特開 2021-93938 クローディン欠損上皮細胞株の製造方法、クローディン欠損上皮細胞株、クローディン欠損上皮細胞株を含むタイトジャンクション機能制御剤のスクリーニング方法、及びクローディン欠損上皮細胞株を含むタイトジャンクション機能制御剤のスクリーニングキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-93938(P2021-93938A)

(43)【公開日】2021年6月24日

(54)【発明の名称】クローディン欠損上皮細胞株の製造方法、クローディン欠損上皮細胞株、クローディン欠損上皮細胞株を含むタイトジャンクション機能制御剤のスクリーニング方法、及びクローディン欠損上皮細胞株を含むタイトジャンクション機能制御剤のスクリーニングキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20210528BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20210528BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20210528BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20210528BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20210528BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210528BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20210528BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12Q1/02

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   C12N5/071

   C12N15/09 100

   C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2019-226655(P2019-226655)

(22)【出願日】2019年12月16日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ・平成３０年１２月１７日に ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊａ／ｒｅｐｏｒｔ／ＫＡＫＥＮＨＩ−ＰＲＯＪＥＣＴ−１６Ｋ１５２２６／１６Ｋ１５２２６２０１７ｈｏｋｏｋｕ／にて公開。 ・平成３１年３月１５日に第９回アジア・オセアニア生理学会連合２０１９年大会プログラム、２５１頁にて公開。 ・平成３１年３月１５日に第９回アジア・オセアニア生理学会連合２０１９年大会予稿集、Ｓ２５３頁にて公開。 ・平成３１年３月３０日に第９回アジア・オセアニア生理学会連合２０１９年大会（開催場所：神戸国際会議場）にて公開。 ・令和１年６月２０日に第９回アジア・オセアニア生理学会連合２０１９年大会抄録集、Ｓ２５３頁にて公開。 ・令和１年８月２９日にＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１９）２１８（１０）：３３７２−３３９６にて公開。

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100121441

【弁理士】

【氏名又は名称】西村 竜平

(74)【代理人】

【識別番号】100154704

【弁理士】

【氏名又は名称】齊藤 真大

(74)【代理人】

【識別番号】100129702

【弁理士】

【氏名又は名称】上村 喜永

(74)【代理人】

【識別番号】100206151

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 惇志

(74)【代理人】

【識別番号】100218187

【弁理士】

【氏名又は名称】前田 治子

(72)【発明者】

【氏名】古瀬 幹夫

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

2G045AA24

2G045CB01

2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB02

2G045FB03

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QS36

4B063QX04

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】 内在性クローディンによるタイトジャンクションが実質的に形成されない上皮細胞株を提供する。
【解決手段】 少なくともクローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７を欠損させることを特徴とするクローディン欠損上皮細胞株の製造方法とした。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくともクローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７を欠損させることを特徴とするクローディン欠損上皮細胞株の製造方法。

【請求項2】

イヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株を親株とするものである請求項１記載のクローディン欠損上皮細胞株の製造方法。

【請求項3】

少なくともクローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７が欠損していることを特徴とするクローディン欠損上皮細胞株。

【請求項4】

請求項３記載のクローディン欠損上皮細胞株を使用することを特徴とするタイトジャンクション機能制御物質のスクリーニング方法。

【請求項5】

請求項３記載のクローディン欠損上皮細胞株を使用することを特徴とするタイトジャンクション機能制御物質のスクリーニングキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クローディン欠損上皮細胞株の製造方法、クローディン欠損上皮細胞株及びこの上皮細胞株を用いたタイトジャンクション機能制御剤のスクリーニングに関するものである。

【背景技術】

【0002】

タイトジャンクションは、上皮細胞や血管内皮細胞等のバリア機能に重要な役割を果たす細胞間接着構造であり、例えば、脳内に流入する物質を厳密に制限している血液脳関門において重要な役割を果たしている。

