特開 2021-173705 標的ポリペプチドの情報取得方法および試薬キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-173705(P2021-173705A)

(43)【公開日】2021年11月1日

(54)【発明の名称】標的ポリペプチドの情報取得方法および試薬キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20211004BHJP

   G01N 33/533 20060101ALI20211004BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/64 F

   G01N33/533

   G01N21/64 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】21

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2020-79588(P2020-79588)

(22)【出願日】2020年4月28日

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(71)【出願人】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】金城 政孝

(72)【発明者】

【氏名】アクシェイ ガングリ

(72)【発明者】

【氏名】ラマスワミー ラソニア

【テーマコード（参考）】

2G043

【Ｆターム（参考）】

2G043AA03

2G043AA04

2G043BA16

2G043CA04

2G043DA02

2G043EA01

2G043FA03

2G043FA07

2G043KA02

2G043NA01

2G043NA11

(57)【要約】

【課題】より正確に、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する方法および試薬キットを提供することを課題とする。
【解決手段】蛍光相関分光法または蛍光相互相関分光法により、蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間と、蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの各々の拡散時間を取得する工程と、前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの拡散時間に基づいて、前記蛍光標識した標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する工程と、
を含み、前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドは各々の大きさに関する情報が既知であり、前記複数の参照ポリペプチドの大きさは互いに異なる、標的ポリペプチドの情報取得方法により、課題を解決する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光相関分光法または蛍光相互相関分光法により、蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間と、蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの各々の拡散時間を取得する工程と、
前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの拡散時間を参照として、前記蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間から前記蛍光標識した標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する工程と、
を含み、
前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドは各々の大きさに関する情報が既知であり、
前記複数の参照ポリペプチドの大きさは互いに異なる、
標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項2】

前記大きさが、流体力学的半径、流体力学的直径、および体積から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項3】

前記参照ポリペプチドの流体力学的半径が、１ｎｍ以上２０ｎｍ以下である、請求項１または２に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項4】

前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドが、少なくとも蛍光標識した第１の参照ポリペプチド、および前記蛍光標識と同じ蛍光標識を施した第２の参照ポリペプチドを含み、
蛍光標識した第１の参照ポリペプチド、および蛍光標識した第２の参照ポリペプチドは互いに異なる大きさであり、
前記拡散時間取得工程において、前記蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間が取得され、
前記情報取得工程において、前記蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間を参照として前記蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間から前記蛍光標識した標的ポリペプチドの大きさに関する情報が取得される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項5】

前記第１の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、１ｎｍ以上５ｎｍ未満であり、
前記第２の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、５ｎｍ以上１０ｎｍ以下である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項6】

第１の参照ポリペプチドの流体力学的半径が第２の参照ポリペプチドの流体力学的半径の少なくとも２倍である、
請求項１から５のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項7】

前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドが、少なくとも蛍光標識した第１の参照ポリペプチド、蛍光標識した第２の参照ポリペプチド、および蛍光標識した第３の参照ポリペプチドを含み、前記蛍光標識はすべて同じ蛍光標識であり、
蛍光標識した第１の参照ポリペプチド、蛍光標識した第２の参照ポリペプチドおよび蛍光標識した第３の参照ポリペプチドはそれぞれ異なる大きさであり、
前記拡散時間取得工程において、前記蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第３の参照ポリペプチドの拡散時間が取得され、
前記情報取得工程において、前記蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第３の参照ポリペプチドの拡散時間を参照として、前記蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間から前記蛍光標識した標的ポリペプチドの大きさに関する情報が取得される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項8】

前記第１の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、１ｎｍ以上３ｎｍ未満であり、
前記第２の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、３ｎｍ以上６ｎｍ未満であり、
前記第３の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、６ｎｍ以上９ｎｍ未満である、
請求項７に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項9】

前記蛍光標識した標的ポリペプチドにおいて、前記蛍光色素が前記標的ポリペプチドに化学結合されており、
前記蛍光標識した参照ポリペプチドにおいて、前記蛍光色素が前記参照ポリペプチドに化学結合されている、
請求項１から８のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項10】

前記化学結合が、共有結合である、請求項９に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項11】

前記蛍光標識した標的ポリペプチドにおいて、抗体を介して蛍光色素が前記標的ポリペプチドに結合しており、
前記蛍光標識した参照ポリペプチドにおいて、抗体を介して前記参照ポリペプチドに結合している、
請求項１から９のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項12】

前記拡散時間を取得する工程の前に、前記標的ポリペプチドと、前記標的ポリペプチドを認識する蛍光標識抗体とを反応させることにより、前記蛍光標識した標的ポリペプチドを調製する工程、
を含む、請求項１１に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項13】

前記情報取得工程において、前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの拡散時間から検量線を作成し、前記検量線に基づいて前記蛍光標識した標的ポリペプチドの大きさに関する情報が取得される、
請求項１から１２のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項14】

前記拡散時間取得工程の前に、
生体から採取された前記標的ポリペプチドを含む検体を第１アリコート、第２アリコートおよび第３アリコートに分割し、
前記第１アリコートに含まれる標的ポリペプチドを蛍光標識して前記蛍光標識した標的ポリペプチドを調製し、
前記第２アリコートと蛍光標識した第１の参照ポリペプチドとを混合し、
前記第３アリコートと蛍光標識した第２の参照ポリペプチドとを混合する工程、
を含み
前記拡散時間取得工程において、第１アリコート中の蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間と、第２アリコート中の蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間と、第３アリコート中の蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間とが取得される、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項15】

前記標的ポリペプチドは生体から採取された検体に由来し、前記検体が、全血、血漿、血清、脳脊髄液、または尿である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項16】

前記拡散時間取得工程が蛍光相互相関分光法により行われ、
前記蛍光標識した標的ポリペプチドが、蛍光波長の異なる２種類の蛍光色素を含み、
前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドのそれぞれが、前記２種類の蛍光色素を含む、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項17】

前記蛍光標識した標的ポリペプチドが、前記標的ポリペプチドと、第１蛍光色素を含む第１抗体と、前記第１蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２蛍光色素を含む第２抗体との複合体である、
請求項１６に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法。

【請求項18】

蛍光標識した複数の参照ポリペプチドを含む試薬キットであって、
前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドは各々の大きさに関する情報が既知であり、
前記複数の参照ポリペプチドの大きさは互いに異なり、
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法に用いられる、前記試薬キット。

【請求項19】

前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドが各々別の容器に収容されている、請求項１８の試薬キット。

【請求項20】

複数の参照ポリペプチドと、前記複数の参照ポリペプチドの各々と結合する蛍光標識抗体を含む試薬キットであって、
前記複数の参照ポリペプチドは各々の大きさに関する情報が既知であり、
前記複数の参照ポリペプチドの大きさは互いに異なり、
請求項１から１７のいずれか一項に記載の標的ポリペプチドの情報取得方法に用いられる、前記試薬キット。

【請求項21】

前記複数の参照ポリペプチドの各々と結合する蛍光標識抗体は、１つの参照ポリペプチドに対して結合する第１の蛍光標識抗体と第２の蛍光標識抗体を含み、
前記第１の蛍光標識抗体は、標識されている蛍光色素の蛍光波長が前記第２の蛍光標識抗体に標識されている蛍光色素の蛍光波長と異なり、
前記第１の蛍光標識抗体のエピトープは、第２の蛍光標識抗体のエピトープと異なる、
請求項２０に記載の試薬キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的ポリペプチドの情報取得方法および試薬キットに関する。

【背景技術】

【0002】

ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する分析法として、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）および蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）が知られている。非特許文献１には、ＦＣＳを用いたタンパク質の失活による構造変化について記載されている。この文献には、拡散係数が既知の色素および検体タンパク質についてＦＣＳにより得られた拡散時間を用いた比例計算で検体タンパク質の大きさが推定されることが記載されている。非特許文献２には、色素標識した大きさの異なるポリスチレンビーズ等を含む標準試料を用い、蛍光相関分光法によりそれぞれの大きさのポリスチレンビーズの拡散時間を求め、検量線を作成することが記載されている。この文献には、標的タンパク質についてＦＣＳで求めた拡散時間を前記検量線に適用して標的タンパク質の大きさが計算されることが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Eilon Sherman, Biophysical Journal Volume 94,June 2008,4819-4827,“Using Fluorescence Correlation Spectroscopy to Study Conformational Changes in Denatured Proteins ”

