特許 5672892 リガンド固定化用共重合体及び該共重合体によるリガンドの固定化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5672892

(24)【登録日】2015年1月9日

(45)【発行日】2015年2月18日

(54)【発明の名称】リガンド固定化用共重合体及び該共重合体によるリガンドの固定化方法

(51)【国際特許分類】

   C08F 220/28 20060101AFI20150129BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20150129BHJP

   C08F 220/58 20060101ALI20150129BHJP

【ＦＩ】

   C08F220/28

   C12N5/00 202

   C08F220/58

【請求項の数】7

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2010-210621(P2010-210621)

(22)【出願日】2010年9月21日

(65)【公開番号】特開2011-84739(P2011-84739A)

(43)【公開日】2011年4月28日

【審査請求日】2013年9月17日

(31)【優先権主張番号】特願2009-216783(P2009-216783)

(32)【優先日】2009年9月18日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】803000115

【氏名又は名称】学校法人東京理科大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000006035

【氏名又は名称】三菱レイヨン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(72)【発明者】

【氏名】大塚 英典

(72)【発明者】

【氏名】上野 耕治

【審査官】 河野 隆一朗

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０４／０５６８９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０８−３１７７８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−３１９３１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−１９９８８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−２２７４４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０１３２７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２６４０７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−３２６０４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３２３８５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１５９９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２８２７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２００４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５１０５９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５１３１３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３７８１３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｆ ６／００ − ２４５／００

Ｃ０８Ｆ ２９０／００ − ２９０／１４

Ｃ０８Ｆ ２５１／００ − ２８３／００

Ｃ０８Ｆ ２８３／００ − ２８９／００

Ｃ０８Ｆ ２９１／００ − ２９７／０８

Ｇ０１Ｎ ３０／８８

Ｂ０１Ｊ ２０／２６

Ｃ１２Ｎ １／００ − ７／０８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

反応性基（ａ）を有する担体の表面にリガンドを固定化するための、鎖状構造を有する共重合体であって、
前記反応性基（ａ）と化学的に結合可能な反応性基（ｂ）を有するモノマー（Ａ）が単独で重合するか、又は前記モノマー（Ａ）と他のモノマーとが共重合してなるセグメント（Ａ）を前記共重合体の主鎖の一端に有するとともに、前記リガンドを有するモノマー（Ｂ）が単独で重合するか、又は前記モノマー（Ｂ）と他のモノマーとが共重合してなるセグメント（Ｂ）を前記共重合体の主鎖の他端に有し、
前記反応性基（ａ）及び前記反応性基（ｂ）のいずれか一方がアジド基であり、他方がアルキニル基であるか、又は前記反応性基（ａ）及び前記反応性基（ｂ）のいずれか一方がアミノ基若しくはチオール基であり、他方がカルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで活性化されたカルボン酸、イソシアナート基、若しくはチオイソシアナート基であり、
前記セグメント（Ａ）中の前記モノマー（Ａ）に由来する構成単位の占める割合が５ｍｏｌ％以上であり、
前記セグメント（Ｂ）中の前記モノマー（Ｂ）に由来する構成単位の占める割合が２０ｍｏｌ％以上であり、
前記共重合体中の前記モノマー（Ａ）に由来する構成単位の占める割合が５〜８０ｍｏｌ％であり、
前記共重合体中の前記モノマー（Ｂ）に由来する構成単位の占める割合が２０〜８０ｍｏｌ％であり、
前記モノマー（Ａ）が下記一般式（Ｉ）で表され、前記モノマー（Ｂ）が下記一般式（ＩＩ）で表される共重合体。

【化1】

（式中、Ｒ^１ａは、水素原子又はメチル基を表し、Ｒ^２ａは、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｘは、スペーサーを表し、Ｙは、反応性基（ｂ）を表す。）

【化2】

（式中、Ｒ^１ｂは、水素原子又はメチル基を表し、Ｒ^２ｂは、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｘは、スペーサーを表し、Ｚは、リガンドを表す。）

【請求項2】

リビングラジカル重合により形成されている請求項１に記載の共重合体。

【請求項3】

前記リガンドが、糖、糖鎖、及びアミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の共重合体。

【請求項4】

請求項１から３いずれかに記載の共重合体によりリガンドが固定化されている担体。

【請求項5】

請求項１から３いずれかに記載の共重合体が有する反応性基（ｂ）と、担体の表面にある反応性基（ａ）とを反応させる工程を含む、リガンドの固定化方法。

【請求項6】

請求項１から３いずれかに記載の共重合体が固定化された培養基材を用いた細胞培養方法。

【請求項7】

無血清培地にて細胞を培養する請求項６に記載の細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リガンド固定化用共重合体及び該共重合体によるリガンドの固定化方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、材料の表面を改質することで、その付加価値を高める試みが様々な分野において広くなされている。特に、特定の対象物質に対して特異的相互作用を示すリガンドを材料表面に固定化する技術は、医療・環境・バイオ分野において急速に進展しつつある。中でも、糖鎖の固定化技術に関しては、タンパク質や脂質と結合した糖鎖が、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与していることが明らかになってきたこともあり、バイオセンシング機材や細胞培養機材に応用する試みが多くなされている。例えば、特許文献１には、末端にガラクトースを含む糖鎖誘導体をリガンドとし、これを基板表面上に固定させたベロ毒素の検出センサーが開示されている。

【0003】

ところで、リガンドとしての機能をバイオセンシング機材等において効果的に発揮させるためには、リガンドと対象物質との相互作用を向上させることが望ましい。一般に、リガンドと対象物質との相互作用を向上させるには、材料表面へのリガンドの集積化が有効であることが知られている。そのためには、リガンドを材料表面に安定且つ高密度に固定化させる必要がある。

【0004】

リガンドを材料表面に集積化させる固定化方法としては、例えば、リガンドである糖鎖をアルカンチオールの自己集積化単分子膜（以下、ＳＡＭと称する。）により２次元的に固定化するものがある（非特許文献１参照）。これによれば、材料表面にＳＡＭが形成されるので、リガンドを高密度に固定化することができる。また、特許文献２には、リガンドとなり得るオリゴ糖を側鎖に有するモノマーを可逆的付加開裂連鎖移動重合反応（以下、ＲＡＦＴと称する。）により重合させる方法が開示されている。この方法によれば、材料表面に糖鎖を効率良く集積することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００２−２２７４５号公報

【特許文献2】特表２００８−５１５９９６号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｍｕｎｌｉｋａ Ｓａｔｊａｐｉｐａｔ，Ｒａｙｍｏｎｄ Ｓａｎｅｄｒｉｎ， ａｎｄ Ｆｅｉｍｅｎｇ Ｚｈｏｕ； Ｌａｎｇｍｕｉｒ； ２００１； １７； ｐ．７６３７−７６４４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、上記非特許文献１及び特許文献２に記載された方法によれば、リガンドを材料表面に集積化させることはできるが、高い相互作用を得るまでには至らなかった。

【0008】

本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、材料となる担体の表面に安定にリガンドを固定することができ、且つリガンドの分子認識作用を高めることができるリガンド固定化用共重合体及び該共重合体によるリガンドの固定化方法を提供することを目的とする。また、上記リガンド固定化用共重合体が固定化された培養基材を用いた細胞培養方法を提供することも目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねたところ、リガンドと対象物質との相互作用の向上には、リガンドの集積化に加え、リガンドの運動性を高めることが有効であることを見出した。そして、更に鋭意研究を重ねたところ、特定の共重合体を材料表面に対してブラシ状に固定化することで、リガンドの集積化と運動性向上とが実現できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、以下のようなものを提供する。

【0010】

（１）反応性基（ａ）を有する担体の表面にリガンドを固定化するための共重合体であって、前記反応性基（ａ）と化学的に結合可能な反応性基（ｂ）を有するモノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを前記共重合体の鎖の一端に有するとともに、前記リガンドを有するモノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを前記共重合体の鎖の他端に有するか、又は、前記モノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを前記共重合体の鎖の両端に有するとともに、前記両端のセグメント間に前記モノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを有する共重合体。

