特開 2021-65171 評価方法、スクリーニング方法および評価キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-65171(P2021-65171A)

(43)【公開日】2021年4月30日

(54)【発明の名称】評価方法、スクリーニング方法および評価キット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20210402BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20210402BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20210402BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20210402BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20210402BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20210402BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/02

   C12Q1/68

   G01N33/50 P

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   G01N33/68

   C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2019-193731(P2019-193731)

(22)【出願日】2019年10月24日

(71)【出願人】

【識別番号】390011442

【氏名又は名称】株式会社マンダム

(71)【出願人】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】河野 まおり

(72)【発明者】

【氏名】高石 雅之

(72)【発明者】

【氏名】池田 英史

(72)【発明者】

【氏名】富永 真琴

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CB01

2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB02

2G045FB03

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QQ79

4B063QS32

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】新たな指標に基づいた皮膚刺激性の評価方法を提供する。
【解決手段】ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、被験物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における特定の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、被験物質に曝露する曝露工程と、
前記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ

【請求項2】

ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、
前記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、皮膚刺激性物質のスクリーニング方法。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ

【請求項3】

ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、非皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、
前記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、非皮膚刺激性物質のスクリーニング方法。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ

【請求項4】

ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、低皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、
前記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、低皮膚刺激性物質のスクリーニング方法。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ

【請求項5】

ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、抗皮膚刺激性物質の候補物質および皮膚刺激性物質に曝露する曝露工程と、
前記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ

【請求項6】

以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子またはタンパク質に特異的に結合するプローブを備えている、被験物質の皮膚への刺激性を評価するための評価キット。
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、評価方法、スクリーニング方法および評価キットに関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚外用剤の皮膚刺激性を評価する方法として、一過性受容体電位チャネル（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｈａｎｎｅｌ；ＴＲＰチャネルとも称する）を用いる方法が知られている（特許文献１〜３）。ＴＲＰチャネルは、刺激受容体として機能するイオンチャネルである。

【0003】

従来のＴＲＰチャネルを用いた皮膚刺激性の評価方法では、ＴＰＲチャネルの活性化を、膜電位の変化（パッチクランプ法）または細胞内に流入するカルシウムイオンを指標（カルシウムイメージング法）として測定している。これらの評価方法によれば、ＴＲＰチャネル活性を有する細胞と被験物質とを接触させた後、膜電位の変化または細胞内に流入するカルシウムイオンを測定することにより、ＴＲＰチャネルの活性化を直接的に評価することができる。したがって、これらの評価方法は、パラベン、アルカリ、アルコールといった急性の刺激反応を起こす成分の評価に応用することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００８−０７９５２８号公報

【特許文献2】特開２００９−０８２０５３号公報

【特許文献3】特開２０１１−２０９１２３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

従来の評価方法は、急性の刺激反応、すなわち、ＴＲＰチャネルの活性化による一過的な反応を検出することに適している。しかしながら、皮膚外用剤による皮膚刺激は、塗布直後だけではなく、一定の時間を置いた後に感じることも多い。このようなタイムラグのある遅延性の刺激反応は、皮膚の神経終末で起こったＴＲＰチャネル（例えば、ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１）の活性化を介した反応が、細胞間のクロストーク等を通じて中枢神経等の感覚神経へ伝わり、痛みや刺激を感じる反応に起因している。したがって、従来の方法により、このような遅延性の刺激反応を検出することは困難である。

【0006】

本発明は、上述の問題に鑑みなされたものであって、新たな指標に基づいた、皮膚刺激性の評価方法、および、皮膚への刺激性を評価するための評価キットを提供することを目的とする。

【0007】

また、本発明は、皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる、新たな指標に基づいた皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

【0008】

さらに、本発明は、皮膚刺激性物質により引き起こされる刺激反応を抑制する抗皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる、新たな指標に基づいた抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題について鋭意検討し、膜電位またはカルシウムイオンとは異なる評価因子を探索した結果、特定の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定することにより、急性および遅延性の両刺激反応を検出し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0010】

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。

【0011】

〔１〕ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、被験物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ。

【0012】

〔２〕ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、皮膚刺激性物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ。

【0013】

〔３〕ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、非皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、非皮膚刺激性物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ。

【0014】

〔４〕ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、低皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、低皮膚刺激性物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ。

【0015】

〔５〕ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、抗皮膚刺激性物質の候補物質および皮膚刺激性物質に曝露する曝露工程と、前記細胞における、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する、抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ。

【0016】

〔６〕以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子またはタンパク質に特異的に結合するプローブを備えている、被験物質の皮膚への刺激性を評価するための評価キット：
（ａ）ＣＸＣケモカイン
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体
（ｃ）ＣＣケモカイン
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体
（ｅ）Ｃケモカイン受容体
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ
（ｌ）ＩＬ−６
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ
（ｎ）ＳＣＦ。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、新たな指標に基づいた、皮膚刺激性の評価方法、および、皮膚への刺激性を評価するための評価キットを提供することができる。

【0018】

また、本発明によれば、刺激反応を引き起こす皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる、新たな指標に基づいた皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供することができる。

【0019】

さらに、本発明によれば、皮膚刺激性物質により引き起こされる刺激反応を抑制する抗皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる、新たな指標に基づいた抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】外因性ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＣＣＬ２の定量結果を示すグラフである。

【図2】外因性ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＣＣＬ７の定量結果を示すグラフである。

【図3】外因性ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＣＸＣＬ８の定量結果を示すグラフである。

【図4】外因性ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＭ−ＣＳＦの定量結果を示すグラフである。

【図5】外因性ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＳＣＦの定量結果を示すグラフである。

【図6】外因性ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＩＬ−６の定量結果を示すグラフである。

【図7】外因性ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＭＩＦの定量結果を示すグラフである。

【図8】外因性ＴＲＰＡ１発現細胞をアリルチオイソシアネート（ＡＩＴＣ）に６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＣＸＣＬ８の定量結果を示すグラフである。

【図9】外因性ＴＲＰＡ１発現細胞をＡＩＴＣに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＣＣＬ７の定量結果を示すグラフである。

【図10】外因性ＴＲＰＡ１発現細胞をＡＩＴＣに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＩＬ−６の定量結果を示すグラフである。

【図11】外因性ＴＲＰＡ１発現細胞をＡＩＴＣに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＭＩＦの定量結果を示すグラフである。

【図12】外因性ＴＲＰＡ１発現細胞をＡＩＴＣに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＭ−ＣＳＦの定量結果を示すグラフである。