【非特許文献2】Tingjuan Gao, PROTEIN SCIENCE 2011 VOL 20:437-447,“Characterizing diffusion dynamics of a membrane protein associated with nanolipoproteins using fluorescence correlation spectroscopy”

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明者らは、従来の方法では測定誤差が大きく正確性の観点で課題があることを見出した。
本発明は、より正確に、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する方法および試薬キットを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明のある実施形態は、標的ポリペプチドの情報取得方法に関する。前記標的ポリペプチドの情報取得方法は、蛍光相関分光法または蛍光相互相関分光法により、蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間と、蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの各々の拡散時間を取得する工程と；前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの拡散時間を参照として、前記蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間から前記蛍光標識した標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する工程と；を含む。ここで、前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドは各々の大きさに関する情報が既知であり、前記複数の参照ポリペプチドの大きさは互いに異なる。

【0006】

本実施形態のタンパク質の情報取得方法によれば、非特許文献１および非特許文献２と比較して、より正確に、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得することができる。
本発明のある実施形態は、試薬キットに関する。

【0007】

試薬キットのある実施形態は、蛍光標識した複数の参照ポリペプチドを含む試薬キットに関する。前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドは各々の大きさに関する情報が既知であり、前記複数の参照ポリペプチドの大きさは互いに異なる。また、前記試薬キットは前記タンパク質の情報取得方法に用いられる。

【0008】

試薬キットの別の実施形態は、複数の参照ポリペプチドと、前記複数の参照ポリペプチドのそれぞれと結合する蛍光標識抗体を含む試薬キットに関する。前記蛍光標識した複数の参照ポリペプチドは各々の大きさに関する情報が既知であり、前記複数の参照ポリペプチドの大きさは互いに異なる。また、前記試薬キットは前記標的ポリペプチドの情報取得方法に用いられる。

【0009】

上記実施形態の試薬キットによれば、非特許文献１および非特許文献２と比較して、より正確に、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得することができる。

【発明の効果】

【0010】

より正確に、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、本発明の概略を示す。本概略はFCCSを用いる例である。

【図2】図２は、試薬キットの外観を示す。

【図3】図３は、比較例１で使用する比例転換の概略を示す。

【図4】図４（A）は、PBS内で流体力学的半径を測定し、基準化した後の結果を示す。図４（B）は、希釈血漿内で流体力学的半径を測定し、基準化した後の結果を示す。図４（C）は、水性溶媒としてPBSを用いた場合と希釈検体を用いた場合における検量線の違いを示す。図４（C）において略語は、それぞれAP：aprotinin、L：lysozyme、CA：carbonic anhydrase、BS：bovine serum albumin、BA：β-amylase、AF：apoferritin、T：thyroglobulinを示す。エラーバーは3回の測定の標準偏差を示す。

【図5】図５（A）は、希釈血清を使用して測定した拡散時間に基づいて作成した検量線である。図５（B）は、希釈血漿１を使用して測定した拡散時間に基づいて作成した検量線である。図５（C）は、希釈血漿１とは異なる希釈血漿２を使用して測定した拡散時間に基づいて作成した検量線である。

【図6】図６（A）は、本発明の方法によりβ-Amylaseについて求めた予測値と理論値の差の値を示す。図６（B）は、各参照ポリペプチドについて求めた予測値と理論値の差の絶対値と参照ポリペプチドとの関係を示す。

【図7】図７（A）は、比較例１の方法によりβ-Amylaseについて求めた予測値と理論値の差の値を示す。図７（B）は、各検体において、各参照ポリペプチドについて求めた差の絶対値と参照ポリペプチドの分子サイズとの関係を示す。

【図8】図８（A）は、リコンビナントVWFタンパク質をFCCSにより測定した際の基準化前の相互相関G（τ）とlag timeを示す。図８（B）は、本発明の方法に基づいて算出されたリコンビナントVWFタンパク質の予測値、理論値、およびその差を示す。

【図9】図９（A）は、卵白リゾチームをFCCSにより測定した際の基準化前の相互相関G（τ）とlag timeを示す。図９（B）は、本発明の方法に基づいて算出された卵白リゾチームタンパク質の予測値、理論値、およびその差を示す。

【図10】図１０（A）はPBSを水性溶媒としてFCCSにより測定した際の各参照ポリペプチドの拡散時間（μｓ）と、流体力学的半径の予測値を示す。図１０（B）は、図１０（A）に基づいて作成した検量線を示す。図１０（C）は、実施例４により求められた予測値と理論値の差の絶対値と、精度を示す。図１０（D）は、比較例２により求められた予測値と理論値の差の絶対値と、精度を示す。

【図11】図１１（A）は、PBSを水性溶媒としてFCSにより測定した各参照ポリペプチドの拡散時間（μｓ）と、流体力学的半径の予測値を示す。また、図１１（B）は、図１１（A）に基づいて作成した検量線を示す。図１１（C）は、参考例により求められた検量線と回帰式を示す。

【図12】図１２（A）は、実施例５の結果を、図１２（B）に参考例の結果を、図１２（C）に比較例３の結果を示す。

【図13】図１３（A）は、β-Amylaseの差の絶対値の比較データを示す。図１３（B）にThyroglobulinの差の絶対値の比較データを示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

１．標的ポリペプチドの情報取得方法
１−１．用語の説明
参照ポリペプチドは、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得するための参照として用いられるポリペプチドであり、大きさに関する情報が既知である。また、大きさが互いに異なる参照ポリペプチドを複数使用することが好ましい。例えば、２種、３種、４種、５種、６種または７種の参照ポリペプチドを用いることができる。

【0013】

参照ポリペプチドの大きさは、標的ポリペプチドの予想される大きさに応じて適宜選択される。例えば、参照ポリペプチドの流体力学的半径は、１ｎｍ以上２０ｎｍ以下である。複数の参照ポリペプチドは、少なくとも第１の参照ポリペプチドと、第２の参照ポリペプチドを含む。第１の参照ポリペプチド、および第２の参照ポリペプチドは互いに異なる大きさである。一実施形態では、第１の参照ポリペプチドの流体力学的半径と、第２の参照ポリペプチドの流体力学的半径の差が、少なくとも２倍である。別の実施形態では、第１の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、１ｎｍ以上５ｎｍ未満であり、第２の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、５ｎｍ以上１０ｎｍ以下である。

【0014】

複数の参照ポリペプチドは、第１の参照ポリペプチド、第２の参照ポリペプチドおよび第３の参照ポリペプチドを含んでもよい。第１の参照ポリペプチド、第２の参照ポリペプチドおよび第３の参照ポリペプチドはそれぞれ異なる大きさである。一実施形態では、第１の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、１ｎｍ以上３ｎｍ未満であり、第２の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、３ｎｍ以上６ｎｍ未満であり、第３の参照ポリペプチドの流体力学的半径が、６ｎｍ以上９ｎｍ未満である。

【0015】

参照ポリペプチドは、具体的には、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（流体力学的半径１．４ｎｍ）；Ｈｅｎ ｅｇｇ−ｗｈｉｔｅ ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）（流体力学的半径１．９ｎｍ）；Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ（ＣＡ）（流体力学的半径２．１ｎｍ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（流体力学的半径３．５ｎｍ）；β−アミラーゼ（流体力学的半径５．４ｎｍ）、Ａｐｏ−ｆｅｒｒｉｔｉｎ（流体力学的半径６．４ｎｍ）、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（流体力学的半径８．６ｎｍ）等を使用することができる。これらのうちから、標的ポリペプチドの予想される大きさに応じて2種以上が選択され得る。