【0011】

（２）前記モノマー（Ａ）に由来する構成単位からなるセグメントを前記共重合体の鎖の一端に有するとともに、前記モノマー（Ｂ）に由来する構成単位からなるセグメントを前記共重合体の鎖の他端に有する、上記（１）に記載の共重合体。

【0012】

（３）リビングラジカル重合により形成されている上記（１）又は（２）に記載の共重合体。

【0013】

（４）前記反応性基（ａ）及び前記反応性基（ｂ）のいずれか一方がアジド基であり、他方がアルキニル基である上記（１）から（３）に記載の共重合体。

【0014】

（５）前記モノマー（Ａ）が一般式（Ｉ）で表される上記（１）から（４）いずれかに記載の共重合体。

【化1】

（式中、Ｒ^１ａは、水素原子又はメチル基を表し、Ｒ^２ａは、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｘは、スペーサーを表し、Ｙは、反応性基（ｂ）を表す。）

【0015】

（６）前記モノマー（Ｂ）が一般式（ＩＩ）で表される上記（１）から（５）いずれかに記載の共重合体。

【化2】

（式中、Ｒ^１ｂは、水素原子又はメチル基を表し、Ｒ^２ｂは、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｘは、スペーサーを表し、Ｚは、リガンドを表す。）

【0016】

（７）前記リガンドが、糖、糖鎖、及びアミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である上記（１）から（６）いずれかに記載の共重合体。

【0017】

（８）上記（１）から（７）いずれかに記載の共重合体によりリガンドが固定化されている担体。

【0018】

（９）上記（１）から（７）いずれかに記載の共重合体が有する反応性基（ｂ）と、担体の表面にある反応性基（ａ）とを反応させる工程を含む、リガンドの固定化方法。

【0019】

（１０）上記（１）から（７）いずれかに記載の共重合体が固定化された培養基材を用いた細胞培養方法。

【0020】

（１１）無血清培地にて細胞を培養する（１０）に記載の細胞培養方法。

【発明の効果】

【0021】

本発明の共重合体は、担体の表面にある反応性基（ａ）と化学的に結合可能な反応性基（ｂ）を有するモノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを共重合体の鎖の一端に有するとともに、リガンドを有するモノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを上記共重合体の鎖の他端に有するので、担体の表面に対してブラシ状に固定化することができる。本発明の共重合体がブラシ状に固定化されると、リガンドの運動性が向上するので、リガンドと対象物質との相互作用が高まり、リガンドの分子認識作用が高まる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】可逆的付加開裂連鎖移動重合反応による本発明の第１の実施形態に係る共重合体の反応スキームを示す図である。

【図2】（Ａ）本発明の第１の実施形態に係る共重合体による糖鎖の修飾、（Ｂ）従来のアルカンチオールの自己組織化単分子膜による糖鎖の修飾を示す模式図である。

【図3】本発明の共重合体の評価：ＲＣＡの特異的結合（Ａ）、ＢＳＡの非特異的結合・ＲＣＡの特異的結合（Ｂ）の確認（Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａ）を示す図である。

【図4】本発明の共重合体の評価：ＲＣＡの特異的結合（Ａ）、ＢＳＡの非特異的結合・ＲＣＡの特異的結合（Ｂ）の確認（Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａ）を示す図である。

【図5】本発明の共重合体の評価：ラット肝実質細胞（ヘパトサイト）の接着（Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａ）を示す写真である。

【図6】本発明の共重合体の評価：添加因子の有無によるアルブミン産生量の違いを示す図である。

【図7】本発明の共重合体の評価：上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の有無によるアルブミン産生量の違いを示す図である。

【図8】本発明の共重合体の評価：ゼラチン修飾基板における初代肝細胞の接着を示す写真（（Ａ）ＡＳＦ有、（Ｂ）ＡＳＦ無）である。

【図9】本発明の共重合体の評価：ラクトースグリコポリマー基板における初代肝細胞の接着を示す写真（（Ａ）ＡＳＦ有、（Ｂ）ＡＳＦ無）である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、詳細に説明する。

【0024】

＜第１の実施形態＞
本発明の第１の実施形態に係る共重合体は、反応性基（ａ）を有する担体の表面にリガンドを固定化するための共重合体であって、上記反応性基（ａ）と化学的に結合可能な反応性基（ｂ）を有するモノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを上記共重合体の鎖の一端に有するとともに、リガンドを有するモノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを上記共重合体の鎖の他端に有する。本発明の共重合体では、モノマー（Ａ）に由来する構成単位と、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位とが混在せず、別々のセグメントに存在することが重要である。なお、モノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントと、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントとの間には、その他のモノマーを有していてもよい。また、本発明の共重合体は、鎖状構造を有するが、その構造は、直鎖ポリマー又は分岐ポリマーのいずれであってもよい。

【0025】

なお、本発明の共重合体を可逆的付加開裂連鎖移動重合反応（以下、ＲＡＦＴと称する。）により合成した場合には、連鎖移動剤に由来する構造を有する共重合体が得られるが、本発明における端とは、上記連鎖移動剤に由来する構造を除いた共重合体の鎖の端を意味する。また、本発明の共重合体が分岐ポリマーの場合には、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位が幹ポリマーの端にあったとしてもよいし、幹ポリマーの端から分岐した枝ポリマー部分にあったとしてもよい。

【0026】

［モノマー（Ａ）］
本発明のモノマー（Ａ）は、担体表面の反応性基（ａ）と化学的に結合可能な反応性基（ｂ）を有する。反応性基（ｂ）は、反応性基（ａ）と化学的に結合可能であれば特に限定されないが、好ましくは反応性基（ａ）及び反応性基（ｂ）のいずれか一方がアジド基であり、他方がアルキニル基であるか、一方がアミノ基又はチオール基であり、他方がカルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで活性化されたカルボン酸、イソシアナート基又はチオイソシアナート基である。本発明の共重合体は、この反応性基（ｂ）が担体の表面にある反応性基（ａ）と化学的に結合することにより、担体に固定化される。

【0027】

本発明のモノマー（Ａ）は、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、モノマー（Ｂ）と重合することができる。

【0028】

本発明の共重合体では、モノマー（Ａ）が下記一般式（Ｉ）で表されるものであることが好ましい。

【化3】

【0029】

ここで、Ｒ^１ａは、水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２ａは、−Ｏ−又は−ＮＨ−である。また、Ｘは、スペーサーであり、Ｙは、反応性基（ｂ）である。

【0030】

モノマー（Ａ）では、スペーサーは、反応性基（ａ）と反応性基（ｂ）との化学的結合に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、繰り返し単位数１〜２００のオリゴアルキレンオキシ基、アルキル基、アルキレン基等が挙げられ、好ましくは繰り返し単位数１〜２０のオリゴエチレンオキシ基又はアルキレン基である。なお、アルキレン基は、直鎖状でも分枝状でもよい。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、好ましくはＣ１〜Ｃ８である。繰り返し単位数１〜５０のエチレンオキシ基やＣ１〜Ｃ８のアルキレン基であれば、共重合体の運動性が良好となるので、リガンドの分子認識作用も良好になる。

【0031】

本発明の第１の実施形態に係る共重合体では、該共重合体の鎖の一端にモノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを有する。該セグメントには、モノマー（Ｂ）以外のその他のモノマーが含まれてもよい。その他のモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド、メチロール（メタ）アクリルアミド、メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、エトキシメチル（メタ）アクリルアミド、プロポキシメチル（メタ）アクリルアミド、ブトキシメトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、フマル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、無水イタコン酸、シトラコン酸、無水シトラコン酸、クロトン酸、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−フェノキシ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロピルフタレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらのモノマーを、単独で有していても、２種以上を組み合わせて有していてもよい。

【0032】

上記セグメントにおけるモノマー（Ａ）に由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは５ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは３０ｍｏｌ％以上であり、更により好ましくは１００ｍｏｌ％である。モノマー（Ａ）に由来する構成単位の占める割合が高いほど、反応性基（ｂ）の占める割合が高くなるので、担体の表面にある反応性基（ａ）との反応確率が高くなる。なお、本発明の第１の実施形態に係る共重合体では、モノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを、共重合体の鎖の端に有していることが重要であって、上記セグメントにおいて、モノマー（Ａ）に由来する構成単位を端に有している必要はない。したがって、共重合体の鎖の端と、モノマー（Ａ）に由来する構成単位との間に、上記その他のモノマーを含むセグメントも本発明の範囲内である。

