特開 2022-1038 哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法および哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2022-1038(P2022-1038A)

(43)【公開日】2022年1月6日

(54)【発明の名称】哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法および哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20211210BHJP

   C12N 15/85 20060101ALN20211210BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20211210BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09

   C12N15/85 Z

   C12N5/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2021-5257(P2021-5257)

(22)【出願日】2021年1月15日

(31)【優先権主張番号】特願2020-106266(P2020-106266)

(32)【優先日】2020年6月19日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和１年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（ＡＭＥＤ）、次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業、「バイオ医薬品の高度製造技術の開発／高性能な国産細胞株の構築」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】清水 典明

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BB13

4B065BC06

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法および哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットを提供する。
【解決手段】哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法であって、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損され、かつ前記目的遺伝子が導入された、前記哺乳動物細胞の形質転換体を、低酸素条件下にて培養する工程を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法であって、
ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損され、かつ前記目的遺伝子が導入された、前記哺乳動物細胞の形質転換体を、低酸素条件下にて培養する工程を含む方法。

【請求項2】

前記低酸素条件は、培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記形質転換体には、前記哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および前記哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターが、さらに導入されている、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記形質転換体を、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で培養する、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウムである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、
ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損された、前記哺乳動物細胞の形質転換体を含むキット。

【請求項7】

前記哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および前記哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターをさらに含む、請求項６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法および哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットに関する。

【背景技術】

【0002】

従来、細胞内で目的遺伝子を増幅させる方法として、宿主細胞あたりの目的遺伝子のコピー数を増加させる技術が知られている。その方法の１つに、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ；dihydrofolate reductase）遺伝子をもつプラスミドを、メソトレキセート（Ｍｔｘ；methotrexate）処理によりチャイニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞内で増幅させる、ＤＨＦＲ／Ｍｔｘ法が挙げられる。具体的には、ＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだプラスミドをＤＨＦＲ欠損細胞であるＣＨＯ ＤＧ４４細胞に導入した後、ＤＨＦＲ酵素タンパク質の阻害剤であるＭｔｘを、段階的に濃度を高めて処理することにより、導入したプラスミドを増幅させる。ＤＨＦＲ／Ｍｔｘ法はバイオ医薬品の製造等に広く用いられているが、ＤＨＦＲ／Ｍｔｘ法は操作が煩雑で時間と経験を要し、この方法により得られた細胞は不安定であることが多い。

【0003】

また、別の方法として、哺乳動物複製開始領域（ＩＲ；Initiation Region）と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ；Matrix Attachment Region）とを具備するベクター（「ＩＲ／ＭＡＲベクター」または「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」と呼ぶ）を細胞（例えば、ＣＯＬＯ ３２０、または、ＣＨＯ ＤＧ４４）に導入し、ベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子を利用して安定な形質転換体を選択することによって、（ｉ）発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（換言すれば、目的遺伝子）の細胞内コピー数を増幅できること、および、（ｉｉ）目的遺伝子を、ＩＲ／ＭＡＲベクターに対して同一の遺伝子構築物（シス）として細胞へ導入した場合であっても、ＩＲ／ＭＡＲベクターに対して別の遺伝子構築物（トランス）として細胞へ導入した場合であっても、目的遺伝子の細胞内コピー数を増幅できること、を本発明者らは見出した。そして、本発明者らは、前記ＩＲ／ＭＡＲベクターを用いて目的遺伝子を高度に増幅する系（「高度遺伝子増幅系」または「ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅系」と呼ぶ）を完成させるに至った（例えば、特許文献１および２、並びに、非特許文献１および２参照）。ここで、高度遺伝子増幅系（ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅系）を用いた遺伝子増幅法を、「ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法」と呼ぶ。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００３−２４５０８３号公報

【特許文献2】特開２００４−３３７０６６号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Noriaki Shimizu et. al., Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification, Cancer Research, Vol.61, No.19, p6987-6990, (2001)

【非特許文献2】Noriaki Shimizu et. al., Amplification of plasmids containing a mammalian replication initiation region is mediated by controllable conflictbetween replication and transcription, Cancer Research, Vol.63, No.17, p5281-5290, (2003)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、上述の遺伝子増幅法によって遺伝子増幅を行った場合、増幅した領域には、目的遺伝子の単純反復配列が形成される。一般的に、反復配列は、頻繁にＲＩＧＳ（Repeat-Induced Gene Silencing）と呼ばれる現象によって、ヘテロクロマチン化が起こり、転写抑制されることが知られている。また反復配列はＲＮＡｉ系を高効率的に活性化し、ＤＮＡのメチル化を誘導することも知られている。そのため、このような転写抑制を解除する方法の開発が進められつつあるが、従来の転写抑制を解除する方法では、目的遺伝子が転写・翻訳されて最終的に生じる目的タンパク質の発現量が十分とはいえず、更なる改善の余地があった。

【0007】

本発明は、前記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法および哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損された哺乳動物細胞に目的遺伝子を導入し、遺伝子増幅する際に低酸素条件下で該細胞を培養することによって、目的遺伝子の転写・翻訳を促進し、目的タンパク質の発現量を上げることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0009】

