特許 5678986 アルツハイマー病の治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5678986

(24)【登録日】2015年1月16日

(45)【発行日】2015年3月4日

(54)【発明の名称】アルツハイマー病の治療薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20150212BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20150212BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   A61P25/28

【請求項の数】1

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2013-112102(P2013-112102)

(22)【出願日】2013年5月28日

(62)【分割の表示】特願2008-514381(P2008-514381)の分割

【原出願日】2007年4月23日

(65)【公開番号】特開2013-173793(P2013-173793A)

(43)【公開日】2013年9月5日

【審査請求日】2013年6月14日

(31)【優先権主張番号】特願2006-120875(P2006-120875)

(32)【優先日】2006年4月25日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2006-199489(P2006-199489)

(32)【優先日】2006年7月21日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】AIST  PERM BP-10808

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】503196776

【氏名又は名称】株式会社ペルセウスプロテオミクス

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】岩坪 威

(72)【発明者】

【氏名】児玉 龍彦

(72)【発明者】

【氏名】浜窪 隆雄

(72)【発明者】

【氏名】富田 泰輔

(72)【発明者】

【氏名】林 幾雄

(72)【発明者】

【氏名】浦野 泰臣

(72)【発明者】

【氏名】岩成 宏子

(72)【発明者】

【氏名】大口 正夫

【審査官】 中尾 忍

(56)【参考文献】

【文献】 Li,T.，et al.，“Nicastrin is Required for Assembly of Presenilin/Gamma-Secretase Complexes to Mediate Notch Signaling for Processing and Trafficking of Beta-Amyloid Precursor Protein in Mammals”，J. Neurosci.，２００３年 ４月１５日，Vol.23，No.8，P.3272-3277

【文献】 Ogura,T.，et al.，“Three-dimensional structure of the gamma-secretase complex”，Biochem. Biophys. Res. Commun.，２００６年 ３月 ９日，Vol.34，No.2，P.525-534，［検索日 2012年 5月 2日］，インターネット＜URL: http://ac.els-cdn.com//ac.els-cdn.com/S0006291X06004

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

成熟型ニカストリンに結合する抗ニカストリン抗体、または当該抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはｓｃＦｖを含有するアルツハイマー病の治療薬であって、
抗ニカストリン抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０８として寄託された細胞株ＰＰＭＸ０４１０から産生される抗体であるアルツハイマー病の治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ニカストリン抗体を用いたアルツハイマー病および／または癌の治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

日本における死亡原因疾患の上位３位は、癌（３０．３％）、心疾患（１５．３％）、脳血管疾患（１５．２％）である。人口の高齢化に伴い、それら患者の占める割合も増加し、治療・介護に要する医療経済への影響は莫大であり、脳血管疾患については近年国策として介護保険制度が発足するに至った。

【0003】

平成１６年の日本国内の癌の死亡者数は、３２０，３１５人、人口１０万人あたりの死亡者数は、２５３．９人である。国内の癌による死亡を、その部位別にみると、男性では肺癌が最も多く、平成１５年では癌死亡の２２．３％を占めており、次いで胃癌が１７．２％、肝臓癌が１２．５％となっている。女性の場合は、大腸癌による死亡が最も多く、癌死亡の１４．６％を占めており、次いで胃癌が１４．２％、肺癌が１２．３％の順となっている。主要部位別に癌患者の５年生存率をみると、膵臓癌の５年生存率が最も悪く、わずか数％である。次いで、胆嚢癌、肺および気管支癌、肝臓癌、食道癌などの５年生存率が悪いことが、国立がんセンターより報告されている。大野、中村らによる２０２０年の癌罹患に関する推計によると、新患者数は男性が５０万１０００人になると予測されており、主な部位は、肺、前立腺、胃、結腸、肝臓などである。一方、女性の新患者は３３万７０００人と予測され、乳房、結腸、胃、肺、子宮、直腸、肝臓などの癌が主な患部と推測されている。従って癌は、現在は勿論、将来においても死亡者数の多い疾患であることが推測され、癌に対する治療法の開発は必須である。

【0004】

癌の治療は時代と共に変化し、従来の手術、薬物療法、放射線療法に加え、最近では内視鏡による癌組織の切除が発達し、外来での通院化学療法も増加している。しかしながら、癌治療の約４割は現在でも手術によるものであり、また膵臓癌のように放射線治療や化学療法の効果が得られにくい癌もある。また、化学療法においては、癌組織の縮小が可能であっても、完治に至ることが困難なケースもあり、さらに難治性の癌の多くでは、抗癌剤の効果よりも薬物による有害な反応、すなわち副作用の方が目立つ場合も少なくない。

【0005】

脳血管疾患は、血管障害に基づく認知症と神経変性疾患であるアルツハイマー病に分類される。国内においては食事の欧米化および高齢化に伴いアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）を原因とする痴呆症の増加が認められる。

【0006】

ＡＤは、大脳皮質の神経細胞の変性・脱落により、記憶を中心に広汎な知的機能の障害を呈する神経変性疾患である。ＡＤ脳においては、神経細胞脱落と表裏一体の関係をもってβアミロイドと呼ばれる異常タンパク質が蓄積することが特徴である（非特許文献１）。

【0007】

βアミロイドは、ＡＤ脳に老人斑、血管アミロイドの病理学的形態をとって蓄積し、生化学的には４０〜４２アミノ酸からなるＡβペプチドから構成される。Ａβは前駆体ＡＰＰ（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）から２段階の切断を受けて生成され、細胞外に分泌される。この第２段階目において、γ−セクレターゼと呼ばれる酵素のプロテアーゼ活性によりＡＰＰのＣ末端断片は膜内部分で切断を受け、Ａβが形成されて細胞外に放出される。その切断部位には多様性があり、ＡβのＣ末端の９０％は４０位、１０％は４２位で生じるが（非特許文献２）、βアミロイドとしての凝集性はＡβ４２がより高く、ＡＤ脳においても初期から優先的に蓄積する（非特許文献３）。
家族性ＡＤの主要な病因遺伝子の産物であるプレセニリン蛋白（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ；ＰＳ）は、膜結合型アスパラギン酸プロテアーゼであるγ−セクレターゼの触媒サブユニットに一致することが示されている（非特許文献４、非特許文献５）。

【0008】

γ−セクレターゼはＡＤに関与するだけでなく、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達にも関与することが示され（非特許文献６）、低分子化合物であるγ−セクレターゼ阻害剤がカポシ肉腫に対しアポトーシスを誘導すること（非特許文献７）やＴ−ＡＬＬ細胞株の生存が抑制されること（非特許文献８）が知られている。しかしながら、逆に癌化を亢進する場合も報告され（非特許文献９）、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害により全ての癌に細胞死が誘導されるわけでなく、γ−セクレターゼ阻害剤による癌の治療薬の可能性については今後の研究結果が待たれる。

【0009】

このような背景から、γ−セクレターゼはＡＤおよび癌の治療標的として重視されてきたが、未だ治療薬の開発に成功していない。γ−セクレターゼが複数の膜蛋白質からなる複合体として形成され膜内で蛋白質分解酵素活性を示すことから、活性を保った状態で再構成することが困難であり、薬物のスクリーニングに妥当な評価がされていないことが一つの原因として挙げられる。

【0010】

ヒト活性型γ−セクレターゼ複合体は、プレセニリン、ニカストリン（ＮＣＴ）、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２の４種の蛋白質を含む分子量２５０〜５００キロダルトン以上の巨大膜蛋白質複合体であることが知られている。すなわち、ニカストリンは、γ−セクレターゼの構成分子である。低分子化合物によるγ−セクレターゼ活性の阻害物の探索は多くなされているが、抗ニカストリン抗体によるγ−セクレターゼ活性の阻害剤ならびにＡＤおよび／または癌の治療について実験結果を示した報告は無い。また、ＡＤおよび癌は多くの患者が存在するにも拘わらず、未だ治療に結びつく良薬が無い。さらに、ＡＤおよび癌の治療薬の開発により、介護の軽減は勿論のこと医療経済への負担の軽減が期待できる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ２００１，８１（２）：７４１−７６６．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ｇｅｎｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．

【非特許文献2】Ｓｕｚｕｋｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：１３３６，１９９４

【非特許文献3】Ｉｗａｔｓｕｂｏ Ｔ，Ｏｄａｋａ Ａ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｎ，Ｍｉｚｕｓａｗａ Ｈ，Ｎｕｋｉｎａ Ｎ，Ｉｈａｒａ Ｙ．Ｎｅｕｒｏｎ．１９９４，１３（１）：４５−５３，