【0003】

このタイトジャンクションの機能を人為的にコントロールすることができれば、例えば、今までタイトジャンクションが障壁となって医薬品を届けることが出来なかった部位に対しても、医薬品を届けることができるようになると考えられる。

【0004】

タイトジャンクションのバリア機能をコントロールする方法として、例えば、タイトジャンクションを構成するクローディンという膜タンパク質の活性を阻害する又は抑制する物質を与えることが考えられる。

【0005】

クローディンには２７種類ものサブタイプが存在し、個々のサブタイプによって、性質が異なることがわかっている。そのため、クローディンの活性を阻害又は抑制する物質は個々のクローディンサブタイプによって異なることが予想される。
また、個々の上皮細胞や血管内皮細胞に発現しているクローディンの種類は、その上皮細胞や血管内皮細胞が存在している体の部位によっても異なることが分かっている。

【0006】

そこで、個々のクローディンサブタイプに作用する物質をそれぞれ個別に特定することができれば、それらの組み合わせによって、体のあらゆる部位におけるタイトジャンクションのバリア機能をコントロールすることができると考えられる。

【0007】

個々のクローディンサブタイプに作用する物質をそれぞれ個別に特定するためには、例えば、クローディンサブタイプ群を全く発現していない又は発現量がきわめて少なくタイトジャンクションが形成されていない細胞株に、特定のクローディンサブタイプのみを発現させて、タイトジャンクションを形成させ、そこに様々な物質を与えてタイトジャンクションのバリア機能を評価する方法が考えられる。

【0008】

従来、クローディンを発現していない細胞株としては、特許文献１に示すような、内在性のクローディンが存在しない繊維芽細胞が知られている。

【0009】

しかしながら、繊維芽細胞は、上皮細胞としての性質を欠くため、クローディン遺伝子を導入して特定のクローディンを発現させたとしても、断片化したタイトジャンクション様構造が形成されるだけで、上皮細胞のようにバリア機能を有するベルト状に連続したタイトジャンクションを形成することはできない。

【0010】

そのため、各クローディンに作用する物質とタイトジャンクションのバリア機能との関係について繊維芽細胞を用いて評価することは難しい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】再表２０１５−１５９８５５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、前述したような課題に鑑みてなされたものであり、バリア機能を有するタイトジャンクションを形成する能力を潜在するにもかかわらず、内在性クローディンの発現がない又は極めて少ないためにタイトジャンクションを形成することができない上皮細胞株を提供することを主な目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

すなわち、本発明は、本発明者が、少なくともクローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７を欠損させることによって、内在性のクローディンによるタイトジャンクションが観察されなくなることに気づいたことによって初めて完成されたものであり、少なくともクローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７を欠損させることを特徴とするクローディン欠損上皮細胞株の製造方法である。

【0014】

このような製造方法によれば、内在性クローディンによるタイトジャンクションが実質的に形成されない上皮細胞株を得ることができる。

【0015】

前記クローディン欠損上皮細胞株が、イヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株を親株とするものであれば、安定して培養することができ、株の取り扱いが容易である。

【0016】

前述したような製造方法によって作製されたクローディン欠損上皮細胞株も、本発明の１つである。

【0017】

前述したようなクローディン欠損上皮細胞を使用するタイトジャンクション機能制御剤のスクリーニング方法及びスクリーニングキットも、それぞれが本発明の１つである。

【発明の効果】

【0018】

本発明に係るクローディン欠損上皮細胞株によれば、内在性クローディンのうち、少なくとも前述した５つのクローディン遺伝子を欠損しているので、内在性クローディンによるタイトジャンクションの形成が実質的に起こらないクローディン欠損上皮細胞株を得ることができる。

【0019】

このようなクローディン欠損上皮細胞株に、調べたい対象である特定のクローディン遺伝子を導入すれば、例えば図１に示すように、実質的に特定のクローディンのみで形成されたタイトジャンクションのバリア機能を直接評価することができる。

