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特許5674798自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、臓器移植に伴う症状の治療薬および予防薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5674798
(24)【登録日】2015年1月9日
(45)【発行日】2015年2月25日
(54)【発明の名称】自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、臓器移植に伴う症状の治療薬および予防薬
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20150205BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20150205BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20150205BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20150205BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20150205BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20150205BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20150205BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20150205BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 DZNA
A61K39/395 N
A61K31/713
A61K31/7105
A61P37/06
A61P29/00
A61P29/00 101
A61K48/00
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
【請求項の数】8
【全頁数】34
(21)【出願番号】特願2012-534040(P2012-534040)
(86)(22)【出願日】2011年9月14日
(86)【国際出願番号】JP2011071022
(87)【国際公開番号】WO2012036214
(87)【国際公開日】20120322
【審査請求日】2013年2月15日
(31)【優先権主張番号】特願2010-292031(P2010-292031)
(32)【優先日】2010年12月28日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2010-208534(P2010-208534)
(32)【優先日】2010年9月16日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】平野 俊夫
(72)【発明者】
【氏名】村上 正晃
【審査官】
佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００６−１７４７４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１０−５０００２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００９／０３６１０１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
小椋英樹 他，サイトカインと疾患 IL-6誘導性の”炎症アンプ”と自己免疫疾患，医学のあゆみ，２０１０年 ７月３１日，Vol.234, No.5，pp.495-500
【文献】
OGURA, H., et al.，Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induct，Immunity, 2008, Vol.29, No.4, pp.628-636
【文献】
The EMBO Journal, 1991, Vol.10, No.12, pp.3675-3682
【文献】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, Vol.101, No.38, pp.13921-13926
【文献】
竹内万彦，特集II アレルギー疾患と炎症・リモデリング, アレルギー性鼻炎とリモデリング，臨床免疫・アレルギー科, 2009, Vol.52, No.1, pp.72-77
【文献】
PRADA, P. O., et al.,，EGFR Tyrosine Kinase Inhibitor (PD153035) Improves Glucose Tolerance and Insulin Action in High-Fat，Diabetes, 2009, Vol.58, No.12, pp.2910-2919
【文献】
Biotherapy, 2011.03, Vol.25, No.2, pp.627-632
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エピレギュリンタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、自己免疫疾患からなる群より選ばれる少なくとも１種の疾患もしくは症状の、治療薬または予防薬であって、前記化合物が、
エピレギュリンタンパク質に特異的に結合する抗体；並びに
エピレギュリンタンパク質をコードする遺伝子を標的とするsiRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群から選ばれる少なくとも１種のRNA分子または該RNA分子を発現することができるベクター；
からなる群から選ばれる少なくとも１種である、治療薬または予防薬。
エピレギュリンタンパク質に特異的に結合する抗体；並びに
エピレギュリンタンパク質をコードする遺伝子を標的とするsiRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群から選ばれる少なくとも１種のRNA分子または該RNA分子を発現することができるベクター；
からなる群から選ばれる少なくとも１種である、治療薬または予防薬。
【請求項2】
自己免疫疾患が、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎、多発性硬化症、動脈硬化、クローン病、潰瘍性大腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、および関節リウマチ症からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の治療薬または予防薬。
【請求項3】
自己免疫疾患が、関節リウマチ症および多発性硬化症からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の治療薬または予防薬。
【請求項4】
前記化合物が、エピレギュリンタンパク質に特異的に結合する抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬または予防薬。
【請求項5】
前記化合物が、エピレギュリンタンパク質をコードする遺伝子を標的とするsiRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群から選ばれる少なくとも１種のRNA分子または該RNA分子を発現することができるベクターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬または予防薬。
【請求項6】
前記化合物が、エピレギュリンタンパク質をコードする遺伝子を標的とするshRNAである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬または予防薬。
【請求項7】
自己免疫疾患からなる群より選ばれる少なくとも１種の疾患もしくは症状の治療薬または予防薬の有効成分を、被験物質の中からスクリーニングする方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質が、エピレギュリンタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）においてエピレギュリンタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を、前記治療薬または予防薬の有効成分として選択する工程
であって、被験物質が、抗体またはタンパク質の発現を抑制できる核酸である、スクリーニング方法。
（ｉ）被験物質が、エピレギュリンタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）においてエピレギュリンタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を、前記治療薬または予防薬の有効成分として選択する工程
であって、被験物質が、抗体またはタンパク質の発現を抑制できる核酸である、スクリーニング方法。
【請求項8】
自己免疫疾患が、関節リウマチ症および多発性硬化症からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、主に自己免疫疾患、炎症性疾患およびアレルギー性疾患などの疾患の治療薬および予防薬、ならびに臓器移植に伴う症状の治療薬および予防薬に関する。さらに、本願発明は、当該疾患もしくは症状の治療薬または予防薬の有効成分をスクリーニングする方法にも関する。【背景技術】
【0002】
炎症反応が制御不能となる慢性炎症性疾患は多数の患者において発症する疾患であり、大きな社会問題となっている。慢性炎症性疾患の一例である自己免疫疾患の場合、我が国の場合は人口の１％以上が発症することが知られている。炎症反応は生体にとってそれほどまれではないが、それを起点とする病気が生じる場合、なぜ炎症反応が制御不能になるのかとの疑問の答えは、未だに得られていない。炎症反応の引き金は、外来抗原が局所で生じさせる自然免疫反応、抗原特異的な獲得免疫反応、さらに各個人の遺伝的背景、環境等が複雑に絡み合って生じると考えられている。これらの反応は非常に多くの分子の制御によって引き起こされるので、その分子レベルでの理解、さらには治療や予防方法の確立への応用は十分に進んでいないのが現状である。【0003】
サイトカインは、免疫応答時に様々な細胞により産生されて、免疫反応の強弱を制御することが知られている一群の低分子タンパク質である。サイトカイン、特に炎症性サイトカインと呼ばれる一群（例えば、インターロイキン-6（IL-6）など）の過剰な産生が、炎症反応を惹起すると考えられている。近年、活性化すると多くの炎症性サイトカインの一種であるIL-17Aを産生するTh17細胞が見出され、Th17細胞が多くの自己免疫疾患（関節リウマチ、糖尿病、自己免疫性脳脊髄炎等）に重要であることが示されてきた（非特許文献１）。また、免疫細胞と線維芽細胞等の非免疫細胞の相互作用が自己免疫病の発症に重要であることも示されていた（非特許文献２）。これらの知見をさらに発展させ、Th17細胞から産生されるIL-17Aが、IL-6と協調して線維芽細胞（I型コラーゲン陽性細胞）に作用して、さらに多くのIL-6および免疫担当細胞の遊走を規定する分子、ケモカインを産生するという「IL-17A誘導性のIL-6産生増幅ループ」（IL-6アンプ（IL-6 Amplifier））の存在が示され（図1参照）、このIL-6アンプの暴走（Dysregulation）がマウスにおける自己免疫性関節炎(F759関節炎）および自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症および病態進行において重要であることも示されている（非特許文献１）。【0004】
以上の知見から、IL-6アンプの活性を人為的に制御することで、生体の免疫反応をコントロールできる可能性が示唆されていた。特に、IL-6アンプの活性を人為的に減弱することで、自己免疫疾患の治療ないし予防が達成できることが期待されていた。しかしながら、具体的にいかなる方法で所望のIL-6アンプの活性の制御が可能となるかは、一切知られていないのが現状である。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ogura H, Murakami M, Okuyama Y, Tsuruoka M, Kitabayashi C, Kanamoto M, Nishihara M, Iwakura Y, Hirano T. Immunity. 2008 Oct 17; 29(4):628-36.
【非特許文献2】Sawa S, Kamimura D, Jin GH, Morikawa H, Kamon H, Nishihara M, Ishihara K, Murakami M, Hirano T. J Exp Med. 2006 Jun 12; 203(6):1459-70.
【非特許文献3】Ohtani T, Ishihara K, Atsumi T, Nishida K, Kaneko Y, Miyata T, Itoh S, Narimatsu M, Maeda H, Fukada T, Itoh M, Okano H, Hibi M, Hirano T. Immunity. 2000 Jan; 12(1):95-105.
【非特許文献4】Igarashi H, Hashimoto J, Tomita T, Yoshikawa H, Ishihara K. Clin Exp Immunol. 2010 Jul 1;161(1):71-80.
