特許 5691240 細胞培養用モジュール

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5691240

(24)【登録日】2015年2月13日

(45)【発行日】2015年4月1日

(54)【発明の名称】細胞培養用モジュール

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20150312BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

【請求項の数】1

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2010-117366(P2010-117366)

(22)【出願日】2010年5月21日

(65)【公開番号】特開2011-239756(P2011-239756A)

(43)【公開日】2011年12月1日

【審査請求日】2013年4月26日

(73)【特許権者】

【識別番号】000006035

【氏名又は名称】三菱レイヨン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108578

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 詔男

(74)【代理人】

【識別番号】100089037

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100094400

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 三義

(74)【代理人】

【識別番号】100107836

【弁理士】

【氏名又は名称】西 和哉

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(72)【発明者】

【氏名】福場 芳則

(72)【発明者】

【氏名】加茂 純

(72)【発明者】

【氏名】山本 康哲

(72)【発明者】

【氏名】松下 ▲琢▼

(72)【発明者】

【氏名】渋谷 望

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０５−１８４３５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０００１００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−３０１７５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１４８４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１４８４９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−０８７０３０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００ − ３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００ − １／３８

Ｃ１２Ｎ ５／００ − ５／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

中空糸膜がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュと、前記中空糸膜メッシュと接する、ナノファイバーの集合体からなるナノファイバー層とを有する細胞培養足場材料が、２枚のカバーの間に液密に配置され、
前記中空糸膜の両端側の部分は前記の２枚のカバーの外側にはみ出しており、
前記カバーにおける前記ナノファイバー層に対応する位置に、培養細胞を注入する細胞注入口と、該細胞注入口以外の開口とが形成され、前記細胞注入口と開口がシートで塞がれている細胞培養用モジュール。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養用モジュールに関する。

【背景技術】

【0002】

従来から、医薬品、化学物質、化粧品等の、人体に影響を及ぼす可能性のある物質については、薬効試験、毒性試験、安全性試験が必要とされ、通常これらの試験には種々の動物を用いた動物実験が行われている。しかし、動物実験は、ヒトと動物種との違いや、動物の個体差を考慮しなければならず、データの信頼性の点から、多くの実験を繰り返す必要があった。そのため、多くの経費や試験時間を要するとともに、試験に供する多数の動物や飼育する場所の確保に手間がかかる等の問題があった。特に、薬物の代謝系がヒトに近いとされているブタのような大型の動物を大量に共試することは、実質的に不可能である。さらに最近では、動物実験においても動物愛護の機運が高まりつつある。そこで、このような問題の解決策として、動物の培養細胞を用いた評価試験法、すなわち動物実験代替法が開発されている。

【0003】

生体外で細胞を効率的に培養するためには、培養細胞に栄養と空気（酸素）を補給する必要がある。その例として、中空糸膜を用いて細胞培養に必要な栄養分や空気（酸素）を供給する手法が提案されている（特許文献１）。この手法では、選択透過性を有する中空糸膜とガス透過性を有する中空糸膜とを用いて、培養液と酸素を細胞培養空間に供給する。これにより細胞培養の効率を高めることができ、有用物質の生産等に好適である。しかしながら、この手法では、培養液体中に細胞が存在するため、培養細胞が組織を形成することが難しく、動物実験代替法には適用することが困難であった。

【0004】

動物細胞、特に付着性動物細胞を高密度で培養する技術としては、半透膜機能を有する中空繊維と繊維状細胞支持体を用いた細胞培養器が示されている（特許文献２）。しかしながら、この細胞培養器は、用いる中空繊維が細胞の産生するタンパク様物質を透過しない半透膜であるため、細胞の代謝物等のモニタリングには好ましくない。また、繊維状細胞支持体が細胞培養容器に固定された状態で中空繊維の間隙に配置されているため、中空繊維から培養細胞への栄養分の補給や、培養細胞からの代謝老廃物の回収の効率が低かった。

【0005】

また、細胞組織体の形成を促進するため、中空糸の内腔または外腔に遠心力を用いて細胞を高密度に充填し、該中空糸を利用して酸素や栄養分の供給、代謝老廃物の除去を行う方法が示されている（特許文献３）。しかしながら、この方法では、充填した細胞と中空糸が直接接しているため、中空糸表面が細胞吸着によって閉塞することにより、酸素や栄養の供給、代謝老廃物の除去が不充分になることがあった。

【0006】

また、多孔質中空糸膜の内腔に細胞を充填し、中空糸外部に栄養分とともに化学物質や薬剤等の被験物質を流し、被験物質の細胞による代謝や代謝速度をモニタリングする試験方法および装置が示されている（特許文献４）。しかしながら、この方法では、充填した細胞と中空糸が直接接しているため、中空糸表面が細胞吸着によって閉塞することで、酸素や栄養の供給、代謝老廃物の除去が不充分となることがあった。

【0007】

その他、培養液を供給する中空糸と、細胞を培養するための不織布等の多孔性担体を有する細胞培養用モジュールが示されている（特許文献５）。しかしながら、この細胞培養用モジュールは、中空糸モジュール内に多孔性担体が配置されているだけであり、必ずしも培養液を供給する中空糸と多孔性担体が近接していない。そのため、細胞分泌物は保持しやすいが、栄養の補給効率が悪く、代謝老廃物の除去は全く不充分であった。

【0008】

近年、生体内組織の繊維状の構造を高度に模倣できる点から、ナノオーダーの繊維径を有するナノファイバーを、細胞培養や組織形成の足場材料として用いることが注目されている（非特許文献１、非特許文献２）。例えば、溶融紡糸によって作製されたナノファイバーを足場材料に用いる方法が示されている（特許文献６）。また、有機系ナノファイバーを溶媒に分散した混合液を利用してナノファイバーのパターンを形成し、さらに細胞培養に有効な機能性薬剤をこのパターンに吸着させることにより、細胞の接着、増殖、分化を制御する方法が示されている（特許文献７）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特許第３０２６５１６号公報

【特許文献2】特開２００２−１１２７６３号公報

【特許文献3】特許第３７２５１４７号公報

【特許文献4】特開２０００−１８９１８９号公報

【特許文献5】特開２００３−１８０３３４号公報

【特許文献6】特開２００６−２５４７２２号公報

【特許文献7】特開２００７−４４１４９号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】高分子，５５，３，１４２（２００６）

【非特許文献2】Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．，１１，１０１（２００５）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

ナノファイバーを用いた足場材料において、培養細胞への栄養と空気（酸素）の供給、および培養細胞からの代謝老廃物の回収を高い効率で行うことができれば、優れた動物実験代替法になると期待される。しかしながら、特許文献６および７の方法では、細胞の成育に必要な栄養や空気（酸素）を補給することが考慮されておらず、細胞を効率的に培養することが困難なことがあった。

【0012】

また、ナノファイバーを用いた足場材料において、中空糸膜を用いても、中空糸膜を介して培養細胞に３種類以上の成分を均一に供給しようとする場合には、中空糸膜の配置が複雑になると考えられる。そのため、３種類以上の成分を供給し、それぞれの条件を逐次制御することは困難であると考えられる。
さらに、従来用いられている細胞培養用モジュールは、用いる細胞培養足場材料を容器中の培養液に浸した状態で使用するものであるため、特に多検体、他条件の同時培養において多くの培養スペースが必要であった。このことから、モジュールをコンパクト化することが望まれていた。

