特開 2021-47046 観察方法、測定方法、解析方法、定量方法、およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-47046(P2021-47046A)

(43)【公開日】2021年3月25日

(54)【発明の名称】観察方法、測定方法、解析方法、定量方法、およびキット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20210226BHJP

   A61K 50/00 20060101ALI20210226BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20210226BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20210226BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20210226BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20210226BHJP

   A61Q 7/00 20060101ALN20210226BHJP

   A61K 8/64 20060101ALN20210226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20210226BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20210226BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/48 M

   A61K50/00 200

   G01N33/48 P

   G01N33/53 D

   G01N33/53 Y

   G01N33/50 H

   G01N21/64 F

   C12Q1/06

   A61Q7/00

   A61K8/64

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   C12M1/34 F

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2019-168469(P2019-168469)

(22)【出願日】2019年9月17日

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000125370

【氏名又は名称】学校法人東京理科大学

(71)【出願人】

【識別番号】503167042

【氏名又は名称】株式会社アドバンジェン

(74)【代理人】

【識別番号】110001070

【氏名又は名称】特許業務法人ＳＳＩＮＰＡＴ

(72)【発明者】

【氏名】行方 昌人

(72)【発明者】

【氏名】山本 昌邦

(72)【発明者】

【氏名】後飯塚 僚

【テーマコード（参考）】

2G043

2G045

4B029

4B063

4C083

4C085

【Ｆターム（参考）】

2G043AA03

2G043BA16

2G043DA02

2G043EA01

2G045AA24

2G045AA25

2G045AA29

2G045BA13

2G045BA14

2G045BB20

2G045BB22

2G045BB25

2G045CB01

2G045CB09

2G045CB13

2G045CB16

2G045CB17

2G045DA13

2G045DA36

2G045FA12

2G045FA16

2G045FA19

2G045FB03

2G045FB05

2G045FB12

2G045GB01

2G045GB02

2G045GC15

4B029AA07

4B029BB11

4B029BB15

4B029FA12

4B063QA01

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR55

4B063QS33

4B063QX02

4C083CC37

4C083DD06

4C083EE22

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA19

4C085EE01

4C085HH11

4C085HH13

4C085KA03

4C085KA27

4C085KB82

4C085LL20

(57)【要約】

【課題】本発明は毛包、特に毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１タンパク質について観察を行うことにより、Ｍｅｉｓ１タンパク質の毛周期における役割について解析する方法を提供する。
【解決手段】毛球部、好ましくは毛球部に含まれる毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を蛍光免疫染色等の方法によって観察する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

毛球部のＭｅｉｓ１タンパク質の観察方法。

【請求項2】

前記毛球部に含まれる毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察する、請求項１に記載の観察方法。

【請求項3】

前記毛乳頭細胞内においてＭｅｉｓ１タンパク質の存在する位置を観察する、請求項２に記載の観察方法。

【請求項4】

蛍光免疫染色により染色されたＭｅｉｓ１タンパク質を観察する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の観察方法。

【請求項5】

前記観察方法においてさらに核の染色を行う、請求項４に記載の観察方法。

【請求項6】

前記観察方法においてさらに組織染色を行う、請求項５に記載の観察方法。

【請求項7】

毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察し、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞の数を測定する、測定方法。

【請求項8】

蛍光免疫染色により染色されたＭｅｉｓ１タンパク質を観察する、請求項７に記載の測定方法。

【請求項9】

前記観察前に、さらに組織染色を行う、請求項７または８に記載の測定方法。

【請求項10】

毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察し、Ｍｅｉｓ１タンパク質が毛乳頭細胞内の核内に存在している細胞の数を観察することで、毛包の毛周期について解析する方法。

【請求項11】

前記毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１タンパク質の存在位置を観察し、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に存在している毛乳頭細胞と全毛乳頭細胞数との比を計算する、毛包の毛周期について解析する方法。

【請求項12】

毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を蛍光免疫染色し、得られた蛍光シグナルを観察することにより、核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量する、定量方法。

【請求項13】

以下の工程により、毛乳頭細胞の核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量する、定量方法。
（ａ）毛乳頭細胞を単離する工程
（ｂ）前記毛乳頭細胞から核画分を分離する工程
（ｃ）前記核画分およびそれ以外の画分に含まれるＭｅｉｓ１タンパク質を定量する工程

【請求項14】

請求項１２または１３の定量方法を用いて、毛包の毛周期について解析する方法。

【請求項15】

請求項３〜６のいずれか一項に記載の観察方法を行うためのキットであって、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方、並びに（ｃ）を含む、キット。
（ａ）毛髪から毛乳頭細胞を単離するための薬剤；
（ｂ）組織染色を行うための薬剤；
（ｃ）Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識するための標識剤：

【請求項16】

請求項１３に記載の定量方法を行うためのキットであって、以下の（ａ’）〜（ｃ’）を含む、キット。
（ａ’）毛髪から毛乳頭細胞を単離するための薬剤；
（ｂ’）前記毛乳頭細胞の、核画分およびそれ以外の画分を分画するための器材；
（ｃ’）Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識するための標識剤：

【請求項17】

前記標識剤が抗Ｍｅｉｓ１抗体である請求項１５または１６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｍｅｉｓ１タンパク質の観察方法、測定方法、解析方法、定量方法、およびそれらを行うためのキットに関する。

