特許 5710634 ヒト由来の多能性幹細胞を分化させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5710634

(24)【登録日】2015年3月13日

(45)【発行日】2015年4月30日

(54)【発明の名称】ヒト由来の多能性幹細胞を分化させる方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20150409BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20150409BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20150409BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150409BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00 102

   C12N5/00 202C

   C12N5/00 202H

   !C12N15/00 AZNA

【請求項の数】7

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2012-536593(P2012-536593)

(86)(22)【出願日】2011年9月30日

(86)【国際出願番号】JP2011072609

(87)【国際公開番号】WO2012043814

(87)【国際公開日】20120405

【審査請求日】2013年3月29日

(31)【優先権主張番号】特願2010-222583(P2010-222583)

(32)【優先日】2010年9月30日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、文部科学省、科学技術試験研究委託事業「ヒトｉＰＳ細胞等を用いた次世代遺伝子・細胞治療法の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100117787

【弁理士】

【氏名又は名称】勝沼 宏仁

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100107342

【弁理士】

【氏名又は名称】横田 修孝

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】辻 浩一郎

(72)【発明者】

【氏名】海老原 康 博

【審査官】 名和 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５０００４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Yonsei Med.J.,2005,46(5),p.693-9

【文献】 PLoS One,2009,4(12),p.e8067

【文献】 Exp.Hematol.,2004,32(10),p.1000-9

【文献】 Haematologica,2009,94(12),p.1649-60

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト由来の多能性幹細胞を分化させる方法であって、前記ヒト由来の多能性幹細胞を、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞との共培養下で分化誘導する方法。

【請求項2】

前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される少なくとも一の細胞である請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記間葉系幹細胞が、ヒト由来の血小板溶解液の存在下でヒト由来の多能性幹細胞から樹立した細胞である請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記間葉系幹細胞と前記ヒト由来の多能性幹細胞とが同一人に由来する請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記分化誘導が、血液細胞への分化誘導である請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ヒト由来の多能性幹細胞から間葉系幹細胞を製造する方法であって、ヒト由来の血小板溶解液の存在下でヒト由来の多能性幹細胞から間葉系幹細胞を樹立する工程を含んでなる、方法。

【請求項7】

ヒト由来の多能性幹細胞から細胞を製造する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって前記ヒト由来の多能性幹細胞を分化誘導する工程を含んでなる、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト由来の多能性幹細胞を分化させる方法に関し、より詳しくは、前記ヒト由来の多能性幹細胞を、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞との共培養下で分化誘導する方法に関する。また、この方法に用いられるヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞、並びにこの方法によって得られるヒト由来の多能性幹細胞から分化した細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は種々の機能細胞に分化できる多能性を有しているため、再生医療への応用が期待されている。しかし、現在のところ、ヒト多能性幹細胞から機能細胞への分化誘導には、動物血清や動物由来のフィーダー細胞を必要としている。そのため、実際にヒト多能性幹細胞から分化誘導された機能細胞をヒトに投与する際には、外来性抗原となる動物細胞（異種細胞）の混入による未知の微生物やウィルス、プリオンによる感染等の危険性があり、これを回避する方法が必要とされている。

【0003】

一方、ヒト多能性幹細胞から特定の細胞への分化、例えば、血液細胞への分化誘導に関しては、ヒト多能性幹細胞から胚樣体を介する分化誘導法があり、胚様体内に赤血球等の血液細胞が見出されたとする報告もある。しかしながら、これらの赤血球の大部分はβグロビンを発現しない一次造血を起源とする胚型赤血球で、βグロビンを発現する成人型の二次造血に由来する赤血球はほとんど認められず、成人型の二次造血への分化誘導の効率が極めて悪い（非特許文献１〜２）。

【0004】

また、ヒト多能性幹細胞から成人型の血液細胞を分化誘導するためには、ヒト多能性幹細胞をフィーダー細胞と共培養する方法が報告されている。しかしながら、従来のヒト由来フィーダー細胞との共培養系ではヒト多能性幹細胞から血液細胞への分化誘導は困難であったことから、マウス由来のフィーダー細胞と共培養する方法が利用されており（非特許文献３〜５）、そうした方法で分化誘導された細胞は、前述のような危険性があるため、ヒトに投与することはできなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｃｈａｎｇ ＫＨら、Ｂｌｏｏｄ、２００６年、１０８巻、１５１５〜１５２３ページ

【非特許文献2】Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｍら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年、１０９巻、２６７９〜２６８７ページ

【非特許文献3】Ｍａ Ｆら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、２００８年、１０５巻、１３０８７〜１３０９２ページ

【非特許文献4】Ｍａ Ｆら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００７年、８５巻、３７１〜３７９ページ

【非特許文献5】Ｃｈｏｉ ＫＤら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００９年、２７巻、５５９〜５６７ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、異種細胞を用いずにヒト由来の多能性幹細胞を分化させる方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト由来の多能性幹細胞を共培養するためのフィーダー細胞として、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）を用いた場合には、ヒト由来の多能性幹細胞を分化させることができることを見出した。このことは、従来、ヒト由来の多能性幹細胞とヒト由来フィーダー細胞との共培養系ではヒト多能性幹細胞を分化させることが困難であったことに鑑みれば、驚くべき知見である。

【0008】

また、本発明者らは、ヒト由来の多能性幹細胞からの間葉系幹細胞の樹立においても、異種動物由来の血清やフィーダー細胞を用いることなく、ヒト由来の血小板溶解液を用いることによって行うことができることを見出した。さらに、前記間葉系幹細胞と多能性幹細胞とが同一人に由来するものであっても、該多能性幹細胞を分化誘導させることができることを見出した。

