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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5666161
(24)【登録日】2014年12月19日
(45)【発行日】2015年2月12日
(54)【発明の名称】ヘチマ及び一酸化窒素産生物質を含有する飲食物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/42 20060101AFI20150122BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20150122BHJP
A61K 8/97 20060101ALI20150122BHJP
A61K 8/44 20060101ALI20150122BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20150122BHJP
A61P 27/04 20060101ALI20150122BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20150122BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20150122BHJP
A23L 1/30 20060101ALN20150122BHJP
A23L 1/305 20060101ALN20150122BHJP
A23L 2/52 20060101ALN20150122BHJP
【ＦＩ】
A61K35/78 S
A61K31/198
A61K8/97
A61K8/44
A61P1/02
A61P27/04
A61P17/16
A61Q19/08
!A23L1/30 B
!A23L1/30 Z
!A23L1/305
!A23L2/00 F
【請求項の数】3
【全頁数】17
(21)【出願番号】特願2010-86686(P2010-86686)
(22)【出願日】2010年4月5日
(65)【公開番号】特開2011-219373(P2011-219373A)
(43)【公開日】2011年11月4日
【審査請求日】2013年2月6日
(73)【特許権者】
【識別番号】000006116
【氏名又は名称】森永製菓株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100086689
【弁理士】
【氏名又は名称】松井 茂
(72)【発明者】
【氏名】木下 洋輔
(72)【発明者】
【氏名】栗田 郁子
(72)【発明者】
【氏名】木藤 圭次朗
(72)【発明者】
【氏名】斎 政彦
【審査官】
鶴見 秀紀
(56)【参考文献】
【文献】
特開昭６０−２１４７４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０４−０２９９１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００１−３３５４９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００９／０９９９９８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開平０６−０３８７０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００７／００４５２３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８
Ａ６１Ｋ ３１／１９８
Ａ６１Ｋ ８／４４
Ａ６１Ｋ ８／９７
Ａ６１Ｐ １／０２
Ａ６１Ｐ １７／１６
Ａ６１Ｐ ２７／０４
Ａ６１Ｑ １９／０８
Ａ２３Ｌ １／３０
Ａ２３Ｌ １／３０５
Ａ２３Ｌ ２／５２
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヘチマ及び／又はその加工物と、シトルリン及び／又はその塩とを有効成分として含有することを特徴とするドライシンドロームの改善剤。
【請求項2】
前記ヘチマが、食用へちま(Luffa aegyptiaca)、又はへちま(Luffa cylindrica)である請求項１記載のドライシンドロームの改善剤。
【請求項3】
ドライシンドロームの改善が肌の潤いの改善である請求項１又は２記載のドライシンドロームの改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ドライシンドロームの改善効果を有する、ヘチマ及び一酸化窒素産生物質を含有する飲食物に関する。