【非特許文献5】Sano S, Chan KS, DiGiovanni J.J Dermatol Sci. 2008 Apr; 50(1):1-14.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、IL-6アンプの活性を人為的に制御し、生体の免疫反応をコントロールできる自己免疫疾患、炎症性疾患、およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に伴う症状などの疾患および症状に対する、新規な治療薬または予防薬を提供すること、および当該治療薬または予防薬の有効成分をスクリーニングするための方法を提供することを主な目的とする。さらに、本発明は、免疫抑制剤、炎症性サイトカイン産生抑制剤およびIL-6アンプ抑制剤を提供することをも目的とする。【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制することによって、IL-6アンプの活性の著しい抑制に基づくと推測される、IL-6産生の低減が誘導されることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてさらに改良を重ねることによって完成したものである。【0008】
すなわち、本発明は、下記態様の発明を包含する：項１、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患および臓器移植に伴う症状からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは症状の、治療薬または予防薬。
【0009】
項２、ErbB1経路に属するタンパク質が、ErbB1タンパク質およびErbB1タンパク質のリガンドタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１に記載の治療薬または予防薬。【0010】
項３、ErbB1経路に属するタンパク質が、エピレギュリンである、項１または２に記載の治療薬または予防薬。【0011】
項４、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物が、該タンパク質に特異的に結合する抗体である項１〜３のいずれかに記載の治療薬または予防薬。【0012】
項４−１、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物が、該タンパク質に特異的に結合し、該タンパク質の機能を阻害できる抗体である項１〜３のいずれかに記載の治療薬または予防薬。【0013】
項５、ErbB1経路に属するタンパク質の機能を阻害することができる化合物が、該タンパク質をコードする遺伝子を標的とするsiRNA、shRNAおよびmiRNAからなる群から選ばれる少なくとも１種のRNA分子または該RNA分子を発現することができるベクターである、項１〜３のいずれかに記載の治療薬または予防薬。【0014】
項６、ErbB1経路に属するタンパク質の機能を阻害することができる化合物が、ErbB1タンパク質に対する特異的なキナーゼ阻害剤である、項１または２に記載の治療薬または予防薬。【0015】
項７、ErbB1経路に属するタンパク質の機能を阻害することができる化合物が、PD153035、PD168393、ゲフィチニブおよびエルロチニブからなる群から選ばれる少なくとも１種である、項６に記載の治療薬または予防薬。【0016】
項８、疾患もしくは症状が、炎症性サイトカインの過剰発現により惹起されるものである、項１〜７のいずれかに記載の治療薬または予防薬。【0017】
項９、疾患もしくは症状が、自己免疫疾患である項１〜８のいずれかに記載の治療薬または予防薬。【0018】
項１０、自己免疫疾患が、関節リウマチ症および多発性硬化症からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１〜９のいずれかに記載の治療薬または予防薬。【0019】
項１１、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、免疫抑制剤。【0020】
項１２、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患および臓器移植に伴う症状からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは症状を治療または予防するための、項１１に記載の免疫抑制剤。【0021】
項１３、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、炎症性サイトカイン産生抑制剤。【0022】
項１４、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、IL-６アンプ抑制剤。【0023】
項１５、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患および臓器移植に伴う症状からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは症状の治療薬または予防薬の有効成分を、被験物質の中からスクリーニングする方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：（ｉ）被験物質が、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）においてErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を、前記治療薬または予防薬の有効成分として選択する工程。
【0024】
項１６、ErbB1経路に属するタンパク質が、ErbB1タンパク質およびErbB1タンパク質のリガンドタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１５に記載のスクリーニング方法。【0025】
項１７、ErbB1経路に属するタンパク質が、エピレギュリンである、項１５または１６に記載のスクリーニング方法。【0026】
項１８、疾患もしくは症状が、自己免疫疾患である項１５〜１７のいずれかに記載のスクリーニング方法。【0027】
項１９、自己免疫疾患が、関節リウマチ症および多発性硬化症からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１５〜１８のいずれかに記載のスクリーニング方法。【0028】
項２０、被験物質が、抗体またはタンパク質の発現を抑制できる核酸である、項１５〜１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。【0029】
項２１、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を投与する工程を含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患および臓器移植に伴う症状からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは症状の、治療方法または予防方法。【0030】
項２２、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患および臓器移植に伴う症状からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは症状を、治療または予防に使用するための、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物。【0031】
項２３、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物の、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患および臓器移植に伴う症状からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは症状の、治療薬または予防薬を製造するための使用。【発明の効果】
【0032】
本発明による、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に伴う症状などの疾患および症状に対する、従来はなかった治療薬または予防薬、ならびに、本発明によりスクリーニングされる該疾患もしくは症状の治療薬または予防薬は、IL-6アンプの活性を人為的に制御し、生体の免疫反応をコントロールでき、当該疾患などの治療技術の向上を担うことが期待される。また、本発明による、新規の免疫抑制剤、炎症性サイトカイン産生抑制剤およびIL-6アンプ抑制剤は、上記疾患などの治療技術の向上に加えて、免疫学の基礎研究における有用なツールとなり得るため、上記疾患などの治療技術のさらなる向上や医学分野全体の進展の基盤となることが期待される。【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】IL-6アンプの模式図を示す。Dysregulation of IL-6 Amplifier：IL6-アンプの暴走、Autoimmune Diseases：自己免疫疾患。
【図2】（A）ErbB1経路の模式図を示す。（B）HERファミリーレセプター（HER Family Receptors）の概略を示す。
【図3】shRNAによるErbB1の発現抑制がIL-6アンプに与える効果の測定結果をmIL-6タンパク質の産生量示す。h7-1、h7-2およびh7-3は、それぞれErbB1遺伝子に対して特異的なshRNAをコードする、異なるレンチウイルスを導入したクローンを示す。
【図4】ウシ胎児血清（FBS）の有無がIL-6アンプに与える効果の測定結果を示す。（A）mIL-6タンパク質の産生量および相対細胞生存率（Relative Cell Survival）、ならびに、（B）mIL-6遺伝子の発現量（IL6 mRNA Expression）を、対照となるHPRT遺伝子の発現量に対する相対比で示す。
【図5】特定の成長因子がIL-6アンプに与える効果の測定結果を示す。（A）EGFタンパク質、（B）HB-EGFタンパク質、（C）エピレギュリンタンパク質の効果をそれぞれmIL-6タンパク質の産生量により示す。
【図6】特定の成長因子がIL-6アンプに与える効果の測定結果を示す。（A）VEGFタンパク質、（B）PDGF-CCタンパク質、（C）FGF7タンパク質の効果をそれぞれmIL-6タンパク質の産生量により示す。
【図7】エピレギュリンタンパク質の添加がIL-6アンプの標的遺伝子の発現量に与える効果の測定結果を示す。（A）および(C)はBC-1細胞、（B）および(D)はMEF細胞での結果を示す。（A）および(B)はmIL-6遺伝子の発現量（IL6 mRNA Expression）、ならびに（C）および(D)はCCL20遺伝子の発現量（Ccl20 mRNA Expression）のそれぞれを、対照群に対する相対比で示す。
【図8】IL-6アンプの活性化においてエピレギュリンタンパク質の受容体を検証した結果を示す。（A）PD153035、および（B）ErbB2 Inhibitor IIの効果を、mIL-6タンパク質の産生量により示す。
【図9】IL-6アンプの活性化がエピレギュリン遺伝子の発現量へ与える効果の測定結果を示す。（A）および(C)はBC-1細胞、（B）および(D)はMEF細胞での結果を示す。マウスエピレギュリン遺伝子の発現量を、対照群に対する相対比で示す。
【図10】ヒト関節リウマチ症患者由来の滑膜細胞における、IL-6アンプへのエピレギュリンタンパク質の関与の測定結果を示す。hIL-6遺伝子の発現量を、対照群に対する相対比で示す。
【図11】（A）F759/F759-STAT3fl/fl-K5 Creマウスの外観所見を示す。（B）F759/F759-STAT3fl/fl-K5 Creマウスおよび（C）F759/F759-STAT3fl/flマウスの、皮膚組織のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色像を示す。
【図12】ErbB1の阻害剤がIL-6アンプに与える効果の測定結果を示す。（A）BC-1細胞におけるPD153035の効果、（B）MEF細胞におけるPD153035の効果、（C）BC-1細胞におけるPD168393の効果、および（D）MEF細胞におけるPD168393の効果をそれぞれmIL-6タンパク質の産生量により示す。対照群である、BC-1細胞における（E）FGF RTK阻害剤の効果、および（F）FGF/PDGF/VEGF RTK阻害剤の効果をmIL-6タンパク質の産生量により示す。
【図13】PI3キナーゼの阻害剤がIL-6アンプに与える効果の測定結果を示す。（A）LY294002、および（B）PIK75の効果を、mIL-6タンパク質の産生量により示す。
【図14】マウスの踝における関節炎の症状の評価方法を示す。（A）正常、臨床スコア（Clinical score）は0、（B）重度の関節炎、踝関節の可動域が正常と比べて60°狭い、臨床スコア（Clinical score）は3。
