特開 2021-172597 脂質ナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-172597(P2021-172597A)

(43)【公開日】2021年11月1日

(54)【発明の名称】脂質ナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/69 20170101AFI20211004BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20211004BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211004BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 31/44 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 31/47 20060101ALI20211004BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20211004BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/69

   A61K31/7105

   A61K31/713

   A61K48/00

   A61K47/22

   A61K9/14

   A61K9/127

   A61K47/24

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   A61K47/28

   A61K31/44

   A61K31/47

   A61P1/16

   A61P43/00 105

   A61K9/50

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2020-75619(P2020-75619)

(22)【出願日】2020年4月21日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）発行日 ２０１９年５月８日 刊行物 公益社団法人日本薬剤学会第３４年会 講演要旨集 第１４３ページ 公益社団法人日本薬剤学会第３４年会組織委員会（発行） ＜資 料＞公益社団法人日本薬剤学会第３４年会 講演要旨集 該当箇所抜粋 （２）開催日 ２０１９年５月１６日 集会名、開催場所 公益社団法人日本薬剤学会第３４年会 富山国際会議場・富山市民プラザ（富山市） ＜資 料＞公益社団法人日本薬剤学会第３４年会 開催概要ウェブページ ＜資 料＞公益社団法人日本薬剤学会第３４年会 発表資料 （３）発行日 ２０１９年８月１２日 刊行物 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第１６巻、第４０３１〜４０４４ページ ＜資 料＞Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第１６巻、第４０３１〜４０４４ページ （４）開催日 ２０１９年９月１６日 集会名、開催場所 Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｙｓ ２０１９ 国立大学法人北海道大学カンファレンスホール（札幌市） ＜資 料＞Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｙｓ ２０１９ プログラム及びアブストラクトの該当箇所 ＜資 料＞Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｙｓ ２０１９ 発表資料

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】100161207

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 和純

(74)【代理人】

【識別番号】100162868

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 英輔

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】原島 秀吉

(72)【発明者】

【氏名】マハモド アブバクル アハメド ヨニス

(72)【発明者】

【氏名】イブラヒム イクラミ アブデルラヒム カリル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA29

4C076AA61

4C076AA95

4C076CC16

4C076CC27

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4C076DD63F

4C076DD70

4C076EE23

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4C084AA13

4C084MA02

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4C084ZB26

4C084ZC20

4C086AA01

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4C086BC17

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4C086MA03

4C086MA05

4C086MA24

4C086MA38

4C086MA43

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA75

4C086ZB26

4C086ZC20

(57)【要約】

【課題】本発明は、肝細胞癌の治療に有用な、抗癌剤を搭載した脂質ナノ粒子を提供することを課題とする。
【解決手段】抗癌剤と、ＲＮＡ干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する低分子核酸と、下記一般式（１）［式中、とは、互いに独立して、炭素数１２〜２４の直鎖状の炭化水素基である。］で表される脂質と、癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドがポリエチレングリコールを介してリン脂質に結合しているＰＥＧ化リン脂質と、を含有しており、前記抗癌剤がソラフェニブである、脂質ナノ粒子。
［化１］

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗癌剤と、
ＲＮＡ干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する低分子核酸と、
下記一般式（１）

【化1】

［式（１）中、とは、互いに独立して、炭素数１２〜２４の直鎖状の炭化水素基である。］
で表される脂質と、
癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドがポリエチレングリコールを介してリン脂質に結合しているＰＥＧ化リン脂質と、
を含有しており、
前記抗癌剤が、ＡＴＣ分類がＬ０１ＸＥであるプロテインキナーゼ阻害剤であり、
前記癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１〜３個のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつ癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチド、又は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドである、脂質ナノ粒子。

【請求項2】

前記一般式（１）で表される脂質が、下記式で表される化合物である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【化2】

【請求項3】

前記癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドが、ポリエチレングリコールを介して、炭素数１２〜２４の脂肪酸残基を有するリン脂質に結合している、請求項１又は２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項4】

脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ＰＥＧ化リン脂質の量の割合が８〜１３モル％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項5】

脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記一般式（１）で表される脂質の量の割合が４０〜６０モル％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項6】

さらに、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン、及び卵黄由来ホスファチジルコリンからなる群より選択される１種以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項7】

さらに、前記癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドが結合していないポリアルキレングリコール修飾脂質を含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項8】

脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の量の割合が２〜４モル％である、請求項７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項9】

個数平均粒子径が１００ｎｍ以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項10】

前記低分子核酸が、ミッドカイン遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項11】

前記抗癌剤が、ソラフェニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ、又はカボザンチニブである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。

【請求項13】

肝細胞癌の治療に用いられる、請求項１２に記載の医薬用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝細胞癌の治療に有用な、抗癌剤を搭載した脂質ナノ粒子に関する。

【背景技術】

【0002】

肝細胞癌は、世界で５番目に多い癌であり、癌関連死の中で２番目に多い死因である。生命にかかわる病気であるにもかかわらず、その治療戦略は、肝臓切除や肝移植などの外科的介入に主に依存している。切除不可能な腫瘍の場合、基本的に放射線療法及び／又は化学療法である。放射線療法は、小さな限局性腫瘍に限定されており、大きな腫瘍や転移性腫瘍にはほとんどメリットがない。一方で、化学療法剤は、それらのオフターゲット毒性と化学療法抵抗性の発生が問題となる。

【0003】

肝細胞癌の治療に用いられる化学療法剤としては、例えば、キナーゼ阻害剤が挙げられる。中でも、複数のキナーゼに対して阻害活性を有するマルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブ（ＳＯＲ）は、切除不能であり、かつ薬剤耐性の肝細胞癌に対する治療剤として、ＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）の承認を受けている（非特許文献１）。

【0004】

近年では、遺伝子治療が癌治療に応用されるようになってきている。遺伝子治療では、例えば、内因性遺伝子が機能不全である場合に、健全に機能する正常な遺伝子を導入することや、病原性遺伝子や過剰発現した遺伝子をノックダウンすることが行われる。癌治療のための遺伝子治療の標的遺伝子として考えられている遺伝子の１つが、ミッドカイン（ＭＫ）遺伝子である。ミッドカインは、肝細胞癌及び他の悪性腫瘍で過剰発現されるヘパリン結合サイトカインであり、抗アポトーシス、分裂促進、血管新生、及び化学療法抵抗性等の機能に関与している（非特許文献２）。

【0005】

一方で、脂溶性薬物や、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）又はｍＲＮＡ等の核酸を封入し、標的細胞へ送達するためのキャリアとして、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が利用されている。例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸を効率的に標的細胞内へ送達するためのキャリアとなる脂質ナノ粒子として、ｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子が報告されている（非特許文献３、特許文献１）。また、肝臓特異的に高い遺伝子発現を示す脂質ナノ粒子も報告されている（非特許文献４）。

【0006】

薬効成分を標的の細胞へ送達するナノ粒子（薬剤キャリアナノ粒子）の小型化は、間質バリアを突破するための非常に有効な戦略である。ｓｉＲＮＡを標的の細胞へ送達する脂質ナノ粒子（ｓｉＲＮＡキャリア脂質ナノ粒子）においても同様の戦略が非常に有効であると考えられるが、ｓｉＲＮＡキャリア脂質ナノ粒子の粒子径を小さく制御することは技術的に難しい。近年、２液の瞬間混合を達成可能なマイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いることで直径３０ｎｍ程度の脂質ナノ粒子を再現良く製造可能であることが報告され（例えば、非特許文献５参照。）、製造そのものの技術的バリアは解消されつつある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２０１８／２３０７１０号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ziogas, et al., World journal of clinical oncology, 2017, vol.8 (3), p.203-213.