【0009】

このように本発明者らは、異種細胞の使用を一切排除して、ヒト由来の多能性幹細胞を分化誘導する系を確立することに世界で初めて成功し、本発明を完成するに至った。

【0010】

本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）ヒト由来の多能性幹細胞を分化させる方法であって、前記ヒト由来の多能性幹細胞を、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞との共培養下で分化誘導する方法。
（２）前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される少なくとも一の細胞である（１）に記載の方法。
（３）前記間葉系幹細胞が、ヒト由来の血小板溶解液の存在下でヒト由来の多能性幹細胞から樹立した細胞である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記間葉系幹細胞と前記ヒト由来の多能性幹細胞とが同一人に由来する（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の方法。
（５）前記分化誘導が、血液細胞への分化誘導である（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の方法。
（６）（１）〜（５）のうちのいずれかに記載の方法に用いられる、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞。
（７）（１）〜（６）のうちのいずれかに記載の方法によって得られる、ヒト由来の多能性幹細胞から分化した細胞。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、異種細胞を用いることなく、ヒト多能性幹細胞から分化誘導された種々の細胞を産生することが可能となる。従って、本発明により、ヒトに投与する場合でも高い安全性を有する形態で、ヒト多能性幹細胞から分化誘導された種々の細胞を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ヒト由来のＥＳ細胞（Ｈ１ヒトＥＳ細胞）から、ＰＬ（血小板溶解液）存在下にて分化誘導した均一な紡錘形の細胞（間葉系幹細胞）を示す顕微鏡写真である。

【図2】ヒト由来のＥＳ細胞（ｋｈＥＳ−１ＥＳ細胞）から、ＰＬ（血小板溶解液）存在下にて分化誘導した均一な紡錘形の細胞（間葉系幹細胞）を示す顕微鏡写真である。

【図3】ヒト由来のｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞）から、ＰＬ（血小板溶解液）存在下にて分化誘導した均一な紡錘形の細胞（間葉系幹細胞）を示す顕微鏡写真である。

【図4】Ｈ１ヒトＥＳ細胞からＰＬ存在下にて分化誘導して得られた細胞を、マーカータンパク質の発現を指標として、ＦＡＣＳ法により解析した結果を示すヒストグラム図である。

【図5】Ｈ１ヒトＥＳ細胞からＰＬ存在下にて分化誘導して得られた細胞を、更に骨芽細胞に分化誘導し、ＡＬＰ染色を施して観察した結果を示す顕微鏡写真である。

【図6】Ｈ１ヒトＥＳ細胞からＰＬ存在下にて分化誘導して得られた細胞を、更に脂肪細胞に分化誘導し、オイルレッドＯ染色を施して観察した結果を示す顕微鏡写真である。

【図7】Ｈ１ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）からＰＬ存在下にて分化誘導して得られた細胞（ｈＥＳＣ由来ＭＳＣ）を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す電気泳動の写真ある。

【図8】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞と共培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞の未分化コロニーの形成を示す顕微鏡写真である。

【図9】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞と共培養された２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞の未分化コロニーの形成を示す顕微鏡写真である。

【図10】２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞と共培養された２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞の未分化コロニーの形成を示す顕微鏡写真である。

【図11】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞と共培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞の未分化コロニーにおけるＯｃｔ−４の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図12】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞と共培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞の未分化コロニーにおけるＴＲＡ−１−６０の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図13】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞と共培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞の未分化コロニーにおけるＮａｎｏｇの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図14】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞と共培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞の未分化コロニーにおけるＳｏｘ−２の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図15】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞とＨ１ヒトＥＳ細胞とを１０日間共培養した後に認められたＨ１ヒトＥＳ細胞由来コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図16】培養液を血液細胞への分化誘導のための培養液に変更してから１４日目にＨ１ヒトＥＳ細胞コロニー内に認められた敷石状細胞群を示す顕微鏡写真である。

【図17】血液細胞への分化誘導のための培養液に変更してから１８日目にＨ１ヒトＥＳ細胞コロニー内に確認された円形小型細胞の増殖を示す顕微鏡写真である。なお、図１７中、右は左内の四角で囲まれた部分を拡大して観察した結果を示す顕微鏡写真である。

【図18】円形小型細胞を血液コロニ―培養することにより形成された、赤血球系コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図19】円形小型細胞を血液コロニ―培養することにより形成された、骨髄球系コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図20】円形小型細胞を血液コロニ―培養することにより形成された、混合コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図21】円形小型細胞を血液コロニ―培養することにより形成された赤血球系コロニーから作製されたサイトスピン標本をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色した結果を示す顕微鏡写真である。

【図22】円形小型細胞を血液コロニ―培養することにより形成された骨髄球系コロニーから作製されたサイトスピン標本をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色した結果を示す顕微鏡写真である。

【図23】円形小型細胞を血液コロニ―培養することにより形成された混合コロニーから作製されたサイトスピン標本をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色した結果を示す顕微鏡写真である。

【図24】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞との共培養によりＨ１ヒトＥＳ細胞を分化誘導した後、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５を用いて形成された赤血球系コロニーからサイトスピン標本を作製し、Ｈｂ（上段）とβグロビン（中段）の発現を免疫染色により解析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、最下段は、上段の写真と中段の写真とを重ね合わせた顕微鏡写真である。

【図25】Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞との共培養によりＨ１ヒトＥＳ細胞を分化誘導した後、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５を用いて形成された赤血球系コロニーからサイトスピン標本を作製し、ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ（ＧＰＡ）の発現を免疫染色により解析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中矢印が指し示しているのはＧＰＡを発現している赤血球系細胞である。

