特開 2021-167289 水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-167289(P2021-167289A)

(43)【公開日】2021年10月21日

(54)【発明の名称】水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/51 20060101AFI20210924BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 31/51 20060101ALI20210924BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210924BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20210924BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/51ZNA

   A61K47/24

   A61K31/51

   A61P9/10

   A61P3/02 105

   A61K9/127

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2020-71309(P2020-71309)

(22)【出願日】2020年4月10日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 発行日：令和２年（２０２０年）２月２６日 刊行物：修士論文要旨集、１８２〜１８４頁、国立大学法人北海道大学大学院生命科学院発行 公開者：石丸 拓也

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】山田 勇磨

(72)【発明者】

【氏名】原島 秀吉

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC11

4C076CC24

4C076DD63H

4C076FF63

4C076FF68

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC83

4C086GA07

4C086GA10

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA24

4C086MA38

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZA36

4C086ZC25

(57)【要約】      （修正有）

【課題】水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子の提供。
【解決手段】脂質ナノ粒子は、リン脂質と水溶性化合物を含み、動的光散乱法で測定した平均粒子径が、６０〜１５０ｎｍである組成物。脂質ナノ粒子は、水溶性化合物を細胞内（特にミトコンドリア）に送達することに有利に用いられ得る。水溶性化合物は、ビタミンＢ1であることが望ましく、リン脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンを含むことが好ましい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子を含む組成物であって、
脂質ナノ粒子は、リン脂質と水溶性化合物を含み、動的光散乱法で測定した平均粒子径が、６０〜１５０ｎｍである、組成物。

【請求項2】

脂質ナノ粒子は、動的光散乱法で測定した多分散性指数（ＰＤＩ）が０．３以下である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

水溶性化合物が、ビタミンＢ₁である、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

脂質ナノ粒子が、非中空の脂質構造体であり、水溶性化合物がビタミンＢ₁である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

脂質ナノ粒子が、中空の脂質構造体であり、水溶性化合物がビタミンＢ₁である、請求項３に記載の組成物。

【請求項6】

前記リン脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

脂質ナノ粒子が、細胞膜透過性ペプチドを表出する脂質ナノ粒子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

水溶性化合物をミトコンドリアに送達することに用いるための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

ビタミンＢ₁を含み、虚血性疾患の対象に投与することに用いるための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

ビタミンＢ₁を含み、ビタミンＢ₁欠乏症の対象に投与することに用いるための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子に関する。

【背景技術】

【0002】

ビタミンＢ₁（ＶＢ₁、チアミン）は１９１１年に鈴木梅太郎によって発見された水溶性ビタミンであり、脚気に対する治療薬として用いられている。ＶＢ₁は各組織でチアミンピロホスホキナーゼによって活性型へと変換され、チアミン二リン酸キナーゼによってさらにチアミン二リン酸へと変換される。生体内でのＶＢ₁の主な作用部位はミトコンドリアマトリックス内のＴＣＡサイクルであり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨＣ， Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＧＤＨＣ， ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）の補酵素として働き、ＴＣＡ回路を活性化することでＡＴＰ産生を促進する。また、脳においてはＶＢ₁は非補酵素作用を有しており、ＶＢ₁およびその誘導体がタンパク質のアロステリック調節を担うことも明らかとなっている。ＶＢ₁の誘導体チアミン三リン酸およびアデニル化チアミン三リン酸はグルタミン酸デヒドロゲナーゼを、チアミンおよびチアミン二リン酸はリンゴ酸デヒドロゲナーゼアイソフォームおよびピリドキサールキナーゼを調節している。

【0003】

体内に取り込まれたＶＢ₁は通常、チアミン輸送タンパク質Ｔｈｉａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ （ＴＨＴＲ）１および２によって細胞内へ輸送され、チアミン二リン酸に変換されトランスケトラーゼの補酵素として働く他、ミトコンドリア膜上の輸送タンパク質ＳＬＣ２５Ａ１９によりミトコンドリアのマトリックスに輸送される。これまでの研究では、例えば、ＶＢ₁をキトサンおよびゼラチンに基づくハイドロゲルから徐放する研究が報告されている（非特許文献１）。しかし、体内に取り込まれたＶＢ₁の細胞内への能動輸送の能力には限界があり、大量投与が必ずしもＶＢ₁の細胞内への輸送量には結びつかない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｋａｕｒ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， １４６： ９８７−９９９， ２０１９

【発明の概要】

【0005】

本発明は、水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子を提供する。

【0006】

本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子を含む組成物であって、
脂質ナノ粒子は、リン脂質と水溶性化合物を含み、動的光散乱法で測定した平均粒子径が、６０〜１５０ｎｍである、組成物。
（２）脂質ナノ粒子は、動的光散乱法で測定した多分散性指数（ＰＤＩ）が０．３以下である、上記（１）に記載の組成物。
（３）水溶性化合物が、水溶性の医薬有効成分である、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）水溶性化合物が、ビタミンＢ₁である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）脂質ナノ粒子が、非中空の脂質構造体であり、水溶性化合物がビタミンＢ₁である、上記（４）に記載の組成物。
（６）脂質ナノ粒子が、中空の脂質構造体であり、水溶性化合物がビタミンＢ₁である、上記（４）に記載の組成物。
（７）前記リン脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンを含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）脂質ナノ粒子が、細胞膜透過性ペプチドを表出する脂質ナノ粒子である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）水溶性化合物をミトコンドリアに送達することに用いるための、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）ビタミンＢ₁を含み、虚血性疾患の対象に投与することに用いるための、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、リン脂質を有する脂質相と水溶性化合物を含む水相とから、単純水和法および逆相蒸発法（ＲＥＶ法）をそれぞれ用いて得られた粒子の動的光散乱法（ＤＬＳ法）による平均粒子径および多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。

【図2A】図２Ａは、リン脂質を有する脂質相と種々の濃度のビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む水相とから、ＲＥＶ法を用いて得られた粒子の脂質ナノ粒子への封入率（％）とＤｒｕｇ／Ｌｉｐｉｄ比（すなわち、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）／リン脂質比）を示す。＊は、封入率に関してｐ＜０．０５であることを表し、＊＊は、Ｄｒｕｇ／Ｌｉｐｉｄ比に関して他と統計学的に有意な差を有することを示す。検定としては、ｎｒＡＮＯＶＡに続きＳＮＫを行った（ｎ＝３）。

【図2B】図２Ｂは、種々の濃度のリン脂質を有する脂質相とビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む水相とから、ＲＥＶ法を用いて得られた粒子の脂質ナノ粒子への封入率（％）とＤｒｕｇ／Ｌｉｐｉｄ比（すなわち、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）／リン脂質比）を示す。＊＊は、Ｄｒｕｇ／Ｌｉｐｉｄ比に関して、他と有意差ｐ＜０．０１があることを示す。検定としては、ｎｒＡＮＯＶＡに続きＳＮＫを行った（ｎ＝３）。

【図3】図３は、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）濃度を２ｍＭとし、脂質濃度５．５ｍＭ（パネルＡ）または１．３８ｍＭ（パネルＢ）としたときにＲＥＶ法で得られた脂質ナノ粒子の透過電子顕微鏡像（ネガティブ染色像）を示す。

【図4】図４は、ＲＥＶ法で得られる脂質ナノ粒子に関して、オクタアルギニン（Ｒ８）表出脂質ナノ粒子とＲＰ ａｐｔａｍｅｒ表出脂質ナノ粒子を作製し、細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）への取込み能を測定した結果である。本実施例では、細胞播種４８時間後に脂質ナノ粒子（キャリア）が添加され、１時間後に測定がなされた。Ｒ８表出脂質ナノ粒子とＲＰ ａｐｔａｍｅｒ表出脂質ナノ粒子は、それぞれ、ステアリル化Ｒ８およびステアリル化ＲＰ ａｐｔａｍｅｒを図に示されるモル％で添加した脂質相を用い、他の条件は変えないことにより作製した。

【図5A】図５Ａは、細胞に取り込まれた脂質ナノ粒子と当該細胞のミトコンドリア（ＭＩＴＯ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ染色）との局在をレーザー走査顕微鏡で観察した結果を示す。