【背景技術】

【0002】

加齢や遺伝的要素による脱毛、あるいは過度なストレスによる円形脱毛症等、頭髪の脱毛についての悩みを抱える者は多い。男性型および女性型脱毛症診療ガイドライン２０１７年版（日本皮膚科学会ガイドライン）によると、男性型脱毛症（male pattern hair loss, androgenetic alopecia（ＡＧＡ））の発症頻度は全年齢平均で約３０％である。
また、平成２６年の政府統計における患者調査（傷病分類変）によると、脱毛症により病院を受診した総患者数だけでも１０万人を超えており、潜在的な脱毛症患者はさらに多いと考えられる。

【0003】

毛髪を形成する器官である毛包は再生と退行を繰り返す独特な性質を有する器官であり、近年では成熟した皮膚組織からの毛再生について、精力的に研究されている。毛包には毛が伸びる成長期（Ａｎａｇｅｎ）、抜ける準備をする退行期（Ｃａｔａｇｅｎ）、抜け落ちるまでの時期である休止期（Ｔｅｌｏｇｅｎ）があり、成長期から休止期までの毛の成長と脱毛のサイクルを（毛周期：ヘアサイクル）と呼ぶ。成長期には、毛包の毛球部にある毛乳頭細胞が活性化することで毛母細胞が増殖・分化し、毛幹として伸長していくことで毛が成長する。その後、退行期に入ると毛の成長は衰え、不可逆的に休止期に入り毛成長は停止し、やがて、脱毛する。毛周期は各毛包ごとにそれぞれの周期を有し、さまざまな遺伝子およびその産物、もしくは毛包周囲の環境によって制御されている繊細な生体機構である。

【0004】

非特許文献１には、転写因子であるＭｅｉｓ１というタンパク質がマウス皮膚の休止期において、毛包内のバルジ領域（毛包幹細胞が存在する領域）や毛乳頭細胞に発現していることが記載されている。同文献においては、休止期において幹細胞を含む上皮系細胞上のＭｅｉｓ１タンパク質をコンディショナルに欠損させると、表皮の過形成およびバルジ領域の上皮系幹細胞の大幅な減少が起きたことが確認されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】K. Okumura et al. PLoS One. 2014 Jul 11;9(7)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

これまでに皮膚におけるＭｅｉｓ１タンパク質の役割については、毛包バルジ領域の上皮系幹細胞の維持に必要であることが報告されているが、毛球部、特に毛乳頭細胞においての成長期、休止期もしくは退行期における役割については未だ報告がない。
本発明は、毛周期の各段階におけるＭｅｉｓ１タンパク質の詳細な観察等を行うことを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１タンパク質と発毛メカニズムとの関係について着目した。本発明者らは毛包内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察することで、毛球部の毛乳頭細胞内におけるＭｅｉｓ１タンパク質が存在する位置が毛周期に応じて変化することを見出した。
本発明はＭｅｉｓ１タンパク質（本明細書においてはＭｅｉｓ１と略することもある）に係る観察方法、測定方法、解析方法、定量方法、およびそれらを行うためのキットに関する。

【0008】

すなわち、本発明は例えば以下の［１］〜［１７］を提供する。
[１]
毛球部のＭｅｉｓ１タンパク質の観察方法。
[２]
前記毛球部に含まれる毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察する、[１]に記載の観察方法。
[３]
前記毛乳頭細胞内においてＭｅｉｓ１タンパク質の存在する位置を観察する、[２]に記載の観察方法。
[４]
蛍光免疫染色により染色されたＭｅｉｓ１タンパク質を観察する、[１]〜[３]のいずれか一項に記載の観察方法。
[５]
前記観察方法においてさらに核の染色を行う、[４]に記載の観察方法。
[６]
前記観察方法においてさらに組織染色を行う、[５]に記載の観察方法。
[７]
毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察し、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞の数を測定する、測定方法。
[８]
蛍光免疫染色により染色されたＭｅｉｓ１タンパク質を観察する、[７]に記載の測定方法。
[９]
前記観察前に、さらに組織染色を行う、[７]または[８]に記載の測定方法。
[１０]
毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察し、Ｍｅｉｓ１タンパク質が毛乳頭細胞内の核内に存在している細胞の数を観察することで、毛包の毛周期について解析する方法。
[１１]
前記毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１タンパク質の存在位置を観察し、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に存在している毛乳頭細胞と全毛乳頭細胞数との比を計算する、毛包の毛周期について解析する方法。
[１２]
毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を蛍光免疫染色し、得られた蛍光シグナルを観察することにより、核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量する、定量方法。
[１３]
以下の工程により、毛乳頭細胞の核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量する、定量方法。
（ａ）毛乳頭細胞を単離する工程
（ｂ）前記毛乳頭細胞から核画分を分離する工程
（ｃ）前記核画分およびそれ以外の画分に含まれるＭｅｉｓ１タンパク質を定量する工程
[１４]
[１２]または[１３]の定量方法を用いて、毛包の毛周期について解析する方法。
[１５]
[３]〜[６]のいずれか一項に記載の観察方法を行うためのキットであって、以下の（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方、並びに（ｃ）を含む、キット。
（ａ）毛髪から毛乳頭細胞を単離するための薬剤；
（ｂ）組織染色を行うための薬剤；
（ｃ）Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識するための標識剤：
[１６]
[１３]に記載の定量方法を行うためのキットであって、以下の（ａ’）〜（ｃ’）を含む、キット。
（ａ’）毛髪から毛乳頭細胞を単離するための薬剤；
（ｂ’）前記毛乳頭細胞の、核画分およびそれ以外の画分を分画するための器材；
（ｃ’）Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識するための標識剤：
[１７]
前記標識剤が抗Ｍｅｉｓ１抗体である[１５]または[１６]に記載のキット。