【図26】２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞と２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞とを共培養し、培養液を血液細胞への分化誘導のための培養液に変更して、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来のコロニー内に認められた敷石状細胞群を示す顕微鏡写真である。

【図27】２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来のコロニー内に認められた敷石状細胞群から細胞を回収し、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５を用いて形成された血液コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図28】２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来のコロニー内に認められた敷石状細胞群から細胞を回収し、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５を用いて形成された骨髄球系コロニーから作製されたサイトスピン標本をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色した結果を示す顕微鏡写真である。

【図29】２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞とＨ１ヒトＥＳ細胞とを共培養し、培養液を血液細胞への分化誘導のための培養液に変更して得られたＨ１ヒトＥＳ細胞由来の敷石状細胞から、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５を用いて形成された赤血球系コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図30】２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞とＨ１ヒトＥＳ細胞とを共培養し、培養液を血液細胞への分化誘導のための培養液に変更して得られたＨ１ヒトＥＳ細胞由来の敷石状細胞から、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５を用いて形成された混合コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図31】２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞とＨ１ヒトＥＳ細胞とを共培養し、培養液を血液細胞への分化誘導のための培養液に変更して得られたＨ１ヒトＥＳ細胞由来の敷石状細胞から、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５を用いて形成された骨髄球系コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図32】健常成人由来の皮膚繊維芽細胞から樹立したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）とマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）との共培養状態を示す顕微鏡写真である。

【図33】自家血清を含む培地にて培養することにより分化誘導された、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）由来の間葉系幹細胞を示す顕微鏡写真である。

【図34】ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）から分化誘導された間葉系幹細胞上で維持された未分化なヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）コロニーを示す顕微鏡写真である。

【図35】ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）由来の間葉系幹細胞と共培養されたヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）の未分化コロニーにおけるＯｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４）、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ−４の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図36】ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）由来の間葉系幹細胞とヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）とを共培養し、培養液を血液細胞への分化誘導のための培養液に変更して、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）由来のコロニー内に認められた小型円形細胞の増殖（ａのパネル）及び敷石状細胞群（ｂのパネル）を示す顕微鏡写真である。

【図37】ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）の未分化コロニーから回収した円形小型細胞を、自家血清を用いた血液コロニ―培養に供することにより形成された血球系コロニーを示す顕微鏡写真である。なお図中、ａ及びｄは赤血球系細胞から構成される赤血球系コロニーを示す。ｂ及びｅは好中球、マクロファージ・単球等の骨髄球系細胞から構成される骨髄球系コロニーを示す。ｃ及びｆは赤血球系細胞、骨髄球系細胞及び巨核球系細胞から構成される混合コロニーを示す。また、ｄ〜ｆは各血球系コロニーから作製されたサイトスピン標本をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色した結果を示す。

【図38】自家血清を用いた血液コロニ―培養によって形成された、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）由来の赤血球系コロニーに含まれる赤血球系細胞におけるβグロビン等の発現を免疫染色により解析した結果を示す顕微鏡写真である。上段の３パネルは、ヒトβグロビン、ヒトαグロビン及びヒトγグロビンの発現を解析した結果を各々示し、中段の３パネルはヒトヘモグロビンの発現を解析した結果を示す。また、下段の３パネルは上段のパネルと中段のパネルとを重ね合わせた結果を各々示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、ヒト由来の多能性幹細胞を分化させる方法であって、前記ヒト由来の多能性幹細胞を、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞との共培養下で分化誘導する方法である。

【0014】

本発明において分化させる対象とするヒト由来の多能性幹細胞は、ヒトを構成する種々の細胞に分化できる多能性と自己複製能とを有する細胞であり、例えば、ヒト由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ヒト由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ヒト由来の胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、ヒト由来の胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）が挙げられる。これらの中では、生物学的特性の解析が格段に進んでいるという観点から、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される少なくとも一の細胞であることが好ましい。また、胚を壊すことなく作製することができるという倫理的な観点から、さらに再生医療等に用いる際に、多能性幹細胞から分化した細胞を移植する患者と血液型の点において適合させ易いという観点から、本発明にかかるヒト由来の多能性幹細胞としてヒト由来のｉＰＳ細胞を用いることがより好ましい。さらにまた、多能性幹細胞から分化した細胞を移植する患者と血液型が完全に一致するという観点から、本発明にかかるヒト由来の多能性幹細胞として患者由来の体細胞から樹立したｉＰＳ細胞を用いることが特に好ましい。なお、本発明における血液型とは、赤血球の型（ＡＢＯ、ＲＨ）のみならず、白血球の型（ＨＬＡ）をも意味する。

【0015】

本発明においては、ヒト由来の多能性幹細胞と共培養を行うための「間葉系幹細胞」として、それ自体が、ヒト由来の多能性幹細胞（例えば、前述のｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等）から樹立した間葉系幹細胞を用いることを特徴とする。当該間葉系幹細胞は、ヒト由来の多能性幹細胞を分化誘導させる際のフィーダー細胞として機能する。間葉系幹細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞等の種々の間葉系の細胞へ分化する能力と自己複製能とを有する細胞である。また、本発明に用いる間葉系幹細胞としては、再生医療等に用いる際に、多能性幹細胞から分化した細胞を移植する患者への拒絶反応が起こらないようにするという観点から、血液型の点において、分化させるヒト由来の多能性幹細胞と適合している間葉系幹細胞であることが好ましく、分化させるヒト由来の多能性幹細胞と同一人に由来する間葉系幹細胞であることがより好ましい。