すなわち、本発明の一実施形態は、以下のような構成である。

【0010】

〔１〕哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法であって、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損され、かつ前記目的遺伝子が導入された、前記哺乳動物細胞の形質転換体を、低酸素条件下にて培養する工程を含む方法。

【0011】

〔２〕前記低酸素条件は、培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件である、〔１〕に記載の方法。

【0012】

〔３〕前記形質転換体には、前記哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および前記哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターが、さらに導入されている、〔１〕または〔２〕に記載の方法。

【0013】

〔４〕前記形質転換体を、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で培養する、〔１〕から〔３〕の何れか１つに記載の方法。

【0014】

〔５〕前記ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウムである、〔４〕に記載の方法。

【0015】

〔６〕哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損された、前記哺乳動物細胞の形質転換体を含むキット。

【0016】

〔７〕前記哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および前記哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターをさらに含む、〔６〕に記載のキット。

【発明の効果】

【0017】

本発明の一実施形態によれば、哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法および哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットが実現できる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】実施例１および２に用いたＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞のウエスタンブロットの結果を示す図である。

【図2】実施例１〜４に用いた発現ベクターの構造を示す図である。

【図3】実施例１において、ＦＩＳＨ法による形質転換体の染色像を示す写真である。

【図4】実施例１において、ＦＩＳＨ法による形質転換体の染色像から算出した、増幅したｄ２ＥＧＦＰの各構造の形成頻度を示すグラフである。

【図5】実施例１において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞内で増幅されたｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度を示すグラフである。

【図6】比較例において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が阻害されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞内で増幅されたｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度を示すグラフである。

【図7】実施例２において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が阻害されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞のｄ２ＥＧＦＰの発現量を示すグラフである。

【図8】実施例２において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が阻害されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞のプラスミドのコピー数およびコピー数に対するｄ２ＥＧＦＰの発現量を示すグラフである。

【図9】実施例３において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞から分離されたサブクローンの、ＤＭおよびＨＳＲの染色像ならびにｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度を示すグラフである。

【図10】実施例４において、ＦＩＳＨ法による形質転換体の染色像から算出した、増幅したｄ２ＥＧＦＰの各構造の形成頻度を示すグラフである。

【図11】実施例４において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞が低酸素条件下で培養された場合の、ｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度を示すグラフである。

【図12】実施例４において、低酸素条件下での培養後、通常の酸素濃度に戻した場合のＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ細胞内でのｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度を示すグラフである。

【図13】実施例５において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されたＣＨＯ ＤＧ４４細胞内で増幅されたｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度を示すグラフである。

【図14】実施例６において、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞が各低酸素条件下で培養された場合の、ｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値を示すグラフである。

【図15】実施例６において、各低酸素条件下で培養されたＣＨＯ ＤＧ４４細胞の各クローンにおける、ｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。本発明はまた、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意図する。

【0020】

本明細書において、「遺伝子」とはヌクレオチドの重合体を意図し、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と同義で使用される。遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）でも存在しうるし、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態でも存在しうる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。遺伝子は化学的に合成してもよい。また、本明細書において「ポリヌクレオチド」と記載した場合、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。

【0021】

本明細書において、「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と同義で使用される。本明細書中、塩基およびアミノ酸の表記は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を適宜使用する。

【0022】

〔１．本発明のメカニズム（モデル）〕
本発明の一実施形態は、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した哺乳動物細胞を、遺伝子増幅する際に低酸素条件下にて培養することにより、目的遺伝子の発現を高めるものである。なお、本明細書において「目的遺伝子」とは、タンパク質の発現を目的として前記の哺乳動物細胞に導入されるポリヌクレオチドを意図する。

【0023】

ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損と、低酸素条件下での培養とは、いずれも哺乳動物細胞における目的遺伝子の発現を高める。そして、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損と、低酸素条件下での培養を組み合わせることで、さらに目的遺伝子の発現が高まる。低酸素条件下では、ＳＩＲＴ１遺伝子が低酸素誘導因子の活性化に働くことが知られている。そのため、本発明の一実施形態において、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損と低酸素条件下での培養とが密接に関連して、目的遺伝子の発現を相乗的に高めることができると考えられる。

【0024】

したがって、本発明の一実施形態では、遺伝子発現に適した環境を人工的に形成し、当該環境の中に目的遺伝子を配置することによって、目的遺伝子の発現量を高めることができる。

【0025】

〔２．哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法〕
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損され、かつ目的遺伝子が導入された、哺乳動物細胞の形質転換体を、低酸素条件下にて培養する工程を含む方法である。

【0026】

以下に、本発明の一実施形態に係る哺乳動物細胞の形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」）について説明し、さらに、当該形質転換体を低酸素条件下にて培養する工程についても説明する。

【0027】

〔２−１．本発明の形質転換体〕
本発明の形質転換体は、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損され、かつ目的遺伝子が導入されてなる哺乳動物細胞の形質転換体である。