【背景技術】
【0002】
ドライシンドローム（乾燥症症候群）とは、生活環境の問題などから体の様々な部位に生じる乾燥現象のことである。その代表的な疾患としては、ドライマウス（口腔乾燥症）、ドライアイ（乾き眼）、ドライスキン（皮膚乾燥症）などがある。ドライマウスでは、唾液分泌が低下し、口腔内が乾き、ねばねばするなどの不快感、ウ蝕、歯周病、口臭、味がわかりにくい、睡眠障害などの症状を伴う。また、ドライアイでは、眼の乾き、眼の痛み、眼の充血、眼の不快感といった症状を伴う。また、ドライスキンでは、皮膚の水分や皮脂量が不足して、皮膚が乾燥した状態になる。ドライアイ・ドライマウスには推定800万人患者がいるとも言われている。これらの症状は生活者のＱＯＬ（Quality of Life）を著しく低下させる要因となるので、適当な処置によって改善されることが望ましい。
【0003】
特に、ドライスキンは、顔や手足のかさつきなどからくる見た目への影響ばかりではなく、痒みによるＱＯＬの低下が著しい。このような皮膚乾燥の症状に対しては、従来、加湿したり、保温したり、外用剤を塗布したりするなどの対処方法が一般的であった。例えば、ウリ科植物であるヘチマから採られたへちま水などが、民間薬として、創傷治癒や物理的な水分の蒸発を防ぐ効果のある皮膚外用剤に用いられてきた。
【0004】
一方、生体内では、一酸化窒素（ＮＯ）が生理機能物質として機能している。その一酸化窒素（ＮＯ）は、ＮＯ合成酵素によってアルギニンからシトルリンが生成する際に生成する。従来、一酸化窒素の生理機能と病態発現の関係に関する研究が盛んに行われており、現在までに、体内の全体又は所定の体内部位において一酸化窒素を増加させることにより、狭心症または心筋梗塞等の虚血性心疾患、脳梗塞、動脈硬化性動脈閉塞症、種々の感染症、インポテンツ等の疾病が改善され、又は治療されることなどが報告されている（下記特許文献１参照）。
【0005】
しかしながら一酸化窒素を増加させることにより、上記ドライシンドロームの症状の改善がみられるとの報告はなかった。また、ヘチマ成分が生体に与える生理的効果と一酸化窒素産生物質が生体に与える生理的効果との関連を明らかにする報告もなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開平７−３２４０３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、ドライマウス、ドライアイ、ドライスキンなどのドライシンドロームの症状に対する改善効果があり、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、ドライシンドロームの改善用組成物、ドライスキンの改善用組成物、肌の潤い改善用組成物などに利用できる、飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、ヘチマと一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とを併用することにより、それらの相乗的な生理的効果によって、生体細胞の水透過機能を亢進させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。［１］ヘチマ及び／又はその加工物と、一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とを含有する飲食物。
［２］前記ヘチマが、食用へちま(Luffa aegyptiaca)、又はへちま(Luffa cylindrica)である［１］記載の飲食物。
［３］前記一酸化窒素（ＮＯ）産生物質が、シトルリン、アルギニン、アルギニノコハク酸、又はこれらの塩である［１］又は［２］記載の飲食物。
［４］前記ヘチマ及び／又はその加工物を０．２５〜６２質量％含有し、前記一酸化窒素（ＮＯ）産生物質を０．５〜３８質量％含有する［１］〜［３］のいずれか１つに記載の飲食物。
［５］ドライシンドロームの改善のために用いられる［１］〜［４］のいずれか１つに記載の飲食物。
［６］ドライシンドロームの改善が肌の潤いの改善である［５］記載の飲食物。
【発明の効果】
【0010】
本発明の飲食物によれば、ヘチマと一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とを併用することにより、それらの相乗的な生理的効果によって、生体細胞の水透過機能を亢進させることができるので、ドライマウス、ドライアイ、ドライスキンなどのドライシンドロームの症状を改善することができる。特に、肌の潤いの改善効果に優れている。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】食用へちまの摂取による肌の潤いの改善効果を調べた結果を示す図表である。
