特開 2021-193982 標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株、その製造方法及びそれを製造するためのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-193982(P2021-193982A)

(43)【公開日】2021年12月27日

(54)【発明の名称】標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株、その製造方法及びそれを製造するためのキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20211129BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20211129BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20211129BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20211129BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20211129BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10ZNA

   C12N15/85 Z

   C12N15/55

   C12N15/09 110

   C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2020-105637(P2020-105637)

(22)【出願日】2020年6月18日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度国立研究開発法人科学技術振興機構、「戦略的創造研究推進事業」「一時繊毛由来微粒子の多次元動態と制御」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】池上 浩司

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】細胞に対して、内在プロモーターによって解析対象タンパク質の発現制御が適切になされる位置に、解析対象タンパク質の発現遺伝子を含む複数の核酸配列を導入することにより、生理的レベルでタグや蛍光タンパク質等で標識された解析対象タンパク質を発現する安定発現株を高効率で得られるようにする。
【解決手段】本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株は、ゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座において、前記解析対象タンパク質の５’非翻訳領域に、前記解析対象タンパク質が標識化された外来の標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列及び外来の薬剤耐性遺伝子配列を有し、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより、前記外来の標識化解析対象タンパク質の発現が制御される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座において、前記内在の解析対象タンパク質の５’非翻訳領域に、前記解析対象タンパク質が標識化された外来の標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列及び外来の薬剤耐性遺伝子配列が挿入されており、
前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより、前記外来の標識化解析対象タンパク質の発現が制御されることを特徴とする標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株。

【請求項2】

前記外来の標識化解析対象タンパク質は、タグ又は蛍光タンパク質に融合された解析対象タンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株。

【請求項3】

標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造する方法であって、
細胞に、前記標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置された標的配列と、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列とを導入する導入ステップと、
前記細胞のゲノムに前記標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列が挿入された細胞を選択的に取得する選択ステップとを含み、
前記導入ステップでは、薬剤耐性遺伝子配列をさらに導入し、
前記選択ステップでは、前記導入ステップ後の細胞を薬剤存在下で培養して前記薬剤耐性遺伝子が導入された細胞のみを選択することを含み、
前記標的配列は、前記細胞のゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に存在する配列と同一であり、
前記細胞株において、前記標識化解析対象タンパク質は、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより発現が制御されることを特徴とする標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法。

【請求項4】

前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列は、前記標的配列に結合するＤＮＡ結合ドメイン及び部位特異的に切断するヌクレアーゼを発現する核酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法。

【請求項5】

前記導入ステップは、前記標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列及び前記核酸配列の上流に配置された標的配列を含むドナーベクターと、前記ＤＮＡ結合ドメイン及び前記ヌクレアーゼを発現する発現ユニットを含む発現ベクターとを前記細胞に導入することを含む請求項４に記載の標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法。

【請求項6】

前記薬剤耐性遺伝子配列は、前記ドナーベクターに含まれていることを特徴とする請求項５に記載の標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法。

【請求項7】

前記標識化解析対象タンパク質は、タグ又は蛍光タンパク質に融合された解析対象タンパク質であることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載の標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法。

【請求項8】

前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択されることを特徴とする請求項３〜７のいずれか１項に記載の標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法。

【請求項9】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）及びＣ２ｃ３から選択されることを特徴とする請求項８に記載の標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法。

【請求項10】

標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造するためのキットであって、
前記標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置された標的配列と、薬剤耐性遺伝子配列と、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列と、核酸配列を細胞に導入するための試薬とを含み、
前記標的配列は、前記細胞のゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に存在する配列と同一であり、
前記細胞株において、前記標識化解析対象タンパク質は、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより発現が制御されることを特徴とすることを特徴とする標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標識化解析対象タンパク質の発現細胞株、その製造方法及びそれを製造するためのキットに関し、特に外来の標識化解析対象タンパク質を内在プロモーターの制御下において生理的レベルで発現する細胞、並びにそのような細胞を高効率で製造するための方法及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

従来から、細胞内におけるタンパク質の局在解析には、解析対象のタンパク質に特異的に結合する抗体が利用されている。このような解析を正確に行うためには、品質が高く、特異性が極めて高い抗体を用いる必要があるが、通常そのような抗体を入手することは困難であることが多い。また、生きた細胞内におけるタンパク質の挙動解析には抗体を用いることはできない。

【0003】

これらの問題を解決するために、小分子タグや蛍光タンパク質に融合された解析対象タンパク質を発現する発現ベクターを細胞に導入し、外来プロモーターにより一過性に当該タンパク質を強制発現させる方法や、プロモーターを含む発現ユニットと薬剤耐性遺伝子とを対象細胞のゲノムに挿入して安定発現細胞株を得る方法等が用いられている。これらの方法により、解析対象タンパク質に融合された小分子タグや蛍光タンパク質を指標として、生きた細胞内においても解析対象タンパク質の挙動を解析することができる。

【0004】

しかしながら、これらの方法を用いた場合、解析対象タンパク質は、外来プロモーターで発現されているため、そのような発現は生理的発現レベルから逸脱するものであり、また、安定発現細胞株においては、遺伝子サイレンシングによる発現レベルの低下や消失の問題もある。このような問題について、近年、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）／Ｃａｓ（CRISPR-associated）９系に代表される部位特異的なヌクレアーゼを利用したゲノム編集によって解析対象タンパク質をコードするゲノム上の遺伝子に直接にタグや蛍光タンパク質をコードする配列を挿入することが可能となったため、上記の問題をほぼ解決できるようになった。

【0005】

ゲノム編集による配列挿入の代表的な方法として、相同組換え修復を利用したＨＤＲ（homology-dependent recombination）法が知られている。しかしながら、ＨＤＲ法では、目的の対象タンパク質の遺伝子の直下にタグ又は蛍光タンパク質をコードする配列を挿入するために、タグ又は蛍光タンパク質をコードする配列の両側に５’組換えアーム配列と３’組換えアーム配列を備えたターゲッティングベクターを構築する必要があり、このようなベクターの構築は煩雑である。さらに、このようなターゲッティングベクターを構築して細胞に導入したとしても、そもそも相同組換え修復が起こる確率が低いため、タグや蛍光タンパク質がノックインされた細胞の取得率が低い。

【0006】

また、上記ＨＤＲ法以外のゲノム編集方法として、２−ｈｉｔ−２−ｏｌｉｇｏ法（特許文献１）、ＰＩＴＣＨ法（ＭＭＥＪ：microhomology-mediated end-joining法）（特許文献２）、ＨＩＴＩ（homology-independent targeted integration）法（特許文献３）及びＨＩＴＩ類似法（非特許文献１）等が知られている。