【非特許文献4】Ｗｏｌｆｅ ＭＳ，Ｘｉａ Ｗ，Ｏｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ ＢＬ，Ｄｉｅｈｌ ＴＳ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ ＷＴ，Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ ３９８（６７２７）：５１３−５１７

【非特許文献5】Ｌｉ ＹＭ，Ｘｕ Ｍ，Ｌａｉ ＭＴ，Ｈｕａｎｇ Ｑ，Ｃａｓｔｒｏ ＪＬ，ＤｉＭｕｚｉｏ Ｍｏｗｅｒ Ｊ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｔ，Ｌｅｌｌｉｓ Ｃ，Ｎａｄｉｎ Ａ，Ｎｅｄｕｖｅｌｉｌ ＪＧ，Ｒｅｇｉｓｔｅｒ ＲＢ，Ｓａｒｄａｎａ ＭＫ，Ｓｈｅａｒｍａｎ ＭＳ，Ｓｍｉｔｈ ＡＬ，Ｓｈｉ ＸＰ，Ｙｉｎ ＫＣ，Ｓｈａｆｅｒ ＪＡ，Ｇａｒｄｅｌｌ ＳＪ（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ ２０００ Ｊｕｎ ８，４０５（６７８７）：６８９−９４．

【非特許文献6】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ａｕｇ １０；２７６（３２）：３００１８−３００２３．

【非特許文献7】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５ Ｓｅｐ ２２；２４（４２）：６３３３−６３４４．

【非特許文献8】Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００３ Ｊａｎ；２３（２）：６５５−６６４．

【非特許文献9】Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００５ Ｓｅｐ １９；９３（６）：７０９−７１８．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明の目的は新たなＡＤおよび癌の治療薬およびそのスクリーニング方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、ＷＯ２００５／０３８０２３において、発芽バキュロウイルスを用いた、活性型γ−セクレターゼ発現に成功している。本発明者らは、発芽バキュロウイルスを用いた活性型γ−セクレターゼ活性を指標に、抗ニカストリン抗体をスクリーニングしたところ、優れた抗ニカストリン抗体がγ−セクレターゼ中和活性を示し、さらにＮｏｔｃｈ発現細胞株の増殖抑制および／または生存率の改善を示すことからＡＤおよび／または癌の治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。また、ニカストリンとγ−セクレターゼの基質である受容体またはＡＰＰの膜内配列を含むポリペプチドとの反応を抗ニカストリン抗体が阻害することから、この反応系を用いればγ−セクレターゼ活性を阻害する抗体のスクリーニングが可能になることを見出し、本発明を完成した。

【0014】

すなわち、本発明は、抗ニカストリン抗体、その誘導体およびそれらの断片を含有するＡＤおよび／または癌の治療薬を提供するものである。
また、本発明は、被検抗体を添加して、ニカストリンとγ−セクレターゼの基質とを反応させることを特徴とするγ−セクレターゼ活性を阻害する抗体のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、抗ニカストリン抗体、その誘導体またはそれらの断片の、アルツハイマー病および／または癌の治療薬の製造のための使用を提供するものである。
抗ニカストリン抗体、その誘導体またはそれらの断片を投与することを特徴とする、アルツハイマー病および／または癌の治療方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0015】

本発明のＡＤおよび／または癌の治療薬によれば、抗ニカストリン抗体によって、γ−セクレターゼ活性を阻害することができ、アルツハイマー病および／または癌の治療をすることができる。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、ニカストリンとγ−セクレターゼの基質との反応系を用いることにより、γ−セクレターゼ活性を阻害する抗体、すなわち、アルツハイマー病および／または癌の治療に有効な抗体をスクリーニングすることができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、ＢＶ−ＥＬＩＳＡによる抗ニカストリン抗体のスクリーニングの結果を示す。

【図2】図２は、ＢＶを用いたウェスタンブロット解析による抗ニカストリン抗体のスクリーニングの結果を示す。

【図3】図３は、ＣＯＳ−７細胞に発現させた各種ニカストリンのウェスタンブロット解析の結果を示す。

【図4】図４は、糖鎖消化したニカストリンに対する抗ニカストリン抗体の交差性実験の結果を示す。「○」はＥｎｄｏ Ｈ耐性のニカストリンを、「●」は糖鎖が完全に除去されたニカストリンを、「△」はＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅによりシアル酸が除去されたニカストリンを表す。

【図5】図５は、ＨｅＬａ細胞膜可溶画分からの抗ニカストリン抗体によるＩＰの結果を示す。

【図6】図６は、ＨｅＬａ細胞のｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅを用いたトリプシン処理実験の結果を示す。

【図7】図７は、抗ニカストリン抗体を用いたＨｅＬａ細胞の免疫細胞染色の結果を示す。

【図8】図８は、抗ニカストリン抗体を用いたＮＫＯ細胞およびＮＫＯ／ＮＣＴ細胞の免疫細胞染色の結果を示す。

【図9】図９は、抗ニカストリン抗体と各種マーカータンパク質に対する抗体との共染色の結果を示す。

【図10】図１０は、抗ニカストリン抗体とコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）との共染色の結果を示す。

【図11】図１１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ γ−セクレターゼ活性に対する抗ニカストリン抗体の影響を示す。

【図12】図１２は、ＨｅＬａ細胞およびＡ５４９細胞の細胞生存率に対するＤＡＰＴの影響を示す。

【図13】図１３は、Ａ５４９細胞の細胞生存率に対するニカストリンの発現抑制の影響を示す。

【図14】図１４は、ｓｉＲＮＡによるＡ５４９細胞の内因性ニカストリンの発現抑制の結果を示す。

【図15】図１５は、Ａ５４９細胞の細胞生存率に対する抗ニカストリン抗体の影響を示す。

【図16】図１６は、各種Ｔ−ＡＬＬ由来細胞におけるＮＯＴＣＨ１遺伝子の変異部位を示す。

【図17】図１７は、各種Ｔ-ＡＬＬ由来細胞ｌｙｓａｔｅにおけるＮＯＴＣＨ１遺伝子産物のウェスタンブロット解析結果を示す。

【図18】図１８は、γ-セクレターゼ阻害剤ＹＯによる各種Ｔ-ＡＬＬ由来細胞の増殖に対する影響を示す。

【図19】図１９は、ＤＮＤ−４１細胞増殖に対する抗ニカストリン抗体の影響を示す。

【図20】図２０は、抗ニカストリン抗体とニカストリン・Ｎ１００画分とのウェスタンブロット解析の結果を示す。

【図21】図２１は、抗ニカストリン抗体のニカストリン・Ｎ１００−ＦＬＡＧ結合阻害の結果を示す。

【図22A】図２２Ａは、抗ニカストリン抗体の生細胞におけるγ−セクレターゼ活性阻害の結果を示す。

【図22B】図２２Ｂは、抗ニカストリン抗体の生細胞におけるγ−セクレターゼ活性阻害の結果を示す。

【図22C】図２２Ｃは、抗ニカストリン抗体の生細胞におけるγ−セクレターゼ活性阻害の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、抗ニカストリン抗体およびその誘導体またはそれらの断片を用いたＡＤおよび／または癌の治療薬、当該薬の製造のための使用、アルツハイマー病および／または癌の処置方法である。

【0018】

本発明における抗ニカストリン抗体の誘導体には、後記のとおり抗体の修飾物および抗ニカストリン抗体に所望の薬効を有する化合物を結合させたものも含むことを意味する。

【0019】

また、ニカストリンとは、膜蛋白質であり、複合体を形成しγ−セクレターゼ活性を示す。ニカストリンのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列はＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ_-０１５３３１）に開示されている（配列番号１および２）。本発明において、ニカストリン蛋白質とは、全長蛋白質およびその断片の両方を含むことを意味する。ここで、断片とは、ニカストリン蛋白質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のニカストリン蛋白質の機能を有していなくてもよい。

【0020】

本発明で抗原として使用するニカストリン蛋白質はヒトニカストリン蛋白質が好ましいが、それに限定されず、イヌニカストリン、ネコニカストリン、マウスニカストリン、ハムスターニカストリン、ショウジョウバエニカストリンなどヒト以外の種のいかなるニカストリンでもよい。さらに、ニカストリン蛋白質を使用して得られた抗体がニカストリンを構成分子とするヒト活性型γ−セクレターゼを中和することが望まれる。
ここで、ヒト活性型γ−セクレターゼとは、フラグメント型プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２の４種の蛋白質を含む分子量２５０〜５００キロダルトン以上の巨大膜タンパク質複合体である。

