特許 5726731 ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5726731

(24)【登録日】2015年4月10日

(45)【発行日】2015年6月3日

(54)【発明の名称】ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20150514BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20150514BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150514BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150514BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20150514BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20150514BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   A61P9/00

   A61P35/00

   A61P43/00 101

   A61K45/00

   !C07K16/28ZNA

【請求項の数】9

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2011-517203(P2011-517203)

(86)(22)【出願日】2009年7月7日

(65)【公表番号】特表2011-527322(P2011-527322A)

(43)【公表日】2011年10月27日

(86)【国際出願番号】FR2009051343

(87)【国際公開番号】WO2010004204

(87)【国際公開日】20100114

【審査請求日】2012年5月7日

(31)【優先権主張番号】08/03888

(32)【優先日】2008年7月8日

(33)【優先権主張国】FR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ボラン，ニコラ

(72)【発明者】

【氏名】ベルヌ，ピエール−フランソワ

(72)【発明者】

【氏名】ブランシユ，フランシス

(72)【発明者】

【氏名】ボノ，フランソワーズ

(72)【発明者】

【氏名】カムロン，ベアトリス

(72)【発明者】

【氏名】ダブドウビ，タリ

(72)【発明者】

【氏名】エルベール，コランタン

(72)【発明者】

【氏名】ミコル，バンサン

(72)【発明者】

【氏名】レミー，エリザベツト

【審査官】 長岡 真

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０５２７９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０５２７９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／１３６８９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５０１３０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２０８８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 R.Pai et al.，Cancer Research，２００８年 ７月 １日，Vol.68, No.13，p.5086-5095

【文献】 C.Chen et al.，Hybridoma，２００５年，Vol.24, No.3，p.152-159

【文献】 Z.R.Qian et al.，The Journal of Clinical Endoclinology & Metabolism，２００４年，Vol.89, No.4，p.1904-1911

【文献】 V.Fuhrmann et al.，Journal of Molecular Neuroscience，１９９９年，Vol.13，p.187-197

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｋ １６／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号９、１０、１１、１２、１３及び１４、又は７３、７４、７５、７８、７９及び８０、又は８３、８４、８５、８８、８９及び９０、又は９３、９４、９５、９８、９９及び１００、又は１０３、１０４、１０５、１０８、１０９及び１１０の配列のＣＤＲを含むＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体であって、前記ＣＤＲの各自が前記各配列と比較して１又は２つのアミノ酸だけ異なっていてもよいが、前記抗体がＦＧＦ−Ｒ４に対するその結合特異性を保持する、ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む、病理学的血管形成に関連する疾患の治療に使用するための医薬組成物。

【請求項2】

ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体であって、該抗体の重鎖の可変領域が配列番号５、７６、８６、９６又は１０６の配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号７、７１、８１、９１又は１０１の配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるが、前記抗体がＦＧＦ−Ｒ４に対するその結合特異性を保持する、ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体であって、該抗体の配列が、配列番号２及び４、若しくは６及び８、若しくは７２及び７７、若しくは８２及び８７、若しくは９２及び９７、若しくは１０２及び１０７のポリペプチド配列、又はこれらの配列に対応する、それらと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むが、前記抗体がＦＧＦ−Ｒ４に対するその結合特異性を保持する、ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ヒト化抗体であるＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体であって、該抗体の可変軽鎖が配列番号３０又は３２のポリペプチド配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有し、かつ該抗体の可変重鎖が配列番号３４、３６又は３８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

細胞毒性薬とコンジュゲートしたＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

肝臓癌又は他の任意の種類の肝癌の治療に使用するための、請求項１から６のいずれか一項に記載のＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む医薬組成物。

【請求項8】

膵臓癌の治療に使用するための、請求項１から６のいずれか一項に記載のＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体を含む医薬組成物。

【請求項9】

さらに賦形剤を含む請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の対象は、ＦＧＦ受容体４（ＦＧＦ−Ｒ４）に特異的な拮抗薬であって、この受容体の活性を阻害することを可能にする拮抗薬である。これらの拮抗薬は、特に、ＦＧＦ受容体４（ＦＧＦ−Ｒ４）に対して特異的な抗体である。