【図13】外因性ＴＲＰＡ１発現細胞をＡＩＴＣに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＳＣＦの定量結果を示すグラフである。

【図14】外因性ＴＲＰＡ１発現細胞をＡＩＴＣに６時間または２４時間曝露した後に、細胞外に放出されたＣＣＬ２の定量結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。本発明は、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態または実施例についても、本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ｘ〜Ｙ」は、「Ｘ以上Ｙ以下」を意図する。

【0022】

〔１．被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法〕
本発明に係る被験物質の評価方法は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、被験物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、特定の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する。本発明に係る被験物質の評価方法であれば、急性の刺激反応だけでなく、遅延性の刺激反応も評価することができる。

【0023】

〔１−１．曝露工程〕
曝露工程は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、被験物質に曝露する工程である。なお、曝露する時間は、限定されず、適宜設定され得る。

【0024】

（細胞）
本発明において用いられる細胞は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞である。当該細胞は、例えば、生体から採取された野生型の細胞、生体から採取された細胞を株化した細胞、または、これらの形質転換細胞であってもよい。

【0025】

本発明において用いられるＴＲＰＶ１活性を有する細胞は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現する細胞である。上記ＴＲＰＶ１の生理学的機能としては、例えば、カプサイシン、カンフル、プロトン等による化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）、痛み刺激、機械刺激等の刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオン等の陽イオンの透過等が挙げられる。

【0026】

上記ＴＲＰＶ１活性を有する細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞等が挙げられる。上記ＴＲＰＶ１活性を有する細胞のなかでは、かかるＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＶ１発現細胞」ともいう）が好ましい。

【0027】

上記内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞等が挙げられる。

【0028】

本発明において用いられるＴＲＰＡ１活性を有する細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。上記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、ＡＩＴＣ、シナモンアルデヒド、カルバクロール、アリシン、パラオキシ安息香酸エステル、メントール、ニコチン、フルフェナム酸等による化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激等の刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオン等の陽イオンの透過等が挙げられる。

【0029】

上記ＴＲＰＡ１活性を有する細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞等が挙げられる。上記ＴＲＰＡ１活性を有する細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。

【0030】

上記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞等が挙げられる。

【0031】

本発明において用いられるＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有する細胞は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能およびＴＲＰＡ１の生理学的機能の両方を発現する細胞である。

【0032】

上記ＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有する細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１および内因性ＴＲＰＡ１の両方を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＶ１をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入されたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞等が挙げられる。なお、宿主細胞が、元々、ＴＲＰＶ１の生理学的機能またはＴＲＰＡ１の生理学的機能の一方を発現する細胞である場合には、ＴＲＰＶ１をコードする核酸またはＴＲＰＡ１をコードする核酸の何れか一方が発現可能に宿主細胞に導入されたＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いることも可能である。

【0033】

上記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞においては、ＴＲＰＶ１をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸は、同一の発現プロモーターの制御下にあってもよいし、別々の発現プロモーターの制御下にあってもよい。被験物質によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象と、被験物質によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象とを、それぞれ区別して測定する観点から、ＴＲＰＶ１をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸は、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。

【0034】

上記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、染色体外要素として上記核酸が存在している細胞であってもよく、上記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。

【0035】

上記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、上記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。上記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。

【0036】

上記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。また、上記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよい。

【0037】

上記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、被験物質のヒトの皮膚への刺激性を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であることが好ましい。当該ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿０８０７０４．３としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている核酸が挙げられる。

【0038】

上記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸のスプライシングバリアントであってもよい。上記スプライシングバリアントとしては、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、ＮＭ＿０８０７０６．３等としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている核酸が挙げられる。

【0039】

上記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、当該核酸によりコードされるポリペプチドが上記生理学的機能を発現するものであればよく、上記アクセッション番号としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている核酸の変異型核酸であってもよいし、上記アクセッション番号としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている核酸のスプライシングバリアントであってもよい。

【0040】

上記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、被験物質のヒトの皮膚への刺激性を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であることが好ましい。当該ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている核酸が挙げられる。

【0041】

上記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸のスプライシングバリアントであってもよい。

【0042】

上記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、当該核酸によりコードされるポリペプチドが上記生理学的機能を発現するものであればよく、上記アクセッション番号としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている核酸の変異型核酸であってもよいし、上記アクセッション番号としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている核酸のスプライシングバリアントであってもよい。

【0043】

ＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、
（ｉ）アクセッション番号ＮＭ＿０８０７０４．３、ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、または、ＮＭ＿０８０７０６．３に示される塩基配列からなる核酸、
（ｉｉ）アクセッション番号ＮＭ＿０８０７０４．３、ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、または、ＮＭ＿０８０７０６．３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列同一性の値が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも上記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｉｉｉ）アクセッション番号ＮＭ＿０８０７０４．３、ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、または、ＮＭ＿０８０７０６．３に示される塩基配列からなる核酸と相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、上記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
等が挙げられる。

【0044】

また、ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、
（ｉｖ）アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２に示される塩基配列からなる核酸、
（ｖ）アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列同一性の値が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも上記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｖｉ）アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２に示される塩基配列からなる核酸と相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
等が挙げられる。

【0045】

なお、本明細書において、上記ストリンジェントな条件としては、例えば、所望の核酸と当該核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、次に、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件等が挙げられる。

【0046】

上記宿主細胞としては、上記ＴＲＰＶ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されない。上記宿主細胞としては、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、マウス細胞等が挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞等が挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞等が挙げられる。ハムスター細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等が挙げられる。上記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易であることから、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができることから、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。

【0047】

上記組換えベクターは、ＴＲＰＶ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。上記ベクターは、その調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。上記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、選択マーカー遺伝子を有するベクターであることが好ましい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、上記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞および外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。

【0048】

上記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法等の形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕等の記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＶ１発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１−ＴＲＰＡ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養すること等によって行なうことができる。

【0049】

得られた細胞が、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１００ｎＭ〜１０μＭカプサイシンと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、カプサイシンと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。また、得られた細胞が、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭ ＡＩＴＣと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、ＡＩＴＣと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。

【0050】

曝露工程において、被験物質に曝露する細胞は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する１種の細胞のみからなるものであっても、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する２種以上の細胞の組み合わせであってもよい。また、被験物質に曝露する細胞は、ＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有しない細胞を含んでいてもよい。