【0020】

さらに、上皮細胞は、本来タイトジャンクションを形成する細胞であるので、特定のクローディンに作用する物質とタイトジャンクションのバリア機能との関係について従来よりも正確に評価することが可能である。

【0021】

体の部位や細胞の種類によって発現しているタイトジャンクションを形成しているクローディンの種類が異なるので、このように各クローディンについて作用物質を検出しておけば、タイトジャンクション機能を制御したい体の特定部位の上皮細胞や血管内皮細胞に対して、どのような物質与えることによってタイトジャンクションの機能を制御することが出来るかを予測することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】本発明の一実施形態に係るクローディン欠損上皮細胞株を利用した実験例を表す模式図。

【図2】本実施例に係るクローディン欠損上皮細胞株におけるクローディンの発現を調べたウェスタンブロットの結果を示す図。

【図3】親株におけるタイトジャンクションの形成状況を表す写真。

【図4】本実施例に係るクローディン欠損上皮細胞株におけるタイトジャンクションの形成状況を表す写真。

【図5】本実施例に係るクローディン欠損上皮細胞株にクローディン１を導入した場合のタイトジャンクションの形成状況を表す写真。

【図6】本実施例に係るクローディン欠損上皮細胞株にクローディン５を導入してタイトジャンクションを形成した細胞の経上皮電気抵抗の測定結果を示すグラフ。

【図7】本実施例に係るクローディン欠損上皮細胞株にクローディン５を導入してタイトジャンクションを形成した細胞の傍細胞経路流量の測定結果を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明に係るクローディン欠損上皮細胞株の製造方法、該製造方法によって得られるクローディン欠損上皮細胞株、該クローディン欠損上皮細胞株を使用するスクリーニング方法及びスクリーニングキットについて、それぞれ以下に説明する。

【0024】

＜クローディン欠損上皮細胞株の製造方法＞
本発明に係るクローディン欠損上皮細胞は、以下のような手順で製造することができる。

【0025】

本発明に係るクローディン欠損上皮細胞を製造する際の親株としては、例えば、イヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ細胞を使用することができる。
親株は、前述したものに限らず、イヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株と同じクローディンを発現していると思われる株であれば、どのようなものでも使用することができる。

【0026】

本発明に係るクローディン欠損上皮細胞株は、例えば、ゲノム編集によって前述した親株のクローディン遺伝子を欠損させることによって得ることができる。クローディン遺伝子をゲノム編集で破壊する以外にも、ＲＮＡ干渉によってクローディンの発現を阻害してクローディン欠損上皮細胞株を得るようにしてもよい。
本実施形態では、一例として、ＴＡＬＥＮｓを用いてゲノム編集を行ったが、この方法に関わらず、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９やＺＦＮｓを用いてゲノム編集を行ってもよい。

【0027】

まず、クローディン遺伝子を欠損させるためのＴＡＬＥＮｓを各クローディン遺伝子毎に作製し、作成されたＴＡＬＥＮｓを適切なベクターに乗せて親株に導入することによって、親株の各クローディン遺伝子を順次切断することによってクローディン遺伝子を欠損させた。

【0028】

このようなゲノム編集により、例えば、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７の５つのクローディン遺伝子を全て欠損させることによって、タイトジャンクションを実質的に形成しないクローディン欠損上皮細胞株を得ることができる。

【0029】

上皮細胞には、前述したクローディンサブタイプ以外にも内在性クローディンが存在しているので、前述した５つ以外のクローディン遺伝子をさらに欠損させても良い。一例としては、クローディン１６などを追加で欠損させることが考えられる。

【0030】

＜クローディン欠損上皮細胞株＞
本実施形態に係るクローディン欠損上皮細胞株は、例えば、イヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株を親株とするものであり、このＭＤＣＫＩＩ株が本来持っているクローディン遺伝子のうち、少なくともクローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７の５つのクローディン遺伝子を欠損しているものである。

【0031】

このクローディン欠損上皮細胞株は、例えば、通常のダルベッコ改変イーグル培地を使用して、例えば、３７℃で培養することができる。使用する培地や温度は、例えば、親株の種類などによって、適宜変更することができる。