【0028】

本発明の一実施形態に係る哺乳動物細胞としては、特に限定されず、各種哺乳動物由来の細胞（例えば、各種哺乳動物由来の培養細胞）が用いられ得る。例えば、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯや、各種腫瘍細胞等が挙げられる。ＣＨＯとしては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０２８５、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０４０３等）や、ＣＨＯ ＤＧ４４が挙げられる。ＣＨＯは、現在、医薬等の有用タンパク質の実生産に用いられており、安全性が確認されている細胞であり、本発明の一実施形態に係る方法が適用される哺乳動物細胞としては好ましい。

【0029】

遺伝子増幅効率が高いという点では、無限増殖能を有する腫瘍細胞が好ましい。前記腫瘍細胞としては、例えば、ＨｅＬａ（入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０１９１等）、ヒト大腸がんＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２０）、ヒト大腸がんＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ（入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２０．１）、マウス骨髄腫ＮＳ０（入手先：例えば、ＲＩＫＥＮ ＲＣＢ０２１３）等が挙げられる。なおヒト大腸がんＣＯＬＯ ３２０ＤＭについては、「Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.」に記載されている。目的遺伝子がヒト由来の遺伝子である場合、哺乳動物細胞として、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭのようなヒト由来の細胞を用いることが好ましい。このような構成によれば、発現したタンパク質には、当該ヒト由来の細胞による翻訳後修飾が施されるため、内在性のタンパク質と同様の活性を有するタンパク質を大量に得ることが容易である。

【0030】

本発明の形質転換体は、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されている。なお、本明細書において「ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損」とは、特に限定されるものではないが、例えば、当該遺伝子が細胞内に存在しない場合のほか、以下の（i）〜（iv）のため、ＳＩＲＴ１遺伝子が機能しない場合等も含むことを意図している：（i）当該遺伝子のＯＲＦの大半が欠損している、（ii）当該遺伝子の主要部分が欠損している、（iii）当該遺伝子が発現しない、（iv）当該遺伝子に変異が含まれている。

【0031】

この場合、宿主に対して人為的に変異を施すことによって、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体を作製してもよいが、元々、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を有していない宿主（例えば、ゲノム中にＳＩＲＴ１遺伝子が存在しない宿主等）を用いて形質転換体を作製してもよい。

【0032】

生物種が異なれば、哺乳動物細胞内に存在する、ＳＩＲＴ１遺伝子も異なる。それ故に、本発明の形質転換体において欠損させるＳＩＲＴ１遺伝子は、宿主に応じて適宜決定すればよい。例えば、本発明の形質転換体がヒト由来であった場合に、機能を欠損させるＳＩＲＴ１遺伝子のゲノム配列を配列番号２に示している。また、本発明の形質転換体がチャイニーズハムスター由来であった場合に、機能を欠損させるＳＩＲＴ１遺伝子のゲノム配列を配列番号６に示している。

【0033】

ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損されている哺乳動物細胞の形質転換体を培養することによって、遺伝子の増幅効率が向上するメカニズムの詳細は現時点では不明である。メカニズムの一例としては、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損によるヒストンのアセチル化レベル上昇が挙げられる。ＳＩＲＴ１はヒストン脱アセチル化酵素として知られており、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損により、ヒストンのアセチル化レベルは上昇する。そのため、ＳＩＲＴ１の機能欠損により、増幅した目的遺伝子が受けているエピジェネティックな発現抑制が解除され、目的遺伝子を高発現させることができると発明者らは考えている。なお、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損により、目的遺伝子の発現が高まるメカニズムについては、これに限定されるものではない。

【0034】

また、本発明の形質転換体には、目的遺伝子が導入されている。なお、目的遺伝子は発現させるべきタンパク質（換言すれば、目的タンパク質）をコードするポリヌクレオチドのことである。よって、目的遺伝子は、特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。当該ポリヌクレオチドは、その塩基配列情報を元に、公知の技術（例えば、ＰＣＲ法、化学合成法）を用いて取得すればよい。

【0035】

目的遺伝子は、発現制御が可能なようにプロモーターに連結されていることが好ましい。前記プロモーターは、導入される哺乳動物細胞内で機能するものであれば特に限定されない。例えば、転写因子等による影響によって、プロモーターの転写活性が制御されて活性化または不活性化されるプロモーター（換言すれば、転写活性調節型プロモーター）であってもよいし、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターであってもよい。

【0036】

転写活性調節型プロモーターは、特に限定されず、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品を利用可能である。恒常型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期領域由来プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、ＳＲａｌｐｈａプロモーター（ＳＲαプロモーター）、ＬＴＲプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター等が利用可能である。

【0037】

目的遺伝子には、その他、ターミネーター等目的遺伝子の発現に必要なポリヌクレオチド、制限酵素認識部位、薬剤耐性遺伝子等のクローニングに必要なポリヌクレオチド等が含まれていてもよい。

【0038】

本発明の形質転換体には、以下に例示するようなベクターが導入されていてもよい。また、当該ベクターに目的遺伝子が含まれていてもよいし、目的遺伝子と、これらのベクターとは別々のプラスミドとして導入されていてもよい。

【0039】

さらに、本実施の形態に用いられるベクターは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を具備していてもよい。当該構成であれば、遺伝子増幅効率および発現効率がより高まることが期待できるという利点があるため、好ましい。