【0016】

本発明にかかる間葉系幹細胞をヒト由来の多能性幹細胞から樹立する方法としては特に制限されることなく、例えば、「Ｗａｎｇら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００５年、２３巻、１２２１〜１２２７ページ」や「Ｈｗａｎｇら、ＰＮＡＳ、２００８年、１０５巻、２０６４１〜２０６４６ページ」に記載されているような、胚樣体を形成した後、異種動物由来の血清を含む培養液を用いて間葉系幹細胞に誘導する方法、「Ｌｉａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０１０年、１２１巻、１１１３〜１１２３ページ」に記載されているような、最初に無血清の状態で培養した細胞から抗ヒトＣＤ２４抗体及び抗ヒトＣＤ１０５抗体を用いてＣＤ３４⁻ＣＤ１０５^＋細胞を分画した後、異種動物由来の血清を用いて間葉系幹細胞に誘導する方法が挙げられる。また「Ｄｏｕｃｅｔら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００５年、２０５巻、２２８〜２３６ページ」や「Ｍｉｒａｂｅｔら、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ、２００８年、９巻、１〜１０ページ」に記載されているような、ヒト由来の血小板溶解液（ＰＬ）を用いて間葉系幹細胞に誘導する方法や、後述の実施例において示すような、ヒト由来の血小板溶解液（ＰＬ）を用いて、ヒト由来の多能性幹細胞から間葉系幹細胞を樹立する方法（「Ｅｂｉｈａｒａら、「Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ（ＥＳ） ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＥＳ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．」、７ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９年」、「海老原ら、「ヒトＥＳ細胞維持能を有するヒトＥＳ細胞由来ストローマ細胞」、第８回日本再生医療学会、２００９年」等 参照）が挙げられる。

【0017】

これらの方法の中では、異種動物由来の血清を用いることなく間葉系幹細胞を樹立することができるという観点から、フィーダー細胞を用いることなく、ヒト由来の血清、ヒト由来の血漿、ヒト由来の血小板溶解液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ、ＰＬ）からなる群から選択される少なくとも一の血液成分を用いて、ヒト由来の多能性幹細胞から間葉系幹細胞を樹立する方法であることが好ましい。さらに、得られる間葉系幹細胞において染色体異常の発生する可能性が非常に低いこという観点から、血小板溶解液を用いて樹立する方法であることがより好ましく、また、血液型（特にＨＬＡの型）を完全に一致させるという観点から、多能性幹細胞から分化した細胞を移植する患者由来の血小板溶解液や血清等を用いて樹立する方法であることが特に好ましい。さらに、かかる間葉系幹細胞の増殖を抑えるという観点から、ヒト由来の多能性幹細胞との共培養に際しては、放射線（例えば、１５〜１８Ｇｙ）を照射しておくことが好ましい。

【0018】

本発明は、本発明の方法に用いられる、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞をも提供するものである。

【0019】

本発明においては、こうしてヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞との共培養下でヒト由来の多能性幹細胞を分化誘導する。多能性幹細胞を血液細胞に分化誘導する場合、例えば、所望の血液細胞に分化させ得る因子を培地中に添加して培養すればよい。このような因子としては、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ)、白血病抑制因子（ＬＩＦ)、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、ＴＮＦ−α、Ｆｌｔ３リガンド、ヘパリン、インターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、融合蛋白質−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との複合体）等）からなる群より選択される少なくとも一のサイトカインが挙げられる。

【0020】

本発明においては、１０〜５００ｎｇ／ｍＬ ヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ）、１０〜５００ｎｇ／ｍＬ ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＦ）、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ ヒト融合蛋白質−６（ヒトインターロイキン−（ＩＬ−）６とヒト可溶性ＩＬ−６受容体との複合体、ｈＦＰ−６）、５〜１００ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ−３、５〜１００ｎｇ／ｍＬ ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）、５〜１００ｎｇ／ｍＬ 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、１〜２０Ｕ／ｍＬ ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、１〜１００ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ、及び、１〜１００ｎｇ／ｍＬ ヒト骨形成タンパク質（ｈＢＭＰ）−４からなるサイトカインカクテルを添加して培養する方法が特に好ましい。

【0021】

そして、これらの因子を添加した培地中において本発明にかかる間葉系幹細胞と共培養することにより、ヒト由来の多能性幹細胞を、赤血球、白血球、血小板といった血液細胞の基となる造血幹細胞や種々の造血前駆細胞に分化誘導することができる。さらに、得られた造血幹細胞や造血前駆細胞を、例えば、後述の実施例に示すような血清やサイトカイン等が添加されているメチルセルロース培地（例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社製のＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５）を用いた血液コロニ―培養や、「Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９５年、９２巻、２８５９〜２８６３ページ」、「Ｓｕｉら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９９６年、１８３巻、８３７〜８４５ページ」に記載の無血清の条件下での血液コロニ―培養法や浮遊血液培養法によって、成熟した血液細胞とすることができる。また、後述の実施例に示す通り、多能性幹細胞から分化した細胞を移植する患者由来の血清（自家血清）等を用いた血液コロニー培養法によっても成熟した血液細胞とすることができる。これらの方法の中では、異種動物血清（ＦＢＳ等）のみならず、ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ（同種異系）抗原をも混入していない成熟した血液細胞が得られるという観点から、自家血清等を用いた血液コロニ―培養法が好ましい。