【0021】

本発明における活性型γ−セクレターゼは、後記実施例記載の方法に従い調製することができる（ＷＯ２００５／０３８０２３）。天然型のヒト活性型γ−セクレターゼとしてヒト脳の破砕物から得ることは可能であるが、γ−セクレターゼ阻害剤のスクリーニングに用いるのは極めて困難である。このため、本発明者らがＷＯ２００５／０３８０２３において、発芽バキュロウイルスを用いた、活性型γ−セクレターゼ複合体の発現に成功している方法を用いることが好ましい。

【0022】

本発明におけるγ−セクレターゼ活性の測定法としては、Ｙａｓｕｋｏ Ｔａｋａｈａｓｈｉらによる方法（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｍａｙ １６；２７８（２０）：１８６６４−７０）が一般的に知られている。すなわち、酵素として脳組織・培養細胞から調製したミクロソームと被検物を混和し、４℃で１２時間インキュベーションを行った後、基質として１μＭのＣ１００ＦｍＨを加え、３７℃で１２時間インキュベーションを行う。その後、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、アミロイドβ量を測定することで、γ−セクレターゼ活性を検討する。

【0023】

抗ニカストリン抗体の作製
本発明で用いられる抗ニカストリン抗体はニカストリン蛋白質に特異的に結合するだけでなく、ヒト活性型γ−セクレターゼを中和することが好ましいが、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、トリ抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化（ＣＤＲ移植）抗体などの公知の抗体を用いることができるが、好ましくは、ヒト、キメラ、ヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。

【0024】

また、抗ニカストリンモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。

【0025】

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ニカストリン蛋白質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。

【0026】

まず、抗体取得の感作抗原として使用されるニカストリン蛋白質を、ＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ_-０１５３３１）に開示されたニカストリン遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ニカストリンをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトニカストリン蛋白質を公知の方法で精製する。また、天然のニカストリン蛋白質を精製して用いることもできる。

【0027】

次に、この精製ニカストリン蛋白質を感作抗原として用いる。あるいは、ニカストリン蛋白質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはニカストリン蛋白質のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ニカストリン遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のニカストリン蛋白質を蛋白質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるニカストリンの部分および大きさは限られない。

【0028】

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはトリ、ウサギ、サル等が使用される。

【0029】

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体蛋白質と結合させて免疫することが望ましい。

【0030】

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

【0031】

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。

【0032】

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。

【0033】

より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

【0034】

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

【0035】

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

【0036】

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。

【0037】

また、ニカストリン蛋白質を認識する抗体の作製は国際公開公報ＷＯ０３／１０４４５３に記載された方法を用いて作製してもよい。

【0038】

目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。

【0039】

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでニカストリンに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ニカストリンへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるニカストリンを投与して抗ニカストリン抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からニカストリンに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。

【0040】

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

【0041】

当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

【0042】

本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗ニカストリン抗体を産生するハイブリドーマから、抗ニカストリン抗体の可変（Ｖ）領域をコードするを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。

【0043】

得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５'−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５'−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。

【0044】

得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。

【0045】

目的とする抗ニカストリン抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。

【0046】

本発明で使用される抗ニカストリン抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。

【0047】

抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。

【0048】

また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。

【0049】

本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。

【0050】

キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。

【0051】

ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。

【0052】

具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。

【0053】

ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。

【0054】

キメラ抗体およびヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。

【0055】

キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、治療剤の有効成分として有用である。

【0056】

本発明で使用される抗ニカストリン抗体は、抗体の全体分子に限られず、ニカストリン蛋白質に結合すれば、抗体の断片またはそれらの誘導体（抗体の修飾物および所望の薬効を有する化合物を結合させた抗体も含む。）であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれるが、好ましくは、ヒト活性型γ−セクレターゼを中和するものであればよい。

【0057】

抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。

【0058】

シングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）は、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。

【0059】

ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。

【0060】

また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。

【0061】

これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。

【0062】

抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や糖鎖などの各種分子と結合した抗ニカストリン抗体を使用することもできる。かかる修飾によって抗体の半減期を長くしたり、血中での加水分解や排除を低減させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体およびその断片に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。

【0063】

さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はＮＣＴ分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。

【0064】

前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。

【0065】

また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。

【0066】

ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。

【0067】

大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。

【0068】

抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅ１Ｂシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。

【0069】

複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。

【0070】

本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。

【0071】

好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。

【0072】

次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

【0073】

前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。

【0074】

前記の如くして得られる抗ニカストリン抗体は、後記実施例に示すように、ヒト活性型γ−セクレターゼの構成分子であるニカストリン蛋白質を認識し、特異的に結合し、かつ、γ−セクレターゼ中和活性を有する。また、γ−セクレターゼ依存的な生存を示す癌細胞に対して増殖阻害能も有する。従って、抗ニカストリン抗体、その誘導体もしくはそれらの断片は、アルツハイマー病および／または癌の治療薬として有効である。
本発明で治療可能な癌は、ニカストリンを発現している癌および／またはγ−セクレターゼ依存性の癌であると考えている。
かかる癌としては、肺癌、急性Ｔ細胞性リンパ芽球性白血病が挙げられる。
ここで、ニカストリンを発現している癌とは、ニカストリンが発現することによりニカストリン蛋白質を生産している癌をいう。また、γ−セクレターゼ依存性の癌とは、癌細胞の増殖にγ−セクレターゼが必須であり、γ−セクレターゼの活性が阻害されると細胞が増殖抑制または死滅する癌をいう。

【0075】

また、抗ニカストリン抗体の誘導体またはその断片は、抗ニカストリン抗体またはその断片に所望の薬効を有する化合物を常法の方法で結合させたものも挙げられる。かかる抗ニカストリン抗体の誘導体は、例えばニカストリンを特異的にターゲティングさせるミサイル療法において用いることができる。また、所望の薬効を有する化合物とは、例えば症状を直接的間接的に進行させる酵素や受容体などを阻害、促進する等の薬効を有するものをいう。

【0076】

癌治療薬の所望の薬効を有する化合物としては、例えば、癌細胞に障害をもたらす化合物、または細胞障害活性を付加あるいは増強させる化合物、例えば放射性同位元素などが挙げられる。放射性同位元素としては、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくは¹³¹Ｉ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙである。
放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いた癌治療は、当業者公知の方法により行うことができる。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。

【0077】

本発明の治療薬は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。

【0078】

経口投与用には、本発明の治療剤を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。

【0079】

非経口投与用には、本発明の治療剤を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明の治療剤を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。座剤処方は、本発明の治療剤をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。

【0080】

投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、本発明の治療剤は、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。

【0081】

治療薬は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、特に限定されず、経口投与でもよい。

【0082】

γ−セクレターゼ活性を阻害する抗体のスクリーニング方法
後記実施例記載のように、抗ニカストリン抗体は、ニカストリンとＣ９９およびＮ９９などのγ−セクレターゼの基質の反応を阻害することを見出した。
従って、本発明のγ−セクレターゼ活性を阻害する抗体のスクリーニング方法は、ＡＤや癌の治療薬の探索として有望である。
本発明のスクリーニング方法は、被検抗体を添加して、ニカストリンとγ−セクレターゼの基質、例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体および／またはＡＰＰの膜内配列を含む一部又は全部からなるポリペプチドとを反応させ、当該ニカストリンと当該基質の反応を検出することによって行う。

【0083】

具体的には、被検抗体を添加して、ニカストリンとＮｏｔｃｈ配列の一部又は全部からなるポリペプチド、もしくはニカストリンとＡＰＰ配列の一部または全部からなるポリペプチドとを反応させ、公知の検出方法にて、被検抗体がこれらの反応を阻害するか否かを確認する。
または、被検抗体を、ニカストリンとＮｏｔｃｈならびに／もしくはＡＰＰ配列の一部または全部からなるポリペプチドとが発現している細胞に添加して反応させ、公知の検出方法にて、これらの反応生産物を生成するか否かを確認する。
好ましくは後者の方法である。後者の方法はスクリーニング工程がより簡便であり、さらに公知の検出方法との組み合わせによって短期間で多数の検体を評価でき、被検抗体がγ−セクレターゼ活性を阻害する抗体か否かを評価でき、ＡＤおよび癌の治療薬を迅速に開発することが可能となる。