【0040】

ＭＡＲは、特に限定されず、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域を挙げることができる。なお、Ｉｇκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば「Tsutsui, K. et. al., J. Biol. Chem. Vol.268, p12886-12894（1993）」に記載されている。ＳＶ４０初期領域の核マ
トリックス結合領域については、例えば「Pommier, Y. et. al., J. Virol., Vol.64, p419-423（1990）」に記載されている。ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば「Shimizu N. et al., Cancer Res. Vol.61, p6987-6990（2001）」に記載されている。

【0041】

また、ＩＲとしては、特に限定されず、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および、β−グロビン遺伝子座の複製開始領域を挙げることができる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242（1990）」に記載されている。ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409（1988）」に記載されている。β−グロビン遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009（1998）」に記載されている。

【0042】

なお、本発明の一実施形態は、ＩＲおよびＭＡＲを利用しない通常の発現系においても適用し得る。本発明の一実施形態に係る方法により得られる作用の一つは、反復配列による転写抑制等の影響の低減であると考えられ、当該作用はＩＲおよびＭＡＲ以外の発現系でも同様に効果が期待できる。そのため、例えばＤＨＦＲ／Ｍｔｘ法であっても、本発明の一実施形態に係る方法による目的遺伝子の発現を高める効果は、ＩＲおよびＭＡＲを用いた場合と同様に得られると考えられる。したがって、本発明の一実施形態に係る方法によれば、ＩＲおよびＭＡＲを利用しない通常の発現系においても、ＩＲおよびＭＡＲを利用する場合と同様に目的遺伝子の発現を高めることができる。

【0043】

ベクターは、核マトリックス結合領域および複製開始領域の他に、目的に応じて、大腸菌内でクローニングを行うために必要な配列、薬剤耐性遺伝子（例えば、ブラストサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子等）、または、選択マーカーとして利用可能な蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ遺伝子等）等を具備していてもよい。

【0044】

目的遺伝子およびベクターを哺乳動物細胞に導入する方法は、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等の公知の方法を利用可能である。またその詳細な条件については、導入される哺乳動物や、各エレメント等に応じて適宜最適な条件を検討の上、採用すればよい。

【0045】

〔２−２．本発明の形質転換体を、低酸素条件下にて培養する工程〕
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、本発明の形質転換体を、低酸素条件下にて培養する工程（換言すれば、培養工程）を含んでいる。

【0046】

ここで、「低酸素条件下にて培養」とは、哺乳動物細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、当該哺乳動物細胞が通常培養される酸素濃度未満であることを意味する。「哺乳動物細胞が通常培養される酸素濃度」は、細胞によって異なるために一義的に決定されるものではないが、一般的な哺乳動物細胞であれば２０％（ｖ/ｖ）である。よって、低酸素条件下とは、哺乳動物細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、２０％（ｖ/ｖ）未満である場合である。哺乳動物細胞を低酸素条件下で培養する際の酸素濃度は、２０％（ｖ/ｖ）未満が好ましく、１０％（ｖ/ｖ）未満がより好ましく、５％（ｖ/ｖ）未満がさらに好ましい。前記好ましい範囲内であれば、哺乳動物細胞が増殖し易く、かつ遺伝子増幅効率の増加効果が得られやすい。また、哺乳動物細胞を低酸素条件下で培養する際の酸素濃度は、０％（ｖ／ｖ）であってもよい。なお、「％（ｖ/ｖ）」は「体積パーセント」を意味し、「％ ｖ／ｖ」または「％ ｖｏｌ／ｖｏｌ」とも表記する。

【0047】

哺乳動物細胞を、このような低酸素条件下で培養することによって、目的遺伝子の発現が向上するメカニズムの詳細は現時点では不明であるが、そのメカニズムの一例として、低酸素条件下で遺伝子増幅をする際に生じるＤＮＡ２本鎖切断が考えられる。このようなＤＮＡ２本鎖切断が、遺伝子増幅する際の低酸素条件下での培養において、目的遺伝子の遺伝子増幅の引き金となるのではないかと本発明者らは推察している。なお、低酸素条件下で培養することにより、目的遺伝子の発現が高まるメカニズムについては、これに限定されるものではない。

【0048】

本実施の形態の方法における培養工程によって、〔２−１．本発明の形質転換体〕の欄にて説明した本発明の形質転換体を培養して、目的遺伝子の発現を高めることができる。

【0049】

ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損された哺乳動物細胞の形質転換体を、低酸素条件下で培養することによって、遺伝子の増幅効率が向上するメカニズムの詳細は現時点では不明である。可能性の一つとして、冒頭に示したように、低酸素条件下では、ＳＩＲＴ１遺伝子が低酸素誘導因子の活性化に働くことが知られており、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損と低酸素条件下での培養との密接な関連が、目的遺伝子の発現に寄与していることが考えられる。すなわち、このように密接に関連している、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能欠損と低酸素条件下での培養とを併用することにより、目的遺伝子の発現が相乗的に高まるのではないかと、本発明者らは推察している。