【0007】

特許文献１の２−ｈｉｔ−２−ｏｌｉｇｏ法の場合、アーム配列は不要である点でＨＤＲ法よりも好ましいが、人工ヌクレアーゼシステムＧ、ドナーＤＮＡ及び二種類の一本鎖オリゴヌクレオチドといった４つの導入物をゲノムに挿入する必要があり、導入物が多く所望のノックイン細胞が得られる効率が高いとは言えない。特許文献２のＰＩＴＣＨ法の場合では、ゲノムにおける所望の切断部位への所望配列の挿入後に当該部位がマイクロホモロジー媒介性末端結合によって結合されることを利用するため、相同組換え効率が低い発生段階の細胞などに対しても、所望の核酸を正確に高頻度で挿入することができる。

【0008】

特許文献３のＨＩＴＩ法の場合、ドナーベクター上で挿入配列の前後又は直前にターゲット部位と同じガイドＲＮＡ認識サイト及びＰＡＭ配列を導入し、切断されたドナー配列がゲノムの切断箇所に挿入されるように構成されており、相同組換え修飾が起こらない非分裂細胞においてもゲノム編集を可能とする。非特許文献１のＨＩＴＩ類似法では、原理はＨＩＴＩ法と同じであり、挿入部位のターゲット配列と同一のターゲット配列を挿入したドナーベクターを共に細胞に導入し、ターゲットサイトに発現ユニットと薬剤耐性遺伝子とを挿入し、当該薬剤による選択によってノックイン細胞を得ることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２０１６／０８０３９９号

【特許文献2】特許第５９００９４２号公報

【特許文献3】特表２０１９−５２４０９８号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Yohei Katoh 他，Molecular Biology of the Cell, Vol.28, No.7, p898-906, 2017.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

しかしながら、上記いずれの方法を用いた場合であっても、所望の解析対象タンパク質をコードするゲノム上の遺伝子に直接にタグや蛍光タンパク質をコードする配列を挿入するには、フレームシフトの問題があり、タグや蛍光タンパク質が融合された所望の内在タンパク質を正常に発現する安定細胞株を高い取得率で得られるとは言えない。また、ターゲットサイトに発現ユニットと薬剤耐性遺伝子とを挿入し、当該薬剤による選択によって安定細胞株を得る方法も考えられるが、上述の通り、この方法では外来の発現プロモーターも共に挿入されるため、発現レベルが過剰発現となり、すなわち非生理条件での発現となり、また、遺伝子サイレンシングの問題も生じ得る。従って、未だ、生理的レベルでタグや蛍光タンパク質等で標識された解析対象タンパク質を発現する安定発現株を高効率で得る方法が求められている。

【0012】

本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞に対して、内在プロモーターによって解析対象タンパク質の発現制御が適切になされる位置に、タグや蛍光タンパク質等で標識された解析対象タンパク質の発現遺伝子を含む核酸配列を導入することにより、生理的レベルで標識化解析対象タンパク質を発現する安定発現株を高効率で得られるようにすることにある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、ゲノム編集を利用して標識化された外来の解析対象タンパク質をコードする核酸配列及び外来の薬剤耐性遺伝子配列を、細胞のゲノム上における内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に挿入することで、標識化解析対象タンパク質を安定発現する細胞株を高効率で取得できることを見出して本発明を完成した。

【0014】

具体的に、本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株は、ゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座において、前記内在の解析対象タンパク質の５’非翻訳領域に、前記解析対象タンパク質が標識化された外来の標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列及び外来の薬剤耐性遺伝子配列が挿入されており、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより、前記外来の標識化解析対象タンパク質の発現が制御されることを特徴とする。

【0015】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株では、ゲノムにおいて内在の解析対象タンパク質の５’非翻訳領域に外来の標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列が挿入され、内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより、外来の標識化解析対象タンパク質の発現が制御されるため、当該標識化解析対象タンパク質を生理的発現レベルで発現することができる。このため、本発明に係る細胞株では、標識化解析対象タンパク質の発現が遺伝子サイレンシング等により低下又は消失することが無く、当該タンパク質を生理的発現レベルで安定的に発現することができる。従って、本発明に係る細胞株によると、所望の解析対象タンパク質の生きた細胞内での挙動をより正確に解析することが可能となる。また、本発明に係る細胞株は、さらに外来の薬剤耐性遺伝子配列を有するため、当該細胞株を取得する際に、薬剤による選択が可能であり、その結果、当該細胞株の取得率を向上できる。

【0016】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株において、前記外来の標識化解析対象タンパク質は、タグ又は蛍光タンパク質に融合された解析対象タンパク質とすることができる。

【0017】

次に、上記本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造する方法は、以下の通りである。当該方法は、細胞に、標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置された標的配列と、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列とを導入する導入ステップと、前記細胞のゲノムに前記標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列が挿入された細胞を選択的に取得する選択ステップとを含み、前記導入ステップでは、薬剤耐性遺伝子配列をさらに導入し、前記選択ステップでは、前記導入ステップ後の細胞を薬剤存在下で培養して前記薬剤耐性遺伝子が導入された細胞のみを選択することを含み、前記標的配列は、前記細胞のゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に存在する配列と同一であり、前記細胞株において、前記標識化解析対象タンパク質は、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより発現が制御されることを特徴とする。

【0018】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法では、細胞に、標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置された標的配列と、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列とを導入するため、細胞内においてヌクレアーゼにより標的配列が切断され、切断部位における非相同末端結合によって、当該切断部位に標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列を挿入することができる。当該切断部位は、細胞のゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域であるため、内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターによって、外来の標識化解析対象タンパク質を発現できる。このため、上記方法で得られた細胞株は、当該標識化解析対象タンパク質を生理的発現レベルで安定的に発現することができる。また、本発明に係る製造方法では、導入ステップにおいて薬剤耐性遺伝子配列をさらに導入し、選択ステップにおいて導入ステップ後の細胞を薬剤存在下で培養して薬剤耐性遺伝子が導入された細胞のみを選択することを含むため、薬剤によって適切に標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列が導入された細胞株を選択することが可能であり、その結果、当該細胞株の取得率を向上できる。従って、本発明係る方法によると、上記のような簡便な方法で、所望の解析対象タンパク質の生きた細胞内での挙動をより正確に解析することを可能とする細胞株を高効率で得ることができる。

【0019】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法において、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列は、前記標的配列に結合するＤＮＡ結合ドメイン及び部位特異的に切断するヌクレアーゼを発現する核酸配列を含むことができる。

【0020】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法において、前記導入ステップは、前記標識化された解析対象タンパク質をコードする核酸配列、及び前記核酸配列の上流に配置された標的配列を含むドナーベクターと、前記ＤＮＡ結合ドメイン及び前記ヌクレアーゼを発現する発現ユニットを含む発現ベクターとを前記細胞に導入することを含むことができ、前記薬剤耐性遺伝子は、前記ドナーベクターに含まれていることが好ましい。