【図5B】図５Ｂは、Ｒ８表出脂質ナノ粒子とＲ８及びＲＰ ａｐｔａｍｅｒ表出脂質ナノ粒子のミトコンドリアへの移行率およびミトコンドリアの占有率を示す。左パネルにおいて、＊＊は、両側独立ｔ−検定（ｎ＝２２〜３０）において有意差ｐ＜０．０１であることを示し、右パネルにおいて、＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに次ぐＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定（ｎ＝２２〜３０）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【図6】図６は、図示されたビタミンＢ₁（ＶＢ₁）の水相を用いて作製した脂質ナノ粒子と細胞を接触させ、１時間後、３時間後、および６時間後のＡＴＰ産生速度（％）を示す。ＡＴＰ産生速度（％）は、未処理細胞のＡＴＰ産生速度との比として求められた。＊および＊＊はそれぞれ、未封入のビタミンＢ₁（ＶＢ₁）とＲ８／ＰＲ ａｐｔａｍｅｒ表出ナノ粒子との間で有意差（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）を有することを示す。図中、白抜きのバーは、未封入のビタミンＢ₁（ＶＢ₁）による結果を示し、黒いバーは、Ｒ８表出脂質ナノ粒子による結果を示し、斜線のバーは、Ｒ８／ＰＲ ａｐｔａｍｅｒ表出ナノ粒子による結果を示す。

【図7】図７は、ＬＳ^NDS細胞に対して未封入のビタミンＢ₁（ＶＢ₁）、Ｒ８表出脂質ナノ粒子、Ｓ２ペプチド表出脂質ナノ粒子を接触させた後の各成分の細胞内への取込み量を評価した結果を示す。

【図8】図８は、ＬＳ^NDS細胞に対して、未封入のビタミンＢ₁（ｆｒｅｅＢ₁）、空のＲ８表出脂質ナノ粒子、空のＳ２ペプチド表出ナノ粒子、ビタミンＢ₁を含むＲ８表出脂質ナノ粒子、およびＳ２ペプチド表出ナノ粒子を接触させた３時間後の細胞のＡＴＰ産生量を示す図である。結果は、未処理の細胞に対する比として表されている。＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝３）において有意差ｐ＜０．０５を有することを示す。

【図9】図９は、塩化カリウム投与による心停止の８分後に胸骨圧迫とエピネフリン投与により自己心肺の再開を誘発させ、再開１分後にＲ８表出脂質ナノ粒子またはＳ２ペプチド表出脂質ナノ粒子を投与したマウスの生存曲線を示す。横軸は心停止後の時間（日）である。

【図10】図１０は、心停止蘇生２４時間後の神経機能（意識、角膜反射、呼吸数、四肢運動協調性、活動性）の評点の合計値を示す。評点はそれぞれ、０、１または２の３段階（２点：正常、１点：正常より劣るが、低下した反応または動きが認められる、０点：反応または動きが認められないか著しく低下している）で評価した。

【図11】図１１は、心停止蘇生４８時間後の神経機能（意識、角膜反射、呼吸数、四肢運動協調性、活動性）の評点の合計値を示す。評点はそれぞれ、０、１または２の３段階（２点：正常、１点：正常より劣るが、低下した反応または動きが認められる、０点：反応または動きが認められないか著しく低下している）で評価した。

【図12】図１２は、両側総頚動脈閉塞（ＢＣＣＡＯ）モデルにおける一過性の虚血（６０分間）の後に、閉塞を解消して再灌流を誘導し、再灌流と同時にＲ８表出脂質ナノ粒子またはＰＥＧ化Ｒ８表出脂質ナノ粒子を投与したときの脳および肝臓への各粒子の蓄積量を示す。＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝３）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【図13】図１３は、ＤｉＤ（緑色）で蛍光標識されたＲ８表出脂質ナノ粒子およびＤｉＩ（赤色）で蛍光標識されたＰＥＧ化Ｒ８表出脂質ナノ粒子のＢＣＣＡＯモデルの脳組織内への蓄積を示すレーザー走査顕微鏡像である。

【図14】図１４は、Ｒ８表出脂質ナノ粒子またはＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子を投与したＢＣＣＡＯモデルの神経学的機能スコアの回復を示す。＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝５〜７）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【図15】図１５は、虚血再灌流および各脂質ナノ粒子投与１時間後のＢＣＣＡＯモデル群の区画間の移動回数の計数結果を示す。＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝５〜７）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【図16】図１６は、虚血再灌流およびＲ８表出脂質ナノ粒子または空の脂質ナノ粒子投与後のＢＣＣＡＯモデル群の神経学的機能スコアおよび体重の推移を示す。横軸は、時間（日）である。＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝５〜７）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【図17】図１７は、虚血再灌流および未封入のビタミンＢ₁（ｆｒｅｅＢ₁）、空のＲ８表出脂質ナノ粒子、ビタミンＢ₁を含むＲ８表出脂質ナノ粒子投与後のＢＣＣＡＯモデル群の生存曲線を示す。横軸は、時間（日）を示す。＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝５〜７）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【図18】図１８は、虚血再灌流および緩衝液またはＲ８表出脂質ナノ粒子投与８日後のマウスの各成分の濃度の測定結果を示す。＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝５〜７）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【図19】図１９は、虚血再灌流および緩衝液またはＲ８表出脂質ナノ粒子投与８日後のマウスの海馬ＣＡ１領域のヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色像およびＮｅｕＮ陽性細胞像を示す。

【図20】図２０は、虚血再灌流および緩衝液またはＲ８表出脂質ナノ粒子投与８日後のマウスの海馬ＣＡ１領域のＮｅｕＮ陽性細胞数を示す。＊＊は、ｎｒＡＮＯＶＡに続くＳＮＫ（ｎ＝５〜７）において有意差ｐ＜０．０１を有することを示す。

【本発明の具体的な説明】

【0008】

本発明によれば、水溶性化合物を含む脂質構造体（または脂質ナノ粒子）を含む組成物が提供される。上記組成物において、水溶性化合物を含む脂質ナノ粒子は分散質であり得、水系溶媒が分散質であり得る。上記脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、リン脂質を含む。上記脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、細胞透過性因子をさらに表出していてもよい。

【0009】

本発明では、リン脂質は、特に限定されないが例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１、２−ジミリストイル−１、２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等であることができる。リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、スフィンゴミエリンであることが好ましく、より好ましくはジオレイルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンであり得る。

【0010】

本発明では、リン脂質を含む脂質膜は、リン脂質に加えて荷電物質を含有することができ、荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与することができる、脂質膜の構成成分であり、脂質膜に含有される荷電物質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は０である。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。ある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）のゼータ電位が５ｍＶ以上、１０ｍＶ以上、１５ｍＶ以上、１６ｍＶ以上、１７ｍＶ以上、１８ｍＶ以上、１９ｍＶ以上、または２０ｍＶ以上、例えば、約２０ｍＶであり得る。

【0011】

本発明のある態様では、ミトコンドリア内への目的物質（水溶性化合物）の効果的な送達の観点では、リン脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとホスファチジン酸及び／又はスフィンゴミエリンであること（すなわち、ホスファチジン酸及びスフィンゴミエリンからなる群から選択される１以上のリン脂質と、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、を含むこと）が、好ましい。

【0012】

本発明では、膜透過性分子は、例えば、カチオン性のポリマーであり得る。膜透過性分子は、例えば、膜透過性ペプチドであり得る。膜透過性ペプチドは、ミトコンドリア内への目的物質の効果的な送達に有効な膜透過性ドメインである。膜透過性ペプチドは、特許文献１に記載の段落００５２〜００９２に記載の膜透過性ペプチドであることができ、好ましくは連続した４〜２０個のアルギニン残基からなるポリアルギニンペプチドである。ポリアルギニンペプチドは、好ましくは６〜１２個、さらに好ましくは７〜１０個の連続したアルギニン残基、または８個の連続したアルギニン残基からなる。膜透過性ペプチドは、脂質と連結させることができる。これにより、脂質膜構造体に膜透過性ペプチドを含有させ、かつ、膜透過性ペプチドを脂質膜構造体上に表出させることができる。ある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）のゼータ電位が５ｍＶ以上、１０ｍＶ以上、１５ｍＶ以上、１６ｍＶ以上、１７ｍＶ以上、１８ｍＶ以上、１９ｍＶ以上、または２０ｍＶ以上、例えば、約２０ｍＶであり得る。

【0013】

本発明のある態様では、上記脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を表出するものであってもよいが、好ましくはＰＥＧを表出するものではない。ポリエチレングリコールの表出は、脂質で修飾したＰＥＧ（脂質修飾ＰＥＧ）を下記で説明する脂質構造体（または脂質ナノ粒子）の調製時に脂質混合物に添加することによりなされ得る。脂質修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に脂質修飾した化合物であり、ポリエチレングリコールの分子量は、例えば３００〜１０、０００程度、好ましくは５００〜１０、０００程度、さらに好ましくは１、０００〜５、０００程度である。ＰＥＧの分子量は、数平均分子量で表される。脂質修飾ポリエチレングリコールとしては、例えば、ジオレオイルグリセロール修飾ＰＥＧ、ジラウロイルグリセロール修飾ＰＥＧ、ジミリストイルグリセロール修飾ＰＥＧ、ジパルミトイルグリセロール修飾ＰＥＧ、ジステアロイルグリセロール修飾ＰＥＧ等であることができる。脂質修飾ポリエチレングリコール（脂質修飾ＰＥＧ）は、より具体的には、例えば、ステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸ＰＥＧ４５（ＳＴＲ−ＰＥＧ４５）など）を用いることができる。その他、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００］−１、２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００］−１、２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０］−１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００］−１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−［カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００］−１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンなどのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできる。