【0013】

そこで本発明では、三次元的な細胞培養が可能で、培養細胞への栄養や空気（酸素）の供給および培養細胞からの代謝老廃物の除去を高い効率で行うことができ、特別な装置を用いなくても簡便に、前記供給や除去を３種以上の条件で、かつそれらの条件を独立に制御して行うことができ、モジュールのコンパクト化が可能な細胞培養用モジュールを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の細胞培養用モジュールは、中空糸膜がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュと、前記中空糸膜メッシュと接する、ナノファイバーの集合体からなるナノファイバー層とを有する細胞培養足場材料が、２枚のカバーの間に液密に配置され、前記カバーにおける前記ナノファイバー層に対応する位置に、培養細胞を注入する細胞注入口と、該細胞注入口以外の開口とが形成され、前記細胞注入口と開口がシートで塞がれているモジュールである。

【発明の効果】

【0015】

本発明の細胞培養用モジュールは、三次元的な細胞培養が可能で、培養細胞への栄養や空気（酸素）の供給および培養細胞からの代謝老廃物の除去を高い効率で行うことができる。また、特別な装置を用いなくても、簡便に、前記供給や除去を３種以上の条件で、かつそれらの条件を独立に制御して行うことができる。また、モジュールをコンパクト化することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の細胞培養用モジュールの一実施形態例を示した図である。（Ａ）平面図、（Ｂ）側面図、（Ｃ）上蓋および下底の分解図。

【図2】本実施形態の細胞培養足場材料の作製に用いる底枠（Ａ）と該底枠に角枠を設けた様子（Ｂ）を示す平面図である。

【図3】本実施形態の細胞培養足場材料を示した図である。（Ａ）平面図、（Ｂ）（Ａ）におけるＡ−Ａ’線での断面図、（Ｃ）（Ａ）におけるＢ−Ｂ’線での断面図。

【図4】本実施形態の細胞培養足場材料を拡大した図である。（Ａ）図３（Ａ）の細胞培養足場材料の一部を拡大した拡大図。（Ｂ）図３（Ｃ）の細胞培養足場材料の一部を拡大した拡大図。

【図5】図３の細胞培養足場材料を作製する様子を示した工程図である。

【図6】（Ａ）図５（Ｃ）の足場材料１０に上枠を設置した様子を示す平面図である。（Ｂ）、（Ｃ）中空糸膜の型枠４０の外側部分を束ねて固定する工程図である。

【図7】実施例１におけるナノファイバー層１５ＡのＳＥＭ写真である。（Ａ）層断面（観察倍率５０００倍）、（Ｂ）層表面（観察倍率１００００倍）。

【図8】実施例１における細胞培養足場材料１０Ａの写真である。

【図9】実施例２におけるナノファイバー層１５ＢのＳＥＭ写真である。（Ａ）層断面（観察倍率２０００倍)、（Ｂ）層表面（観察倍率１００００倍）。

【図10】実施例３の培養における細胞密度の変化を示したグラフである。

【図11】実施例３の培養後の細胞を位相差顕微鏡（観察倍率３２倍）により観察した顕微鏡写真である。

【図12】実施例３の培養後の細胞を位相差顕微鏡（観察倍率５６倍）により観察した顕微鏡写真である。

【図13】比較例１の培養における細胞密度の変化を示したグラフである。

【図14】比較例１の培養後の細胞を位相差顕微鏡（観察倍率５６倍）により観察した顕微鏡写真である。

【図15】比較例１の培養後の細胞を共焦点レーザー顕微鏡（観察倍率２００倍）により観察した顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

［細胞培養用モジュール］
本発明の細胞培養用モジュールは、中空糸膜がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュと、前記中空糸膜メッシュと接する、ナノファイバーの集合体からなるナノファイバー層とを有する細胞培養足場材料が、２枚のカバーの間に液密に配置されている。また、本発明の細胞培養用モジュールは、前記カバーにおける前記ナノファイバー層に対応する位置に、培養細胞を注入する細胞注入口と、該細胞注入口以外の開口とが形成され、前記細胞注入口と開口がシートで塞がれている。以下、本発明の細胞培養用モジュールの実施形態の一例を示して詳細に説明する。

【0018】

本実施形態の細胞培養用モジュール１（以下、「モジュール１」という。）は、図１（Ａ）および図１（Ｂ）に示すように、細胞培養足場材料１０（以下、「足場材料１０」という。）がポッティング樹脂で型枠４０に固定されており、さらに、それらが２枚のカバーである下底２０、上蓋３０により挟まれ、足場材料１０が液密に封入されている。

【0019】

下底２０は、図１（Ｃ）に示すように、板２１、２２の間にシート２３が配置されている。平板２１、２２には、細胞注入口２１ａ、２２ａ、および開口２１ｂ、２２ｂが形成されている。平板２１、２２の形状は、足場材料１０の形状に合わせた形状であればよい。
平板２１、２２としては、足場材料１０を挟んでしっかりと固定するのに適した強度を有するものであればよく、例えば、アクリル板が挙げられる。
シート２３としては、細胞注入口２１ａ、２２ａ、および開口２１ｂ、２２ｂを密封でき、かつ必要に応じて顕微鏡、チューブ等の接続、注射針の刺し込み等が可能なものであればよく、例えば、シリコンゴムからなるシートが挙げられる。

【0020】

細胞注入口２１ａ、２２ａは、培養細胞を注入するための開口である。例えば、細胞注入口２１ａ、２２ａにおいて、シート２３に注射針を刺し込んで、培養細胞を足場材料１０へと注入できる。
細胞注入口２１ａ、２２ａの形状は特に限定されず、穴あけ加工の容易さの点から、円形状が好ましい。
細胞注入口２１ａ、２２ａの大きさは特に限定されず、それぞれが開口２１ｂ、２２ｂと独立して形成され、培養細胞の注入が可能な範囲であればよい。例えば、細胞注入口２１ａ、２２ａの形状が円形状である場合、その直径は５００μｍ以上５ｍｍ以下が好ましい。

【0021】

開口２１ｂ、２２ｂは、細胞注入口２１ａ、２２ａとは独立して形成される開口である。開口２１ｂ、２２ｂは、例えば、チューブの接続による栄養や空気の供給もしくは代謝老廃物の除去、または顕微鏡の接続による培養状態の観察等に使用できる。
開口２１ｂ、２２ｂの形状は特に限定されず、穴あけ加工の容易さの点から、円形状が好ましい。
また、開口２１ｂ、２２ｂの大きさは特に限定されず、それぞれが細胞注入口２１ａ、２２ａと独立して形成される範囲であればよい。例えば、開口２１ｂ、２２ｂの形状が円形状である場合、その直径はモジュール１の大きさにも依るが、１ｍｍ以上でナノファイバー層の短辺を上限とすることが好ましい。