【0032】

このクローディン欠損上皮細胞株は、少なくとも前述した５つのクローディンを発現しておらず、タイトジャンクションを形成しない。そのため、バリア機能は顕著に低下しているが、タイトジャンクションを形成する能力は潜在的に保持するものである。

【0033】

＜クローディン欠損上皮細胞株を使用したスクリーニング方法＞
まず、前述したクローディン欠損上皮細胞株に、タイトジャンクションのバリア機能への影響を調べたい特定のクローディンサブタイプの遺伝子を導入して、特定のクローディンを発現させる。
この時に導入する特定のクローディン遺伝子は、１つだけでも良いし、もしタイトジャンクション機能を制御したい体の部位によって存在する上皮細胞や血管内皮細胞に発現している複数のクローディンの種類が分かっている場合には、これらを発現させるようにしてもよい。導入するクローディン遺伝子は１つに限らず、２つ以上としても良い。

【0034】

本実施形態では、その一例として、ヒトの血液脳関門に存在する血管内皮細胞が有しているクローディン５を前記特定のクローディンとして発現させ、そのバリア機能を評価するものとしているが、これに限られず、様々なクローディンを発現させることができる。例えば、クローディン１、クローディン２、クローディン１０ａ、クローディン１０ｂ、クローディン１５等を挙げることができる。

【0035】

これら特定のクローディンを発現させたクローディン欠損上皮細胞株を培養すると、特定のクローディンによってタイトジャンクションが形成される。
このように形成されたタイトジャンクションのバリア機能を１００として、様々な物質を供与した場合のタイトジャンクション機能を評価することによって、目的のクローディンに作用して、タイトジャンクションのバリア機能を制御する物質をスクリーニングすることができる。
例えば、クローディン５やクローディン１を発現させて、このクローディン５又はクローディン１に作用してタイトジャンクションのバリア機能を低下させるような物質をスクリーニングするようにしても良い。
また、タイトジャンクションに孔を形成するクローディン２、クローディン１０ａ、クローディン１０ｂ、クローディン１５等をそれぞれ発現させて、これらの孔を塞いでタイトジャンクションのバリア機能を向上させるような物質をスクリーニングするようにしても良い。

【0036】

この時の具体的なバリア機能評価方法としては、例えば、形成されたタイトジャンクションの長さを測定する方法、経上皮電気抵抗を測定する方法又は傍細胞経路流量（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｘ）を測定する方法などを挙げることができるが、これらに限られない。

【0037】

＜クローディン欠損上皮細胞株を使用したスクリーニングキット＞
前述したクローディン欠損上皮細胞株を含むタイトジャンクション機能制御物質のスクリーニングキットとしてもよい。

【0038】

前記スクリーニングキットは、例えば、前述したクローディン欠損上皮細胞株に加えて、該クローディン欠損上皮細胞株に対して特定のクローディンを導入するための遺伝子、該導入操作に使用するベクター等、特定のクローディン遺伝子を導入したクローディン欠損上皮細胞株、各種試薬、前記クローディン欠損上皮細胞株用の培地等のうち、少なくとも１つを含むものとしても良い。
本発明は、以上に説明したものに限られず、本発明の趣旨に反しない限りにおいて、種々の変形や実施形態の組合せを行ってもかまわない。

【実施例】

【0039】

以下に、本発明について実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。

【0040】

＜クローディン欠損上皮細胞株の作製＞
クローディン欠損用ベクターの作製
本発明に係るクローディン欠損上皮細胞は、ＴＡＬＥＮｓを使用したゲノム編集によって、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７を欠損させたものである。

【0041】

まず、クローディンを欠損させるためのＴＡＬＥＮｓを各クローディン遺伝子毎に作成し、作成されたＴＡＬＥＮｓを使用して、親株であるイヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株が本来持っているクローディン遺伝子のうち、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７の遺伝子をそれぞれ切断することによってクローディンを欠損させた。