【0014】

本発明のある態様では、細胞膜透過性を高めるために、細胞膜透過性ペプチドなどのカチオン性のポリマー（例えば、カチオン性アミノ酸のポリマー、例えば、ポリアルギニンまたはポリリジン）を表出していてもよい。カチオン性のポリマーを脂質膜構造体に表出させるためには、カチオン性のポリマーと脂質（特に限定されないが例えば、ミリストイル基）とのコンジュゲートを作製し、当該コンジュゲートの脂質部分で脂質膜構造体にアンカーさせることによって、カチオン性ポリマーを安定的に脂質膜構造体に表出させることができる。膜透過性ペプチドとしては、ｔａｔペプチド（ヒト免疫不全ウイルスのｔａｔタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＦ３５３６２．１のアミノ酸配列の４８〜６０位に対応するペプチド配列を有する）、オリゴアルギニン（Ｒ９）、オリゴリジン（Ｋ１０）などの塩基性アミノ酸に富むペプチド、ペネトラチンなどの塩基性部分と疎水性部分とを有する両親媒性ペプチド、トランスポーチン、ＴＰ１０などのペプチドが挙げられる。膜透過性ペプチドであって、ミトコンドリア指向性を有するペプチドとしては、オクタアルギニン（Ｒ８）、親油性トリフェニルホスホニウムカチオン（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｃａｔｉｏｎ；ＴＰＰ）若しくはローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）１２３などの脂溶性カチオン物質、ミトコンドリア標的配列（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＭＴＳ）ペプチド（Ｋｏｎｇ，ＢＷ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ２００３，１６２５，ｐｐ．９８−１０８）若しくはＳ２ペプチド（Ｓｚｅｔｏ，Ｈ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． ２０１１，２８，ｐｐ．２６６９−２６７９）などのポリペプチドが挙げられる。ある好ましい態様では、細胞透過性ペプチドは、オクタアルギニン（Ｒ８）またはＳ２ペプチドであり得、より好ましくはＳ２ペプチドであり得る。ここでＳ２ペプチドとしては、Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−ＦＫ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−ＦＫ−ＮＨ₂｛ここで、Ｄｍｔは、２，６−ジメチルチロシンであり、Ｄ−ＡｒｇはＤ体のアルギニンであり、Ｆは、Ｌ体のフェニルアラニンであり、Ｋは、Ｌ体のリジンである｝が挙げられる。ある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）のゼータ電位が５ｍＶ以上、１０ｍＶ以上、１５ｍＶ以上、１６ｍＶ以上、１７ｍＶ以上、１８ｍＶ以上、１９ｍＶ以上、または２０ｍＶ以上、例えば、約２０ｍＶであり得る。

【0015】

ある好ましい態様では、本発明の分散体は、分散媒中に、製造途上で用いられ得るアルコールを１％未満、０．５％未満、０．１％未満、または０．０５％未満しか含まないか、またはアルコールを含まない。製造途上で用いられ得るアルコールを含まない分散体を得るためには、例えば、分散体をアルコールを含有しない透析外液で透析することができる。透析外液は、例えば、生理食塩水などの水溶液であり得る。

【0016】

ある好ましい態様では、上記脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、ＤＬＳ法で測定した粒径において１５０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１３０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、好ましくは５５ｎｍ以下、または、より好ましくは５０ｎｍ以下の脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）を含み得る。当該脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）は、ＤＬＳ法で測定した粒径において、１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、または５０ｎｍ以上であり得る。

【0017】

ある好ましい態様では、上記脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）の数平均粒径は、例えば、３０ｎｍ以上、３５ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、４５ｎｍ以上、または５０ｎｍ以上であり得、１５０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１３０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１１０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９５ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８５ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７５ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６５ｎｍ以下、または６０ｎｍ以下であり得る。数平均粒径は、ある態様では、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ以下、例えば、５０ｎｍ〜１００ｎｍであり得る。粒径は上述の通り、ＤＬＳ法により求められる粒径であり得る。

【0018】

ある好ましい態様では、上記脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）は、ＤＬＳ法によって求められる多分散性指数（ＰＤＩ）が、０．５以下、０．４５以下、０．４以下、０．３５以下、０．３以下、０．２５以下、または０．２以下であり得る。ＰＤＩは、１を最大とし、数値が小さくなるほど粒径が均一になる（粒径分布がシャープになる、及び／又は、単分散になる）ことを意味する。本発明のある好ましい態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）のＰＤＩは、０．３以下である。

【0019】

本発明のある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）は、
ＤＬＳ法によって測定される粒径が、３０ｎｍ〜１５０ｎｍであり、
ＤＬＳ法によって求められるＰＤＩが、０．３以下である、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）を含む。ここで上記粒径は、例えば、３０ｎｍ〜４０ｎｍ、４０ｎｍ〜１５０ｎｍ、４０ｎｍ〜１４０ｎｍ、４０ｎｍ〜１３０ｎｍ、４０ｎｍ〜１２０ｎｍ、４０ｎｍ〜１１０ｎｍ、４０ｎｍ〜１００ｎｍ、４０ｎｍ〜９０ｎｍ、４０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、４０ｎｍ〜６０ｎｍ、４０ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１４０ｎｍ、５０ｎｍ〜１３０ｎｍ、５０ｎｍ〜１２０ｎｍ、５０ｎｍ〜１１０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜９０ｎｍ、５０ｎｍ〜８０ｎｍ、５０ｎｍ〜７０ｎｍ、５０ｎｍ〜６０ｎｍ、６０ｎｍ〜１５０ｎｍ、６０ｎｍ〜１４０ｎｍ、６０ｎｍ〜１３０ｎｍ、６０ｎｍ〜１２０ｎｍ、６０ｎｍ〜１１０ｎｍ、６０ｎｍ〜１００ｎｍ、６０ｎｍ〜９０ｎｍ、６０ｎｍ〜８０ｎｍ、または６０ｎｍ〜７０ｎｍであり得る。

【0020】

本発明のある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）は、
ＤＬＳ法によって測定される粒径が、３０ｎｍ〜１５０ｎｍであり、
ＤＬＳ法によって求められるＰＤＩが、０．３以下である、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）を５０％以上、６０％以上、７０％以上、または８０％以上含む。ここで上記粒径は、例えば、３０ｎｍ〜４０ｎｍ、４０ｎｍ〜１５０ｎｍ、４０ｎｍ〜１４０ｎｍ、４０ｎｍ〜１３０ｎｍ、４０ｎｍ〜１２０ｎｍ、４０ｎｍ〜１１０ｎｍ、４０ｎｍ〜１００ｎｍ、４０ｎｍ〜９０ｎｍ、４０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、４０ｎｍ〜６０ｎｍ、４０ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１４０ｎｍ、５０ｎｍ〜１３０ｎｍ、５０ｎｍ〜１２０ｎｍ、５０ｎｍ〜１１０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜９０ｎｍ、５０ｎｍ〜８０ｎｍ、５０ｎｍ〜７０ｎｍ、５０ｎｍ〜６０ｎｍ、６０ｎｍ〜１５０ｎｍ、６０ｎｍ〜１４０ｎｍ、６０ｎｍ〜１３０ｎｍ、６０ｎｍ〜１２０ｎｍ、６０ｎｍ〜１１０ｎｍ、６０ｎｍ〜１００ｎｍ、６０ｎｍ〜９０ｎｍ、６０ｎｍ〜８０ｎｍ、または６０ｎｍ〜７０ｎｍであり得る。