【0051】

本発明の一実施形態において、被験物質に曝露する細胞は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する１種の細胞のみからなる。細胞が、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する１種の細胞からなることにより、培養系を容易に構築することができ、また、単位細胞数あたりの遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を容易に測定することができる。

【0052】

本発明の一実施形態において、被験物質に曝露する細胞は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する２種以上の細胞の組み合わせである。細胞が、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する２種以上の細胞の組み合わせであることにより、異種の細胞間のクロストークを評価することが可能である。すなわち、異種の細胞間または組織間に起こると考えられる包括的な生体反応を評価することができる。たとえば、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞とＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有しない細胞との組み合わせを用いることにより、被験物質の皮膚への刺激性を、生体内の環境により近い条件下で、評価することができる。

【0053】

（被験物質）
本発明において用いられる被験物質としては、特に制限されず、化合物であってもよいし、組成物であってもよい。組成物としては、例えば、化粧品、医薬部外品、医薬品などの皮膚外用剤が挙げられる。また、化合物としては、上記皮膚外用剤に含まれる各成分が挙げられる。

【0054】

（曝露方法）
上記細胞を被験物質に曝露する方法は、特に限定されず、公知の方法であってよい。例えば、細胞を培養する培地に、被験物質を添加してインキュベーションする方法、または、当該細胞に被験物質を直接添加する方法等が挙げられる。

【0055】

培地に被験物質を添加してインキュベーションする方法は、用いられる細胞の種類に応じて適宜に選択することができ、かかる方法としては、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法等が挙げられる。

【0056】

上記培地としては、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質）、血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ等）、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を含む培地を用いることができる。上記培地は、市販されている培地であってもよい。ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞の培養に用いられる培地としては、かかる細胞に適した培地であればよく、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地等が挙げられる。例えば、用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地等が用いられ得る。

【0057】

また、インキュベーション温度、二酸化炭素濃度等の条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。

【0058】

本発明に係る評価方法において、用いられる細胞が、ＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞であって、ＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１の一過性発現を行なう細胞である場合には、被験物質により引き起こされるＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１を介する生理学的事象を十分に評価する観点から、好ましくは、ＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸を導入した後２４時間〜４８時間に、曝露工程を行うことが望ましい。

【0059】

被験物質に接触させる細胞の量は、試験データの信頼性の観点から、被験物質１００μＬあたり、それぞれ１×１０¹細胞以上が好ましく、１×１０²細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０^２細胞以下が好ましく、２×１０^２細胞以下がより好ましい。

【0060】

細胞に被験物質を直接添加する方法としては、特に限定されず、塗布、パッチ、滴下、噴霧等であってよい。細胞に接触させる被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。

【0061】

なお、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞は、当該細胞を上記生理学的事象を測定するのに適した状態に維持するために、当該細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。

【0062】

（曝露時間）
本発明に係る評価方法により、被験物質の遅延性の刺激反応を評価する場合、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を被験物質に曝露する曝露時間は、細胞内シグナル伝達に要する時間を考慮して、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは６時間以上であり、また、細胞毒性の影響を考慮して、好ましくは７２時間以内であり、より好ましくは２４時間以内である。

【0063】

本発明に係る評価方法により、被験物質の急性の刺激反応を評価する場合、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を被験物質に曝露する曝露時間は、一過的細胞内シグナル伝達に要する時間を考慮して、好ましくは１秒以上であり、より好ましくは１分以上であり、また、指標の遺伝子発現のタイミングを考慮して、好ましくは２４時間以内であり、より好ましくは１時間以内である。

【0064】

〔１−２．培養工程〕
本発明に係る評価方法は、必要に応じて、上記曝露工程の後に、被験物質に曝露された細胞を、被験物質を含まない培地中で所定時間培養する培養工程をさらに含んでもよい。

【0065】

曝露工程において細胞を被験物質に曝露することにより、指標となる遺伝子発現および／またはタンパク質産生に変化が生じ、当該変化が測定可能なレベルに到達するまでには、一定の時間がかかる場合がある。この場合は、曝露工程の後に、培養工程を行うことが好ましい。

【0066】

細胞を培養する培養方法は、特に限定されず、用いられる細胞の種類に応じて適宜に選択することができ、かかる方法としては、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法等が挙げられる。

【0067】

上記培地としては、上記曝露工程について上述したものと同様の培地を用いることができる。また、インキュベーション温度、二酸化炭素濃度等の条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、外因性ＴＲＰ発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。

【0068】

培養時間は、用いられる細胞および測定する指標に応じて適宜設定されるが、例えば、転写開始に要する時間を考慮して、１時間以上であり、より好ましくは６時間以上であり、また、細胞毒性の影響を考慮して、好ましくは７２時間以内であり、より好ましくは２４時間以内である。

【0069】

〔１−３．測定工程〕
測定工程は、上記曝露工程において被験物質に曝露されたＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における、特定の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する工程である。

【0070】

（指標）
本発明において用いられる指標は、以下の（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種であり、測定工程では、当該指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が測定される。

【0071】

（ａ）ＣＸＣケモカイン（αケモカイン）
（ｂ）ＣＸＣケモカイン受容体（αケモカイン受容体）
（ｃ）ＣＣケモカイン（βケモカイン）
（ｄ）ＣＣケモカイン受容体（βケモカイン受容体）
（ｅ）Ｃケモカイン受容体（γケモカイン受容体）
（ｆ）ＣＸ３Ｃケモカイン（δケモカイン）
（ｇ）ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（δケモカイン受容体）
（ｈ）非定型ケモカイン受容体
（ｉ）ＥＧＲ（Early growth response）
（ｊ）ＦＯＳ
（ｋ）ＭＩＦ（Macrophage migration inhibitory factor）
（ｌ）ＩＬ−６（Interleukin-6）
（ｍ）Ｍ−ＣＳＦ（Macrophage colony stimulating factor）
（ｎ）ＳＣＦ（skip1-cul1-F-box-protein）
ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣケモカインファミリーを意図しており、αケモカイン（またはそのファミリー）とも称する。ＣＸＣケモカインとしては、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７等が挙げられ、好ましくは、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、およびＣＸＣＬ８である。

【0072】

ＣＸＣケモカイン受容体は、ＣＸＣケモカイン受容体ファミリーを意図しており、例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ６等が挙げられ、好ましくは、ＣＸＣＲ２、およびＣＸＣＲ４である。