【発明の効果】

【0009】

本発明の観察方法によれば毛球部を観察することによって、Ｍｅｉｓ１タンパク質の存在する位置を観察し、また定量することで毛球部の毛周期について解析することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１（ａ）はマウス毛乳頭細胞の各毛周期における、Ｍｅｉｓ１の存在位置の変化の様子を示す模式図である。図１(ｂ)は各毛周期におけるマウス体毛の形態学的変化を示す図である。

【図2】図２はマウス背部皮膚の各毛周期におけるＭｅｉｓ１の細胞内位置の変化を示す図である。（ａ）各毛周期におけるマウスの皮膚切片を用いたＨＥ染色画像である。（ｂ）マウス背部皮膚の毛包のバルジ領域における、各毛周期におけるＭｅｉｓ１に対する蛍光免疫染色画像である。（ｃ）毛球部における、各毛周期におけるＭｅｉｓ１に対する蛍光免疫染色画像である。

【図3】図３（ａ）は各毛周期における野生型マウス（C57BL/6）の頬髭毛包を示した写真である。図３（ｂ）は各毛周期における頬髭毛包の毛乳頭細胞についてのＭｅｉｓ１に対する蛍光免疫染色画像である。図３（ｃ）はＭｅｉｓ１が核内に存在している細胞の割合の変化と毛周期との関係を示したグラフである。

【図4】図４はＭｅｉｓ１を欠損していないマウスの頬髭(左画像）およびＭｅｉｓ１を欠損したマウスの頬髭(右画像）のそれぞれの毛幹成長の経時的変化を示した明視野画像、およびそれぞれのマウスの頬髭毛幹の長さの経時的変化を示したグラフである。

【図5】図５（ａ）はＭｅｉｓ１を欠損していないマウスおよびＭｅｉｓ１を欠損したマウスの頬髭毛包についてＥｄＵ染色を行った結果を示した染色画像である。図５（ｂ）は図５（ａ）の結果を定量化したグラフである。図５（ｃ）はそれぞれのマウスの体毛のＡｕｂｅｒ’ｓ ｌｉｎｅ上の毛母細胞が存在する領域の厚さを示したグラフである。

【図6】図６（ａ）は野生型マウスの毛乳頭細胞培養上清、またはＭｅｉｓ１を欠損した毛乳頭細胞の培養上清を加えて培養したＭｅｉｓ１欠損マウス頬髭毛包についてＥｄＵ染色を行った結果を示した染色画像である。図６（ｂ）は図６（ａ）の結果を定量化したグラフである。図６（ｃ）はそれぞれのマウスの体毛のＡｕｂｅｒ'ｓ ｌｉｎｅ上の毛母細胞が存在する領域の厚さを示したグラフである。

【図7】図７は得られた知見より、成長期、並びに退行期及び休止期の毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１タンパク質の動向および作用機序を示した模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

＜観察方法＞
本発明の「観察方法」においては、毛球部に含まれる毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察することによって行われ、好ましくは毛球部に含まれる毛乳頭細胞内におけるＭｅｉｓ１タンパク質を観察することによって行われる。

【0012】

本発明の「観察方法」においては、蛍光免疫染色によってＭｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識することによって、Ｍｅｉｓ１タンパク質の観察が行われることが好ましい。
本発明において用いられる蛍光免疫染色の「目的物質」はＭｅｉｓ１タンパク質であり、染色の対象となる検体は毛髪や体毛の毛球部、または毛球部に含まれる毛乳頭細胞、毛球部を含んだ皮膚組織、または毛球部から単離した毛乳頭細胞であることが好ましい。

【0013】

本発明の「観察方法」においては毛球部に含まれる毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１タンパク質の存在する位置を観察することが好ましい。Ｍｅｉｓ１タンパク質の存在する位置としては、毛乳頭細胞一細胞においてＭｅｉｓ１タンパク質が存在している位置を観察してもよく、複数の毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１タンパク質が存在している位置を観察してもよく、毛球部に含まれる全ての毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１タンパク質が存在している位置を観察してもよい。

【0014】

また、毛乳頭細胞一細胞を観察した場合において例えば８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％のＭｅｉｓ１タンパク質が核内に存在している毛乳頭細胞を、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞であると判断することが好ましい。具体的には例えば、Ｍｅｉｓ１タンパク質を蛍光免疫染色し、核をＤＡＰＩで染色した場合において、蛍光免疫染色由来のシグナルの９０％以上が核と重なっているとき、その毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１タンパク質が核内に局在していると判断することができる。