【0021】

本発明のある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）は、
ＤＬＳ法によって測定される粒径の数平均（数平均粒径）が、３０ｎｍ〜１５０ｎｍであり、
ＤＬＳ法によって求められるＰＤＩが、０．３以下である、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）を含む。ここで、数平均粒径は、ここで粒径は、例えば、３０ｎｍ〜４０ｎｍ、４０ｎｍ〜１５０ｎｍ、４０ｎｍ〜１４０ｎｍ、４０ｎｍ〜１３０ｎｍ、４０ｎｍ〜１２０ｎｍ、４０ｎｍ〜１１０ｎｍ、４０ｎｍ〜１００ｎｍ、４０ｎｍ〜９０ｎｍ、４０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、４０ｎｍ〜６０ｎｍ、４０ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１４０ｎｍ、５０ｎｍ〜１３０ｎｍ、５０ｎｍ〜１２０ｎｍ、５０ｎｍ〜１１０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜９０ｎｍ、５０ｎｍ〜８０ｎｍ、５０ｎｍ〜７０ｎｍ、５０ｎｍ〜６０ｎｍ、６０ｎｍ〜１５０ｎｍ、６０ｎｍ〜１４０ｎｍ、６０ｎｍ〜１３０ｎｍ、６０ｎｍ〜１２０ｎｍ、６０ｎｍ〜１１０ｎｍ、６０ｎｍ〜１００ｎｍ、６０ｎｍ〜９０ｎｍ、６０ｎｍ〜８０ｎｍ、または６０ｎｍ〜７０ｎｍであり得る。

【0022】

本発明では、水溶性化合物は、水系溶媒に対して溶解性を示す化合物、例えば、水溶性ビタミン（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））が挙げられる。

【0023】

本発明によれば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む脂質構造体（または脂質ナノ粒子）を含む組成物が提供される。上記組成物においては、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む脂質ナノ粒子は分散質であり得、水系溶媒が分散質であり得る。

【0024】

本発明のある態様では、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、中空であり得る。この中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、脂質二重膜の殻とその内部に水系溶媒を含み得る。

【0025】

本発明のある態様では、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、非中空であり得る。この非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、内部が脂質または脂質膜で充填されている。この態様において、ＤＬＳ法で測定される平均粒径が１００〜１５０ｎｍであり、ＰＤＩが０．３以下である脂質構造体（または脂質ナノ粒子）がより好ましく提供される。ＰＤＩは、０．１以上、０．１１以上、０．１２以上、０．１３以上、０．１４以上、０．１５以上、０．１６以上、０．１７以上、０．１８以上、０．１９以上、または０．２以上であり得、かつ０．３以下であり得る。

【0026】

本発明の水溶性化合物を含む脂質構造体（または脂質ナノ粒子）を含む組成物は、例えば、以下の製造方法によって製造され得る。具体的には、本発明の水溶性化合物を含む脂質構造体（または脂質ナノ粒子）を含む組成物の製造方法は、逆相蒸発法（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；またはＲＥＶ）法によって得ることができる。ＲＥＶ法では、脂質を含む有機相と水溶性化合物を含む水相とを混合し、混合物を超音波処理に供して、油中水滴型エマルション（ｗ／ｏエマルション）を形成させ、次いで有機溶媒を留去し、超音波処理にさらに供することによって脂質ナノ粒子を得ることができる。
すなわち、本発明の製造方法は、リン脂質を含む有機溶媒と水溶性化合物を含む水系溶媒とを混合することと、得られた混合物を超音波処理に供することと、得られたｗ／ｏエマルションからアルコールを留去することと、その後、アルコールが留去された組成物に超音波処理に供することとを含み得る。上記において、リン脂質を含むアルコール溶液と水溶性化合物を含む水系溶媒とを混合して得られた混合物を超音波処理に供することにより、ｗ／ｏエマルションが形成され得る。また、ｗ／ｏエマルションにおいて水滴は水溶性化合物を含み得る。

【0027】

本発明のある態様では、有機溶媒としては、アルコール（例えば、ｔ−ブタノール、１−プロパノール、２−プロパノール及び２−ブトキシエタノール）を用いることができる。本発明のある態様では、水系溶媒としては、水を用いることができる。水系溶媒は、緩衝剤、および塩などの生理的にまたは薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。本発明のある態様では、水系溶媒は、緩衝液（ｐＨ７〜８、例えば、ｐＨ７．２〜７．６、特に約ｐＨ７．４）であり得、例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７〜８、例えば、ｐＨ７．２〜７．６、特に約ｐＨ７．４）であり得る。

【0028】

本発明のある態様では、水溶性化合物は、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）である。リン脂質を含む有機溶媒中のリン脂質濃度は、例えば、３ｍＭ以上、３．５ｍＭ以上、４ｍＭ以上、４．５ｍＭ以上、５ｍＭ以上、または５．５ｍＭ以上であり得、例えば、５．５ｍＭであり得る。リン脂質は、好ましくは、ホスファチジン酸及びスフィンゴミエリンからなる群から選択される１以上のリン脂質と、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとを含み得る。ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）は、好ましくは、３ｍＭ以下の濃度で水相に含まれ得る。このようにすることで、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）が得られ得る。得られた非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、例えば、ＤＬＳ法で測定したときの平均粒径が１００ｎｍ〜１５０ｎｍであり得、ＰＤＩが０．３以下であり得る。この態様において、得られた非中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、数値が大きいほど好ましく、例えば、０．０３以上、０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上、０．１１以上、または０．１２以上であり得る。ＶＢ₁／脂質（重量比）の上限は、例えば、０．３、０．３５または０．４程度であり得る。得られた非中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、例えば、０．０４〜０．１５であり得る。得られた非中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、例えば、０．０４〜０．１であり得る。得られた非中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、例えば、０．１〜０．１５であり得る。

【0029】

本発明のある態様では、水溶性化合物は、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）である。リン脂質を含む有機溶媒中のリン脂質濃度は、例えば、３ｍＭ未満、２．５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、または１．５ｍＭ以下であり得、例えば、１．４ｍＭ（例えば、１．３８ｍＭ）であり得る。リン脂質は、好ましくは、ホスファチジン酸及びスフィンゴミエリンからなる群から選択される１以上のリン脂質と、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとを含み得る。ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）は、好ましくは、２〜５ｍＭの濃度で水相に含まれ得る。このようにすることで、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）が得られ得る。得られた中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、例えば、ＤＬＳ法で測定したときの平均粒径が１００ｎｍ〜１５０ｎｍであり得、ＰＤＩが０．３以下であり得る。本発明では、中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）であっても、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）の封入率に変わりは無い一方で、製造過程で用いる脂質量を低減することができる。したがって、本発明では、このようにして得られ得る中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）は、製造上のメリットを有する。この態様において、得られた中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、数値が大きいほど好ましく、例えば、０．０３以上、０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０７以上、０．０８以上、０．０９以上、０．１以上、０．１１以上、０．１２以上、０．１３以上、０．１４以上、０．１５以上、０．１６以上、０．１７以上、０．１８以上、０．１９以上、または０．２０以上であり得る。ＶＢ₁／脂質（重量比）の上限は、例えば、０．３、０．３５または０．４程度であり得る。得られた中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、例えば、０．１〜０．４であり得る。得られた中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、例えば、０．２〜０．３であり得る。得られた中空の脂質構造体におけるＶＢ₁／脂質（重量比）は、例えば、０．１〜０．２であり得る。

【0030】

本発明によれば、水溶性化合物を含む中空のまたは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物は、医薬として製剤化され得る。したがって、医薬製剤が提供される。本発明の医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでいてもよい。賦形剤としては、特に限定されないが、緩衝剤、等張化剤、薬学的に許容可能な塩、分散剤、抗酸化剤、保存剤、および無痛化剤が挙げられる。

【0031】

本発明の組成物は、化粧品またはサプリメントとして調製され得る。したがって、本発明によれば、本発明の組成物を含む化粧品およびサプリメントが提供され得る。

【0032】

本発明において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、ミトコンドリアに機能異常（特に機能低下）を有する対象に投与され得る。ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、ミトコンドリアに機能異常（特に機能低下）を有する対象において、ミトコンドリア機能を向上させること（またはＡＴＰ産生を増強すること）に用いられ得る。

【0033】

本発明において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、虚血性疾患を有する対象に投与され得る。虚血性疾患としては、虚血性脳疾患（例えば、脳梗塞）および虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞、心不全）が挙げられる。本発明において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、虚血性疾患を有する対象において虚血再灌流傷害を処置することに用いられ得る。本明細書では、「対象」は、動物、特に哺乳動物、特に霊長類、特に好ましくはヒトであり得る。

【0034】

本発明において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、神経変性疾患を有する対象に投与され得る。神経変性疾患としては、アルツハイマー病やパーキンソン病が挙げられる。本発明において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、神経変性疾患を有する対象において、低下するＡＴＰ産生または低下するＡＴＰ産生により引き起こされる症状を処置することに用いられ得る。

【0035】

本発明において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）欠乏症を有する対象に投与され得る。ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）欠乏症を有する対象としては、例えば、脚気を有する対象が挙げられる。本発明において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤は、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）欠乏症を有する対象において、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）の欠乏により引き起こされる症状を処置することに用いられ得る。