【0084】

スクリーニング方法に使用されるγ−セクレターゼの基質は、Ｎｏｔｃｈ受容体（ＮＭ＿００８７１４）（配列番号３）の膜内配列を含む一部又は全部からなるポリペプチドおよび／またはＡＰＰタンパク質（ＮＭ＿０００４８４）（配列番号４）の膜内配列を含む一部又は全部からなるポリペプチドが挙げられる。Ｎｏｔｃｈ受容体またはＡＰＰタンパク質の一部又は全部からなるポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ受容体の膜内配列（ＮＨ２−ＨＬＭＹＶＡＡＡＡＦＶＬＬＦＦＶＧＣＧＶＬＬ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列（５'−ｃａｃｃｔｃａｔｇｔａｃｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｔｃｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔｔｃｔｔｔｇｔｇｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇ−３'）（配列番号６）またはＡＰＰタンパク質の膜内配列（ＮＨ２−ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ−ＣＯＯＨ）（配列番号７）を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列（５'−ｇｇｔｇｃａａｔｃａｔｔｇｇａｃｔｃａｔｇｇｔｇｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇｔｃａｔａｇｃｇａｃａｇｔｇａｔｃｇｔｃａｔｃａｃｃｔｔｇｇｔｇａｔｇｃｔｇ−３'）（配列番号８）を発現させたものであればよく、Ｎｏｔｃｈ受容体の１７１１から１８０９番目までの膜内配列を含むタンパク質の９９アミノ酸（Ｎ９９ともいう。）（ＮＨ２−ＶＫＳＥＰＶＥＰＰＬＰＳＱＬＨＬＶＹＶＡＡＡＡＦＶＬＬＦＦＶＧＣＧＶＬＬＳＲＫＲＲＲＱＨＧＱＬＷＦＰＥＧＦＫＶＳＥＡＳＫＫＫＲＲＥＰＬＧＥＤＳＶＧＬＫＰＬＫＮＡＳＤＧＡＬＭＤＤＮＱＮＥＷＧＤＥＤＬＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号９）をコードする遺伝子配列（配列番号１０）またはＡＰＰのＣ末端から９９番目までの膜内配列を含むタンパク質の９９アミノ酸（Ｃ９９ともいう。）（ＮＨ２−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧＶＶＥＶＤＡＡＶＴＰＥＥＲＨＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥＱＭＱＮ−ＣＯＯＨ）（配列番号１１）をコードする遺伝子配列（配列番号１２）を発現させたものが特に好ましい。

【0085】

γ−セクレターゼの基質であるタンパク質の一部又は全部からなるポリペプチドは、アミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列を発現することによって、または天然物より得られる。
γセクレターゼの基質であるタンパク質の一部又は全部からなるポリペプチドの由来は、ヒト由来が好ましいが、それに限定されず、イヌ、ネコ、マウス、ハムスター、ショウジョウバエなどヒト以外の種のいかなる由来でもよい。
ニカストリンまたはγ−セクレターゼの基質のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列には、検出方法に応じて、Ｖ５、ＦＬＡＧなどのタグ配列を付加して発現させてもよい。

【0086】

被検抗体が、γ−セクレターゼ活性を阻害するか否かの検出方法は、免疫共沈（ＩＰ）、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、レポータージーンアッセイ（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ）法、ＳＰＡ Ｂｅａｄｓ法、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ法、Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｉｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ法等公知の方法を適宜単独または組み合わせることにより行うことができる。

【0087】

例えば、免疫共沈（ＩＰ）とウェスタンブロット法との組み合わせを用いる。公知の方法にて、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体およびＡＰＰの膜内配列を含む一部または全部からなるペプチドのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列に、ＦＬＡＧ、Ｖ５などのタグ配列を付加して発現させる。
上記発現させた宿主細胞からニカストリンやＮｏｔｃｈ受容体およびＡＰＰの膜内配列を含む一部または全部からなるペプチドを、公知の抽出方法により、細胞膜を可溶化して抽出し、適宜精製する。

【0088】

抽出したニカストリンを培養液で希釈後、被検抗体を混合し、４℃で８〜１２時間反応後、ＮｏｔｃｈまたはＡＰＰペプチドを添加し、さらに３〜４時間、混和する。緩衝溶液は、０．５％ ＣＨＡＰＳＯを含むＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒを用いる。
タグに対応する抗体を添加後、ＩＰし、ついで沈降画分を公知のウェスタンブロットにて解析する。タグに対応する抗体は、予めアガロースビーズなどの担体に結合させていてもよい。

【0089】

この場合、ニカストリンと、Ｎｏｔｃｈ受容体およびＡＰＰの膜内配列を含む一部または全部からなるペプチドの沈降が少ないほど、γ−セクレターゼ活性阻害率が高い被検抗体であると判断する。
また、一方を担体やアッセイプレートなどに固定し、他方を放射性同位体や蛍光物質などでラベルし、バインディングアッセイを用いてもよい。また、被検抗体に抗原などのタグや放射性同位体などのラベルなどをつけて検出してもよい。

【0090】

また、例えば、ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムとＥＬＩＳＡやリポータージーンを組み合わせた方法を用いる。公知の方法にて、Ｃ９９にＧＡＬ４を挿入したコンストラクト（ＳＣ１００Ｇ）を作製し、またレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にＵＡＳ配列を挿入したレポーターコントラスト（ＵＡＳ−ｌｕｃ）を作製する。これらを宿主細胞にリポフェクションなどの公知の方法で導入する。恒常発現細胞の選択は、適宜抗生物質耐性マーカーなどにより行う。
恒常発現細胞を３７℃、２４時間培養後、被検抗体を添加して、さらに導入遺伝子を発現させる。導入遺伝子の発現誘導は、１０ｍＭのｎ−ｂｕｔｙｌｉｃ ａｃｉｄを添加する。３７℃、１２時間培養後、当該細胞または上清を回収する。
当該細胞を用いる場合は、溶解後、ルシフェラーゼによる発光量の減少するほど、被検抗体がニカストリンとＮｏｔｃｈ受容体の膜内ペプチドまたはＡＰＰペプチドとの結合を阻害し、Ｎｏｔｃｈ受容体の膜内ペプチドおよびＡＰＰペプチド切断を抑制し、γ−セクレターゼ活性阻害率が高い被検抗体であると判断する。
当該上清を用いる場合には、細胞外に放出された、ＥＬＩＳＡに対応できる指標を付けたＡβペプチドの断片をＥＬＩＳＡ法により測定する。ＥＩＬＳＡ反応が少ないほど、被検抗体がニカストリンとＮｏｔｃｈ受容体またはＡＰＰペプチドとの結合を阻害し、Ｎｏｔｃｈ受容体ペプチドまたはＡＰＰペプチドの膜内配列切断を抑制し、γ−セクレターゼ活性阻害率が高い被検抗体であると判断する。
ルシフェラーゼの代わりに、アルカリフォスファターゼ、ＧＦＰを用いてもよい。

【実施例】

【0091】

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

【0092】

実施例１ 昆虫細胞の培養
昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓｆ９）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００Ｕ／ｍＬ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＧｒａｃｅ'ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２７℃で培養を行った。大量培養を行う際には、１Ｌのスピナーフラスコを用いて、上記培地にさらに０．００１％ ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して培養した。

【0093】

実施例２ 組み換えウイルスの作製
ヒトニカストリンを含むコンストラクト（ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５−ＮＣＴ）は、ｐＥＦ６−ＴＯＰＯ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされたヒトニカストリンｃＤＮＡ（ｐＥＦ６−ＮＣＴ）（Ｔ．Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５２０（２００２）１１７−１２１）を、Ｃ末端側にベクター由来のＶ５−Ｈｉｓタグを含んでｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして作製した。組み換えウイルスの作製はＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添付されているプロトコールに従い、Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＤＮＡと作製した各プラスミド４μｇをＳｆ９細胞にトランスフェクトした。数回のプラークアッセイによる純化を行い、目的の遺伝子のみを含む組み換えウイルスを調製した。Ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｓｔｏｃｋ作製後、プラークアッセイによりウイルスのタイターチェックを行った。

【0094】

実施例３ ニカストリンのＢＶ上への発現の確認
１回膜貫通型タンパク質であるニカストリンについて、組み換えウイルスを作製し、ＢＶ上への発現を確認した。Ｓｆ９細胞にｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）５で感染させ、１２、２４、４８、７２時間後に細胞およびＢＶを回収し、抗ニカストリンＮ末端抗体（ａｎｔｉ−ＮＣＴ（Ｎ−１９）ＳａｎｔａＣｒｕｚ）とａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を用いたイムノブロットによりニカストリンの発現を確認したところ、細胞画分に加えてＢＶ画分においても、感染から４８時間後に十分な発現が認められたことから、ニカストリンにおいてもＳＲＥＢＰ−２（Ｙ．Ｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０８（２００３）１９１−１９６）と同様にＢＶ上への発現が可能であることが示された。