【0022】

多能性幹細胞を血液細胞以外の細胞に分化誘導する方法としては、ドーパミン産生神経細胞に分化誘導する場合には、例えば、「Ｚｅｎｇら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００４年、２２巻、９２５〜９４０ページ」に記載の、ヒトＥＳ細胞と、マウス骨髄間質細胞由来の前脂肪細胞であるＰＡ６細胞とを共培養する方法が挙げられる。また、血管内皮細胞に分化誘導する場合には、例えば、「Ｓｏｎｅら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．、２００７年、２７巻、２１２７〜２１３４ページ」に記載のヒトＥＳ細胞と、マウス新生児の頭蓋冠から分離したＯＰ９細胞とを共培養し、その後出現してくるＶＥＧＦ−Ｒ２（＋）ＴＲＡ１−６０（−）ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（＋）細胞を分離し、コラーゲンIVコーティング上で培養する方法が挙げられる。さらに、心筋細胞に分化誘導する場合には、例えば、「Ｙａｍａｓｈｉｔａら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、２００５年、１９巻、１５３４〜１５３６ページ」に記載のマウスＥＳ細胞をコラーゲンIVコーティング上において、ＬＩＦを含有していない培養液中で培養し、その後出現してくるＦｌｋ−１（＋）細胞とＯＰ−９細胞とを共培養する方法が挙げられる。そして、これらの方法において用いられる異種動物由来のフィーダー細胞（ＰＡ６細胞やＯＰ９細胞）の代わりに、本発明にかかる間葉系幹細胞を用いることにより、異種細胞を用いずにヒト由来の多能性幹細胞をドーパミン産生神経細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等の機能細胞に分化することが可能となる。

【0023】

間葉系幹細胞との共培養下でヒト由来の多能性幹細胞の分化誘導を行う段階においては、ヒト由来の多能性幹細胞は、高い増殖能を有しているという観点から、未分化コロニ―を形成している状態となっていることが好ましい。ヒト由来の多能性幹細胞の未分化コロニ―の形成は、例えば、ヒト由来のＥＳ細胞を用いる場合は、後述のＨＥＳ１培養液中で、ヒト由来のｉＰＳ細胞を用いる場合は、後述のＨＥＳ２培養液中で、６〜１０日程度培養することにより行うことができる。

【0024】

本発明は、上記の本発明の方法により得られる、ヒト由来の多能性幹細胞から分化した細胞をも提供するものである。

【実施例】

【0025】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0026】

＜ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の維持培養＞
ヒトＥＳ細胞としてはＨ１ヒトＥＳ細胞（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）又は、京都大学中辻憲夫教授から供与されたＫｈＥＳ−１細胞を用いた。ヒトｉＰＳ細胞としては、京都大学山中伸弥教授から供与されたヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞）を用いた。そして、これらヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）との共培養により維持し、継代は６〜８日毎に実施した。

【0027】

Ｈ１ヒトＥＳ細胞の共培養のための培養液としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍ’ｓ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ社製）とを１：１で混合し、これに０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ社製）、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、最小必須培地（ＭＥＭ）−非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５ｎｇ／ｍＬ ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ社製）と２０％ ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えたものを用いた（以下、ＨＥＳ１培養液とも称する）。

【0028】

ＫｈＥＳ−１細胞又はヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞）の維持培養のための培養液としては、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２とを１：１で混入し、これに０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ＭＥＭ−非必須アミノ酸溶液、４ｎｇ／ｍＬ ヒト組み換えｂＦＧＦと２０％ ＫＳＲとを加えものを用いた（以下、ＨＥＳ２培養液とも称する）。

【0029】

また、未分化なヒトＥＳ細胞コロニーであることの確認は、組織免疫染色によるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＴＲＡ−１−６０、Ｎａｎｏｇの発現、及び免疫不全ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの腎被膜下への移植によるテラトーマ形成能によった。

【0030】

＜ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞から間葉系幹細胞への分化誘導＞
血小板採取装置により得られたヒト血小板濃厚血漿を−８０℃で冷凍した後解凍することにより血小板を破壊した後、９００ｇで遠心分離して上清を回収し、血小板溶解液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ、ＰＬ）を作製した。ヒト多能性幹細胞から間葉系幹細胞を分化誘導するために、ＭＥＦ上で維持培養されていたヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を回収して、又は凍結されていたヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を解凍して、フィーダー細胞を敷かないゼラチンコートされた１０ｃｍ培養皿に播種し、ＨＥＳ１培養液又はＨＥＳ２培養液に、５％ ＰＬと１０，０００Ｕ ノボ−ヘパリン（持田製薬株式会社製）とを添加し（以下、ＰＬ培養液とも称する）、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。培養液交換は週２回行い、２〜３週毎に継代培養し、培養６〜８週目に、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を均一な紡錘形の細胞へと分化させた。得られた結果を図１〜３に示す。

【0031】

＜間葉系幹細胞の性状の解析＞
前記の通りにして得られた均一な紡錘形の細胞の細胞表面マーカーをＦＡＣＳ（製品名：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｏｍｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ社製）を用いて解析した。また、得られた均一な紡錘形の細胞の遺伝子発現を、表１に示すプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで検討した。さらに、ＮＨ ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍ、ＮＨ ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、得られた均一な紡錘形の細胞から脂肪細胞や骨芽細胞への分化誘導を行い、各々オイルレッドＯ（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ）染色、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色により各細胞に分化誘導されていることを確認した。得られた結果を図４〜７に示す。さらに、Ｈ１ヒトＥＳ細胞又は２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された均一な紡錘形の細胞（５０細胞）については、染色体検査を実施した。