【0036】

本発明によれば、水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を投与する方法であって、対象に本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤を投与することを含む、方法が提供される。
本発明によれば、水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を対象の細胞内に送達する方法であって、対象に本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤を投与することを含む、方法が提供される。
本発明によれば、水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を対象の細胞内のミトコンドリアに送達する方法であって、対象に本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤を投与することを含む、方法が提供される。
本発明によれば、虚血性疾患を有する対象に水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を投与する方法であって、対象に本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤を投与することを含む、方法が提供される。
本発明によれば、虚血性疾患を有する対象において虚血性疾患を処置する方法であって、対象に本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤を投与することを含む、方法が提供される。
本発明によれば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）欠乏症（例えば、脚気）を有する対象を処置する方法であって、対象に本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む組成物または医薬製剤を投与することを含む、方法が提供される。

【0037】

本発明によれば、本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む医薬製剤の製造における水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））の使用が提供される。
本発明によれば、本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む医薬製剤の製造におけるリン脂質の使用が提供される。
本発明によれば、本発明の水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））を含む中空の若しくは非中空の脂質構造体（または脂質ナノ粒子）またはこのいずれか若しくは両方を含む医薬製剤の製造における水溶性化合物（例えば、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁））およびリン脂質の使用が提供される。

【0038】

実施例１：培養細胞中のミトコンドリアへのビタミンＢ₁の送達
本実施例では、ビタミンＢ₁（ＶＢ₁）を細胞内のミトコンドリアに送達する系を構築した。

【0039】

＜準備するもの＞
□脂質溶液（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）を９：２のモル比で含むエタノール溶液）
ＤＯＰＥ： １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＳＭ： スフィンゴミエリン
ＤＭＧ−ＰＥＧ ２０００： １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール， メトキシポリエチレングリコール ２０００
□ＥｔＯＨ
□ＰＢＳ（−）
□２０ ｍｇ／ｍＬ ＳＴＲ−Ｒ８を含むエタノール溶液
ＳＴＲ−Ｒ８： ステアリル化Ｒ８
□透析膜 Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ４ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ （ＭＷＣＯ １２ｋ−１４ｋ、 Ｓｐｅｃｔｒａｍ Ｌａｂｐｒａｔｏｒｉｅｓ）
□１ ｍＬ、 ２．５ ｍＬガラスシリンジ（ＨＡＭＩＬＴＯＮ）
□シリンジポンプＳｔａｎｄａｒｄ ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｏｎｌｙ Ｐｕｍｐ １１ Ｅｌｉｔｅ（ＨＡＲＶＡＲＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ）
□透析膜クリップＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｃｌｏｓｕｒｅｓ

【0040】

１−１．ＶＢ₁を内包した脂質ナノ粒子の調製
ＶＢ₁としては、チアミン塩化物塩酸塩（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社、製品番号：Ｃ８７５４）を用いた。ＶＢ₁を脂質ナノ粒子に内包させ、ステアリルアルギニン８重合体（ＳＴＲ−Ｒ８）を用いてミセルにＲ８を表出させた。
脂質ナノ粒子作製は、単純水和法およびＲｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＲＥＶ）法により行い、脂質濃度をそれぞれ０．５５ｍＭ、および５．５ｍＭとし、ＶＢ₁濃度を１〜５ｍＭとして小胞を形成させた。

【0041】

単純水和法では、試験管に脂質溶液を添加した後に、溶媒を除去して試験管内壁に脂質膜を形成させた。その後、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＶＢ₁を試験管に添加した。その後、超音波処理を行うことによってＶＢ₁を内包した脂質ナノ粒子（単純水和法）を得た。
ＲＥＶ法では、試験管に脂質溶液と１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＶＢ₁を添加し、混合した上で超音波処理を行って試験管内で油中水滴（ｗ／ｏ）型エマルションを形成させた。得られたｗ／ｏエマルションに対してＮ₂置換によって溶媒を留去した。その後、超音波処理を行うことでＶＢ₁を内包した脂質ナノ粒子（ＲＥＶ法）を得た。
得られた脂質ナノ粒子を動的光散乱法によりＺＥＴＡ ＳＩＺＥＲ Ｎａｎｏ−ＺＳ （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ， ＵＫ） を用いて粒子径（ｎｍ）と多分散指数（ＰＤＩ）を測定した。

【0042】

結果は、図１に示されるとおりであった。図１に示されるように、いずれのＶＢ₁濃度においても良好な粒径およびＰＤＩを有する脂質ナノ粒子が得られたが、単純水和法ではＶＢ₁濃度が２ｍＭ以下の系において、ＲＥＶ法ではＶＢ₁濃度が３ｍＭ以下の系において０．３未満の特に良好なＰＤＩを有する粒子が得られていることが明らかとなった。

【0043】

１−２．脂質ナノ粒子におけるＶＢ₁の封入率
単純水和法とＲＥＶ法で調製した脂質ナノ粒子におけるＶＢ₁の封入率の評価のため、超遠心による精製を行った。７４，０００×ｇで超遠心すると、ＶＢ₁を封入した脂質ナノ粒子およびＶＢ₁を封入していない脂質ナノ粒子は沈殿してペレットを形成するが、封入されていない遊離形態のＶＢ₁は沈殿せず上清に残る。したがって、これらを分離し精製することができる。超遠心（７４，０００×ｇ，２０分，４℃）を３回行い精製した後に、回収した粒子を１０％ ＳＤＳ処理によって破壊し、粒子の脂質回収率（％）、ＶＢ₁の回収率（％）、およびＶＢ₁の封入率（％）を算出した。各数値は以下の式（１）〜（３）からそれぞれ算出した。また、数値の算出の場合のみ脂質膜に０．１モル％ ニトロベンゾオキサジアゾールで標識したＤＯＰＥ（ＮＢＤ−ＤＯＰＥ）で蛍光を付与した。

【0044】

【数1】

【0045】

ＶＢ₁は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）条件下では２３３ｎｍと２６６ｎｍに二つの吸収極大波長を有する。本実施例では、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）条件下で２６６ｎｍの波長における吸光度を測定してＶＢ₁濃度を求めた。

【0046】

１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中に含有させるＶＢ₁濃度を２ｍＭとした。単純水和法およびＲＥＶ法によって上述の通りに脂質ナノ粒子を調製し、粒子の脂質回収率（％）、ＶＢ₁の回収率（％）、およびＶＢ₁の封入率（％）を算出した。

【0047】

結果は、表１に記載される通りであった。

【0048】

【表1】

【0049】

図１および表１に示されるように、脂質濃度０．５５ｍＭでは、単純水和法およびＲＥＶ法のいずれでもＰＤＩが０．３以下の均質な脂質ナノ粒子が形成された。これに対して、脂質濃度５．５ｍＭでは、ＲＥＶ法では脂質ナノ粒子が形成されたのに対して、単純水和法では、調整中に凝集が生じてしまい、脂質ナノ粒子を得ることはできなかった。ところで、ＶＢ₁の封入率（％）に注目すると、ＲＥＶ法で脂質濃度５．５ｍＭの場合には、２６％が脂質ナノ粒子に封入（内包）できたことが明らかとなった。この封入率は、単純水和法およびＲＥＶ法の脂質濃度０．５５ｍＭ条件下での封入率（それぞれ、２．４％および５．４％）よりも大きな率であった。このことから、ＶＢ₁のような水溶性化合物を内包した脂質ナノ粒子を得るには、ＲＥＶ法を用い、かつ脂質濃度を５．５ｍＭの条件で調製することがよいことが明らかになった。

【0050】

１−３Ａ．脂質ナノ粒子におけるのＶＢ₁の封入率とＶＢ₁／脂質比（重量／重量比）
さらに、脂質濃度５．５ｍＭの条件下で、様々な濃度のＶＢ₁を含むＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてＲＥＶ法によって脂質ナノ粒子を作製した。上記と同様に、ＶＢ₁の脂質ナノ粒子への封入率（％）を求めた。また、ＶＢ₁／脂質比（重量／重量比）を以下の式（４）にしたがって求めた。

【0051】

【数2】

【0052】

結果は、図２Ａに示される通りであった。図２Ａに示されるように、ＶＢ₁濃度を高めても脂質ナノ粒子に対するＶＢ₁の封入率は向上しなかった。一方で、ＶＢ₁／脂質比は、ＶＢ₁濃度を高めると向上することが明らかとなった。