【非特許文献2】Takei and Kadomatsu, Midkine: From Embryogenesis to Pathogenesis and Therapy, 2012, p.225-236.

【非特許文献3】Sato, et al., Journal of Controlled Release, 2012, vol.163 (3), p.267-276.

【非特許文献4】Khalil et al., Journal of Controlled Release, 2011, vol.156(3), p.374-380.

【非特許文献5】Leung et al.，Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces，2012，vol.116(34)，p.18440-18450.

【非特許文献6】Lo, et al., Molecular cancer therapeutics, 2008, vol.7(3), p.579-589.

【非特許文献7】Warashina, et al., Journal of Controlled Release, 2016, vol.225, p.183-191.

【非特許文献8】Sakurai, et al., Molecular Therapy, 2013, vol.21(6), p.1195-1203.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

癌は単純な単一の疾患ではなく、実際には一群の疾患及び異常に基づくと考えられており、化学療法、遺伝子療法、免疫療法などの複数の治療法を組み合わせることによって、治療効果を最大化し、耐性メカニズムを克服し、副作用を軽減する試みがなされている。

【0010】

そこで、本発明は、化学療法と遺伝子治療を併用した肝細胞癌の治療剤として有用な脂質ナノ粒子を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、ソラフェニブとミッドカイン遺伝子を標的とした遺伝子治療を併用することが、肝細胞癌の治療に有効であること、肝細胞に高度に選択的なペプチドで修飾された脂質ナノ粒子が、肝細胞選択的に送達可能な送達キャリアとして優れていること、当該ペプチドで修飾されており、かつソラフェニブとミッドカイン遺伝子に対するｓｉＲＮＡの両方を担持する脂質ナノ粒子が、肝細胞癌に対して高い治療効果を奏することを見出し、本発明を完成させた。

【0012】

すなわち、本発明は、以下の脂質ナノ粒子等を提供するものである。
［１］ 抗癌剤と、
ＲＮＡ干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する低分子核酸と、
下記一般式（１）

【0013】

【化1】

【0014】

［式（１）中、とは、互いに独立して、炭素数１２〜２４の直鎖状の炭化水素基である。］
で表される脂質と、
癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドがポリエチレングリコールを介してリン脂質に結合しているＰＥＧ化リン脂質と、
を含有しており、
前記抗癌剤が、ＡＴＣ分類がＬ０１ＸＥであるプロテインキナーゼ阻害剤であり、
前記癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１〜３個のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつ癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチド、又は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドである、脂質ナノ粒子。
［２］ 前記一般式（１）で表される脂質が、下記式で表される化合物である、前記［１］の脂質ナノ粒子。

【0015】

【化2】

【0016】

［３］ 前記癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドが、ポリエチレングリコールを介して、炭素数１２〜２４の脂肪酸残基を有するリン脂質に結合している、前記［１］又は［２］に記載の脂質ナノ粒子。
［４］ 脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ＰＥＧ化リン脂質の量の割合が８〜１３モル％である、前記［１］〜［３］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［５］ 脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記一般式（１）で表される脂質の量の割合が４０〜６０モル％である、前記［１］〜［４］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［６］ さらに、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン、及び卵黄由来ホスファチジルコリンからなる群より選択される１種以上を含む、前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
［７］ さらに、前記癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドが結合していないポリアルキレングリコール修飾脂質を含有する、前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
［８］ 脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の量の割合が２〜４モル％である、前記［７］の脂質ナノ粒子。
［９］ 個数平均粒子径が１００ｎｍ以下である、前記［１］〜［８］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［１０］ 前記低分子核酸が、ミッドカイン遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、前記［１］〜［９］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［１１］ 前記抗癌剤が、ソラフェニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ、又はカボザンチニブである、前記［１］〜［１０］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［１２］ 前記［１］〜［１１］のいずれかの脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
［１３］ 肝細胞癌の治療に用いられる、前記［１２］の医薬用組成物。

【発明の効果】

【0017】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、抗癌剤とＲＮＡ干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する低分子核酸の両方を、癌化した肝細胞に選択的に導入させることができる。このため、当該脂質ナノ粒子は、肝細胞癌治療に用いられる治療剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】実施例１において、製造したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の各培養細胞株に対する相対取り込み量（％）を調べた結果を示した図である。

【図2】実施例１において、製造したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませた各細胞株の細胞生存率（％）を調べた結果を示した図である。

【図3】実施例１において、製造したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませた各細胞株のＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた結果を示した図である。

【図4】実施例２において、ＳＯＲ濃度が１０μＭのＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませて２４時間インキュベート後の細胞生存率の結果を示した図である。

【図5A】実施例２において、ＳＯＲ単独、ＭＫ−ｓｉＲＮＡ単独、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡ、又はＳＯＲとＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡを搭載させたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませて、２４時間インキュベート後の細胞生存率の結果を示した図である。

【図5B】実施例２において、ＳＯＲ単独、ＭＫ−ｓｉＲＮＡ単独、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡ、又はＳＯＲとＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡを搭載させたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませて、４８時間インキュベート後の細胞生存率の結果を示した図である。

【図6】実施例２において、５μＭのＳＯＲ濃度、２００ｎＭのＭＫ−ｓｉＲＮＡ濃度をｐＨ５．５又はｐＨ７．４で搭載したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子について、脂質ナノ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＯＲの放出の経時的変化を調べた結果を示した図である。

【図7A】実施例３において、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの割合を５モル％とした脂質ナノ粒子を肝細胞癌の担癌マウスに尾静脈注射した場合の、血中濃度（ＩＤ％／ｍＬ）の測定結果を図７Ａに示す。

【図7B】実施例３において、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの割合を１０モル％とした脂質ナノ粒子を肝細胞癌の担癌マウスに尾静脈注射した場合の、血中濃度（ＩＤ％／ｍＬ）の測定結果を図７Ｂに示す。

【図8】実施例４において、ＹＳＫ０５を構成脂質全体の４０〜７０モル％含有させて製造したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与した担癌マウスの肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた結果を示した図である。

【図9】実施例４において、ＹＳＫ０５に加えてさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡを含有させて製造したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与した担癌マウスの肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた結果を示した図である。

【図10】実施例５において、製造したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与した担癌マウスの肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた結果を示した図である。

【図11】実施例６において、製造したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与した担癌マウスの肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた結果を示した図である。

【図12】実施例７において、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与した担癌マウスの腫瘍体積をモニタリングした図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の実施態様について具体的に説明する。本願明細書において、「Ｘ１〜Ｘ２（Ｘ１とＸ２は、Ｘ１＜Ｘ２を満たす実数）」は、「Ｘ１以上Ｘ２以下」を意味する。

【0020】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、抗癌剤とＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する低分子核酸（以下、「ＭＫ発現抑制用低分子核酸」ということがある。）とを含み、癌化した肝細胞に選択的に取り込まれる脂質ナノ粒子である。ミッドカインは、抗アポトーシス、分裂促進、血管新生、及び化学療法抵抗性等の機能に関与しており（非特許文献２）、癌細胞においてミッドカインの機能を低減させることにより、抗癌剤単独投与よりも高い抗癌効果が得られる。本発明に係る脂質ナノ粒子が導入された細胞では、当該脂質ナノ粒子に搭載されていたＭＫ発現抑制用低分子核酸によってミッドカイン遺伝子の発現が抑制されるため、同じく脂質ナノ粒子に搭載されていた抗癌剤の抗癌効果が改善される。