【0015】

上述したように毛周期には毛が成長する成長期（Ａｎａｇｅｎ）、抜ける準備をする退行期（Ｃａｔａｇｅｎ）、抜け落ちるまでの時期である休止期（Ｔｅｌｏｇｅｎ）が存在する。なお、成長期（Ａｎａｇｅｎ）は早初期成長期（Ｖｅｒｙ Ｅａｒｌｙ Ａｎａｇｅｎ）、初期成長期（Ｅａｒｌｙ ａｎａｇｅｎ）、中期成長期（Ｍｉｄ Ａｎａｇｅｎ）、および後期成長期（Ｌａｔｅ Ａｎａｇｅｎ）に大別される。本発明者らの検討によると早初期成長期〜初期成長期〜中期成長期にかけて、Ｍｅｉｓ１タンパク質は核外から核内に移行していく。そして中期成長期が終わり、後期成長期〜退行期〜休止期にかけてＭｅｉｓ１タンパク質は核内から核外に移行する。

【0016】

各毛周期におけるＭｅｉｓ１の存在位置の変化する様子の模式図と、各毛周期におけるマウス体毛の形態学的変化の様子を図１に示す。上述したように、例えば８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％のＭｅｉｓ１タンパク質が核内にある毛乳頭細胞はＭｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞といえ、そのような毛乳頭細胞が毛包中の全毛乳頭細胞の９０％以上を占める場合、当該毛包は中期成長期にあるといえる。また、中期成長期から後期成長期にかけて核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質が核内から核外に移行する。退行期になるとＭｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞の割合は通常１０％以下となり、休止期となると０〜１％となる。そして再び毛周期が成長期に入ると共にＭｅｉｓ１タンパク質は徐々に核内へと再移行する。

【0017】

本発明の「観察方法」は、蛍光免疫染色により染色されたＭｅｉｓ１タンパク質を観察することによって行われてもよい。この蛍光免疫染色におけるＭｅｉｓ１タンパク質の蛍光標識は直接的に行われてもよいし、間接的に行われてもよい。具体的な方法としては、抗Ｍｅｉｓ１抗体に直接化学的方法で蛍光色素を修飾したものを用いて検体上にあるＭｅｉｓ１タンパク質と反応させることでＭｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識してもよいし、抗Ｍｅｉｓ１抗体と検体である毛根等を反応させ、次に抗ＩｇＧ抗体に蛍光修飾したものを用いて検体上にあるＭｅｉｓ１タンパク質と結合した抗Ｍｅｉｓ１抗体に、蛍光修飾した抗ＩｇＧ抗体を反応させることでＭｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識してもよい。

【0018】

蛍光免疫染色を行った検体を観察する工程では、所望の倍率における顕微鏡において、蛍光免疫染色に用いられた蛍光色素に対応した励起光を標本サンプルに照射し、蛍光色素から発せられた蛍光による免疫染色像それぞれを観察・撮影する。これらの励起光の照射は、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源と、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用光学フィルターを用いることで照射することができる。また、蛍光免疫染色像を撮影する場合には、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラによって行うことができる。蛍光免疫染色像の撮影の際には、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる蛍光用光学フィルターを用いることで、目的とする蛍光のみを含み、目的としない蛍光やノイズとなる励起光およびその他の光を排除した免疫染色像を撮影することができる。

【0019】

なお、蛍光色素とは所定の波長の電磁波（Ｘ線、紫外線または可視光線）が照射されてそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、その励起状態から基底状態に戻る際に余剰のエネルギーを電磁波として放出する物質を指す。また、「蛍光」は広義的な意味を持ち、励起のための電磁波の照射を止めても発光が持続する発光寿命の長い燐光と、発光寿命が短い狭義の蛍光とを包含する。

【0020】

蛍光色素は特に限定されるものではなく、たとえば、ローダミン系色素、スクアリリウム系色素、シアニン系色素、芳香環系色素、オキサジン系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素などを例示することができる。あるいは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。

【0021】

また、Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に蛍光標識すると同時に核を染色することが好ましく、核を蛍光染色することがさらに好ましい。核を同時に蛍光染色することによってＭｅｉｓ１タンパク質が核内に存在しているか核外に存在しているか、核内および核外に存在しているかを判断することができる。核を蛍光染色する方法は特に限定されないが、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色剤やＳＹＴＯ（登録商標）、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３およびＳＹＴＯＸ（登録商標）などの核染色剤が広く知られており、特にＤＮＡに対して強力に結合するという観点からＤＡＰＩが用いられることが好ましい。

【0022】

本発明の「観察方法」においては、Ｍｅｉｓ１タンパク質の染色に加えて、さらに組織染色を行うことが好ましい。本明細書において組織染色とは明視野において毛根周囲の皮膚、毛根や毛根に含まれる細胞の形態等を観察することができるようにするための染色を指す。組織染色は、常法に従って行うことができる、例えば、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。また、細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。組織染色を行う場合は、免疫染色をした同じ検体から連続的に切り出した別の切片を用いて、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。

【0023】

また、本発明の「観察方法」においては色素を用いた免疫染色によってＭｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識することによって、Ｍｅｉｓ１タンパク質の観察を行うこともできる。具体的には、例えば、Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識する抗体と任意の色素とを結合させたものを用いて免疫染色を行なうことでＭｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識してもよいし、Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識する抗体と任意の発色基質を発色させる酵素とを結合させたものを用いて免疫染色したのち、検体と発色基質とを反応させることによりＭｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識してもよい。このように色素を用いた免疫染色を行った場合には適宜明視野顕微鏡によって観察を行うことができる。