【0033】

［モノマー（Ｂ）］
本発明のモノマー（Ｂ）は、リガンドを有することを特徴とする。

【0034】

リガンドとしては、例えば、糖鎖、糖、糖タンパク質、糖脂質、タンパク質、抗原、抗体、アミノ酸、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ等の核酸等の特定の対象物質に対して特異的相互作用を示す分子認識素子が挙げられる。これらのリガンドを結合させることにより、共重合体に種々の機能を付加することができる。

【0035】

本発明のモノマー（Ｂ）は、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、モノマー（Ａ）等と重合することができる。

【0036】

本発明の共重合体では、モノマー（Ｂ）が下記一般式（ＩＩ）で表されるものであることが好ましい。

【化4】

【0037】

ここで、Ｒ^１ｂは、水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２ｂは、−Ｏ−又は−ＮＨ−である。また、Ｘは、スペーサーであり、Ｚは、リガンドである。

【0038】

モノマー（Ｂ）では、スペーサーは、上述のリガンドを導入することができれば特に限定されないが、例えば、繰り返し単位数１〜２００のオリゴアルキレンオキシ基、アルキル基、アルキレン基等が挙げられ、好ましくは繰り返し単位数１〜５０のオリゴエチレンオキシ基又はアルキレン基である。アルキレン基は、直鎖状でも分枝状でもよい。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、好ましくはＣ１〜Ｃ８である。繰り返し単位数１〜５０のエチレンオキシ基やＣ１〜Ｃ８のアルキレン基であれば、共重合体の運動性が良好となるので好ましい。なお、本発明の共重合体では、このスペーサーを介して上述のリガンドが結合している。

【0039】

本発明の第１の実施形態に係る共重合体では、該共重合体の鎖の他端にモノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを有する。該セグメントには、モノマー（Ａ）以外の上述のその他のモノマーが含まれてもよい。該セグメントにおけるモノマー（Ｂ）に由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは２０ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは５０ｍｏｌ％以上であり、更により好ましくは８０ｍｏｌ％以上である。モノマー（Ｂ）に由来する構成単位の占める割合が高いほど、リガンドの占める割合が高くなり、リガンドの分子認識作用が向上するが、リガンドによっては、その他のモノマーが含まれている方が、分子認識作用が高まる場合もある。なお、本発明の第１の実施形態に係る共重合体では、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを、共重合体の鎖の端に有していることが重要であって、上記セグメントにおいて、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位を端に有している必要はない。したがって、共重合体の鎖の端と、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位との間に、上記その他のモノマーを含むセグメントも本発明の範囲内である。

【0040】

［共重合体の合成方法］
本発明の共重合体の重合方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、ＲＡＦＴ、原子移動ラジカル重合（以下、ＡＴＲＰと称する。）等のリビングラジカル重合法が好ましい。リビングラジカル重合法によれば、合成する共重合体の分子量や分子量分布を制御できるので好ましい。以下に、モノマー（Ａ）に由来する構成単位からなるセグメントを前記共重合体の鎖の一端に有するとともに、該モノマー（Ｂ）に由来する構成単位からなるセグメントを前記共重合体の鎖の他端に有する本発明の共重合体の合成方法を例示する。なお、重合方法はリビングラジカル重合法による。

【0041】

ＲＡＦＴによる場合、まず、モノマー（Ｂ）と、連鎖移動剤と、重合開始剤とを所定の溶媒に溶解し、溶存酸素を含む反応容器中の酸素を完全に除いた後、重合開始剤が開裂する温度以上、１００℃以下で、１〜５００時間加熱することにより、モノマー（Ｂ）が重合したポリマー（以下、Ｂブロックと称する。）の末端に連鎖移動剤が導入されたマクロ連鎖移動剤を合成する。次に、このマクロ連鎖移動剤と、モノマー（Ａ）とを所定の溶媒に溶解し、重合開始剤を加え、重合開始剤が開裂する温度以上、２００℃以下で、１〜５００時間加熱することにより、Ｂブロックと、モノマーＡが重合したポリマー（以下、Ａブロックと称する。）とが直列に結合した、本発明の共重合体を合成する。反応スキームの略図を図１に示す。

【0042】

ＡＴＲＰによる場合、まず、モノマー（Ｂ）と、ハロゲン化アルキル開始剤と、メタル化剤と、リガンドとを所定の溶媒に溶解し、反応させることにより、Ｂブロックの末端にハロゲン化アルキル開始剤が導入されたマクロハロゲン化アルキル開始剤を合成する。次に、マクロハロゲン化アルキル開始剤と、モノマー（Ａ）とを所定の溶媒に溶解し、更にメタル化剤と、リガンドとを加え、室温以上、２００℃以下で、１〜５００時間加熱することにより、ＢブロックとＡブロックとが直列に結合した、本発明の共重合体を合成する。

【0043】

重合反応に用いる溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド又はこれらの混合液が挙げられる。

【0044】

重合開始剤としては、特に限定されないが、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、ジイソプロピルペルオキシカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ベンゾイル、ラウロイルパーオキサイド、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等を用いることができる。重合開始剤の好適な使用量は、モノマーに対して、０．００１〜１質量％、連鎖移動剤に対して、１〜３３質量％である。

【0045】

ＲＡＦＴに用いられる連鎖移動剤としては、特に限定されないが、例えば、ブチルベンジルトリチオカルボナート、クミルジチオベンゾエート、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、酢酸ジチオベンゾエート、ブタン酸ジチオベンゾエート、４−トルイル酸ジチオベンゾエート等が挙げられる。

【0046】

ＡＴＲＰに用いられるハロゲン化アルキル開始剤としては、特に限定されないが、例えば、２−ブロモイソブチリルブロミド、２−クロロイソブチリルクロリド、ブロモアセチルブロミド、ブロモアセチクロリド、ベンジルブロミド等が挙げられる。

【0047】

遷移金属錯体としては、特に限定されないが、１価の銅、２価のルテニウム等の錯体を用いることができる。

【0048】

本発明の共重合体の質量平均分子量（ポリスチレンを標準物質としたＧＰＣによる測定）は、２０００〜１０００００であることが好ましく、２０００〜２００００であることがより好ましい。上記範囲とすることで、担体の表面に対して安定に固定化することができる。

【0049】

本発明の共重合体では、該共重合体の鎖の一端にモノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを有するとともに、該共重合体の鎖の他端にモノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを有していれば、モノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントと、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントとの間にその他のモノマーを有していてもよい。

【0050】

本発明の共重合体では、該共重合体におけるモノマー（Ａ）に由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは５〜８０ｍｏｌ％であり、より好ましくは５〜２０ｍｏｌ％である。上記範囲であれば、本発明の共重合体を担体の表面に対してブラシ状に固定化することができる。また、本発明の共重合体におけるモノマー（Ｂ）に由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは２０〜８０ｍｏｌ％であり、より好ましくは５０〜８０ｍｏｌ％である。上記範囲であれば、リガンドの分子認識作用が良好である。

【0051】

本発明の共重合体は、担体の表面にある反応性基（ａ）と化学的に結合可能な反応性基（ｂ）を有するモノマー（Ａ）に由来する構成単位を含むセグメントを共重合体の鎖の一端に有するとともに、リガンドを有するモノマー（Ｂ）に由来する構成単位を含むセグメントを共重合体の鎖の他端に有する。図２（Ａ）は、モノマー（Ａ）に由来する構成単位からなるセグメントと、モノマー（Ｂ）に由来する構成単位からなるセグメントとを両端に有する、本発明の共重合体による糖鎖の修飾を示す模式図である。図２（Ｂ）は、従来法であるアルカンチオールの自己集積化単分子膜（以下、ＳＡＭと称する。）による糖鎖の修飾を示す模式図である。本発明の共重合体では、図２（Ａ）に示すように、複数の反応性基（ｂ）を有するので、担体の表面にある反応性基（ａ）との反応確率が高くなる。また、共重合体が多点的に固定化するので、共重合体を担体の表面から延伸したブラシ状に固定化することができ、共重合体の運動性が向上し、ひいては、リガンドの運動性が向上する。更に、一方の末端にリガンドが集積化されているので、リガンドを有する共重合体の運動性の向上と、リガンドの集積化とが実現することにより、リガンドと対象物質との相互作用が高まるので、リガンドの分子認識作用も高まると考えられる。
これに対して、リガンドをアルカンチオールのＳＡＭにより２次元的に固定化する従来法では、図２（Ｂ）に示すように、材料表面にＳＡＭが形成されるので、リガンドを高密度に固定化することができるが、分子同士の相互作用により、運動性は低くなる。