【0002】

また、本発明の対象は、特に血管形成分野における、及び特定の種類の癌の治療におけるこれらの拮抗薬の治療的使用でもある。

【背景技術】

【0003】

ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）は、インビトロ及びインビボで血管細胞増殖、移動及び分化を刺激することできると報告された最初の分子の１つである。ＦＧＦによるインビトロ及びインビボでの血管形成の誘導及び毛細血管の形成については多くの文献で報告されている。また、ＦＧＦは、腫瘍によって動員される血管の形成を促進することによる腫瘍血管形成にも関与する。

【0004】

ヒトＦＧＦファミリーは、少なくとも２３のメンバーから構成され、これらは全て、１２０のアミノ酸からなる保存された中央ドメインを有する。ヒトＦＧＦファミリーは、三重複合体を形成するように、そのチロシンキナーゼ型の高親和性受容体（ＦＧＦ−Ｒ）と、ほとんどの細胞表面及び細胞外マトリックス（低親和性結合部位）上に存在する成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用することによってそれらの生物学的活性を発揮する。ＦＧＦは、幾つかのＦＧＦ−Ｒに対して高親和性を有するものもあるが、ある受容体又は受容体のあるアイソフォームを特異的に活性化するものもある。

【0005】

ＦＧＦ−Ｒ４特異的リガンドは、Ｘｉｅら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１９９９年、１１：７２９−３５頁）によって同定された。ＦＧＦ１９と呼ばれるこのリガンドは、ＦＧＦ−Ｒ４だけに対して高親和性を有するリガンドであり、この受容体に対するリガンドの結合は、ヘパリン依存性又はヘパラン硫酸依存性である。ＦＧＦ１９は、成体動物では肝細胞及び小腸のみにおいて同定され、そこではＦＧＦ１９は肝臓による胆汁酸の合成を調節している。ＦＧＦ１９は、胚発育の間に関与する成長因子であると思われ、ゼブラフィッシュ及びヒトにおける胎児の脳発育に関与すると思われる。

【0006】

ＦＧＦ１又はＦＧＦ２等の他のＦＧＦ−Ｒ４リガンドも報告されている。これらのリガンドは、ＦＧＦ−Ｒ４を強力に活性化するが、ＦＧＦ−Ｒ４に特異的ではなく、即ち、これらのリガンドは他のＦＧＦ−Ｒにも結合する（Ｏｒｎｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１：１５２９２−７頁）。

【0007】

ＦＧＦ−Ｒ４受容体の活性化は、数種類の細胞シグナル伝達を生じさせる。これらの中で、最も通常の型は、ＦＧＦによるＦＧＦ−Ｒ４の刺激の後のリン酸化カスケードを介したシグナル伝達経路の状況に対応する。この誘導は、ＦＧＦ−Ｒ４のチロシンキナーゼドメインの自己リン酸化をもたらし、他のシグナル伝達タンパク質、例えばＡＫＴ、ｐ４４／４２、ＪＮＫ等のリン酸化に依存する細胞内シグナル伝達経路を開始する働きがある。このリン酸化を介したシグナル伝達は、細胞の種類や、これらの細胞の表面に存在する補助受容体又は接着分子によって様々である（Ｃａｖａｌｌａｒｏら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３／７、６５０−６５７頁（２００１）、Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１８／６、７８３−７９４頁（２００６）、Ｌｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２００７年、１４：２７２７７−８４頁（２００７））。ＦＧＦ−Ｒ４を含むＦＧＦ−Ｒにとって重要なシグナル伝達の別の方法は、そのリガンドと組み合わせた活性化の後の受容体の内部移行である。この機構は、受容体のチロシンキナーゼ活性に依存しないが、ＦＧＦ−Ｒ４の短いＣ末端配列に依存する（Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１１３／Ｐｔ１０：１８２７−１８３８頁（２０００））。