【0042】

具体的には、ＡｄｄｎｅｎｅのＴＡＬＥ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｋｉｔ（＃１０００００００１９）を使用し、このキットの取り扱い説明書に記載の手順に従ってクローディン２遺伝子に対応するＴＡＬＥＮペアを作成し、これらＴＡＬＥＮ遺伝子をそれぞれｐＣＡＧＧＳベクターにｎｅｏｍｙｏｃｉｎ耐性遺伝子又はｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子とともに導入した。なお、ｐＣＡＧＧＳベクターは、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＤＮＡ ＢＡＮＫから購入することができる（カタログ＃ＲＤＢ０８９３８）。

【0043】

親株の培養とＴＡＬＥＮｓによるゲノム編集
前述したような手順で作製したＴＡＬＥＮｓベクターの親株へのトランストランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｗｉｔｈ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ，Ａ１２６２１）を使用して行った。培地は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｗｉｔｈ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔで推奨されているＯＰＴＩ−ＭＥＭを使用した。
６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、親株であるイヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株（シグマアルドリッチ、ＭＴＯＸ１３００−１ＶＬ）を、１ウェル当たり４×１０^４ｃｅｌｌとなるように播いた。その２時間後に、これら細胞に対して、前述のＴＡＬＥＮｓベクターを導入した。
ベクターを導入した翌日に、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８と５μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを４時間投与して、ＴＡＬＥＮペアを発現するための２種類のベクターが両方導入された細胞のみが生き残るようにした。
生き残った細胞株を分離して、クローディン２欠損上皮細胞株とした。
このようにして作製したクローディン２を欠損した上皮細胞株に対して、同様の手順を繰り返してクローディン４、クローディン３、クローディン７、クローディン１の順番で５種類のクローディン遺伝子を欠損させたクローディン欠損上皮細胞株を作製した。１つのクローディンサブタイプを欠損させる度に、次のトランスフェクションの前に、得られたクローディン欠損上皮細胞株のゲノムに、ベクターが導入されたことを示す薬物耐性遺伝子が組み込まれていないかどうかを、この薬物耐性遺伝子に特異的なDNA配列をPCRで増幅させることによって確認した。

【0044】

クローディン欠損上皮細胞株における各クローディン欠損の確認
（１）ゲノムシークエンスによる各クローディン遺伝子の破壊の確認
各クローディン遺伝子の破壊が成功したかどうかについては、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して確認した。結果は図示していないが、クローディン１については、開始コドンから数えて１５番目のコドンに２塩基対の挿入が確認された。クローディン２及びクローディン４については、開始コドンの直後にそれぞれ４塩基対の挿入があった。クローディン３については、開始コドンから８番目のコドンに４０９塩基対の挿入が確認された。クローディン７については、開始コドンから１７番目のコドンに４塩基対の挿入が確認された。この実験結果から、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７の５つのクローディン遺伝子が破壊されていることが確認できた。
ゲノムＰＣＲに使用したプライマーは以下の通りである。
Ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｆｏｒｗａｒｄ， ５‘−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＴ−３’、Ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｒｅｖｅｒｓｅ， ５‘−ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＣＣＣ−３’。
Ｃｌａｕｄｉｎ−２ ｆｏｒｗａｒｄ， ５‘−ＡＣＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＧＧ−３’、Ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｒｅｖｅｒｓｅ， ５‘−ＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＣＡＣＴＧ−３’。
Ｃｌａｕｄｉｎ−３ ｆｏｒｗａｒｄ， ５‘−ＡＡＧＣＡＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＣ−３’、Ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｒｅｖｅｒｓｅ， ５‘−ＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧ−３’。
Ｃｌａｕｄｉｎ−４ ｆｏｒｗａｒｄ， ５‘−ＣＴＣＡＴＧＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴ−３’、Ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｒｅｖｅｒｓｅ， ５‘−ＧＴＣＣＣＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＧ−３’。
Ｃｌａｕｄｉｎ−７ ｆｏｒｗａｒｄ， ５‘−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＣＧＣＧＧＡＴＣＧＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’、Ｃｌａｕｄｉｎ−１ ｒｅｖｅｒｓｅ， ５‘−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣ−３’。
（２）ウエスタンブロッティングによるクローディンの発現確認
前述したようにして作製した５つのクローディンを全て欠損したクローディン欠損上皮細胞株（以下、Claudin quinKO株ともいう。寄託受領番号：ＮＩＴＥ-ＡＰ-０３０８８）において、実際に５つのクローディンが発現していないことをウェスタンブロッティングにより確認した。