【0050】

培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなく、培養する哺乳動物細胞によって最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。例えば、本発明の形質転換体を、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下で培養してもよい。ＨＤＡＣ阻害剤はヒストンのアセチル化レベルを上昇させるため、増幅した目的遺伝子が受けているエピジェネティックな発現抑制を解除することにより、目的遺伝子を高発現させることができる。

【0051】

ＨＤＡＣ阻害剤は、特に限定されるものではないが、例えば酪酸ナトリウム（Butyrate）、Trichostatin A（ＴＳＡ）、ＭＳ−２７５、Oxamflatin、ＤＭＳＯ等が挙げられる。中でも、ＨＤＡＣ阻害剤として、酪酸ナトリウムが好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤の培地への添加量については、本発明の形質転換細胞の生存および／または増殖に影響を与えない範囲内で、目的遺伝子の発現量が向上する添加量を検討の上、採用すればよい。

【0052】

〔３．哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキット〕
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットは、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損された、哺乳動物細胞の形質転換体を備えている。

【0053】

哺乳動物細胞の形質転換体については、〔２−１．本発明の形質転換体〕の欄にて説明した哺乳動物細胞の形質転換体を用いればよい。本実施の形態のキットに用いるＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損された、哺乳動物細胞の形質転換体の構成については、〔２−１．本発明の形質転換体〕の説明が援用可能である。

【0054】

本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域および哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域を具備するベクターを含まれていてもよい。このようなベクターの構成については、〔２−１．本発明の形質転換体〕の説明が援用可能である。

【0055】

本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能が欠損された、哺乳動物細胞を含み、当該哺乳動物細胞は、目的遺伝子が導入され、低酸素条件下にて培養されてもよい。

【0056】

また、本発明のキットには、形質転換に必要な機器や試薬、宿主となる哺乳動物細胞、その他取扱説明書等がさらに含まれていてもよい。

【0057】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【実施例】

【0058】

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0059】

〔実施例１〕
（ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３の形質転換体の培養）
実施例１では、哺乳動物細胞として神経内分泌細胞由来ヒト大腸がん細胞株であるＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（ＣＣＬ−２２０）（American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)から取得）のクローンであるＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３を用いた。ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３は、複数の染色体外遺伝因子（ＤＭ）を有している。ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３のＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させるため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとの複合体によって、細胞内でゲノムＤＮＡ上の任意の領域を切断し、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３の遺伝子破壊を行った。Ｃａｓ９タンパク質としては、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Feng Zhang氏提供）を用い、このＣａｓ９タンパク質のＢｂｓ Ｉサイトに、ヒトのＳＩＲＴ１遺伝子のガイドＲＮＡ（配列番号１）を挿入した。

【0060】

Cas9 Human Sirt1(67-87); GAGGCCGCGTCGTCCCCCGCCGG（配列番号１）
ガイドＲＮＡが標的染色体部位を認識し、ガイドＲＮＡにリクルートされたＣａｓ９が標的染色体部位を切断することで、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３のＳＩＲＴ１遺伝子を破壊した。ＣＯＬＯ ３２０ＤＭのＳＩＲＴ１遺伝子のゲノム配列については、配列番号２に示す。

【0061】

図１に、ＳＩＲＴ１遺伝子を破壊してＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させたＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３の各クローンサンプル（ノックアウト：ＫＯ）におけるウエスタンブロットの結果を示す。図１に示すように、ＳＩＲＴ１遺伝子を欠損させていないＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３のクローンサンプル（Ｎｏｎ−ＫＯ）と比較して、いずれのクローンサンプルでも、ＳＩＲＴ１遺伝子が破壊されていることが示された。

【0062】

続いて、実施例１に用いる目的遺伝子を有したベクターを作製した。図２に、ベクターの構造を示す。ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰは、目的遺伝子であるｄ２ＥＧＦＰと、ＭＡＲ（具体的にはＡＲ１、配列番号３）と、ＩＲ（具体的にはヒトｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子座由来の複製開始領域）と、が挿入されている。本実施例において、ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰは「Harada et al., J. Biol. Chem. vol.284, p24320-24327(2009)」に記載の方法で作製した。

【0063】

前記ベクターをＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３に導入した。具体的には、GenePORTER（登録商標）2 Transfection Reagent（Genlantis社製）を用いて、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３に導入し、続いて、ブラストサイジン（フナコシ社製）およびピューロマイシン（ナカライテスク社製）を用いて、薬剤同時選択を行った。ＳＩＲＴ１遺伝子を破壊し、前記ベクターを導入したＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３の培養は、ＲＰＭＩ １６４０培地へ１０％牛胎児血清（Biowest社製）を添加した培地中で、３７℃、通常の酸素濃度条件（２０％（ｖ/ｖ））で約３０日間行われた。

【0064】

（ｄ２ＥＧＦＰの増幅評価）
ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させた哺乳動物細胞の形質転換体で、目的遺伝子が増幅しているかを評価するため、ＦＩＳＨ法およびフローサイトメトリーを行った。ＦＩＳＨ法では、細胞に導入したものと同じプラスミドＤＮＡをＤＩＧ（ジゴキシゲニン：Digoxigein）標識したものをプローブとした。当該プローブを、形質転換体細胞から調製した染色体標本との間でハイブリダイゼーションを行ない、ハイブリダイズしたプローブを蛍光色素で検出した。このとき、ＤＡＰＩ染色も併せて行った。