【0053】

さらに、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中のＶＢ₁濃度が２ｍＭである条件下で、様々な濃度の脂質を含む脂質相を用いて脂質ナノ粒子を調製し、上記の通りにＶＢ₁の脂質ナノ粒子への封入率（％）とＶＢ₁／脂質比（重量／重量比）を求めた。結果は、図２Ｂに示される通りであった。図２Ｂに示されるように、脂質濃度を１．３８ｍＭまで低下させてもＶＢ₁の脂質ナノ粒子への封入率（％）は低下しなかった。一方で、脂質濃度を１．３８ｍＭまで低下させると、ＶＢ₁／脂質比（重量／重量比）は向上した。このとき、ＤＬＳ法による平均粒径は１２５±８ｎｍであり、ＰＤＩは０．２８±０．１０であった。
また、調製時の脂質濃度５．５ｍＭ、２．７５ｍＭおよび１．３８ｍＭのぞれぞれのケースにおいて得られた脂質ナノ粒子における透析後のＶＢ₁／脂質（重量比）を求めた。脂質濃度が５．５ｍＭの時ではＶＢ₁／脂質（重量比）は０．０６０であり、脂質濃度が２．７５ｍＭの時ではＶＢ₁／脂質（重量比）は０．１２４であり、脂質濃度が１．３８ｍＭの時ではＶＢ₁／脂質（重量比）は０．２３であった。ＶＢ₁／脂質（重量比）は、０．０５以上が好ましく、０．１以上は特に好ましい数値である。

【0054】

ＶＢ₁が脂質ナノ粒子の水層にのみ取り込まれるとすると、ＶＢ₁濃度を増加させると封入されないＶＢ₁が増加するため、封入率は低下し、ＶＢ₁／脂質比は低下すると考えられる。しかしながら、上記の実験においては、ＶＢ₁濃度を増加させても封入率は低下せず、ＶＢ₁／脂質比は増加した。これは、正電荷を有するＶＢ₁が脂質ナノ粒子のリン脂質を含む脂質膜構造と相互作用し、粒子形成に影響を与えた結果であると考察される。なお、ＲＥＶ法において、ＶＢ₁非存在下で脂質濃度０．５５ｍＭの条件下では、ｗ／ｏエマルションは形成されず、粒子形成ができなかったことから、ＶＢ₁は脂質ナノ粒子形成時に、脂質と相互作用し、その粒子形成に影響を与えていることが示唆される。
電荷を有しない水溶性化合物や負電荷を有する水溶性化合物では、脂質膜構造との相互作用を考える必要はないであろう。

【0055】

１−３Ｂ．得られた脂質ナノ粒子の構造の検討
ネガティブ染色法を用いて常法により透過電子顕微鏡下で得られた脂質ナノ粒子を観察した。結果は図３に示される通りであった。図３に示されるように、脂質濃度５．５ｍＭの条件下で調製した脂質ナノ粒子は、粒子内部まで脂質が充填していた（図３パネルＡ）のに対して、脂質濃度１．３８ｍＭの条件下で調製した脂質ナノ粒子は、リポソーム様の中空のナノ粒子であることが明らかとなった（図３パネルＢ）。ＶＢ₁は水溶性にもかかわらず、脂質濃度５．５ｍＭの条件下で調製した脂質ナノ粒子への封入率が高かったことから、ＶＢ₁は脂質膜に取り込まれている可能性が示唆される。

【0056】

１−４．得られた脂質ナノ粒子の細胞内への送達アッセイ
本アッセイ系では、ＲＥＶ法においてＶＢ₁を２ｍＭ、脂質濃度を１．３８ｍＭとして調製した脂質ナノ粒子を用いた。
神経芽細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における脂質ナノ粒子の細胞内導入能をフローサイトメーターによって評価した。脂質ナノ粒子を蛍光観察するために、脂質相に０．５モル％ＮＢＤ−ＤＯＰＥを添加した。また、脂質ナノ粒子の細胞取込み能を向上させるために、ＳＴＲ−Ｒ８及び／またはステアリル化したミトコンドリア移行性アプタマーを脂質相に添加し、ＲＥＶ法で脂質ナノ粒子を形成させた。得られた脂質ナノ粒子をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加し、１時間インキュベートした後に、細胞を回収し、細胞内に取り込まれた脂質ナノ粒子の蛍光に基づいてフローサイトメーターにより細胞を測定した。ミトコンドリア移行性アプタマーとしては、ＲＮａｓｅ Ｐ ａｐｔａｍｅｒ （ＲＰ ａｐｔａｍｅｒ） ［５’− ＵＣＵＣＣＣＵＧＡＧＣＵＵＣＡＧＧ −３’］を使用した。結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、ＳＴＲ−Ｒ８を添加して調製した脂質ナノ粒子は、その細胞内導入能を大きく向上させた。また、アプタマーをさらに添加して調製した脂質ナノ粒子では、その細胞内導入能をさらに大きく向上させた。Ｒ８とＲＰ ａｐｔａｍｅｒによる脂質ナノ粒子の表面修飾は、協調して粒子の細胞内導入能を向上させており、他の群に対して有意であった。

【0057】

さらに、脂質ナノ粒子を取り込ませた細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察した。脂質ナノ粒子は、ＮＢＤに由来する蛍光（緑色）に基づいて検出し、ミトコンドリアは、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（赤色）により染色した。結果は図５Ａに示される通りであった。図５Ａに示されるように、未修飾の脂質ナノ粒子よりも修飾した脂質ナノ粒子の方が多く細胞内に取り込まれていた。また、脂質ナノ粒子のミトコンドリアへの局在（黄色）が確認された。

【0058】

Ｒ８及び／またはＲＰ ａｐｔａｍｅｒによる脂質ナノ粒子の表面修飾が、脂質ナノ粒子のミトコンドリアへの移行性に影響しているかを確認するために、以下の式（５）によりミトコンドリア移行率を算出した。

【0059】

【数3】

【0060】

上記式中、黄色の面積は、ミトコンドリアと脂質ナノ粒子が重なった部分の面積であり、緑色の面積は、脂質ナノ粒子の観察される面積である。これは、細胞内に導入された脂質ナノ粒子のうちミトコンドリアに局在する粒子の量に相当する。また、ミトコンドリア占有率（％）は、以下式（６）により算出した。

【0061】

【数4】

【0062】

結果は、図５Ｂに示される通りであった。図５Ｂに示されるように、ミトコンドリア移行率およびミトコンドリア占有率において、Ｒ８修飾によってミトコンドリアへの脂質ナノ粒子の移行が促進され、ＲＰ ａｐｔａｍｅｒによりミトコンドリアへの移行がさらに促進されることが認められた。

【0063】

１−５．細胞に送達されたＶＢ₁による細胞機能の亢進の評価アッセイ
細胞内では、ＶＢ₁は、ペントースからグリセルアルデヒド３リン酸への変換、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの変換、およびＴＣＡサイクルにおいてα−ケトグルタル酸からコハク酸ＣｏＡへの変換を触媒する酵素に作用し、これらの反応を活性化させることによって、細胞内のＡＴＰ産生を促進する。本実施例では、細胞内に導入されたＶＢ₁が細胞内で細胞機能を亢進させることができるかをＡＴＰ産生の評価系において確認した。
実験では、１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８、または１０モル％ＳＴＲ−Ｒ８と２モル％ＳＴＲ−ＲＰ ａｐｔａｍｅｒ（ＳＴＲ−ＲＰ）を用いてミトコンドリア移行性を高めた脂質ナノ粒子（それぞれＲ８表出脂質ナノ粒子およびＲ８／ＲＰ表出脂質ナノ粒子という）を用いた。細胞としては、神経芽細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いた。細胞に対して、ＶＢ₁、Ｒ８表出ナノ粒子、Ｒ８／ＲＰ表出ナノ粒子をＶＢ１当量でそれぞれ１０μＭまたは２０μＭとなるように細胞に添加し、１時間〜６時間後のＡＴＰ産生量を測定した。ＡＴＰ産生量の評価には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いた。結果は、各時間の未処理細胞（陰性対照）に対する割合で表示した。結果は、図６に記載される通りであった。

【0064】

図６に記載されるように、Ｒ８表出脂質ナノ粒子も、Ｒ８／ＲＰ表出ナノ粒子も、細胞のＡＴＰ産生量を増加させることが明らかとなった（図中、白抜きのバーは、未封入のビタミンＢ１（ＶＢ１）による結果を示し、黒いバーは、Ｒ８表出脂質ナノ粒子による結果を示し、斜線のバーは、Ｒ８／ＰＲ ａｐｔａｍｅｒ表出ナノ粒子による結果を示す。）。Ｒ８表出脂質ナノ粒子処理細胞とＶＢ₁処理細胞のＡＴＰ産生量を比較する実験を行った。するとＲ８表出脂質ナノ粒子処理細胞は、１０μＭ以上で細胞のＡＴＰ産生量を大きく向上させることができたが、ＶＢ₁処理細胞では、１０ｍＭでも細胞のＡＴＰ産生量を有意に向上させることはできなかった。このことから、Ｒ８表出脂質ナノ粒子は、ＶＢ₁を１０００倍以上効果的に細胞内に導入し、細胞内で機能させることが明らかである。