【0016】

標的ポリペプチドは、測定対象となるポリペプチドである。標的ポリペプチドは、生体から採取された検体に由来するポリペプチドであってよい。検体として、例えば、全血、血漿、血清、脳脊髄液、尿等を挙げることができる。標的ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質の断片、またはポリペプチドの凝集体であり得る。ポリペプチドの凝集体は、「重合体」または「多量体」とも呼ばれ、複数のモノマー分子が物理的および／または化学的に重合して形成される。凝集体の具体例は、フォン・ヴィレブランド因子凝集体、アミロイドβ凝集体、タウタンパク質凝集体、血清−アミロイド−Ａ−タンパク質凝集体、ＩｇＧ−軽鎖凝集体、ＡａｐｏＡＩ凝集体、ＡａｐｏＡＩＩ凝集体、ＡＴＴＲ凝集体、ＤＩＳＣ１凝集体、ＦＵＳ凝集体、ＩＡＰＰ凝集体、ＳＯＤ１凝集体、α−シヌクレイン凝集体、ＴＤＰ−４３凝集体、ハンチンチン凝集体、リゾチーム凝集体などである。ポリペプチドの凝集体は、疾患の存否などの判定に用いられ得る。例えば、フォン・ヴィレブランド因子は、健常人の血中では凝集体（フォン・ヴィレブランド因子マルチマー）として存在するが、後天性フォン・ヴィレブランド因子症候群ではこの凝集体が分解されていることがある。すなわち、フォン・ヴィレブランド因子の大きさに関する情報は、後天性フォン・ヴィレブランド因子症候群の指標となり得る。また、アミロイドβ凝集体、タウタンパク質凝集体などの大きさに関する情報はアルツハイマー病などの神経性疾患の指標となり得る。

【0017】

蛍光相関分光法（以下、「ＦＣＳ」と呼ぶことがある）は、１つの分子に結合した１色の蛍光色素を検出する方法である。蛍光相互相関分光法（以下、「ＦＣＣＳ」と呼ぶことがある）は、１つの分子に結合した２色の蛍光色素を検出する方法である。ＦＣＳまたはＦＣＣＳによる解析を行う装置は公知である。例えば、倒立顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ（カールツァイス株式会社）と同社のＺｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを組み合わせることによりＦＣＳおよびＦＣＣＳの両方の解析が可能である。また、ＦＣＳの解析装置として、例えば蛍光相関分光装置ＦＣＳコンパクトシリーズ（浜松ホトニクス株式会社）を挙げることができる。ＦＣＣＳの解析装置として、例えば蛍光相互相関分光装置ＦＣＣＳコンパクト（浜松ホトニクス株式会社）を挙げることができる。

【0018】

拡散時間は、一般的に記号τ_Ｄ等で表され、例えばマイクロ秒（μｓ）あるいはミリ秒等の単位で表すことができる。

【0019】

ＦＣＳまたはＦＣＣＳによって取得される大きさに関する情報として、流体力学的半径、流体力学的直径、体積などが例示される。流体力学的半径および流体力学的直径は、例えばナノメートル（ｎｍ）等の単位で表すことができる。体積は、立方ナノメートル（ｎｍ^３）等の単位で表すことができる。

【0020】

ＦＣＳにおいて使用する蛍光色素は、１色であるため、ＦＣＳ解析装置が検出できる範囲のいずれの蛍光色素も使用することができる。

【0021】

一方、ＦＣＣＳは、２種類の蛍光色素を使い、これらの蛍光色素をほぼ同時に検出する。このため、使用する２種類の蛍光色素の蛍光波長は、互いに異なることが好ましい。例えば、２色の蛍光色素のうち一方の蛍光色素の蛍光波長のピークが４００ｎｍから５５０ｎｍの範囲である場合、もう一方の蛍光色素の蛍光波長のピークは、６００ｎｍから８００ｎｍの範囲であることが好ましい。励起波長で表現すると、２色の蛍光色素のうち一方の蛍光色素の励起波長のピークが４００ｎｍから５００ｎｍの範囲である場合、もう一方の蛍光色素の励起波長のピークは、５３０ｎｍから７００ｎｍの範囲であることが好ましい。例えば、一方の蛍光色素にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ２等を使用する場合には、もう一方の蛍光色素にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ６４７、ローダミン、Ｃｙ５等を使用することができる。蛍光スペクトルが重なる２種類の蛍光色素を使用する場合には、例えば、バンドパスフィルター等を介して蛍光シグナルを検出してもよい。

【0022】

標的ポリペプチドに標識する蛍光色素と、参照ポリペプチドに標識する蛍光色素は、同じであることが好ましい。

【0023】

参照ポリペプチドまたは標的ポリペプチドには、公知の方法により共有結合などの化学結合を介して蛍光色素を標識することができる。以下、化学結合を介する蛍光標識方法を直接標識法ともいう。例えば、アミノラベリング、チオールラベリング等を利用して蛍光色素をポリペプチドに共有結合により標識することができる。アミノラベリングは、蛍光色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ｓｕｌｆｏｄｉｃｈｏｌｏｒｐｈｅｎｏｌ（ＳＤＰ）エステル、ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ（ＴＦＰ）エステル等を使用し、前記エステルと、ポリペプチドのアミンとのアミンカップリング反応により蛍光色素を標識することができる。また、チオールラベリングは、蛍光色素のマレイミド誘導体とポリペプチドのチオール基との共有結合により、蛍光色素を標識することができる。

【0024】

標識を行う際、ポリペプチドと蛍光色素エステルまたは蛍光色素誘導体は所定の反応バッファー内で混合される。ポリペプチドと蛍光色素エステルまたは蛍光色素誘導体の混合比は、ポリペプチド１モルに対して、蛍光色素エステルまたは蛍光色素誘導体２モルから５０モルとすることができる。２つの蛍光色素を使用する場合には、例えば、ポリペプチド１モルに対して、第１の蛍光色素エステルまたは第１の蛍光色素誘導体２モルから５０モルおよび第２の蛍光色素エステルまたは第２の蛍光色素誘導体２モルから５０モルとすることができる。第１と第２の蛍光色素エステルまたは蛍光色素誘導体のモル比は同じになるように混合することが好ましい。

【0025】

標識反応は、暗所で、例えば２０℃から２８℃で攪拌しながら、３０分から２時間程度行うことができる。

【0026】

蛍光標識されたポリペプチドは、反応液を脱塩・バッファー交換用カラム等を使用して脱塩し、未反応の蛍光色素エステルまたは蛍光色素誘導体を除去することにより精製することができる。脱塩・バッファー交換用カラムとして、例えば、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ． Ｎｏ． ２９０４８６８４）を使用することができる。

【0027】

別の実施形態として、参照ポリペプチドまたは標的ポリペプチドに蛍光標識プローブを使用して、公知の方法によりプローブを介して蛍光色素を標識することができる。以下、プローブを介する蛍光標識方法を間接標識法ともいう。ここで、プローブは、個々の参照ポリペプチド、または標的ポリペプチド等に特異的に結合できる限り制限されない。本明細書では、特異的に結合するとは、測定に悪影響を及ぼさない程度の非特異的な反応を含んでよいことを意味する。プローブには、抗体、レクチン、アプタマー等が含まれる。プローブは好ましくは抗体である。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）_２等）のいずれも用いることができる。免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスは特に制限されない。前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）等であってもよい。また、抗体には、ラクダ科動物由来重鎖抗体のＶＨＨ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）ドメイン、軟骨魚類（例えばサメ）重鎖抗体ＩｇＮＡＲ（ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）由来のＶＮＡＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ドメイン等も含み得る。蛍光標識プローブとして使用される抗体は、それ自体の分子サイズが小さいＦａｂ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、ｓｃＦｖを使用することが好ましい。

【0028】

ＦＣＳでは、個々の参照ポリペプチド、または標的ポリペプチドに結合するプローブには、同じ蛍光波長の蛍光色素、好ましくは同じ蛍光色素を標識することができる。

【0029】

ＦＣＣＳでは、前記１−１．で述べた蛍光波長の異なる２種類の蛍光色素をポリペプチドに結合させて、参照ポリペプチドが２種類の蛍光色素を含むように蛍光標識を行うことができる。この場合、2種類の蛍光色素のうち一方の蛍光色素を含む第1プローブと、他方の蛍光色素を含む第2プローブとをポリペプチドに結合させることが好ましい。標的ポリペプチドについても同様に、蛍光波長の異なる２種類の蛍光色素を異なる２つのプローブに結合させて標的ポリペプチドが２種類の蛍光色素を含むように蛍光標識を行うことができる。このとき、参照ポリペプチドに標識される２種類の蛍光色素は、標的ポリペプチドに標識される蛍光色素と同じであることが好ましい。