【0021】

抗癌剤の多くは低分子化合物であり、低分子核酸とは物理化学的特性が大きく異なる。一般的には、物理化学的特性の異なる複数の薬剤を、独立して同一の標的細胞へ送達させることは非常に困難である。加えて、抗癌剤は細胞毒性を有すること、及び、低分子核酸は代謝に不安定であることから、それぞれに対して適切な送達デバイスが必要となる。本発明においては、抗癌剤とＭＫ発現抑制用低分子核酸の両方を脂質ナノ粒子に搭載させることにより、それぞれを独立した送達デバイスで送達させた場合よりも、より高効率に両者を同一の細胞に導入させることができる。さらに、両者を脂質ナノ粒子の内部に搭載させることによって、当該脂質ナノ粒子が取り込まれていない細胞や組織に対する抗癌剤の影響を低減させることができ、さらに、低分子核酸を生体内でより安定して標的細胞へ送達させることができる。

【0022】

本発明に係る脂質ナノ粒子が含む抗癌剤としては、特に限定されるものではないが、ミッドカイン遺伝子の発現抑制と併用することにより、抗癌効果の相乗的な改善が期待できる抗癌剤であることが好ましい。このような抗癌剤としては、例えば、ＡＴＣ分類（解剖治療化学分類）がＬ０１ＸＥであるプロテインキナーゼ阻害剤が好ましい。当該プロテインキナーゼ阻害剤としては、マルチキナーゼ阻害剤が好ましく、特に、肝細胞癌の治療薬として使用されているソラフェニブ（CAS No.: 284461-73-0、ATC code：L01XE05）、レンバチニブ（CAS No.: 417716-92-8、ATC code：L01XE29）、レゴラフェニブ（CAS No.:755037-03-7、ATC code：L01XE21）、又はカボザンチニブ（CAS No.: 849217-68-1、ATC code：L01XE26）が好ましい。

【0023】

【化3】

【0024】

本発明に係る脂質ナノ粒子が含むＭＫ発現抑制用低分子核酸としては、導入された細胞内において、ＲＮＡ干渉によりミッドカイン遺伝子の発現を抑制する機能を発揮し得る核酸であれば特に限定されるものではなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等が挙げられる。これらは、ミッドカイン遺伝子の塩基配列に基づいて常法により設計して合成することができる。

【0025】

ｓｉＲＮＡは、２１〜２３塩基対からなる低分子二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉に関与し、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。本発明において使用可能なｓｉＲＮＡの種類は特に限定されず、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができるものであればいかなるものを使用してもよい。一般的には、２１〜２３塩基対の二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ鎖の３’部分が２塩基分突出した構造をとり、それぞれの鎖は５’末端にリン酸基と３’末端にヒドロキシル基を有する構造のＲＮＡを、本発明に係る脂質ナノ粒子に搭載させるｓｉＲＮＡとして使用することができる。また、リボース骨格の２’位のヒドロキシル基がメトキシ基、フルオロ基、あるいはメトキシエチル基に、ホスフォジエステル結合がホスフォロチオエート結合に一部置換されたｓｉＲＮＡも含まれる。その他、本発明に係る脂質ナノ粒子が搭載するＭＫ発現抑制用低分子核酸としては、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させるｓｉＲＮＡ発現ベクターであってもよい。ｓｉＲＮＡ発現ベクターとしては、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターから調製することができ、また、これを適宜改変してもよい。

【0026】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、下記一般式（１）で表される脂質と、癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチド（以下、「肝癌細胞結合性ペプチド」ということがある。）がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介してリン脂質に結合しているＰＥＧ化リン脂質（以下、「肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質」ということがある。）と、を含む。下記一般式（１）で表される脂質はｐＨ感受性カチオン性脂質である。本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子の構成脂質として、特定の構造のｐＨ感受性カチオン性脂質と肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質とを含むため、癌化した肝細胞に対する選択性が高い。すなわち、本発明に係る脂質ナノ粒子は、癌化した肝臓に選択的に送達可能となるように、構成脂質が最適化されたものであり、全身投与型遺伝子治療のための医薬用組成物の有効成分として有用である。

【0027】

【化4】

【0028】

一般式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２は、互いに独立して、炭素数１２〜２４の直鎖状の炭化水素基である。当該炭化水素基としては、アルキル基であってもよく、アルケニル基であってもよい。当該アルケニル基としては、不飽和結合を１個有する基であってもよく、２個有する基であってもよく、３個有する基であってもよい。炭素数１２〜２４の直鎖状アルキル基としては、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、エイコシル基、ヘンイコシル基、ヘンエイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基等が挙げられる。炭素数１２〜２４の直鎖状のアルケニル基としては、デセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、エイコセニル基、ヘンイコセニル基、ヘンエイコセニル基、ドコセニル基、トリコセニル基等が挙げられる。

【0029】

一般式（１）で表される脂質としては、Ｒ^１及びＲ^２が互いに独立して、炭素数１４〜２２の直鎖状のアルキル基又は炭素数１４〜２２の直鎖状のアルケニル基である脂質が好ましく、Ｒ^１及びＲ^２が互いに独立して、炭素数１６〜２０の直鎖状のアルキル基又は炭素数１６〜２０の直鎖状のアルケニル基である脂質がより好ましく、Ｒ^１及びＲ^２が互いに独立して、炭素数１６〜２０の直鎖状のアルケニル基である脂質がさらに好ましく、ＹＳＫ０５（非特許文献３）が特に好ましい。

【0030】

【化5】

【0031】

本発明に係るリン脂質の構成脂質に含まれている肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質としては、肝癌細胞結合性ペプチドがＰＥＧを介してリン脂質に結合しているＰＥＧ化グリセロリン脂質であれば特に限定されるものではない。肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質としては、ＰＥＧの一方の端部が、リン脂質の親水性基部分と直接又は連結基を介して結合しており、残る他方の端部が、肝癌細胞結合性ペプチドと直接又は連結基を介して結合しているリン脂質が挙げられる。

【0032】

肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質中のリン脂質としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファリジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスフォリルエタノールアミン、セラミドホスフォリルグリセロール、セラミドホスフォリルグリセロールホスファート、１,２−ジミリストイル−１,２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸（ＰＡ）などを挙げることができる。

【0033】

肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質中のリン脂質としては、特に限定されるものではないが、前記一般式（１）で表される脂質との親和性が高く、リン脂質膜を構成しやすい点から、炭素数１２〜２４の脂肪酸残基を有するグリセロリン脂質であることが好ましい。当該グリセロリン脂質としては、１個の炭素数１２〜２４の脂肪酸残基を有するモノアシルグリセロリン脂質であってもよく、２個の炭素数１２〜２４の脂肪酸残基を有するジアシルグリセロリン脂質であってもよく、１個の炭素数１２〜２４の脂肪酸残基と１個の炭素数１１以下又は２５以上の脂肪酸残基とを有するジアシルグリセロリン脂質であってもよい。２個の炭素数１２〜２４の脂肪酸残基を有するジアシルグリセロリン脂質は、２個の脂肪酸残基が同じ脂肪酸残基であってもよく、異なる脂肪酸残基であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子中の肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質としては、肝癌細胞結合性ペプチドがＰＥＧを介して、１個又は２個の炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸残基を有するグリセロリン脂質の親水性基部分と結合した脂質であることが好ましく、肝癌細胞結合性ペプチドがＰＥＧを介して、ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＭＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、モノパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、モノミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＭＰＥ）等のホスファチジルエタノールアミン；ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、モノステアリルホスファチジルコリン（ＭＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、モノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、モノミリストイルホスファチジルコリン（ＭＭＰＣ）等のホスファチジルコリンの親水性基部分と結合した脂質であることがより好ましく、肝癌細胞結合性ペプチドがＰＥＧを介して、ジステアリルホスファチジルエタノールアミンの親水性基部分と結合した脂質であることがさらに好ましい。