【0055】

［共重合体の固定化］
本発明の共重合体は、該共重合体が有する反応性基（ｂ）と、担体の表面にある反応性基（ａ）とを反応させることにより、リガンドを担体の表面に固定化する。この反応により、反応性基（ｂ）と反応性基（ａ）とが化学的に結合するので、担体の表面に安定に固定化することができる。反応性基（ａ）は、反応性基（ｂ）と化学的に結合可能であれば特に限定されないが、好ましくは反応性基（ａ）及び反応性基（ｂ）のいずれか一方がアジド基であり、他方がアルキニル基であるか、一方がアミノ基であり、他方がカルボキシル基であるか、一方がアミノ基又はチオール基であり、他方がカルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで活性化されたカルボン酸、イソシアナート基又はチオイソシアナート基であることが好ましい。

【0056】

反応性基（ａ）及び反応性基（ｂ）のいずれか一方がアジド基であり、他方がアルキニル基である場合、反応性基（ａ）と反応性基（ｂ）との反応は、クリック反応により行うことが好ましい。クリック反応では、トリアゾール環が形成されるように、溶媒中において、アジド基とアルキニル基とを反応させる。反応混合液に銅等の触媒及びアスコルビン酸塩等の還元剤を添加することにより、水性溶媒中でも室温でトリアゾール環を形成することができる。クリック反応は、水混合溶媒中でも反応が進行するという点のほか、固体表面に対する高分子の末端反応等、通常の有機化学反応では反応率が低くなりやすい条件であっても、他のカップリング反応と比較して高い効率で反応が進行するという点においても好ましい。

【0057】

固定化対象である担体を構成する材料の種類や形態は、特に限定されない。担体は、固体であっても、半固体であってもよい。材料の種類としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、セラミックス、金属等が挙げられ、目的に応じて用いることができる。金属としては、例えば、金、銀、鉄、銅、白金等が挙げられる。形態としては、例えば、プレート状、フィルム状、繊維状、粒子状、ゲル状等が挙げられる。

【0058】

反応性基（ａ）を上記担体の表面に修飾する方法は、特に限定されないが、例えば、担体が金の場合には、金とチオール基との結合を利用したり、担体がガラス等の水酸基を有する場合には、シランカップリング剤を利用したりすることができる。

【0059】

本発明の共重合体は、上記のように担体の表面に安定に固定化することができる。したがって、例えば、特定の細胞、ウイルス、細菌、毒素、ペプチド等を特異的に認識する糖鎖や抗体をリガンドとして結合させた共重合体は、診断用のセンシングプローブやアクティブ・ターゲティング・ドラックデリバリーシステム（能動的・標的指向性ＤＤＳ）に好適に利用することができる。

【0060】

［細胞培養方法］
リガンドを結合させた本発明の共重合体によって表面を修飾した培養基材によれば、細胞培養が可能となる。特に、特定の細胞に対して特異的に結合するリガンドを用いた場合には、当該細胞の選択培養に利用することができる。例えば、肝実質細胞にのみ認識される性質を有するラクトースをリガンドとして用いることで、肝実質細胞と、その他の肝臓を構成する非実質細胞（類洞内皮細胞、星細胞、クッパー細胞等）との混合物から、肝実質細胞のみを容易に分離することが可能となる。また、ラクトースをリガンドとして結合させた本発明の共重合体によって表面を修飾した培養基材によれば、ラクトースと細胞とがアシアロ糖タンパク受容体を介して良好に接着するので、無血清培地でも細胞を培養することができる。

【実施例】

【0061】

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0062】

本実施例では、まず、１，２の工程を経て、反応性基（ａ）を担体表面に修飾するための分子を製造した。反応性基（ａ）は、モノマーＡの反応性基（ｂ）に対応する。

【0063】

［担体表面修飾用分子の製造］
＜工程１：３−アジドプロピルトリエトキシシランの合成＞
既知の方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，２９３４−２９４１）に従い、式（１）で表される３−クロロプロピルトリエトキシシラン３．０ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）から、式（２）で表される３−アジドプロピルトリエトキシシランを得た（収量：２．１２ｇ（８．６０ｍｍｏｌ），収率：６９％）。反応スキームを以下に示す。

【0064】

【化5】

【0065】

＜工程２：１−アジドウンデカン−１１−チオールの合成＞
既知の方法（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．，２００４，２０（４），１０５１−１０５３）を参考に、式（３）で表される１−ブロモウンデカン−１１−オールから、式（７）で表される１−アジドウンデカン−１１−チオールを合成した。
具体的には、アルゴン雰囲気下、式（３）で表される１−ブロモウンデカン−１１オール２．５１ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム１．９５ｇ（３０．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ４５ｍｌに懸濁し、７０℃で３時間加熱攪拌した。過剰なアジ化ナトリウムをろ過で取り除いた後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣にイソプロピルエーテルを加え、水で２回洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して、式（４）で表される１−アジドウンデカノールを得た（収量：２．１３ｇ（１０．０ｍｍｏｌ），収率：１００％）。
次に、式（４）で表される１−アジドウンデカン−１１−チオール２．０７ｇ（９．７０ｍｏｌ）とメタンスルホニルクロリド２．２９ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ ６０ｍｌ溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン２．０２ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ２０ｍｌ溶液を滴下し、そのまま室温で３時間攪拌した。反応溶液をろ過し、生成した塩を除いた後、減圧濃縮した。残渣にイソプロピルエーテルを加え、１Ｍ塩酸、水、ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して、式（５）で表される１−アジドウンデカン−１１−メチルスルホナートを得た（収量：２．７０ｇ（９．２７ｍｍｏｌ），収率：９６％）。
続いて、式（５）で表される１−アジドウンデカン−１１−メチルスルホナート２．７０ｇ（９．２７ｍｍｏｌ）とカリウムチオアセテート２．１０ｇ（１８．６ｍｍｏｌ）をメタノール８０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、２．５時間加熱還流した。反応溶液を減圧濃縮し、残差に水を加え、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を更に水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して、式（６）で表される１−アジドウンデカン−１１−チオアセテートを得た。（収量：２．２７ｇ（８．３６ｍｍｏｌ），収率：９０％）
最後に、式（６）で表される１−アジドウンデカン−１１−チオアセテート２．２７ｇ（８．３６ｍｍｏｌ）をメタノール１５０ｍｌに溶解した後、濃塩酸８ｍｌを添加し、アルゴン雰囲気下、５時間加熱還流した。反応溶液に水を加えた後、メタノールを減圧で除き、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を更にＮａＨＣＯ_３水溶液、水、ブラインで洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して、式（７）で表される１−アジドウンデカン−１１−チオールを得た（収量：１．９２ｇ（８．３８ｍｍｏｌ），収率：１００％）。反応スキームを以下に示す。

【0066】

【化6】

【0067】

３の工程を経て、本発明に用いる可逆的付加開裂連鎖移動剤（以下、連鎖移動剤と称する。）であるブチルベンジルトリチオカルボナートを製造した。

【0068】

［連鎖移動剤の製造］
＜工程３：ブチルベンジルトリチオカルボナートの合成＞
既知の文献（日本化学会誌，１９８７，７，１４０８−１４１３）を参考に、式（８）で表されるベンジルメルカプタンから、式（１０）で表されるブチルベンジルトリチオカルボナートを合成した。
具体的には、式（８）で表されるベンジルメルカプタン１．２４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）と１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク―７−エン（ＤＢＵ）１．５２ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を脱水ベンゼン１０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、二硫化炭素１．５２ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で３０分攪拌した。この反応溶液に１−ブロモブタン１．３７ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）の脱水ベンゼン５ｍｌ溶液を滴下し、室温で１８時間攪拌した。反応溶液をベンゼンで希釈し、セライトでろ過した。ろ液を１Ｍ塩酸、水、ブラインで洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して、式（１０）で表されるブチルベンジルトリチオカルボナートを得た（収量：２．４８ｇ（９．６７ｍｍｏｌ），収率：９７％）。反応スキームを以下に示す。