【0095】

実施例４ 発芽型ウイルス（ＢＶ）を用いた抗ニカストリン抗体の作製
ＢＶ上にはウイルス由来の膜タンパク質であるｇｐ６４が多量に発現しかつ抗原性が高いために、ＢＶをマウスに免疫するとｇｐ６４に対する抗体が強く誘導され、目的の抗原に対する抗体を得ることが困難であることから、ｇｐ６４に対して耐性を示すよう作出されたｇｐ６４トランスジェニックマウスを免疫用マウスとして使用した。
ヒトニカストリン発現組み換えウイルス（ＮＣＴ−ＢＶ）を用いて、Ｓｆ９細胞（５ｘ１０⁸ｃｅｌｌｓ／５００ｍＬ）にＭＯＩ５で感染させ、４８時間培養した。回収した培養上清から超遠心により抗原となるＢＶを調製した後、ｇｐ６４トランスジェニックマウスに対して、５回免疫を行った。
抗血清、および得られたハイブリドーマの培養上清のスクリーニングは、ＢＶ−ＥＬＩＳＡにより、定法に従い行った。固層化用の抗原として、免疫時に使用したＮＣＴ−ＢＶ、およびネガティブコントロールとしてＳＲＥＢＰ−２とＳＲＥＢＰ ｃｌｅａｖａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＣＡＰ）（Ｙ．Ｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０８（２００３）１９１−１９６）を共感染させて得られたＳＲＥＢＰ＋ＳＣＡＰ−ＢＶまたは外来の遺伝子を含まないＷｉｌｄ−ＢＶ（２０μｇ／ｍＬ ｉｎ ｓａｌｉｎｅ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ加えた。その結果、野生型ＢＶやＳＲＥＢＰ・ＳＣＡＰ発現ＢＶには反応せず、ニカストリン発現ＢＶのみに陽性な反応を示すクローンが多数得られた（図１）。また同様にＢＶを用いたイムノブロットではＰＰＭＸ０４０１、ＰＰＭＸ０４１０などＢＶ上に発現したニカストリンを認識するクローンが複数得られた（図２）。

【0096】

実施例５ 細胞培養
ＣＯＳ−７（サル腎臓由来細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌由来細胞）、Ａ５４９（ヒト肺癌由来細胞）、およびＮＫＯ細胞（ニカストリンノックアウトマウス由来線維芽細胞：Ｔ．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（２００３）３２７２−３２７７）は、１０％ＦＢＳ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００Ｕ／ｍＬ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ₂中で培養した。

【0097】

実施例６ ＢＶおよび強制発現産物を用いた抗体の同定
ＢＶ−ＥＬＩＳＡにより得られた陽性クローンの培養上清について、ＮＣＴ−ＢＶ、Ｗｉｌｅｄ−ＢＶおよびヒト野生型や各変異型ニカストリンを用いて、１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロットを行った。ポジティブコントロールとして抗ニカストリンＮ末端抗体（Ｎ−１９）を用いた。動物細胞を用いた一過性の発現では、ＣＯＳ−７細胞へＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを用いて導入し、トランスフェクションから４８時間後に細胞を回収した。ヒト野生型ニカストリンにはｐＥＦ６−ＮＣＴを用いた。また、各変異型ニカストリンのコンストラクト（Δ３１２、Δ６９４）は、ｐＥＦ６−ＮＣＴからｌｏｎｇＰＣＲ法により作製した（Ｔ．Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５２０（２００２）１１７−１２１）。

【0098】

その結果、いずれの抗体も外因性に発現させたヒト野生型ニカストリンを認識出来ることが確認された。ポジティブコントロールに用いた抗ニカストリンＮ末端抗体（Ｎ−１９）やＣ末端に付加されたＶ５タグに対する抗体では、野生型、変異型に関わらず認識できるのに対して、今回作製した抗体は、ＰＰＭＸ０４０１、ＰＰＭＸ０４１０等ほとんどのクローンがニカストリンΔ３１２を認識しなかった（図３）。このことは、今回得られた抗体のエピトープ部位がニカストリンの細胞外ドメイン中に存在することを示唆する。

【0099】

実施例７ ニカストリン恒常発現細胞の作製
抗ニカストリン抗体の解析を目的として、ＮＫＯ細胞にｐＥＦ６−ＮＣＴをＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入し、１０μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを含む培地で選択することにより、ヒトニカストリンを恒常的に発現するＮＫＯ細胞（ＮＫＯ／ＮＣＴ）細胞を取得した。

【0100】

実施例８ ニカストリンの糖鎖消化
ニカストリンは配列上２０カ所の予想される糖鎖修飾部位を持ち、高度にＮ−結合型の糖鎖修飾を受けることが知られている（Ｔ．Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５２０（２００２）１１７−１２１；Ｊ．Ｙ．Ｌｅｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）１９２３６−１９２４９；Ｄ．Ｓ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）２８１３５−２８１４２；Ｗ．Ｔ．Ｋｉｍｂｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）３５１１３−３５１１７）。
ニカストリンには、糖鎖の修飾の程度により成熟型（分子量約１３０ｋＤａ）または未成熟型（分子量約１１０ｋＤａ）と呼ばれるものが存在し、活性型のγ−セクレターゼ複合体中には、成熟型ニカストリンのみが含まれている。Ｎ−結合型糖鎖のうち複合型糖鎖はＥｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｈ（Ｅｎｄｏ Ｈ）に対しては耐性であるが、Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆ（ＰＮＧａｓｅ）では切断を受けることが知られている。したがってニカストリンにおいては、ＥｎｄｏＨ処理により複合型糖鎖修飾を受けた成熟型ニカストリンは分子量が約１１５ｋＤａとなり、複合型糖鎖を持たない未成熟型は約８０ｋＤａとなるが、ＰＮＧａｓｅＦ処理により両方とも約８０ｋＤａとなる（Ｄ．Ｓ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）２８１３５−２８１４２、Ｗ．Ｔ．Ｋｉｍｂｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）３５１１３−３５１１７）。
そこで、抗ニカストリン抗体のエピトープ解析を目的に糖鎖消化実験を行った。

【0101】

まずＮＫＯ／ＮＣＴ細胞をＰＢＳで洗浄後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ａｔ ｐＨ７．５，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％ ＳＤＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、４℃で８時間転倒混和して可溶化した得られた可溶画分から抗ニカストリンＣ末端抗体（Ｎ１６６０，Ｓｉｇｍａ）によりニカストリンを免疫沈降（ＩＰ）し、沈降したニカストリン画分を以降の解析に用いた。
Ｅｎｄｏ ＨまたはＰＮＧａｓｅ処理として、ニカストリン画分に２００ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ−ＮＡＯＨ ｐＨ５．８，０．１％ ＳＤＳ，１％ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加え、９５℃で５分間煮沸した。これに５００ｍＵ／ｍＬ Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）または２００Ｕ／ｍＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、３７℃で終夜反応させた。最後に１／４量の５ｘ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ加えて９５℃で５分間煮沸し、反応を停止させた。
Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｓｉａｌｉｄａｓｅ）処理として、ニカストリン画分に５０ｍＭ Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．２，２ｍＭ ＣａＣｌ₂，０．５％ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加え、９５℃で５分間煮沸した。これに５００ｍＵ／ｍＬ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、３７℃で終夜反応させた。最後に１／４量の５ｘ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて９５℃で５分間煮沸し、反応を停止させた。
各糖鎖消化酵素により処理したサンプルをウェスタンブロット解析した結果、ＰＰＭＸ０４０１、ＰＰＭＸ０４０８、ＰＰＭＸ０４１０はいずれも糖鎖消化されたニカストリンに対して交差性を示すことが明らかとなった（図４）。「○」はＥｎｄｏＨ耐性のニカストリンを、「●」は糖鎖が完全に除去されたニカストリンを、「△」はＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅによりシアル酸が除去されたニカストリンを表す。
この結果、特にＰＮＧａｓｅ Ｆにより完全に糖鎖を除去したニカストリンを認識するという結果は、今回得られた抗体がニカストリンの糖鎖ではなく、ペプチド鎖を認識して結合することを示唆する。

【0102】

実施例９ 抗ニカストリン抗体による内因性ニカストリンの免疫沈降（ＩＰ）
ＨｅＬａ細胞を細胞破砕ｂｕｆｆｅｒ（１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）））に懸濁しホモジェナイザーにて破砕後、１，５００ｘｇ、１０分間遠心した。さらに上清を１００，０００ｘｇ、１時間超遠心し、得られた沈殿をＨｅＬａ細胞膜画分とした。細胞膜画分を１％ＣＨＡＰＳＯを含むＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒにて可溶化し、ＨｅＬａ細胞膜可溶画分を得た。今回得られた抗ニカストリンモノクローナル抗体を用いて可溶画分からＩＰした後、各種の抗体でウェスタンブロット解析した。