【図2】シトルリンの摂取による肌の潤いの改善効果を調べた結果を示す図表である。
【図3】食用へちまとシトルリンとの併用摂取による肌の潤いの改善効果を調べた結果を示す図表である。
【図4】MDCK I単層細胞のドーム形成の顕微鏡写真とその概略概念図である。
【図5】NO刺激時におけるドーム形成数(number of domes/field)の増加を示す図表である。
【図6】NO消去剤によるNO刺激阻害時におけるドーム形成数(number of domes/field)の抑制を示す図表である。
【図7】食用へちま及びNO産生剤によるMDCK I細胞のドーム形成促進効果を調べたときの顕微鏡写真である。
【図8】食用へちま及びNO産生剤によるドーム形成数(number of domes/field)の増加を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明においては、含有成分の１つとしてヘチマ及び／又はその加工物を用いる。
【0013】
ヘチマはウリ科の植物であり、その植物ヘチマからの採取物としては、蔓、葉、茎、花、果実、地下部、植物樹液などが挙げられるが、本発明においてはこれらのいずれを用いてもよく、これらの複数又は全部を用いてもよい。特に、食用へちまの可食部（果実）は、食経験があるので好ましい。ヘチマの種類としては、食用へちま(Luffa aegyptiaca)、へちま(Luffa cylindrica)などを例示できる。
【0014】
本発明で用いられるヘチマ及び／又はその加工物の形態としては、植物ヘチマからの採取物をそのまま用いてもよく、適当な大きさに細分化したものやその乾燥物、又はその粉砕物などを用いることができる。また、溶剤抽出、水蒸気蒸留などの手段によって抽出した抽出物、その乾燥物、又はその粉砕物なども用いることができる。植物ヘチマからの採取物をそのまま用いるという観点、ならびに他の配合材料との混合のしやすさの観点からは、後述する実施例で用いられた食用へちまの可食部の凍結乾燥物であって、これを粉体の形態に製したものを用いることが好ましい。
【0015】
本発明においては、含有成分の他の１つとして一酸化窒素（ＮＯ）産生物質を用いる。
【0016】
本発明において、一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とは、例えば、経口摂取したり、点眼したり、外用剤として皮膚に塗布したりすることによって、生体内で一酸化窒素の産生を促進する効果を有する物質を意味する。
【0017】
一酸化窒素を産生する物質としては、例えばシトルリン、アルギニン、アルギニノコハク酸、又はこれらの塩、もしくは生体に摂取したときにこれらの物質に変換されるこれらの前駆物質などが好ましく例示できる。すなわち生体内での一酸化窒素の生成は、下記の概念式により表される反応サイクルを経て起こるので、その反応サイクルの中間体物質を摂取すれば、その反応サイクルを経て一酸化窒素が生成する。
【0018】
【化1】
【0019】
特にシトルリンは肝臓などでの分解、代謝、排泄を受けずに、目的とする体内部位に到達するので好ましい。なお、シトルリンは、海外ではOTC薬として古くから用いられており、2007年に日本で食品として認可されたアミノ酸の一種であり、スイカなどの瓜科植物に多く含まれている。強い日差しと極度に乾燥した過酷な環境で自生する野生種スイカにはシトルリンが特に多く含有しており、シトルリンが乾燥環境を生き抜くのに大きな役割を果たしていると考えられる。
【0020】
なお、一酸化窒素（ＮＯ）産生物質としては、例えば特開平７−３２４０３９号に記載された虎杖根、黄耆、蛇床子、麦芽、桑白皮、粳米、山椒、浮ひょう、姜黄、延胡索、牡蛎、益母草、青木香、人参および黄ごんより選ばれる１種または２種以上の生薬またはその抽出物などを用いることもできる。
【0021】
後述する実施例で示されるように、ヘチマと一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とを併用摂取することにより、それらの相乗的な生理的効果によって、生体細胞の水透過機能を亢進させることができる。特に肌の潤いの改善効果に優れている。したがって、これをドライマウス、ドライアイ、ドライスキンなどのドライシンドロームの症状の改善のために利用することができる。
【0022】