【0024】

＜測定方法＞
本発明の「測定方法」においては上記毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察し、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞の数を測定する。
好ましくは蛍光免疫染色によってＭｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞の数を測定する。測定方法は特に限定はされないが、任意のプログラムによって自動的に計測してもよいし、視認によって計測しても良い。このとき、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞であるかを判断する基準は任意に定めることができるが、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％のＭｅｉｓ１タンパク質が核内に存在している毛乳頭細胞を、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞であると判断することが好ましい。具体的には例えば、Ｍｅｉｓ１タンパク質を蛍光免疫染色し、核をＤＡＰＩで染色した場合において、蛍光免疫染色由来のシグナルの９０％が核と重なっているとき、その細胞においてＭｅｉｓ１タンパク質が核内に局在していると判断することができる。この測定方法におけるＭｅｉｓ１タンパク質の観察においては、前記観察前に組織染色を行うことが好ましい。

【0025】

＜解析方法＞
本発明の「解析方法」においては、毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察する方法により、Ｍｅｉｓ１タンパク質が毛乳頭細胞内の核内に存在している細胞の量を観察することで、毛包の毛周期について解析する方法である。

【0026】

上述したように毛乳頭細胞においては早初期成長期〜初期成長期〜中期成長期にかけて、Ｍｅｉｓ１タンパク質は核外から核内に移行していく。そして中期成長期が終わり、後期成長期〜退行期〜休止期にかけてＭｅｉｓ１タンパク質は核内から核外に再び移行する。
「解析方法」の一様態においては、毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質を観察する方法により毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１タンパク質の存在位置を観察することで、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に存在している毛乳頭細胞と全毛乳頭細胞数との比を計算する工程を含む、毛包の毛周期について解析する方法が挙げられる。例えば、Ｍｅｉｓ１タンパク質が核内に局在している毛乳頭細胞数／全毛乳頭細胞数が９０％であればその毛包は中期成長期にあると解析することができる。

【0027】

＜定量方法＞
本発明の「定量方法」は、毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質に対して蛍光免疫染色を行うことで得られた蛍光シグナルを観察することにより、核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量する、定量方法である。
「定量方法」の一様態においては、毛乳頭細胞内のＭｅｉｓ１タンパク質に対して蛍光免疫染色を行うことで得られた蛍光シグナルにより、核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量する。
例えば、撮影された蛍光免疫染色像について、画像処理に基づきＭｅｉｓ１タンパク質を標識した蛍光色素に対応する蛍光標識シグナルを計測し、核外にある前記目的生体物質に対応する蛍光標識シグナルを特定する。

【0028】

画像処理に用いることができるソフトウェアとしては、たとえば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース：http://imagej.nih.gov/ij/）が挙げられる。このような画像処理ソフトウェアを利用することにより、蛍光免疫染色像から、所定の波長（色）の輝点を抽出してその輝度の総和を算出したり、所定の輝度以上の輝点の数を計測したりする処理を半自動的に、迅速に行うことができる。

【0029】

また、別の様態の本発明の「定量方法」においては、（ａ）毛乳頭細胞を単離する工程、（ｂ）前記毛乳頭細胞から核画分を分離する工程、（ｃ）前記核画分およびそれ以外の画分に含まれるＭｅｉｓ１タンパク質を定量する工程、により毛乳頭細胞の核内に存在しているＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量する。

【0030】

上記（ａ）毛乳頭細胞を単離する工程に供する方法においては特に限定されることはなく、常法によって行われることができる。例えば、体毛を有する皮膚片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄した後、必要によりタンパク質分解酵素等を用いて表皮層および真皮層を除いて皮下脂肪層のみにし、次いでピンセット等で単離した毛包から毛球部を切り取り、この毛球部下部から毛乳頭を露出させて毛乳頭細胞を単離することができる。

【0031】

上記（ｂ）毛乳頭細胞から核画分を分離する工程においてもその手法は特に限定されるものではなく、例えば8-min Cytoplasmic & Nuclear Protein Extraction Kit（コスモバイオ社）等市販のキットを用いて行うことができる。

【0032】

上記（ｃ）核画分およびそれ以外の画分に含まれるＭｅｉｓ１タンパク質を定量する工程においてもその手法は特に限定されるものではなく、通常特定のタンパク質を定量する方法にもちいられる手法、例えば電気泳動などを用いた染色など任意の方法をもって行うことができる。また、任意の工程として、上記（ｂ）における核画分とそれ以外の画分とを分離する前のサンプルから採取した全タンパク質の量を定量することも好ましい。

【0033】

当該「定量方法」を用いて上述した毛包の毛周期について解析することもできる。具体的には工程（ｂ）で分離した毛乳頭細胞の核画分とそれ以外の画分のそれぞれにおけるＭｅｉｓ１タンパク質の量を定量することで、当該毛乳頭細胞における毛周期が、成長期にあるか、退行期にあるか、休止期にあるかを決定することができる。例えば、マウスにおいて例えば核画分に存在するＭｅｉｓ１タンパク質がＭｅｉｓ１タンパク質全体量の５０％以上８０％未満であればその細胞は初期成長期にあり、８０％以上１００％以下であればその細胞は中期成長期にあるなどの判断ができるといえる。なお、当該数値においては動物種等や個体、個人などによって大きく異なるため、任意に設定することが好ましい。