【0069】

【化7】

【0070】

４の工程を経て、本発明のモノマー（Ａ）を製造した。

【0071】

［モノマー（Ａ）の製造］
＜工程４：アクリル酸−４−ペンチニルエステルの合成＞
式（１１）で表される４−ペンチン−１−オールとアクリル酸クロリドから、式（１３）で表されるアクリル酸−４−ペンチニルエステルを合成した。
具体的には、式（１１）で表される４−ペンチン−１−オール２．８３ｇ（４０．０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン４．４５ｇ（４４．０ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ ４０ｍｌに溶解し、氷浴で冷却しながら、表（１２）で表されるアクリル酸クロリド３．９８ｇ（４４．０ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ ４０ｍｌ溶液を滴下した。その後、氷浴を外し、室温で５時間攪拌した。反応溶液をろ過し、生成した塩を除去した後、減圧濃縮した。残渣にイソプロピルエーテルを加え、ＮａＨＣＯ_３水溶液、塩化アンモニウム水溶液、ブラインで洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して粗生成物得た。得られた粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１０）で精製し、式（１３）で表されるアクリル酸−４−ペンチニルエステルを得た（収量：１．９０ｇ（１３．８ｍｍｏｌ），収率：３５％）。反応スキームを以下に示す。

【0072】

【化8】

【0073】

５又は６の工程を経て、本発明のモノマー（Ｂ）を製造した。

【0074】

［モノマー（Ｂ）の製造］
＜工程５：β−アクリル酸エチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテートの合成＞
既知の方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ，２００４，５（１），２２４−２３１）を参考に、式（１４）で表されるβ体リッチのＤ−ラクトース−オクタアセテートと、式（１５）で表されるヒドロキシエチルアクリレートとから、式（１６）で表されるβ−アクリル酸エチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテートを合成した。
具体的には、式（１４）で表されるβ体リッチのＤ−ラクトース−オクタアセテート１０．０ｇ（１４．７ｍｍｏｌ）と、式（１５）で表されるアクリル酸ヒドロキシエチルエステル２．０６ｇ（１７．７ｍｍｏｌ）とを、アルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタンに溶解し、氷浴で冷却しながら、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体（４６〜４９％）６ｍｌを滴下した。そのまま２時間攪拌した後、氷浴を外し、更に室温で１８時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、ＮａＨＣＯ_３水溶液、水で洗浄、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して粗生成物得た。得られた粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン：ジクロロメタン＝１：３０→１：２５）で精製した後、メタノール／水で再沈澱を行い、式（１６）で表されるβ−アクリル酸エチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテートを得た（収量：５．３６ｇ（７．３０ｍｍｏｌ），収率：５０％）。反応スキームを以下に示す。

【0075】

【化9】

【0076】

＜工程６：β−アクリルアミジルエチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテートの合成＞
既知の方法（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，５１，３１−３５）に従い、式（１７）で表される１−アミノエタノールと、式（１８）で表されるアクリル酸クロリドとから、式（１９）で表される２−ヒドロキシエチルアクリルアミドを合成した。次に、既知の方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ，２００４，５（１），２２４−２３１）を参考に、式（１４）で表されるβ体リッチのＤ−ラクトース−オクタアセテートと、式（１９）で表される２−ヒドロキシエチルアクリルアミドとから、式（２０）で表されるβ−アクリルアミジルエチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテートを合成した。
具体的には、式（１７）で表される１−アミノエタノール３０ｍｌ（０．５０ｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン３００ｍｌに溶解し、氷浴で冷却しながら式（１８）で表されるアクリル酸クロリド２０ｍｌ（０．２５ｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン１００ｍｌ溶液を滴下した。そのまま氷浴で冷却しながら３時間攪拌した後、生成した塩をろ過で除き、ろ液を減圧濃縮し、式（１９）で表される２−ヒドロキシエチルアクリルアミドを合成した（収量：１５ｇ（０．１３ｍｏｌ），収率：５２％）。
次に、式（１４）で表されるβ体リッチのＤ−ラクトース−オクタアセテート１０．０ｇ（１４．７ｍｍｏｌ）と式（１９）で表される２−ヒドロキシエチルアクリルアミド２．０３ｇ（１７．７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタンに溶解し、氷浴で冷却しながら、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体（４６〜４９％）６ｍｌを滴下した。そのまま２時間攪拌した後、氷浴を外し、更に室温で１８時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、ＮａＨＣＯ_３水溶液、水で洗浄、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水、減圧濃縮して粗生成物得た。得られた粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１→酢酸エチル）で精製し、式（２０）で表されるβ−アクリル酸エチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテートを得た（収量：６．２２ｇ（８．４８ｍｍｏｌ），収率：５８％）。反応スキームを以下に示す。

【0077】

【化10】

【0078】

７，８，９，又は１０の工程を経て、糖鎖ポリマーを製造した。

【0079】

［糖鎖ポリマーの製造：ホモポリマータイプ（１）］
＜工程７：Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａの合成＞
式（１６）で表されるβ−アクリル酸エチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテート１．４７ｇ（２．０ｍｍｏｌ）と、式（１０）で表されるブチルベンジルトリチオカルボナート２６ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ １．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ １０ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で４日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱を行い、更に得られた沈澱を少量のクロロホルムに溶解し、イソプロパノール／イソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２１）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａを得た（収量：４４５ｍｇ，回収率：３０％）。反応スキームを以下に示す。
反応溶液の一部を減圧濃縮した粗生成物の^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）を測定し、積分比から算出したモノマーの転化率は４３％であった。また、精製後のポリマーをＧＰＣ（ポリスチレンスタンダード）で測定した数平均分子量（Ｍｎ_ｃａｌ）は３８４２、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．２０、Ｍｎ_ｃａｌから算出した平均重合度（ｎ_ｃａｌ）は４．９であった。なお、分子量分布が狭いことから、この重合反応はＲＡＦＴ機構で進行したと考えられる。よって、モノマーの転化率から算出した理論的な平均分子量（Ｍｎ_ｔｈ）は６５７４、平均重合度（ｎ_ｔｈ）は８．６であった。

【0080】

【化11】

【0081】

［糖鎖ポリマーの製造：ホモポリマータイプ（２）］
＜工程８：Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡの合成＞
式（２０）で表されるβ−アクリルアミジルエチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテート１．１０ｇ（１．５ｍｍｏｌ）と、式（１０）で表されるブチルベンジルトリチオカルボナート１３ｍｇ（０．０５０ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ １．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ ８ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で４日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱を行い、更に得られた沈澱を少量のクロロホルムに溶解し、イソプロパノール／イソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２２）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡを得た（収量：５５５ｍｇ，回収率：５０％）。反応スキームを以下に示す。
なお、工程７と同様の方法にて測定し、算出したモノマーの転化率は６０％、Ｍｎ_ｃａｌは４７８５、Ｍｗ／Ｍｎは１．２０、ｎ_ｃａｌは６．２、Ｍｎ_ｔｈは１３４６３、ｎ_ｔｈは１８であった。

【0082】

【化12】

【0083】

［糖鎖ポリマーの製造：コポリマータイプ（１）］
＜工程９：Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡの合成＞
式（１６）で表されるβ−アクリル酸エチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテート１．４７ｇ（２．０ｍｍｏｌ）と、式（１５）で表されるアクリル酸ヒドロキエチルエステル２３２ｍｇ（２．０ｍｏｌ）と、式（１０）で表されるブチルベンジルトリチオカルボナート２６ｍｇ（０．１０ｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ ３．３ｍｇ（２０μｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ １０ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で４日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱を行い、更に得られた沈澱を少量のクロロホルムに溶解し、イソプロパノール／イソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２３）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡを得た（収量：１．０４ｇ，回収率：５３％）。反応スキームを以下に示す。
なお、工程７と同様の方法にて測定し、算出したモノマーの転化率は７０％（２種類のモノマー全体として）、Ｍｎ_ｃａｌは５１８６、Ｍｗ／Ｍｎは１．２８であった。