【0022】

上蓋３０は、図１（Ｃ）に示すように、平板３１、３２の間にシート３３が配置されている。平板３１、３２には、細胞注入口３１ａ、３２ａ、および開口３１ｂ、３２ｂが形成されている。
平板３１、３２、シート３３は、平板２１、２２、シート２３と同じものを用いることができる。
細胞注入口２１ａ、２２ａと細胞注入口３１ａ、３２ａの形状および大きさは、同じであっても異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。また、開口２１ｂおよび開口２２ｂと開口３１ｂおよび開口３２ｂの形状および大きさは、同じであっても異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。

【0023】

本実施形態では、足場材料１０はポッティング樹脂により型枠４０に固定されている。足場材料１０がポッティング樹脂で型枠４０に固定されていることにより、該ポッティング樹脂と型枠４０とにより、モジュール１における足場材料１０の側面部分が密封され、足場材料１０がモジュール１内に液密に封入されている。また、型枠４０を用いることで、足場材料１０の作製が容易になる。

【0024】

型枠４０は、図１（Ｂ）および図２（Ａ）、（Ｂ）に示すように、開口４１ａを有する底枠４１と、底枠４１の四隅に設けられた角枠４２と、上枠４４とを有している。
底枠４１および上枠４４の材質としては、ポッティング樹脂との接着性が充分に得られるものであればよく、例えば、シリコンゴム等が挙げられる。
また、角枠４２の材質としては、シリコンゴムが好ましい。角枠４２の材質がシリコンゴムであれば、下底２０と上蓋３０により型枠４０に固定された足場材料１０を挟んだ後、それらをクリップ等で固定する際に、高い圧力が加わってもモジュール１が破損することを抑制しやすい。

【0025】

本発明におけるポッティング樹脂は、充分な接着性を有するものであればよく、例えば、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、シリコン樹脂等の各種の熱硬化性樹脂や熱可塑性樹脂等が挙げられる。

【0026】

本発明における細胞培養足場材料は、図３に例示した足場材料１０であることが好ましい。ただし、これに限定されるものではない。
足場材料１０は、図３（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、中空糸膜１１ａ、１１ｂ（１１）がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュ１２と、ナノファイバーの集合体からなるナノファイバー層１５と、中空糸膜１３ａ、１３ｂ（１３）がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュ１４とが、この順に積層されている。

【0027】

中空糸膜メッシュ１２を形成する中空糸膜１１の膜基材ポリマーは、中空糸膜上に成形できるものであればよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスルフォン、ポリアリルスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、これらの２種類以上を混合した混合物等が挙げられる。

【0028】

中空糸膜１１の外径は、５０〜３０００μｍが好ましく、１００〜２０００μｍがより好ましい。外径が５０μｍ以上であれば、中空糸膜１１において充分な大きさの中空部分を確保しやすいため、培養液を送液する際の差圧が大きくなったり、代謝老廃物の除去が不充分になったりすることを抑制しやすい。また、外径が３０００μｍ以下であれば、単位体積あたりの中空糸膜１１の表面積をより大きくすることができるため、培養細胞に充分な栄養およびガスを供給することが容易になる。

【0029】

中空糸膜１１の膜厚は、５〜５００μｍが好ましい。膜厚が５μｍ以上であれば、栄養供給やガス供給の際の加圧によって中空糸膜が破壊されることを防止しやすい。また、膜厚が５００μｍ以下であれば、ろ過抵抗がより小さくなるため、培養細胞への栄養供給やガス供給や、培養細胞からの代謝老廃物の除去の効率が向上する。
なお、中空糸膜１１が多層膜である場合の膜厚は、各層の膜厚の総和（全層の膜厚）である。
中空糸膜１１の内径は、１０μｍ以上２９９５μｍ以下が好ましい。

【0030】

中空糸膜１１としては、精密ろ過膜、限外ろ過膜、ガス分離膜等を用いることができる。これらは必要に応じて適宜選択することができる。
物質選択透過性を有する中空糸膜を用いることにより、特定の物質を培養細胞に供給したり、特定の代謝老廃物を培養細胞から除去したりすることができる。また、培養液中の特定成分、化学物質、薬物等の被験物質を培養細胞に効率的に供給することや、老廃物や代謝物を系外に排出させてこれらをモニタリングすることが可能となる。
物質選択透過性を有する中空糸膜としては、前記精密ろ過膜や限外ろ過膜を挙げることができ、さらに、膜素材そのものに物質選択透過性を有する中空糸膜や、中空部分に選択透過性を有する物質が充填された多孔質中空糸膜を挙げることができる。

【0031】

また、ガス分離膜を用いることにより、培養細胞に空気、酸素、およびその他のガスを効率的、かつ選択的に供給することができる。ガス供給は多孔質中空糸膜を用いて行ってもよく、この場合、ガス分離機能を有する非多孔性の膜基材を、多孔性の膜基材で支持した中空糸膜が好ましい。このようなガス分離機能を有する中空糸膜を用いることにより、培養液中にバブルレスでガスを供給できるので、培養細胞へのダメージを防止しやすい。また、培養液等の液体が中空糸膜の中空部分に入り込んで該中空部を閉塞することを防止しやすい。

【0032】

また、中空糸膜１１は、親水化処理されていることが好ましい。中空糸膜を親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になり、また中空糸膜表面への細胞接着の抑制も容易になる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば、中空糸膜をエチレン−ビニルアルコール共重合体等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。
また、中空糸膜メッシュ１２には、２種類以上の中空糸膜を用いることもできる。例えば、栄養の供給を行う精密ろ過膜、ガスの供給を行うガス分離膜、培養細胞への特定成分の供給あるいは培養細胞からの特定の代謝老廃物の排出を行う物質選択透過性を有する中空糸膜を、任意に組み合わせて用いることができる。

【0033】

中空糸膜メッシュ１２は、複数の中空糸膜を網目が形成するようにメッシュ状に配置したものである。中空糸膜メッシュ１２の形態としては、例えば、複数の中空糸膜１１ａ（中空糸膜１１）を所定の間隔で平行に配置してシート状とし、それら中空糸膜１１ａに対して直交する方向に沿って複数の中空糸膜１１ｂ（中空糸膜１１）を所定の間隔で平行に配置してシート状とすることにより、メッシュ状とした形態が挙げられる（図３（Ａ））。
中空糸膜１１ａの間隔ｄ_１（図４（Ａ））は、０．０５〜５ｍｍが好ましく、０．０５〜１ｍｍがより好ましい。前記間隔ｄ_１は、中空糸膜１１ａの外径以上で、５ｍｍ以下であれば、栄養やガスの供給や代謝老廃物の除去がナノファイバー層１５に接着した細胞全体に均一に行えるため、細胞培養の効率が向上する。中空糸膜１１ｂの間隔ｄ_２（図４（Ａ））は、同様の理由から、０．０５〜５ｍｍが好ましく、０．０５〜１ｍｍがより好ましい。
中空糸膜メッシュ１２における中空糸膜１１からなるシートの層数は特に制限されず、２〜１０層が好ましい。この例では、シートは２層（中空糸膜１１ａからなる層と中空糸膜１１ｂからなる層）である。