【0021】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法において、前記標識化された解析対象タンパク質は、タグ又は蛍光タンパク質に融合された解析対象タンパク質とすることができる。

【0022】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法において、前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択されることが好ましい。なお、前記ＤＮＡ結合ドメインは、選択されたヌクレアーゼに従って適宜選択され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの場合にガイドＲＮＡが用いられ、ＴＡＬＥＮの場合にＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）又は改良型ＴＡＬＥが用いられ、ジンクフィンガーヌクレアーゼの場合にジンクフィンガーが用いられ得る。その他、ＤＮＡ結合ドメインとして、標的配列に相補的な一本鎖ＤＮＡ相補的ヌクレオチド等も用いられ得る。

【0023】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株の製造方法において、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）及びＣ２ｃ３から選択されることが好ましい。

【0024】

次に、本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造するためのキットは以下の通りである。当該キットは、標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置された標的配列と、薬剤耐性遺伝子配列と、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列と、核酸配列を細胞に導入するための試薬とを含み、前記標的配列は、前記細胞のゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に存在する配列と同一であり、前記細胞株において、前記標識化解析対象タンパク質は、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより発現が制御されることを特徴とする。

【0025】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造するためのキットによると、上記各配列と、核酸配列を細胞に導入するための試薬とを含むので、当該試薬によってそれらの配列を細胞内に導入することで、細胞内において標的配列がヌクレアーゼにより切断され、切断部位における非相同末端結合により、当該切断部位に標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列を挿入できる。当該切断部位は、細胞のゲノムにおける前記解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域であるため、内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターによって、前記外来の標識化解析対象タンパク質を発現できる。このため、上記キットで得られた細胞株は、当該標識化解析対象タンパク質を生理的発現レベルで安定的に発現することができる。また、本発明に係るキットでは、薬剤耐性遺伝子配列を含み、当該薬剤耐性遺伝子配列も導入することで、細胞を薬剤存在下で培養して薬剤耐性遺伝子が導入された細胞のみを選択できるため、薬剤によって適切に標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列が導入された細胞株を選択することが可能であり、その結果、当該細胞株の取得率を向上できる。従って、本発明に係るキットによると、簡便に、所望の解析対象タンパク質の生きた細胞内での挙動をより正確に解析することを可能とする細胞株を高効率で得ることができる。

【発明の効果】

【0026】

本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株、その製造方法及びそれを製造するためのキットによると、標識化解析対象タンパク質を生理的発現レベルで安定的に発現することができて所望の解析対象タンパク質の生きた細胞内での挙動をより正確に解析することを可能とする細胞株を、簡便な方法で高い効率で得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】本発明の一実施形態に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造する方法において、細胞のゲノムに標識化された解析対象タンパク質をコードする核酸配列を挿入する方法を説明する概要図である。

【図2】実施例１におけるＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１のノックイン細胞株の取得率を評価した結果を示す図である。

【図3】実施例１におけるＥＧＦＰ−α−Ｔｕｂｕｌｉｎのノックイン細胞株の取得率を評価した結果を示す図である。

【図4】実施例１におけるＡｒｌ１３ｂ−Ｖｅｎｕｓのノックイン細胞株の取得率を評価した結果を示す図である。

【図5】比較例１におけるＡｒｌ１３ｂ−ＧＦＰのノックイン細胞株の取得率を評価した結果を示す図である。

【図6】比較例２におけるＨＡ標識Ｓｔａｍ１のノックイン細胞株の取得率を評価した結果を示す図である。

【図7】実施例１におけるＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１のノックイン細胞株のＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１長期発現安定性を評価した実施例２の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0029】

本発明の一実施形態は、標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株である。具体的に、本実施形態に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株は、ゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座において、前記内在の解析対象タンパク質の５’非翻訳領域に、前記解析対象タンパク質が標識化された外来の標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列及び外来の薬剤耐性遺伝子配列が挿入されており、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより、前記外来の標識化解析対象タンパク質の発現が制御されることを特徴とするものである。

【0030】

また、本発明の他の実施形態は、上記のような細胞株を得るための方法である。具体的に、本実施形態に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造する方法は、細胞に、標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置された標的配列と、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列とを導入する導入ステップと、前記細胞のゲノムに前記標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列が挿入された細胞を選択的に取得する選択ステップとを含み、前記導入ステップでは、薬剤耐性遺伝子配列をさらに導入し、前記選択ステップでは、前記導入ステップ後の細胞を薬剤存在下で培養して前記薬剤耐性遺伝子が導入された細胞のみを選択することを含み、前記標的配列は、前記細胞のゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に存在する配列と同一であり、前記細胞株において、前記標識化解析対象タンパク質は、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより発現が制御されることを特徴とするものである。

【0031】

さらに、本発明の他の実施形態は、上記のような細胞株を得るためのキットである。具体的に、本実施形態に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株を製造するためのキットは、標識化解析対象タンパク質をコードする核酸配列と、薬剤耐性遺伝子配列と、該核酸配列の上流に配置された標的配列と、前記標的配列を部位特異的に切断するヌクレアーゼをコードする配列と、核酸配列を細胞に導入するための試薬とを含み、前記標的配列は、前記細胞のゲノムにおける前記解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に存在する配列と同一であり、前記細胞株において、前記標識化解析対象タンパク質は、前記内在の解析対象タンパク質の発現プロモーターにより発現が制御されることを特徴とするものである。

【0032】

本実施形態に係る細胞株を得るために、ゲノム編集の技術を利用し、特にＨＩＴＩ法の技術を利用する。そのために、例えば周知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ヌクレアーゼ（ＲＧＮ；RNA-guided nuclease）とＤＮＡ結合ドメインとして機能するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用する。ヌクレアーゼとしてはタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩが挙げられ、中でもタイプＩＩのヌクレアーゼが好ましく、Ｃａｓ９が特に好ましいが、Ｃａｓ９以外のヌクレアーゼを使用してもよい。このような、Ｃａｓ９とガイドＲＮＡにより、標的配列に対して部位特異的にＤＮＡ二本鎖切断が生じる。なお、本実施形態において、Ｃａｓ９以外のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いてもよく、例えばＣｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）及びＣ２ｃ３等のヌクレアーゼを用いても構わない。さらに、所望の部位の切断を可能であれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ以外の系を用いてもよく、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ以外のヌクレアーゼを利用することもでき、例えばＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びジンクフィンガーヌクレアーゼ等を利用しても構わない。例えばＴＡＬＥＮを用いる場合、ＤＮＡ結合ドメインとしてＴＡＬＥが用いることができるが、高活性型ＴＡＬＥＮとして知られるＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮでは、アミノ酸配列が改変された改良型ＴＡＬＥが用いられ得る。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼの場合にジンクフィンガーが用いられ得る。ＤＮＡ結合ドメインとしては、その他、標的配列に相補的な一本鎖ＤＮＡ相補的ヌクレオチド等も用いられ得るが、上記標的配列に対して部位特異的にＤＮＡ二本鎖切断をする目的を達成できる限り、ＤＮＡ結合ドメインの種類は特に限定されない。