【0084】

【化13】

【0085】

［糖鎖ポリマーの製造：コポリマータイプ（２）］
＜工程１０：Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｃｏ−ＨＥＡＡの合成＞
式（２０）で表されるβ−アクリルアミジルエチルオキシ−Ｄ−ラクトース−ヘプタアセテート１．４６ｇ（２．０ｍｍｏｌ）と、式（１９）で表される２−ヒドロキシエチルアクリルアミド２３０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）と、式（１０）で表されるブチルベンジルトリチオカルボナート２６ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ １．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ １０ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で４日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱を行い、更に得られた沈澱を少量のクロロホルムに溶解し、イソプロパノール／イソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２４）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｃｏ−ＨＥＡＡを得た（収量：７７０ｍｇ，回収率：３９％）。反応スキームを以下に示す。
なお、工程７と同様の方法にて測定し、算出したモノマーの転化率は４５％（２種類のモノマー全体として）、Ｍｎ_ｃａｌは４９３０、Ｍｗ／Ｍｎは１．１８であった。

【0086】

【化14】

【0087】

１１，１２，１３又は１４の工程を経て、本発明の共重合体を製造した。

【0088】

［本発明の共重合体の製造：糖鎖ポリマーがホモポリマータイプ（１）］
＜工程１１：Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａの合成＞
式（２１）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ ３８４ｍｇ（Ｍｎ_ｃａｌ＝３８４２、Ｍｎ_ｔｈ＝６５７４）と、式（１３）で表されるアクリル酸−４−ペンチニルエステル６９ｍｇ（０．５０ｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ ５．０ｍｇ（３０μｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ ３ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で６日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２５）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａを得た（収量：３４１ｍｇ，回収率：７５％）。反応スキームを以下に示す。
反応溶液の一部を減圧濃縮した粗生成物の^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）を測定し、積分比から算出したモノマーの転化率は１００％であった。また、精製後のポリマーをＧＰＣ（ポリスチレンスタンダード）で測定した数平均分子量（Ｍｎ_ｃａｌ）は３７１２、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．１９であった。なお、分子量分布が狭いことから、この重合反応は、ＲＡＦＴ機構で進行したと考えられる。よって、マクロ連鎖移動剤のＭｎ_ｔｈとモノマーの転化率とから算出した理論的な平均分子量（Ｍｎ_ｔｈ）は７７５７、平均重合度はｎ_ｔｈが８．６、ｍ_ｔｈが８．６であった。

【0089】

【化15】

【0090】

［本発明の共重合体の製造：糖鎖ポリマーがホモポリマータイプ（２）］
＜工程１２：Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａの合成＞
式（２２）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ ５４０ｍｇ（Ｍｎ_ｃａｌ＝４７８５、Ｍｎ_ｔｈ＝１３４６３）と、式（１３）で表されるアクリル酸−４−ペンチニルエステル５５ｍｇ（０．４０ｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ ３．３ｍｇ（２０ｍｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ ４ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で６日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２６）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａを得た（収量：５２６ｍｇ，回収率：８８％）。反応スキームを以下に示す。
なお、工程１１と同様の方法にて測定し、算出したモノマーの転化率は１００％、Ｍｎ_ｃａｌは４４５２、Ｍｗ／Ｍｎは１．２３、Ｍｎ_ｔｈは１４８４０、平均重合度はｎ_ｔｈが１８、ｍ_ｔｈが１０であった。

【0091】

【化16】

【0092】

［本発明の共重合体の製造：糖鎖ポリマーがコポリマータイプ（１）］
＜工程１３：Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａの合成＞
式（２３）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ １．０４ｇ（Ｍｎ_ｃａｌ＝５１８６）と、式（１３）で表されるアクリル酸−４−ペンチニルエステル８３ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ ４．９ｍｇ（３０μｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ １０ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で６日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２７）で表されるＰｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａを得た（収量：８０７ｍｇ，回収率：７２％）。反応スキームを以下に示す。
なお、工程１１と同様の方法にて測定し、算出したモノマーの転化率は１００％、Ｍｎ_ｃａｌは３５０２、Ｍｗ／Ｍｎは１．３２であった。

【0093】

【化17】

【0094】

［本発明の共重合体の製造：糖鎖ポリマーがコポリマータイプ（２）］
＜工程１４：Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｃｏ−ＨＥＡＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａの合成＞
式（２４）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｃｏ−ＨＥＡＡ ７４２ｍｇ（Ｍｎ_ｃａｌ＝４９３０）と、式（１３）で表されるアクリル酸−４−ペンチニルエステル２０７ｍｇ（１．５０ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ ４．９ｍｇ（３０μｍｏｌ）とを脱水ＤＭＦ ５ｍｌに溶解し、シュレンク管で３回凍結脱気を行った後、アルゴン雰囲気下、７０℃で６日間加熱攪拌した。反応溶液をイソプロピルエーテルに滴下して再沈澱による精製を行い、式（２８）で表されるＰｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｃｏ−ＨＥＡＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａを得た（収量：７１８ｍｇ，回収率：７６％）。反応スキームを以下に示す。
なお、工程１１と同様の方法にて測定し、算出したモノマーの転化率は７８％、Ｍｎ_ｃａｌは５５９４、Ｍｗ／Ｍｎは１．２３であった。

【0095】

【化18】

【0096】

［担体表面への糖鎖ポリマーブラシの形成］
糖鎖ポリマーブラシを担体表面に形成する方法は、担体表面にアジド基を修飾する第１の工程、合成した本発明の共重合体の末端アルキン部分と第１の工程において担体表面に修飾したアジド基とのクリック反応を行う第２の工程、及び糖鎖の保護基を外す脱保護反応を行う第３の工程で行う。なお、共重合体の状態で脱保護を行っておくことで、第３の工程は省略することができる。各工程における反応進行度は、水滴の接触角の変化で確認した。

【0097】

（１）第１の工程：担体表面へのアジド基の修飾
アジド基を修飾する担体には、ガラス基板（スライドガラス）と金蒸着ガラス基板を用いた。これら担体表面に付着した有機物等の汚れは、表面反応の促進を阻害する可能性がある。そこで、オゾン洗浄機で１５分間処理した後、メタノールをかけ流して洗浄し、乾燥させた担体を用いた。

【0098】

（１−１）ガラス基板表面の修飾
ガラス基板表面へのアジド基の修飾は、シランカップリング反応により行った。シランカップリング剤には、工程１にて合成した式（２）で表される３−アジドプロピルトリエトキシシランを用いた。３−アジドプロピルトリエトキシシランの１ｖｏｌ％トルエン溶液を調製し、脱脂綿でガラス基板表面に薄く塗布し、ヘアドライアーで数秒間加熱と乾燥を３回繰り返した。

【0099】

（１−２）金蒸着ガラス基板表面の修飾
金蒸着ガラス基板表面へのアジド基の修飾は、金とチオール基の反応により行った。アルカンチオールは、金表面上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成することが知られていることから、金蒸着ガラス基板を、工程２にて合成した式（７）で表される１−アジドウンデカン−１１−チオールの０．２ｖｏｌ％トルエン溶液に浸漬し、１８時間放置した。

【0100】

（２）第２の工程：クリック反応
第１の工程においてアジド基を修飾した担体表面上に、工程１４にて合成した式（２８）で表されるＰｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−ＡＡ−ｃｏ−ＨＥＡＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａの粉末を少量（１ｃｍ^２当たり１ｍｇ未満）ふりかけた後、クリック反応溶液を塗布し、１８時間放置した。クリック反応溶液には、硫酸銅（ＩＩ）・５水和物１０ｍｇとアスコルビン酸ナトリウム１５ｍｇとを、ＴＨＦ／ミリＱ水（２０ｍｌ／５ｍｌ）溶液に溶解したものを用いた。反応終了後は、担体表面をアセトン、メタノール、ミリＱ水の順でよく洗浄し、乾燥した。