【0034】

なお、初期成長期および退行期における核画分とそれ以外の画分に含まれるＭｅｉｓ１タンパク質の割合は類似していることもある。この場合その毛根がどちらの毛周期に属しているかは当該毛根の形態によって簡便に判断することができる（図１参照）。

【0035】

本発明者らの検討によると、毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１は細胞核に存在しているか、あるいは細胞質に存在しているかということが毛周期において重要であることがわかった。例えば、後述する実施例において述べるように、Ｍｅｉｓ１をコンディショナルノックアウトした初期成長期の頬髭毛包を用いることにより、Ｍｅｉｓ１が欠損することで、毛幹形成に重要な毛母細胞の増殖が著しく抑制されること、さらにその増殖抑制はＭｅｉｓ１が含まれている毛乳頭細胞培養上清の添加により部分的に救済されるが、Ｍｅｉｓ１をコンディショナルノックアウトした毛乳頭細胞由来の培養上清では変化しないことが示された。したがって毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１は細胞核に存在しているか、あるいは細胞質に存在しているかによって機能制御されることが推測できる。

【0036】

＜キット＞
本発明の「キット」の一様態は上述した観察方法を行うためのキットであって、（ａ）毛髪から毛乳頭細胞を単離するための薬剤、（ｂ）組織染色を行うための薬剤の一以上、および（ｃ）Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識するための標識剤を含むキットである。
本発明の「キット」の一様態は上述した定量方法を行うためのキットであって、（ａ’）毛髪から毛乳頭細胞を単離するための薬剤；（ｂ’）前記毛乳頭細胞の、核画分およびそれ以外の画分を分画するための器材；（ｃ’）Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識するための標識剤を含む。
Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に標識するための標識剤としては特に限定されないが、抗Ｍｅｉｓ１抗体を用いることが好ましい。例えば、上記キットを蛍光免疫染色で観察、または定量に用いる場合には抗Ｍｅｉｓ１抗体を直接的または間接的に蛍光色素で修飾したものを選択することが好ましい。

【0037】

抗Ｍｅｉｓ１抗体としては特に限定されるものではないが、Ｍｅｉｓ１タンパク質との結合力の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。また、Ｍｅｉｓ１タンパク質を特異的に認識して結合する能力を有するものであれば、天然の全長の抗体でなく、抗体断片または誘導体であってもよい。すなわち、本明細書における「抗体」という用語には、全長の抗体だけでなく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）'２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片およびキメラ抗体（ヒト化抗体等）、多機能抗体などの誘導体が包含される

【実施例】

【0038】

次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［作製例１］
＜Ｍｅｉｓ１コンディショナルノックアウトマウス（Ｍｅｉｓ１ｃＫＯマウス）の作製＞
成長期にあるマウスの頬髭毛包からＭｅｉｓ１遺伝子を欠損することで、毛周期にどのような影響があるかを検討した。
以下、全ての動物実験は東京理科大学動物実験委員会の承認されたプロトコールに従って行われた。
Ｍｅｉｓ１遺伝子の固定対立遺伝子（Ｍｅｉｓ１ ｆｌ／ｆｌ）を有するマウスを作成し(Ariki et al., 2014; Hirayama et al., 2014)、当該マウスをＲｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２トランスジェニックマウス（Kawai et al., 2018）と交配させることにより、染色体上のＲｏｓａ２６の遺伝子座にＣｒｅリコンビナーゼ誘導配列、Ｍｅｉｓ１の機能性領域であるＥｘｏｎ８の領域にｌｏｘＰ配列が導入された、Ｒｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２； Ｍｅｉｓ１ ｆｌｏｘマウスを作製した。
当該マウスにおいては４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）の投与によりＭｅｉｓ１遺伝子はマウス体毛においてコンディショナルに欠損される。

【0039】

［実施例１］
まず毛包におけるＭｅｉｓ１の詳細な発現を確認するため、抗Ｍｅｉｓ１抗体による蛍光免疫染色を行った。２４日齢〜５１日齢の野生型マウス（C57BL/6）背部の皮膚を採取し、各毛周期にある皮膚に対してＨＥ染色（図２（ａ）上図）および抗Ｍｅｉｓ１抗体による蛍光免疫染色（図２（ａ）下図）を行った。
ＨＥ染色については以下の手法を用いて行った。
背中の裏側の皮膚を採取し、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定し、続いて１５％、次いで３０％スクロースで段階的に置換した。その後、皮膚片をティシュー・テック（登録商標）O.C.T.コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）に包埋、凍結し標本ブロックを作製した。当該標本ブロックから８〜１２μｍの切片を作製したのち、常法に従ってヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
蛍光免疫染色については以下の手法を用いて行った。

【0040】

上記調製した皮膚切片について０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳで２０分間細胞膜透化処理を行い、ブロッキングバッファー（３％ ＢＳＡおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で１時間ブロッキングを行った。当該切片に対し、一次抗体としてウサギ抗Ｍｅｉｓ１抗体（Ａｂｃａｍ社）を１：１００で用いて一晩反応させ、洗浄後二次抗体（Alexa Fluor 647結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Cell Signaling Technology社））を１：１０００で用いて１時間反応させることでＭｅｉｓ１の蛍光免疫染色を行った。さらにＭｅｉｓ１を染色した各切片について、褪色防止封入剤であるＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Thermo Fisher Scientific社）で封入した。画像はHSオールインワン蛍光顕微鏡BIOREVO BZ9000 (株式会社キーエンス)または共焦点レーザー走査型顕微鏡FV1000-D（オリンパス株式会社)を用いて取得した。