【0034】

肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質中の肝癌細胞結合性ペプチドとしては、癌化した肝細胞の表面と選択的に結合するペプチドであれば特に限定されるものではなく、公知のペプチドの中から適宜選択して使用することができる。肝癌細胞結合性ペプチドとしては、例えば、１２アミノ酸からなるＳＰ９４（ＳＦＳＩＩＨＴＰＩＬＰＬ：配列番号１）（非特許文献６）が挙げられる。また、肝癌細胞結合性ペプチドとしては、ＳＰ９４に対して、その肝癌細胞結合能を損なわないように、アミノ酸残基の一部に変異を導入したペプチドも用いることができる。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１〜３個のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失したアミノ酸配列からなり、かつ癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドや、配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ癌化した肝細胞に選択的に結合するペプチドが挙げられる。

【0035】

肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧとしては、肝癌細胞結合性ペプチドの効果を損なうことなく、グリセロリン脂質の親水性基部分と連結させることができる長さの物であれば特に限定されるものではない。本発明に係るリン脂質としては、血中滞留性とエンドソーム脱出能の両方を良好に調整しやすい点から、その構成脂質に含まれている肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質のＰＥＧの数平均分子量は、２，０００〜５，０００が好ましい。ＰＥＧの数平均分子量は、例えば、ＪＩＳ Ｋ１５５７−１に準拠したアセチル化法により測定された水酸基価に基づいて算出することができる。

【0036】

肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質において、ＰＥＧとリン脂質の親水性基部分を結合させる連結基、及びＰＥＧと肝癌細胞結合性ペプチドを結合させる連結基としては、特に限定されるものではなく、例えば、−（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、２価のマレイミド基、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0037】

本発明に係る脂質ナノ粒子において、肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質の量が少なすぎる場合には、十分な肝癌細胞に対する選択性が得られないおそれがある。一方で、肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質の量が多すぎる場合にも、かえって肝癌細胞に対する選択性が低下する場合がある。充分な肝癌細胞に対する選択性が得られやすい点から、本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質の量の割合は、５〜１５モル％が好ましく、８〜１３モル％がより好ましい。

【0038】

本発明に係る脂質ナノ粒子において、一般式（１）で表される脂質の量は特に限定されるものではない。本発明においては、脂質ナノ粒子の大きさを肝癌細胞への送達効率の点で好ましい範囲内に調節しやすい点から、本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する一般式（１）で表される脂質の量の割合は、４０〜７０モル％が好ましく、肝癌細胞においてミッドカイン遺伝子の発現抑制効率をより向上させられる点から、４０〜６０モル％がより好ましく、４５〜５５モル％がさらに好ましい。

【0039】

本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質のうち、一般式（１）で表される脂質と肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質以外の脂質としては、一般的にリポソームを形成する際に使用される脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えば、リン脂質、ステロール、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0040】

リン脂質としては、肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質を構成するリン脂質と同様のものを用いることができる。ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールなどが挙げられる。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、ステロールを含むことが好ましく、コレステロールを含むことがより好ましい。

【0041】

本発明に係る脂質ナノ粒子としては、肝癌細胞においてより高いミッドカイン遺伝子の発現抑制効果が得られる点から、本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質のうち、一般式（１）で表される脂質と肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質以外の脂質としては、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、及び卵黄由来ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）からなる群より選択される１種以上を含むことが好ましく、コレステロールと、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、及び卵黄由来ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）からなる群より選択される１種以上とを含むことがより好ましく、コレステロールとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとを含むことがさらに好ましい。

【0042】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質成分としてポリアルキレングリコール修飾脂質を含有することが好ましい。ポリアルキレングリコールは親水性ポリマーであり、ポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質ナノ粒子を構築することにより、脂質ナノ粒子の表面をポリアルキレングリコールで修飾することができる。ポリアルキレングリコールで表面修飾することにより、脂質ナノ粒子の血中滞留性などの安定性を高めることができる場合がある。

【0043】

ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば３００〜１０，０００程度、好ましくは５００〜１０，０００程度、さらに好ましくは１，０００〜５，０００程度である。

【0044】

例えば、脂質のポリエチレングリコールによる修飾には、ステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸PEG45(STR-PEG45)など）を用いることができる。その他、N-[カルボニル−メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、n-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-750]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000]（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡ）などのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。

【0045】

本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合は、一般式（１）で表される脂質と肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質による肝癌細胞への選択性を損なわない量であれば特に限定されるものではない。例えば、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合は、肝癌細胞においてミッドカイン遺伝子の発現抑制効率をより向上させられる点から、２〜４モル％とすることが好ましい。

【0046】

本発明に係る脂質ナノ粒子には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面を親水性ポリマー等で修飾することにより、血中滞留性を高めることができる。これらの修飾基で修飾された脂質を脂質ナノ粒子の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行なうことができる場合もある。

【0047】

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかにデキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。

【0048】

また、本発明に係る脂質ナノ粒子の核内移行を促進するために、例えば、脂質ナノ粒子を３糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。３糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、３〜１０個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは３〜６個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。

【0049】

オリゴ糖化合物で脂質ナノ粒子を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質ナノ粒子をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム（国際公開第２００７／１０２４８１号）が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。

【0050】

また、本発明に係る脂質ナノ粒子には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、脂質ナノ粒子の血液中での滞留性を向上させ、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質ナノ粒子を脱出させて、封入された核酸を肝癌細胞内でより効率よく発現させることができる。

【0051】

肝細胞癌に存在する間質バリアは、脂質ナノ粒子の肝癌細胞への送達の障害となっている。脂質ナノ粒子の大きさを、肝細胞癌の間質関門を通過できる程度の大きさに調整することによって、腫瘍の微小環境自体を調整する必要なく、効率よく肝癌細胞へ送達させることができる。そこで、本発明に係る脂質ナノ粒子の大きさは、個数平均粒子径が、１００ｎｍ以下が好ましく、８０ｎｍ以下がより好ましく、４０〜７０ｎｍがさらに好ましく、５０〜７０ｎｍがよりさらに好ましい。なお、脂質ナノ粒子の平均粒子径とは、動的光散乱法（Dynamic light scattering：ＤＬＳ）により測定された個数平均粒子径を意味する。動的光散乱法による測定は、市販のＤＬＳ装置等を用いて常法により行うことができる。

【0052】

本発明に係る脂質ナノ粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は０．０５〜０．７程度、好ましくは０．１〜０．６程度、さらに好ましくは０．２〜０．６程度である。ゼータ電位は−５０ｍＶ〜−１ｍＶの範囲、好ましくは−３０ｍＶ〜−５ｍＶの範囲とすることができる。

【0053】

本発明に係る脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、球状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソームであることが好ましい。

【0054】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜で覆われた粒子内部に、標的の細胞内に送達する目的の成分を内包していることが好ましい。すなわち、本発明に係る脂質ナノ粒子は、抗癌剤とＭＫ発現抑制用低分子核酸を粒子内部に内包していることが好ましい。

【0055】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、本発明の効果を損なわない範囲において、抗癌剤とＭＫ発現抑制用低分子核酸以外の他の成分を粒子内部に内包していてもよい。当該他の成分としては、酸、糖類、ペプチド類、低分子化合物、金属化合物などが挙げられる。

【0056】

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、当該脂質ナノ粒子に封入させる抗癌剤とＭＫ発現抑制用低分子核酸を水系溶媒に溶解させた状態で添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質ナノ粒子の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。本発明に係る脂質ナノ粒子は、例えば、非特許文献５に記載の方法を用いて製造することもできる。