【0030】

第１プローブと第２プローブが認識するポリペプチド内の領域は、異なっていても同じであってもよいが、異なっていることが好ましい。プローブが抗体の場合、第１蛍光色素を含む第１抗体のエピトープと第２蛍光色素を含む第２抗体のエピトープは、１つのポリペプチド内の異なる部位であることが好ましい。

【0031】

蛍光標識プローブは、ＰＢＳ等のバッファー内、検体内、または希釈検体内で、個々の参照ポリペプチド、または標的ポリペプチドと混合し結合させることができる。希釈検体は、ＰＢＳ、生理食塩水等で１．５倍から１０倍程度に希釈された検体であり得る。反応時間は、例えば、室温（約２３℃から２７℃）、３分から７分程度である。蛍光標識抗体は、例えば、タンパク質濃度で５０ｎＭから１５０ｎＭ程度添加することができる。この反応により、蛍光標識された各参照ポリペプチド、または蛍光標識された標的ポリペプチドを調製することができる。

【0032】

１−２．標的ポリペプチドの情報取得方法
本発明のある実施形態は、標的ポリペプチドの情報取得方法（以下、単に「情報取得方法」と呼ぶことがある）に関する。情報取得方法は、ＦＣＳまたはＦＣＣＳにより、蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間と、蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの拡散時間を取得する第１の工程と、蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの拡散時間に基づいて、蛍光標識した標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する第２の工程と、を含む。

【0033】

（１）第１の工程：拡散時間取得工程
第１の工程では、各標準サンプルから、蛍光標識した参照ポリペプチドの拡散時間が取得される。標準サンプルは、直接標識により蛍光標識した参照ポリペプチドまたは間接標識により蛍光標識した参照ポリペプチドを用いて調製され得る。標準サンプルには、蛍光標識した第１の参照ポリペプチドを含む第１の標準サンプルと、蛍光標識した第２の参照ポリペプチドを含む第２の標準サンプルとが含まれる。したがって、各標準サンプルから取得される拡散時間は、蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間を含む。標準サンプルが蛍光標識した第３の参照ポリペプチドを含む第３の標準サンプルをさらに含む場合には、標準サンプルから取得される拡散時間は、少なくとも蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第３の参照ポリペプチドの拡散時間を含む。

【0034】

各参照ポリペプチドを直接標識法により蛍光標識する場合、一実施形態では、水性溶媒中で参照ポリペプチドと蛍光色素とを反応させ、その反応液を標準サンプルとして用いることができる。別の実施形態では、蛍光標識された参照ポリペプチドと水性溶媒とを混合し、その混合液を標準サンプルとして用いることができる。標準サンプルは、参照ポリペプチドごとに調製される。本明細書における「水性溶媒」は、液状の溶媒であれば特に限定されない。水性溶媒としては、水、緩衝液、生理食塩水などが例示される。また、生体から採取された液状の検体を「水性溶媒」として用いてもよい。検体は、細胞などの不溶性成分を含んでいてもよく、全血、血漿、血清、脳脊髄液、尿等の検体が例示される。また、検体は必要に応じて公知の方法により不溶性成分の除去や希釈などの前処理を行ってもよい。

【0035】

参照ポリペプチドを間接標識法により蛍光標識する場合、一実施形態では、水性溶媒中で参照ポリペプチドと蛍光プローブとを反応させる。この実施形態ではその反応液を標準サンプルとして用いることができる。別の実施形態では、蛍光標識された参照ポリペプチドと水性溶媒とを混合し、その混合液を標準サンプルとして用いることができる。

【0036】

さらに、第１の工程では、測定サンプルから、蛍光標識された標的ポリペプチドの拡散時間が取得される。

【0037】

直接標識法により蛍光標識した標的ポリペプチドまたは間接標識法により蛍光標識した標的ポリペプチドを用いて測定サンプルを調製することができる。標的ポリペプチドを直接標識法により蛍光標識する場合、一実施形態では、水性溶媒中で標的ポリペプチドと蛍光色素とを反応させ、その反応液を測定サンプルとして用いることができる。

【0038】

標的ポリペプチドを間接標識法により蛍光標識する場合、一実施形態では、水性溶媒中で標的ポリペプチドと蛍光プローブとを反応させる。この実施形態ではその反応液を測定サンプルとして用いることができる。別の実施形態では、蛍光標識された標的ポリペプチドと水性溶媒とを混合し、その混合液を測定サンプルとして用いることができる。

【0039】

液中の分子の拡散時間は水性溶媒の粘度が影響する。したがって、好ましくは、蛍光標識した参照ポリペプチドを含む水性溶媒の粘度と、蛍光標識した標的ポリペプチドを含む水性溶媒の粘度とは同程度である。より好ましくは、蛍光標識した参照ポリペプチドを含む水性溶媒と、蛍光標識した標的ポリペプチドを含む水性溶媒とが同じである。測定サンプルが蛍光標識した標的ポリペプチドが生体から採取された検体などの不純物を含む水性溶媒に含まれる場合には、標準サンプルは蛍光標識した各参照ポリペプチドと、測定サンプルに用いた水性溶媒と同じ水性溶媒とを混合することにより調製されることが好ましい。この場合、より好ましい実施形態では、生体から採取された検体などの水性溶媒を複数に分割し、一方には標的ポリペプチドを標識する蛍光標識プローブが添加され、他方には蛍光標識した参照ポリペプチドが添加される。これにより、蛍光標識した標的ポリペプチドを含む測定サンプルと、蛍光標識した参照ポリペプチドを含む標準サンプルとが調製され得る。より具体的には、生体から採取された標的ポリペプチドを含む検体を第１アリコート、第２アリコートおよび第３アリコートに分割する。第１アリコートと標的ポリペプチドと結合する蛍光標識プローブとを混合することにより、蛍光標識した標的ポリペプチドを含む測定サンプルを調製することができる。第２アリコートと蛍光標識した第１の参照ポリペプチドとを混合することにより、第１の標準サンプルを調製することができる。また、第３アリコートと蛍光標識した第２の参照ポリペプチドとを混合することにより、第２の標準サンプルを調製することができる。

【0040】

蛍光標識された各参照ポリペプチドまたは蛍光標識された標的ポリペプチドを含む測定サンプルの粘度は、２３℃で、０．８００〜３０．００ｍＰａ．ｓ程度であることが好ましい。また、ペプチド溶液に含まれる蛍光色素の量は、０．１ｎＭから１０００ｎＭ程度となるように調製することが好ましい。

【0041】

一実施形態では、標的ポリペプチドと蛍光色素との結合様式は、参照ポリペプチドと蛍光色素との結合様式と同じである。例えば、標的ポリペプチドに直接標識により蛍光色素が結合している場合、参照ポリペプチドには直接標識により蛍光色素が結合してよい。標的ポリペプチドに間接標識により蛍光色素が結合している場合、参照ポリペプチドには間接標識により蛍光色素が結合してよい。この場合、標的ポリペプチドと蛍光色素との間接標識に用いられる蛍光標識プローブの種類は、参照ポリペプチドと蛍光色素との間接標識に用いられる蛍光標識プローブの種類と同じであることが好ましい。具体例としては、標的ポリペプチドが、当該標的ポリペプチドに特異的に結合する蛍光標識抗体により標識され、参照ポリペプチドは、当該参照ポリペプチドに特異的に結合する蛍光標識抗体により標識される。

【0042】

別の実施形態では、標的ポリペプチドと蛍光色素との結合様式は、参照ポリペプチドと蛍光色素との結合様式と相違する。参照ポリペプチドはポリペプチドの大きさに関する情報について標的ポリペプチドの参照となることができればよいため、必ずしも結合様式が同じである必要はない。例えば、標的ポリペプチドに直接標識により蛍光色素が結合している場合、参照ポリペプチドには間接標識により蛍光色素が結合してよい。標的ポリペプチドに間接標識により蛍光色素が結合している場合、参照ポリペプチドには直接標識により蛍光色素が結合してよい。具体例としては、標的ポリペプチドが、当該標的ポリペプチドに特異的に結合する蛍光標識抗体により標識され、参照ポリペプチドは、当該参照ポリペプチドは共有結合を介して蛍光色素により標識される。