【0101】

（３）第３の工程：糖鎖の脱保護反応
糖鎖の脱保護反応は、既知の方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ，２００４，５，２２４−２３１）を参考に行った。第２の工程においてクリック反応させた担体を、ヒドラジン一水和物の３ｖｏｌ％ ＤＭＳＯ溶液に浸漬し、密閉状態で５時間放置した。反応終了後は、担体表面をアセトン、メタノール、ミリＱ水の順でよく洗浄し、乾燥した。

【0102】

［反応進行度の確認：接触角の測定］
担体表面における糖鎖ポリマーブラシの形成は、担体表面の接触角を測定することにより確認した。糖鎖ポリマーブラシが担体表面に形成されていれば、担体表面における水酸基の密度が高まり、親水性が高くなると考えられるからである。
ガラス基板については、第３の工程の脱保護を部分的に行い、脱保護されている部分と脱保護されていない部分の接触角を比較した。なお、接触角はガラス基板２枚（１枚当たり４ヶ所測定）の平均値を求めた。
金蒸着ガラス基板については、第２の工程のクリック反応を部分的に行い、更に第３の工程の脱保護を部分的に行い、各工程後の接触角を比較した。なお、接触角は金蒸着ガラス基板１枚（１枚当たり１０ヶ所測定）の平均値を求めた。
室温（約２３℃）下、空気中で担体表面にイオン交換水（ミリＱ水）２μｌを滴下し、担体表面と水滴との接触角を測定した。測定装置には、表面張力計（協和界面科学社製ＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ−５００，解析ソフトウエアーＦＡＭＡＳ使用）を用いた。

【0103】

ガラス基板については、脱保護していない部分の接触角が６７．６°であるのに対し、脱保護した部分の接触角は４１．８°であり、脱保護した部分の方が２６°程度小さな値を示した。
金蒸着ガラス基板については、第１の工程後（アジド基の修飾後）の接触角が６７．１°であり、第２の工程後（クリック反応後）の接触角が６５．８°であるのに対し、第３の工程後（脱保護反応後）の接触角は５１．８°であり、脱保護した部分の接触角が最も小さな値を示した。
以上の結果から、ガラス基板、金蒸着ガラス基板のいずれの担体においても、各工程の反応は進行し、表面に糖鎖ポリマーブラシが形成されたことが示唆された。

【0104】

［糖鎖ポリマーブラシの評価］
１．レクチンの特異的結合とタンパク質の非特異的吸着による評価
（ＱＣＭセンサーのセンシング面への糖鎖ポリマーブラシの形成）
（１）第１の工程：センシング面へのアジド基の修飾
ＱＣＭセンサー（イニシアム社製，ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ，２７ＭＨｚ）のセンサーチップのセンシング面に、ピラニア洗浄溶液（濃硫酸：過酸化水素水＝３：１）を塗布し、１０分間放置した後、水洗し、更に１％ＳＤＳ溶液を綿棒につけて軽くこすり洗いした後、水洗し乾燥した。
センシング面は、金の薄膜でできていることから、第１の工程（アジド基の修飾）は、金とチオール基の反応により行った。センシング面を、工程２にて合成した式（７）で表される１−アジドウンデカン−１１−チオールの０．２ｖｏｌ％トルエン溶液に浸漬し、２時間放置した。

【0105】

（２）第２の工程：クリック反応
第１の工程においてアジド基を修飾したＱＣＭセンサーのセンシング面上に、工程１１にて合成した式（２５）で表されるＰｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａ、又は工程１３にて合成した式（２７）で表されるＰｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａの粉末を少量（１ｃｍ^２当たり１ｍｇ未満）ふりかけた後、クリック反応溶液を塗布し、１８時間放置した。
クリック反応溶液には、硫酸銅（ＩＩ）・５水和物１０ｍｇとアスコルビン酸ナトリウム１５ｍｇとを、ｔ−ＢｕＯＨ／ミリＱ水（１：１）⇒（１０ｍｌ／１０ｍｌ）溶液に溶解したものを用いた。反応終了後は、センシング面をアセトン、メタノール、ミリＱ水の順でよく洗浄し、乾燥した。

【0106】

（３）第３の工程：糖鎖の脱保護反応
糖鎖の脱保護反応は、既知の方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ，２００４，５，２２４−２３１）を参考に行った。第２の工程においてクリック反応させたＱＣＭセンサーのセンシング面に、ヒドラジン一水和物の３ｖｏｌ％ ＤＭＳＯ溶液を塗布して２時間放置することを２回繰り返し行った。反応終了後は、センシング面をアセトン、メタノール、ミリＱ水の順でよく洗浄し、乾燥した。

【0107】

（レクチンの特異的結合の確認）
レクチンには、ラクトースのレクチンであるＲＣＡ_１２０（フナコシ社製）を用いた。測定装置には、ＱＣＭセンサーを用いた。ＱＣＭセンサーの付属のガラス製セルに、予め減圧脱気したイオン交換水（ミリＱ水）８ｍｌを入れ、これに上記方法により糖鎖ポリマーブラシを表面に形成したセンサーチップを浸漬し、２５℃で攪拌（８５０ｒｐｍ）した。この状態で周波数が一定になるまで待機した後、ＲＣＡ_１２０（５ｍｇ／ｍｌ）８μｌを添加し、周波数変化を記録した。

【0108】

（タンパク質の非特異的吸着の確認）
タンパク質には、ＢＳＡ（シグマ社製）を用いた。ＱＣＭセンサーの付属のガラス製セルに、予め減圧脱気したイオン交換水（ミリＱ水）８ｍｌを入れ、これに上記方法により糖鎖ポリマーブラシを表面に形成したセンサーチップを浸漬し、２５℃で攪拌（８５０ｒｐｍ）した。この状態で周波数が一定になるまで待機した後、ＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）８μｌを添加し、周波数変化を記録した。更に続いて、周波数が一定になるまで待機した後、ＲＣＡ_１２０（５ｍｇ／ｍｌ）８μｌを添加し、周波数変化を記録した。

【0109】

Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａを固定化して形成した糖鎖ポリマーブラシの評価結果を図３（Ａ），（Ｂ）に、Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａを固定化して形成した糖鎖ポリマーブラシの評価結果を図４（Ａ），（Ｂ）に示す。Ｐｏｌｙ−Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａ、Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａともに、ＢＳＡでは周波数の変化がほとんど認められなかったのに対し、ＲＣＡ_１２０では１５００〜２０００Ｈｚの周波数の変化が認められた。このことから、本発明の共重合体を固定化し、糖鎖ポリマーブラシを形成したセンシング面が、レクチン（ＲＣＡ_１２０）と特異的結合を示し、タンパク質の非特異的吸着をほとんど示さないことが確認された。

【0110】

２．ラット初代肝実質細胞の接着による評価（Ｉ）
（培養基板表面への糖鎖ポリマーブラシの形成）
（１）第１の工程：ガラス基板表面へのアジド基の修飾
ガラス基板表面へのアジド基の修飾は、シランカップリング反応により行った。シランカップリング剤には、工程１にて合成した式（２）で表される３−アジドプロピルトリエトキシシランを用いた。３−アジドプロピルトリエトキシシランの１ｖｏｌ％トルエン溶液を調製し、脱脂綿でガラス基板表面に薄く塗布し、ヘアドライアーで数秒間加熱と乾燥を３回繰り返した。

【0111】

（２）第２の工程：クリック反応
第１の工程においてアジド基を修飾したガラス基板表面上に、工程１３にて合成した式（２７）で表されるＰｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａの粉末を少量（１ｃｍ^２当たり１ｍｇ未満）ふりかけた後、クリック反応溶液を部分的に塗布し、１８時間放置した。なお、クリック反応溶液には、硫酸銅（ＩＩ）・５水和物１０ｍｇとアスコルビン酸ナトリウム１５ｍｇとを、ｔ−ＢｕＯＨ／ミリＱ水（１：１）⇒（１０ｍｌ／１０ｍｌ）溶液に溶解したものを用いた。反応終了後は、ガラス基板表面をアセトン、メタノール、ミリＱ水の順でよく洗浄し、乾燥した。