【図15】サイトカイン（Cytokine）誘導関節炎マウスにおけるErbB1阻害剤投与の効果を示す。（A）PD153035の効果、（B）PD168393の効果をそれぞれ臨床スコア（Clinical score）により示す。
【図16】サイトカイン（Cytokine）誘導関節炎マウスにおける（A）エピレギュリン遺伝子に対するshRNA（Ereg sh #1〜#3）の効果および（C）抗エピレギュリン抗体の効果をそれぞれ臨床スコア（Clinical score）により示す。（B）はエピレギュリン遺伝子に対するshRNAのノックダウン効率を、エピレギュリン遺伝子の相対発現量（Relative Epiregulin mRNA Expression）により示す。（A）および（C）の横軸は、注射後の経過時間（日、Time (Days)）を示す。
【図17】実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）マウスの作製方法の概略を示す。
【図18】EAEマウスに対する（A）エピレギュリン特異的に結合する抗体（Anti Epiregulin）、および（B）ゲフィチニブ（gefitinib、商品名：イレッサ）の効果を臨床スコア（Clinical score）により示す。横軸は、病原性のTh17細胞注射後の経過時間（日、Days after pathogenic Th17 transfer）を示す。
【図19】サイトカイン（Cytokine）誘導関節炎マウスにおけるErbB1（Egfr）遺伝子に対するshRNA（Egfr sh #1〜#3）の効果を臨床スコア（Clinical score）により示す。横軸は、注射後の経過時間（日、Time (Days)）を示す。
【図20】サイトカイン（Cytokine）誘導関節炎マウスにおけるゲフィチニブ（gefitinib、商品名：イレッサ）の効果を臨床スコア（Clinical score）により示す。横軸は、注射後の経過時間（日、Time (Days)）を示す。
【図21】shRNAによるエピレギュリン遺伝子の発現抑制がIL-6アンプに与える効果を、mIL-6タンパク質の産生量により示す。図中、白色棒はエピレギュリンタンパク質を添加しない条件（Epiregulin(-)）、黒色棒はエピレギュリンタンパク質を添加した条件（Epiregulin(+)）をそれぞれ示す。mockは非特異的shRNAを発現するクローンでの結果、sh-Eregはエピレギュリン遺伝子に対する特異的なshRNAを発現するクローンでの結果をそれぞれ示す。（A）48時間、および（B）72時間培養後のmIL6タンパク質の産生量を示す。
【図22】（A）ヒト滑膜線維芽細胞において、エピレギュリンタンパク質の添加がヒトIL-6遺伝子の発現量（hIL6 mRNA Expression）の発現量に与える効果の測定結果を示す。測定結果は、対照群に対する相対比で示す。(B)ヒト滑膜線維芽細胞において、ErbB1の阻害剤PD153035がIL-6アンプに与える効果の測定結果を示す。測定結果は、ヒトIL-6遺伝子の発現量（hIL6 mRNA Expression）の対照群に対する相対比で示す。
【図23】ヒト滑膜線維芽細胞において、IL-6アンプの活性化がエピレギュリン遺伝子の発現量へ与える効果の測定結果を示す。ヒトエピレギュリン遺伝子の発現量を、対照群に対する相対比で示す。
【0034】
なお、図面中において、「NS」は有意差なし（no significance）、「*」はt検定によるp値＜0.05の有意差、「**」はt検定によるp値＜0.01の有意差、および「***」はt検定によるp値＜0.001の有意差をそれぞれ示す。【0035】
また、図中「−」は無添加、および「＋」は添加をそれぞれ表す。図８、１２および１３において、各阻害剤の添加量は、それぞれ左が添加量が少なく、右へ向かい添加量が増大した条件を表す。【発明を実施するための形態】
【0036】
（１）治療薬または予防薬本発明は、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびアレルギー性疾患などの疾患の、ならびに臓器移植に伴う症状などの治療薬または予防薬に関する。本発明の治療薬または予防薬は、上記疾患または症状などの、治療または予防のための医薬組成物であってもよい。
【0037】
本発明の治療薬または予防薬が対象とする疾患および症状は、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患の疾患および臓器移植に伴う症状である（以下、「疾患など」と記載する場合もある）。本発明の治療薬または予防薬は、上記疾患または症状から選ばれる少なくとも１つを対象とすることができる。好ましくは、上記疾患などは、自己免疫疾患である。上記疾患などは、抗原に反応する免疫反応によって引き起こされる、サイトカイン（特にIL-1、IL-6、IL-17、TNFαなど、好ましくはIL-6等の炎症性サイトカインが過剰に産生されることによると考えられる炎症を伴う。従って、本発明の治療薬または予防薬が対象とする疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくはアレルギー性疾患などの疾患に伴う炎症、または臓器移植などに起因の炎症であってもよい。あるいは、上記疾患などは、サイトカイン（好ましくは、炎症性サイトカイン）の過剰発現により惹起される自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、または臓器移植に伴う症状であってもよい。【0038】
上記疾患などのうちの自己免疫疾患は、体の種々の部位において症状が現れる多様な病態を含みうる。例えば、上記自己免疫疾患は、脳神経系の自己免疫疾患、血液循環器系の自己免疫疾患、腸・消化器系の自己免疫疾患などの特定器官の自己免疫疾患を含むが、これに限定されるものではない。脳神経系の自己免疫疾患として、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎、多発性硬化症などが例示されるが、これに限定されるものではない。血液循環器系の自己免疫疾患としては動脈硬化などが例示されるが、これに限定されるものではない。腸・消化器系の自己免疫疾患としては、クローン病、潰瘍性大腸炎などが例示されるが、これに限定されるものではない。無論、その他の器官・臓器の自己免疫疾患、例えば慢性腎炎、慢性炎症性肺疾患など、ならびに全身性の自己免疫疾患、例えば糖尿病、関節リウマチ症などの自己免疫疾患も当然含まれる。上記自己免疫疾患は、好ましくは関節リウマチおよび多発性硬化症であり、より好ましくは多発性硬化症である。あるいは、上記自己免疫疾患は、関節リウマチを除く自己免疫疾患であってもよい。【0039】
上記疾患などのうちの炎症性疾患は、体の種々の部位において症状が現れる多様な炎症性疾患を含みうる。上記炎症性疾患は、形態上の分類による変質性、滲出性、増殖性のいずれであってもよい。また、上記炎症性疾患は、経過の分類による急性および慢性のいずれであってもよいが、慢性炎症であることが好ましい。例えば、上記炎症性疾患は、脳神経系の炎症性疾患、血液循環器系の炎症性疾患、腸・消化器系の炎症性疾患などの特定器官の炎症性疾患を含むが、これに限定されるものではない。【0040】
上記疾患などのうちのアレルギー性疾患は、特に限定されるものではないが、炎症を伴うアレルギー性疾患が、好ましい病態として例示される。上記アレルギー性疾患の具体的病態としては、クームス（Coombs）の分類によるＩＶ型アレルギー反応（遅延型アレルギー反応）を伴う接触性皮膚炎など、ならびにＩＶ型には分類されないが炎症を伴うアレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、急性散在性脳脊髄炎および花粉症などが例示されるが、これに限定されるものではない。【0041】
上記疾患などのうちの臓器移植に伴う症状は、特に限定されるものではないが、臓器移植に伴い、臓器提供者（ドナー）および臓器受給者（レシピエント）の臓器の間に生じる免疫応答に起因する症状、好ましくは炎症が例示される。上記臓器移植に伴う症状の具体的な病態として、移植片対宿主病、ならびに急性および慢性の拒絶反応が例示されるが、これに限定されるものではない。【0042】
本発明が対象とする疾患などは、当該疾患などが発症するあらゆる動物におけるものを含む。上記疾患などはヒトならびにサル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマなどの非ヒト哺乳類における疾患などであることが好ましく、ヒトおよびマウスにおける疾患などであることがより好ましく、ヒトにおける疾患などであることが特に好ましい。【0043】
本発明の予防または治療薬は、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含むものである。上記ErbB1経路は図２（A）に示す当業者において公知のシグナル経路であり、上記タンパク質は、受容体であるErbB1タンパク質、ならびにErbB1タンパク質のリガンドおよび下流エフェクターからなる。【0044】
上記受容体は、ErbB1タンパク質（別名、HER1またはEGFR）である。ErbB1タンパク質は、HERファミリーに属する、公知のチロシンキナーゼ型受容体（レセプター）である。なお、HERファミリーに属するタンパク質として、ErbB1タンパク質以外に、ErbB2タンパク質（別名、HER2またはNeu）、ErbB3タンパク質（別名、HER3）およびErbB4タンパク質（別名、HER4）が知られているが、後述の実施例に示すようにErbB2タンパク質はErbB1タンパク質とは区別され、またErbB3タンパク質およびErbB4タンパク質は、ErbB1経路に属さないことは公知である。【0045】
上記リガンドは、受容体であるErbB1タンパク質に対するリガンドである。上記リガンドの公知の具体例としてEGFタンパク質、HB-EGFタンパク質、TGFαタンパク質、エピレギュリン（Epiregulin）タンパク質、アンフィレギュリン（Amphiregulin）タンパク質、ベータセルリン（Betacellulin）タンパク質などが例示されるが、これに限定されない。好ましくは、上記リガンドはEGFタンパク質、HB-EGFタンパク質およびエピレギュリンタンパク質であり、より好ましくはエピレギュリンタンパク質である。【0046】
上記下流エフェクターは、例えば、ERK経路に属するタンパク質（Grb2タンパク質、Rasタンパク質、ERK（MAPK）タンパク質など）、PI3キナーゼ／Akt／NF-κB経路に属するタンパク質（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3キナーゼ、PI3K）、Aktタンパク質、GSK３タンパク質、eIF2Bタンパク質、NF-κBタンパク質など）、JAK/STAT経路に属するタンパク質（JAKタンパク質、STATタンパク質など）等が例示されるが、これらに限定されない。上記下流エフェクターとしてはPI3キナーゼ／Akt／NF-κB経路に属するタンパク質が好ましく、PI3キナーゼおよびNF-κBがより好ましく、PI3キナーゼが特に好ましい。【0047】
PI3キナーゼは、触媒ユニット（p110）および制御ユニット（p85）からなる二量体耐タンパク質であると考えられている。PI3キナーゼは、p110のサブタイプにより分類することができ、p110αを有するα型、p110βを有するβ型、p110γを有するγ型、p110δを有するδ型などが知られている。本発明において、上記PI3キナーゼは、特に限定されるものではないが、α型のPI3キナーゼであることが好ましい。【0048】
本発明において、ErbB1経路に属するタンパク質としてErbB1タンパク質およびエピレギュリンタンパク質が好ましく、エピレギュリンタンパク質が特に好ましい。【0049】
なお、上記タンパク質のアミノ酸配列および当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列はいずれも公知であり、例えば米国立衛生研究所(National Institute of Health, NIH)が公開するデータベースにて公開されている。また、ErbB1経路に属するタンパク質は、ヒト由来のものならびにサル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマなどの非ヒト哺乳類由来のもののいずれもが存在する。【0050】