【0073】

ＣＣケモカインは、ＣＣケモカインファミリーを意図しており、βケモカイン（またはそのファミリー）とも称する。ＣＣケモカインとしては、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４Ｌ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８等が挙げられ、好ましくは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４Ｌ２、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、およびＣＣＬ２２であり、より好ましくは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、およびＣＣＬ８である。

【0074】

ＣＣケモカイン受容体は、ＣＣケモカイン受容体ファミリーを意図しており、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲＬ２、ＮＣＣＲＰ１等が挙げられ、好ましくは、ＣＣＲ６である。

【0075】

Ｃケモカインは、γケモカインとも称する。Ｃケモカイン受容体としては、ＸＣＲ１等が挙げられる。

【0076】

ＣＸ３Ｃケモカインは、δケモカインとも称する。ＣＸ３Ｃケモカインとしては、ＣＸ３ＣＬ１等があげられる。ＣＸ３Ｃケモカイン受容体としては、ＣＸ３ＣＲ１等が挙げられる。

【0077】

非定型ケモカイン受容体としては、Ａｔｙｐｉｃａｌ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅファミリー受容体が挙げられ、例えば、ＡＣＫＲ１、ＡＣＫＲ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＫＲ４等が挙げられ、好ましくは、ＡＣＫＲ１およびＡＣＫＲ３である。

【0078】

ＥＧＲとしては、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４等が挙げられ、好ましくは、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、およびＥＧＲ３である。

【0079】

ＦＯＳとしては、ＦＯＳＢ、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＳＬ２等が挙げられ、好ましくは、ＦＯＳＢ、ＦＯＳ、およびＦＯＳＬ１である。

【0080】

上記指標となるタンパク質および遺伝子のアクセッション番号を、以下の表１〜表６に示す。

【0081】

【表1】

【0082】

【表2】

【0083】

【表3】

【0084】

【表4】

【0085】

【表5】

【0086】

【表6】

【0087】

本発明に係る評価方法により、被験物質の遅延性の刺激反応を評価する場合、上記指標としては、ＣＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＣケモカイン、ＣＣケモカイン受容体、Ｃケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、非定型ケモカイン受容体、ＭＩＦ、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦを好適に用いることができる。

【0088】

上記指標のうち、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＭＩＦ、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦのタンパク質は、細胞外に分泌され、測定が容易である等の利点を有するため、特に好ましい。

【0089】

本発明に係る評価方法により、急性の刺激反応を評価する場合、上記指標としては、ＥＧＲ、およびＦＯＳ、並びにそれらをコードする遺伝子を好適に用いることができる。

【0090】

上記指標のうち、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２、ＣＣＲ６、ＡＣＫＲ１、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＦＯＳＢ、ＦＯＳ、およびＦＯＳＬ１は、ＴＲＰＶ１活性を有する細胞を用いる評価方法において、指標として好ましく用いることができる。これらのうち、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１８、ＣＣＲ６、ＡＣＫＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、およびＦＯＳは、ＴＲＰＶ１活性を有する細胞に特異的な指標である。

【0091】

上記指標のうち、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ４Ｌ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２２、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＡＣＫＲ３、ＭＩＦ、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＧＲ１、ＦＯＳＢ、およびＦＯＳＬ１は、ＴＲＰＡ１活性を有する細胞を用いる評価方法において、指標として好ましく用いることができる。これらのうち、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ４Ｌ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１９、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＡＣＫＲ３およびＭＩＦは、ＴＲＰＡ１活性を有する細胞に特異的な指標である。

【0092】

上記指標のうち、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２２、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＧＲ１、ＦＯＳＢおよびＦＯＳＬ１は、ＴＲＰＶ１活性を有する細胞およびＴＲＰＡ１活性を有する細胞のいずれにおいても、好適に用いることができる。

【0093】

（測定方法）
指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する方法は、特に限定されず、指標となるタンパク質の産生、または、遺伝子の発現を測定する公知の方法であってよい。遺伝子の発現量の測定は、例えば、ｍＲＮＡの発現を測定する方法を挙げることができる。

【0094】

ｍＲＮＡの発現を測定する方法としては、例えば、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、ノーザンブロット解析法、ドットブロット法、ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析、マイクロアレイ、ＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）等により測定する方法が挙げられる。

【0095】

タンパク質の発現を測定する方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、バイオアッセイ法等が挙げられる。

【0096】

上述した測定方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うこともでき、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともできる。また、複数の遺伝子・タンパク質等の発現量を測定する場合、それらの発現量は、例えば、それぞれ別個に測定してもよく、まとめて同時に測定してもよい。

【0097】

〔１−４．評価工程〕
本発明に係る評価方法は、上記測定工程において測定された遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量に基づき、被験物質の皮膚への刺激性を評価する評価工程をさらに含んでもよい。

【0098】

評価工程において、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を、対照における発現量および／または産生量と比較することで当該被験物質の皮膚への刺激性を評価することができる。

【0099】

対照としては、被験物質に曝露前のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ａ）、既知の非皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ｂ）、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有しない対照細胞（対照Ｃ）、既知の皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ｄ）、既知の皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有しない細胞（対照Ｅ）等を用いることができる。

【0100】

既知の非皮膚刺激性物質とは、皮膚への刺激性を有しないことが既に知られている物質である。また、既知の皮膚刺激性物質とは、皮膚への刺激性を有することが既に知られている物質である。既知の皮膚刺激性物質としては、ＴＲＰＶ１および／またはＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストを使用することができる。ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストとしては、例えば、カプサイシン、カンフル等が挙げられる。また、ＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストとしては、例えば、ＡＩＴＣ、マスタード、シナモンアルデヒド、カルバクロール、アリシン、パラオキシ安息香酸エステル、メントール、ニコチン、フルフェナム酸等が挙げられる。

【0101】

刺激性の評価としては、例えば、対照Ａ、対照Ｂまたは対照Ｃを対照とする場合であって、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ａ〜Ｃ）における発現量または産生量と比べて同等、または少ない場合、被験物質が皮膚への刺激性を有しない、または刺激性を有するが少ないと評価することができる。一方、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ａ〜Ｃ）における発現量または産生量と比べて多い場合、被験物質が皮膚への刺激性を有すると評価することができる。

【0102】

また、例えば、対照Ｄまたは対照Ｅを対照とする場合であって、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ｄ〜Ｅ）における発現量または産生量と比べて同等、または多い場合、被験物質が皮膚への刺激性を有すると評価することができる。一方、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ｄ〜Ｅ）における発現量または産生量と比べて少ない場合、被験物質が皮膚への刺激性を有しない、または有するが低いと評価することができる。