【0032】

【表1】

【0033】

図１に示した結果から明らかなように、ＭＥＦ上で維持されていたヒトＥＳ細胞（Ｈ１ヒトＥＳ細胞）を回収して、フィーダー細胞を用いず、ゼラチンをコートした１０ｃｍ培養皿に播種し、ＰＬ培養液で３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養すると、６〜８週後に均一な紡錘形の細胞、すなわち間葉系幹細胞が分化誘導された。また、同様の方法を用いて、ｋｈＥＳ−１細胞や２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞からも、図２〜３に示した結果から明らかなように、間葉系幹細胞を分化誘導することができた。

【0034】

さらに、これらの細胞の表面抗原をＦＡＣＳ法にて解析すると、図４に示した結果から明らかなように、前記均一な紡錘形の細胞は、血液細胞、血管内皮細胞、未分化なＥＳ細胞のマーカーであるＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＳＳＥＡ−４は発現しておらず、間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５、ＣＤ１６６を発現していた。さらに、骨芽細胞や脂肪細胞へ分化誘導すると、図５〜６に示した結果から明らかなように、ＡＬＰ染色陽性の骨芽細胞やオイルレッド染色陽性の脂肪細胞に分化したことより、前記の方法によって樹立された細胞は間葉系幹細胞であることが確認された。また、樹立された間葉系幹細胞のＲＴ−ＰＣＲ法による解析では、図７に示した結果から明らかなように、未分化なヒトＥＳ細胞のマーカーであり、ｈＥＳＣ（Ｈ１ヒトＥＳ細胞）においては遺伝子発現が確認されたＯｃｔ−４の発現は認められなかった。また、マウス細胞由来のｍＨＰＲＴの発現もＨ１ヒトＥＳ細胞から樹立された間葉系幹細胞（ｈＥＳＣ由来ＭＳＣ）においては認められなかったため、かかる間葉系幹細胞において、未分化なヒトＥＳ細胞やＭＥＦの残存又は混入はないことが確認された。

【0035】

さらに、図には示さないが、Ｈ１ヒトＥＳ細胞、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された間葉系幹細胞については染色体検査を実施し、いずれも、解析された５０細胞全てが正常核型であることを確認した。

【0036】

従って、ヒトＰＬ（血小板溶解液）を用いて６〜８週間培養することにより、異種動物由来の血清を用いることなく、ヒトＥＳ細胞から間葉系幹細胞へ分化誘導でき、これらには未分化なヒトＥＳ細胞やＭＥＦも混入していないことが確認された。また、かかるヒトＰＬを用いたヒト多能性幹細胞から間葉系幹細胞への分化誘導法は、ヒト由来のＥＳ細胞、ヒト由来のｉＰＳ細胞いずれにも適応可能で有り、染色体異常の発生する可能性は非常に低いことを示している。

【0037】

＜ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の未分化コロニーの形成＞
前記の通りにして、６ｗｅｌｌプレート上でヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導された間葉系幹細胞を、１５〜１８Ｇｙの放射線照射した後にヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と共培養した。すなわち、この際の培養液として、間葉系幹細胞上に播種する細胞がＨ１ヒトＥＳ細胞であればＨＥＳ１培養液を、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞であればＨＥＳ２培養液を用いて、間葉系幹細胞との共培養を行い、ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の未分化コロニーの形成を行った。得られた結果を図８〜１０に示す。また、一部の実験では、ヒト多能性幹細胞由来間葉系幹細胞と共培養されたヒト多能性幹細胞の未分化性を確認するために、未分化なヒトＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＴＲＡ−１−６０、Ｎａｎｏｇの発現を検討した。すなわち、蛍光標識した各々のマーカータンパク質を認識する抗体を用いて、形成されたコロニ―を染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。得られた結果を図１１〜１４に示す。さらに、形成されたコロニ―を構成する細胞が未分化性を維持していることを確認するため、Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞上で培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞又は２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞をＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに移植し、テラトーマが形成されるかどうかを検証した。

【0038】

図８〜１０に示した結果から明らかなように、前記の方法を用いてヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から間葉系幹細胞を分化誘導し、１５〜１８Ｇｙの放射線照射した後、その上に自己、非自己のヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を播種して６〜１０日間共培養すると、ＭＥＦによる継代培養中のヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、あるいは解凍直後のヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞であっても、未分化コロニーの形成を認めた。また、図１１〜１４に示した結果から明らかなように、Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞上で培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞は、いずれも未分化なヒトＥＳ細胞マーカーを発現していた。さらに、図には示さないが、Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来間葉系幹細胞上で培養されたＨ１ヒトＥＳ細胞、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞をＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに移植すると、内胚樣、中胚葉、外胚葉由来の細胞からなるテラトーマが形成され、これらのヒト多能性幹細胞では未分化性が維持されていることが確認できた。

【0039】

（実施例１）
＜ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞から血液細胞への分化誘導＞
前記の通りにして、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の未分化コロニーの形成が認められる培養６〜１０日目に、２ｍＭ グルタミンと、４×１０^−４Ｍ モノチオグリセロール（ＭＴＧ、Ｓｉｇｍａ社製）と５０ｍｇ／ｍＬ アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社製）とを含む無血清培地であるＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培養液に、１００ｎｇ／ｍＬ ヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ）、１００ｎｇ／ｍＬ ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＦ）、１００ｎｇ／ｍＬ ヒト融合蛋白質−６（ヒトインターロイキン−（ＩＬ−）６とヒト可溶性ＩＬ−６受容体との複合体、ｈＦＰ−６）、２０ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍＬ ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）、１０ｎｇ／ｍＬ 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、５Ｕ／ｍＬ ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、１０ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ヒト骨形成タンパク質（ｈＢＭＰ）−４からなるサイトカインカクテルを添加して、培養液を週２回交換しながら、培養を継続した。得られた結果を図１５〜１７、２６に示す。