本発明の治療薬または予防薬は、上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含むものである。本発明の治療薬または予防薬は、上記化合物を１種または２種以上含むことができる。上記化合物は、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる限度において特に限定されるものではない。ここで、「タンパク質の機能発現を抑制」とは、該タンパク質の機能発現を抑制するあらゆる態様を指し、例えば該タンパク質の機能を阻害すること、該タンパク質の発現を抑制すること（該タンパク質をコードする遺伝子の転写の抑制、該タンパク質の翻訳の抑制など）などが例示されるが、これに限定されない。該タンパク質の機能を阻害する態様として、例えば、上記タンパク質がErbB1タンパク質である場合は、ErbB1タンパク質とリガンドとの結合を阻害する、ErbB1タンパク質の二量体化を阻害する、ErbB1タンパク質のチロシンキナーゼ活性などの酵素活性を阻害するなどの態様が例示されるが、これに限定されない。上記タンパク質がErbB1タンパク質のリガンドである場合は、ErbB1タンパク質とリガンドとの結合を阻害するなどの態様が例示されるが、これに限定されない。上記タンパク質がErbB1タンパク質の下流エフェクターである場合は、該タンパク質とErbB1タンパク質またはその他の標的タンパク質との結合を阻害する、該タンパク質が有するキナーゼ活性などの酵素活性を阻害するなどの態様が例示されるが、これに限定されない。【0051】
上記化合物の具体例として、ErbB1経路に属するタンパク質の阻害剤、ErbB1経路に属するタンパク質に特異的に結合する抗体、ErbB1経路に属するタンパク質の発現を抑制できる核酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【0052】
上記ErbB1経路に属するタンパク質の阻害剤としては、公知のおよび将来開発されるあらゆるErbB1経路に属するタンパク質の阻害剤を用いることができる。好ましくは、上記阻害剤は、ErbB1経路に属するタンパク質の特異的な阻害剤である。【0053】
上記ErbB1タンパク質に対する阻害剤として、ErbB1タンパク質に対するキナーゼ阻害剤が例示されるが、これに限定されるものではない。ErbB1タンパク質に対するキナーゼ阻害剤の具体例として、公知のPD153035（4-[(3-Bromophenyl)amino]-6,7-dimethoxyquinazoline）、PD168393（4-[(3-Bromophenyl)amino]-6-acrylamidoquinazoline）、ゲフィチニブ（gefitinib）（N-(3-chloro-4-fluoro-phenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine、商品名：イレッサ（Iressa ）（登録商標））、エルロチニブ（erlotinib）（N-(3-ethynylphenyl)-6,7- bis(2-methoxyethoxy)-4-quinazolinamine、商品名：タルセバ（Tarceva）（登録商標））など、およびこれらの薬学的に許容される塩、ならびにこれらのいずれかの誘導体でありErbB1タンパク質のチロシンキナーゼ活性に対する阻害活性を有するものが例示される。【0054】
また、その他のErbB1タンパク質に対するキナーゼ阻害剤として、バンデタニブ（vandetanib）（N-(4-bromo-2-fluorophenyl)-6-methoxy-7-[(1-methylpiperidin-4-yl)methoxy]quinazolin-4-amine、商品名：（Zactima）（登録商標））、ラパチニブ（lapatinib）（n-[3-chloro-4-[(3-fluorophenyl)methoxy]phenyl]-6-[5-[(2-methylsulfonylethylamino)methyl]-2-furyl]quinazolin-4-amine、商品名：タイケルブ（Tykerb））、ARRY-543（4-N-[3-chloro-4-(thiazol-2-ylmethoxy)phenyl]-6-N-[(4R)-4-methyl-4,5-dihydrooxazol-2- yl]quinazoline-4,6-diamine bis(4-methylbenzenesulfonate)、アレイ・バイオファーマ・インコーポレイテッド（Array BioPharma Inc.））なども例示される。【0055】
さらに、上記ErbB1タンパク質に対する阻害剤として、XL647（別名：EXEL-7647、エクセリクス社（Exelixis））、PF-00299804（別名：PF299、ファイザー・インコーポレイテッド社（Pfizer Inc.））、TAK-285（武田薬品工業）などのキナーゼ阻害剤以外の阻害剤も例示される。【0056】
なお、上述するErbB1タンパク質に対するキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブ、エルロチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ARRY-543、XL647、PF-00299804およびTAK-285は、抗癌剤として知られている。【0057】
上記ErbB1タンパク質の下流エフェクターの特異的な阻害剤として、ErbB1タンパク質の下流エフェクターであるPI3キナーゼに対する特異的なキナーゼ阻害剤が例示されるが、これに限定されるものではない。PI3キナーゼに対する特異的なキナーゼ阻害剤として、LY294002（2-(4-Morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one）、PIK75（2-methyl-5-nitro-2-[(6-bromoimidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)methylene]-1-methylhydrazide-benzenesulfonic acid）およびそれら薬学的に許容される塩、ならびにそれらいずれかの誘導体であってPI3キナーゼに対する阻害活性を有するものが例示される。好ましくは、PI3キナーゼに対する特異的なキナーゼ阻害剤は、PIK75などのα型のPI3キナーゼに対する特異的なキナーゼ阻害剤である。【0058】
上記ErbB1経路に属するタンパク質に特異的に結合する抗体は、ErbB1経路に属するタンパク質の機能を阻害できる、あらゆる公知のおよび将来開発される抗体を用いることができる。好ましくは、上記抗体は、ErbB1経路に属するタンパク質の活性部位に結合し、その機能を阻害する抗体である。ここで、上記タンパク質が受容体であるErbB1タンパク質である場合は、上記活性部位とは、例えば該ErbB1タンパク質と該リガンドとの結合部位、該ErbB1タンパク質のチロシンキナーゼの酵素活性中心、該ErbB1タンパク質と下流エフェクターとの結合部位などを指すが、これに限定されない。上記タンパク質が前述のリガンド（例えば、エピレギュリンタンパク質）である場合は、上記活性部位とは、例えば該リガンドとErbB1タンパク質との結合部位などを指すが、これに限定されない。上記タンパク質がErbB1タンパク質の下流エフェクターである場合は、上記活性部位とは、例えば該下流エフェクターとErbB1タンパク質またはその他の標的タンパク質との結合部位、該タンパク質が有するキナーゼ活性などの酵素活性中心などを指すが、これに限定されない。【0059】
上記抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、いずれも当業者が公知の方法により適宜作成することができる。上記抗体がモノクローナル抗体である場合は、公知の方法により作成されるキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であってもよい。【0060】
上記抗体の具体例として、セツキシマブ（cetuximab）（商品名：アービタックス（Erbitux）（登録商標））、パニツマブ（panitumumab）（商品名：ベクチビックス(Vectibix)（登録商標））、ザルツムマブ（zalutumumab）（商品名：HuMax-EGFr）、ネシツムマブ(necitumumab、別名：IMC-11F8）、ニモツズマブ（nimotuzumab）（商品名：Theraloc、Vecthix、BiomAb-EGFR）、マツズマブ（matuzumab、別名：EMD 72000）、Ch806（ライフ・サイエンス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド社（Life Science Pharmaceuticals Inc.））などが例示されるが、これに限定されない。【0061】
なお、上述する抗体であるセツキシマブ、パニツマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブおよびCh806は、抗癌剤として知られている。【0062】
ErbB1経路に属するタンパク質がエピレギュリンタンパク質である場合、R&D Systems社、Cat# MAB1068などの中和活性を有する抗体が、ErbB1経路に属するタンパク質に特異的に結合する抗体の好ましい態様として例示される。【0063】
上記ErbB1経路に属するタンパク質の発現を抑制できる核酸は、具体的にはErbB1経路に属するタンパク質をコードする遺伝子を標的とするRNA分子および当該低分子RNAを発現できるベクター等のDNA分子が例示される。上記RNA分子の具体例としては、siRNA、shRNA、dsRNAなどのRNA干渉作用（標的遺伝子のmRNAを特異的に破壊することに基づくと考えられる作用）を有するRNA分子および標的遺伝子のmRNAの翻訳を抑制することができると考えられるmiRNAを例示することができるが、これらに限定されない。【0064】
上記RNA干渉作用を有するRNA分子の設計は、標的である上記遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。また、上記RNA分子は当業者が公知の手法に基づいて作製することができる。無論、上記RNA分子および上記核酸は、市場に流通するものを入手して用いることもできる。上記RNA分子としては、siRNA、shRNAおよびmiRNAが好ましく、siRNAおよびshRNAが特に好ましい。【0065】
上記miRNAは、上記遺伝子の転写または翻訳を阻害する活性を有するものを用いることができるが、これに限定されるものではない。【0066】
上記RNA分子を発現できるベクター等のDNA分子は、当業者が公知の手法により適宜作製することができる。上記ベクターの具体例として、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが例示されるが、これに限定されるものではない。好ましくは、上記ベクターはレンチウイルスベクターである。【0067】
本発明の治療薬または予防薬は、医薬組成物として好適に提供される。上記医薬組成物は、公知の手法により製剤化することができる。上記製剤の具体例として、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤などの固形製剤、および液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤などの液体製剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤の形態に応じて、適宜薬学的に許容される担体および添加剤を加えることができる。上記担体および添加剤の具体例として、賦形剤、充填剤、結合剤、付湿剤、香料、着色剤などが挙げられるが、これらに限定されない。製剤が液体製剤である場合は、公知の薬学的に許容される溶媒、例えば生理食塩水、緩衝作用を有する溶液などを用いることができる。【0068】
本発明の治療薬または予防薬の投与量は、上記疾患などの治療または予防の効果が得られることを限度として、当業者が適宜設定することができ、特に制限されるものではない。上記投与量は、例えば、１回の投与量を患者の体重１kgあたり、0.01〜1000 mg、好ましくは0.05〜500 mg、より好ましくは0.1〜100 mgとすることができる。【0069】
本発明の治療または予防薬の投与方法は、上記疾患などの治療または予防の効果が得られることを限度として、当業者が適宜設定することができ、特に制限されるものではない。例えば、当業者が上記疾患などの具体的病態に応じて、必要な投与方法を選択しても良い。投与方法の具体的態様として、注射投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への注射など）、経口投与、座薬投与、経皮投与（塗布など）などが例示されるが、これに制限される物ではない。【0070】
本発明は、さらに、上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を投与する工程を含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に起因する症状の治療方法または予防方法を提供する。投与対象、投与方法、投与量などについては、前述の通りである。【0071】
本発明は、さらに、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に起因する症状の治療または予防に使用するための上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能を阻害することができる化合物を提供する。【0072】