【0043】

後述する拡散時間の取得において、測定サンプル中の蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間と、第１の標準サンプル中の蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間と、第２の標準サンプル中の蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間とがそれぞれ取得され得る。

【0044】

各サンプルは、例えば、３８４ウェルのガラス底プレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ４４３７−１６ＥＡ）等に３０μｌ程度ずつ独立して分注し、測定に供する。標準サンプルおよび測定サンプルの測定時の温度は、同程度にすることが好ましく、例えば、２３℃から２５℃程度で測定することがより好ましい。

【0045】

測定に使用するレーザーは、各サンプルに含まれる蛍光色素を励起できる限り制限されない。レーザーは、１ｆＬ領域程度まで焦点を絞り、サンプル中の蛍光標識ポリペプチドが共焦点領域を通過した時に発する蛍光シグナルを検出する。ＦＣＳでは、１つのレーザーを使って蛍光色素を励起し、経時的に蛍光シグナルを取得する。ＦＣＣＳでは、２つのレーザーを使って蛍光色素を励起し、経時的に蛍光シグナルを取得する。検出された蛍光シグナルの生データは、信号強度と測定時間とで表されるデータ群である。この生データの処理は、ＦＣＳとＦＣＣＳとで異なるため、以下に両者を分けて説明する。

【0046】

生データには、必要に応じてベースラインのドリフトまたはバースト（平均蛍光輝度と3倍以上高い蛍光信号）を示す測定値を削除する前処理を行ってもよい。

【0047】

（ｉ）ＦＣＳ
上述したＦＣＳ解析装置により、単一波長の光子計測の生データを取得する。生データの自己相関分析を行い、自己相関関数の生曲線を取得する。自己相関関数の曲線に対して適切なフィッティングモデルによるフィッティングを行い、相関関数Ｇ（τ）とｌａｇ ｔｉｍｅ（τ）によって引かれる相関曲線を求める。

【0048】

測定サンプルおよび標準サンプルが、生体から採取した検体を用いて調製される場合、２成分モデルで自己相関関数によるフィッティングを行うことができる。２成分モデルで使用する１成分目は、例えば未反応の蛍光標識プローブとすることができる。２成分目は、各ポリペプチドとこれらに対応する蛍光標識プローブとの各複合体とすることができる。例えば、Ｚｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ等の解析ソフトウエア上で、１成分モデルを選択し、蛍光標識プローブごとに、１成分目の拡散時間を測定する。次に、同じソフトウエア上で、２成分モデルを選択し、１成分目の拡散時間を先に測定した１成分目の拡散時間に固定し、２成分目の拡散時間を測定する。

【0049】

（ｉｉ）ＦＣＣＳ
上述したＦＣＣＳ解析装置により、２波長の光子計測生データを取得する。生データの相互相関分析を行い、相互相関関数の生曲線を取得する。相互相関関数の曲線に対して適切なフィッティングモデルでフィッティングを行い、例えばＸ軸がｌａｇ ｔｉｍｅ （τ）、Ｙ軸が相互相関関数Ｇ（τ）で表される相関曲線を得る。具体的な関数は実施例のＥｑ．１Ａ、Ｅｑ．１Ｂ、Ｅｑ．２、及びＥｑ．３に示す。

【0050】

ＦＣＣＳでは、１成分モデルで相関関数のフィッティングを行うことができる。１成分は、各ポリペプチドとこれらに対応する蛍光標識プローブとの各複合体である。Ｚｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ等のソフトウエア上で、１成分モデルを選択し、各複合体の拡散時間を測定する。ＦＣＣＳは１つのポリペプチドに対して２種類の蛍光色素を使用するため、より精度の高い解析が可能である。

【0051】

ここで、τ＝０の時のＧ（τ）の値を原点の値とし、拡散時間は原点の値が１／２となったときのｌａｇ ｔｉｍｅ τを示す。具体的には、ｌａｇ ｔｉｍｅ（τ）が０であるＧ（τ）値、すなわちＧ（０）がａである場合、拡散時間は、Ｇ（τ）＝ａ×１／２となるｌａｇ ｔｉｍｅ τを意図する。より具体的には、相関関数Ｇ（τ）において、Ｇ（０）の時の値を１に換算した時、拡散時間は、Ｇ（τ）＝０．５となるｌａｇ ｔｉｍｅ τである。したがって、相関関数Ｇ（τ）は、最大値が「１」、最小値が「０」となるように基準化してもよい。相関関数Ｇ（τ）を基準化する場合、最大値および最小値の組み合わせは、適宜設定することができる。例えば、最大値が「２」および最小値が「１」である組み合わせとしてもよく、最大値が「１００」および最小値が「０」である組み合わせ等としてもよい。

【0052】

（２）第２の工程：情報取得工程
第１の工程で得られた各標準サンプルに含まれる参照ポリペプチドの所定のＧ（τ）値に対応する拡散時間を参照として、標的ポリペプチドの拡散時間から、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得することができる。蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間が取得されている場合には、これらを参照として、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する。蛍光標識した第１の参照ポリペプチドの拡散時間、蛍光標識した第２の参照ポリペプチドの拡散時間、および蛍光標識した第３の参照ポリペプチドの拡散時間が取得されている場合には、これらを参照として、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する。

【0053】

好ましくは、各標準サンプルに含まれる参照ポリペプチドの所定のＧ（τ）値に対応する拡散時間とあらかじめわかっている各々の参照ポリペプチドの大きさに基づいて回帰式を求め検量線を作成する。参照ポリペプチドの所定のＧ（τ）値と同じ標的ポリペプチドのＧ（τ）値に対応する拡散時間を取得する。取得した標的ポリペプチドの拡散時間を検量線にあてはめ、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する。ここで求められる標的ポリペプチドの大きさは、蛍光標識されていない標的ポリペプチドの大きさである。

【0054】

（３）実施形態の一例
本実施形態の方法の原理について、図１に示す具体例を用いて説明する。図1に示す例はあくまで一例であり、本発明は、この例に限定して解釈されるものではない。図１には、蛍光相互相関分光法を用いた情報取得方法を示す。

【0055】

工程Ａにおいて蛍光色素で標識した複数の参照ポリペプチドについて、ＦＣＣＳにより拡散時間（ｌａｇ ｔｉｍｅともいう）τを取得する。溶液中の分子は、ブラウン運動等により常に自由に移動している。ＦＣＳおよびＦＣＣＳは、共焦点レーザーを用い、溶液中の分子が共焦点領域を通過した時に発する蛍光シグナルを検出する。検出された蛍光シグナルの生データは、信号強度と測定時間とで表される。これを、ＦＣＣＳでは相互相関関数でフィッティングし、例えばＸ軸が拡散時間（τ）、Ｙ軸が相関関数Ｇ（τ）で表される相関曲線が得られる。ＦＣＳの場合には、検出された蛍光シグナルの生データを自己相関関数でフィッティングし、相関関数Ｇ（τ）の曲線を得ることができる。ここで、工程Aに示されている相関関数Ｇ（τ）は基準化後の相関曲線である。

【0056】

工程Ｂにおいて、検量線が作成される。参照ポリペプチドは、あらかじめ大きさがわかっているため、それぞれの参照ポリペプチドにおける一定のＧ（τ）値に対応する拡散時間と、それぞれの参照ポリペプチドの大きさ（ここでは、流体力学的半径）から回帰式を求め、検量線を作成することができる。

【0057】

工程Ｃは、蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間を求める工程である。拡散時間は、参照ポリペプチドの拡散時間と同様に求めることができる。

【0058】

工程Ａと工程Ｃは、蛍光標識した標的ポリペプチドの拡散時間と、蛍光標識した複数の参照ポリペプチドの拡散時間を取得する工程に相当する。工程Aと工程Cの順序は限定されない。工程Cの前に工程Aを行ってもよいし、工程Aの前に工程Cを行ってもよいし、工程Aと工程Cとを同時に行ってもよい。