【0065】

従来のＶＢ₁治療薬の難点として、ＶＢ₁が細胞内に取り込まれ難いことに加えて、ＶＢ₁が細胞に取り込まれたとしても細胞外に排出され、細胞内に蓄積しにくいことが指摘されている。本発明の脂質ナノ粒子は、ＡＴＰ産生を現に向上させる能力を有しており、この問題を解決し得るものとなる。

【0066】

１−６．ミトコンドリア疾患細胞に対するＶＢ₁の導入アッセイ
ミトコンドリア病患者由来皮膚細胞であるＬＳ^ND3細胞は呼吸鎖複合体Ｉのサブユニット３に異常を有し、これによって電子伝達系が正常に機能せず、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生能が低下した細胞である。ＬＳ^ND3細胞に対して、ＶＢ₁を内包した脂質ナノ粒子（未修飾）、１０モル％のＳＴＲ−Ｒ８を導入したＲ８表出脂質ナノ粒子、または１０モル％ＳＴＲ−Ｓ２を導入したＳ２表出脂質ナノ粒子を接触させて、細胞内への取込み量を確認した。ＳＴＲ−Ｓ２は、Ｓ２ペプチド（Ｄｍｔ−_D−Ａｒｇ−ＦＫ−Ｄｍｔ−_D−Ａｒｇ−ＦＫ−ＮＨ₂）（Ｓｚｅｔｏ，Ｈ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ． ２０１１，２８，ｐｐ．２６６９−２６７９）をステアリル化したものを意味し、脂質相に添加して、Ｓ２表出脂質ナノ粒子を作製した。細胞内への脂質ナノ粒子の取込みは上記の通り０．５モル％のNBD−ＤＯＰＥを各脂質ナノ粒子に導入することにより、ナノ粒子を蛍光標識し、これをフローサイトメーターにより検出することによって測定した。結果は、図７に記載される通りであった。

【0067】

図７に示されるように、未処理細胞（ＮＴ）に対して、未修飾脂質ナノ粒子は、若干の細胞内への導入を示したが、Ｒ８表出脂質ナノ粒子およびＳ２表出脂質ナノ粒子は、細胞内への導入効率が顕著に高かった。

【0068】

１−７．ミトコンドリア疾患細胞におけるＡＴＰ産生の回復アッセイ
ＬＳ^ND3細胞に対して、ＶＢ₁、またはＶＢ₁を内包したＲ８表出脂質ナノ粒子若しくはＳ２表出脂質ナノ粒子を接触させて、細胞内にＶＢ₁を取り込ませて細胞のＡＴＰ産生能を回復させた。接触させるＶＢ₁は、７μＭとなるようにそれぞれの添加量を調整した。添加３時間後のＡＴＰ産生量を測定した。結果は、未処理細胞に対するＡＴＰ産生量の比（％）によって示された。ＡＴＰ産生量の評価は、上記１−５と同様に行った。結果は、図８に記載される通りであった。
図８に示されるように、細胞のＡＴＰ産生量は、細胞にＶＢ₁を接触させるだけではほとんど増強されず、細胞にＶＢ₁を内包しない空のＲ８表出脂質ナノ粒子若しくはＳ２表出脂質ナノ粒子を接触させた場合にも増強されることはなかった。これに対して、細胞にＶＢ₁を内包したＲ８表出脂質ナノ粒子若しくはＳ２表出脂質ナノ粒子を接触させたときには、細胞のＡＴＰ産生能を有意に向上させた。

【0069】

２．インビボにおける治療実験
静脈投与した脂質ナノ粒子が効率的に脳へ到達するためには、粒子サイズの微小化が必要であると思われた。調製した脂質ナノ粒子をエクストゥルーダー（エクストルーダーＭｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ （ＡＶＡＮＴＩ ＰＯＬＡＲ−ＬＩＰＩＤＳ）、メンブレン ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ （Ｎｕｃｒｅｐｏｒｅ）（０．１μｍのサイズ））を用いて整粒し、数平均粒径において１５０ｎｍ程度の脂質ナノ粒子を１００ｎｍ程度に調整することに成功した。

【0070】

治療効果の検証
下記の手順で脳虚血モデルマウスを作成し、治療効果の検証を行った。マウスを１００％酸素下５％イソフルランによる全身麻酔下に気管挿管し、人工呼吸器を装着した。１．５〜２．０％の吸入イソフルラン濃度で麻酔を維持した。食道体温計を経口的に留置、観血的動脈圧を左大腿動脈より測定し、薬物投与経路として左大腿静脈に静脈路を確保した。また、経皮ニードルプローブを用いて心電図をモニターした。
塩化カリウム０．０８ｍｇ／ｇ体重を経静脈投与することにより心停止させ、人工呼吸器を停止した。
胸骨圧迫の３０秒前から１００％酸素による人工呼吸とエピネフリン０．６ μｇ／分での持続静注を開始した。心停止８分後より用手的胸骨圧迫３００〜３５０回／分を開始した。胸骨圧迫とエピネフリンの持続静注は、自己心拍再開まで継続した。洞調律と平均動脈圧４０ｍｍＨｇ以上を１０秒維持した時点を、自己心拍再開と定義した。自己心拍再開１分後に、ＶＢ₁を内包した脂質ナノ粒子を静脈投与した。ＶＢ₁を１０μｍｏｌ／ｋｇ相当、５μＬ／ｋｇの用量で経静脈的に投与した。食道温は、保温ランプを用いて、実験開始から蘇生開始１時間後まで、一貫して３７．２±０．１℃に維持した。胸骨圧迫開始１時間後に動静脈カテーテルを抜去し、モノフィラメント糸で閉創した。抜管後、術後鎮痛目的にブピバカイン（０．２５％、２ｍｇ／ｋｇ）とブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。手術終了から２時間は３０℃に保温したケージで経過観察した後、室温下のケージ内で飼育した。観察期間を１０日間とし、１０日目での両群の生存率を比較検証した。１０日間の生存率を確認後は速やかにペントバルビタールナトリウム１５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与により安楽死させた。結果は、図９に示される通りであった。図９に示されるように、Ｒ８表出脂質ナノ粒子もＳ２表出脂質ナノ粒子もマウスの生存曲線を改善した。特に短期における救命効果が高く、Ｒ８表出脂質ナノ粒子またはＳ２表出脂質ナノ粒子を用いたＶＢ₁の投与は、脳虚血疾患モデル動物において有効性が示された。

【0071】

さらに下記の手順で神経学的機能スコアを評価した。心停止蘇生２４時間および４８時間後の神経機能を５つのカテゴリ（意識、角膜反射、呼吸数、四肢運動協調性、活動性）で評価した（例えば、Ｍａｉｅｒ， Ｃ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｏｋｅ， ２９， ２１７１−２１８０，１９９８およびＡｂｅｌｌａ， Ｂ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０９， ２７８６−２７９１， ２００４）。角膜反射は、用手的にマウスを把持し、ティッシュのコヨリで角膜を軽く刺激して評価した。具体的には、以下の５つのカテゴリ：意識、角膜反射、呼吸数、四肢運動協調性、および活動性）について、０、１または２の３段階（２点：正常、１点：正常より劣るが、低下した反応または動きが認められる、０点：反応または動きが認められないか著しく低下している）で評価した。次に、５つの評点を加算して、神経学的機能スコアとした。その他の４項目については、マウスの拘束および苦痛は生じない。その結果、Ｒ８表出脂質ナノ粒子もＳ２表出脂質ナノ粒子もコントロール群と比較して神経スコアに大きな差が確認され治療効果があると示唆された（図１０および１１参照）。

【0072】

３．両側総頚動脈閉塞（ＢＣＣＡＯ）モデルにおける脳虚血再灌流に対するＶＢ１内包脂質ナノ粒子の治療効果
両側総頚動脈閉塞（ＢＣＣＡＯ）モデルは、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｊ、２０〜３０週齢、雄）の両頸動脈を一時的に閉塞させることで得られるモデルである。本実施例では、ＢＣＣＡＯモデルの脳において一過性の虚血（６０分間）を誘発させた後に、閉塞を解消して再灌流を誘導し、その際に生じる脳組織ダメージに対するＶＢ₁内包脂質ナノ粒子の効果を確認した。