本発明は、さらに、上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物の、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に起因する症状の、治療薬または予防薬を製造するための使用を提供する。【0073】
（２）免疫抑制剤上記（１）に記載のErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、後述する実施例および参考例に示されるように、IL-6などの炎症性サイトカインの産生を大きく低減させる。このことにより、免疫反応が抑制されると考えられる。従って、本発明は、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、免疫抑制剤をも提供する。
【0074】
上記免疫抑制剤は、免疫の抑制が求められる患者および過剰な免疫反応が生じている患者などに対して好適に用いられる。上記患者の具体例として、上記の自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、または臓器移植に伴う症状などの疾患または症状を有する患者が例示されるが、これに限定されるものではない。【0075】
上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、上記（１）に記載の化合物を好適に用いることができる。【0076】
上記免疫抑制剤は、上記（１）に記載の医薬組成物として好適に提供される。【0077】
上記免疫抑制剤は、上記（１）に記載の投与量および投与方法により好適に使用することができる。【0078】
（３）炎症性サイトカイン産生抑制剤上記（１）に記載のErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、後述する実施例および参考例に示されるように、IL-6タンパク質などの炎症性サイトカインの産生を大きく低減させる。従って、本発明は、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、炎症性サイトカイン産生抑制剤をも提供する。
【0079】
上記炎症性サイトカインは、炎症性サイトカインとして知られるあらゆる炎症反応および免疫反応を促進する活性を有するサイトカインを含む。上記炎症性サイトカインの具体例として、TNF-αタンパク質、IFNγタンパク質、IL-1タンパク質、IL-6タンパク質、IL-8タンパク質、IL-12タンパク質、IL-17タンパク質、IL-18タンパク質などが例示されるが、これらに限定されるものではない。上記炎症性サイトカインは、好ましくはIL-1タンパク質、IL-6タンパク質、IL-17タンパク質、TNF-αタンパク質であり、より好ましくはIL-6である。【0080】
上記炎症性サイトカイン産生抑制剤は、炎症性サイトカインの産生抑制が求められる患者および過剰な炎症性サイトカインが産生している患者などに対して、治療薬または予防薬などの好適に用いられる。上記患者の具体例として、上記の自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、または臓器移植に伴う症状などの疾患または症状を有する患者が例示されるが、これに限定されるものではない。【0081】
上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、上記（１）に記載の化合物を好適に用いることができる。【0082】
上記炎症性サイトカイン産生抑制剤は、上記（１）に記載の医薬組成物として好適に提供される。【0083】
上記炎症性サイトカイン産生抑制剤は、上記（１）に記載の投与量および投与方法により好適に使用することができる。【0084】
（４）IL-6アンプ抑制剤上記（１）に記載のErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、後述する実施例および参考例に示されるように、IL-6アンプの活性の著しい抑制に基づくと推測される、IL-6タンパク質およびCCL20タンパク質、KCタンパク質、Mip2タンパク質、CXCL5タンパク質、CCL2タンパク質などのケモカイン産生の低減を誘導できる。従って、本発明は、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、IL-6アンプ抑制剤をも提供する。
【0085】
ここで、「IL-6アンプ」とは、図１に示す非特許文献１で見出されたIL-17Aタンパク質誘導性の炎症性サイトカイン産生に寄与する増幅ループ（正のフィードバックループ）を指す。具体的な構成因子としては、サイトカインであるIL-6タンパク質、IL-17Aタンパク質およびIL-7タンパク質など、ならびに転写因子であるNF-κBおよびSTAT３タンパク質などが構成すると考えられている。具体的な作用機序としては、Th17細胞が産生するおよびIL-17Aタンパク質とIL-6タンパク質とが協調して、線維芽細胞（I型コラーゲン陽性細胞）におけるNF-κBおよびSTAT３タンパク質の活性を亢進させ、NF-κBタンパク質およびSTAT３タンパク質の活性亢進がIL-6タンパク質、ケモカインなどの炎症性サイトカインの産生亢進を誘導し、かかる炎症性サイトカインの産生亢進によってIL-6タンパク質およびIL-17Aタンパク質がより産生されることに基づくと考えられる正のフィードバックループに基づくと考えられている。【0086】
上記IL-6アンプ抑制剤は、IL-6アンプの活性抑制が求められる患者および過剰にIL-6アンプが活性化している患者などに対して、治療薬または予防薬などの医薬として好適に用いられる。上記患者の具体例として、上記の自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、または臓器移植に伴う症状などの疾患または症状を有する患者が例示されるが、これに限定されるものではない。あるいは、上記IL-6アンプ抑制剤は、IL-6アンプの研究またはIL-6アンプが関与する分野の技術開発などにおける研究ツールとして用いることもできる。【0087】
上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、上記（１）に記載の化合物を好適に用いることができる。【0088】
上記IL-6アンプ抑制剤を医薬として用いる場合は、上記（１）に記載の医薬組成物として好適に提供される。【0089】
上記IL-6アンプ抑制剤を医薬として用いる場合は、上記（１）に記載の投与量および投与方法により好適に使用することができる。【0090】
（５）スクリーニング方法本発明は、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患および臓器移植に伴う症状からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは症状の治療薬または予防薬の有効成分を、被験物質の中からスクリーニングする方法に関する。当該疾患もしくは症状は、好適には上記（１）に記載の疾患などである。上記治療薬または予防薬は、上記有効成分を含む、上記の疾患などの、治療または予防のための医薬組成物であってもよい。
【0091】
本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含む、：（ｉ）被験物質が、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）においてErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を、前記治療薬または予防薬の有効成分として選択する工程。【0092】
上記工程（ｉ）により、スクリーニング対象の被験物質が、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かが判定される。【0093】
上記被験物質は、上記疾患などの治療薬または予防薬の有効成分の候補化合物となり得る化合物であれば、特に限定されるものではない。上記被験物質は、天然化合物（例えば、生体生体由来物質）または合成化合物のいずれであってもよい。好ましくは、上記被験物質は、ヒトにおいて薬学的に許容される化合物である。上記被験物質の具体例として、低分子化合物、抗体などのタンパク質、タンパク質の発現を抑制できる核酸（例えば、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA等）、糖鎖もしくは複合糖質などが挙げられるが、これに限定されるものではない。【0094】
上記ErbB1経路に属するタンパク質は、好適には、上記（１）に記載のタンパク質である。【0095】
上記ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定するための手段は、判定の対象とする被験物質、および、抑制が判定されるErbB1経路に属するタンパク質の機能発現などに応じて、目的が達成される範囲内において、当業者が公知のおよび将来開発されるあらゆる手段の中から、適宜選択することができる。【0096】
ここで、「タンパク質の機能発現を抑制」とは、該タンパク質の機能発現を抑制するあらゆる態様を指し、例えば該タンパク質の機能を阻害すること、該タンパク質の発現を抑制すること（該タンパク質をコードする遺伝子の転写の抑制、該タンパク質の翻訳の抑制など）などが例示されるが、これに限定されない。該タンパク質の機能を阻害する態様として、例えば、上記タンパク質がErbB1タンパク質である場合は、ErbB1タンパク質とリガンドとの結合を阻害する、ErbB1タンパク質の二量体化を阻害する、ErbB1タンパク質のチロシンキナーゼ活性などの酵素活性を阻害するなどの態様が例示されるが、これに限定されない。上記タンパク質がErbB1タンパク質のリガンドである場合は、ErbB1タンパク質とリガンドとの結合を阻害するなどの態様が例示されるが、これに限定されない。上記タンパク質がErbB1タンパク質の下流エフェクターである場合は、該タンパク質とErbB1タンパク質またはその他の標的タンパク質との結合を阻害する、該タンパク質が有するキナーゼ活性などの酵素活性を阻害するなどの態様が例示されるが、これに限定されない。【0097】
必要に応じて、上記工程（ｉ）においてErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質について、さらに、IL-6タンパク質などの炎症性サイトカインの発現を抑制（例えば、該炎症性サイトカインをコードする遺伝子の転写を抑制、該炎症性サイトカインの翻訳を抑制など）できる化合物であるか否かを判定することができる。これは、上記「背景技術」欄などの記載から理解されるように、炎症性サイトカインが過剰に産生されることによると考えられる炎症を伴う疾患などに対して、該炎症性サイトカインの発現が効率よく抑制できる有効成分を含む治療薬または予防薬を用いることが、効果的な治療または予防をもたらすと考えられるためである。【0098】
上記炎症性サイトカインの発現を抑制できる化合物であるか否かを判定するための手段は、目的が達成される範囲内において、当業者が公知のおよび将来開発されるあらゆる手段の中から、適宜選択することができる。【0099】
上記炎症性サイトカインの発現を抑制できる化合物であるか否かを判定するための手段として、下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む手段が、これに限定されるものではないが、例示される：（ａ）IL-6アンプが機能する細胞（例えば、マウスI型コラーゲン陽性細胞BC-1、または、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、MEF）など）においてIL-6アンプを活性化させた場合の炎症性サイトカインの発現量を、上記細胞に上記工程（ｉ）においてErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を適用した場合と対照との間で比較する工程、および（ｂ）上記比較において、炎症性サイトカインの発現量が対照と比べて有意に（例えば、t検定によるp値＜0.05ないしp値＜0.01である程度に有意に）減少する被験物質を、炎症性サイトカインの発現を抑制できる化合物であると判定する工程。【0100】
上記IL-6アンプの活性化は、例えば、上記細胞を含む溶液（好ましくは培地溶液、より好ましくはRPMI 1640培地などの無血清培地）にIL-6タンパク質およびIL-17Aタンパク質を含ませることで達成させることができる。IL-6アンプの活性化は、後述する参考例などで示されるように、エピレギュリンタンパク質をさらに含ませることもできる。しかしながら、後述する参考例などで示されるように、IL-6アンプの活性化はエピレギュリン遺伝子の発現を増大させると考えられるため、精度良く炎症性サイトカインの発現を抑制できる化合物であることを判定するとの観点からは、上記細胞を含む溶液にエピレギュリンタンパク質を含ませないことが好ましい。培地溶液にエピレギュリンタンパク質を含ませずにIL-6アンプの活性化をした場合において、炎症性サイトカインの発現を抑制できる化合物が判定できることは、後述する実施例により示されるとおりである。【0101】