【0059】

工程Ｄは、工程Ｂで作成した検量線と、工程Ｃで求めた標的ポリペプチドの拡散時間から、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得する工程である。検量線を作成した時のＧ（τ）値に対応する標的ポリペプチドの拡散時間を検量線にあてはめ、標的ポリペプチドの分子の大きさに関する情報を取得する。

【0060】

２．試薬キット
本発明のある実施形態は、試薬キットに関する。試薬キットは、上記１−２．で述べた蛍光標識した複数の参照ポリペプチドを含む。この試薬キットは、標的ポリペプチドの大きさに関する情報を取得するためのキャリブレータとして用いられ得る。蛍光標識した複数の参照ポリペプチドは、それぞれ別の容器に収容されていることが好ましい。試薬キットは、図２に例示するキットとしてユーザに提供され得る。試薬キット５０は、外装箱５５と、蛍光標識された第１の参照ポリペプチドを格納する第１容器５１と、蛍光標識された第２の参照ポリペプチドを格納する第２容器５２と、蛍光標識された第３の参照ポリペプチドを格納する第３容器５３と、試薬キットの添付文書５４とを含む。添付文書５４には、試薬キットの取り扱い方法、保管条件、使用期限などを記載しておくことができる。希釈用の水性溶媒を含む容器などを外装箱５５に同梱してもよい。

【0061】

また、試薬キットは、複数の参照ポリペプチドと、前記複数の参照ポリペプチドのそれぞれと結合する蛍光標識抗体を含む試薬キットとしてユーザに提供されてもよい。

【0062】

複数の参照ポリペプチドのそれぞれと結合する蛍光標識抗体は、１つの参照ポリペプチドに対して結合する第１の蛍光標識抗体と第２の蛍光標識抗体を含んでいてもよい。好ましくは、第１の蛍光標識抗体は、標識されている蛍光色素の蛍光波長が前記第２の蛍光標識抗体に標識されている蛍光色素の蛍光波長と異なる。また、第１の蛍光標識抗体のエピトープは、第２の蛍光標識抗体のエピトープとは異なることが好ましい。

【実施例】

【0063】

以下に、実施例を用いて本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定して解釈されるものではない。

【0064】

I．方法
１．参照ポリペプチド
参照ポリペプチドとして、Aprotinin（Sigma-Aldrich, A3886-1VL, 流体力学的半径1.4 nm）；Hen egg-white lysozyme（lysozyme）（Sigma-Aldrich, L4919-500MG, 流体力学的半径1.9 nm）；Carbonic anhydrase（CA）（Sigma-Aldrich, C7025-1VL, 流体力学的半径2.1 nm）；ウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma-Aldrich, A8531-1VL, 流体力学的半径3.5 nm）；β−アミラーゼ（Sigma-Aldrich, A8781-1VL, 流体力学的半径5.4 nm）、Apo-ferritin（Sigma-Aldrich, A3660-1VL, 流体力学的半径6.4 nm）、Thyroglobulin（Sigma-Aldrich, T1001-100MG, 流体力学的半径8.6 nm）を使用した。

【0065】

２．ポリペプチドへの蛍光標識
（１）蛍光色素のポリペプチドへの直接標識
Alexa Fluor（商標） 647 (Invitrogen, Cat. No. A20006)、および／またはAlexa Fluor（商標） 488 (Invitrogen, Cat. No. A20000)のN-hydroxy succinimidyl (NHS) esterを用いて参照ポリペプチドおよび標的ポリペプチドのアミンに、アミンカップリング反応により蛍光色素を標識した。FCSで測定する各ポリペプチドには、上記のうちいずれか1種類の蛍光色素を標識した。FCCSで測定する各ポリペプチドには、上記の2種類の蛍光色素を標識した。
アミンカップリング反応は、蛍光色素とポリペプチドとをPBSの中で混合し、暗所の室温で400 rpmで攪拌しながら１時間行った。

【0066】

FCSでは、ポリペプチドと蛍光色素のNHS esterの混合比は、モル比で、Aprotinin：蛍光色素＝１：２、CA：蛍光色素＝１：２、lysozyme：蛍光色素＝１：２、BSA：蛍光色素＝１：５、β−アミラーゼ：蛍光色素＝１：20、Apo-ferritin：蛍光色素＝１：20、Thyroglobulin：蛍光色素＝１：50とした。FCCSにおいて2つの蛍光色素を使用する場合には、例えば、モル比をAprotinin：第１の蛍光色素：第２の蛍光色素＝１：２：２のように、第１と第２の蛍光色素のモル比は同じになるように混合した。

【0067】

アミンカップリング反応後に、HiTrap Desalting column (GE Healthcare Cat. No. 29048684)を使って、反応液を脱塩し、未反応の蛍光色素を除去した。脱塩後の反応液を、さらにTSKgel G3000SWXL column (TOSOH Cat. No. 08541)を使った超高速液体クロマトグラフィ(Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC)に供し、蛍光標識ポリペプチドの品質を解析した。

【0068】

蛍光標識ポリペプチドの品質は、230 nmから700 nmの領域の蛍光スペクトルを取得し、タンパク質に由来する280 nmの領域と、各蛍光色素の蛍光波長領域のピークを観察することで評価した。

【0069】

（２）蛍光色素のポリペプチドへの間接標識
間接標識は、血清や血漿のように多数の成分を含む検体中の標的ポリペプチドを検出する測定で使用した。

【0070】

標的ポリペプチドに対するAlexa Fluor（商標） 647またはAlexa Fluor（商標） 488を結合した標識抗体を検体に含まれる各ポリペプチドと反応させることにより、標的ポリペプチドに間接的に蛍光標識をした。FCCSで測定する各ポリペプチドには、Alexa Fluor（商標）647標識抗体とAlexa Fluor（商標）488標識抗体の両方を使って標識した。

【0071】

血清または血漿には、検体と同じ量の蛍光標識抗体溶液を添加した。蛍光標識抗体を添加したあと、暗所、室温、5分間混合し、インキュベートした。その後、13,000 rpm/5分遠心し、上清を測定サンプルとした。

【0072】

３．測定
（１）蛍光標識参照ポリペプチドの測定
水性溶媒としてPBSを用いる場合には、蛍光色素を直接標識した各蛍光標識参照ポリペプチドを100 nMとなるようにPBSに添加し、検量線作成用の標準サンプルとした。水性溶媒として希釈検体を用いる場合には、血清または血漿に各蛍光標識参照ポリペプチドを100 nMとなるように添加し検量線作成用の標準サンプルとした。

【0073】

それぞれの標準サンプルを、ブロッキング試薬N101（日本油脂、71S410050011）であらかじめブロッキングされた384ウェルのガラス底プレート（Sigma-Aldrich, M4437-16EA）に30μlずつ添加し、測定に供した。測定は、LSM710レーザーモジュールを備えたZeiss AxioObserverのConfocor3セットアップで行った。Alexa Fluor（商標） 488は488 nmのレーザーで励起した。Alexa Fluor（商標） 647は、633 nm レーザーで励起した。488 nmおよび633 nmのレーザーは、それぞれ8 mWおよび1.2 mWで出力した。各ウェルあたり１回の測定を20秒間とし、10回の測定を行った。すなわち、各ウェルあたりの総測定時間を 200秒とした。相関関数は、この10回の測定に基づいて算出した。測定時の温度は23℃とした。FCS解析、およびFCCS解析には、Zeiss社のZen softwareを使用した。

【0074】

（２）各関数のフィッティングとポリペプチドのサイズ推定
Zen softwareを使用し、取得した生データに対して、ベースラインのドリフトまたはバースト（平均蛍光輝度と3倍以上高い蛍光信号）を示す測定値を削除する前処理を行った。FCCSにおいて使用する相互相関、及びFCSに使用する自己相関曲線のフィッティングは、3D拡散モデルに基づく1成分または2成分フィッティング（3D、または3D＋3D、またはT×3D、またはT×{3D＋3D}）により行った。