【0041】

図２（ａ）で示されるＨＥ染色の結果においては、初期成長期と比較して中期成長期にでは皮膚組織（真皮および脂肪層）の肥厚が見られ、また毛球部の形も大きく膨らんでいることが確認できる。退行期になると毛球部の形が小さく、休止期になると毛球部は委縮し、真皮および脂肪層も初期成長期で観察されたように薄くなっていることが示された。
図２（ｂ）は各毛周期における外毛根鞘およびバルジ（Ｂｕ）を含む領域、図２（ｃ）は毛球部（毛乳頭細胞が含まれる領域）におけるＭｅｉｓ１の蛍光免疫染色画像である。どの毛周期においても、毛乳頭細胞、バルジ領域、および外毛根鞘においてＭｅｉｓ１の発現が認められ、そのうちバルジ領域、および外毛根鞘のＭｅｉｓ１は細胞内の核外に存在していることが確認された（図２（ｂ））。一方毛乳頭細胞においては毛周期においてＭｅｉｓ１が細胞質と核との間で移行し、細胞内での存在位置が変化している様子が確認された。（図２（ｃ））。矢印はＭｅｉｓ１が核外に存在している箇所を示し、矢尻はＭｅｉｓ１が核内に蓄積している箇所を示す。
すなわち、毛乳頭細胞の初期成長期においては、ほとんどのＭｅｉｓ１が細胞質に存在しているが、中期成長期では細胞の多くにおいてＭｅｉｓ１が核内に存在している様子が確認された。また毛周期が退行期となるとまた核内のＭｅｉｓ１の一部は核外へ移行し、さらに休止期になるとほとんどのＭｅｉｓ１が細胞質に存在していることが確認された。
つまり、毛包では毛乳頭細胞においてのみ、Ｍｅｉｓ１が一連の毛周期の間で細胞核の内外を移行することで細胞内における存在位置の変化を起こし、成長期においてＭｅｉｓ１が細胞核内に蓄積していることが確認された。

【0042】

［実施例２］
毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１の存在位置の変化が毛の位置や種類に関わらず起きるかどうかを調査するため、マウス頬髭の毛包を用いて検証を行った。頬髭毛包は外科的に単離することが可能であり、マウス背部の毛包と同様の毛周期観察が可能である。また、単離した毛包はディッシュ上で培養が可能であり、毛成長から退行にいたる毛周期の継時的な観察、解析ができる。
毛包は４〜８週齢の野生型マウス（C57BL/6）の頬組織（Whisker pad）を切り出し、さらにその組織片から頬髭毛包を切り出し、それぞれの毛包について顕微鏡を用いて毛周期に応じて分類した。早初期成長期、初期成長期、中期成長期、後期成長期、退行期の毛包をそれぞれ図３（ａ）に示す。
実施例１と同じ手法で、各毛周期における毛乳頭細胞について抗Ｍｅｉｓ１抗体による蛍光免疫染色を行った。結果を図３（ｂ）に示す。矢印が核外に存在しているＭｅｉｓ１、矢尻が核内に蓄積されているＭｅｉｓ１をそれぞれ示す。背部皮膚の毛包と同様、初期成長期から成長が進むにつれて、毛乳頭細胞のＭｅｉｓ１は細胞核へ蓄積され、後期成長期になると細胞核のＭｅｉｓ１が減少し、退行期においてはほとんどが核外に存在していることが示された。マウス頬髭毛包においても毛乳頭細胞において毛周期とともにＭｅｉｓ１の細胞質と核との間での存在位置の変化が起こり、つまり毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１の存在位置の変化はマウスの背部皮膚の毛包および頬組織（頬髭毛包）のいずれにも起こりうる現象であることが示された。
また、さらに同様の手法で取得した抗Ｍｅｉｓ１抗体による蛍光免疫染色画像に対して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いることで、毛乳頭細胞のＤＡＰＩ陽性領域（核）および核とＭｅｉｓ１陽性領域が重なり合う細胞をそれぞれ抽出し、マルチポイントツールを用いて計数した。計数結果から全毛乳頭細胞数（ＤＡＰＩ陽性細胞数）に対する、核とＭｅｉｓ１陽性領域が重なり合う細胞の割合を算出することで、Ｍｅｉｓ１が核内に存在している毛乳頭細胞の比率を割り出した。それぞれの毛周期におけるＭｅｉｓ１が核内に存在する細胞の割合の変化を示したグラフを図３（Ｃ）に示す。左図がマウスの背中から採取した毛包、右図がマウス頬髭から採取した毛包についてのデータである。いずれの毛包においても成長期、特に中期成長期において核内にＭｅｉｓ１が存在している細胞の比率が多いことが示された。