【0073】

ＤＯＰＥ、ＳＭ、およびＳＴＲ−Ｒ８（ＤＯＰＥ：ＳＭ：ＳＴＲ−Ｒ８＝９：２：０．１）を含むエタノール溶液（総脂質濃度：２ｍＭ）を脂質層として用いる以外は上記と同様の条件で、Ｒ８表出脂質ナノ粒子を作製した。また、ＤＯＰＥ、ＳＭ、ＳＴＲ−Ｒ８、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ２ｋ（日油株式会社社製の製品番号ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ）（ＤＯＰＥ：ＳＭ：ＳＴＲ−Ｒ８：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ＝９：２：０．１：０．０３）を含むエタノール溶液（総脂質濃度：２ｍＭ）を脂質相として用い、２ｍＭ ＶＢ₁を含むＰＢＳ（−）を水相として用い、エタノール最終希釈濃度２０％の条件下にて上記実施例の通りにマイクロ流路デバイスを用いて脂質ナノ粒子（ＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子）を作製した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋは、脂質ナノ粒子の血中滞留性の向上のために用いられた。

【0074】

治療効果を確認するため、ＢＣＣＡＯモデルの虚血再灌流の１日後に得られた脂質ナノ粒子を投与し、投与１時間後および２４時間後の肝臓および脳組織における脂質ナノ粒子の移行量を確認した。具体的には、ＢＣＣＡＯモデル作製２４時間後において、脂質量に対し０．３モル％になるようにＤｉＩを修飾したＲ８表出脂質ナノ粒子（ＶＢ₁）およびＤｉＤを修飾したＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子（ＶＢ₁）をそれぞれ１００μＬ／匹の容積で静脈内に投与した。投与から１時間後および２４時間後にマウスから全血を採取し、右心耳を切除し、左心室からＰＢＳ（−）を５分間灌流した後、肝臓および脳を摘出した。摘出した組織を１％ＳＤＳで２０倍希釈した後、ジルコニウムビーズを加え、ホモジナイザーによって破砕した。その後遠心分離（１００００×ｇ、１０分、４℃）し、上清を採取した。上清に含まれるＤｉＩおよびＤｉＤの蛍光強度をＶａｒｉｏｓｋａｎＬＵＸ （Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定し、脳および肝臓への移行量を評価した。

【0075】

結果は、図１２に示される通りであった。図１２に示されるように、脂質ナノ粒子投与１時間後に、Ｒ８表出脂質ナノ粒子は脳において０．８ ＩＤ％／ｇ脳の蓄積量を示した。一方で、脂質ナノ粒子投与１時間後に、ＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子は脳において０．３ ＩＤ％／ｇ脳の蓄積量を示した。投与２４時間後には、Ｒ８表出脂質ナノ粒子およびＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子のいずれの脳の蓄積量も低下した。これに対して、肝臓組織への脂質ナノ粒子の蓄積量は、図１２に示されるように、投与１時間後および２４時間後において、ＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子の蓄積量は、他と比較して少なかった。

【0076】

次いで、投与１時間後のマウスの脳組織を共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、Ｒ８表出脂質ナノ粒子はＤｉＤで染色し、ＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子はＤｉＩで染色した。結果は、図１３に示される通りであった。図１３に示されるように、脳組織中にはＲ８表出脂質ナノ粒子が大量に蓄積していることが確認された。図１３中では、白い矢尻はＲ８表出脂質ナノ粒子の蓄積場所を示す。これに対して、ＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子は、脳移行量が少なく、蛍光観察によっては明確な蓄積を確認することができなかった。この結果は、図１２においてＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子がＲ８表出脂質ナノ粒子よりも脳における蓄積量が低いことと一致する結果である。

【0077】

上記Ｒ８表出脂質ナノ粒子またはＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子を投与したＢＣＣＡＯモデルの神経学的機能スコアを上記の通りに評価し、神経学的機能スコアを求めた。

【0078】

上記評価基準によると、健常マウスは通常１０の評点となる。モデルを作成し、１日後に神経学的機能スコアが５以下となった個体のみをＢＣＣＡＯモデル（各群でｎ＝５〜７）として用いた。１日後に、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ＶＢ₁を含むＨｅｐｅｓ緩衝液、ＶＢ₁を含まないＲ８表出脂質ナノ粒子、Ｒ８表出脂質ナノ粒子またはＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子をＢＣＣＡＯモデルマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。それぞれの時点での神経学的機能スコアは、図１４に示される通りであった。図１４に示されるように、Ｒ８表出脂質ナノ粒子は、ＢＣＣＡＯモデルマウスの神経学的スコアを２日目には大きく改善し、３日目にはさらに大きく改善した。
上記評価において、２日目における活動性評価の結果は図１５に示される通りであった。図１５に示されるように、５分間の活動性を区画間を移動した回数によって評価すると、Ｒ８表出脂質ナノ粒子では、区画移動回数が未処置（Ｓｈａｍ；虚血処置せず）マウス（非ＢＣＣＡＯモデル）と同等のレベルにまで回復した。ＰＥＧ−Ｒ８表出脂質ナノ粒子を投与したＢＣＣＡＯモデル群では、Ｈｅｐｅｓ緩衝液を投与したＢＣＣＡＯモデル群よりも区画移動回数の平均は大きかったが、その効果は小さかった。

【0079】

Ｒ８表出脂質ナノ粒子を投与したＢＣＣＡＯモデル群とＨｅｐｅｓ緩衝液を投与したＢＣＣＡＯモデル群の４日目移行の神経学的機能スコアおよび体重の推移を調べた。結果は、図１６に示される通りであった。図１６に示されるように、Ｒ８表出脂質ナノ粒子で処置されたＢＣＣＡＯモデル群では神経学的スコアが有意に改善していることが明らかである。また、Ｒ８表出脂質ナノ粒子で処置されたＢＣＣＡＯモデル群では、体重の低下が抑制された。

【0080】

次いで、８日目までのＢＣＣＡＯモデル群の生存率を調べた。その結果、図１７に示されるように、Ｒ８表出脂質ナノ粒子で処置されたＢＣＣＡＯモデル群ではすべてのマウスが生存した。これに対して、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で処置したＢＣＣＡＯモデル群、ＶＢ１を含むＨｅｐｅｓ緩衝液で処置されたＢＣＣＡＯモデル群、および、空の脂質ナノ粒子で処置された群では、死亡するマウスが認められた。

【0081】

さらに、８日目において、未処置（Ｓｈａｍ）マウス、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で処置したＢＣＣＡＯモデル群、およびＲ８表出脂質ナノ粒子で処置されたＢＣＣＡＯモデル群からそれぞれ採血し、カリウム濃度、ＡＳＴ濃度、ＡＬＴ濃度、ＬＤＨ濃度、およびＣＫ濃度を確認し、神経機能障害の程度を評価した。図１８に示されるように、カリウム濃度、ＡＳＴ濃度、ＡＬＴ濃度、ＬＤＨ濃度、およびＣＫ濃度のいずれにおいても、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で処置したＢＣＣＡＯモデル群では濃度が上昇するのに対して、Ｒ８表出脂質ナノ粒子で処置したＢＣＣＡＯモデル群では、その値が未処理群（Ｓｈａｍ）と同等程度まで低下した。このことから、ＶＢ１を内包したＲ８表出脂質ナノ粒子は、神経機能障害を回復させることが確認された。

【0082】

８日目において、未処置（Ｓｈａｍ）マウス、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で処置したＢＣＣＡＯモデル群、およびＲ８表出脂質ナノ粒子で処置されたＢＣＣＡＯモデル群から脳を回収し、海馬のＣＡ１領域を免疫組織化学染色に供した。ＢＣＣＡＯモデルでは、頸動脈の虚血により海馬のＣＡ１領域が主に損傷を受けるとされている。脳を常法に基づいて固定し、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ染色）またはＮｅｕＮ染色に供した。ＮｅｕＮ抗体は、ニューロンを染色する抗体として知られている。ＮｅｕＮ抗体としては、Ａｎｔｉ−ＮｅｕＮ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ａｂ１７７４８７、ａｂｃａｍ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＳＡ））を用い、二次抗体としてＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（Ｒ） ６４７ （ａｂ１５００７９、ａｂｃａｍ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＳＡ））を用いた。また、ＣＡ１領域におけるＮｅｕＮ陽性細胞の数を示すグラフを図２０に示した。

【0083】

結果は図１９および２０に示される通りであった。図１９および２０に示されるように、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で処置したＢＣＣＡＯモデル群では、ＮｅｕＮ陽性細胞が明らかに減少しており、虚血再灌流によってＣＡ１領域のニューロンが障害を受けて減少したことが明らかであったが、これに対してＲ８表出脂質ナノ粒子で処置したＢＣＣＡＯモデル群では、その減少が未処置群（Ｓｈａｍ）と同等のレベルにまで回復していることが明らかとなった。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]