【0075】

3次元1成分相関曲線（3D）を求めるためのフィッティング関数G（τ）は、下記Eq. 1Aで表される。3次元2成分相関曲線（3D+3D）を求めるためのフィッティング関数G（τ）は、下記Eq. 1Bで表される。両方ともの関数は、並進拡散プロセスを示す。相互相関曲線から並進拡散時間を算出する場合、下記Eq.1AまたはEq.1Bのようにフィッティングモデルを使用した。

【0076】

【数1】

【数2】

【0077】

Eq.1Aにおいて、Nは振幅（分子数）を表す。τ_Dは拡散時間（μs）を示す。τは、lag timeを示す。ω(構造因子)は、レーザー焦点体積の横（XY）幅及び縦（Z）軸幅の比（w_z/w_xy）である。 Eq.1Bにおいて、Qは量子収率である。

【0078】

構造因子は、参照として使用される100 nM のAlexa Fluor（商標） 488 と10 nMのAlexa Fluor（商標） 647の色素混合物から得られた公知の拡散時間に基づいて、測定開始時に毎日割り当てた。

【0079】

三重項状態遷移時間（T）を算出する為、以下Eq.2のようにフィッティングモデルを使用した。
下記Eq. 2は、三重項状態遷移を示す。

【0080】

【数3】

Eq. 2において、Τは、は三重項状態振幅を示す。τ_Tは色素フルオロフォアの三重項状態遷移を示す。

【0081】

自己相関関数の場合は、並進拡散時間及び色素の三重項状態遷移時間両方（T×3D、又はT×{3D＋3D}）を含めた以下Eq. 3のようにフィッティングモデルを使用した。

【0082】

【数4】

上記各数式は公知（Krichevsky and Bonnet, 2002. Fluorescent Correlation Spectroscopy, the technique and its applications. Rep. Prog. Phys.65 251）である。

【0083】

(i)検体を用いたFCS解析
FCSは、2成分モデルで自己相関関数のフィッティングを行った。1成分目を未反応蛍光標識抗体とした。2成分目は、各参照ポリペプチドとこれらに対応する蛍光標識抗体との各免疫複合体とした。はじめに、Zen software 上で、１成分モデルを選択し、蛍光標識抗体ごとに、１成分目の拡散時間を、抗原を含まない別の独立した実験系で測定した(Tp₄₈₈またはTp₆₄₇)。次に、Zen software 上で、2成分モデルを選択し、1成分目の拡散時間を先に測定した1成分目の拡散時間(Tp₄₈₈またはTp₆₄₇)に固定した。2成分目の拡散時間を測定した。取得された拡散時間と、各参照ポリペプチドの流体力学的半径(nm)の回帰式を求め、検量線を作成した。

【0084】

標的ポリペプチドについても、参照ポリペプチドと同様に拡散時間を求め、検量線から、流体力学的半径を算出した。

【0085】

(ii) 希釈検体を用いたFCCS解析
FCCSは、1成分モデルで相関関数のフィッティングを行った。1成分は、各ポリペプチドとこれらに対応する蛍光標識抗体との各免疫複合体である。Zen software 上で、１成分モデルを選択し、各免疫複合体の拡散時間を測定した。取得された拡散時間と、各参照ポリペプチドの流体力学的半径(nm)の回帰式を求め、検量線を作成した。
標的ポリペプチドについても、参照ポリペプチドと同様に拡散時間を求め、検量線から、流体力学的半径を算出した。

【0086】

II．比較例１
比較例１として、非特許文献１に記載の比例転換を用いた。図３に比例転換の概略を示す。比例転換では、はじめに、スタンダードとして流体力学的半径R_HCが既知のAlexa Fluor（商標） 488（流体力学的半径R_HC=0.7 nm）の拡散時間と、Alexa Fluor（商標） 647（流体力学的半径R_HC=0.8 nm）の拡散時間とをFCSにより測定した（図３の工程１）。測定時の温度は23℃とした。続いて、スタンダードの自己相関関数を求め、蛍光色素の拡散時間を補正した（図３の工程２）。続いて、蛍光標識標的ポリペプチドの拡散時間をFCSで測定し、蛍光色素の拡散時間τ_DC（μs）と蛍光標識標的ポリペプチドの拡散時間τ_D（μs）と、スタンダードとして流体力学的半径R_HCから、蛍光標識標的ポリペプチドの流体力学的半径R_Hを求めた。

【0087】

III.実施例１
上記I．において説明した方法にしたがい、水性溶媒としてPBSまたは希釈検体を用い、参照ポリペプチドとして、Aprotinin、lysozyme、CA、BSA、β-Amylase、Apo-ferritin、Thyroglobulinを用いてFCCSにて拡散時間を測定し、検量線を作成した。さらに、血清１例、被検者が異なる血漿２例を検体として用いて、検量線を作成した。

【0088】

図４に、水性溶媒としてPBSを用いた場合と希釈血漿を用いた場合の拡散時間（lag time（s））の違いを示す。図４（A）は、PBS内で流体力学的半径を測定し、基準化した後の結果を示す。図４（B）は、希釈血漿内で流体力学的半径を測定し、基準化した後の結果を示す。図４（B）では、図４（A）に比べて、相関曲線が右にシフトした。また、図４（C）は、水性溶媒としてPBSを用いた場合と希釈血漿を用いた場合における検量線の違いを示す。検量線の傾きは、水性溶媒としてPBSを用いた場合と希釈血漿を用いた場合で変わらないが、PBSの方が接片が低くなった。このことから、PBSよりも粘度の高い希釈血漿では、分子移動速度が遅くなることが示された。

【0089】

図５に、異なる３種の検体を使用し取得した検量線を示す。図５（A）は、希釈血清を使用して測定した拡散時間に基づいて作成した検量線である。図５（B）は、希釈血漿１を使用して測定した拡散時間に基づいて作成した検量線である。図５（C）は、希釈血漿１とは異なる希釈血漿２を使用して測定した拡散時間に基づいて作成した検量線である。血漿と比べて、血清は拡散時間が短かった。また血漿に関しても、検体によって、拡散時間に差があることが示された。

【0090】

これらの結果から、標的ポリペプチドの大きさを予測するためには、参照ポリペプチドの測定も標的ポリペプチドと同等の溶媒環境で行い、検量線を作成することが好ましいと考えられた。

【0091】

また、参照ポリペプチドのそれぞれを標的ポリペプチドと仮定し、本発明のFCCSの希釈検体を用いた測定系で得られた検量線に基づいて、各参照ポリペプチドの流体力学的半径の予測値を算出した。検体は、血清、血漿１または血漿２を用いた。そして、ゲル濾過クロマトグラフィマーカとして記載されている分子サイズを流体力学的半径の理論値として予測値と理論値の間の差、および差の絶対値を求めた。図６（A）にβ-Amylaseについて求めた差の値を示す。また、図６（B）に、各検体において、各参照ポリペプチドについて求めた差の絶対値と参照ポリペプチドの流体力学的半径との関係を示す。

【0092】

さらに、比較例１の方法にしたがって、同様に参照ポリペプチドの予測値を算出し、それぞれの参照ポリペプチドの理論値と比較した。その結果を図７に示す。図７（A）は、β-Amylaseについて求めた予測値と理論値の差の値を示す。図７（B）は、各検体において、各参照ポリペプチドについて求めた差の絶対値と参照ポリペプチドの分子サイズとの関係を示す。比較例１に記載の方法では、スタンダードとして、Alexa Fluor（商標） 488およびAlexa Fluor（商標） 647の蛍光色素を用いた場合でも、予測値と理論値の差が大きかった。また、３種類の検体のいずれを用いた場合であっても、予測値と理論値の差が大きかった。特に、参照ペプチドの流体力学的半径が大きくなるほど、予測値と理論値の差が大きくなることが示された。

【0093】

これらの結果から、本発明の情報収集方法の方が、比較例よりも予測精度が高いことが示された。

【0094】

IV．実施例２
大きなサイズのポリペプチドについて、本発明の情報の取得方法により流体力学的半径の予測が可能であることを証明するため、FCCSを用いた本発明の情報取得方法にしたがって、フォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand factor：VWF；分子量約250kDa）の分子サイズを予測した。