【0033】

上記Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡは、例えばこれらのコード配列及びこれらの発現のためのプロモーター等を含む発現ユニットが導入されたベクターを構築して、当該ベクターを細胞内に導入することにより細胞内で発現できる。これらのベクターの構築方法は、当業者に周知であり、本技術分野における通常の方法を用いて構築することができる。当該ベクターの細胞内への導入方法は、後に説明するドナーベクターの導入方法と同じ方法を利用することができ、それらは同時に導入されることが好ましい。

【0034】

一方、上記ゲノムにおける切断部位に挿入したい配列を含むドナーベクターを準備し、本実施形態において当該ドナーベクターには、ガイドＲＮＡに結合される標的配列が設けられる。これにより、細胞内に導入されたドナーベクターは、ゲノムと同様に上記ガイドＲＮＡにより標的配列が認識されてＣａｓ９により切断される。その後、ゲノムの切断部位と当該ドナーベクターの切断部位とが非相同末端結合されることにより、結果としてゲノムの切断部位にドナーベクターに含まれた所望の配列が挿入されることとなる。

【0035】

本実施形態において、挿入すべき配列は標識化された解析対象タンパク質をコードする核酸配列である。解析対象タンパク質は、細胞内での挙動を解析したい所定のタンパク質であり、その種類は特に限定されない。当該解析対象タンパク質は、細胞内での挙動を容易に解析できるように標識化されている。標識化の手段は特に限定されないが、タグや蛍光タンパク質に融合されていることが好ましい。なお、タグや蛍光タンパク質は、解析対象タンパク質のＮ末側に融合されていてもよいし、Ｃ末側に融合されていてもよい。タグは、特に限定されず、本技術分野において通常用いられているものを利用でき、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ及びＳＴＲＥＰタグ等を用いることができる。蛍光タンパク質についても特に限定されず、本技術分野において通常用いられているものを利用でき、例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｖｅｎｕｓ等を用いることができる。

【0036】

本実施形態において、ドナーベクターは、標識化された解析対象タンパク質の上流に上記標的配列が配置されている。標的配列は、細胞のゲノムにおける前記解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に存在する配列と同一の配列となる。すなわち、図１に示すように、ゲノムにおける標的配列と、ドナーベクターにおける標的配列とがＣａｓ９により部位特異的に切断され（図１の三角で示す位置）、切断されたドナーベクターの両端が、ゲノムの切断部位の端部と非相同末端結合することにより、ドナーベクターに標識化された解析対象タンパク質がコードされた配列が挿入されることとなる。

【0037】

本実施形態において、上記のように細胞のゲノムに標識化された解析対象タンパク質がコードされた配列が挿入されるが、この標識化された解析対象タンパク質の発現を制御するためのプロモーターは挿入されないことが重要である。すなわち、ドナーベクターには当該標識化された解析対象タンパク質の発現を制御するための外来プロモーターは含まれていない。本実施形態において、標識化された解析対象タンパク質は、細胞のゲノムにおける内在の解析対象タンパク質の遺伝子座における５’非翻訳領域に挿入されることが重要であり、これにより、内在の解析対象タンパク質の発現制御に関わる内在のプロモーターがゲノムに挿入された標識化された解析対象タンパク質の発現制御をすることとなる。このため、上記方法で得られた細胞は、生理的発現レベルから逸脱せず、また、遺伝子サイレンシングの影響を受けずに、解析対象タンパク質を生理的発現レベルで安定的に発現することができる。その結果、当該細胞を用いることで、所望の解析対象タンパク質の生きた細胞内での挙動をより正確に解析することを可能となる。

【0038】

本実施形態では、図１に示すように、標識化された解析対象タンパク質がコードされた配列において、翻訳を開始するために５’末端にはコザック配列が、また、発現されるｍＲＮＡの安定性等のために３’末端にはポリアデニル酸鎖（ポリＡ、ｐＡ）がそれぞれ付加されていることが好ましい。

【0039】

本実施形態において、上述の通り、細胞には、標識化された解析対象タンパク質がコードされた配列のみならず薬剤耐性遺伝子が導入される。このため、導入処理後の細胞を薬剤存在下で培養することで、標識化された解析対象タンパク質がコードされた配列と共に薬剤耐性遺伝子が導入された細胞のみを容易に選択することができる。薬剤耐性遺伝子は、図１に示すように、標識化された解析対象タンパク質がコードされた配列と共に、ドナーベクターに含まれていることが好ましい。薬剤耐性遺伝子は、本技術分野において通常用いられているものを利用でき、例えばカナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の種々の薬剤耐性遺伝子を用いることができる。また、ドナーベクターには、上記薬剤耐性遺伝子の発現誘導のための外来プロモーターが含まれていてもよく、さらに、発現されるｍＲＮＡの安定性等のために３’側にはｐＡ付加シグナル配列が含まれていてもよい。

【0040】

本実施形態において、用いられる細胞は、任意の細胞であり、培養細胞であってもよく、体細胞や、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞であってもよい。細胞の由来としては、ヒトであってもよく、ウシ、ミニブタ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの非ヒト哺乳動物であってもよい。その他に、鳥類、ゼブラフィッシュなどの魚類、カエルなどの両生類、爬虫類、ショウジョウバエなどの昆虫類、甲殻類などでもよく、植物、菌類などでも構わない。

【0041】

本実施形態において用いられるベクターは、環状のベクターであってもよく、直鎖状のベクターであってもよく、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどを用いることができる。

【0042】

また、本実施形態において、細胞へのドナーベクター等の核酸導入方法は、特に限定されず、本技術分野において通常用いられる方法を用いることができ、例えばカチオン性脂質試薬又はカチオン性非脂質試薬等を用いた化学的方法、エレクトロポレーション等の物理的方法、ウィルスを用いた生物学的方法等を用いることができる。

【実施例】

【0043】

以下に、本発明に係る標識化解析対象タンパク質の安定発現細胞株、その製造方法及びそれを製造するためのキットについて詳細に説明するための実施例を示す。

【0044】

［実施例１］
（Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ発現ベクターの作製）
まず、ＢＲＯＡＤ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが提供しているガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）設計ウェブサイト（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）に解析対象タンパク質（本実施例においてはＳｔａｍ１、α−ｔｕｂｕｌｉｎ及びＡｒｌ１３ｂ）をコードする遺伝子座における５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む核酸配列を５’ＵＴＲ配列全てと翻訳開始点であるスタートコドンＡＴＧの下流２０塩基程度までを入力し、ｇＲＮＡの標的配列の候補を得た。