【0065】

一方、フローサイトメトリーでは、細胞をリン酸バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒシステム（Becton Dickinson社製）を用いてｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度を解析した。サンプルとして、２ｍＭの酪酸ナトリウム中で最後の３日間培養したサンプルと、酪酸ナトリウムを使用していないサンプルとを準備して、それぞれ解析した。

【0066】

（結果）
図３に、ＦＩＳＨ法による、ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰを導入したＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３の形質転換体の染色像を示す。ＤＩＧ標識プローブの蛍光が観察された部分は、図３中の白色となっている部分である。ＤＩＧ標識プローブの蛍光は、染色体内で増幅したＨＳＲ（均一染色領域）および染色体外で増幅したＤＭとしてそれぞれ観察され、それぞれサイズの異なるＨＳＲおよびＤＭが存在した。

【0067】

図４に、形質転換体においてＨＳＲおよびＤＭが形成された頻度（すなわち「遺伝子増幅構造形成頻度」）を示す。ここでは、ＳＩＲＴ１遺伝子を破壊し、ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰを導入したＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３の形質転換体（ＫＯクローン：ｃｌ.１〜３、５、６）、および、これらの親株である、ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰを導入したＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３の形質転換体（ＷＴ）を用いた。

【0068】

また、図５にフローサイトメトリーの結果を示す。それぞれのサンプルについて、酪酸ナトリウムを使用しなかった場合（Butyrate(-)）と、酪酸ナトリウム中で培養した場合（Butyrate(+)）との結果を示す。なお、図中の数値はｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値を示している。この結果より、ＫＯ ｃｌ.１〜３、５、６のそれぞれのサンプルでは、ＷＴと比較してｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値が高くなることが示された。つまり、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体では、親株と比較して目的遺伝子の発現が大きく増加していることが示された。また、酪酸ナトリウム中で培養した場合においても、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体では、親株と比較して目的遺伝子の発現が大きく増加していることが示された。

【0069】

図６に、親株（ＷＴ）を培養した後、ＳＩＲＴ１阻害剤であるＥｘ−５２７を、培養液中に２μＭとなるように添加した際のフローサイトメトリーの結果を示す。ＳＩＲＴ１阻害剤であるＥｘ−５２７を添加しても、ｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度に変化は見られなかった。この結果より、遺伝子増幅後の細胞について、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を阻害しても、目的遺伝子の発現には影響しないことが示された。したがって、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させることで、目的遺伝子の発現が増加するメカニズムは、遺伝子増幅する過程で関与していることが示された。

【0070】

〔実施例２〕
（ＫＯクローンのｄ２ＥＧＦＰの発現量評価）
実施例１と同様のＫＯクローンを培養し、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させた哺乳動物細胞の形質転換体で、目的遺伝子のコピー数に対する発現率を評価するため、セルソータおよびリアルタイムＰＣＲを行った。

【0071】

セルソータによる測定では、ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）ＩＩＩ（Becton Dickinson社製）を用いて、ＫＯクローンおよび親株（ＷＴ）のそれぞれのサンプルを測定した。サンプルをセルソータで測定し、ＦＩＴＣ−Ａの値とＦＩＴＣ−Ｈの値とでプロットすることで、それぞれのｄ２ＥＧＦＰの発現量を評価した。各細胞株について、酪酸ナトリウム中で培養したサンプルと、酪酸ナトリウムを使用していないサンプルとを準備して、それぞれ評価した。

【0072】

一方、リアルタイムＰＣＲによる測定では、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）システム（Applied Biosystems社製）を用いて、細胞中のｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰのコピー数を解析した。解析には、ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰに含まれるＳＲαプロモーターの配列を用いた。上述したセルソータによって検出したｄ２ＥＧＦＰの発現量が上位１０％および下位１０％の各細胞集団におけるｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰのコピー数をそれぞれ解析した。

【0073】

（結果）
図７に、セルソータによる、ＫＯクローン（ＫＯ ｃｌ.１、６）および親株（ＷＴ）の形質転換体におけるｄ２ＥＧＦＰの発現量を示す。それぞれのサンプルについて、酪酸ナトリウムを使用しなかった場合（Butyrate(-)）と、酪酸ナトリウム中で培養した場合（Butyrate(+)）との結果を示す。なお、図中の数値はｄ２ＥＧＦＰの発現量が上位１０％（Ｈ）、ｄ２ＥＧＦＰの発現量が下位１０％（Ｌ）および全体の蛍光強度の平均値を示している。この結果より、ＫＯ ｃｌ.１、６のそれぞれのサンプルでは、ＷＴと比較してｄ２ＥＧＦＰの発現量が高くなることが示された。つまり、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体では、親株と比較して目的遺伝子の発現が大きく増加することが示された。また、酪酸ナトリウム中で培養した場合には、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体では、親株と比較して目的遺伝子の発現が、顕著に増加していることが示された。