【0095】

陽性サンプルとして、終濃度で、25nMとなるようにリコンビナントVWFタンパク質（Merck、681300-100UGCN）を血漿に添加したサンプルを調製した。陰性サンプルとして、リコンビナントVWFタンパク質を添加せず、リコンビナントVWFタンパク質溶液と同じ量のバッファーを血漿に添加したサンプルを調製した。陽性サンプルと陰性サンプルは、以下に示す同様の処理を行った。

【0096】

各サンプルに、Alexa Fluor（商標）488標識２F2A9抗体（BD Biosciences、555849）およびAlexa Fluor（商標）647標識NMC4 Fabを終濃度でそれぞれ100nMとなるように添加し、暗所室温で、５分間反応させた。NMC4 Fabは、公知のNMC4 Fabのアミノ酸配列から遺伝子組換えにより作製した。
上記３．に記載の方法にしたがって、FCCSの測定を行った。

【0097】

結果を図８に示す。図８（A）は、基準化前の相互相関G（τ）とlag timeを示す。図８（B）は、本発明の情報取得方法に基づいて算出されたリコンビナントVWFタンパク質の予測値、理論値、およびその差を示す。

【0098】

リコンビナントVWFタンパク質の流体力学的半径の理論値は、抗体と反応させていない状態で16.25 nmであり、比較的大きなタンパク質である。このように大きなタンパク質であっても、予測値と実測値の差は2.3 nmと小さく、精度よく予測が可能であることが示された。

【0099】

V．実施例３
小さなサイズのポリペプチドについて、本発明の情報の取得方法により流体力学的半径の予測が可能であることを証明するため、FCCSを用いた本発明の情報取得方法にしたがって、卵白リゾチーム（分子量約14kDa；流体力学的半径３ nm）の流体力学的半径を予測した。

【0100】

陽性サンプルとして、終濃度で、100 nMとなるように卵白リゾチームタンパク質（Sigma-Aldrich、L4919-500MG）を血漿に添加したサンプルを調製した。陰性サンプルとして、卵白リゾチームタンパク質を添加せず、卵白リゾチームタンパク質溶液と同じ量のバッファーを血漿に添加したサンプルを調製した。陽性サンプルと陰性サンプルは、以下に示す同様の処理を行った。

【0101】

各サンプルに、Alexa Fluor（商標）488標識cAB-Lys2 VHHおよびAlexa Fluor（商標）647標識D2L24 VHHを終濃度でそれぞれ100 nMとなるように添加し、暗所室温で、５分間反応させた。cAB-Lys2 VHHおよびD2L24 VHHは、それぞれ公知のcAB-Lys2 VHHのアミノ酸配列およびD2L24 VHHのアミノ酸配列から遺伝子組換えにより作製した。
上記３．に記載の方法にしたがって、FCCSの測定を行った。

【0102】

結果を図９に示す。図９（A）は、基準化前の相互相関G（τ）とlag timeを示す。図９（B）は、本発明の情報取得方法に基づいて算出された卵白リゾチームタンパク質の予測値、理論値、およびその差を示す。

【0103】

卵白リゾチームタンパク質の流体力学的半径の理論値は、抗体と反応させていない状態で3 nmであり、比較的小さなタンパク質である。このように小さなタンパク質であっても、予測値と実測値の差は0.5 nmと小さく、精度よく予測が可能であることが示された。

【0104】

VI．実施例４および比較例２
水性溶媒としてPBSを用いた測定系において、本発明の情報取得方法をFCCSにより実施した場合の予測精度を評価した。

【0105】

実施例４では、上記３．で述べた水性溶媒としてPBSを用いたFCCSの測定系を使用し、上述の２色の蛍光色素で二重標識した参照ポリペプチドを用いて検量線を作成した。それぞれの参照ポリペプチドを標的ポリペプチドと仮定し、それぞれの参照ポリペプチドの流体力学的半径を検量線から求めた。図１０（A）は、FCCSでの各参照ポリペプチドの拡散時間（μs）と、流体力学的半径の予測値を示す。また、図１０（B）は、図１０（A）に基づいて作成した検量線を示す。図１０（C）は、実施例４により求められた予測値と理論値の差の絶対値と、精度を示す。精度（％）は、100％から%エラーを差し引くことにより求めた。％エラーは、100×［（差の絶対値）÷（理論値）］の式でもとめた。

【0106】

また、比較例２において、FCCSで測定した拡散時間測定値τ_DCを使って比較例１と同様に非特許文献１に記載の比例転換により流体力学的半径を予測した。但し、スタンダードは、FCCSで測定できるよう、蛍光色素にかえてAlexa Fluor（商標） 647標識抗BSA抗体、およびAlexa Fluor（商標） 488標識抗BSA抗体を結合させたBSAを用いた。また、測定系はPBSを水性溶媒として用いた。二重蛍光標識BSAの流体力学的半径R_HCは、3.5 nmであり、拡散時間測定値τ_DCは、230 μsである。二重蛍光標識したそれぞれの参照ポリペプチドを標的ポリペプチドと仮定し、それぞれの参照ポリペプチドの流体力学的半径を比較例１の方法にしたがって求めた。図１０（D）は、比較例２により求められた予測値と理論値の差の絶対値と、精度を示す。用語の定義は、図１０（C）と同様である。

【0107】

比較例２は、スタンダードとしてBSAを用いているため、差の絶対値は０、予測精度は100％となったが、それ以外は本発明の実施例４の方が精度が高かった。

【0108】

VII．実施例５、参考例および比較例３
水性溶媒としてPBSを用いた測定系において、本発明の情報取得方法をFCSにより実施した場合の予測精度を評価した。

【0109】

実施例５では、上記３．で述べた水性溶媒としてPBSを用いたFCSの測定系を使用し、上述の２色の蛍光色素で標識した参照ポリペプチドを用いて検量線を作成した。それぞれの参照ポリペプチドを標的ポリペプチドと仮定し、それぞれの参照ポリペプチドの流体力学的半径を検量線から求めた。検量線を図１１（A）は、FCSでの各参照ポリペプチドの拡散時間（μs）と、流体力学的半径の予測値を示す。また、図１１（B）は、図１１（A）に基づいて作成した検量線を示す。

【0110】

参考例は、非特許文献２に記載のキャリブレータとして蛍光ビーズを使用する方法で測定した例である。図１１（C）に示すように、様々な粒子径の蛍光ビーズの拡散時間（ｍ秒）をFCSで測定し、拡散時間と粒子径に基づいて回帰式を作成し、この回帰式に蛍光標識した標的ポリペプチドのFCSで測定した拡散時間をあてはめた。Alexa Fluor（商標） 647標識抗体と反応させたそれぞれの参照ポリペプチドを標的ポリペプチドと仮定して流体力学的半径を求めた。

【0111】

比較例３は、II.で述べた比較例１と同様の方法で、流体力学的半径を求めた例である。スタンダードとして、Alexa Fluor（商標） 647色素を使用した。また、測定系はPBSを水性溶媒として用いた。Alexa Fluor（商標） 647色素の流体力学的半径R_HCは、0.8 nmであり、拡散時間測定値τ_DCは、49 μsである。蛍光標識したそれぞれの参照ポリペプチドを標的ポリペプチドと仮定し、それぞれの参照ポリペプチドの流体力学的半径を比較例１の方法にしたがって求めた。

【0112】

図１２（A）は、実施例５の結果を、図１２（B）は、参考例の結果を、図１２（C）は、比較例３の結果を示す。実施例５は、使用した参照ポリペプチドの範囲において、良好な精度を示した。参考例および比較例３は、流体力学的半径が大きい範囲での精度が実施例５と比べて不良であり、流体力学的半径が実際よりも小さく出る傾向があることが示された。

【0113】

図１３（A）は、β-Amylaseの差の絶対値の比較データを示す。図１３（B）は、Thyroglobulinの差の絶対値の比較データを示す。実施例５は、どちらのポリペプチドにおいても、参考例および比較例３よりも、差の絶対値が小さかった。

【0114】

異常タンパク質は正常タンパク質と比較して流体力学的半径が大きいことがある。そのような場合は、非特許文献１および非特許文献２に記載の方法では、異常タンパク質の流体力学的半径が実際より小さく見積もられてしまい、偽陰性のリスクがあると考えられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】