【0103】

なお、本願明細書において、発現量または産生量が少ないとは、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が、対照における発現量または産生量と比較して、１．０倍未満であり、好ましくは１／２以下であり、より好ましくは１／５以下であり、最も好ましくは１／１０以下であることを指す。

【0104】

また、本願明細書において、発現量または産生量が多いとは、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が、対照における発現量または産生量と比較して、１．０倍超であり、好ましくは１．１倍以上であり、より好ましくは１．３倍以上であり、より好ましくは１．５倍以上であり、より好ましくは２．０倍以上であり、より好ましくは５．０倍以上であり、最も好ましくは１０倍以上であることを指す。

【0105】

〔２．皮膚刺激性物質のスクリーニング方法〕
本発明はまた、皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供する。本発明に係る皮膚刺激性物質のスクリーニング方法は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、上述した（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する。本発明に係る皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、急性および／または遅延性の刺激反応を引き起こす皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる。

【0106】

なお、本明細書において「皮膚刺激性物質」とは、皮膚において、急性および／または遅延性の刺激反応を引き起こす物質を意図する。

【0107】

当該スクリーニング方法において用いられる細胞、曝露方法、曝露時間、指標、および測定方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において用いられるものと同様である。

【0108】

また、皮膚刺激性物質の候補物質としては、特に限定されず、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において挙げられる被験物質と同様のものを使用することができる。

【0109】

当該スクリーニング方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法と同様に、必要に応じて、曝露工程の後に、皮膚刺激性物質の候補物質に曝露された細胞を、候補物質を含まない培地中で細胞を培養する培養工程をさらに含んでもよい。

【0110】

また、当該スクリーニング方法は、測定工程において測定された遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量に基づき、皮膚刺激性物質をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに含んでもよい。

【0111】

スクリーニング工程において、候補物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を、対照における発現量または産生量と比較し、対照に比べて上記発現量または産生量が多い場合に、当該候補物質を、皮膚刺激性物質としてスクリーニングすることができる。

【0112】

対照としては、被験物質に曝露前のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ａ）、既知の非皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ｂ）、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有しない対照細胞（対照Ｃ）等を用いることができる。ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を介した刺激性を評価するという観点から、対照Ｃを用いることが好ましく、対照Ａまたは対照Ｂに加えて対照Ｃを用いることがより好ましい。

【0113】

〔３．非皮膚刺激性物質のスクリーニング方法〕
本発明はまた、非皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供する。本発明に係る非皮膚刺激性物質のスクリーニング方法は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、非皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、上述した（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する。本発明に係る非皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、急性および／または遅延性の刺激反応を引き起こさない非皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる。

【0114】

なお、本明細書において「非皮膚刺激性物質」とは、皮膚において、急性および／または遅延性の刺激反応を引き起こさない物質を意図する。

【0115】

当該スクリーニング方法において用いられる細胞、曝露方法、曝露時間、指標、および測定方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において用いられるものと同様である。

【0116】

また、非皮膚刺激性物質の候補物質としては、特に限定されず、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において挙げられる被験物質と同様のものを使用することができる。

【0117】

当該スクリーニング方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法と同様に、必要に応じて、曝露工程の後に、非皮膚刺激性物質の候補物質に曝露された細胞を、候補物質を含まない培地中で細胞を培養する培養工程をさらに含んでもよい。

【0118】

また、当該スクリーニング方法は、測定工程において測定された遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量に基づき、非皮膚刺激性物質をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに含んでもよい。

【0119】

スクリーニング工程において、候補物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を、対照における発現量または産生量と比較し、対照に比べて上記発現量または産生量が同等または低い場合に、当該候補物質を、非皮膚刺激性物質としてスクリーニングすることができる。

【0120】

対照としては、被験物質に曝露前のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ａ）、既知の非皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ｂ）、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有しない対照細胞（対照Ｃ）等を用いることができる。ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を介した刺激性を評価するという観点から、対照Ｃを用いることが好ましく、対照Ａまたは対照Ｂに加えて対照Ｃを用いることがより好ましい。

【0121】

〔４．低皮膚刺激性物質のスクリーニング方法〕
本発明はまた、低皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供する。本発明に係る低皮膚刺激性物質のスクリーニング方法は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、低皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露工程と、上記細胞における、上述した（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する。本発明に係る低皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、急性および／または遅延性の刺激反応が対照に比べて低い低皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる。

【0122】

なお、本明細書において「低皮膚刺激性物質」とは、皮膚において、急性および／または遅延性の刺激反応が対照に比べて低い物質を意図する。

【0123】

当該スクリーニング方法において用いられる細胞、曝露方法、曝露時間、指標、および測定方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において用いられるものと同様である。

【0124】

また、低皮膚刺激性物質の候補物質としては、特に限定されず、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において挙げられる被験物質と同様のものを使用することができる。

【0125】

当該スクリーニング方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法と同様に、必要に応じて、曝露工程の後に、低皮膚刺激性物質の候補物質に曝露された細胞を、候補物質を含まない培地中で細胞を培養する培養工程をさらに含んでもよい。

【0126】

また、当該スクリーニング方法は、測定工程において測定された遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量に基づき、低皮膚刺激性物質をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに含んでもよい。

【0127】

スクリーニング工程において、候補物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を、対照における発現量または産生量と比較することで、当該候補物質を、低皮膚刺激性物質としてスクリーニングすることができる。

【0128】

対照としては、被験物質に曝露前のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ａ）、既知の非皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ｂ）、被験物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性を有しない対照細胞（対照Ｃ）、既知の皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞（対照Ｄ）、既知の皮膚刺激性物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有しない細胞（対照Ｅ）等を用いることができる。ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を介した刺激性を評価するという観点から、対照Ｃおよび対照Ｅを用いることが好ましく、対照Ａ、対照Ｂまたは対象Ｄに加えて対照Ｃおよび対照Ｅを用いることがより好ましい。

【0129】

例えば、対照Ａ、対照Ｂまたは対照Ｃを対照とする場合であって、候補物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ａ〜Ｃ）における発現量または産生量と比べて同等、または少ない場合、候補物質を、低皮膚刺激性物質としてスクリーニングすることができる。