本発明を、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品などとして利用する場合には、その飲食物としては、例えば、チョコレート、ビスケット、ガム、キャンディー、クッキー、グミ、打錠菓子等の菓子類；シリアル；粉末飲料、清涼飲料、乳飲料、栄養飲料、炭酸飲料、ゼリー飲料等の飲料；アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓が挙げられる。更に、そば、パスタ、うどん、そーめん等の麺類も好ましく例示できる。また、特定保健用食品や栄養補助食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット、糖衣錠等の形態のものであってもよい。また、ドライシンドロームの改善用組成物、ドライスキンの改善用組成物、肌の潤い改善用組成物などとして利用する場合には、必要に応じて、基材や担体を添加して、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ゼリー状剤等の経口剤とすることができる他、点眼剤等の眼用外用剤や、軟膏剤、クリーム剤、ジェル、パック、化粧水、化粧料等の皮膚用外用剤として製品化することができる。
【0023】
ヘチマと一酸化窒素（ＮＯ）産生物質との相乗的な生理的効果を有効に発揮するためには、上記飲食物又は組成物中に、ヘチマ及び／又はその加工物を０．２５〜６２質量％含有させ、一酸化窒素（ＮＯ）産生物質を０．５〜３８質量％含有させることが好ましい。
【0024】
ヘチマ及び／又はその加工物と一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とは、これを経口的に併用摂取して、体の中から作用させてもよく、あるいは、体の外から外用的に作用させるようにしてもよい。以下には、後述する実施例で用いられた食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物と、シトルリンとを用いる態様について説明する。
【0025】
・ ドライマウス食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物と、シトルリンとを経口的に併用摂取し、あるいは一定時間口腔内に留まるようにして唾液の分泌経路に直接作用させることにより、ドライマウス改善効果を得ることができる。経口的に摂取する場合の摂取量は、大人１日あたり食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物を、食用へちまの可食部の乾燥固形物換算で１００〜５０００ｍｇ程度、且つ、シトルリンを２００〜３０００ｍｇ程度とすることが好ましい。もっとも、飴、トローチ、チューアブル錠、マウスウォッシュ等の口腔用外用剤に製したものを一定時間口腔内に留まるようにして唾液の分泌経路に直接作用させるようにしてもよい。その適用量は、飴、トローチ、チューアブル錠等の場合には、その組成物に食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物を、食用へちまの可食部の乾燥固形物換算で０．２５〜６２質量％程度含有させ、且つ、シトルリンを０．５〜３８質量％程度含有させて適用することが好ましい。また、マウスウォッシュ等の場合には、その組成物に食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物を、食用へちまの可食部の乾燥固形物換算で０．００５〜３５質量％程度含有させ、且つ、シトルリンを０．０１〜２０質量％程度含有させて適用することが好ましい。
【0026】
・ ドライアイ食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物と、シトルリンとを経口的に併用摂取し、あるいは眼用外用剤として点眼投与することにより、涙液の分泌が促進され、ドライアイの改善効果を得ることができる。経口的に摂取する場合の摂取量は、大人１日あたり食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物を、食用へちまの可食部の乾燥固形物換算で１００〜５０００ｍｇ程度、且つ、シトルリンを２００〜３０００ｍｇ程度とすることが好ましい。点眼剤等の眼用外用剤として点眼投与する場合の適用量は、１日１〜６回程度の使用で１回の使用に際して、食用へちまの可食部の抽出物であって眼用外用剤に適する形態に製したものを、食用へちまの可食部の乾燥固形物換算で１００〜５０００ｍｇ程度、且つ、シトルリンを０．００５〜１０ｍｇ程度を適用することが好ましい。
【0027】