【0112】

（３）第３の工程：糖鎖の脱保護反応
糖鎖の脱保護反応は、既知の方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ，２００４，５，２２４−２３１）を参考に行った。第２の工程においてクリック反応させたガラス基板を、ヒドラジン一水和物の３ｖｏｌ％ ＤＭＳＯ溶液に浸漬し、密閉状態で５時間放置した。反応終了後、ガラス基板表面をアセトン、メタノール、ミリＱ水の順でよく洗浄し、乾燥した後、これを培養基板として用いた。

【0113】

（細胞接着の確認）
細胞接着による評価には、細胞表面にラクトース認識サイトの存在が知られているラット初代肝実質細胞（ヘパトサイト）を用いた。
ラット（７週齢、オス）からコラゲナーゼ溶液により肝細胞を分離し、遠心分離（５０×ｇ，２ｍｉｎ）を３回行い、肝細胞を精製した。この精製した肝細胞を、上記培養基板に、３．０×１０^６ｃｅｌｌｓ播種し、培養した。なお、培養基板全体への細胞接着を避けるために、肝細胞の培養には無血清のＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（５０ｍｌ ＦＢＳ，１０ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン）を用いた。

【0114】

培養結果を図５に示す。図中の矢印は、培養基板上のＰｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａを固定化した位置を示す。ヘパトサイトは、Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａにより糖鎖ポリマーブラシを形成した部位にのみ選択的に、球状で接着することが確認された（図５の点線より下側）。

【0115】

３．ラット初代肝実質細胞の分化機能に対する効果（Ｉ）
試験には、２．と同様にラット肝実質細胞を用いた。ラット（７週齢、オス）からコラゲナーゼ溶液により肝細胞を分離し、遠心分離（５０×ｇ，２ｍｉｎ）を３回行い、肝細胞を精製した。この精製した肝細胞を無血清のＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地を用いて１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞懸濁液を、１２ｗｅｌｌプレートに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種し（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）、培養した。なお、基板には、ラクトースグリコポリマー（Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａ）基板とゼラチン修飾基板とを用いた。ラクトースグリコポリマー基板表面への糖鎖ポリマーブラシの形成は、上記２．（１）〜（３）と同様の方法にて行った。培養６時間後に、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（添加因子無し，１０％ ＦＢＳ，２％ペニシリン−ストレプトマイシン）と、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（添加因子有り，１０％ ＦＢＳ，２％ペニシリン−ストレプトマイシン，１０^−６Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ，１０^−７ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，０．３ｍｇ／ｍｌ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）とに培地交換を行った。

【0116】

そして、１，２，３，４日目に細胞の形態を観察するとともに、ＭＴＴアッセイ及びアルブミン産生量の測定を行った。なお、ＭＴＴアッセイは常法に従った。アルブミン産生量の測定は、以下の方法により行った。
（１）培地の上澄みを１ｍｌ採取し、−８０℃で保存した。
（２）９６ｗｅｌｌプレートに５０００倍希釈した一次抗体（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ｒａｔ ＩｇＧ）を１００μｌずつ加えて、１時間静置した。
（３）ｗｅｌｌ内の溶液を吸い取り、洗浄液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。
（４）０．１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を２００μｌ加えて、３０分間静置した。
（５）ｗｅｌｌ内の溶液を吸い取り、洗浄液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。
（６）試料溶液を１００μｌずつ加えて、１時間静置した。
（７）ｗｅｌｌ内の溶液を吸い取り、洗浄液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。
（８）二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｔ ａｌｂｕｍｉｎ ＩｇＧ）を１００μｌずつ加えて、１時間静置した。
（９）ｗｅｌｌ内の溶液を吸い取り、洗浄液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。
（１０）発色試薬（ＳＡＴ Ｂｌｕｅ）を５０μｌずつ加えて、ｗｅｌｌ内の溶液が青色になるまで反応させた。
（１１）溶液が青くなった後、反応停止液（１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液）を５０μｌずつ加えた。
（１２）マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、アルブミン産生量を測定した。

【0117】

培養結果を図６に示す。ラクトースグリコポリマー基板は、ゼラチン修飾基板よりも、アルブミン産生量が高かった。このことから、ラクトースグリコポリマー基板では、初代肝細胞の分化機能が活性化され、且つ、維持されることが明らかとなった。これは、ラクトースグリコポリマー基板によれば、細胞がアシアロ糖タンパク受容体を介し、且つ、球状で接着されるためであると思われる。

【0118】

４．ラット初代肝実質細胞の分化機能に対する効果（ＩＩ）
試験には、上記２．と同様にラット肝実質細胞を用いた。ラット（７週齢、オス）からコラゲナーゼ溶液により肝細胞を分離し、遠心分離（５０×ｇ，２ｍｉｎ）を３回行い、肝細胞を精製した。この精製した肝細胞を無血清のＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地を用いて１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞懸濁液を、１２ｗｅｌｌプレートに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種し（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）、培養した。なお、基板には、ラクトースグリコポリマー（Ｐｏｌｙ−［Ｌａｃ（ＯＡｃ）_７−Ａ−ｃｏ−ＨＥＡ］−ｂ−Ａｌｋｙｎｅ−Ａ）基板とゼラチン修飾基板とを用いた。ラクトースグリコポリマー基板表面への糖鎖ポリマーブラシの形成は、上記２．（１）〜（３）と同様の方法にて行った。培養６時間後に、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（ＥＧＦ無し，１０％ ＦＢＳ，２％ペニシリン−ストレプトマイシン，１０^−６Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ，１０^−７ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，０．３ｍｇ／ｍｌ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）と、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（ＥＧＦ有り，１０％ ＦＢＳ，２％ペニシリン−ストレプトマイシン，１０^−６Ｍ Ｉｎｓｕｌｉｎ，１０^−７ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，０．３ｍｇ／ｍｌ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ＥＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌ）と、に培地交換を行った。

【0119】

そして、１，２，３，４日目に細胞の形態を観察するとともに、ＭＴＴアッセイ及びアルブミン産生量の測定を行った。なお、ＭＴＴアッセイは常法に従った。アルブミン産生量の測定は、上記と同様の方法により行った。

【0120】

培養結果を図７に示す。ラクトースグリコポリマー基板は、ゼラチン修飾基板よりも、アルブミン産生量が高かった。このことから、ラクトースグリコポリマー基板では、初代肝細胞の分化機能が活性化され、且つ、維持されることが明らかとなった。これは、ラクトースグリコポリマー基板によれば、細胞がアシアロ糖タンパク受容体を介し、且つ、球状で接着されるためであると思われる。

【0121】

５．ラット初代肝実質細胞の接着による評価（ＩＩ）
試験には、２．と同様にラット肝実質細胞を用いた。ラット（７週齢、オス）からコラゲナーゼ溶液により肝細胞を分離し、遠心分離（５０×ｇ，２ｍｉｎ）を３回行い、肝細胞を精製した。この精製した肝細胞を無血清のＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（２％ペニシリン−ストレプトマイシン）を用いて５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した細胞懸濁液に、アシアロフェツィン（ＡＳＦ）を濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、４℃で３０分間プレインキュベートした。また、アシアロフェツィン濃度０μｇ／ｍｌの細胞懸濁液も同様に、４℃で３０分間プレインキュベートした。その後、１２ｗｅｌｌプレートに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種し、３７℃で６時間培養した。

【0122】

培養結果を図８，９に示す。図８に示すように、ゼラチン修飾基板（ＡＳＦ １０μｇ／ｍｌ）では、接着阻害が認められなかった。これに対して、ラクトースグリコポリマー基板（ＡＳＦ １０μｇ／ｍｌ）において、接着阻害が認められた（図９）。このことから、ラクトースグリコポリマー基板は、糖鎖特異的に初代肝細胞を接着できる表面であると思われる。

【0123】

以上の結果から、ラクトースグリコポリマーはブラシ構造を有しているので、ラクトースに特異的な肝細胞接着を容易に達成することができたものと考えられる。そして、添加因子やＥＧＦを添加することによって、更にアルブミン産生能の有意な上昇が認められたものと考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図6】

【図7】

【図5】

【図8】

【図9】