【0130】

また、例えば、対照Ｄまたは対照Ｅを対照とする場合であって、候補物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における遺伝子発現量またはタンパク質産生量が、これらの対照（対照Ｄ〜Ｅ）における発現量または産生量と比べて少ない場合、候補物質を、低皮膚刺激性物質としてスクリーニングすることができる。

【0131】

〔５．抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法〕
本発明はまた、抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法を提供する。本発明に係る抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、抗皮膚刺激性物質の候補物質および皮膚刺激性物質に曝露する曝露工程と、前記細胞における、上述した（ａ）〜（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を測定する測定工程と、を有する。本発明に係る抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、皮膚刺激性物質により引き起こされる急性および／または遅延性の刺激反応を抑制する抗皮膚刺激性物質をスクリーニングすることができる。

【0132】

なお、本明細書において「抗皮膚刺激性物質」とは、皮膚刺激性物質により引き起こされる、皮膚における急性および／または遅延性の刺激反応を抑制する物質を意図する。

【0133】

上記曝露工程は、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を、（ｉ）抗皮膚刺激性物質の候補物質に曝露した後で、既知の皮膚刺激性物質に曝露することによって、（ｉｉ）既知の皮膚刺激性物質に曝露した後で、抗皮膚刺激性物質の候補物質に曝露することによって、または、（ｉｉｉ）抗皮膚刺激性物質の候補物質および既知の皮膚刺激性物質に同時に曝露することによって、行うことができる。

【0134】

抗皮膚刺激性物質の候補物質としては、特に限定されず、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において挙げられる被験物質と同様のものを使用することができる。

【0135】

細胞に対する抗皮膚刺激性物質の候補物質の添加量は、指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が測定可能な程度に変化する範囲であれば特に限定されるものではない。また、細胞に対する既知の皮膚刺激性物質の添加量は、指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が測定可能な程度に変化する範囲であれば特に限定されるものではない。

【0136】

皮膚刺激性物質の遅延性の刺激反応を抑制する抗皮膚刺激性物質をスクリーニングする場合、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を既知の皮膚刺激性物質に曝露する曝露時間は、細胞内シグナル伝達に要する時間を考慮して、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは６時間以上であり、また、細胞毒性の影響を考慮して、好ましくは７２時間以内であり、より好ましくは２４時間以内である。

【0137】

皮膚刺激性物質の急性の刺激反応を抑制する抗皮膚刺激性物質をスクリーニングする場合、ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を既知の皮膚刺激性物質に曝露する曝露時間は、一過性シグナル伝達に要する時間を考慮して、好ましくは１秒以上であり、より好ましくは５分以上であり、また、指標の遺伝子発現のタイミングを考慮して、好ましくは２４時間以内であり、より好ましくは１時間以内である。

【0138】

ＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を抗皮膚刺激性物質の候補物質に曝露する曝露時間は、指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量が測定可能な程度に変化する範囲であれば特に限定されるものではない。

【0139】

当該スクリーニング方法において用いられる細胞、曝露方法のその他の構成、曝露時間、指標、および測定方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法において用いられるものと同様である。

【0140】

当該スクリーニング方法は、上述の被験物質の皮膚への刺激性を評価する方法と同様に、必要に応じて、曝露工程の後に、抗皮膚刺激性物質の候補物質および皮膚刺激性物質に曝露された細胞を、当該候補物質および皮膚刺激性物質を含まない培地中で培養する培養工程をさらに含んでもよい。

【0141】

また、当該スクリーニング方法は、測定工程において測定された遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量に基づき、抗皮膚刺激性物質をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに含んでもよい。

【0142】

スクリーニング工程において、候補物質に曝露後のＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における指標の遺伝子発現量および／またはタンパク質産生量を、対照における発現量または産生量と比較し、対照に比べて上記発現量または産生量が少ない場合に、当該候補物質を、抗皮膚刺激性物質としてスクリーニングすることができる。

【0143】

対照としては、既知の皮膚刺激性物質のみに曝露したＴＲＰＶ１活性および／またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞を用いることができる。

【0144】

〔６．被験物質の皮膚への刺激性を評価するための評価キット〕
本発明の一実施形態は、上記指標のｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するプローブを備えている、被験物質の皮膚への刺激性を評価するための評価キット（例えば、マイクロアレイ用キット、ＰＣＲ用キット）を提供する。本発明に係る被験物質の皮膚への刺激性を評価するための評価キットによれば、急性の刺激反応だけでなく、遅延性の刺激反応も評価することができる。また、本評価キットは、上述した皮膚刺激性物質、非皮膚刺激性物質、低皮膚刺激性物質または抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法に使用し得る。

【0145】

ｍＲＮＡに特異的に結合するプローブとしては、当該ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド等が挙げられる。また、タンパク質に特異的に結合するプローブとしては、当該タンパク質に特異的に結合する抗体等が挙げられる。

【0146】

上記プローブは、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため、本評価キットは、上記プローブを固定化した、マイクロアレイチップ、ＤＮＡチップ、タンパク質チップ等として提供するものであってもよい。上記固相としては、プローブを固定化できるものであれば特に制限されないが、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー等の基板を挙げることができる。

【0147】

本発明に係る評価キットは、更に、プローブに捕捉されたｍＲＮＡまたはタンパク質を定量するために、当該ｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合する第２のプローブであって、標識化されている第２のプローブを備えていてもよい。第２のプローブとしては、ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする標識化されたポリヌクレオチド、タンパク質に特異的に結合する標識化された抗体を挙げることができる。なお、標識化する方法としては、特に限定されず、例えば、蛍光色素などを用いて標識化することができる。

【0148】

本発明に係る評価方法および評価キットによれば、急性の刺激反応を起こす被験物質、および、遅延性の刺激反応を起こす被験物質を評価することができる。

【0149】

また、本発明に係る皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、例えば、急性および／または遅延性の刺激反応により炎症を引き起こすような物質をスクリーニングすることができる。

【0150】

また、本発明に係る非皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、例えば、急性および／または遅延性の刺激反応を引き起こさない物質をスクリーニングすることができる。

【0151】

また、本発明に係る低皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、例えば、急性および／または遅延性の刺激反応が対照に比べて低い物質をスクリーニングすることができる。

【0152】

また、本発明に係る抗皮膚刺激性物質のスクリーニング方法によれば、例えば、急性および／または遅延性の刺激反応により炎症を抑えるような物質をスクリーニングすることができる。

【0153】

以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

【実施例】

【0154】

（製造例１）
ヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＶ１発現ベクター５μｇを滅菌水１０μＬに懸濁し、混合物Ｉを得た。