【0045】

具体的には、Claudin quinKO株をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後に、１００ｍＭＤＴＴを添加したＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃１６１０７３７）で溶解し、９５℃で５〜〜１０分間インキュベートした。
このようにして得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、分離したタンパク質をポアサイズ０．４５μｍのニトロセルロース転写膜（Ｗｈａｔｍａｎ，＃１０−４０１−１９６）に転写し、５質量％となるようにスキムミルクを添加したＴＢＳ緩衝液（ブロッキングバッファー）でブロッキングした。
その後、ブロッキングバッファに検出したいタンパク質に結合する一次抗体を添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。

【0046】

この時に使用した、一次抗体は以下の通りである。
ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｃｌａｕｄｉｎ−１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃５１−９０００）、ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｃｌａｕｄｉｎ−２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃｌｏｎｅ １２Ｈ１２；＃３２−５６００）、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｃｌａｕｄｉｎ−３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃３４−１７００）、ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｃｌａｕｄｉｎ−４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃｌｏｎｅ ３Ｅ２Ｃ１；＃３２−９４００）、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｃｌａｕｄｉｎ−７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃３４−９１００）。
また、使用した２次抗体は以下の通りである。
ｓｈｅｅｐ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ，＃ＮＡ９３１Ｖ）、ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｆ（ａ‘ｂ’）_２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ，＃ＮＡ９３４０Ｖ）．

【0047】

次に、０．１質量％となるようにＴｗｅｅｎ２０ｗ添加したＰＢＳを用いて、１０分間浸透しながら洗浄する工程を３回繰り返した後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃ＲＰＮ２２３２）を用いてシグナルを検出した。
画像は、ＬＡＳ３０００ ｍｉｎｉ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用してキャプチャーし、画像の明るさ及びコントラストは、Ｆｉｊｉ／ＩｍａｇｅＪ １．５２ｆ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）で調整した。結果を図２示す。

【0048】

図２の結果から、今回作成したクローディン欠損上皮細胞株は、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７を発現していないことが確認できた。

【0049】

＜クローディン欠損上皮細胞株におけるタイトジャンクション機能の確認＞
次に、前述したようにして作製したClaudin quinKO株について、タイトジャンクションの形成状況を確認した。
凍結割断法によるタイトジャンクションの観察
まず、親株のイヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株について、タイトジャンクションの形成状況を凍結割断法によって確認した。写真を図３に示す。図３の写真から、イヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株では、ベルト状に連続したタイトジャンクションを形成することが確認できた。
前記凍結割断法は以下のようにして行った。
イヌ腎臓由来ＭＤＣＫＩＩ株を、CorningのTranswellフィルター上で５〜７日間培養した。その後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で一回リンスして、２％のｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で一晩固定化した。 これを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１０分間洗浄する工程を１０回繰り返し、この試料を３０％のｇｌｙｃｅｒｏｌを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に室温で３０分浸し、凍結保護した。
メスでフィルターを切除した後、フィルターからスクレイパーで細胞を剥がしとり、金製の試料台に載置した。余剰の緩衝液を除去した後、試料を液体窒素中で急速凍結させた。
凍結させた試料を、フリーズフラクチャー装置（Bal-Tec、BAF-０６０）に入れて、−１１０℃で割断した。割断後ただちに割断面に対して４０°の角度から白金を膜厚が〜２ｎｍとなるように蒸着させ、さらに９０°の角度から炭素を膜厚が〜２０ｎｍとなるように蒸着させて、試料表面を覆った。
試料を装置から取り出した後、コロジオンで被覆し、家庭用漂白剤で洗浄した。
これを水で10分間リンスする工程を3回繰り返して作製したレプリカを２００−メッシュのフォームコーティング銅電極上に集めた。
このようにして作製した試料を、透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，ＪＥＭ１０１１又はＪＥＭ１０１０）を使用して加速電圧１００−ｋＶで観察した。画像は、ｉＴＥＭＭｅｇａＶｉｅｗＧ２又はＶｅｌｅｔａ ＣＣＤ カメラでキャプチャーした。