【0008】

ＦＧＦ−Ｒ４の４つの互いに異なる型は、文献で報告されている。受容体の標準型である３８８位で２つの多型変異体を有する完全長型、即ちＦＧＦ−Ｒ４ Ｇｌｙ３８８、及び幾つかの腫瘍の関連において報告されているＡｒｇ３８８型（Ｂａｎｇｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２／３、８４０−８４７頁（２００２）、Ｓｐｉｎｏｌａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２３、７３０７−７３１１頁（２００５）、Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１８／６、７８３−７９４頁（２００６））。乳腫瘍細胞において発現する可溶型も発見された（Ｔａｋａｉｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、２０００年、２６７：６５８−６２頁）。細胞外部分において切断される第４の型は、特定の下垂体腺腫において報告された（Ｅｚｚａｔら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、２００２年、１０９：６９−７８頁）。ＦＧＦ−Ｒ４は、胃腸管、膵臓、肝臓、筋肉、副腎等、内胚葉から誘導される組織において主に発現する。

【0009】

ＦＧＦ−Ｒ４は、幾つかの細胞の役割を有することが文献において知られており、それらの主な３つを以下に記載する。

【0010】

第１に、この受容体は、骨格筋分化及び再生、間葉組織分化又は骨形成等、インビトロ及びインビボでの各種の細胞分化プロセスの制御に、又は出生後の肝臓発育の間の腺胞の形成に関与する。

【0011】

第２に、ＦＧＦ−Ｒ４は、胆汁酸及びコレステロールホメオスタシスの制御において報告され、肥満の制御に関与すると考えられる。更に、胆汁酸産生及びコレステロール産生の間のバランスは、インビトロ及びインビボでＦＧＦ−Ｒ４によって制御される。

【0012】

第３に、ＦＧＦ−Ｒ４は、特定の腫瘍現象、例えば肝細胞癌若しくは大腸癌の発現、又は乳房線維腺腫細胞若しくは乳癌上皮細胞の増殖、例えば乳房若しくは直腸結腸癌細胞運動に関与する。ＦＧＦ−Ｒ４の腫瘍への関与は、乳房及び結腸直腸腫瘍（Ｂａｎｇｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２／３、８４０−８４７頁、２００２年）、前立腺腫瘍（Ｗａｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０／１８、６１６９−６１７８頁、２００４年）又は肝臓腫瘍（Ｎｉｃｈｏｌｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０／６、２２９５−３０７頁、２００２年）の腫瘍進行の促進に相関する多型（Ｇｌｙ３８８Ａｒｇ）の出現を主に伴う。また、この多型は、肉腫の場合（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ９８／１０、２２４５−２２５０頁、２００３年）、肺腺癌の場合（Ｓｐｉｎｏｌａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２３、７３０７−７３１１頁、２００５年）又は扁平上皮肉腫の場合（ｄａ Ｃｏｓｔａ Ａｎｄｒａｄｅら、Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ８２、５３−７頁、２００７年）、予後不良をも伴う。また、ＦＧＦ−Ｒ４の過剰発現は、特定の膵臓癌株においても報告され（Ｓｈａｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２１／５４、８２５１−６１頁、２００２年）、星状細胞腫悪性腫瘍に相関する（Ｙａｍａｄａら、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２４／３、２４４−８頁、２００２年）。更に、移植大腸腫瘍のインビボモデル又は肝細胞癌モデルにおける抗ＦＧＦ１９モノクローナル抗体の使用は、ＦＧＦ１９の不活性化、したがってＦＧＦ−Ｒ４活性化の抑止が大腸癌又は肝臓癌の治療に有益であり得ることを示す。

【0013】

ＩＩは、ＦＧＦ／ＦＧＦ−Ｒ１及びＦＧＦ／ＦＧＦ−Ｒ２の対が正常又は病的な状況における新しい血管の形成に関与することが文献において受け入れられる。しかし、この細胞現象の制御におけるＦＧＦ―Ｒ４の可能な関与は、これまで研究されてこなかった。それは、実際、現在まで、血管形成の活性化はＦＧＦ−Ｒ１及び／又はＦＧＦ−Ｒ２によって媒介されると考えられてきた（Ｐｒｅｓｔａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、２００５年、１６：１５９−７８頁）。