上記工程（ｉｉ）により、上記疾患などの治療薬または予防薬の有効成分が選択される。上記工程（ｉｉ）において、ErbB1経路に属するタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であり、かつ、炎症性サイトカインの発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を選択することもできる。【実施例】
【0102】
以下、参考例および実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの参考例および実施例は、本発明を限定するものではない。【0103】
参考例１STAT３タンパク質およびNF-κBタンパク質と相乗的にIL-6アンプを活性化し、IL-6生産を引き起こす原因因子の候補をスクリーニングした。
【0104】
＜実験方法＞マウスI型コラーゲン陽性細胞BC-1に、添付の手順書に従い、shRNA搭載レンチウイルスライブラリーであるMISSION（登録商標） Whole Viral Library（The RNAi Consotrium）を導入し、shRNA搭載レンチウイルスが導入された細胞をピューロマイシン選択により選別した。
【0105】
得られた各クローンについて、50 ng/mlのヒトIL-6（hIL-6）タンパク質（東レ）、50 ng/mlのヒト可溶性IL-6受容体（hIL-6Rタンパク質、R&D Systems社）および50 ng/mlのマウスIL-17Aタンパク質（mIL-17A、R&D Systems社）を添加した、10％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum、FBS）の存在下のRPMI 1640培地中で96穴プレートにて24時間培養した。【0106】
培養後、各々のクローンにおけるマウスIL-6（mIL-6）タンパク質の産生量、すなわち培地溶液中のmIL-6タンパク質の物質量、をELISA法により定量した。ELISA法は、eBiosciences社製の抗mIL-6抗体およびELISAキットを用いた。また、各々のクローンについての細胞増殖アッセイを、TetraColor ONEキット（生化学工業社）により行なった。【0107】
当該クローン感染細胞からのmIL-6タンパク質の産生量が当該96穴プレート平均の25％以下であり、細胞増殖アッセイの結果が全クローン平均の90％以上であるクローンに導入されたshRNA搭載レンチウイルスが標的とする遺伝子を、STAT３タンパク質およびNF-κBタンパク質と相乗的にIL-6アンプを活性化し、IL-6タンパク質生産を引き起こす遺伝子の候補として選別した。【0108】
＜実験結果＞選別された候補遺伝子には、IL-6信号伝達系に含まれる遺伝子（gp130、JAK、STAT3等）およびIL-17信号伝達系に含まれる遺伝子（IL-17受容体、TRAF6、NF-κB等）の他に、ErbB1遺伝子、エピレギュリン遺伝子が含まれていた。ErbB1遺伝子を標的とするshRNAクローンについての追試の結果を図３に示す。後述する参考例２の条件（e）〜（h）の各条件下、かつ、ピューロマイシンの存在下で培養を行なった。ErbB1遺伝子の発現がshRNAにより抑制されると、ErbB1遺伝子の発現がshRNAにより抑制されない対照と比較して、mIL6タンパク質の発現量が減少した。
【0109】
参考例２IL-6アンプの活性化によるIL-6タンパク質生産において、血清の有無の効果を検証した。
【0110】
＜実験方法＞2×105個のマウスBC-1細胞をRPMI 1640培地中で、
（a）10％ FBSの存在下、
（b）50 ng/mlのhIL-6タンパク質および50 ng/mlのhIL-6Rタンパク質（以下、「hIL-6/6Rタンパク質」と記載。）を添加し、10％ FBSの存在下、
（c）50 ng/mlのmIL-17Aタンパク質を添加し、10％ FBSの存在下
（d）50 ng/mlのhIL-6/6Rタンパク質および50 ng/mlのmIL-17Aタンパク質を添加し、10％ FBSの存在下、
（e）FBS非存在化、
（f）50 ng/mlずつのhIL-6/6Rタンパク質を添加し、FBS非存在化、
（g）50 ng/mlのmIL-17Aタンパク質を添加し、FBS非存在化、または
（h）50 ng/mlずつのhIL-6/6Rタンパク質および50 ng/mlのmIL-17Aタンパク質を添加し、FBS非存在化、
の各条件下で、24時間培養した。
【0111】
培養後、各々のクローンにおけるmIL-6タンパク質の産生量を、参考例１と同様にELISA法により定量した。【0112】
また、mIL-6遺伝子の発現量を、リアルタイムRT-PCR法により定量した。リアルタイムRT-PCR法は、GeneAmp 5700 sequence detection system（アプライドバイオシステムズ社）およびSYBER green PCR Master Mix（シグマアルドリッチ社）を用いて行なった。PCR増幅の条件は、次の通りとした：熱変性を94℃で15秒間、アニーリングを60°Cで30秒間、および伸長反応を72℃で30秒間行うサイクルを、40サイクル。【0113】
リアルタイムRT-PCR法におけるプライマーは、下記に示す塩基配列を有するプライマーセットを用いた：mIL-6遺伝子
フォワードプライマー：5'-GTGGCAGGTAGAGCAGGAAG-3' （配列番号１）
リバースプライマー ：5'-CCACCTGAAAGGCACTCTGT-3' （配列番号２）
マウスHPRT遺伝子
フォワードプライマー：5’-GATTAGCGATGATGAACCAGGTT-3' （配列番号３）
リバースプライマー ：5’-CCTCCCATCTCCTTCATGACA-3’ （配列番号４）。
【0114】
さらに、各々のクローンについての細胞増殖アッセイを、TetraColor ONEキット（生化学工業社）により行なった。【0115】
結果を、図４に示す。mIL-6遺伝子の発現量は、対照となるHPRT遺伝子の発現量に対する相対比で示す。FBSを添加した条件下において、mIL-6タンパク質の発現量およびmIL-6遺伝子の発現量が有意に（p値＜0.01）増大した。【0116】
参考例３IL-6アンプの活性化によるIL-6生産において、特定の成長因子の添加の効果を検証した。
【0117】
＜実験方法＞2×105個のマウスBC-1細胞を、50 ng/mlずつのhIL-6/6Rタンパク質および50 ng/mlのmIL-17Aタンパク質を添加したRPMI 1640培地中で、
・100 ng/mlのマウスEGFタンパク質（R＆D Systems社）、
・100 ng/mlのヒトHB-EGFタンパク質（R＆D Systems社）、
・0.1、1、10、100 ng/mlのマウスエピレギュリンタンパク質（R＆D Systems社）、
・50 ng/mlのマウスVEGFタンパク質（R＆D Systems社）、
・50 ng/mlのマウスFGF7タンパク質（R＆D Systems社）、または
・300 ng/mlのmPDGF-CCタンパク質（R＆D Systems社）をそれぞれ添加した条件下で、24時間培養した。hIL-6/6Rタンパク質およびmIL-17Aタンパク質のみを添加したものを対照群とした。
【0118】
培養後、各々の条件下におけるmIL-6タンパク質の産生量を、参考例１と同様にELISA法により定量した。結果を図５および６に示す。図５に示されるように、ErbB1タンパク質のリガンドであるEGFタンパク質、HB-EGFタンパク質、およびエピレギュリンタンパク質を添加した各々の条件下では、添加しない場合と比較して、mIL-6タンパク質の産生量が有意に（p値＜0.01）増大した。一方、ErbB1タンパク質のリガンドではないVEGFタンパク質、FGF7タンパク質、およびPDGF-CCタンパク質を添加した各々の条件下では、mIL-6タンパク質の産生量は、添加しない場合に対して有意差が測定されなかった。【0119】
参考例４エピレギュリンタンパク質の添加によるIL-6アンプの標的遺伝子の発現量への効果を検証した。
【0120】
＜実験方法＞2×105個のマウスBC-1細胞またはマウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、MEF）を、参考例２の（e）〜（h）の条件で、または該条件においてさらに100 ng/mlのマウスエピレギュリンタンパク質を添加した条件下で、24時間培養した。
【0121】
培養後、各々の条件下におけるmIL-6遺伝子および転写因子NF-κBの標的であるマウスCCL20遺伝子の発現量を、参考例２と同様にリアルタイムRT-PCR法により定量した。【0122】
リアルタイムRT-PCR法におけるプライマーは、参考例２に記載のプライマーセットおよび下記に示す塩基配列を有するプライマーセットを用いた：マウスCCL20遺伝子
フォワードプライマー：5'- ACAGTGTGGGAAGCAAGTCC-3'（配列番号５）
リバースプライマー ：5'- CCGTGAACTCCTTTGACCAT-3'（配列番号６）。
【0123】
結果を図７に示す。発現量は、タンパク質を添加しない条件（参考例２の（e）の条件）を対象群とし、該条件におけるCCL20遺伝子の発現量に対する相対比で示す。BC-1細胞およびMEF細胞のいずれにおいても、エピレギュリンタンパク質の添加によりmIL6遺伝子の転写量が有意に増大した。【0124】
参考例５IL-6アンプの活性化によるIL-6タンパク質生産において、エピレギュリンの下流で機能する受容体の特異性を検証した。
【0125】
＜実験方法＞2×105個のマウスBC-1細胞を、参考例２の（e）〜（h）の条件の各々においてさらに100 ng/mlのマウスエピレギュリンタンパク質を添加し、
・0、0.1、1もしくは10マイクロモル/LのPD153065（Calbiochem社）の存在下、または
・0、0.1、1もしくは10マイクロモル/LのErbB2 Inhibitor II（Calbiochem社、Cat# 324732）の存在下で、24時間培養した。
【0126】
培養後、各々の条件下におけるマウスIL-6タンパク質の産生量を、参考例１と同様にELISA法により定量した。結果を図８に示す。ErbB1タンパク質の阻害剤であるPD153065の添加量に依存して、エピレギュリンタンパク質によるmIL-6転写量増大は阻害された。一方、ErbB2タンパク質の阻害剤であるErbB2 Inhibitor IIの添加によっては、エピレギュリンタンパク質によるmIL-6転写量増大は阻害されなかった。【0127】
参考例６IL-6アンプの活性化がエピレギュリン遺伝子の発現量へ与える効果を検証した。
【0128】
＜実験方法＞2×105個のマウスBC-1細胞またはマウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、MEF）を、参考例２の（e）〜（h）の条件で、または100 ng/mlのマウスエピレギュリンタンパク質を添加したRPMI 1640培地中で、2時間培養した。
【0129】
培養後、各々の条件下におけるマウスエピレギュリン遺伝子の発現量を、参考例２と同様にリアルタイムRT-PCR法により定量した。【0130】
リアルタイムRT-PCR法におけるプライマーは、下記に示す塩基配列を有するプライマーセットを用いた：マウスエピレギュリン遺伝子
フォワードプライマー：5’-CTGCCTCTTGGGTCTTGACG-3’ （配列番号７）
リバースプライマー ：5’-GCGGTACAGTTATCCTCGGATTC-3’ （配列番号８）。
【0131】
結果を図９に示す。マウスエピレギュリン遺伝子の発現量は、タンパク質を添加しない条件（参考例２の（e）の条件）を対象群とし、該条件の発現量に対する相対比で示す。BC-1細胞およびMEF細胞のいずれにおいても、hIL-6/6Rタンパク質およびmIL-17Aタンパク質の添加、ならびに、エピレギュリンタンパク質の添加により、エピレギュリン遺伝子の転写量が増大した。【0132】
参考例７ヒト関節リウマチ症患者由来の滑膜細胞における、IL-6アンプへのエピレギュリンタンパク質の関与を検証した。
【0133】
＜実験方法＞ヒト関節リウマチ患者由来滑膜細胞050127（非特許文献４）を、参考例２の（e）〜（h）の条件で、または該条件においてさらに100 ng/mlのヒトエピレギュリンタンパク質を添加した条件下で、3時間培養した。
【0134】
培養後、hIL-6遺伝子の発現量を、参考例２と同様にリアルタイムRT-PCR法により定量した。【0135】
リアルタイムRT-PCR法におけるプライマーは、下記に示す塩基配列を有するプライマーセットを用いた：ヒトIL-6遺伝子
フォワードプライマー：5’-GGAGACTTGCCTGGTGAAAA-3’ （配列番号１０）
リバースプライマー ：5’- GTCAGGGGTGGTTATTGCAT-3’ （配列番号１１）。