【0045】

得られた候補リストの中から、ＡＴＧよりも上流の５’ＵＴＲでＣａｓ９が切断するもの且つ切断効率スコアの高いものを選択した。選択した配列が標的配列となる。以下に、Ｓｔａｍ１、α−ｔｕｂｕｌｉｎ及びＡｒｌ１３ｂの標的配列を示す。
Ｓｔａｍ１：ＧＴＣＡＣＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＣＣＧＣＧＧＧＧ（配列番号１）
α−ｔｕｂｕｌｉｎ：ＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧ（配列番号２）
Ａｒｌ１３ｂ：ＡＣＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＧＧＧ（配列番号３）

【0046】

標的配列として選択した配列について，プラスミドベクターに組み込むためにオーバーハング配列（センス鎖：ＣＣＧ／アンチセンス鎖：ＡＡＣ）を５’末端に負荷し、５’末端をリン酸化した相補的なオリゴＤＮＡをアニーリングにより二本鎖ＤＮＡにしてプラスミドベクター（ＡＴＵＭ社，カタログ番号ＰＤ１３０１−ＡＤ，ＣＭＶ−Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰ Ｃａｓ９−ＥｌｅｃＤ）に挿入してＣａｓ９及びｇＲＮＡを発現するプラスミドベクター（以下Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター）を構築した。以下に、Ｓｔａｍ１、α−ｔｕｂｕｌｉｎ及びＡｒｌ１３ｂの標的配列に対応する上記オリゴＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を示す。
Ｓｔａｍ１：
センス鎖：［Ｐｈｏｓ］ＣＣＧＧＴＣＡＣＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＣＣＧＣＧ（配列番号４）
アンチセンス鎖：［Ｐｈｏｓ］ＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣ（配列番号５）
α−ｔｕｂｕｌｉｎ：
センス鎖：［Ｐｈｏｓ］ＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣ（配列番号６）
アンチセンス鎖［Ｐｈｏｓ］ＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＧＧ（配列番号７）
Ａｒｌ１３ｂ：
センス鎖：［Ｐｈｏｓ］ＣＣＧＡＣＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧ（配列番号８）
アンチセンス鎖：［Ｐｈｏｓ］ＡＡＣＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＣＧＴ（配列番号９）

【0047】

（ドナーベクターの作製）
標識化Ｓｔａｍ１、標識化α−ｔｕｂｕｌｉｎ又は標識化Ａｒｌ１３ｂを発現するプラスミドベクター（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１−Ｎｅｏ、ｐＣＶＭ−ＥＧＦＰ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ−Ｎｅｏ、ｐＣＭＶ−Ａｒｌ１３ｂ−ｖｅｎｕｓ−Ｎｅｏ）を準備した。ｐＣＶＭ−ＥＧＦＰ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ−Ｎｅｏは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手した（型番６３２３４９）。

【0048】

ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１−Ｎｅｏは、次の通りに作成した。まず、以下のプライマーセット（配列番号１０及び１１）を設計し、高精度ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ）を用いたＰＣＲによりＳｔａｍ１コーディング領域の核酸配列を増幅した。続いて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを用いて、上記ＤＮＡ断片とｐＥＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、型番６０８４−２）を消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社、ＬＧＫ−１０１）を用いてベクターにＳｔａｍ１配列を挿入し、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１−Ｎｅｏを得た。
フォワード側：ＧＡＡＴＴＣａｔｇＣＣＴＣＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡ（配列番号１０）
リバース側：ＧＴＣＧＡＣｃｔａＴＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡ（配列番号１１）

【0049】

ｐＣＭＶ−Ａｒｌ１３ｂ−ｖｅｎｕｓ−Ｎｅｏは、次の通りに作成した。まず、下記プライマーセット（配列番号１２及び１３）を設計し、高精度ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＡｒｌ１３ｂコーディング領域の核酸配列を増幅した。続いて、制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩを用いて、上記ＤＮＡ断片とｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、型番６３２５２３）を消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてベクターにＡｒｌ１３ｂ配列を挿入し、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｒｌ１３ｂを得た。
フォワード側：ＣＴＣＧＡＧｇｃｃａｃｃＡＴＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＣＴ（配列番号１２）
リバース側：ＧＧＡＴＣＣｃｇＴＧＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣ（配列番号１３）

【0050】

次に、下記プライマーセット（配列番号１４及び１５）を設計し、高精度ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりｖｅｎｕｓをコードする核酸配列を増幅した。その後、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｏｔＩを用いて、上記ＤＮＡ断片とｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｒｌ１３ｂを消化し、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｒｌ１３ｂのｍｃｈｅｒｒｙ配列をｖｅｎｕｓ配列と置換し、ｐＣＭＶ−Ａｒｌ１３ｂ−ｖｅｎｕｓ−Ｎｅｏを得た。
フォワード側：ＡＣＣＧＧＴｃｇｃｃａｃｃＡＴＧｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇ（配列番号１４）
リバース側：ＧＣＧＧＣＣＧＣｔｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔ（配列番号１５）

【0051】

上記ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１−Ｎｅｏ、ｐＣＶＭ−ＥＧＦＰ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ−Ｎｅｏ及びｐＣＭＶ−Ａｒｌ１３ｂ−ｖｅｎｕｓ−Ｎｅｏの各プラスミドベクターのＣＭＶプロモーターを、上記の通りに構築した各解析対象タンパク質遺伝子に対するｇＲＮＡ標的配列に置換した。具体的に、ＡｓｅＩおよびＮｈｅＩの２つの制限酵素でＣＭＶプロモーター配列を除去し、それぞれの解析対象タンパク質のｇＲＮＡ標的配列にＡｓｅＩおよびＮｈｅＩで消化した断片になるように５’側および３’側に核酸配列を付加したオリゴＤＮＡをアニーリングにより二本鎖ＤＮＡにして、ＣＭＶプロモーターを除去したプラスミドベクターに挿入してドナーベクターを構築した。以下に、各解析対象タンパク質遺伝子の標的配列に、ＡｓｅＩおよびＮｈｅＩで消化した断片になるように５’側および３’側に核酸配列を付加したオリゴＤＮＡ配列を示す。
Ｓｔａｍ１：
センス鎖：［ｐｈｏｓ］ｔａａｔＧＴＣＡＣＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＣＣＧＣＧＧＧＧｇ（配列番号１６）
アンチセンス鎖：［ｐｈｏｓ］ｃｔａｇｃＣＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣａｔ（配列番号１７）
α−ｔｕｂｕｌｉｎ：
センス鎖：［Ｐｈｏｓ］ｔａａｔＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧｇ（配列番号１８）
アンチセンス鎖：［Ｐｈｏｓ］ｃｔａｇｃＣＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＧＧａｔ（配列番号１９）
Ａｒｌ１３ｂ：
センス鎖：［Ｐｈｏｓ］ｔａａｔＡＣＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＧＧＧｇ（配列番号２０）
アンチセンス鎖：［Ｐｈｏｓ］ｃｔａｇｃＣＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＣＧＴａｔ（配列番号２１）