【0155】

また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径１００ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、ＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養し、エレクトロポレーションによる遺伝子導入試薬〔Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、商品名：Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １００μＬキット、カタログ番号：ＭＰＫ１００２５〕中に付属のＲ ｂｕｆｆｅｒ１００μＬに懸濁し、細胞懸濁液Ｉを得た。

【0156】

混合物Ｉと細胞懸濁液Ｉとを混合し、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ〔Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、カタログ番号：ＭＰＫ５０００〕を用いて、Ｐｌｕｓ Ｖｏｌｔａｇｅ １１００Ｖ、Ｐｌｕｓ Ｗｉｄｔｈ２０ｍｓ、Ｐｌｕｓ Ｎｕｍｂｅｒ２で遺伝子導入を実施した。遺伝子導入を実施した翌日に、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８硫酸塩を添加した１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に変換し、２日ごとに培地交換を続け、５体積％二酸化炭素の雰囲気中で３週間培養を続けることによって、ＨＥＫ２９３細胞に上記ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターが導入された外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を得た。

【0157】

（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡの代わりに、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を用いた以外は、製造例１と同様にして外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。

【0158】

（製造例３）
製造例１において、ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターの代わりに、ヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡを含まない空の哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕を用いた以外は、製造例１と同様にしてＭＯＣＫ細胞（ＨＥＫ２９３＿ＭＯＣＫ）を得た。

【0159】

〔１：プロテオーム解析による、ＴＲＰＶ１活性を有する細胞における細胞内変動タンパク質の探索および定量〕
製造例１で得られた外因性ＴＲＰＶ１発現細胞（ＨＥＫ２９３＿ＴＰＲＶ１）を、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０^５細胞の外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。

【0160】

次いで、上記１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシンを、以下の表７に示される濃度となるように添加し、試料１〜５を得た。

【0161】

上記で得られた試料１〜３については、カプサイシンを培地に添加してから１０分後に、カプサイシン非含有の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で洗浄後、当該カプサイシン非含有の培地において培養を６時間続けた。次いで、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を回収し、プロテオーム解析を行った。

【0162】

上記で得られた試料４および５については、カプサイシンを培地に添加してから６時間後に、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を回収し、プロテオーム解析を行った。

【0163】

対照（ＮＴ）として、カプサイシン非含有の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６時間培養した外因性ＴＲＰＶ１発現細胞（比較試料１）を使用した。

【0164】

プロテオーム解析において、ペプチドの質量分析は、質量分析装置（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ−Ｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。

【0165】

プロテオーム解析の結果、対照における発現量に比較して発現量が有意に多いタンパク質として、ＥＧＲ１およびＦＯＳＢを見出した。

【0166】

試料１〜５について測定されたＥＧＲ１およびＦＯＳＢのタンパク質の発現量の、対照における発現量に対する比を、以下の表８に示す。

【0167】

【表7】

【0168】

【表8】

【0169】

表８に示されるとおり、試料１〜５において、ＥＧＲ１のタンパク質の発現量の有意な増加が認められた。また、試料１〜４において、ＦＯＳＢのタンパク質の発現量の有意な増加が認められた。

【0170】

〔２：ＴＲＰＶ１活性を有する細胞における細胞外放出タンパク質の定量〕
上記〔１〕と同様にして、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞（ＨＥＫ２９３＿ＴＰＲＶ１）を培養し、培地にカプサイシンを以下の表９に示される濃度となるように添加し、試料６〜９を得た。

【0171】

上記で得られた試料６〜８については、カプサイシンを培地に添加してから６時間後に、培地上清を回収し、当該培地上清における種々のサイトカインの量をＢｉｏ−Ｐｌｅｘヒトサイトカインアッセイキットを用いて測定した。また、試料９については、カプサイシンを培地に添加してから２４時間後に、培地上清を回収し、同様に種々のサイトカインの量を測定した。

【0172】

対照として、ＭＯＣＫ細胞（ＨＥＫ２９３＿ＭＯＣＫ）（比較試料２〜７）、および、カプサイシン非含有の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６時間または２４時間培養した外因性ＴＲＰＶ１発現細胞（比較試料８、９）を使用した。

【0173】

【表9】

【0174】

測定の結果、対照における発現量に比較して発現量が有意に多いタンパク質として、ＣＣケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ７）、ＣＸＣケモカイン（ＣＸＣＬ８）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＩＬ−６を見出した。各タンパク質の定量結果を、図１〜６に示す。また、ＭＩＦの定量結果を図７に示す。

【0175】

図１〜６に示されるとおり、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦのタンパク質の発現量の有意な増加が認められた。一方、ＭＩＦについては、対照における発現量と比較して、有意な増加は認められなかった。

【0176】

〔３：プロテオーム解析による、ＴＲＰＡ１活性を有する細胞における細胞内変動タンパク質の探索および定量〕
製造例１で得られた外因性ＴＲＰＶ１発現細胞の代わりに、製造例２で得られた外因性ＴＲＰＡ１発現細胞（ＨＥＫ２９３＿ＴＰＲＡ１）を用いた以外は、上記〔１〕と同様にして、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を培養した。

【0177】

次いで、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に、ＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるＡＩＴＣを、以下の表１０に示される濃度となるように添加し、試料１０〜１２を得た。

【0178】

上記で得られた試料１０については、ＡＩＴＣを培地に添加してから１０分後に、ＡＩＴＣ非含有の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で洗浄後、当該ＡＩＴＣ非含有の培地において培養を６時間続けた後、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を回収し、プロテオーム解析を行った。

【0179】

上記で得られた試料１１および１２については、ＡＩＴＣを培地に添加してから６時間後に、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を回収し、プロテオーム解析を行った。

【0180】

対照（ＮＴ）として、ＡＩＴＣ非含有の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６時間培養した外因性ＴＲＰＡ１発現細胞（比較試料１０）を使用した。

【0181】

プロテオーム解析は、上記〔１〕と同様にして行った。

【0182】

プロテオーム解析の結果、対照における発現量に比較して発現量が有意に多いタンパク質として、ＥＧＲ１およびＦＯＳＢを見出した。

【0183】

試料１０〜１２について測定されたＥＧＲ１およびＦＯＳＢのタンパク質の発現量の、対照における発現量に対する比を、以下の表１１に示す。

【0184】

【表10】

【0185】

【表11】

【0186】

表１１に示されるとおり、試料１０〜１２において、ＥＧＲ１およびＦＯＳＢのタンパク質の発現量の有意な増加が認められた。

【0187】

〔４：ＴＲＰＡ１活性を有する細胞における細胞外放出タンパク質の定量〕
上記〔２〕と同様にして、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞（ＨＥＫ２９３＿ＴＰＲＡ１）を培養し、培地にＡＩＴＣを以下の表１２に示される濃度となるように添加し、試料１３〜１６を得た。