【0103】

その結果、今回得られた抗体には、未成熟型ニカストリンのみをＩＰする群（ＰＰＭＸ０４０１、ＰＰＭＸ０４０２、ＰＰＭＸ０４０７、ＰＰＭＸ０４０９）と未成熟型と成熟型ニカストリンの両方をＩＰする群（ＰＰＭＸ０４０６、ＰＰＭＸ０４０８、ＰＰＭＸ０４１０）の２群が存在することが明らかとなった（図５）。後者（ＰＰＭＸ０４０６、ＰＰＭＸ０４０８、ＰＰＭＸ０４１０）ではγ−セクレターゼ複合体の構成因子であるプレセニリン、ＰＥＮ−２、ＡＰＨ−１ａＬが共沈降されたのに対し、前者（ＰＰＭＸ０４０１、ＰＰＭＸ０４０２、ＰＰＭＸ０４０７、ＰＰＭＸ０４０９）では少量のＡＰＨ−１ａＬのみが共沈降された。未成熟型ニカストリンはγ−セクレターゼ複合体の形成に先立ってＡＰＨ−１と結合し、ｓｕｂ−ｃｏｍｐｌｅｘを形成することが報告されている（Ｍ． ＬａＶｏｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）３７２１３−３７２２２）。したがって、前者（ＰＰＭＸ０４０１、ＰＰＭＸ０４０２、ＰＰＭＸ０４０７、ＰＰＭＸ０４０９）はニカストリン−ＡＰＨ−１ ｓｕｂ ｃｏｍｐｌｅｘ中の未成熟型ニカストリンに特異的に結合するものと考えられた。

【0104】

また、ニカストリンの細胞外ドメインはγ−セクレターゼ複合体の形成に伴って構造変化をすることが報告されている（Ｋ．Ｓｈｉｒｏｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）１６４７４−１６４７７）。ＨｅＬａ細胞の１％ ＣＨＡＰＳＯ ｌｙｓａｔｅをトリプシンで処理すると、ニカストリンの細胞外ドメインはトリプシン耐性を示したことから、１％ＣＨＡＰＳＯ条件下でニカストリンの細胞外ドメインはγ−セクレターゼ複合体中での構造を保持していると考えられた（図６）。したがって、ＩＰの結果は、前者のエピトープ部位はニカストリンの構造変化によりマスクされるが、後者のエピトープ部位は構造変化後も露出している可能性を示唆している。

【0105】

実施例１０ 抗ニカストリンモノクローナル抗体を用いた培養細胞の免疫染色
生化学的検討から、成熟型ニカストリンを含む活性型γ−セクレターゼは脂質ラフトに局在することが報告されている（Ｕｒａｎｏ Ｙ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｉ，Ｉｓｏｏ Ｎ ｅｔ ａｌ．：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００５，４６：９０４）。そこで、今回得られた抗体について培養細胞を用いて免疫染色を行い、それぞれの抗体により認識されるニカストリンの細胞内局在を検討した。検討にはＨｅＬａ細胞とＮＫＯ細胞を用いた。予めポリ−Ｄ−リジンでコートしたカバーガラスに細胞を適当な密度で接着させ、ＰＢＳで洗浄後４％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。ブロッキングには３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用い、浸透化する場合にはさらに終濃度０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた。適当な濃度にブロッキング液で希釈した各抗体と室温にて３時間または４℃にて一晩反応させた。二次抗体にはＡｌｅｘａ４８８または５４６を結合した抗マウスまたはラビットイムノグロブリン抗体を用いた。
その結果、ＨｅＬａ細胞において、ＰＰＭＸ０４０８では顆粒状の構造と細胞膜が染色されたのに対し、ＰＰＭＸ０４０１ではそのような構造は染色されなかった（図７）。ＮＫＯ細胞ではＰＰＭＸ０４０８によって顆粒状の構造は染色されなかったが、ＮＫＯ細胞に野生型ニカストリンを導入するとＨｅＬａ細胞での結果と同様の染色像を示した（図８）。これらの結果は、ＰＰＭＸ０４０８により染色される顆粒状の構造はニカストリンに由来することを示す。

【0106】

続いて、この顆粒状構造の細胞内局在を検討するため、ＰＰＭＸ０４０８と各種のマーカー蛋白質に対する抗体との共染色を行った。その結果、それぞれ小胞体、ゴルジ体のマーカー蛋白質であるカルネキシン、ジャイアンチンとは局在が一致しなかった（図９）。それに対し、脂質ラフトに存在するＧＭ１ガングリオシドを染色するコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の染色は、ＰＰＭＸ０４０８による顆粒状構造の染色とよく一致した。ＰＰＭＸ０４０１による染色はＣＴＢとは一致しなかった（図１０）。ブロッキング時にＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理しない非浸透化条件においても同様の局在の一致が見られた（図１０）。これらの結果から、ＰＰＭＸ０４０８は細胞膜を含む脂質ラフトに局在する成熟型ニカストリンを認識することが考えられる。

【0107】

実施例１１ 抗ニカストリンモノクローナル抗体を用いたヒト活性型γ−セクレターゼ活性の中和
ＰＰＭＸ０４０８およびＰＰＭＸ０４１０はγ−セクレターゼ複合体を保持した条件下で、活性型γ−セクレターゼに含まれる成熟型ニカストリンと結合することから、これらの抗体はγ−セクレターゼの活性に影響を与えるものと考えられた。ＨｅＬａ細胞のミクロソーム画分を１％ＣＨＡＰＳＯにより可溶化し、人工基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ γ−セクレターゼアッセイ系に各抗体を添加して、γ−セクレターゼ活性をｄｅ ｎｏｖｏ合成されたＡβの集積を指標にして測定した（Ｔａｋａｓｕｇｉ Ｎ，Ｔｏｍｉｔａ Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｉ，Ｔｓｕｒｕｏｋａ Ｍ，Ｎｉｉｍｕｒａ Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｙ，Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ Ｇ，Ｉｗａｔｓｕｂｏ Ｔ．：Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２２：４３８；Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｙ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｉ，Ｔｏｍｉｎａｒｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．：Ｓｕｌｉｎｄａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓ ａ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｂｅｔａ ４２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３，２７８：１８６６４）。
その結果、ＰＰＭＸ０４０１を終濃度１０μｇ／ｍＬ添加した場合のγ−セクレターゼ活性はＰＢＳを添加した場合と同程度であったのに対し、ＰＰＭＸ０４０８およびＰＰＭＸ０４１０を終濃度１０μｇ／ｍＬ添加した場合はγ−セクレターゼ活性はＰＢＳを添加した場合と比して約２０％阻害された（図１１）。このことから、成熟型ニカストリンと結合するこれらの抗体はγ−セクレターゼ阻害活性を有することが考えられる。

【0108】

実施例１２ 抗ニカストリンモノクローナル抗体の各種癌細胞株の生存率に対する影響
まず、Ｎｏｔｃｈシグナル依存的な生存を示す癌細胞株を同定する目的で、ＨｅＬａ細胞およびＡ５４９細胞の生存に対するγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（ＨＦ．Ｄｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７６（２００１）１７３−１８１）の影響をＭＴＴ法により評価した。各細胞５ｘ１０³個を９６ウェルマルチプレートに播種し、終濃度１００μＭのＤＡＰＴにより７２時間処理した。処理時間経過後、ＰＢＳに希釈したＭＴＴを終濃度５００μｇ／ｍＬになるよう添加し、３７℃にて３−４時間培養した。その後ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０％ＳＤＳ，０．０１Ｍ ＨＣｌ）を添加して反応を停止し、さらに３７℃にて一晩静置して生成したｆｏｒｍａｚａｎを溶解させた。ピペッティングにてｆｏｒｍａｚａｎ溶液を均一に混和し、５５０ｎｍの吸光度を測定して細胞生存率を算出した。その結果、ＤＡＰＴ処理によってＡ５４９細胞では未処理群に比して有意に細胞生存率の低下が見られたが、ＨｅＬａ細胞では差が見られなかった（図１２）。さらに、この細胞生存率の低下がγ−セクレターゼ活性の阻害によるものであることを確認するため、Ａ５４９細胞の内因性ニカストリンをニカストリンに対するｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）処理によりノックダウンして、細胞生存率の変化を測定した。その結果、ランダムな配列のｓｉＲＮＡ処理（ｓｃｒａｍｂｌｅ）に比してニカストリンｓｉＲＮＡによる処理では、細胞生存率が約２０％低下した（図１３）。この条件下で内因性ニカストリンの発現は完全に抑制されていた（図１４）。これらの結果から、ＨｅＬａ細胞とは異なり、Ａ５４９細胞の生存にはγ−セクレターゼ活性が必須であることが考えられる。