・ ドライスキン食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物と、シトルリンとを経口的に併用摂取し、あるいは皮膚外用剤として皮膚に塗布することにより、肌の潤いを増大させて、ドライスキン改善効果を得ることができる。経口的に摂取する場合の摂取量は、大人１日あたり食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物を、食用へちまの可食部の乾燥固形物換算で１００〜５０００ｍｇ程度、且つ、シトルリンを２００〜３０００ｍｇ程度とすることが好ましい。また、軟膏剤、クリーム剤、ジェル、パック、化粧水、化粧料等の皮膚用外用剤に製したものを一定時間適用箇所に留まるようにして皮膚に直接作用させるようにしてもよく、その場合の適用量は、食用へちまの可食部の凍結乾燥物又はその抽出物を、食用へちまの可食部の乾燥固形物換算で単位面積あたり一回1.0〜50 mg/ｃm2程度、且つ、シトルリンを2.5〜30 mg/ｃm2程度を適用することが好ましい。
【実施例】
【0028】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【0029】
＜試験例１＞ 食用へちまの摂取が肌の潤いにどのような効果を及ぼすかを調べた。
（１）試験サンプルの調製
肌評価試験を行うための試験サンプルとして、食用へちま凍結乾燥物（食用へちま可食部、沖縄産）を乳鉢で粉砕して、その0.5g又は1.Ogとデキストリンとを混合し、それぞれ計3gの粉末状組成物を調製した。また、デキストリン3gをプラセボとした。表1には各試験サンプルの配合と肌評価試験の試験群との関係を示す。
【0030】
【表1】
【0031】
（２）肌評価試験健康な男女13名のボランティアを、食用へちま低用量(0.5g)群４名、食用へちま高用量(1.Og)群５名、プラセボ群４名に群分けし、試験サンプル又はデキストリン（プラセボ群）を、１日１回、５日間、水と共に服用してもらい、肌水分合量への効果を調べた。試験は単盲検並行群間比較にて行った。また、肌水分合量の測定は、試験開始前と試験終了後に、肌水分含量測定器(「Triplesense」株式会社モリテックス製)で前腕部の肌水分合量(100段階評価)を測定することにより行い、試験前の水分値を100とした時の摂取後の肌水分合量の変化率(%)として評価した。その結果を図１Ａに示す。また、図１Ｂには、その結果を、プラセボ摂取後の肌水分合量の変化率を１とした肌水分改善度(倍)として示す。
【0032】
（３）結果・まとめデキストリン（プラセボ群）、又は食用へちま凍結乾燥物(0.5g又は1.0g)を５日間摂取することにより、それぞれ78.4%、97.0%、104.1%の肌水分合量の変化率であった。また、プラセボ群と比較して、食用へちま低用量(0.5g)群において1.2倍、食用へちま高用量(1.Og)群において1.3倍の肌水分改善度であった。以上により、食用へちま凍結乾燥物を摂取することにより、肌水分が改善され、肌の潤いの改善効果が期待できることが明らかとなった。
【0033】
＜試験例２＞ シトルリンの摂取が肌の潤いにどのような効果を及ぼすかを調べた。
（１）試験サンプルの調製
肌評価試験を行うための試験サンプルとして、シトルリン（協和発酵バイオ株式会社製）の0.4g、0.8g又は1.6gとデキストリシとを混合し、それぞれ計3gの粉末状組成物を調製した。また、デキストリン3gをプラセボとした。表２には各試験サンプルの配合と肌評価試験の試験群との関係を示す。
【0034】
【表2】
【0035】
（２）肌評価試験健康な男女13名のボランティアを、シトルリン低用量(0.4g)群４名、シトルリン中用量(0.8g)群３名、シトルリン高用量(1.6g)群３名、プラセポ群３名に群分けし、試験サンプル又はデキストリン（プラセボ群）を、１日１回、５日間、水と共に服用してもらい、肌水分合量への効果を調べた。試験は単盲検並行群間比較にて行った。また、肌水分合量の測定は、試験開始前と試験終了後に、肌水分含量測定器(「Triplesense」株式会社モリテックス製)で前腕部の肌水分合量(100段階評価)を測定することにより行い、試験前の水分値を100とした時の摂取後の肌水分合量の変化率(%)として評価した。その結果を図２Ａに示す。また、図２Ｂには、その結果を、プラセボ摂取後の肌水分合量の変化率を１とした肌水分改善度(倍)として示す。
【0036】