【0034】

２種類以上の中空糸膜で中空糸膜メッシュを形成する場合には、種類の異なる中空糸膜を同一シート内に混在させてもよく、シート毎に種類の異なる中空糸膜を用いるようにしてもよい。すなわち、本実施形態の場合、中空糸膜１１ａとして種類の異なる２種以上の中空糸膜を用い、かつ中空糸膜１１ｂとして種類の異なる２種以上の中空糸膜を用いる態様（１）としてもよく、中空糸膜１１ａとして同一種類の中空糸膜を用い、中空糸膜１１ｂとして中空糸膜１１ａとは異なる種類の同一種類の中空糸膜を用いる態様（２）としてもよく、中空糸膜１１ａまたは中空糸膜１１ｂのいずれか一方に異なる２種以上の中空糸膜を用い、他方に同一種類の中空糸膜を用いる態様（３）としてもよい。中空糸膜メッシュ１２において２種類以上の中空糸膜１１を用いる場合には、同一種類の中空糸膜を集結させてポート部を設け、該ポート部を外部機器に繋いで中空糸膜を介して排出された老廃物等をオンラインで分析することが容易である点から、態様（２）が好ましい。
具体的には、例えば、中空糸膜１１ａとして精密ろ過膜、中空糸膜１１ｂとしてガス分離膜を用いることにより、中空糸膜１１ａにより培養細胞に栄養を供給し、中空糸膜１１ｂにより培養細胞にガスを供給することができる（態様（２））。
中空糸膜メッシュ１２における中空糸膜１１ａ、１１ｂは、メッシュ状となっている部分以外の部分をポッティング樹脂により固定することで、位置を固定することができる。ポッティング樹脂は、前述のポッティング樹脂を用いることができる。

【0035】

本発明における中空糸膜メッシュ１４および中空糸膜１３は、中空糸膜メッシュ１２および中空糸膜１１と同じものを用いることができ、好ましい形態も同じである。
足場材料１０においては、中空糸膜メッシュ１２、１４の形態は、中空糸膜を介する栄養や気体の供給、代謝老廃物の除去に応じて選択すればよく、足場材料１０をモジュール化する際のポート部の設計にも依存する。
足場材料１０では、中空糸膜メッシュ１２の中空糸膜１１ａと中空糸膜メッシュ１４の中空糸膜１３ａは同一種類の中空糸膜であることが好ましい。同様に、中空糸膜メッシュ１２の中空糸膜１１ｂと中空糸膜メッシュ１４の中空糸膜１３ｂは同一種類の中空糸膜であることが好ましい。このような形態とすることで、足場材料１０をモジュール化する際に、中空糸膜１１ａおよび中空糸膜１３ａと、中空糸膜１１ｂおよび中空糸膜１３ｂとをそれぞれ集結させて同一のポート部に繋ぐことで、中空糸膜を介して排出された老廃物等をオンラインで分析しながら細胞培養を行うことが容易になる。

【0036】

本実施形態の足場材料１０では、図３（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、中空糸膜メッシュ１２と中空糸膜メッシュ１４における互いに平行な中空糸膜１１、１３が、それぞれ１／２ピッチずつ、ずれて配置されるようにすることが好ましい。これにより、足場材料１０において中空糸膜を、ナノファイバー層１５に対してより高い密度で均一に配列させることができるため、細胞培養の効率が向上する。
中空糸膜メッシュ１２と中空糸膜メッシュ１４における中空糸膜１１bと中空糸膜１３bの間隔ｄ_３（図４（Ｂ））は、０．５〜１０００μmが好ましく、１．０〜５０μmがより好ましい。前記間隔ｄ_３が０．５μm以上１０００μm以下であれば、栄養やガスの供給や代謝老廃物の除去がナノファイバー層１５に接着した細胞全体に均一に行えるため、細胞培養の効率が向上する。

【0037】

本実施形態のナノファイバー層１５は、ナノファイバーの集合体からなる層である。
ナノファイバー層１５は、基材上で、エレクトロスピニング（電界紡糸）により形成されたものであることが好ましい。前記基材は、特に制限されず、エレクトロスピニングにより表面にナノファイバー層１５を形成できるものであればよく、例えば、アルミ箔等が挙げられる。

【0038】

ナノファイバーの材質は、紡糸が容易である点から、溶剤可溶性のポリマーであることが好ましい。特にエレクトロスピニングが可能な溶剤可溶性のポリマーとしては、例えば、ナイロン４，６、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１２、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルイミド、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリスルフォン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、シルク、酢酸セルロース、キトサン、コラーゲン等が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではなく、これらのポリマーの混合物や、無機物や炭素材料を含有させたものであってもよい。

【0039】

また、前記ポリマーの分子量は特に限定されないが、分子量が低すぎると曳糸性が低下するおそれがあり、分子量が高すぎると粘度が高くなって紡糸が困難になるおそれがある。
また、溶剤に不溶なポリマーであっても、レーザーエレクトロスピニング法を適用する場合は熱可塑性ポリマーを用いることができる。レーザーエレクトロスピニング法に適用できる熱可塑性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレートが挙げられる。

【0040】

ナノファイバー（単繊維）の直径は１ｎｍ〜１０００ｎｍが好ましく、１０ｎｍ〜５００ｎｍがより好ましく、２０ｎｍ〜３００ｎｍがさらに好ましい。前記直径が１ｎｍ以上であれば、充分な強度を有するナノファイバーとなりやすい。また、前記直径が１０００ｎｍ以下であれば、充分な比表面積を有するナノファイバーとなりやすい。ナノファイバーの特徴の一つは比表面積の大きさであり、単繊維の直径が小さくなるほど比表面積が指数関数的に大きくなり、吸着特性が大きくなるため、細胞培養の足場材料として好適である。
ナノファイバーの単繊維の直径は、以下のようにして測定することができる。ナノファイバー、またはその集合体（ナノファイバー層１５）の表面を電子顕微鏡により観察し、得られた電子顕微鏡写真（図９（Ｂ））中の任意の２０本のナノファイバー表面の幅を計測し、その平均をナノファイバーの単繊維の直径とする。電子顕微鏡としては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）が好ましい。観察倍率は５０００倍〜５万倍が好ましい。観察倍率が５０００倍以上であれば、ナノファイバーの直径の決定が容易になる。また、単繊維の直径を求める際には、画像解析ソフトを用いることが好ましい。画像解析ソフトによって得られるナノファイバーの単繊維の直径は、画像解析のための画質調整、画像解析ソフトの種類等によって若干変動があるが、その差は通常の実験誤差の範囲内である。

【0041】

ナノファイバー層１５の厚みは、０．５〜１００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましい。厚みが０．５μｍ以上であれば、ナノファイバー層１５を中空糸膜メッシュ間に配置するのが容易になる。厚みが１００μｍ以下であれば、栄養やガスの供給や代謝老廃物の除去がナノファイバー層１５に接着した細胞全体に均一に行えるため、細胞培養の効率が向上する。

【0042】

本実施形態では、ナノファイバー層１５に生理活性物質を吸着または固定させることにより、培養細胞の接着、増殖、分化、機能発現の制御を行うことができる。
生理活性物質としては、機能性ポリマー、アミノ酸、タンパク質、糖鎖、ビタミン類等
が挙げられる。特に、細胞培養に有効な生理活性物質、例えば培養細胞の増殖、分化、機能発現に重要な役割を有する生理活性物質の総称であるサイトカインを用いると効果的である。サイトカインとしては、インターロイキン、増血因子、増殖因子等が挙げられる。また、細胞−細胞外マトリックス、細胞−細胞間の接着に関与するインテグリン、カドヘリン等の細胞接着基質を用いることも効果的である。また、薬剤や化学物質等の被験物質をナノファイバー層１５に吸着または固定することにより、細胞培養試験を行うことも可能である。