【0136】
発現量は、タンパク質を添加しない条件（参考例２の（e）の条件）を対象群とし、該条件の発現量に対する相対比で示す。結果を図１０に示す。ヒト関節リウマチ患者由来滑膜細胞において、IL-6アンプ活性時には、エピレギュリンタンパク質の添加により、hIL-6遺伝子の転写量が増大した。【0137】
参考例８皮膚炎発症におけるIL-6アンプの異常の関与を、疾患モデルマウスを用いて検証した。
【0138】
＜実験方法＞F759マウス（非特許文献３）とSTAT3fl/fl-K5 Creマウス（非特許文献５）との交配により、下記表１に示す各々の遺伝子型のマウスを常法により作製した。
【0139】
各々の遺伝子型のマウスにおける皮膚炎の発症率、発症時期および６ヶ月齢以内の死亡匹数を下記表１に示す。また、図１１（Ａ）にはF759/F759-STAT3fl/fl-K5 Creマウスの外観所見、および図１１（Ｂ）および（Ｃ）はF759/F759-STAT3fl/fl-K5 CreマウスおよびF759/F759-STAT3fl/flマウスそれぞれの、皮膚組織のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色像を示す。F759/F759-STAT3fl/fl-K5 Creマウスにおいて、皮膚炎によると考えられる脱毛が観察され、また、皮膚組織切片の観察にて細胞浸潤を伴う炎症像が観察された。【0140】
【表1】
【0141】
なお、STAT3fl/fl-K5 Creマウスとは、STAT3遺伝子座がCreリコンビナーゼ標的配列であるloxP配列により挟まれた形（flanked by loxP sites）であり、かつ、皮膚組織特異的プロモーターであるケラチン５（K5）プロモーターによって発現するCreリコンビナーゼが導入された遺伝子組み換えマウスである。すなわち、STAT3fl/fl-K5 Creマウスにおいては、皮膚組織特異的に発現するCreリコンビナーゼの作用により、皮膚組織がSTAT3遺伝子を欠損すると考えられる。STAT3fl/fl-K5 Creマウスにおいて、皮膚の創傷治癒における異常のため、生後１年程度で皮膚炎が生じることが知られている（非特許文献５）。【0142】
F759マウスは、後述するように、IL-6アンプの暴走が引き起こされると考えられるマウスである。【0143】
すなわち、IL-6アンプの暴走を引き起こすと考えられるF756変異を有するマウスにおいて、アトピー性皮膚炎様の症状が悪化することが示された。【0144】
参考例９ヒト由来細胞における、IL-6アンプへのエピレギュリンタンパク質の関与を検証した。
【0145】
＜実験方法＞1×104個のヒト由来滑膜線維芽細胞を、参考例２の（e）〜（h）の条件で、または該条件においてさらに100 ng/mlのヒトエピレギュリンタンパク質を添加した条件下で、3時間培養した。
【0146】
培養後、hIL-6遺伝子の発現量を、参考例２と同様にリアルタイムRT-PCR法により定量した。【0147】
発現量は、タンパク質を添加しない条件（参考例２の（e）の条件）を対象群とし、該条件の発現量に対する相対比で示す。結果を図２２（Ａ）に示す。ヒト由来滑膜線維芽細胞において、IL-6アンプ活性時には、エピレギュリンタンパク質の添加により、hIL-6遺伝子の転写量が増大した。【0148】
参考例１０ヒト由来細胞において、ErbB1タンパク質の阻害剤が、IL-6アンプに与える効果を評価した。
【0149】
＜実験方法＞1×104個のヒト滑膜線維芽細胞を、参考例２の（e）〜（h）の条件の各々においてさらに100 ng/mlのマウスエピレギュリンタンパク質を添加し、
・0もしくは10マイクロモル/LのPD153065（Calbiochem社）の存在下で、3時間培養した。
【0150】
培養後、各々の条件下におけるヒトIL-6遺伝子の発言を、参考例９と同様にRT-PCR法により定量した。結果を図２２（Ｂ）に示す。ErbB1タンパク質の阻害剤であるPD153065の添加量に依存して、エピレギュリンタンパク質によるhIL-6転写量増大は阻害された。【0151】
参考例１１ヒト由来細胞におけるIL-6アンプの活性化が、エピレギュリン遺伝子の発現量へ与える効果を検証した。
【0152】
＜実験方法＞1×104個のヒト由来滑膜線維芽細胞を、参考例２の（e）〜（h）の条件で、または100 ng/mlのヒトエピレギュリンタンパク質を添加したRPMI 1640培地中で、3時間培養した。
【0153】
培養後、各々の条件下におけるヒトエピレギュリン遺伝子の発現量を、参考例２と同様にリアルタイムRT-PCR法により定量した。【0154】
リアルタイムRT-PCR法におけるプライマーは、下記に示す塩基配列を有するプライマーセットを用いた：ヒトエピレギュリン遺伝子
フォワードプライマー：5’- CTGCCTGGGTTTCCATCTTCT-3’ （配列番号１２）
リバースプライマー ：5’- GCCATTCATGTCAGAGCTACACT-3’ （配列番号１３）。
【0155】
結果を図２３に示す。マウスエピレギュリン遺伝子の発現量は、タンパク質を添加しない条件（参考例２の（e）の条件）を対象群とし、該条件の発現量に対する相対比で示す。hIL-6/6Rタンパク質およびmIL-17Aタンパク質の添加、ならびに、エピレギュリンタンパク質の添加により、ヒトエピレギュリン遺伝子の転写量が増大した。【0156】
実施例１培養細胞において、ErbB1タンパク質の阻害剤が、IL-6アンプに与える効果を評価した。
【0157】
＜実験方法＞2×105個のマウスBC-1細胞またはマウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、MEF）を、
・0.1、1もしくは10マイクロモル/LのPD153065、または
・0.1、1もしくは10マイクロモル/LのPD168393（Calbiochem社）の存在下で30分間 RPMI 1640培地中で、培養した。
【0158】
次に、阻害剤で処理した細胞を、参考例２の（a）〜（d）の条件下で刺激して、24時間培養した。【0159】
BC-1細胞をErbB1タンパク質の阻害剤に代えて、FGF RTK阻害剤（Calbiochem社、Cat# 341608）またはFGF/PDGF/VEGF RTK阻害剤（Calbiochem社、Cat# 341610）で処理した試料を、対照群とした。【0160】
培養後、各々の条件下におけるマウスIL-6タンパク質の産生量をELISA法により定量した。結果を図１２に示す。ErbB1タンパク質の阻害剤の添加により、阻害剤の添加量に依存して、IL-6アンプの活性化により増大するmIL-6タンパク質の発現量増大が有意に抑制された。一方、ErbB1タンパク質とは異なる受容体型チロシンキナーゼに対する阻害剤の添加によっても、IL-6アンプの活性化により増大するmIL-6タンパク質の発現量増大は抑制されなかった。【0161】
実施例２培養細胞において、PI3キナーゼの阻害剤が、IL-6アンプに与える効果を評価した。
【0162】
＜実験方法＞2×105個のマウスBC-1細胞を、参考例２の（a）〜（d）の条件下においてさらに0または100 ng/mlのマウスエピレギュリンタンパク質を添加し、ならびに0.1、1もしくは10マイクロモル/LのLY294002（Cell Signaling Technology社）または0.01、0.03（マウスエピレギュリンタンパク質を添加した場合のみ）、0.1、0.3もしくは1.0マイクロモル/LのPIK75（Cayman Chemical社）の存在化で24時間培養した。
【0163】
培養後、各々の条件下におけるマウスIL-6タンパク質の産生量をELISA法により定量した。結果を図１３に示す。PI3キナーゼの阻害剤の添加により、阻害剤の添加量に依存して、IL-6アンプの活性化により増大するmIL-6タンパク質の発現量増大が抑制された。【0164】
実施例３サイトカイン誘導関節炎マウスにおいて（関節リウマチ症の疾患モデルマウス）、病変部へのErbB1タンパク質の阻害剤投与の効果を評価した。
【0165】
＜実験方法＞8週齢のF759マウスにおいて、0日目、1日目および2日目の各日に、サイトカインとして100 ngのmIL-6タンパク質および100 ngのmIL-17Aタンパク質を踝関節に注射投与し、関節炎を誘導した。同時に、0〜23日目の各日に10マイクログラムのPD153035を溶解したDMSOを踝関節に注射投与した（n=6）。サイトカインおよびDMSOのみを注射投与したマウス（n=6）、ならびにDMSOのみを注射投与したマウス（n=6）をそれぞれ対照群とした。
【0166】
0〜23日目にわたり、関節炎の症状を臨床スコアにより評価した。評価の具体例を下記および図２に示す。すなわち、例えば、図１４(A)に示すように踝関節の可動域が正常な場合には臨床スコアは0であり、図１４(B)に示すように重度の関節炎が発症し踝関節の可動域が正常と比べて60度狭い場合には臨床スコアは3である。また、踝関節の可動域が正常と比べて20°狭い場合には臨床スコアは1であり、踝関節の可動域が正常と比べて40°狭い場合には臨床スコアは2である。【0167】
評価の結果を図１５(A)に示す。ErbB1タンパク質の阻害剤であるPD153035の投与により、サイトカイン誘導関節炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0168】
なお、サイトカイン誘導関節炎マウスに用いるF759マウスとは、IL-6タンパク質などの受容体であるgp130タンパク質において、759番目のチロシン残基（Y）がフェニルアラニン（F）に置換される変異（F759変異）が導入された遺伝子組み換えマウスであり（非特許文献３）、F759マウスではIL-6アンプの暴走が観察される（非特許文献１）。F759マウスにおいて観察されるIL-6アンプの暴走は、gp130タンパク質の759番目のチロシン残基（Y759）のリン酸化状態に依存したSOCS3タンパク質のシグナル伝達がF759変異により阻害され、これによりSOCS3タンパク質を介したSTAT3シグナルに対する抑制作用が低減しSTAT3依存性のシグナルが増強されることにより引き起こされると考えられる。当該マウスは、生後1年〜1年半経過するとほぼ100％の個体において自己免疫性の関節炎が発症することが知られている。また、当該マウスの関節（例えば、踝関節）にIL-6やIL-17などの炎症性サイトカインを注射することで、より早期に関節炎を発症することも知られている。マウスにおける自己免疫性関節炎は、ヒトの関節リウマチ症の疾患モデルであると考えられている。
【0169】
実施例４サイトカイン誘導関節炎マウスにおいて、病変部へのErbB1タンパク質の阻害剤投与の効果を評価した。
【0170】
＜実験方法＞8週齢のF759マウスにおいて、0日目、1日目および2日目の各日に、サイトカインとして100 ngのmIL-6タンパク質および100 ngのmIL-17Aタンパク質を踝関節に注射投与し、関節炎を誘導した。同時に、0〜11日目の各日に10マイクログラムのPD168393を溶解したDMSOを踝関節に注射投与した（n=4）。サイトカインおよびDMSOのみを注射投与したマウス（n=4）、ならびにDMSOのみを注射投与したマウス（n=4）をそれぞれ対照群とした。
【0171】
0〜23日目にわたり、実施例３と同様の方法により、関節炎の症状を臨床スコアにより評価した。評価の結果を図１５(B)に示す。ErbB1タンパク質の阻害剤であるPD168393の投与により、サイトカイン誘導関節炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0172】
実施例５サイトカイン誘導関節炎マウスにおいて、病変部へのエピレギュリン遺伝子に対するshRNA投与の効果を評価した。
【0173】
＜実験方法＞8週齢のF759マウスにおいて、0日目、2日目および4日目の各日に、3.8×105 TU（Total transducing units needed）のエピレギュリン遺伝子に対するshRNAを発現するレンチウイルス（シグマアルドリッチ社、TRCN0000250419（sh #1）、TRCN0000250420（sh #2）またはTRCN0000250421（sh #3））を3.8×105 TU溶解した生理食塩水を踝関節に注射投与した。次いで、6日目、7日目および8日目の各日に、サイトカインとして100 ngのmIL-6タンパク質および100 ngのmIL-17Aタンパク質を溶解した生理食塩水を踝関節に注射投与し、関節炎を誘導した（n=4）。エピレギュリン遺伝子に対するshRNAに代えて非特異的shRNA（Nontarget sh、シグマアルドリッチ社）を3.8×105 TUを注射投与したマウス（n=3）、および、エピレギュリン遺伝子に対するshRNAに代えて、NFκ-B p65遺伝子に対するshRNA（p65 sh、シグマアルドリッチ社、TRCN0000055346）を注射投与したマウス（n=3）、ならびに生理食塩水のみを注射投与したマウス（n=3）をそれぞれ対照群とした。
【0174】