【0052】

（細胞へのベクターの導入）
まず、６０ｍｍプラスチック培養皿に播種したｍＩＭＣＤ−３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１２３）又はＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）に対して、２μｇの上記Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター、２μｇの上記ドナーベクター（ｍＩＭＣＤ−３細胞にはＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１又はＥＧＦＰ−α−ｔｕｂｕｌｉｎを含むドナーベクター、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にはＡｒｌ１３ｂ−ｖｅｎｕｓを含むドナーベクター）及び１２μｇのｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ＭＡＸ（以下ＰＥＩ−ＭＡＸ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．製）を３００μＬのＰＢＳ中で混合し、室温で２０分間反応させた後、３ｍＬの培養液（ｍＩＭＣＤ−３細胞では１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地）が入っている培養皿に滴下し、培地とよく混合した。その半日後に培地を交換し、発現ベクターとＰＥＩ−ＭＡＸを除去して更に１日培養した。

【0053】

（導入細胞の選択）
上記培養後、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＧ４１８を添加した培地に交換し、更に５日〜１０日培養した。途中で１〜２回、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む新鮮な培地に交換した。

【0054】

（本実施例によるノックイン細胞株の取得率の評価）
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター、上記ドナーベクター及びＰＥＩ−ＭＡＸを加えられた後にＧ４１８で選択されたｍＩＭＣＤ−３又はＮＩＨ／３Ｔ３に対して、０．２５％（ｍＩＭＣＤ−３）又は０．０５％（ＮＩＨ／３Ｔ３）のトリプシン溶液を用いて培養皿から細胞を剥がし取り、１ウェル当たり０．２〜０．５細胞の密度で０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む８０μＬの培地とともに９６ウェル培養プレートに播いた。

【0055】

９６ウェルで培養してから１０日〜２週間経過したのち、コロニーを形成しているウェルから上記と同様にトリプシンを用いて細胞を剥がし取り、０．２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１ｍＬの培地で満たした１２ウェルプレートのウェルにそれぞれ播いた。

【0056】

プレート中の細胞がウェルの１００％を占めるまで増えた後、４０〜６０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーで細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を泳動したのち、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写して、各解析対象タンパク質に対する抗体（Ｓｔａｍ１：抗Ｓｔａｍ１抗体；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社 １３０５３、Ａｒｌ１３ｂ：抗Ａｒｌ１３ｂ抗体；ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ社 １７７１１−１−ＡＰ）又は抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社 ５９８）を用いてノックインが成功した細胞をスクリーニングした。

【0057】

ｍＩＭＣＤ−３細胞に対して、標識化解析対象タンパク質としてＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１の導入を行った場合におけるスクリーニング結果を図２に示す。図２に示すように、２２細胞株中１０細胞株（図２において↓が付いたレーン）にＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１のノックインが認められた。すなわちノックイン株取得率は４５％であった。

【0058】

ｍＩＭＣＤ−３細胞に対して、標識化解析対象タンパク質としてＥＧＦＰ−α−Ｔｕｂｕｌｉｎの導入を行った場合におけるスクリーニング結果を図３に示す。図３に示すように、２０細胞株中１１細胞株（図３において↓が付いたレーン）にＥＧＦＰ−α−Ｔｕｂｕｌｉｎのノックインが認められた。すなわちノックイン株取得率は５５％であった。

【0059】

ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対して、標識化解析対象タンパク質としてＡｒｌ１３ｂ−ｖｅｎｕｓの導入を行った場合におけるスクリーニング結果を図４に示す。図４に示すように、２３細胞株中１９細胞株（図４において↓が付いたレーン）にＡｒｌ１３ｂ−ｖｅｎｕｓのノックインが認められた。すなわちノックイン株取得率は８３％であった。

【0060】

［比較例１］
上記の通り、本発明の方法を利用することにより、高い効率で標識化解析対象タンパク質発現細胞株が得られたが、上記の通り示された取得率が極めて高いものであることを証明するために、従来の方法としてのＨＩＴＩ法を利用し、薬剤による選択を利用しない場合のノックイン株取得率を以下の通りに評価した。

【0061】

（Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ発現ベクターの作製）
まず、上記ＢＲＯＡＤ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが提供しているｇＲＮＡ設計ウェブサイトに解析対象タンパク質としてＡｒｌ１３ｂのＮＣＢＩ ｇｅｎｅＩＤ（６８１４６）を入力し、ｇＲＮＡの標的配列の候補リストを得た。得られた候補リストの中から、Ｃａｓ９切断部位が翻訳領域にあるもの且つ切断効率スコアの高いものの中からできるだけ終止コドンに近いものを標的配列として選択した。標的配列として選択した配列は、以下の通りである。
ＧＣＴＧＴＧＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴＡＡＣＧＧ（配列番号２２）

【0062】

上記選択した配列について、プラスミドベクターに組み込むためにオーバーハング配列（センス鎖：ＣＣＧ／アンチセンス鎖：ＡＡＣ）を５’末端に付加し、５’末端をリン酸化した相補的なオリゴＤＮＡをアニーリングにより二本鎖ＤＮＡにしてプラスミドベクター（ＡＴＵＭ社，カタログ番号ＰＤ１３０１−ＡＤ，ＣＭＶ−Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰ Ｃａｓ９−ＥｌｅｃＤ）に挿入してＣａｓ９およびｇＲＮＡを発現するプラスミドベクター（以下Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター）を構築した。上記選択した配列にオーバーハング配列を付加した相補的なオリゴＤＮＡの配列は以下の通りである。
センス鎖：［Ｐｈｏｓ］ ＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴＡＡ（配列番号２３）
アンチセンス鎖：［Ｐｈｏｓ］ ＡＡＣＴＴＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号２４）

【0063】

（ドナーベクターの作製）
次に、Ａｒｌ１３ｂのカルボキシ末端にＨＡタグ及びＧＦＰを連結した標識を融合させるためのドナーベクターを構築した。まず、ＧＦＰ配列の５’末端側にＨＡタグ配列（ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴ：配列番号２５）を３’末端側に上記の通り選択したｇＲＮＡ標的配列の相補配列（ＣＣＧＴＴＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＣＡＧＣ：配列番号２６）を持つＨＡ−ＧＦＰ−ｇＲＮＡ（Ｒｖ）配列ＤＮＡ断片を作成した。具体的に、フォワード側プライマーとしてＨＡタグ配列とＧＦＰのアミノ末端領域をコードする核酸配列を連結したもの（ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇ：配列番号２７）、リバース側プライマーとして上記選択したｇＲＮＡ標的配列（ＧＣＴＧＴＧＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴＡＡＣＧＧ：配列番号２２）にＧＦＰのカルボキシ末端領域をコードする核酸配列の相補配列を連結したもの（ＧＣＴＧＴＧＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴＡＡＣＧＧｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇａｇａｇｔｇａｔＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴ：配列番号２８）を設計し、高精度ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社 ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ）を用いたＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。