【0188】

上記で得られた試料１３〜１５については、ＡＩＴＣを培地に添加してから６時間後に、培地上清を回収し、当該培地上清における種々のサイトカインの量をＢｉｏ−Ｐｌｅｘヒトサイトカインアッセイキットを用いて測定した。また、試料１６については、ＡＩＴＣを培地に添加してから２４時間後に、培地上清を回収し、同様に種々のサイトカインの量を測定した。

【0189】

対照として、ＭＯＣＫ細胞（ＨＥＫ２９３＿ＭＯＣＫ）（比較試料１１〜１６）、および、ＡＩＴＣ非含有の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６時間または２４時間培養した外因性ＴＲＰＡ１発現細胞（比較試料１７、１８）を使用した。

【0190】

【表12】

【0191】

測定の結果、対照における発現量に比較して発現量が有意に多いタンパク質として、ＣＸＣケモカイン（ＣＸＣＬ８）、ＣＣケモカイン（ＣＣＬ７）、ＩＬ−６、ＭＩＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦを見出した。各タンパク質の定量結果を、図８〜１３に示す。また、ＣＣＬ２の定量結果を図１４に示す。

【0192】

図８〜１３に示されるとおり、ＣＸＣケモカイン、ＣＣケモカイン、ＩＬ−６、ＭＩＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦのタンパク質の発現量の有意な増加が認められた。

【0193】

〔５：ＴＲＰＶ１活性またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における遅延性の刺激反応によるｍＲＮＡ発現量の変動解析〕
上記〔１〕と同様にして、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を培養し、培地にカプサイシンを１０ｎＭとなるように添加し、試料１７を得た。また、同様にして外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を培養し、培地にカプサイシン非含有培地を添加し、比較試料１９を得た。

【0194】

上記で得られた試料１７については、カプサイシンを培地に添加してから６時間後に、比較試料１９については、カプサイシン非含有培地を添加してから６時間後に、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を回収し、カプサイシンへの曝露による、ｍＲＮＡ発現量の変動を、Ｃｌａｒｉｏｍ^ＴＭＳアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて解析した。

【0195】

同様に、上記〔３〕と同様にして、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を培養し、培地にＡＩＴＣを１０μＭとなるように添加し、試料１８を得た。また、同様にして外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を培養し、培地にＡＩＴＣ非含有培地を添加し、比較試料２０を得た。

【0196】

上記で得られた試料１８については、ＡＩＴＣを培地に添加してから６時間後に、比較試料２０については、ＡＩＴＣ非含有培地を添加してから６時間後に、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を回収し、ＡＩＴＣへの曝露による、ｍＲＮＡ発現量の変動を、Ｃｌａｒｉｏｍ^ＴＭＳアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて解析した。

【0197】

対照として、ＭＯＣＫ細胞（ＨＥＫ２９３＿ＭＯＣＫ）を培養し、培地にカプサイシンを１０ｎＭとなるように添加し、比較試料２１を得た。また、同様にしてＭＯＣＫ細胞を培養し、培地にカプサイシン非含有培地を添加し、比較試料２２を得た。同様に、上記ＭＯＣＫ細胞を培養し、培地にＡＩＴＣを１０μＭとなるように添加し、比較試料２３を得た。また、同様にしてＭＯＣＫ細胞を培養し、培地にＡＩＴＣ非含有培地を添加し、比較試料２４を得た。

【0198】

上記試料１７および１８、並びに比較試料１９〜２４について、使用した細胞株、カプサイシンまたはＡＩＴＣの添加の有無および添加濃度、曝露時間、並びに細胞生存率を、以下の表１３および表１４にまとめる。

【0199】

【表13】

【0200】

【表14】

【0201】

ＣＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＣケモカイン、ＣＣケモカイン受容体、Ｃケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体および非定型ケモカイン受容体についての解析結果を、以下の表１５に示す。表中のｍＲＮＡ値は、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６時間培養した外因性ＴＲＰＶ１発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞またはＭＯＣＫ細胞（ＮＴ）におけるｍＲＮＡ発現量に対する比として表示した。

【0202】

【表15】

【0203】

表１５に示されるとおり、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞および／または外因性ＴＲＰＡ１発現細胞において、カプサイシンまたはＡＩＴＣによる遅延性の刺激反応により、ＣＸＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＣケモカイン、ＣＣケモカイン受容体、Ｃケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体および非定型ケモカイン受容体のｍＲＮＡの発現量の顕著な増加が認められた。

【0204】

〔６：ＴＲＰＶ１活性またはＴＲＰＡ１活性を有する細胞における急性の刺激反応によるｍＲＮＡ発現量の変動解析〕
上記〔５〕と同様にして、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞および外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を培養し、培地にカプサイシンまたはＡＩＴＣを添加した。

【0205】

カプサイシンまたはＡＩＴＣを培地に添加してから１０分後に、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で洗浄後、当該培地において６時間続けた後、細胞を回収し、上記〔５〕と同様にして、カプサイシンまたはＡＩＴＣへの曝露によるｍＲＮＡ発現量の変動を解析した。

【0206】

対照として、ＭＯＣＫ細胞（ＨＥＫ２９３＿ＭＯＣＫ）を使用した。

【0207】

ＥＧＲおよびＦＯＳについての解析結果を、以下の表１６に示す。表中のｍＲＮＡ値は、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６時間培養した外因性ＴＲＰＶ１発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞またはＭＯＣＫ細胞（ＮＴ）におけるｍＲＮＡ発現量に対する比として表示した。

【0208】

【表16】

【0209】

表１６に示されるとおり、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞および／または外因性ＴＲＰＡ１発現細胞において、カプサイシンまたはＡＩＴＣによる急性の刺激反応により、ＥＧＲおよびＦＯＳのｍＲＮＡの発現量の顕著な増加が認められた。

【産業上の利用可能性】

【0210】

本発明の評価方法および評価キットによれば、急性の刺激反応を起こす被験物質、および、遅延性の刺激反応を起こす被験物質を評価することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】