【0057】

水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質ナノ粒子を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質ナノ粒子を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０〜８．０程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。

【0058】

得られた脂質ナノ粒子の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。

【0059】

本発明に係る脂質ナノ粒子を動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入された抗癌剤とＭＫ発現抑制用低分子核酸は、他の臓器や健康な肝細胞よりも肝癌細胞に選択的に取り込まれ、ミッドカイン遺伝子の発現が抑制され、かつ抗癌剤によって細胞死に至る。この肝癌細胞に対する高選択的なミッドカイン遺伝子発現抑制活性と抗癌活性により、本発明に係る脂質ナノ粒子は、肝細胞癌を標的とする抗癌剤の有効成分として機能する。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、医薬用組成物の有効成分として有用であり、特に、肝細胞癌に対する治療に用いられる医薬用組成物の有効成分として有用である。

【0060】

本発明に係る脂質ナノ粒子が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。また、本発明に係る脂質ナノ粒子を動物に投与する際の投与経路は、特に限定されるものではないが、経静脈投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等の非経口投与であることが好ましい。

【実施例】

【0061】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0062】

［試薬等］
ＳＯＲは、米国のAstaTech社から入手した。ＭＫ−ｓｉＲＮＡとコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＬ４）は、表１に記載の塩基配列からなる合成ＲＮＡを用いた。ｑＲＴ−ＰＣＲで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、表２に記載の塩基配列からなる合成ＲＮＡを用いた。ＳＰ９４ペプチドの末端にシステインを付加したペプチド（ＳＦＳＩＩＨＴＰＩＬＰＬ−Ｃｙｓ）は、化学合成したものを用いた。

【0063】

【表1】

【0064】

【表2】

【0065】

ＹＳＫ０５は、非特許文献３に記載の方法で合成した。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル]−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）は、米国のAvanti Polar Lipids社から入手した。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、卵黄由来Ｌ−α−ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡ）は、日本のNOF社から入手した。コレステロール、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｒｉ試薬、及びシナピン酸は、米国のSigma-Aldrich社から入手した。分岐型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（平均分子量１０ＫＤａ）は、日本の和光社から入手した。 ステアリル化オクタアルギニンペプチド（ＳＴＲ−Ｒ８）は、日本のクラボウ社によって合成された。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎは、米国のInvitrogen社から入手した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）細胞増殖アッセイキットは、英国のAbcam社から入手した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔとｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ及びＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲＭｉｘは、日本のTOYOBO社から購入した。細胞培養プレート（２．５×１５０ｍｍ、６ウェルプレート及び２４ウェルプレート）は、米国のCorning社から入手した。ガラス底ディッシュ（３５ｍｍ）は、日本のいわき社から入手した。

【0066】

ヌクレアーゼフリー水、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−４−クロロベンゼンスルホン酸塩（ＤｉＤ）及び２’−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２,５’−ビベンゾイミダゾール（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）は、米国のThermo Fisher Scientific社から入手した。Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡは、米国のQiagen社から入手した。カットオフ分子量３．５ＫＤａ（Spectra / Por 6）の透析膜は、米国のSpectrum Labs社から入手した。

【0067】

［細胞］
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ、マウス肝細胞癌細胞株Ｈｅｐａ １−６、及びマウス正常肝細胞株ＦＬ８３Ｂは、米国のＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手した。各細胞株は、製造業者のガイドラインに従って培養され、維持された。ＨｅｐＧ２及びＨｅｐａ １−６細胞は、高比率のグルコース（４．５ｇ／Ｌ）（ナカライテスク社、日本）を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養され、ＨｅＬａ細胞は、低比率のグルコース（１ｇ／Ｌ）を含むＤＭＥＭ（米国、Sigma Aldrich社）で培養された。ＦＬ８３Ｂ細胞をＦ−１２Ｋ培地（米国、ＡＴＣＣ）で培養した。すべての培地に１０容量％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Biosera、米国）と抗生物質溶液（Thermo Fisher Scientific社、米国）を追加し、微生物汚染を防ぐために１００ユニット／ｍＬ ペニシリンと１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含有させた。すべての細胞は、３７℃、５％ ＣＯ_２、湿度９５％のインキュベーター内で培養した。

【0068】

［脂質ナノ粒子の調製］
以降の実験において、特に記載のない限り、脂質ナノ粒子は、脂質薄膜水和法によって調製された。
ｓｉＲＮＡ（３ｎｍｏｌ）とＰＥＩは、個別にＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ４）に溶解し、リン酸に対する窒素比（Ｎ／Ｐ）がイコールから０．５になるように、ＰＥＩ溶液をｓｉＲＮＡ溶液にボルテックスをしながら徐々に加えることで、負に帯電したコアを形成するようにして、複合体を形成した。室温で３０分間インキュベーションした後、このコア溶液を使用して、脂質のエタノール溶液を真空下で蒸発させることにより形成された脂質フィルムを水和させた。ＳＯＲは、エバポレーション前に、望ましい量のエタノール溶液を脂質溶液に添加することにより、脂質ナノ粒子に内包させた。室温でさらに３０分間インキュベーションした後、水和したフィルムを１分間超音波処理して脂質ナノ粒子を形成し、脂質ナノ粒子を安定させるためにさらに室温で３０分間インキュベートした。脂質ナノ粒子溶液を、分子量１５ｋＤａのフィルターチューブ（Merck Millipore社）を使用した限外濾過−遠心分離（２０００ｇ、３０分間、室温）で濾過し、内包されていないＳＯＲを除去した。

【0069】

次に、フィルター上に保持された脂質ナノ粒子をＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に再懸濁して、ＹＳＫ０５のカチオン電荷を中和した。他のｐＨ非依存性脂質を使用した場合も、すべての調製物はＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で処理した。ブランク脂質ナノ粒子は、ｓｉＲＮＡ又はＳＯＲなしで同様の方法で調製され、ネガティブコントロールとした。

【0070】

［脂質ナノ粒子の粒子径及びゼータ電位の測定］
脂質ナノ粒子の粒子径及びゼータ電位は、動的光散乱法を用いて粒子径を、ＤＬＳ装置（製品名：「ゼータサイザー」、マルバーン・パナリティカル社製）を用いて測定した。

【0071】

［脂質ナノ粒子への封入効率の評価］
ＳＯＲの脂質ナノ粒子への封入効率（encapsulation efficiency：ＥＥ）は、最終的に得られた脂質ナノ粒子溶液のサンプル３０μＬを、適切な量のエタノールと激しくボルテックスしながら混合して測定した。ＳＯＲ含有量は、脂質ナノ粒子を入れずに同様に調製したサンプルをブランクとして、２６６ｎｍの分光光度法（「Life Science UV / vis Spectrophotometer DU730」、米国、Beckman Coulter社）で決定された。予め設定された検量線を使用して、封入されたＳＯＲ量を計算した。ＳＯＲ封入効率は、以下の式で計算した。

【0072】

【数1】

【0073】

ｓｉＲＮＡ封入効率は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ蛍光分析法（非特許文献７）によって決定された。

【0074】

［細胞毒性の評価］
以降の実験において、特に記載のない限り、細胞毒性は以下の方法によって評価された。
細胞を、各実験の２４時間前に５×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。実験時に、０．２５ｍＬの無血清培地で、細胞を目的の濃度に調製した脂質ナノ粒子で処理し、３７℃で４時間インキュベートした。次に、１０％ ＦＢＳを含む１ｍＬの新鮮な培地を各ウェルに加え、細胞をさらに２０時間インキュベートした。 細胞生存率を評価するために、製造元のガイドラインに従ってＭＴＴアッセイを実施した。