【0074】

図８の左側のグラフに、リアルタイムＰＣＲによる、それぞれのサンプルにおけるｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰコピー数を示す。セルソータによって検出したｄ２ＥＧＦＰの発現量が、上位１０％（Ｈ）および下位１０％（Ｌ）のそれぞれの細胞集団について、酪酸ナトリウムを使用しなかった場合と、酢酸ナトリウム中で培養した場合とをそれぞれ解析した。その結果、ＫＯクローンおよびＷＴの形質転換体において、ｄ２ＥＧＦＰの発現量が上位１０％の細胞集団の方が、発現量が下位１０％の細胞集団よりもｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰのコピー数が高いことが示された。つまり、ｄ２ＥＧＦＰの発現量が高い細胞において、ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰのコピー数も高くなることが示された。

【0075】

また、図８の右側のグラフに、各サンプルにおけるｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰのコピー数に対するｄ２ＥＧＦＰの発現量の割合を示す。その結果、ＫＯ ｃｌ.１、６のそれぞれのサンプルでは、ＷＴと比較してｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰのコピー数に対するｄ２ＥＧＦＰの発現量の割合が高くなることが示された。つまり、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体では、目的遺伝子を含むプラスミドのコピー数に対する目的遺伝子の発現が大きく増加しており、細胞内で目的遺伝子の発現効率が増加していることが示された。また、酪酸ナトリウム中で培養した場合においては、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体における、目的遺伝子を含むプラスミドのコピー数に対する目的遺伝子の発現量の割合が、顕著に増加していることが示された。

【0076】

〔実施例３〕
（サブクローンのｄ２ＥＧＦＰの増幅評価）
実施例１と同様に培養されたＫＯクローンおよび親株から、１５以上のサブクローンを単離した。それぞれのサブクローンを、実施例１と同様にＦＩＳＨ法およびフローサイトメトリーによって評価した。

【0077】

（結果）
図９に、親株（ＷＴ）から分離したサブクローン（ＷＣ４、ＷＡ１、ＷＡ３、ＷＡ４）およびＫＯクローン（ＫＯ ｃｌ.１）から分離したサブクローン（ＫＨ１、ＫＥ５、ＫＦ３）の、それぞれのフローサイトメトリーの結果を示す。図９の染色像（Ｌａｒｇｅ ＤＭ）に示す通り、ＷＣ４はＷＴと、Ｌａｒｇｅ ＤＭの増幅量が同程度であった。また、ＫＨ１はＫＯ ｃｌ.１と、Ｌａｒｇｅ ＤＭの増幅量が同程度であった。また、図９の染色像（ｓｉｎｇｌｅ ｓｈｏｒｔ ＨＳＲ）に示す通り、ＷＡ１、ＷＡ３、ＷＡ４、ＫＥ５およびＫＦ３は、それぞれＷＴおよびＫＯ ｃｌ.１と、ＨＳＲの増幅量が同程度であった。これらの各サブクローンについて、酪酸ナトリウムを使用しなかった場合（Butyrate(-)）と、酪酸ナトリウム中で培養した場合（Butyrate(+)）との、フローサイトメトリーの結果を図９に示す。

【0078】

図９に示す通り、ＫＯ ｃｌ.１のそれぞれのサブクローンでは、ＷＴのサブクローンと比較してｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値が高くなることが示された。つまり、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体のサブクローンは、親株のサブクローンと比較して、目的遺伝子の発現が大きく増加していることが示された。すなわち、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させた細胞株は、継代を重ねても、安定的に目的遺伝子の発現が増加する形質を維持していることが示された。

【0079】

〔実施例４〕
（ＫＯクローンの低酸素条件におけるｄ２ＥＧＦＰの増幅評価）
実施例１と同様のＫＯクローンを、低酸素条件（３％（ｖ/ｖ））で培養した。その他の条件はすべて実施例１と同様である。培養したサンプルを、実施例１と同様にＦＩＳＨ法およびフローサイトメトリーによって評価した。

【0080】

（結果）
図１０に、ＫＯクローンを２０％の酸素濃度で培養したサンプル（２０％ＫＯ ｃｌ.１、３）および当該ＫＯクローンを３％の酸素濃度（低酸素条件下）で培養したサンプル（３％ＫＯ ｃｌ.１、３）内で、ＨＳＲおよびＤＭが形成された頻度を示す。２０％ＷＴおよび３％ＷＴは、親株（ＷＴ）をそれぞれの酸素濃度で培養したサンプルである。

【0081】

また、図１１にフローサイトメトリーの結果を示す。この結果より、３％ＫＯ ｃｌ.１および３％ＫＯ ｃｌ.３のそれぞれのサンプルでは、２０％ＷＴおおよび３％ＷＴと比較してｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値が高くなることが示された。また、３％ＫＯ ｃｌ.１、３のそれぞれのサンプルでは、２０％ＫＯ ｃｌ.１、３と比較してｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値が高くなることが示された。したがって、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体を低酸素条件で培養すると、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損した形質転換体を通常の酸素濃度で培養したサンプルと比較して、目的遺伝子の発現が大きく増加していることが示された。すなわち、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させ、さらに低酸素条件で培養することで、目的遺伝子の発現を相乗的に増加させることができると示された。