（３）結果・まとめデキストリン（プラセボ群）、又はシトルリン(0.4g、0.8g、又は1.6g)を５日間摂取することにより、それぞれ80.5%、96.3%、83.2%、85.7%の肌水分合量の変化率であった。また、プラセボ群と比較して、シトルリン低用量(0.4g)群において1.2倍、シトルリン中用量(0.8g)群において0.9倍、シトルリン高用量(1.6g)群において1.0倍の肌水分改善度であった。以上により、シトルリン低用量(0.4g)群において肌水分が改善され、肌の潤いの改善効果が期待できることが明らかとなったが、シトルリン中用量(0.8g)群又はシトルリン高用量(1.6g)群では、さらなる改善が見られずむしろプラセボ群と同様に改善効果を示さなかった。したがって、シトルリンによる肌の潤いの改善効果はシトルリンの低用量域において既にプラトーに達していると考えられた。
【0037】
＜試験例３＞ 食用へちまとシトルリンとの併用摂取が肌の潤いにどのような効果を及ぼすかを調べた。
（１）試験サンプルの調製
肌評価試験を行うための試験サンプルとして、上記食用へちま凍結乾燥物、シトルリン、デキストリンを下記表３に示される配合で混合して、それぞれ計3gの粉末状組成物を調製した。また、デキストリン3gをプラセボとした。表３には各試験サンプルの配合と肌評価試験の試験群との関係を示す。
【0038】
【表3】
【0039】
（２）肌評価試験健康な男女17名のボランティアを、シトルリン群４名、食用へちま群４名、食用へちま＋シトルリン群５名、プラセボ群４名に群分けし、試験サンプル又はデキストリン（プラセボ群）を、１日１回、５日間、水と共に服用してもらい、肌水分合量への効果を調べた。試験は単盲検並行群間比較にて行った。また、肌水分合量の測定は、試験開始前と試験終了後に、肌水分含量測定器(「Triplesense」株式会社モリテックス製)で前腕部の肌水分合量(100段階評価)を測定することにより行い、試験前の水分値を100とした時の摂取後の肌水分合量の変化率(%)として評価した。その結果を図３Ａに示す。また、図３Ｂには、その結果を、プラセボ摂取後の肌水分合量の変化率を１とした肌水分改善度(倍)として示す。
【0040】
（３）結果・まとめデキストリン（プラセボ群）、又はシトルリン(0.4g)、食用へちま凍結乾燥物(0.5g)、「食用へちま凍結乾燥物(0.5g)＋シトルリン(0.4g)」を５日間摂取することにより、それぞれ82.3%、105.3%、101.4%、136.4%の肌水分合量の変化率であった。また、プラセボ群と比較して、シトルリン群において1.28倍、食用へちま群において1.23倍、食用へちま＋シトルリン群において1.66倍の肌水分改善度であった。なお、一般にへちまに含まれるシトルリン量は0.057質量％程度であり、上記食用へちま凍結乾燥物による効果はシトルリンによるものではないことは明らかであった。
【0041】
上記試験例１及び試験例２においては、シトルリン0.4g摂取により肌水分改善度がプラトーに達しており、食用へちま凍結乾燥物0.5g摂取により肌水分改善度がほぼプラトーに達していた。したがって、これらの単独で摂取量を高めても、更なる肌の潤いの改善効果は期待できなかった。これに対し、試験例３において、食用へちま凍結乾燥物及びシトルリンを併用することにより、著しく肌水分値が改善しており(プラセボ比1.66倍)、相乗的に肌の潤いの改善効果が発揮されることが示された。
【0042】
したがって、ヘチマと一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とを併用することにより、それらの相乗的な生理的効果によって、顕著に優れた肌の潤いの改善効果が得られるものと考えられた。
【0043】
＜試験例４＞ 一酸化窒素産生物質によるNO刺激が、生体細胞の水透過機能にどのような影響を与えるかを、培養細胞を用いて調べた。そのための培養細胞としてはMDCK I細胞を用いた。MDCK I（Madin-Darby Canine Kidney）細胞はイヌ腎由来細胞であり、プレート上で細胞が単層シート状になる。そしてこれに刺激が加わることにより、一部細胞がアーチ状に盛り上がり、培養プレートと単層細胞の隙間に細胞内外の塩や水が流れ込み溜まった”ドーム”を形成することが知られていた（図４にはそのドーム形成の顕微鏡写真とその概念図を示す。）。したがって、このようなドーム形成が促進されれば、細胞の水透過機能の亢進を評価できると考えた。具体的には以下のようにして試験を行った。
【0044】
[細胞の培養]DSファーマバイオメディカル株式会社より購入したイヌ腎臓由来のMDCK I細胞を、常法に従い、10% FBSを含むMEM 培地(GIBCO製)で37℃の5%CO2環境で培養した。なお、その培地には100 U/mlペニシリンと100 mg/mlストレプトマイシンを添加した。
【0045】