【0014】

ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬の例は、文献に記載されており、特に小分子であるが、それらは、ＦＧＦ−Ｒ４を特異的に標的とせず、したがって悪影響につながる。したがって、幾つかのＦＧＦ−Ｒを阻害するチロシン−キナーゼドメイン阻害化学的小分子及び更には他の受容体型チロシンキナーゼは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらによって報告されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２０００年、４３：４２００−１１頁）。また、それらの細胞外部分との会合によってＦＧＦ−Ｒを阻害する化学的小分子は、出願ＷＯ２００７／０８０３２５にも記載されている。

【0015】

また、国際出願ＷＯ２００５／０６６２１１及びＷＯ２００８０５２７９６において、又はＣｈｅｎら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ２４／３、１５２−１５９頁、２００５年）に記載されている抗ＦＧＦＲ１抗体及び／又は抗ＦＧＦＲ４抗体等の抗体も研究されている。出願ＷＯ２００５／０３７２３５は、肥満及び糖尿病の治療のためのＦＧＦ−Ｒ拮抗薬である抗体について記載している。更に、作動薬である抗ＦＧＦ−Ｒ４抗体は、出願ＷＯ０３／０６３８９３に記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】国際公開第２００７／０８０３２５号

【特許文献2】国際公開第２００５／０６６２１１号

【特許文献3】国際公開第２００８／０５２７９６号

【特許文献4】国際公開第２００５／０３７２３５号

【特許文献5】国際公開第０３／０６３８９３号

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｘｉｅら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１９９９年、１１：７２９−３５頁）

【非特許文献2】Ｏｒｎｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１：１５２９２−７頁

【非特許文献3】Ｃａｖａｌｌａｒｏら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３／７、６５０−６５７頁（２００１）

【非特許文献4】Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１８／６、７８３−７９４頁（２００６）

【非特許文献5】Ｌｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２００７年、１４：２７２７７−８４頁（２００７）

【非特許文献6】Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１１３／Ｐｔ１０：１８２７−１８３８頁（２０００）

【非特許文献7】Ｂａｎｇｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２／３、８４０−８４７頁（２００２）

【非特許文献8】Ｓｐｉｎｏｌａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２３、７３０７−７３１１頁（２００５）

【非特許文献9】Ｔａｋａｉｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、２０００年、２６７：６５８−６２頁

【非特許文献10】Ｅｚｚａｔら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、２００２年、１０９：６９−７８頁

【非特許文献11】Ｗａｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０／１８、６１６９−６１７８頁、２００４年

【非特許文献12】Ｎｉｃｈｏｌｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０／６、２２９５−３０７頁、２００２年

【非特許文献13】Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ９８／１０、２２４５−２２５０頁、２００３年

【非特許文献14】ｄａ Ｃｏｓｔａ Ａｎｄｒａｄｅら、Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ８２、５３−７頁、２００７年

【非特許文献15】Ｓｈａｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２１／５４、８２５１−６１頁、２００２年

【非特許文献16】Ｙａｍａｄａら、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２４／３、２４４−８頁、２００２年

【非特許文献17】Ｐｒｅｓｔａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、２００５年、１６：１５９−７８頁

【非特許文献18】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２０００年、４３：４２００−１１頁

【非特許文献19】Ｃｈｅｎら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ２４／３、１５２−１５９頁、２００５年）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体に特異的に結合することを特徴とするＦＧＦ−Ｒ４受容体拮抗薬である。

【0019】

有利には、前記拮抗薬は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体に特異的な抗体である。

【課題を解決するための手段】

【0020】

一実施形態において、本発明の対象である前記拮抗薬は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体のＤ２−Ｄ３ドメインに結合する。有利な一実施形態において、本発明の対象である前記拮抗薬は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体のＤ２ドメインに結合する。更により有利な一実施形態において、前記拮抗薬は、配列番号７０の配列に結合する。