なお、TU（Total transducing units needed）は、シグマアルドリッチ社が各レンチウイルスベクターのロットについて提供する情報（TU/ml）に従って求めた。【0175】
0〜26日目にわたり、実施例３と同様の方法により、関節炎の症状を臨床スコアにより評価した。評価の結果を図１６(A)に示す。エピレギュリン遺伝子に対するshRNAの投与により、IL-6アンプを構成すると知られるNFκ-B p65遺伝子に対するshRNAを投与した同程度に、サイトカイン誘導関節炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0176】
なお、用いたshRNAの遺伝子発現を抑制する効果について検証した結果を、図１６(B)に示す。BC-1細胞に対して当該shRNAを搭載したレンチウイルスにより3マイクロリットル量のshRNA（sh #1：4.8×104 TU、sh #2：5.4×104TU、sh #3：6.0×104TU）を導入した試料と、shRNAを導入しない対照試料との間で、参考例２と同様にリアルタイムRT-PCR法によりエピレギュリン遺伝子の発現量を比較した。【0177】
実施例６サイトカイン誘導関節炎マウスにおいて、病変部への抗エピレギュリン抗体投与の効果を評価した。
【0178】
＜実験方法＞8週齢のF759マウスにおいて、0日目、1日目および2日目の各日に、サイトカインとして100 ngのmIL-6タンパク質および100 ngのmIL-17Aタンパク質を踝関節に注射投与し、関節炎を誘導した。同時に、0〜14日目の各日に1マイクログラムのラット由来抗エピレギュリン抗体（R&D Systems社、Cat# MAB1068）を踝関節に注射投与した（n=3）。サイトカインのみを注射投与したマウス（n=3）、および生理食塩水のみを注射投与したマウス（n=3）をそれぞれ対照群とした。
【0179】
0〜29日目にわたり、実施例３と同様の方法により、関節炎の症状を臨床スコアにより評価した。評価の結果を図１６(C)に示す。抗エピレギュリン抗体の投与により、サイトカイン誘導関節炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0180】
なお、当該実施例で用いた抗エピレギュリン抗体（R&D Systems社、Cat# MAB1068）は、Balb/3T3マウス由来のマウス胚性線維芽細胞において、エピレギュリンタンパク質が誘発する細胞増殖を中和する活性を有する抗エピレギュリン抗体である。すなわち、当該抗エピレギュリン抗体は、ErbB1タンパク質とエピレギュリンタンパク質との結合を阻害する抗体であると考えられる。【0181】
実施例７実験的自己免疫性脳脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis、EAE）マウスにおける、抗エピレギュリン抗体投与の効果を評価した。
【0182】
＜実験方法＞（ｉ）EAEマウスの作成
EAEマウスの作成は、非特許文献１に記載の方法に従い行なった。概略を図１７に示す。
【0183】
7-8週齢のＣ57/Ｂ6系統マウスにおいて、200マイクログラムのMOG（myelin oligodendrocyte glycoprotein）ペプチド（マウスMOGタンパク質の全長アミノ酸配列の33-55番目の残基（配列番号９に示すアミノ酸配列）を有するペプチド）を、完全フロイントアジュバント(Complete Freund’s adjuvant、CFA)で溶解し、これを尾部に皮下注射（subcutaneous injection、s.c.）し、次いで、200ナノグラムの百日咳毒素（Pertussis Toxin、PTx）を静脈注射（intravenous injection、i.v.）した。【0184】
上記マウスを10日間飼育した後に摘出した脾臓から、常法に従いMOG特異的CD4+T細胞群を得た。2×106細胞の該MOG特異的CD4+T細胞を、20 ng/mlのリコンビナントIL-23（rIL-23）タンパク質の存在下で、5×105細胞のMOGペプチドでパルスしたＣ57/Ｂ6系統マウス骨髄由来の樹状細胞（bone marrow derived dendritic cells、BMDC）とともに、10%FBSを含むRPMI 1640培地中で温度条件37℃の恒温槽中で培養し、病原性のTh17細胞を含む細胞群を得た。【0185】
得られた細胞群（8×106細胞）を、亜致死量の5 Gyのγ線を照射した7-8週齢のＣ57/Ｂ6系統マウスに静脈注射し、次いで、200ナノグラムの百日咳毒素を静脈注射し、EAEマウスを得た（0日目）。【0186】
（ｉｉ）抗エピレギュリン抗体の投与上記（ｉ）で得たEAEマウスにおいて、0日目、4日目および7日目に、100マイクログラムのラット由来抗エピレギュリン抗体（R&D Systems社、Cat# MAB1068）を含む生理食塩水を腹腔注射により投与した（n=4）。100マイクログラムの非特異的IgG（シグマアルドリッチ社）を含む溶液を同様に投与したものを、対照群とした（n=4）。
【0187】
非特許文献１に記載の方法に従い、0〜12日目の各マウスの臨床スコアを評価した。結果を図１８（A）に示す。抗エピレギュリン抗体の投与により、実験的自己免疫性脳脊髄炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0188】
なお、実験的自己免疫性脳脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis、EAE）マウスは、ヒトの多発性硬化症の疾患モデルであると考えられている。【0189】
実施例８EAEマウス（多発性硬化症のモデルマウス）における、ゲフィチニブ（商品名：イレッサ（登録商標）、アストラゼネカ社）投与の効果を評価した。
【0190】
＜実験方法＞（ｉ）EAEマウスの作成
実施例７と同様の方法により、EAEマウスを得た。
（ｉｉ）ゲフィチニブの投与
上記（ｉ）で得たEAEマウスにおいて、0日目〜6日目の各日に、5 mgのゲフィチニブを溶解したDMSOを腹腔注射により投与した（n=5）。溶媒のDMSOのみを同様に投与したものを、対照群とした（n=5）。
【0191】
非特許文献１に記載の方法に従い、0〜13日目の各マウスの臨床スコアを評価した。結果を図１８（B）に示す。ゲフィチニブの投与により、実験的自己免疫性脳脊髄炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0192】
実施例９サイトカイン誘導関節炎マウスにおいて、病変部へのErbB1遺伝子に対するshRNA投与の効果を評価した。
【0193】
＜実験方法＞エピレギュリン遺伝子に対するshRNAを発現するレンチウイルスに替えて、ErbB1（Egfr）遺伝子に対するshRNAを発現するレンチウイルス（シグマアルドリッチ社、TRCN0000023480（sh #1）、TRCN0000023481（sh #2）またはTRCN0000023483（sh #3））を投与した以外は、実施例５と同様の方法により、サイトカイン誘導関節炎マウスにおいて、病変部へのErbB1に対するshRNA投与の効果を評価した。
【0194】
0〜29日目にわたり、実施例３と同様の方法により、関節炎の症状を臨床スコアにより評価した。評価の結果を図１９に示す。ErbB1（Egfr）遺伝子に対するshRNAの投与により、IL-6アンプを構成すると知られるNFκ-B p65遺伝子に対するshRNAを投与した同程度に、サイトカイン誘導関節炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0195】
実施例１０サイトカイン誘導関節炎マウスにおいて、病変部へのゲフィチニブ（商品名：イレッサ（登録商標）、アストラゼネカ社）投与の効果を評価した。
【0196】
＜実験方法＞8週齢のF759マウスにおいて、0日目、1日目および2日目の各日に、サイトカインとして100 ngのmIL-6タンパク質および100 ngのmIL-17Aタンパク質を踝関節に注射投与し、関節炎を誘導した。同時に、0〜23日目の各日に10マイクログラムのゲフィチニブを溶解したDMSOを踝関節に注射投与した（n=4）。サイトカインおよびDMSOのみを注射投与したマウス（n=4）、ならびにDMSOのみを注射投与したマウス（n=4）をそれぞれ対照群とした。
【0197】
0〜23日目にわたり、実施例３と同様の方法により、関節炎の症状を臨床スコアにより評価した。評価の結果を図２０に示す。ゲフィチニブの投与により、サイトカイン誘導関節炎の症状が緩和されるないし症状の悪化が抑制されることが観察された。【0198】
実施例１１IL-6アンプの活性化時において、エピレギュリンの発現抑制によるIL-6タンパク質の発現量減少を検出した。
【0199】
＜実験方法＞マウスBC-1細胞に、常法従い、エピレギュリン遺伝子に対するshRNAを発現するレンチウイルス（シグマアルドリッチ、TRCN0000250421）を導入し、shRNA搭載レンチウイルスが導入された細胞をピューロマイシン選択により選択した。
【0200】
次いで、得られたクローンおよび対照クローン（非特異的shRNAを発現するレンチウイルス）について、2×105個の細胞を、参考例２の（e）〜（h）の条件で、または該条件においてさらに100 ng/mlのマウスエピレギュリンタンパク質を添加した条件下で、48時間または72時間培養した。【0201】
培養後、各々の条件下におけるmIL-6タンパク質の産生量を、参考例１と同様にELISA法により定量した。結果を図２１に示す。マウスエピレギュリンタンパク質を添加した条件下および添加しない条件下のいずれにおいても、エピレギュリン遺伝子に対するshRNAの効果により、mIL-6タンパク質の産生量減少が測定された。【0202】
考察参考例１および２により、ErbB1タンパク質および成長因子がIL-6アンプの活性化に寄与することが示唆された。成長因子については、参考例３および４により、ErbB1経路の成長因子（リガンド）が特異的にIL-6アンプの活性化に寄与することが示唆された。さらに、参考例６によりエピレギュリンがIL-6アンプにおける正のフィードバック制御に寄与することが示唆された。また、参考例５および実施例１により、IL-6アンプの活性化においては、ErbB1受容体が特異的に関与することが示唆された。参考例７および９〜１１は、同様の機構がヒトにも存在することを示している。
【0203】
実施例１および２の結果が示すように、hIL-6タンパク質、hIL-6Rタンパク質およびmIL-17Aタンパク質の添加によりIL-6アンプが活性化されることにより誘導されるIL-6の産生を、ErbB1の阻害剤であるPD153065およびPD168393、ならびにPI3キナーゼの阻害剤であるLY294002が抑制できることが示された。また、この結果から、ErbB1経路に属するタンパク質の機能を阻害できる化合物が、IL-6アンプの抑制剤、すなわち炎症性サイトカインの産生抑制剤として機能することも示唆される。さらには、当該化合物が免疫抑制剤として機能することをも示唆される。【0204】
実施例３〜１０の結果は、ErbB1経路のタンパク質の機能発現を抑制できる化合物が、関節リウマチ症や多発性硬化症のモデルマウスにおける症状を緩和できることが示されている。また、参考例７により、関節リウマチ症の患部において、IL-6アンプが活性化し炎症性サイトカインの産生が亢進することが示唆された。また、参考例８の結果は、IL-6アンプの暴走がアトピー性皮膚炎の発症に寄与することを示唆している。そのため、ErbB1経路のタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は自己免疫疾患、炎症性疾患およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に伴う症状の治療薬または予防薬として用いることができる。【0205】
ErbB1経路のタンパク質のなかで、エピレギュリンタンパク質はIL-6アンプの活性化に寄与し、かつ、エピレギュリン遺伝子はIL-6アンプの活性化により発現量が増加する。このことは、エピレギュリンがIL-6アンプにおける正のフィードバック制御に寄与することが示唆している。すなわち、エピレギュリンタンパク質機能発現を抑制できる化合物は、IL-6アンプの活性化を抑制できる化合物、ならびに、自己免疫疾患、炎症性疾患およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に伴う症状の治療薬または予防薬の有効成分として、特に高い効果を奏すると推測される。【0206】
また、実施例１〜１０の結果は、ErbB1経路のタンパク質の機能発現を抑制できる化合物をスクリーニングすることで、炎症性疾患およびアレルギー性疾患などの疾患、ならびに臓器移植に伴う症状の治療薬または予防薬がスクリーニングされることをも示唆している。実施例１１は、スクリーニング方法において用いることができる、炎症性サイトカインの発現を抑制できる化合物であるか否かを判定するための好適な手段が実証されている。【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]