【0064】

得られたＨＡ−ＧＦＰ−ｇＲＮＡ（Ｒｖ）配列ＤＮＡ断片を鋳型に、上記選択したｇＲＮＡ標的配列に基づいてＣａｓ９が切断する部位からＡｒｌ１３ｂのカルボキシ末端までの配列から終止コドンを除去した配列（ｃｔａａｃｇｇｔｇａｔｇｃｔｃａｇｇａｃａｃｇａｔｃｔｃａ：配列番号２９）の３’側にＨＡタグ配列（ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴ：配列番号２５）を連結し、５’側に上記で選択したｇＲＮＡ標的配列の相補配列（ＣＣＧＴＴＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＣＡＧＣ：配列番号２６）を連結させた配列（ＣＣＧＴＴＡＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＣＡＧＣｃｔａａｃｇｇｔｇａｔｇｃｔｃａｇｇａｃａｃｇａｔｃｔｃａＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴ：配列番号３０）をフォワード側プライマーとし、前述のリバース側プライマー（配列番号２８）とともにＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏを用いてＰＣＲ反応により目的のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、ドナーベクターを構築した。

【0065】

（細胞へのベクターの導入）
６０ｍｍプラスチック培養皿に播種したｍＩＭＣＤ−３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１２３）、２μｇのＣａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター、２μｇのドナーベクター、及び１２μｇのＰＥＩ−ＭＡＸを３００μＬのＰＢＳ中で混合し、室温で２０分間反応させた後、３ｍＬの培養液（１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）の入っている培養皿に滴下し，培地とよく混合した。その半日後に培地を交換し発現ベクターとＰＥＩ−ＭＡＸを除去して更に１日培養した。

【0066】

（導入細胞の選択）
０．２５％トリプシン溶液で細胞を剥がし取り、蛍光細胞分離装置（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｅａ）を用いて緑色蛍光を示す遺伝子導入された細胞を分取し、３５ｍｍプラスチック培養皿で１週間培養した。

【0067】

（比較例１によるノックイン細胞株の取得率の評価）
上記培養後、培養皿から０．２５％トリプシン溶液を用いて細胞を剥がし取り、１ウェル当たり０．２細胞の密度で８０μＬの培地とともに９６ウェル培養プレートに播いた。９６ウェルで培養してから２週間経過したのち、コロニーを形成しているウェルから上記と同様にトリプシンを用いて細胞を剥がし取り、１ｍＬの培地で満たした１２ウェルプレートのウェルにそれぞれ播いた。

【0068】

スクリーニング用プレート中の細胞がウェルの１００％を占めるまで増えた後、４０〜６０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーで細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を泳動したのち、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写して、抗体（Ａｒｌ１３ｂ： ａｎｔｉ−Ａｒｌ１３ｂ抗体；ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ社 １７７１１−１−ＡＰ）を用いてノックインが成功した細胞をスクリーニングした。その結果を図５に示す。

【0069】

図５に示すように、比較例１の方法を用いて、標識化解析対象タンパク質としてＡｒｌ１３ｂ−ＧＦＰの導入を行った場合、９５細胞株中１細胞株（図５において星印が付いたレーン）にＡｒｌ１３ｂ−ＧＦＰのノックインが認められた。すなわちノックイン株取得率は１．０５％であった。

【0070】

以上の通り、実施例１と比較例１との結果を対比すると、本発明に係る方法を用いた実施例１の方が極めて高い効率で標識化解析対象タンパク質のノックイン細胞株が得られた。すなわち、本発明に係る方法によると、標識化解析対象タンパク質のノックイン細胞株を高効率で得られることが明らかとなった。

【0071】

［比較例２］
さらに、本発明に係る方法による標識化解析対象タンパク質発現細胞株の取得率が極めて高いものであることを証明するために、ＨＩＴＩ法を利用して本発明とは異なる遺伝子座に標識化解析対象タンパク質の発現ユニットを挿入した場合のノックイン株取得率を以下の通りに評価した。

【0072】

（Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ発現ベクターの作製）
まず、上記ＢＲＯＡＤ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが提供しているｇＲＮＡ設計ウェブサイトに、恒常的に発現が見られてノックイン先として従来から用いられているＲｏｓａ２６のイントロン配列３９９９塩基を入力し、ｇＲＮＡの標的配列の候補リストを得た。得られた候補リストの中から、切断効率スコアの高いものを標的配列として選択した。標的配列として選択した配列は、以下の通りである。
ＣＧＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＣＧＧ（配列番号３１）

【0073】

上記選択した配列について、プラスミドベクターに組み込むためにオーバーハング配列（センス鎖：ＣＣＧ／アンチセンス鎖：ＡＡＣ）を５’末端に付加し、５’末端をリン酸化した相補的なオリゴＤＮＡをアニーリングにより二本鎖ＤＮＡにしてプラスミドベクター（ＡＴＵＭ社，カタログ番号ＰＤ１３０１−ＡＤ，ＣＭＶ−Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰ Ｃａｓ９−ＥｌｅｃＤ）に挿入してＣａｓ９およびｇＲＮＡを発現するプラスミドベクター（以下Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター）を構築した。上記選択した配列にオーバーハング配列を付加した相補的なオリゴＤＮＡの配列は以下の通りである。
センス鎖：［Ｐｈｏｓ］ ＣＣＧＣＧＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ（配列番号３２）
アンチセンス鎖：［Ｐｈｏｓ］ ＡＡＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＣＧ（配列番号３３）

【0074】

（ドナーベクターの作製）
次に、Ｓｔａｍ１のアミノ末端にＨＡタグを連結したＨＡ標識Ｓｔａｍ１をターゲットサイトにノックインするためのドナーベクターを構築した。まず、実施例１で作成したｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１−ＮｅｏのＣＭＶプロモーター配列の上流に上記の通り選択したｇＲＮＡ標的配列を挿入した。具体的に、制限酵素ＡｓｅＩでｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１−Ｎｅｏを消化し、ｇＲＮＡ標的配列にＡｓｅＩで消化した断片になるように５’側および３’側に核酸配列を付加したオリゴＤＮＡをアニーリングにより二本鎖ＤＮＡにして、ＡｓｅＩで消化した上記のプラスミドベクターに挿入してドナーベクターを構築した。以下に、ｇＲＮＡ標識配列にＡｓｅＩで消化した断片になるように５’側および３’側に核酸配列を付加したオリゴＤＮＡ配列を示す。
センス鎖：［ｐｈｏｓ］ｔａａｔＣＧＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＧＡＧＧＣＧＧａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃａｔｇｃａｔｔａｇｔｔＡＴ（配列番号３４）
アンチセンス鎖：［ｐｈｏｓ］ＴＡＡＴａａｃｔａａｔｇｃａｔｇｇｃｇｇｔａａｔａｃｇｇｔＣＣＧＣＣＴＣＧＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＣＧａｔ（配列番号３５）