【0043】

本実施形態の足場材料１０は、以上説明した中空糸膜メッシュ１２と中空糸膜メッシュ１４との間に、ナノファイバー層１５が配置された積層体を有する。このように、ナノファイバー層を中空糸膜メッシュ間に配置することにより、ナノファイバーを中空糸膜メッシュに強固に固定することができ、培養細胞への栄養やガスの供給や、細胞培養からの代謝老廃物の除去をより安定して行うことができる。
また、中空糸膜メッシュ上にナノファイバー層を形成して該ナノファイバー層上に培養細胞を接着させる場合に比べ、ナノファイバー層を中空糸膜メッシュ間に配置することで、ナノファイバー層に接着させた培養細胞と中空糸膜との距離が近くなるため、培養細胞への栄養やガスの供給や、細胞培養からの代謝老廃物の除去をより高い効率で行うことができ、培養細胞のネクローシスが減少して細胞培養の効率が向上する。

【0044】

本発明における細胞培養足場材料は、中空糸膜メッシュとナノファイバー層の積層数は特に限定されず、中空糸膜メッシュ、ナノファイバー層、中空糸膜メッシュ、ナノファイバー層、中空糸膜メッシュがこの順に積層された細胞培養足場材料であってもよく、これ以上の数が積層された細胞培養足場材料であってもよい。
また、中空糸膜メッシュのメッシュ部分の形態も足場材料１０における中空糸膜１１ａ（１３ａ）と中空糸膜１１ｂ（１３ｂ）とが直交する形態には限定されない。例えば、ナノファイバー層に接着させた培養細胞に対する、栄養やガスの供給や代謝老廃物の排出の効率が低くなりすぎない範囲であれば、中空糸膜１１ａ（１３ａ）と中空糸膜１１ｂ（１３ｂ）とが直交していなくてもよい。また、縦方向と、該縦方向となす角がα（０°＜α＜９０°）、β（−９０°＜β＜０°）の斜め２方向（例えば縦方向に対して±６０°の２方向）との３方向に、中空糸膜をそれぞれ平行に配置してメッシュ状とした中空糸膜メッシュであってもよい。この場合、ナノファイバー層の形状もそれに合わせて六角形にすることが好ましい。また、該足場材料を固定する型枠についても、六角形のものを用いることが好ましい。

【0045】

以下、本実施形態における型枠４０に固定された足場材料１０の形態について説明する。
底枠４１の枠部分４３に、中空糸膜１３ａが一定の間隔で配置され、さらに中空糸膜１３ａと直交する方向に沿って中空糸膜１３ｂが配置され、中空糸膜メッシュ１４が形成されている（図５（Ａ））。また、中空糸膜メッシュ１４の上に、ナノファイバー層１５が配置され、ポッティング樹脂により該ナノファイバー層１５の四隅が角枠４２に固定されている（図５（Ｂ））。

【0046】

また、ナノファイバー層１５の上に、中空糸膜１１ｂが配置され、さらに中空糸膜１１ｂと直交する方向に沿って中空糸膜１１ａが配置されて中空糸膜メッシュ１２が形成され（図５（Ｃ））、これら中空糸膜１１ｂ、１１ａと、先に配置した中空糸膜１３ａ、１３ｂがポッティング樹脂で底枠４１に固定される。中空糸膜メッシュ１２上には、上枠４４がポッティング樹脂で固定されている（図６（Ａ））。

【0047】

足場材料１０は、ポート部を設けるのが容易になることから、同一のポート部に接続する中空糸膜同士の型枠４０の外側の部分が、束ねて固定されていることが好ましい。例えば、中空糸膜の型枠４０よりも外側の部分を束ねてシリコンチューブ５０に通して結び、シリコンチューブ５０内にポッティング樹脂を充填して固定する（図６（Ｂ））。その後、型枠４０からシリコンチューブ５０までの中空糸膜部分をポッティング樹脂で覆って固定し、シリコンチューブ５０よりも先の部分を切断して除去する（図６（Ｃ））。

【0048】

本発明のモジュール１は、下底２０の開口２１ｂ、２２ｂと、上蓋３０の開口３１ｂ、３２ｂに、例えばチューブ等を接続することにより、栄養やガスの供給や、代謝老廃物の除去の行う経路として、中空糸膜メッシュ１２、１４の中空糸膜１１、１３以外の第３の経路を設けることができる。そのため、中空糸膜のみを用いて栄養やガスを供給したり、代謝老廃物を除去したりする場合に比べて、より多くの条件でかつそれらの条件を独立に制御しながらの細胞培養を、より簡便に行うことができる。また、下底２０の細胞注入口２１ａ、２２ａと、上蓋３０の細胞注入口３１ａ、３２ａにより、前記開口にチューブや顕微鏡等が接続された状態でも、の足場材料１０のナノファイバー層２０に容易に培養細胞を注入して接着できる。また、モジュール１は、下底２０と上蓋３０（カバー）を用いて足場材料１を液密に封入するため、足場材料１０を容器中の培養液中に浸漬させるような形態に比べ、モジュールをコンパクト化することができる。

【0049】

モジュール１の使用方法としては、例えば、以下に示す使用方法が挙げられる。
モジュール１において、中空糸膜メッシュの中空糸膜の両端を集結させたものの開口部をポート部に繋げ、中空糸膜から排出された老廃物や代謝物等を外部機器に導入することで、オンラインでの分析が可能になる。
例えば、モジュール１において、中空糸膜１１ａ、１３ａとしてガス分離膜である中空糸膜、中空糸膜１１ｂ、１３ｂとして物質選択透過性を有する中空糸膜を用いた場合、中空糸膜１１ａ、１３ａの片端より酸素を含むガスを供給しつつ、他方の端部より該ガスを排出させ、かつ中空糸膜１１ｂ、１３ｂの片端より培養細胞の栄養を供給し、他方の端部より該培養細胞の老廃物や代謝物を排出させることができる。これにより、排出される成分をオンラインで分析することで、培養細胞を培養しながら連続的に培養細胞の生育状況を評価することも可能である。また、下底２０の開口２１ｂ、２２ｂと、上蓋３０の開口３１ｂ、３１ｂに、チューブ等を接続し、該チューブから培養細胞に対して、中空糸膜１１ａ、１３ａとは別の成分、条件の栄養を供給することもできる。

【0050】

また、モジュール１中で培養した培養細胞に、中空糸膜１１ｂ、１３ｂの片端より被験物質を投与し、老廃物や代謝物を含む溶液を中空糸膜１１ｂ、１３ｂの他方の端部より排出させ、この溶液を分析しモニタリングすることによって、被験物質を投与した場合の培養細胞が受けるストレスや培養細胞の状態を経時的に評価することができる。この場合についても、被験物質の投与、および老廃物や代謝物を含む溶液の排出を、下底２０の開口２１ｂ、２２ｂおよび上蓋３０の開口３１ｂ、３２ｂに接続したチューブ等によって行ってもよい。