【0109】

続いて、今回得られた抗体がＡ５４９細胞の生存に与える影響を検討した。各抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加し、９６時間後の細胞生存率をＭＴＴ法により評価した。その結果、Ａ５４９細胞において、ＰＰＭＸ０４１０処理群では未処理群およびＰＰＭＸ０４０１処理群に比して有意に細胞生存率の低下を認めた（図１５）。γ−セクレターゼ阻害活性を有する抗体は、γ−セクレターゼ依存的な生存を示す癌細胞に対して増殖阻害能を有することが示唆される。

【0110】

実施例１３ 各種白血病細胞株の増殖に対する抗ニカストリンモノクローナル抗体の影響
急性Ｔ細胞性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｔ−ＡＬＬ）患者から単離・樹立されたＴＡＬＬ−１、ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＤＮＤ−４１の各細胞は、いずれもその増殖にＮｏｔｃｈシグナリングが必要であることが報告されている（Ｗｅｎｇ， Ａ． Ｐ．， Ｆｅｒｒａｎｄｏ， Ａ． Ａ．， Ｌｅｅ， Ｗ．，Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｐ． ｔ．， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｌ． Ｂ．， Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｉｒｉｚａｒｒｙ， Ｃ．， Ｂｌａｃｋｌｏｗ， Ｓ． Ｃ．，Ｌｏｏｋ， Ａ． Ｔ． ａｎｄ Ａｓｔｅｒ， Ｊ． Ｃ． （２００４）． Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＯＴＣＨ１ ｉｎ ｈｕｍａｎＴ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６， ２６９−２７１．）。さらに、ＴＡＬＬ−１細胞にはＮＯＴＣＨ１遺伝子に体細胞変異は見出されていないが、ＡＬＬ−ＳＩＬ細胞、ＤＮＤ−４１細胞ではＮＯＴＣＨ１の細胞外領域とＴＭＩＣ（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ）の相互作用に関与する領域（ＨＤＮ）にミスセンス変異が存在し、ＮＩＣＤ（Ｎｏｔｃｈ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）の分解に関与するＰＥＳＴ領域が変異によって欠損していることが報告され（図１６）、ＨＤＮ領域の変異によりリガンド非依存的なヘテロ二量体の解離とｓｈｅｄｄｉｎｇ、γ−セクレターゼによる切断が起こることやＰＥＳＴ領域の欠損によってＮＩＣＤの安定性が高まることがＮｏｔｃｈシグナリングの異常亢進を引き起こし、これがＴ−ＡＬＬの原因となると考えられている。
まず、ＴＡＬＬ−１、ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＤＮＤ−４１の各細胞をγ−セクレターゼ阻害剤で処理した場合に、ＮＯＴＣＨ１の代謝がどのような影響を受けるかについて、検討を行った。ＮＯＴＣＨ１の細胞内アンキリンリピート領域に対する抗体ｍＮ１Ａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ ＃ＭＡＢ５３５２）を用いたウェスタンブロット解析において、全ての細胞でＮＯＴＣＨ１ ＴＭＩＣと思われるバンドが確認できた。さらにＡＬＬ−ＳＩＬ、ＤＮＤ−４１においてはやや低い位置にＮＥＸＴ（Ｎｏｔｃｈ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）と思われるバンドと、さらにその下にＮＩＣＤと思われるやや不明瞭なバンドが観察された（図１７）。ＡＬＬ−ＳＩＬおよびＤＮＤ−４１細胞では、恒常的なＮＩＣＤの発現がＮＩＣＤのＮ末端断端特異抗体Ｖａｌ１７４４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ ＃２４２１）により確認されたが、ＴＡＬＬ−１細胞では見られなかった。次に各細胞の培養上清にγ−セクレターゼ阻害剤ＹＯを１０、１００、１０００ｎＭの濃度で添加して、４８時間後に細胞を回収してｌｙｓａｔｅをウェスタンブロット解析したところ、ＡＬＬ−ＳＩＬおよびＤＮＤ−４１細胞ではＹＯ処理によりＮＩＣＤの消失とＴＭＩＣ、ＮＥＸＴの蓄積が観察された（図１７）。このことから、少なくともＡＬＬ−ＳＩＬ、ＤＮＤ−４１細胞の両細胞において恒常的にＮｏｔｃｈシグナリングが活性化していることが示唆された。

【0111】

続いて、ＹＯ処理によりこれらの細胞の増殖がどのような影響を受けるかについて検討した。９６−ｗｅｌｌ プレートに５×１０³ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で細胞をまき、３７℃にて一晩培養後、γ−セクレターゼ阻害剤ＹＯを添加して培養した。７日間培養後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて細胞増殖率を測定した。１／１０量のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを培養液に添加し、３７℃にて４時間培養した後、培養上清を回収した。プレートリーダーにて培養上清中の蛍光（励起光波長：５３０ｎｍ、蛍光波長：５９０ｎｍ）を測定し、細胞増殖率を以下の式により計算した。

【0112】

【数1】

【0113】

ここで、Ａ５９０はサンプルの５９０ｎｍの吸光度を、ＰＣ５９０はポジティブコントロール群（ＰＢＳまたはＤＭＳＯ処理）の５９０ｎｍの吸光度を表す。その結果、ＴＡＬＬ−１およびＤＮＤ−４１細胞においてＹＯ処理によって細胞増殖の抑制が観察され、１０ｎＭ ＹＯではそれぞれ約６０％および５０％、１０００ｎＭにおいてはともに約８０％の抑制が見られた（図１８）。予想に反して、ウェスタンブロット解析でＹＯ処理によるＮＩＣＤ消失が観察されたＡＬＬ−ＳＩＬ細胞では、細胞増殖の抑制はほとんど認められなかった。これら結果から、ＴＡＬＬ−１およびＤＮＤ−４１細胞の増殖はγ−セクレターゼ活性依存的であることが示された。

【0114】

以上の結果から、検討に用いたＴ−ＡＬＬ由来細胞のうち、少なくともＤＮＤ−４１細胞の増殖はＮｏｔｃｈシグナリング／γ−セクレターゼ活性に依存していると考えられた。そこで、ＤＮＤ−４１細胞を用いて抗ニカストリン抗体であるＰＰＭＸ０４１０が細胞増殖に与える影響を検討した。ＤＮＤ−４１細胞の培養上清にＰＰＭＸ０４１０またはマウスＩｇＧ画分を０．１、１、１０、１００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、７日間培養後にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて細胞増殖率を測定した。その結果、ＩｇＧ画分の添加では細胞増殖は濃度依存的にやや増加する傾向があったが、ＰＰＭＸ０４１０の添加では減少傾向が認められ、１００μｇ／ｍＬのＰＰＭＸ０４１０添加によりＤＮＤ−４１細胞の増殖は約６０％抑制された（図１９）。この結果から、ＰＰＭＸ０４１０はＮｏｔｃｈシグナリング／γ−セクレターゼ活性依存的なＴ−ＡＬＬ細胞の増殖を抑制することが示された。

【0115】

この結果を踏まえてＰＰＭＸ０４１０を２００６年４月２１日、〒３０５−８５６６
茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ−Ｐ２０８９５として寄託した（国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８０８として移管）。

【0116】

実施例１４ 抗ニカストリンモノクローナル抗体のニカストリンと基質との結合阻害作用
ニカストリンはγ−セクレターゼ複合体において、基質受容体として機能する可能性が報告されている（Ｓｈａｈ Ｓ，Ｌｅｅ ＳＦ，Ｔａｂｕｃｈｉ Ｋ，Ｈａｏ ＹＨ，Ｙｕ Ｃ，ＬａＰｌａｎｔ Ｑ，Ｂａｌｌ Ｈ，ＤａｎｎＣＥ ３ｒｄ，Ｓｕｄｈｏｆ Ｔ，Ｙｕ Ｇ．：Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ ２００５，１２２：４３５）。
そこで、ＰＰＭＸ０４１０がγ−セクレターゼと基質との相互作用の阻害を介してγ−セクレターゼ阻害活性を発揮する可能性について検討した。