【0075】

上記で作成したベクターのＥＧＦＰ配列をＨＡ配列に置換しドナーベクターを構築した。具体的に、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩの２つの制限酵素でＥＧＦＰ配列を除去し、ＨＡ配列にＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した断片になるように５’側および３’側に核酸配列を付加したオリゴＤＮＡをアニーリングにより二本鎖ＤＮＡにして、ＥＧＦＰ配列を除去したプラスミドベクターに挿入してドナーベクターを構築した。ＨＡ配列にＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した断片になるように５’側および３’側に核酸配列を付加したオリゴＤＮＡ配列を示す。
センス鎖：［ｐｈｏｓ］ＣＴＡＧＣｇｃｔａｃｃｇｇｔｃＧＣＣＡＣＣａｔｇＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴｇ（配列番号３６）
アンチセンス鎖：［ｐｈｏｓ］ａａｔｔｃＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡｃａｔＧＧＴＧＧＣｇａｃｃｇｇｔａｇｃＧ（配列番号３７）

【0076】

（細胞へのベクターの導入）
６０ｍｍプラスチック培養皿に播種したｍＩＭＣＤ−３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１２３）、２μｇのＣａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター、２μｇのドナーベクター、及び１２μｇのＰＥＩ−ＭＡＸを３００μＬのＰＢＳ中で混合し、室温で２０分間反応させた後、３ｍＬの培養液（１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）の入っている培養皿に滴下し，培地とよく混合した。その半日後に培地を交換し発現ベクターとＰＥＩ−ＭＡＸを除去して更に１日培養した。

【0077】

（導入細胞の選択）
上記培養後、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＧ４１８を添加した培地に交換し、更に５日〜１０日培養した。途中で１〜２回、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む新鮮な培地に交換した。

【0078】

（比較例２によるノックイン細胞株の取得率の評価）
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現ベクター、上記ドナーベクター及びＰＥＩ−ＭＡＸを加えられた後にＧ４１８で選択されたｍＩＭＣＤ−３に対して、０．２５％のトリプシン溶液を用いて培養皿から細胞を剥がし取り、１ウェル当たり０．２〜０．５細胞の密度で０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む８０μＬの培地とともに９６ウェル培養プレートに播いた。

【0079】

９６ウェルで培養してから１０日〜２週間経過したのち、コロニーを形成しているウェルから上記と同様にトリプシンを用いて細胞を剥がし取り、０．２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む１ｍＬの培地で満たした１２ウェルプレートのウェルにそれぞれ播いた。

【0080】

スクリーニング用プレート中の細胞がウェルの１００％を占めるまで増えた後、４０〜６０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーで細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を泳動したのち、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写して、抗ＨＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社 ９０１５０２）を用いてノックインが成功した細胞をスクリーニングした。その結果を図６に示す。

【0081】

図６に示すように、比較例２の方法を用いて、標識化解析対象タンパク質としてＨＡ標識Ｓｔａｍ１の導入を行った場合、７７細胞株中５細胞株（図６において矢印が付いたレーン）にＨＡ標識Ｓｔａｍ１のノックインが認められた。すなわちノックイン株取得率は６．４９％であった。比較例２では、恒常的な発現が見られ、遺伝子サイレンシングが起こり難いと考えられるＲｏｓａ２６のイントロンにノックインしたが、完全には遺伝子サイレンシングが抑えられず、ノックイン細胞株が十分に増殖するまでの過程で解析対象タンパク質の発現が低下したため、高い取得率が得られなかったと考えられる。また、この他に、外来プロモーター（ＣＭＶ）による強制発現は細胞にとって大きなストレスとなるため、解析対象タンパク質を過剰発現する状態のままとなった細胞では、その増殖速度が低下する又は増殖せず死滅することにより、高い所得率が得られなかったと考えられる。

【0082】

以上の通り、実施例１と比較例２との結果を対比すると、本発明に係る方法を用いた実施例１の方が極めて高い効率で標識化解析対象タンパク質のノックイン細胞株が得られた。すなわち、本発明に係る方法によると、標識化解析対象タンパク質の発現に内在のプロモーターが用いられ、遺伝子サイレンシング等の影響を受け難いため、標識化解析対象タンパク質を安定的に発現するノックイン細胞株を高効率で得られることが明らかとなった。

【0083】

［実施例２］
次に、本実施例１で得られた細胞株における標識化解析対象タンパク質の発現についての長期安定性を評価した。その方法及び結果を以下に示す。なお、用いた細胞株は、実施例１において標識化解析対象タンパク質としてＥＧＦＰ−Ｓｔａｍ１のノックインが確認されたｍＩＭＣＤ−３細胞株である。

【0084】

凍結保存した上記ノックインが確認されたｍＩＭＣＤ−３細胞株を凍結保存状態から起こし、３日から４日間隔で継代を行いながら５８日間培養し、５９日目の継代で底がカバーガラスになっている３５ｍｍ培養皿（以下ガラスボトムディッシュ；松浪 Ｄ１１１３０Ｈ）に細胞を播種して３日間培養した。当該細胞が培養開始から５８日間経過した５９日目に、新たに上記ノックイン細胞を凍結保存状態から起こし、１日後の継代でガラスボトムディッシュに播種して２日間培養した。培養開始から６１日間および３日間経過した上記ノックイン細胞を培養している培地をフェノールレッド色素と血清の含まない培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に交換した。培地交換後５時間経過したのち、１００倍油浸レンズを装着した倒立型蛍光顕微鏡（ライカＤＭＩ３０００Ｂ）およびＣＭＯＳカメラを用いて細胞の蛍光画像を取得した。その結果を図７に示す。

【0085】

図７に示すように、培養継代期間が３日間の細胞と、６１日間の細胞との両方でＧＦＰによる蛍光が見られた。また、その蛍光の平均輝度を測定したところ、培養継代期間が３日間の細胞では平均輝度が５０．６であり、６１日間の細胞では平均輝度が５４．７であった。これらの結果から、上記ノックイン細胞を長期培養してもＧＦＰの蛍光が低減せず、すなわち、ノックインされた標識化された解析対象タンパク質が安定的に発現されているといえる。

【0086】

以上から、本発明によると、標識化解析対象タンパク質を生理的発現レベルで安定的に発現することができて、所望の解析対象タンパク質の生きた細胞内での挙動をより正確に解析することを可能とする細胞株を、簡便な方法で高い効率で得ることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]