【0082】

さらに、図１２に、低酸素条件で培養したサンプルであるＫＯ ｃｌ.１を、通常の酸素濃度に戻して培養を続けた際のフローサイトメトリーの結果を示す。通常の酸素濃度に戻しても、７日間では目的遺伝子の発現量にあまり変化がみられなかった。つまり、低酸素条件下で形質転換体を培養することで、該形質転換体は目的遺伝子の発現が高い状態となり、その後に通常の酸素濃度に戻しても、当該発現が高い状態は維持されることが示された。

【0083】

〔実施例５〕
（ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させたＣＨＯ ＤＧ４４におけるｄ２ＥＧＦＰの増幅評価）
実施例５では、哺乳動物細胞としてチャイニーズハムスターの卵巣から樹立された正常不死化線維芽細胞株であるＣＨＯ ＤＧ４４（コロンビア大学のLawrence Chasin先生提供）を用いた。ＣＨＯ ＤＧ４４のＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させるため、Ｃａｓ９タンパク質としては、pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0（Feng Zhang氏から提供）を用い、このＣａｓ９タンパク質のＢｂｓ Ｉサイトに、ハムスターのＳＩＲＴ１遺伝子のガイドＲＮＡ（配列番号４、５）をそれぞれ挿入し、２種類のサンプルを作成した。

【0084】

Cas9 CHO SIRT1 (213-235); AACAATCCCTCCACCTGAGTTGG（配列番号４）
Cas9 CHO SIRT1 (230-252); AGTTGGATGATATGACACTGTGG（配列番号５）
それぞれのガイドＲＮＡが標的染色体部位を認識し、ガイドＲＮＡにリクルートされたＣａｓ９が標的染色体部位を切断することで、ＣＨＯ ＤＧ４４のＳＩＲＴ１遺伝子を破壊した。ＣＨＯ ＤＧ４４のＳＩＲＴ１遺伝子のゲノム配列については、配列番号６に示す。

【0085】

ＳＩＲＴ１遺伝子を破壊したＣＨＯ ＤＧ４４に、ベクターとしてｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰを導入し、実施例１と同様に培養した。培養したサンプルを、フローサイトメトリーで評価した。

【0086】

（結果）
図１３にフローサイトメトリーの結果を示す。２種類のガイドＲＮＡによって１か所ずつＳＩＲＴ１遺伝子が破壊されたＣＨＯ ＤＧ４４に、ｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰを導入した形質転換体（Ｃａｓ９（２３０−２５２）およびＣａｓ９（２１３−２３５））は、親株であるｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰを導入したＣＨＯ ＤＧ４４の形質転換体（ＷＴ）と比較して、目的遺伝子の発現が大きく増加していることが示された。すなわち、ＳＩＲＴ１遺伝子の機能を欠損させることで目的遺伝子の発現が増加することは、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ＃３に限られず、様々な哺乳動物細胞において適用されることが示された。

【0087】

〔実施例６〕
（低酸素条件で培養したＣＨＯ ＤＧ４４における目的遺伝子の増幅評価）
実施例６では、哺乳動物細胞としてＣＨＯ ＤＧ４４を使用した。ベクターとしてｐΔＢＭ ｄ２ＥＧＦＰを導入し、複数の酸素濃度条件で培養した。サンプルａは通常の酸素濃度条件（２０％（ｖ/ｖ））で、サンプルｂは低酸素条件（５％（ｖ/ｖ））で、サンプルｃは酸素濃度を０％（ｖ／ｖ）として６時間培養する期間を間歇的に入れ込む条件で、それぞれ培養した。サンプルｃでは、酸素濃度が０％（ｖ／ｖ）で培養する期間以外は通常の酸素濃度（２０％（ｖ/ｖ））で培養した。それぞれ、酪酸ナトリウム中で最後の３日間培養したサンプルと、酪酸ナトリウムを使用していないサンプルとを作製し、フローサイトメトリーで解析した。

【0088】

（結果）
図１４に、フローサイトメトリーから算出した、それぞれのサンプルにおけるｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度の平均値を示す。この結果より、サンプルａと比較して、サンプルｂおよびサンプルｃの方が目的遺伝子の発現が増加することが示された。よって、通常の酸素濃度で培養するよりも、低酸素濃度で培養することで、目的遺伝子の発現が増加することが示された。

【0089】

さらに、それぞれのサンプルから１５個のクローン細胞を取得し、それぞれについてｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度をフローサイトメトリーで解析した。その結果、サンプルａに比べて、サンプルｂおよびサンプルｃの方が、ｄ２ＥＧＦＰの蛍光強度が高いクローンが得られた。すなわち、低酸素濃度で培養することで、これらのクローン細胞も目的遺伝子の発現が高い状態となることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0090】

本発明の一態様は、所望のタンパク質（例えば、有用タンパク質）を大量に生産することが所望される分野、例えば、医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等の種々広範な産業において利用可能である。また、本発明の一態様は、染色体の特定の部位で目的遺伝子の増幅が所望される分野、例えば、遺伝子治療等の分野において利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]