【0050】

次に、今回作製したClaudin quinKO株について、同様にタイトジャンクションの形成状況を確認した。前述した凍結割断法によって得た写真を図４に示す。この時の実験条件は、全て図３と同じものとした。

【0051】

これら写真を比べると分かるように、図３では細かな点線のようにベルト状に連続して形成されていたタイトジャンクションが図４では全く観察できないことが分かった。
この結果から、クローディン１、クローディン２、クローディン３、クローディン４及びクローディン７を欠損させると、タイトジャンクションが形成されなくなることが確認できた。

【0052】

＜クローディン欠損上皮細胞株へのクローディン遺伝子の導入とタイトジャンクションのバリア機能の確認＞
次に、作製したClaudin quinKO株に対して、クローディン１又はクローディン５を発現させて、タイトジャンクションが形成されることを確認した。実験手順を以下に説明する。

【0053】

ヒトClaudin-1発現ベクター及びヒトClaudin-5発現ベクターの作製
ヒトClaudin-1 cDNA又はヒトClaudin-5 cDNAを発現ベクターpCAGGSに挿入した。なお、ヒトClaudin-1 cDNA及びヒトClaudin-5 cDNAは、例えば、ヒト脳cDNAライブラリーから簡単に取得できる。

【0054】

ヒトClaudin-1発現ベクター又はヒトClaudin-5発現ベクターの導入
前述したヒトClaudin-1発現ベクター又はヒトClaudin-5発現ベクターを、それぞれClaudin quinKO細胞にトランスフェクションさせた。具体的には、Thermo Fisher Scientific社のLipofectamine LTX Reagentを用い、メーカープロトコールに従ってトランスフェクションを行った。
翌日、細胞をトリプシンで分散して蒔き直し、G418 300μｇ／ｍｌを含む選択培地で培養し、１１日後に耐性クローンを48個回収し、トリプシン処理を行い、96ウェルプレート2枚に等分した。
96ウェルプレートに移植した3日後に、片側の96ウェルプレートを、細胞を接着させたまま抗クローディン１抗体（フナコシ, FAB4618G）又は抗クローディン5抗体（Morita et al., J Cell Biol. 147:185-94, 1999, Thermo Fisherの4C3C2等を使用しても良い。）で蛍光免疫染色し、陽性クローンを取得した。このようにして取得した株を以下、 Claudin quinKO＋claudin１株、Claudin quinKO＋claudin５株とそれぞれ呼ぶことにする。

【0055】

タイトシャンクション形成の観察
前述したようにして得たClaudin quinKO＋claudin１株を培養し、タイトジャンクションの形成状況を観察した。結果を図５に示す。この時の実験条件は、全て図３及び図４の時と同じものとした。
この図５から分かるように、Claudin quinKO株では形成されなかったタイトジャンクションが、クローディン１遺伝子を導入したClaudin quinKO＋claudin１株では再構築されていることが分かった。このタイトジャンクションは、導入したクローディン１によって形成されているものと考えられる。