【0040】

＜血液細胞の同定＞
前記の通りにして、１０〜１４日間共培養して得られた細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等を含むＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４４３５（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社製）を用いて、血液コロニー培養し、血液コロニーの形成を行った。また、形成された血液コロニーについては、各コロニーのサイトスピン標本を作製し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色又は組織免疫染色して、コロニーを構成している細胞の同定を行った。なお、組織免疫染色は、前記の通りにして得られた細胞を、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて固定した後、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＴＲＡ−１−６０、Ｎａｎｏｇ、ｇlｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ（ＧＰＡ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、βグロビンの発現を、免疫染色により検討した。また、核染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて行った。得られた結果を図１８〜２５、２７〜３１に示す。

【0041】

図１５〜１７に示した結果から明らかなように、前述のように１５〜１８Ｇｙの放射線照射したＨ１ヒトＥＳ細胞由来の間葉系幹細胞との共培養によりＨ１ヒトＥＳ細胞の未分化コロニー（図１５参照）が形成される培養６〜１０日目に、前記サイトカインカクテル等を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４培養液に変更して、培養を継続し、培養液を変更してから１０〜１４日目にヒトＥＳ細胞から形成されたコロニーの中に、未分化な血液細胞が間葉系幹細胞下で増殖していることを示す敷石状細胞群（造血幹細胞や種々の造血前駆細胞等）が確認された（図１６参照）。また、その後造血細胞、または血液細胞と推測される小型円形細胞の増殖が確認された（図１７参照）。

【0042】

さらに、図１８〜２３に示した結果から明らかなように、それらの細胞を回収して、血液コロニー培養すると、赤血球系細胞から構成される赤血球系コロニー、好中球、マクロファージや単球等の骨髄球系細胞から構成される骨髄球系コロニー、赤血球系細胞、骨髄球系細胞及び巨核球系細胞から構成される混合コロニーが形成された。

【0043】

また、図２４及び図２５に示した結果から明らかなように、これらの赤血球系コロニーに含まれる細胞は、赤血球系細胞のマーカーであるＧＰＡやＨｂを発現する赤血球系細胞であることを確認した。さらに、これらの赤血球系細胞が、未熟な一次造血を起源とする胚性赤血球であるか、二次造血を起源とする成人型赤血球であるかを検討したところ、これらの赤血球の９５％以上が、二次造血に特異的なβグロビンの発現する成人型赤血球であることを確認した（図２４参照）。なお、図には示さないが、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＴＲＡ−１−６０、Ｎａｎｏｇといった未分化マーカーはこれら細胞において発現していないことも確認された。

【0044】

また、図２６〜２８に示した結果から明らかなように、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞と２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞との共培養においても、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞から形成されたコロニー中に敷石状細胞群が確認され（図２６参照）、１０〜１４日後に、それらの細胞を回収して血液コロニー培養すると、血液コロニーが形成され（図２７参照）、マクロファージ、骨髄球系細胞等の血液細胞が含まれていた（図２８参照）。

【0045】

さらに、図２９〜３１に示した結果から明らかなように、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞とＨ１ヒトＥＳ細胞との共培養においても、Ｈ１ヒトＥＳ細胞から形成されたコロニー中に敷石状細胞群（造血幹細胞や種々の造血前駆細胞等）が確認され（図示せず）、１０〜１４日後に、それらの細胞を回収して血液コロニー培養すると、赤血球コロニー、混合コロニー、骨髄球系コロニー等様々な血液コロニーが形成された。

【0046】

従って、ヒト由来の多能性幹細胞を、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞との共培養下で分化誘導することによって、血液細胞といった分化した細胞を得ることができることが明らかになった。さらには、従前のヒト多能性幹細胞から胚樣体を介して血液細胞に分化誘導する方法（非特許文献１〜２ 参照）では得ることが困難だった二次造血に特異的な成人型赤血球も、前述の通り、本発明の方法では９５％以上と極めて効率良く得ることができることも明らかになった。

【0047】

また、分化誘導させられる多能性幹細胞と、かかる間葉系幹細胞とが同一人由来のものであっても（前記、Ｈ１ヒトＥＳ細胞由来の間葉系幹細胞とＨ１ヒトＥＳ細胞との共培養の例、及び、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞と２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞との共培養の例 参照）、異なる人由来のものであっても（前記、２５３Ｇ１ヒトｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞とＨ１ヒトＥＳ細胞との共培養の例 参照）、同様にヒト由来の多能性幹細胞から分化した細胞を得ることができることも明らかになった。

【0048】

次に、ヒトＰＬ（血小板溶解液）の代わりに自家血清を含む培地にて培養することにより、ヒトｉＰＳ細胞から自家由来の間葉系幹細胞を樹立し、さらに当該ヒトｉＰＳ細胞を当該間葉系幹細胞との共培養下で、自家血清を用いて血球系細胞に分化させることができるかどうかを以下に示す通り検証した。

【0049】

＜ヒトｉＰＳ細胞の維持培養＞
先ず、Ｎ Ｔａｋａｙａｍａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１０年１２月、２０７巻、１３号、２８１７〜２８３０ページの記載に従って、健常成人由来の繊維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）を樹立し、＜ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の維持培養＞に記載の方法と同様の方法にて、ＭＥＦ上で維持した（図３２ 参照）。