【0051】

以上説明した本発明の細胞培養用モジュールは、２枚のカバー（下底２０、上蓋３０）の間に細胞培養足場材料を配置し、液密に封入することで、培養領域を一定の領域に分画しているため、培養条件の制御が容易である。また、細胞培養足場材料を容器中の培養液に浸漬させるような形態のモジュールに比べ、モジュールをコンパクト化することができるため、複数のモジュールを並べて多検体、多条件の同時培養を行う場合でも培養スペースをより小さくすることができる。

【0052】

また、本発明の細胞培養用モジュールのカバーは、細胞注入口と該細胞注入口以外の開口を有し、それら細胞注入口と開口がシートで塞がれた形態である。そのため、カバーの開口にチューブ等を接続することにより、中空糸膜メッシュの中空糸膜以外の新たな経路を設けることができる。これにより培養細胞への経路が増えるため、より簡便な手法で、栄養やガスの供給や、代謝老廃物の除去の条件を多くでき、かつそれらの条件を独立に制御した細胞培養を行うことができる。また、培養細胞を注入する細胞注入口を独立して設けているため、モジュールの製造後に前記開口にチューブや顕微鏡等が接続された状態でも、モジュール内の細胞培養足場材料に容易に培養細胞を注入して接着できる。

【0053】

また、細胞培養ディッシュやプレートを用いた通常の培養では、細胞培養ディッシュやプレート上での平面的な細胞培養しか行えないのに対し、本発明の細胞培養用モジュールは、ナノファイバー層を有する細胞培養足場材料を備えているため、培養細胞が該ナノファイバー層の内部にまで入り込んで三次元的に付着増殖できる。そのため、培養された細胞形態が生体内の形態に近く、医薬品、化学物質、化粧品等の物質の薬効試験、毒性試験、安全性試験等において、より評価の信頼性の高い培養細胞が得られる。

【0054】

尚、本発明の細胞培養用モジュールは、図１に例示したモジュール１には限定されない。例えば、細胞培養足場材料を液密に封入できれば、前述の型枠を用いずにモジュールを形成してもよい。
また、細胞培養用モジュールにおける細胞培養足場材料も前述の足場材料１０には限定されず、中空糸膜メッシュ上にナノファイバー層が形成された細胞培養足場材料であってもよく、中空糸膜メッシュの中空糸膜間にナノファイバーを有する細胞培養足場材料であってもよい。また、エレクトロスピニング以外の湿式紡糸、溶融紡糸等の方法を用いてナノファイバー層を形成した細胞培養足場材料であってもよい。

【0055】

［製造方法］
以下、本発明の細胞培養用モジュール製造方法の一例として、前述の足場材料１０を有するモジュール１の製造方法について説明する。
ナノファイバー層１５は、均一で斑のないナノファイバー層が得られやすく、製造効率が高い点から、前述の表面に凹凸のない基材上で、エレクトロスピニング（電界紡糸）により形成することが好ましい。ただし、エレクトロスピニングには限定されず、湿式紡糸、溶融紡糸等の方法を用いてもよい。

【0056】

以下、エレクトロスピニング法を用いたナノファイバー層１５の製造について簡単に説明する。エレクトロスピニング法の基本的な装置構成は、ノズル、ターゲット、直流高圧電源からなる。この装置において、ノズルに紡糸原液を供給しつつ高電圧を印加すると、紡糸原液に電気的反発力が生じる。このとき、ノズルとターゲットの間に基材を設置しておくことで、紡糸原液がターゲットに向かって噴射され、紡糸条件が適当な場合に基材上にナノオーダーの繊維からなる層、すなわちナノファイバー層を得ることができる。

【0057】

ナノファイバー層１５を得るための紡糸条件は、ナノファイバーを形成するポリマーの分子量、溶媒、溶液の濃度、印加電圧、ノズルとターゲットとの距離等であり、これらを適宜調節することにより所望のナノファイバー層を得ることができる。
ポリマーは、エレクトロスピニングが容易である点から、前述の溶剤可溶性のポリマーを用いることが好ましい。また、熱可塑性ポリマーを用いる場合は、レーザーエレクトロスピニング法を適用することも可能である。
用いるポリマーの分子量は特に限定されないが、分子量が低すぎると曳糸性が低下するおそれがあり、分子量が高すぎると粘度が高くなって紡糸が困難になるおそれがある。
また、ポリマーの溶解性が低い場合であっても、ポリマー濃度を低く調節することによりエレクトロスピニングを可能にすることもできる。また、添加剤を加える等して、紡糸原液の表面張力や導電性を調整することも可能である。

【0058】

紡糸原液のポリマー濃度は、使用するポリマーの種類や分子量、溶媒により異なるため、一概には言えないが、０．１〜４０ｗｔ％に調整することが好ましい。ポリマー濃度が０．１ｗｔ％以上であれば、生産性により優れ、ナノファイバー層１５が得られやすい。また、ポリマー濃度が４０ｗｔ％以下であれば、紡糸原液の粘度が上昇しすぎてノズルから噴射しにくくなることを防ぎやすい。

【0059】

用いる溶媒は、前記濃度でポリマーを溶解させることができれば特に限定されず、例えば、アセトン、トリアセチン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の溶剤を用いることができる。溶媒は、溶媒が揮発してノズルの先端にポリマーが詰まることを抑制しやすい点から、揮発性の高い溶媒を用いることが好ましい。また、溶媒は、ポリマー
の溶解性の向上等のために、複数の溶媒をブレンドして用いてもよい。

【0060】

印加する電圧は、用いるポリマーの種類や物性により異なるため一概には言えないが、０．１〜５０ｋＶが好ましく、１ｋＶ〜４０ｋＶがより好ましい。電圧が０．１ｋＶ以上であれば、ナノファイバー層の製造効率が向上する。また、電圧が４０ｋＶ以下であれば、ノズルとターゲットの間で短絡しにくくなる。
ノズルとターゲットの距離は、用いるポリマーの種類や物性や印加電圧により異なるため一概には言えないが、１０〜１０００ｍｍが好ましく、３０ｍｍ〜５００ｍｍがより好ましい。前記距離が１０ｍｍ以上であれば、放電が生じにくくなる。また、前記距離が１０００ｍｍ以下であれば、ノズルからの紡糸原液の噴射性が向上する。
また、ターゲットの形状は、均一なナノファイバー層１５が得られやすい点から、平板状、ロール状が好ましい。
以上説明した方法によりナノファイバー層１５が得られる。

【0061】

次に、中央に開口４１ａを有する底枠４１（図２（Ａ））の四隅に、角枠４２をポッティング樹脂により固定する（図２（Ｂ））。その後、底枠４１に、中空糸膜１３ａを配置し、さらに中空糸膜１３ａと直交する方向に沿って中空糸膜１３ｂを配置し、底枠４１外にある中空糸膜の端部を仮固定して中空糸膜メッシュ１４を形成する（図５（Ａ））。
次いで、形成した中空糸膜メッシュ１４の上に、ナノファイバー層１５を設置し、ポッティング樹脂により該ナノファイバー層１５の四隅を角枠４２に固定する（図５（Ｂ））。