[NO刺激によるドーム形成試験]24穴培養プレートに2.5 X 105 cells/wellの細胞密度で上記MDCK I細胞を播種し、コンフルエントに達したことを確認した。NO刺激のための一酸化窒素産生物質としては、NO産生剤であるNOC18(株式会社同仁化学研究所製)を用いた。このNOC18を10 mM NaOHに溶解し終濃度0, 0.05, 0.1, 0.2 ,0.5 mMとなるように、上記コンフルエントに達した細胞に添加した。37℃の5% CO2環境で20時間インキュベートした後、位相差顕微鏡(40倍)により観察し、一辺50 mmの正方形を超える大きさのものを一視野あたりのドーム形成数(number of domes/field)として計数した。図５にはその結果をグラフで示す。
【0046】
[NO消去剤によるNO刺激阻害]NO消去剤によりNOを消去した際のドーム形成への影響を調べた。具体的には、NOと選択的に反応してNO2を生成し、NOを消去する試薬であるCarboxy-PTIO（2-(4-Carboxyphenyl)-4, 4, 5, 5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）(株式会社同仁化学研究所製)を、上記コンフルエントに達した細胞に終濃度0.1, 0.2, 0.4 mMで添加した後、NOC18を終濃度0.2 mMとなるように添加し、37℃の5% CO2環境で20時間インキュベートした。そして上記と同様にしてドーム形成数を計数した。図６にはその結果をグラフで示す。
【0047】
［結果・まとめ］ NO産生剤であるNOC18をMDCK I 細胞に添加することで、濃度依存的にドーム形成数の増加が見られた（図５）。NOC18によるNOをCarboxy-PTIO により消去した結果、Carboxy-PTIO濃度依存的にドーム形成が抑制された（図６）。したがって、MDCK I単層細胞のドーム形成が、NO刺激により亢進していることが明らかとなった。
【0048】
＜試験例５＞ 食用へちま及びNO産生剤がMDCK I細胞のドーム形成にどのような効果を及ぼすかを調べた。
（１）食用へちま抽出物の調製
食用へちま凍結乾燥物（食用へちま可食部、沖縄産）の10.8gについて、ミルミキサーで粉砕後、80%エタノール200mLで2時間攪拌抽出を行った。得られた抽出液についてグラスフィルターによるろ過を行い、そのろ液についてエバポレーターによりエタノールを除去し、残留した水溶液18mLにさらに水32mLを加えた。この水溶液について、酢酸エチル100mLを用いて2回液液分配を行い、酢酸エチル相を回収して濃縮した結果、脂溶性物質146.9mgを得た。これを食用へちま抽出物として下記の試験に供した。なお、通常、酢酸エチルなどの有機溶媒ではたんぱく質は抽出されず、得られた抽出物には一酸化窒素合成酵素(NOS)などが含有していることは考え難かった。また、混入していたとしても有機溶媒による処理により変性し、失活していると考えられた。
【0049】
（２）ドーム形成実験上記試験例４と同様にして、MDCK I細胞のドーム形成実験を行った。すなわち、24穴培養プレートにMDCK I細胞を2.5 X 105cells/wellの細胞密度となるように播種し、24時間後コンフルエントに達したことを確認した。その後培地を、NOC18を0.2 mM含有する培地、あるいは上記へちま抽出物を1 mg/mL含有する培地、又はNOC18の0.2 mMと上記へちま抽出物の1 mg/mLとを同時に含有する培地に交換した。なお、上記食用へちま抽出物はDMSOに溶解させた後、食用へちま抽出物が1 mg/mLとなり、培地中のDMSO量が培地1mLにつき1%となるように揃えて培地に加えた。37℃, 5% CO2環境下でインキュベートし、21時間後、位相差顕微鏡による観察(X 40)の後、一辺50 mmの正方形を超える大きさのものを一視野あたりのドーム(number of domes/field)として計数した。図７にはその顕微鏡写真を示し、図８にはそのドーム形成数の結果を示す。
【0050】
（３）結果・まとめ図７，８に示されるように、何も添加しないコントロールではドームが形成しなかったのに対して、NOC18を0.2 mM含有する培地では、一視野あたり１８個のドームが形成し、へちま抽出物を1 mg/mL含有する培地では、一視野あたり５１個のドームが形成していた。更に、NOC18の0.2 mMとへちま抽出物の1 mg/mLとを同時に含有する培地では、一視野あたり１２３個のドームが形成し、相乗的にドーム形成が亢進していた。
【0051】
このようなドーム形成が促進されれば、細胞の水透過機能を亢進できると考えられた。したがって、ヘチマと一酸化窒素（ＮＯ）産生物質とを併用することにより、それらの相乗的な生理的効果によって、生体細胞の水透過機能を亢進させて、ドライマウス、ドライアイ、ドライスキンなどのドライシンドロームの症状を改善する効果が得られるものと考えられた。