【0050】

＜ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）から間葉系幹細胞への分化誘導＞
次に、ＭＥＦ上にて維持されていたヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）を回収して、フィーダー細胞を敷かないゼラチンコートした１０ｃｍ培養皿に移し、５％前記健常成人由来の血清（自家血清）を加えたＨＥＳ１培養液（自家培地）にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。その結果、培養６〜８週ぐらいで図３３に示すような均一な紡錘形の細胞（間葉系幹細胞）が分化誘導された。

【0051】

＜ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）の未分化コロニーの形成＞
そして、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）から分化誘導された間葉系幹細胞に１５〜１８Ｇｙの放射線を照射した後に、その上で自家ｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）を共培養することにより、図３４に示すように、自家ｉＰＳ細胞はコロニーを形成し、未分化な状態で維持された。

【0052】

また、前記未分化コロニーついて、未分化なヒトＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、Ｎａｎｏｇの発現を＜ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の未分化コロニーの形成＞に記載の方法と同様に検討した。その結果、図３５に示す通り（ＴＲＡ−１−６０については図には示さないが）、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）由来の間葉系幹細胞上で培養されたヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）は、いずれも未分化なヒトＥＳ細胞マーカーを発現しており、未分化性が維持されていることが確認できた。

【0053】

（実施例２）
＜ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）から血液細胞への分化誘導＞
前記の通りにして、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）の未分化コロニーの形成が認められる培養６〜１０日目に、１００ｎｇ／ｍＬ ｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ｈＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ｈＦＰ−６、２０ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍＬ ｈＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍＬ Ｇ−ＣＳＦ、５Ｕ／ｍＬ ｈＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ｈＢＭＰ−４からなるサイトカインカクテルを添加した、２ｍＭ グルタミン及び４×１０^−４Ｍ ＭＴＧと５０ｍｇ／ｍＬ アスコルビン酸を含む無血清培地（ＳｔｅｍＰｒｏ−３４培養液）に変更して培養を継続した。培養液を変更してから１０〜１４日目の結果を図３６に示す。

【0054】

図３６に示した結果から明らかなように、培養液を変更してから１０〜１４日目の、ヒトｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）から形成されたコロニーの中に、小型円形細胞の増殖が確認された（図３６のａ）。また、一部には未分化な血液細胞が間葉系幹細胞下にて増殖していることを示す敷石状細胞群が確認された（図３６のｂの矢印が示す箇所）。

【0055】

さらに、その後、それらの細胞を回収して、ＦＢＳの代わりに自家血清を用いて血液コロニー培養を行った。すなわち、当該細胞を、３０％ 自家血清、０．９％ メチルセルロース、１％ ＢＳＡ（純度１００％）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＧ−ＣＳＦ、５Ｕ／ｍｌ ｈＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＴＰＯ及びαメディウムからなる培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で血液コロニー培養を行った。得られた結果を図３７及び３８に示す。

【0056】

図３７に示した結果から明らかなように、前記自家血清を用いた血液コロニー培養によって、赤血球系細胞から構成される赤血球系コロニー（図３７ a、ｄ）、好中球、マクロファージ・単球等の骨髄球系細胞から構成される骨髄球系コロニー（図３７ ｂ、ｅ）、赤血球系細胞、骨髄球系細胞及び巨核球系細胞から構成される混合コロニー（図３７ ｃ、ｆ）が形成された。また、表２に、独立して４回施行した自家間葉系幹細胞との共培養によって形成された血液コロニーについての結果を示す。なお表中、「ｉＰＳコロニーの数」は、１回の前記自家血清を用いた血液コロニー培養に供したｉＰＳ細胞のコロニーの数を示す。

【0057】

【表2】

【0058】

また、これらの赤血球コロニーに含まれる赤血球系細胞におけるβグロビン等の発現を＜血液細胞の同定＞に記載の方法と同様の方法にて検討したところ、ほぼ１００％の赤血球系細胞にαグロビン、γグロビンが、また約７０％の赤血球系細胞にβグロビンが発現していた（図３８ 参照）。従って、これらの血液コロニーは二次造血を起源としており、約７０％の赤血球系細胞は成人型ヘモグロビンを合成していることが明らかになった。

【0059】

従って、上述のようにヒトＰＬを用いずとも、自家血清を用いて、間葉系幹細胞を分化誘導し、分化誘導された間葉系幹細胞と自家ｉＰＳ細胞とを共培養することで、ヒトｉＰＳ細胞から異種動物血清（ＦＢＳ等）やａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ（同種異系）血清を用いずに、血液細胞を誘導できることが明らかになった。

【0060】

また、実際に、一人のドナーから樹立されたｉＰＳ細胞（ＳＰＨ−０１０３）から、そのドナーの血清を用いて、動物細胞・動物血清を用いることなく、赤血球、白血球、巨核球等の血液細胞が分化誘導できることも明らかになった。

【産業上の利用可能性】

【0061】

以上説明したように、本発明によれば、ヒト由来のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞にかかわらず、ヒト由来の多能性幹細胞から樹立した間葉系幹細胞と共培養することにより、自己又は自己以外のヒト由来の多能性幹細胞から、血液細胞等の機能細胞に分化誘導ができる。

【0062】

本発明の方法により分化誘導することによって得られる血液細胞等の機能細胞は、異種細胞の混入がなく、さらにヒト由来の血清溶解液を用いて樹立した間葉系幹細胞の共培養下で分化誘導すればり、異種血清を混入させることもない。このため本発明の方法により得られた各種細胞を用いれば、動物細胞の混入、未知の微生物やウィルスやプリオンによる感染等の危険性のない、極めて安全性の高い再生医療等を実現することができる。

【配列表フリーテキスト】

【0063】

配列番号１〜６
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【配列表】

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