【0075】

まず、培地を除去し、細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄した。ＭＴＴ試薬の５０μＬアリコートと等量の無血清培地を各ウェルに加え、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。次いで、各ウェルに１５０μＬのＭＴＴ溶媒を加えて、形成されたホルマザンを溶解し、プレートをシェーカーで１５分間振とうした。各ウェルの溶液の５９０ｎｍの吸光度を、マルチプレートリーダー（「Enspire 2300 Multilabel Reader」、PerkinElmer社、米国）を使用して分光測光法で測定し、その吸光度を未処理のコントロール細胞の吸光度と比較した。細胞を含まない無血清培地を同様の方法で処理したものをネガティブコントロールとし、バックグラウンドの吸光度を補正した。細胞生存率は、未処理細胞の補正後吸光度に対する、処理細胞の補正後吸光度の割合（［処理細胞の補正後吸光度］／［未処理細胞の補正後吸光度］）（％）として求めた。

【0076】

［細胞へのin vitroトランスフェクション］
以降の実験において、特に記載のない限り、細胞へのin vitroトランスフェクションは以下の方法によって実施した。
各実験の２４時間前に、細胞を２×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。無血清培地１ｍＬに目的の濃度になるようにｓｉＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を含有させたサンプルを各ウェルに加え、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。次いで、１０％ ＦＢＳを含む新鮮な培地（４ｍＬ）を各ウェルに加え、細胞をさらに２０時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、５００μＬのＴｒｉ試薬を使用して溶解し、測定が行われるまで−８０℃で保存した。

【0077】

［遺伝子発現の測定］
以降の実験において、特に記載のない限り、遺伝子発現量は以下の方法によって測定した。
細胞溶解物を含むTri試薬をクロロホルムと混合し、遠心分離して、ＤＮＡ及びタンパク質から全ＲＮＡを分離した。上部のＲＮＡ層を分離し、ＲＮＡペレットをイソプロパノールで沈殿させ、７５％ 冷エタノールで２回洗浄した。次に、最終的なＲＮＡペレットを適切な量のヌクレアーゼフリー水に溶解し、ＵＶ分光光度法（「NanoDrop Lite」、Thermo Fisher Scientific社、米国）で定量化した。製造元のプロトコルに従って、ｇＲＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（TOYOBO社、日本）を含むＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔを使用して、トータルＲＮＡの５００ｎｇサンプルを逆転写して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に得た。

【0078】

ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（TOYOBO社、日本）と表２に記載のプライマーを使用して、取得したｃＤＮＡを用いて実行した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、サクライらの方法（非特許文献８）と同じ条件下で、Light Cycler 480（Roche Diagnostics、バーゼル、スイス）を使用して９６ウェルプレートで行われた。ＭＫ遺伝子のｍＲＮＡの相対量は、サクライらの方法（非特許文献８）と同様にｄｄＣｔ法で計算され、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のｍＲＮＡで正規化された。

【0079】

［蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析による細胞取り込み実験］
以降の実験において、特に記載のない限り、ＦＡＣＳ分析による細胞取り込み実験は以下の方法によって実施した。
調製した脂質ナノ粒子の細胞への取り込みを、様々な細胞株で評価した。被験細胞は、各実験の２４時間前に２×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。脂質ナノ粒子は、親油性蛍光プローブＤｉＤ（０．１モル％）で標識された。被験脂質ナノ粒子を含むサンプルを無血清細胞培養培地と混合して、総量１ｍＬで１０μＭ ＳＯＲに相当する最終濃度に調整して、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去して細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．０５％ トリプシンでの処理により剥離した。次に、細胞懸濁液５００ｇを４℃で１０分間遠心し、細胞ペレットを、０．５％ ウシ血清アルブミンと０．１％ アジ化ナトリウムを含む１ｍＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁した。遠心分離と細胞ペレットのＦＡＣＳバッファーによる洗浄を２サイクル行った後、細胞ペレットを７５０μＬのＦＡＣＳバッファーに完全に懸濁し、ナイロンメッシュに通して全ての細胞凝集体を除去した。細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（BD Biosciences社、米国）によって決定され、様々な細胞株による様々な脂質ナノ粒子の細胞取り込みを比較するために、未処理の細胞のＭＦＩに正規化された。

【0080】

［統計］
以降の実験において、特に記載のない限り、分析による細胞取り込み実験は以下の方法によって実施した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを使用して、統計分析を行った。さまざまなグループの平均値の比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を使用して行った。平均間のペアワイズ比較は、両側スチューデントt検定を使用して行った。 Ｐ値＜０．０５は有意であるとした。各測定値は、３つの独立した実験の平均値±標準偏差で表された。

【0081】

［製造例１］
肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質として、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧを合成した。システインが末端に付加されたＳＰ９４ペプチド（Ｃｙｓ−ＳＰ９４）を、Ｍｉｃｈｅａｌ反応を介してＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡに結合させた。

【0082】

【化6】

【0083】

Ｃｙｓ−ＳＰ９４とＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡのエタノール溶液又は水溶液を２ｍＭ濃度で調製した。次に、等量の２つの溶液を混合し、９００ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とうしながらインキュベートして、最終濃度１ｍＭのコンジュゲートを得た。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を使用して、反応の完了とコンジュゲートの分子量を確認した。

【0084】

［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析］
反応物と生成物の分子量を確認するために、共役反応の後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用した。０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と１％ シナピン酸を含むアセトニトリル（３０％）の水溶液をマトリックス溶液として使用した。各サンプルの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ II機器（Bruker Daltonics社、米国）を用いて測定された。

【0085】

［実施例１］
製造例１で合成したＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧを構成脂質として含み、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡを搭載した脂質ナノ粒子（ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子）を製造し、各培養細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける取り込み等を調べた。

【0086】

さらに、ｐＨ感受性カチオン性脂質ＹＳＫ０５も構成脂質として用いた。脂質ナノ粒子の構成脂質のモル比は、ＹＳＫ０５／ＥＰＣ／コレステロール／ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ＝４：３：３：０．５とした。ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子には、１０μＭのＳＯＲと４００ｎＭのＭＫ−ｓｉＲＮＡを搭載させた。

【0087】

ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧは、事前挿入法又事後挿入法のいずれかの方法で、脂質ナノ粒子に挿入した。事前挿入法では、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧのエタノール溶液を、蒸発及び脂質薄膜の形成前に、他の脂質のエタノール溶液に目的の量で直接添加した。事後挿入法では、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧの水溶液を目的の量で脂質ナノ粒子の水溶液に添加し、脂質ナノ粒子を室温又は６０℃で３０分間インキュベートして、脂質ナノ粒子を安定化させた。

【0088】

調製されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐａ １−６細胞、及びＦＬ８３Ｂ細胞にそれぞれ導入させて、ＦＡＣＳ分析による細胞への取り込み量を調べた。ＨｅｐＧ２細胞への取り込み量を１００％とした相対取り込み量（％）を図１に示す。図中、「*」はＰ＜０．０５、「***」はＰ＜０．０００１を表す。図１に示すように、肝癌細胞由来のＨｅｐＧ２細胞とＨｅＬａ細胞とＨｅｐａ １−６細胞では、いずれもＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の取り込みが確認されたが、正常肝細胞由来のＦＬ８３Ｂ細胞には、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の取り込みは確認されなかった。