【0117】

まず、Ｓｆ９細胞にニカストリン（カルボキシル末端にＶ５−Ｈｉｓタグ配列を付加）またはＮ１００−ＦＬＡＧ（（Ｎｏｔｃｈ受容体の膜内配列を含む１７１１から１８０９番目までの１００アミノ酸（ＮＨ２−ＭＶＫＳＥＰＶＥＰＰＬＰＳＱＬＨＬＶＹＶＡＡＡＡＦＶＬＬＦＦＶＧＣＧＶＬＬＳＲＫＲＲＲＱＨＧＱＬＷＦＰＥＧＦＫＶＳＥＡＳＫＫＫＲＲＥＰＬＧＥＤＳＶＧＬＫＰＬＫＮＡＳＤＧＡＬＭＤＤＮＱＮＥＷＧＤＥＤＬＥ−ＣＯＯＨ）のカルボキシル末端にＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＳＨＨＨＨＨＨ）を付加）（配列番号１３および１４）、Ｌｅｅ ＳＦ，Ｓｈａｈ Ｓ，Ｌｉ Ｈ，Ｙｕ Ｃ，Ｈａｎ Ｗ，Ｙｕ Ｇ．：Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＡＰＨ−１ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ａｎｄ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｏｔｃｈ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２２７７：４５０１３）を発現させ、実施例９に示した方法に従ってそれぞれの細胞膜画分を調製した。
得られた膜画分を１％ ＣＨＡＰＳＯを含むＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒにて可溶化し、ニカストリン画分およびＮ１００画分を得た。
ニカストリン画分をＰＢＳにて適当な濃度に希釈したＰＰＭＸ０４０１またはＰＰＭＸ０４１０と混合して４℃で終夜反応した後、Ｎ１００画分を添加してさらに３時間転倒混和した。Ｂｕｆｆｅｒは、抗体との混合時には１％ ＣＨＡＰＳＯを含むＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ、Ｎ１００画分を添加後は０．５％ ＣＨＡＰＳＯを含むＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを用いた。
得られたニカストリン・Ｎ１００混合画分から抗Ｖ５抗体を結合したＶ５−アガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ）または抗ＦＬＡＧ抗体を結合したＭ２−アガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ）を用いてニカストリンおよびＮ１００−ＦＬＡＧを共沈降し、沈降画分を抗Ｖ５抗体でウェスタンブロット解析した（図２０）。

【0118】

その結果、予め０．１％ ＳＤＳにより変性させたニカストリン画分を用いた場合には、変性しない場合に比して、Ｍ２−アガロースビーズにより沈降されるニカストリン、すなわちＮ１００−ＦＬＡＧと結合しているニカストリンは減少した（図２０、レーン「Ｄ」と「Ｎ」を比較）。
したがって、本実験系によりニカストリンの構造依存的なＮ１００との結合を検出可能であると考えられた。

【0119】

この条件下で、ＰＰＭＸ０４０１またはＰＰＭＸ０４１０を添加した場合にＭ２−アガロースビーズにより沈降されるニカストリンの量を比較したところ、抗体濃度１０および１００μｇ／ｍＬにおいてＰＰＭＸ０４１０を添加した場合には沈降ニカストリン量の明らかな減少が見られた（図２１）。Ｖ５−アガロースビーズにより沈降されたニカストリン量により規格化したところ、ＰＰＭＸ０４１０はこれらの濃度域においてニカストリンとＮ１００−ＦＬＡＧの結合を約６０％阻害していた（図２１）。

【0120】

これらの結果から、ＰＰＭＸ０４１０はニカストリンと基質との結合を阻害することで、γ−セクレターゼ活性を阻害することが示唆される。すなわち、ニカストリン−基質結合阻害を指標にして、強力なγ−セクレターゼ活性阻害をする抗体の選択方法としての可能性が示された。

【0121】

実施例１５ 抗ニカストリン抗体による生細胞におけるγ−セクレターゼ活性の阻害
ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応系においてγ−セクレターゼ活性を阻害するＰＰＭＸ０４１０が、生細胞においても同様にγ−セクレターゼ活性による切断を抑制するか確認するため、ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムを利用したレポーター細胞を用いた検討を行った。
Ｃ９９はＡＰＰ（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）がＢＡＣＥ（β−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）による切断を受けて産生される断片であり、γ−セクレターゼの直接の基質となる。
Ｃ９９にｐｒｅｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ由来のシグナルペプチド、および膜貫通領域直下に酵母由来の転写因子であるＧＡＬ４を挿入したコンストラクト（ＳＣ１００Ｇ）を作製し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。
また、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞外領域を欠損し、リガンド非依存的にγ−セクレターゼの直接の基質となるＮΔＥ（Ｎ９９を含む）にＧＡＬ４／ＶＰ１６を結合したコンストラクト（ＮΔＥＧＶ、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｋａｒｌｓｔｒｏｍ Ｈ，Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ Ｊ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ Ｔ，Ｏｔａｋａ Ａ，Ｖｅｓｔｌｉｎｇ Ｍ，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ａ，Ｄｏｎｏｖｉｅｌ Ｄ，Ｌｅｎｄａｈｌ Ｕ，Ｈｏｎｊｏ Ｔ．：Ｎｏｔｃｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌｅａｖａｇｅｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｅｘｅｃｕｔｅｄ ｂｙ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ ２００２，９９：４０１４）をｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした（ｐｃＤＮＡ３．１−ＮΔＥＧＶ）。
レポーターコンストラクトとして、ｐＧＬ３（Ｒ２．２）ベクター（ｐｒｏｍｅｇａ）のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの上流にＵＡＳ配列を挿入したコンストラクト（ＵＡＳ−ｌｕｃ）を作製した。さらに、細胞数をモニターするコントロールベクターとして、ｐｃＤＮＡ３（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にｅＧＦＰをサブクローニングした、ｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰを作製した。ＨＥＫ２９３細胞にｐｃＤＮＡ３．１−ＳＣ１００ＧおよびＵＡＳ−ｌｕｃを共に、もしくはｐｃＤＮＡ３．１−ＮΔＥＧＶ、ＵＡＳ−ｌｕｃとｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰを共に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入した。ＨＥＫ／ＳＣ１００Ｇ細胞、ＨＥＫ／ＮΔＥＧＶ細胞にそれぞれＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（和光純薬）またはＧ４１８（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）の抗生物質抵抗性マーカーを用いて恒常発現細胞（それぞれＨＥＫ／ＳＣ１００Ｇ細胞、ＨＥＫ／ＮΔＥＧＶ細胞）を選択した。

【0122】

４８ウェルマルチプレートにＨＥＫ／ＳＣ１００Ｇ細胞またはＨＥＫ／ＮΔＥＧＶ細胞を２．５ｘ１０⁴個播種した。３７℃にて２４時間培養後、ＰＢＳまたはＰＢＳにて適当な濃度に希釈したＰＰＭＸ０４１０を添加した。また、γ−セクレターゼ活性を抑制するコントロールとして、ＤＭＳＯまたはＤＡＰＴ（終濃度１０μＭ）処理した群をおいた。３７℃にて３６時間培養した後、終濃度１０ｍＭのｎ−ｂｕｔｙｌｉｃ ａｃｉｄを添加して導入遺伝子の発現を誘導した。１２時間培養後、細胞および培養上清を回収し、レポーターアッセイおよびＥＬＩＳＡによるＡβの測定を行った。
回収した細胞をｌｙｓｉｓバッファー（ｐｒｏｍｅｇａ）にて溶解し、得られたｌｙｓａｔｅをレポーターアッセイに供した。発光基質としてピッカジーン（東洋インキ）を用いた。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅによる発光量の規格化は、ＨＥＫ／ＳＣ１００Ｇ細胞の場合は蛋白質濃度で、ＨＥＫ／ＮΔＥＧＶ細胞の場合はｅＧＦＰの発光量で行い、得られた値をＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）とした。また、ＨＥＫ／ＳＣ１００Ｇ細胞の培養上清中に分泌されたＡβ量をＥＬＩＳＡにより測定し、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅによる発光量と同様に蛋白質濃度で規格化した。

【0123】

その結果、ＨＥＫ／ＳＣ１００Ｇ細胞におけるレポーター活性（図２２（Ａ））および分泌Ａβ量（図２２（Ｂ））、ＨＥＫ／ＮΔＥＧＶ細胞におけるレポーター活性（図２２（Ｃ））はいずれもＰＰＭＸ０４１０の添加により濃度依存的に阻害された。また、この条件下でγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴは、いずれの活性も阻害した。
これらの結果から、ＰＰＭＸ０４１０は生細胞においてもγ−セクレターゼ活性を阻害し、ＡＰＰおよびＮｏｔｃｈ受容体の膜内タンパク質切断を抑制することが示された。

【0124】

実施例１４に示した方法はＨｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇにも使用可能な方法であることから、強力なγ−セクレターゼ活性阻害を有する抗体の選択方法として利用できると思われる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]