【0062】

次いで、ナノファイバー層１５の上に、中空糸膜１１ｂを配置し、さらに中空糸膜１１ｂと直交する方向に沿って中空糸膜１１ａを配置して中空糸膜メッシュ１２を形成し（図５（Ｃ））、これら中空糸膜１１ｂ、１１ａと、先に配置した中空糸膜１３ａ、１３ｂを角枠４２間の枠部分４３でポッティング樹脂により固定する。
中空糸膜メッシュ１２の上側には、上枠４４をポッティング樹脂で固定し、足場材料１０が型枠４０に固定された状態とする（図６（Ａ））。

【0063】

次に、中空糸膜の型枠４０よりも外側の部分を束ねてシリコンチューブ５０に通して結び、該チューブ内にポッティング樹脂を充填して固定する（図６（Ｂ））。その後、型枠４０の外側の中空糸膜部分をポッティング樹脂で覆って固定し、結び目を切断する（図６（Ｃ））。

【0064】

次いで、型枠４０に足場材料１０が固定されたものを、下底２０と上蓋３０で挟み、それらをクリップ等で固定する。ただし、足場材料１０を下底２０と上蓋３０で挟んだものの固定方法は、前記クリップ等を用いる方法には限定されず、これらをしっかりと固定できる方法であれば特に限定されない。
また、ナノファイバー層１５への培養細胞の接着は、型枠４０で固定した足場材料１０を下底２０と上蓋３０で挟んで固定した後、細胞注入口のシートに注射器の針を刺し込んで注入する等して行うことができる。細胞注入口から培養細胞を注入すれば、下底２０と上蓋３０の開口の形状、該開口へのチューブ、顕微鏡等の接続状況に関わらず培養細胞の接着が可能である。また、下底２０または上蓋３０の一方の細胞注入口から培養細胞を注入する際、他方の細胞注入口や開口を利用して、細胞注入による与圧を調整することも可能である。なお、ナノファイバー層１５への培養細胞の接着は、細胞注入口から培養細胞を注入する方法には限定されず、下底２０と上蓋３０で挟んで固定する前に行ってもよく、チューブ等を接続する前に下底２０または上蓋３０の開口から注射器等により行ってもよい。
以上の方法により、足場材料１０が液密に封入されたモジュール１が得られる。

【実施例】

【0065】

以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例におけるナノファイバーの直径の測定方法は以下の通りである。
［ナノファイバー層の観察］
ナノファイバー層の観察には、日本電子（株）製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ−６０６０Ａを用いた。

【0066】

［ナノファイバーの単繊維の直径］
ナノファイバーの単繊維の直径は、得られたＳＥＭ写真を画像解析ソフト（（株）プラネトロン製、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．４．５．０．２４）を用いて画像解析することによって求めた。ＳＥＭ写真のスケールに対して、画像解析のスケールが合うように調整した後、ＳＥＭ写真中の任意の２０本のナノファイバーの表面の幅を求め、その平均値をナノファイバーの単繊維の直径とした。

【0067】

［実施例１］
ナノファイバー層の形成は、カトーテック製のＮＥＵナノファイバーエレクトロスピニングユニットを用いた。前記エレクトロスピニングユニットのドラム型のターゲットにアルミ箔を固定した。ナノファイバーを形成するポリマーとして、質量平均分子量（Ｍｗ）が約３５００００、アクリロニトリル含量が約９７％のポリアクリロニトリル系重合体を用いた。このポリアクリロニトリル系重合体をジメチルアセトアミドに１０ｗｔ％になるように溶解して紡糸原液とした。この紡糸原液を１８Ｇのノズル（ニードル）が取り付けられたシリンジ内に充填し、エレクトロスピニングを行ってアルミ箔上にナノファイバー層１５Ａを作製した。紡糸条件は、ターゲットである金属ドラムの周速度を１ｍ／ｍｉｎ、印加電圧を１２ｋＶ、ノズル先端とターゲットの距離を１００ｍｍとし、紡糸時間を６０分とした。
ナノファイバー層１５ＡのＳＥＭ写真を図７（Ａ）、（Ｂ）に示す。ナノファイバー層１５の厚みは約５μｍであった。また、ナノファイバーの直径は、約２００ｎｍであった。

【0068】

中空糸膜として、親水化された多孔質中空糸膜（三菱レイヨンエンジニアリング製、ＥＸ２７０ＦＳ）（中空糸膜１１ａ、１３ａ）と、ガス分離機能を有する三層複合中空糸膜（三菱レイヨンエンジニアリング製、ＭＨＦ２００ＴＬ）（中空糸膜１１ｂ、１３ｂ）を用いた。
底枠４１（縦３５ｍｍ×横３５ｍｍ、枠部分の幅１０ｍｍ）に、中空糸膜１３ａを２ｍｍ間隔で配置し、次いで該中空糸膜１３ａに対して直交する方向に沿って中空糸膜１３ｂを２ｍｍ間隔で配置した。この際、中空糸膜１３ａと中空糸膜１３ｂで構成されるメッシュ部分は約１５ｍｍ×１５ｍｍになるように配置し、底枠外の中空糸膜の端部を仮止めして中空糸膜メッシュ１４を形成した（図５（Ａ））。

【0069】

次いで、中空糸膜メッシュ１４上に、アルミ箔から剥離したナノファイバー層１５Ａを設置し、ポッティング樹脂（日本ポリウレタン工業（株）のコロネート（登録商標）４４０３とニッポラン（登録商標）４２２３を１／１（ｗｔ比）で調合したもの）により、ナノファイバー層１５Ａの四隅を角枠４２に固定した（図５（Ｂ））。さらにナノファイバー層１５Ａ上に、中空糸膜１１ｂを２ｍｍ間隔で配置し、次いで該中空糸膜１１ｂに対して直交する方向に沿って中空糸膜１１ａを２ｍｍ間隔で配置した。中空糸膜１１ａおよび中空糸膜１１ｂはそれぞれ、隣り合う中空糸膜１３ａ、１３ｂの中間に位置するように、すなわち１／２ピッチずつずれるように設置して、中空糸膜メッシュ１２を形成した（図５（Ｃ））。これら中空糸膜１１ｂ、中空糸膜１１ａと、先に配置した中空糸膜１３ａと中空糸膜１３ｂをポッティング樹脂により枠部分４３で固定した。その後、中空糸膜メッシュ１０上に上枠４４を設置し、ポッティング樹脂で固定し、型枠４０に固定された細胞培養足場材料１０Ａを得た（図６（Ａ））。

【0070】

次いで、中空糸膜メッシュ１２、１４における中空糸膜１１ａおよび１３ａと、中空糸膜１１ｂおよび１３ｂとをそれぞれ束ねて、シリコンチューブ５０（長さ１０ｍｍ）に通して結び、該シリコンチューブ５０内にポッティング樹脂を充填して固定した後、型枠４０の外側の中空糸膜部分をポッティング樹脂で覆って固定し、シリコンチューブ５０よりも先の部分を切断して除去した。
この型枠４０に固定された細胞培養足場材料１０Ａの写真を図８に示す。