【0089】

また、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の取り込み処理を行った各細胞について、細胞毒性を評価した。各細胞の細胞生存率（％）を調べた。結果を図２に示す。図中、「**」はＰ＜０．００１を表し、「***」はＰ＜０．０００１を表す。ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の取り込みが確認されなかったＦＬ８３Ｂ細胞では細胞生存率はほぼ１００％近くであったのに対して、３種の肝癌細胞由来の培養株では、図１に示すＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の取り込み量が多いほど、細胞生存率は低い傾向が観察された。

【0090】

搭載させるＭＫ−ｓｉＲＮＡの量を０〜４００ｎＭとした以外は同様にして、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を製造した。得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を各細胞へ取り込ませ、ＲＮＡ干渉によるＭＫ遺伝子の発現抑制（サイレンシング）を調べた。ＭＫ−ｓｉＲＮＡを搭載していないＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子（ＭＫ−ｓｉＲＮＡ量が０ｎＭ）のＭＫ遺伝子の発現量を１００％とした相対発現量の測定結果を図３に示す。図中、「**」はＰ＜０．００１を表し、「***」はＰ＜０．０００１を表す。ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の取り込みが確認されなかったＦＬ８３Ｂ細胞では、ＭＫ−ｓｉＲＮＡの搭載量を増大させてもＭＫ遺伝子の発現量は変化しなかった。３種の肝癌細胞由来の培養株では、ＭＫ−ｓｉＲＮＡの搭載量依存的にＭＫ遺伝子の発現量は低下した。

【0091】

これらの結果から、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子は、肝癌細胞に選択的に取り込まれ、ＭＫ遺伝子の発現抑制と細胞死を引き起こすことがわかった。

【0092】

［実施例２］
製造例１で合成したＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧを構成脂質として含む脂質ナノ粒子（ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子）に、ＳＯＲのみ、ＭＫ−ｓｉＲＮＡのみ、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡ、又はＳＯＲとＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡを搭載させ、得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子をＨｅｐＧ２細胞に取り込ませた。

【0093】

ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子は、ＳＯＲ濃度が０、５、又は１０μＭ、ＭＫ−ｓｉＲＮＡ及びＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡの濃度が４００ｎＭとした以外は実施例１と同様にして製造した。製造されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子は、ＨｅｐＧ２細胞の培養培地に添加した後、２４又は４８時間インキュベートした後の細胞生存率（％）を調べた。

【0094】

ＳＯＲ濃度が１０μＭのＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませて２４時間インキュベート後の細胞生存率の結果を図４に示す。図中、「**」はＰ＜０．００１を表し、「***」はＰ＜０．０００１を表す。ＭＫ−ｓｉＲＮＡのみが搭載されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子やＳＯＲとＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡが搭載されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませた細胞よりも、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡの両方が搭載されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませた細胞のほうが、細胞生存率が明らかに低下していた。

【0095】

ＳＯＲ濃度が０、５、又は１０μＭであり、ＳＯＲ単独、ＭＫ−ｓｉＲＮＡ単独、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡ、又はＳＯＲとＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡを搭載させたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませて、２４時間インキュベート後の細胞生存率の結果を図５Ａに、４８時間インキュベート後の細胞生存率の結果を図５Ｂに、それぞれ示す。図中、「**」は、ＳＯＲとＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡを搭載させたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子に対してＰ＜０．００１を表し、「***」はＰ＜０．０００１を表す。ＳＯＲのみが搭載されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませた細胞よりも、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡの両方が搭載されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を取り込ませた細胞のほうが、細胞生存率が明らかに低下していた。

【0096】

図４〜５に示すように、ＭＫ−ｓｉＲＮＡの存在は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＯＲの用量反応曲線を大幅に改善した。これは、ＭＫ−ｓｉＲＮＡをコントロールのｓｉＲＮＡであるｓｉＣｎｔｒｌで置き換えた場合には示されなかった。さらに、二元配置分散分析テスト（ＳＯＲ＊ＭＫ−ｓｉＲＮＡのＰ値＜０．０５）、及び、Ｃｏｍｐｕｓｙｎ（登録商標）ソフトウェアを使用してＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙモデルから計算された組み合わせインデックス値（ＣＩ＜１）から、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡ間の相互作用効果は、相加的であるだけでなく、相乗的であった。すなわち、これらの結果から、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡを併用することにより、ＳＯＲの抗癌効果が相乗的に増強されることが確認された。

【0097】

５μＭのＳＯＲ、２００ｎＭのＭＫ−ｓｉＲＮＡをｐＨ５．５又はｐＨ７．４で搭載したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子について、脂質ナノ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＯＲの放出の経時的変化を調べた。各ｐＨでの脂質ナノ粒子からのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＯＲ放出プロファイル（「***」は、ｐＨ７．４の結果に対してＰ＜０．０００１を表す。）を図６に示す。ＳＯＲは、ｐＨ７．４の場合よりもｐＨ５．５においてより多く放出されており、脂質ナノ粒子からのＳＯＲのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出は、ｐＨに敏感であることがわかった。

【0098】

［実施例３］
実施例２において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける優れた抗癌効果が確認された、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡを搭載したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子について、肝細胞癌の担癌マウスに対する抗癌効果を調べた。

【0099】

雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹部に、ヒト肝細胞癌由来培養細胞株ＨｅｐＧ２を皮下接種して、４〜６週間生育させることにより、肝細胞癌の担癌マウスを作製した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したとき、当該担癌マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で尾静脈からＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を静脈内投与した。

【0100】

投与されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子は、実施例１及び２におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞への取り込みや抗癌効果等について優れていたにもかかわらず、担癌マウスへ投与した場合には、腫瘍細胞への選択的な取り込みが確認できず、腫瘍細胞内においてＭＫ遺伝子のサイレンシング活性を誘発することもできなかった。

【0101】

ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の構成脂質全体に占めるＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧの割合を、５又は１０モル％とした以外は実施例２と同様にして、５μＭのＳＯＲと２００ｎＭのＭＫ−ｓｉＲＮＡを搭載したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を製造した。コントロールとして、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧに代えてＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡを用いた以外は同様にして、ＳＰ９４不含脂質ナノ粒子を製造した。これらの脂質ナノ粒子を、担癌マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で尾静脈からＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を静脈内投与し、血中量を経時的に測定した。ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの割合を５モル％とした脂質ナノ粒子の血中濃度（ＩＤ％／ｍＬ）の測定結果を図７Ａに、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの割合を１０モル％とした脂質ナノ粒子の血中濃度（ＩＤ％／ｍＬ）の測定結果を図７Ｂに、それぞれ示す。

【0102】

ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧを全構成脂質に対して５モル％含有しているＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは優れた肝癌細胞への取り込みと抗癌効果を有していたにもかかわらず（実施例２）、担癌マウスでは血中での平均滞留時間（ＭＲＴ）が２０分間未満と非常に低い薬物動態を示し、肝臓と脾臓による急速なクリアランスを示した（図７Ａ）。これに対して、ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧを全構成脂質に対して１０モル％含有しているＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子は、ＭＲＴが９時間を超えて延長され、血中プロファイルが劇的に改善された（図７Ｂ）。これらの結果から、肝癌細胞結合性ＰＥＧ化脂質の含有割合を最適化することにより、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗癌効果を顕著に改善できることがわかった。

【0103】

［実施例４］
侵襲性脂質ナノ粒子製造装置（ｉＬｉＮＰ）と呼ばれるマイクロ流体デバイス（非特許文献５）を利用して、装置の製造条件や、構成脂質の組成を変化させて、個数平均粒子径が１００ｎｍ以下となるように調節して、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡを搭載したＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を調製した。マイクロ流体デバイスの流量比を変化させて調製された脂質ナノ粒子の特性値を表３に、マイクロ流体デバイスのバッファーを変化させて調製された脂質ナノ粒子の特性値を表４に、ｓｉＲＮＡ量と構成脂質のモル比を変化させて調製された脂質ナノ粒子の特性値を表５に、それぞれ示す（ｎ＝６）。