【0043】

［実施例３］
作製例１で作製したＲｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２； Ｍｅｉｓ１ ｆｌｏｘマウスを用いて毛成長について観察を行った。生後３０日のマウスからサイズがそろった早期成長期にある毛包のみを頬髭部位から単離し、２日間無血清基礎培地で培養した。毛成長が確認できた毛包に１μＭの４−ＯＨＴおよびコントロールとしてエタノール（ＥｔＯＨ）を添加し、６日間培養して実体顕微鏡下で毛成長を測定した。結果を図４に示す。
コントロールマウス（野生型マウスおよびＥｔＯＨ添加）においては培養８日目まで一定の毛幹成長が観察された一方で、Ｍｅｉｓ１のコンディショナルノックアウトマウスにおいては４−ＯＨＴを添加後５日目にあたる、培養７日目以降から毛成長が有意に遅延した。

【0044】

［実施例４］
実施例３と同様にＲｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２； Ｍｅｉｓ１ ｆｌｏｘマウスの頬髭毛包を用いてＥｄＵ(5-ethynil-2'-deoxyuridine, 5-エチニル-2'-デオキシウリジン) 染色を行った。当該染色は細胞増殖期の細胞を染色する。具体的には１μＭの４−ＯＨＴもしくはエタノールを添加後培養５日目のマウスの頬髭毛包を５％ＣＯ₂下、３７℃で１時間、１０μＭのＥｄＵと共にインキュベートし、次いでClick-iT EdU-Alexa-Fluor488キット（Thermo Fisher Scientific社）を用いて取り込まれたＥｄＵを蛍光ラベリングした。得られた蛍光画像を図５（ａ）、ＥｄＵポジティブであった毛母細胞数を計測したグラフを図５（ｂ）、毛母細胞が存在する領域の厚さを図５（ｃ）に示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いることで、毛包中のＥｄＵ陽性細胞かつＤＡＰＩ陽性細胞である細胞を抽出し、マルチポイントツールを用いて計数した。また、Ａｕｂｅｒ’ｓ ｌｉｎｅ（毛軸に直角方向の最大径を通る線）に対して毛球部の毛母細胞が存在する領域の厚さをデジタル画像の分析によって定量した。
４−ＯＨＴによりＭｅｉｓ１を欠損させた毛包は、特に毛球部上方においてＥｄＵポジティブ細胞が少ないことが示された。一方でコントロールであるＥｔＯＨ群の毛包は毛球部においてＥｄＵ陽性細胞が多くみられた。また、４−ＯＨＴによりＭｅｉｓ１を欠損させた頬髭毛包では毛球部の当該増殖抑制は毛球部の上部において著しかった。とくにＡｕｂｅｒ‘ｓ ｌｉｎｅの上方においてＥｄＵ陽性細胞が有意に減少していた（図５（ａ））。図５ａにおけるＥｄＵ陽性細胞の数を定量して作製したグラフが図５（ｂ）である。また当該箇所の毛母細胞が存在する領域の厚さについてもＭｅｉｓ１を欠損させた頬髭毛包においては有意に薄くなっていることが確認された（図５（ｃ））。以上をまとめると、Ｍｅｉｓ１を欠損させることにより、毛母細胞が存在する領域の増殖が抑制されるといえる。

【0045】

［実施例５］
中期成長期の毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１は核内に局在するため、転写因子として何等かの機能を果たしている可能性が考えられる。
そこで、本発明者らはＭｅｉｓ１が毛乳頭細胞において何等かの分泌因子の産生を制御して、毛母細胞の増殖を促進している可能性が高いと考えた。その可能性を検討するために、野生型マウス、またはＭｅｉｓ１を欠損したマウスの頬髭毛乳頭細胞の培養液を、Ｍｅｉｓ１を欠損した頬髭毛包に添加してそれぞれ培養したところ、野生型マウスの毛乳頭細胞の培養液（正常毛乳頭培養液）を添加した場合のみ、Ｍｅｉｓ１欠損頬髭毛包におけるＥｄＵ陽性細胞数が回復した（図６（ａ））。Ａｕｂｅｒ’ｓ ｌｉｎｅの上方または下方におけるＥｄＵ陽性細胞数の数を計測したグラフが図６（ｂ）である。特にＡｕｂｅｒ’ｓ ｌｉｎｅより上方において正常毛乳頭培養液の添加によるＥｄＵ陽性細胞数が有意に回復していることが示された。
Ａｕｂｅｒ’ｓ ｌｉｎｅにおける毛母もまた毛乳頭細胞培養液を添加することによって厚みを増したがＭｅｉｓ１欠損した毛乳頭細胞の培養液ではマトリックスの厚さに変化はなかった（図６ｃ）。これらのデータによって、毛乳頭細胞／毛母間の作用によって生じていることが示された。このことは、核内のＭｅｉｓ１の転写活性によって調節される毛乳頭細胞に由来する何等かの分泌因子が間接的にＡｕｂｅｒ’ｓ ｌｉｎｅより上方の毛母細胞の増殖を促進するという可能性を示唆する。

【0046】

（考察）
以上の知見から、毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１は細胞核に存在しているか、あるいは核外に存在しているかによって機能制御されることが推測できる。具体的には成長期の開始時に毛乳頭細胞においてＭｅｉｓ１が核内に移行し、それにともない毛乳頭細胞における転写因子としての核内でのＭｅｉｓ１が何等かの分泌タンパク質の転写に関わり、その分泌タンパク質が近位に存在する毛母細胞の増殖活性および毛成長を促進されることが示唆される。成長期、ならびに退行期および休止期の毛乳頭細胞におけるＭｅｉｓ１の動向および作用機序を示した模式図を図７に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】