【0056】

タイトジャンクションのバリア機能評価
プラスチックシャーレに培養して増やした細胞（Claudin quinKO株及びClaudin quinKO＋claudin５株）をトリプシン処理によってはがして、計数する。
2 X 105個の細胞を、Corning社 Transwellカルチャーインサート（#3401）にまいて培養し、４から６日後に以下の二通りのバリアアッセイを行った。なお、Claudin quinKO＋claudin５株については、陽性クローン４種類を使用して実験を行った。

【0057】

(1)Transepithelial electrical resistance (経上皮電気抵抗)
ミリセル(Millicell) ERS-2抵抗値測定システム（ミリポア社）を用いて、Transwellの上チャンバーと下チャンバーにそれぞれ電極を入れ、細胞シートの電気抵抗を測定した。結果を図６に示す。図中の１はClaudin quinKO株を、２〜５はClaudin quinKO＋claudin５株をそれぞれ示す。

【0058】

この図６の結果から、５つのクローディン遺伝子を欠損したClaudin quinKO株では、上チャンバーと下チャンバーとの間でほとんど電気抵抗が発生していない。この数値は、同じ条件で実験をした場合の親株（MDCKII株）の６分の１程度の値である。この結果から、Claudin quinKO株では、細胞間にタイトジャンクションが形成されておらず、バリア機能が失われていることが分かった。

【0059】

一方、クローディン５遺伝子を導入したClaudin quinKO＋claudin５株の場合は、いずれのクローンでも、上チャンバーと下チャンバーとの間に明らかな電気抵抗が発生している。このことから、これらClaudin quinKO＋claudin５株では、クローディン５遺伝子を導入したことによって、タイトジャンクションが形成され、バリア機能が復活していることが分かった。

【0060】

(2)Paracellular flux (傍細胞経路流量)
Transwellの上チャンバーに３８９Ｄａのフルオレセイン（ナカライテスク、１６１０６−８２）を200μＭになるように加え、１時間後に下チャンバーを回収し、細胞膜を通過して下チャンバーに漏れ出たフルオレセイン量を蛍光プレートリーダーにて定量した。結果を図７に示す。図中の１はClaudin quinKO株を、２〜５はClaudin quinKO＋claudin５株をそれぞれ示す。

【0061】

この図７の結果から、５つのクローディン遺伝子を欠損したClaudin quinKO株では、上チャンバーに添加したフルオレセインが下チャンバーに漏れ出していることが分かる。同じ条件で実験をした場合の親株（MDCKII株）では、下チャンバーにはほとんどフルオレセインが漏れ出さないことが確かめられている。この結果からも、Claudin quinKO株では、細胞間にタイトジャンクションが形成されておらず、バリア機能が失われていることが分かった。

【0062】

一方、クローディン５遺伝子を導入したClaudin quinKO＋claudin５株の場合は、いずれのクローンでも、上チャンバーに添加したフルオレセインは下チャンバーからはほとんど検出されなかった。このことから、これらClaudin quinKO＋claudin５株では、クローディン５遺伝子を導入したことによって、タイトジャンクションが形成され、バリア機能が復活していることが分かった。

【0063】

以上の結果から、５つのクローディンを欠損することによって、タイトジャンクションが形成されず、バリア機能が失われたClaudin quinKO株に、クローディン遺伝子を導入してクローディンを発現させることによって、タイトジャンクションが形成され、バリア機能が発揮されることが分かった。

【0064】

また、Claudin quinKO株にクローディン１遺伝子又はクローディン５遺伝子を導入すれば、バリア機能を有するタイトジャンクションが形成されたことから、Claudin quinKO株は内在性のクローディンを実質的に発現しないことによって、タイトジャンクションを形成しなくなったものであり、タイトジャンクションを形成するための、例えば、上皮細胞極性などの性質や機能は保持していることが分かった。

【0065】

そのため、例えば、このClaudin quinKO株に様々なクローディン遺伝子を導入することによって、特定のクローディンのみからなるタイトジャンクションを形成することができる。その結果、クローディンに作用してタイトジャンクションのバリア機能に影響を与える物質をスクリーニングすることができると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】