【0104】

【表3】

【0105】

【表4】

【0106】

【表5】

【0107】

これらの結果から、以降は、より粒子径が小さく、生体内の肝細胞癌へ送達させやすい脂質ナノ粒子を製造するため、流量比を４：１、ＨＥＰＥＳバッファーを用い、ｓｉＲＮＡ／脂質モル比を１：１０００として製造することにした。

【0108】

流量比等の条件を最適化した上で、ＹＳＫ０５の構成脂質全体に対する割合（モル％）を変化させて調製されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の特性値を表６に示す。また、調製された脂質ナノ粒子と、実施例２と同じ条件で、ＹＳＫ０５の構成脂質全体に対する割合４０モル％で調製されたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を作製した。これらのＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を、実施例２と同様にして作製した肝細胞癌の担癌マウスに対して、腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したとき、０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で尾静脈からＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を静脈内投与し、肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた。結果を図８に示す（ｎ＝３）。図中、「ＮＴ」は、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与していない担癌マウスの結果を示す。

【0109】

【表6】

【0110】

図８に示すように、個数平均粒子径を１６０ｎｍから１００ｎｍに減少させると、脂質組成は同じであるにもかかわらず、肝細胞癌に対する選択性が向上した。さらに、ＹＳＫ０５の含有量を増大させ、個数平均粒子径を７０ｎｍに小さくすることにより、肝細胞癌に対する選択性をより向上させることができた。

【0111】

次いで、ＹＳＫ０５の含有量が５０モル％、個数平均粒子径が７０ｎｍの脂質ナノ粒子の構成脂質に、ポリアルキレングリコール修飾脂質を加えて、正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の遺伝子サイレンシング能に対する影響を調べた。具体的には、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡを構成脂質全体に対して０、１、３、又は５モル％となるように添加した以外が前記と同様にしてＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を製造した。実施例２と同様にして作製した肝細胞癌の担癌マウスに対して、腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したとき、０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で尾静脈からＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を静脈内投与し、肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた。結果を図９に示す（ｎ＝３）。図中、「ＮＴ」は、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与していない担癌マウスの結果を示す。

【0112】

ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの含有量依存的に、得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の個数平均粒子径は小さくなった。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの含有量が０モル％では得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の個数平均粒子径は７０ｎｍであったのに対して、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの含有量が３モル％では得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の個数平均粒子径は６０ｎｍ程度、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの含有量が５モル％では得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の個数平均粒子径は５０ｎｍ程度であった。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡの含有量が３モル％で平均粒子径６０ｎｍのＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子が、肝細胞癌において最大のＭＫ遺伝子の遺伝子サイレンシングが達成され、正常肝臓では遺伝子サイレンシングを最小限にすることができた。

【0113】

［実施例５］
ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の構成脂質のうち、リン脂質の種類がＭＫ遺伝子の遺伝子サイレンシング能に対する影響を調べた。リン脂質としては、ＥＰＣ、ＤＯＰＣ、又はＤＯＰＥを用いた。脂質ナノ粒子の構成脂質のモル比は、ＹＳＫ０５／リン脂質／コレステロール／ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡ＝５：２：３：１：０．３とした。ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子には、５μＭのＳＯＲ、２００ｎＭのＭＫ−ｓｉＲＮＡを搭載させた。

【0114】

実施例４と同様の製造条件で、平均粒子径が６０μｍ程度のＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を調製した。実施例２と同様にして作製した肝細胞癌の担癌マウスに対して、腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したとき、得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を、０．３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で尾静脈から静脈内投与し、肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた。結果を図１０に示す（ｎ＝３）。図中、「ＮＴ」は、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与していない担癌マウスの結果を示す。いずれのリン脂質を用いたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子でも肝細胞癌に対して選択的な高いＭＫ遺伝子の遺伝子サイレンシングが達成された。中でも、ＹＳＫ０５／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡ＝５：２：３：１：０．３（モル比）のＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子は肝細胞癌に対する選択性が最も良好であった。

【0115】

［実施例６］
血中滞留時間は、充分な治療効果を得るために重要なファクターである。そこで、構成脂質に占めるＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧの割合の、血中滞留時間に対する影響を調べた。構成脂質をＹＳＫ０５／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２ｋ−ＭＡ＝５：２：１．５〜３：０〜１．５：０．３（モル比）とした以外は実施例５と同様の製造条件で、平均粒子径が６０μｍ程度のＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を調製した。

【0116】

実施例２と同様にして作製した肝細胞癌の担癌マウスに対して、腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したとき、得られたＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を、０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で尾静脈から静脈内投与し、血中濃度を経時的に測定した。各ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を投与したマウスのＴ_２０％（脂質ナノ粒子の血中濃度が２０％ＩＤ／ｍＬに下がるまでの時間）を表７に示す。ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧが８〜１３モル％のＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子では、Ｔ_２０％が６時間以上であり、非常に良好であった。

【0117】

【表7】

【0118】

また、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与した担癌マウスにおける、肝細胞癌と正常肝臓におけるＭＫ遺伝子の相対発現量を調べた。結果を図１１に示す（ｎ＝３）。図中、「ＮＴ」は、ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を尾静脈投与していない担癌マウスの結果を示す。ＳＰ９４修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧが１０又は１３モル％のＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子を投与したマウスでは、肝細胞癌において高い遺伝子サイレンシングが達成され、正常肝臓では遺伝子サイレンシングが抑えられており、肝癌細胞に対する選択性が良好であった。

【0119】

［実施例７］
ＳＰ９４修飾脂質ナノ粒子の肝細胞癌に対する治療効果を調べた。実施例３と同様にして作製された肝細胞癌の担癌マウスを４つのグループに分け、脂質ナノ粒子を尾静脈投与した。グループ１は、ＨＥＰＥＳバッファーのみを封入した脂質ナノ粒子を尾静脈投与するコントロールグループ、グループ２は、ＳＯＲとｓｉＣｎｔｒを封入した脂質ナノ粒子を尾静脈投与するグループ、グループ３は、ＭＫ−ｓｉＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を尾静脈投与するグループ、グループ４は、ＳＯＲとＭＫ−ｓｉＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を尾静脈投与するグループとした。脂質ナノ粒子のＳＯＲ含有量は７．５モル％とした。ＳＯＲの用量は、中程度の抗癌活性を示す２．５ｍｇ／ｋｇとした。ｓｉＲＮＡ用量は、０．５ｍｇ／ｋｇとした。

【0120】

ＨｅｐＧ２細胞を移植した日から７、１０、１３、１６、１９、２２、及び２５日目に脂質ナノ粒子を尾静脈投与した。また、各マウスの腫瘍体積をモニタリングした。結果を図１２に示す。腫瘍体積は以下の式で算出した。

【0121】

［腫瘍体積（ｍｍ^３）］＝［長径（ｍｍ）］×［短径（ｍｍ）］^２×０．５２

【0122】

グループ２〜４の治療終了時の腫瘍増殖の抑制は、グループ１（コントロール群）と比較して、グループ２は４０％、グループ３は１８％、グループ４は８５％であった。これらの結果から、ＭＫ−ｓｉＲＮＡが、肝細胞癌のＳＯＲに対する感受性を２倍以上増加させること、ＳＯＲ等の抗癌剤とＭＫ−ｓｉＲＮＡを両方内包し、肝癌細胞への選択性が高い本発明に係る脂質ナノ粒子は、肝細胞癌の治療剤として非常に有効であることが明らかである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]