後の種子、及び、発芽後の芽生えの子葉の全てで、遺伝子発現量が検出限界以下であり、遺伝子の発現が見られなかった。
29935.m000048、30183.m001305は、開花後２５日目及び３５日目の登熟種子で、遺伝子発現量が５を超えており、遺伝子の発現が見られた。また、29935.m000048、30183.m001305は、発芽直後の種子、及び発芽した芽生えの子葉では、遺伝子発現量が０（ゼロ）であり、遺伝子の発現が見られなかった。
上記の結果は、29935.m000048、30183.m001305が、発芽後は機能せず、登熟種子で特異的に機能するリパーゼであることを示唆している。
よって、29935.m000048をＴＡＧリパーゼＡ、30183.m001305をＴＡＧリパーゼＢと同定し、以下ではＴＡＧリパーゼＡである29935.m000048をRcTL1、ＴＡＧリパーゼＢである30183.m001305をRcTL2と記載する。
また、RcTL1の塩基配列（配列番号３）に基づき、ＴＡＧリパーゼＡのアミノ酸配列を解析し、ＴＡＧリパーゼＡのアミノ酸配列を、配列番号１８に示す。
さらに、RcTL2の塩基配列（配列番号６）に基づき、ＴＡＧリパーゼＢのアミノ酸配列を解析し、ＴＡＧリパーゼＢのアミノ酸配列を、配列番号１９に示す。

【0040】

［７］シロイヌナズナ由来ＤＮＡ断片の単離
上記［１］に従って４週間生育したシロイヌナズナから葉を採取し、その葉を液体窒素で凍結させた後、液体窒素を加えて冷やしながら乳鉢・乳棒ですり潰した。
すり潰した植物体粉末０．１ｇからＤＮＡ抽出キット（「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（商品名）、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてシロイヌナズナのゲノムＤＮＡを抽出した。
抽出したシロイヌナズナのゲノムＤＮＡについて、このゲノムＤＮＡを鋳型とし、シロイヌナズナ由来の特定のＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、単離した。
単離したＤＮＡ断片を表２に示す。

【0041】

【表2】

【0042】

［８］形質転換植物体の作成
リシノール酸合成を担う水酸基付加酵素であるＦＡＨ１２を導入Ｎｏ．１として、このＮｏ．１のみをシロイヌナズナへ導入し、比較試料とした。
さらに、Ｎｏ．１のＦＡＨ１２とともに、上記［６］で同定されたリパーゼのうち、ＲｃＴＬ１（ＴＡＧリパーゼＡ）を導入Ｎｏ．２、ＲｃＴＬ２（ＴＡＧリパーゼＢ）を導入Ｎｏ．３として、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．２の組み合わせと、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．３の組み合わせとを、それぞれシロイヌナズナへ導入し、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．２を実施試料１、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．３を実施試料２とした。
比較試料、実施試料１及び２のシロイヌナズナからそれぞれ採取した種子を、２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む発芽培地に播種し、形質転換植物としてそれぞれ３０個ずつ合計１５０個を選抜した。
上記Ｎｏ．１〜３のシロイヌナズナへの導入は、クローニングキット（「Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ」（商品名）、タカラバイオ社）を用い、Ｔｉプラスミド（「ｐＧＷＢ５０１」（Ａｄｄｇｅｎｅ提供））に導入後、このＴｉプラスミドをアグロバクテリウム法によりシロイヌナズナへ導入して行った。
Ｎｏ．１について、種子における強力な発現を目的として、ＦＡＨ１２を、シロイヌナズナのプロモーター（１２Ｓ１）及び３’ＵＴＲ（１２Ｓ１）と融合した。
Ｎｏ．２及びＮｏ．３については、ＲｃＴＬ１及びＲｃＴＬ２をそれぞれ、シロイヌナズナのオレオシン１および２のプロモーターと融合した。
この導入における組み合わせを表３に示す。

【0043】

【表3】

【0044】

［９］リシノール酸含量の定量
上記［８］で得られた形質転換植物について、ガスクロマトグラフィー質量分析法（以下、「ＧＣ−ＭＳ」と略す）により、リシノール酸含量の定量を行った。その結果を、図３のグラフに示す。
なお、比較試料、実施試料１及び２の形質転換植物（種子）は、リシノール酸含量を定量化するため、各３０個ずつをホモジナイザーで粉砕して使用した。

【0045】

［９−１］ＧＣ−ＭＳの手順
ＧＣ−ＭＳは、以下（１）〜（６）に示す手順に従って行った。
（１）比較試料、実施試料１及び２の形質転換植物（種子）各３０個ずつを、クロロホルム：メタノールを２：１で混合した抽出溶媒４００ｍＬと、ホモジナイザーと、を使用して粉砕した後、温度２５℃、遠心力２０００×ｇで５分間、遠心分離し、上清を回収した。
（２）（１）の上清の回収後に残ったペレットに、クロロホルム：メタノールを２：１で混合した抽出溶媒４００ｍＬを加え、温度２５℃、遠心力２０００×ｇで５分間、遠心分離し、上清を回収した。
（３）（１）で回収した上清と、（２）で回収した上清とを混合し、乾燥した後、得られた乾燥脂質を２５ｍＬのヘキサンに溶解させた。
（４）（３）で得た乾燥脂質から、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用のプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、ＴＡＧを分離した。ＴＬＣにおけるＴＡＧ中の脂肪酸定量時の内標準物質には、トリヘプタデカノイン（和光社）を使用した。ＴＬＣ溶媒には、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸を８０：２０：１で混合したものを使用した。
（５）（４）のプレートから、ＴＡＧのスポットを収集し、ヘキサン１００ｍＬでＴＡＧを抽出した。
（６）前処理として、脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク社）を使用してＴＡＧ中の脂肪酸をメチル化して脂肪酸メチルエステルとした後、カラム（ＤＢ−２３、アジレント・テクノロジー社）と、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−１４、島津製作所社）と、スペクトル測定に二重収束型質量分析計（ＪＭＳＤＸ−３００、日本電子社）と、を用い、ＴＡＧ中の脂肪酸メチルエステルを定量した。

【0046】

［９−２］リシノール酸含量の定量結果
図３のグラフに示されるように、ＦＡＨ１２のみを導入した比較試料（図３中に「Ｎｏ．１」と記載）は、リシノール酸含量が４〜６％前後であった。
ＦＡＨ１２とＲｃＴＬ１（ＴＡＧリパーゼＡ）を導入した実施試料１（図３中に「Ｎｏ．１＋Ｎｏ．２」と記載）は、リシノール酸含量が７〜１０％であった。
ＦＡＨ１２とＲｃＴＬ２（ＴＡＧリパーゼＢ）を導入した実施試料２（図３中に「Ｎｏ．１＋Ｎｏ．３」と記載）は、リシノール酸含量が９〜１２％であった。
これらの結果から、リパーゼ（ＲｃＴＬ１、ＲｃＴＬ２）の機能により、種子中におけるリシノール酸含量が向上することが示された。

【産業上の利用可能性】

【0047】

本発明のヒマ由来リパーゼは、種子中のリシノール酸含量を向上させる機能を有し、形質転換に有用であるから、産業上利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]