【0071】

次いで、型枠４０に固定された細胞培養足場材料１０Ａを、細胞注入口および開口を有する２枚のアクリル板間にシリコンゴムからなるシートを配置した下底２０と、下底２０と同様に細胞注入口および開口を有する２枚のアクリル板間にシリコンゴムからなるシートを配置した上蓋３０とで挟んで固定することで細胞培養用モジュール１Ａを得た。

【0072】

［実施例２］
ナノファイバー層の作製において紡糸時間を１２０分に変更した以外は、実施例１と同様にしてナノファイバー層１５Ｂを形成し、細胞培養足場材料１Ｂを形成した。
ナノファイバー層１５ＢのＳＥＭ写真を図９（Ａ）、（Ｂ）に示す。ナノファイバー層１５Ｂの厚みは約１０μｍであった。また、ナノファイバーの直径は、約２００ｎｍであった。

【0073】

本発明の細胞培養用モジュールは、モジュールがコンパクトであった。そのため、多検体、多条件の同時培養においても培養スペースをより小さくできる。また、中空糸膜を介して栄養やガスの供給および代謝老廃物の除去を行うため、高い効率で細胞培養を行うことができる。また、下底、上蓋（カバー）の開口にチューブ等を接続することで、特別な装置を用いなくても、栄養やガスの供給や老廃物の除去を３種以上の条件で、かつそれらの条件を独立に制御して行うことが容易である。さらに、細胞注入口から培養細胞を注入することで、開口にチューブや顕微鏡等が接続されている状態でも、ナノファイバー層への培養細胞の接着が容易に行える。

【0074】

＜細胞培養＞
以下、本発明の細胞培養用モジュールを用いた細胞培養について説明する。
［実施例３］
実施例１で製造した細胞培養用モジュール１Ａを用いて、ヒト胎児肝細胞（Ｈｃ細胞、大日本住友製薬社製）の培養を３２日間行った。該培養は、中空糸膜１１ａ、３１ａを含む培地循環回路を形成し、該回路を用いて細胞培養用モジュール１００Ａ内にＣＳ−Ｃ培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を６．８ｍＬ／ｈｒで連続的に供給しながら行った。供給する前記ＣＳ−Ｃ培地の交換時期は、培地のｐＨ（ｐＨ指示薬）とグルコース濃度（測定試薬：グルコースＣII−テストワコー、和光純薬工業社製）の測定結果から判断し、培養開始から１５、２５、２７、２９、および３１日目にそれぞれ新しい培地に交換した。また、培養開始から１９日目からは、エアポンプにより中空糸膜１１ｂ、３１ｂから細胞培養用モジュール１００Ａに空気を供給（約１Ｌ／ｍｉｎ）しつつ培養を行った。
３２日間の培養における細胞密度の変化を図１０に示す。細胞密度は、培地中のグルコース濃度の減少度合いから算出した。図１０中の破線は、空気の供給の開始時点を示す。また、培養後の細胞用足場材料における細胞形態を位相差倒立顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ−ＴＥ３００、Ｎｉｋｏｎ社製）により観察した顕微鏡写真を図１１（観察倍率３２倍）および図１２（観察倍率５６倍）に示す。なお、図１１および図１２における（Ａ）および（Ｂ）は、同一の細胞培養足場材料におけるそれぞれ別の部分を観察した写真である。

【0075】

［比較例１］
実施例３の培養との比較対象として、細胞培養足場材料１Ａを用いた静置培養を行った。
実施例１で製造した細胞培養足場材料１Ａを、３５ｍｍ培養ディッシュ内のＣＳ−Ｃ培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）中に入れ、ヒト胎児肝細胞（Ｈｃ細胞、大日本住友製薬社製）を２２日間、静置培養した。該培養は、細胞培養足場材料１Ａ内部への物質移動を良好にするために、ディッシュを振盪しながら行った。前記ＣＳ−Ｃ培地の交換時期は、培地のｐＨ（ｐＨ指示薬）とグルコース濃度（測定試薬：グルコースＣII−テストワコー、和光純薬工業社製）の測定結果から判断し、６日目までは２日間隔、７〜１０日目は１日間隔、１１〜１４日目は１８時間間隔、１５〜２３日目は１２時間間隔で交換した。
３１日間の静置培養における細胞密度の変化を図１３に示す。細胞密度は、培地中のグルコース濃度の減少度合いから算出した。また、２２日間の培養後の細胞用足場材料における細胞形態を位相差倒立顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ−ＴＥ３００、Ｎｉｋｏｎ社製）により観察した顕微鏡写真を図１４（観察倍率５６倍）に示す。また、２２日後の細胞用足場材料上の細胞をホルマリンで固定した後、細胞骨格と核を染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した顕微鏡写真を図１５（観察倍率２００倍）に示す。なお、図１４および図１５における（Ａ）および（Ｂ）は、同一の細胞用足場材料におけるそれぞれ別の部分を観察した写真である。また、図１５においては、左上が細胞骨格を観察した写真、右上が核を観察した写真、左下が細胞用足場材料を観察した写真、右下が細胞骨格および核を観察した写真である。

【0076】

図１０に示すように、本発明の細胞培養用モジュールを用いた実施例３の培養では、ＣＳ−Ｃ培地と空気を連続的に供給したことで、細胞密度の最大値が１．２×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^３（培養開始後３２日目に到達）と高密度になった。一方、図１３に示すように、比較例１の培養ディッシュによる静置培養では、細胞密度の最大値が１．９×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^３（培養開始後２０日目に到達）となった。このように、本発明の細胞培養用モジュールを用いて培地や空気を連続的に供給しながら行う培養は、静置培養と比較して約６倍の細胞密度が得られ、優れた細胞増殖促進能を示した。

【0077】

また、共焦点レーザー顕微鏡により、静置培養した細胞培養足場材料における細胞の核を観察した写真（図１５、右上）においては、核が重なって観察された。この結果から、静置培養における細胞培養足場材料に付着増殖した細胞は、ナノファイバー層の内部のファイバー間にまで入り込んで三次元的に増殖していることがわかった。一方、図１１、１３および図１４に示すように、実施例３の培養および比較例１の静置培養のいずれの培養においても、細胞は細胞培養足場材料のナノファイバー層に同様に付着増殖していることが確認された。実施例３の培養と比較例１の静置培養における細胞培養足場材料は同じであり、実施例３の培養においても、細胞培養足場材料において、細胞は三次元的に増殖していると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0078】

本発明によれば、医薬品、化学物質、化粧品等の物質の薬効試験、毒性試験、安全性試験を、容易かつ迅速に行うことができる。

【符号の説明】

【0079】

１ 細胞培養用モジュール １０ 細胞培養足場材料 １１、１１ａ、１１ｂ 中空糸膜 １２ 中空糸膜メッシュ １３、１３ａ、１３ｂ 中空糸膜 １４ 中空糸膜メッシュ １５ ナノファイバー層 ２０ 下底（カバー） ２１ａ、２２ａ 細胞注入口 ２１ｂ、２２ｂ 開口 ３０ 上蓋（カバー） ３１ａ、３２ａ 細胞注入口 ３１ｂ、３２ｂ 開口

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図10】

【図13】

【図7】

【図8】

【図9】

【図11】

【図12】

【図14】

【図15】