【0021】

有利には、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体に対して、Ｂｉａｃｏｒｅ法によって決定される１０^−８Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、２×１０^−９Ｍ未満又は１×１０^−９Ｍ未満のＫ_Ｄを有する。

【0022】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、ヒトＦＧＦ−Ｒ４及びマウスＦＧＦ−Ｒ４の両方に対して活性である。

【0023】

別の有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、ヒトＦＧＦ−Ｒ４、マウスＦＧＦ−Ｒ４及びラットＦＧＦ−Ｒ４に対して同時に活性である。

【0024】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、７３、７４、７５、７８、７９、８０、８３、８４、８５、８８、８９、９０、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０３、１０４、１０５、１０８、１０９若しくは１１０と同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲ、又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、７３、７４、７５、７８、７９、８０、８３、８４、８５、８８、８９、９０、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０３、１０４、１０５、１０８、１０９若しくは１１０の配列と比較して１若しくは２つのアミノ酸だけ配列が異なる少なくとも１つのＣＤＲを含むが、前記抗体は、その結合特異性を保持する。

【0025】

特に有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、７３、７４、７５、７８、７９、８０、８３、８４、８５、８８、８９、９０、９３、９４、９５、９８、９９、１００、１０３、１０４、１０５、１０８、１０９若しくは１１０の配列のＣＤＲ、又は上述した配列とそれぞれ比較して１若しくは２つのアミノ酸だけ配列が異なるＣＤＲを含むが、これは、前記抗体のＦＧＦ−Ｒ４受容体結合特異性を改変しない。

【0026】

有利な一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号９、１０及び１１、又は７３、７４及び７５、８３、８４及び８５、又は９３、９４及び９５、又は１０３、１０４及び１０５から構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ配列を含み、前記軽鎖は、配列番号１２、１３及び１４、又は７８、７９及び８０、又は８８、８９及び９０、又は９８、９９及び１００、又は１０８、１０９及び１１０から構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲ配列を含む。

【0027】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体の重鎖可変領域は、配列番号６、７７、８７、９７又は１０７の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する配列を含む。

【0028】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８、７２、８２、９２又は１０２の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する配列を含む。

【0029】

また、本発明の対象は、配列番号５、７６、８６、９６又は１０６の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる可変領域を含む重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0030】

また、本発明の対象は、配列番号７、７１、８１、９１又は１０１の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる可変領域を含む軽鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0031】

また、本発明の対象は、配列番号６、７７、８７、９７又は１０７のポリペプチド配列の可変領域を含む重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0032】

また、本発明の対象は、配列番号８、７２、８２、９２又は１０２のポリペプチド配列の可変領域を含む軽鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0033】

また、本発明の対象は、配列番号５及び７、又は７１及び７６、又は８１及び８６、又は９１及び９６、又は１０１及び１０６のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0034】

また、本発明の対象は、配列番号６及び８、又は７２及び７７、又は８２及び８７、又は９２及び９７、又は１０２及び１０７のポリペプチド配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0035】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号２及び／又は配列番号４、又は配列番号７２及び／又は配列番号７７、又は配列番号８２及び／又は配列番号８７、又は配列番号９２及び／又は配列番号９７、又は配列番号１０２及び／又は配列番号１０７と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である配列を含む。

【0036】

特に有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号１の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖を含む。

【0037】

また、本発明の対象は、配列番号２の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一のポリペプチド配列の重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体拮抗薬抗体でもある。

【0038】

また、本発明の対象は、配列番号３の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0039】

また、本発明の対象は、配列番号４の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一のポリペプチド配列の軽鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0040】

また、本発明の対象は、配列番号１及び３のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0041】

更により有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４特異的拮抗薬抗体は、配列番号２の配列を含む重鎖、及び配列番号４の配列を含む軽鎖を含む。

【0042】

配列番号２の配列の重鎖及び配列番号４の軽配列から構成される抗体は、残りの本出願において４０−１２と呼ばれる。

【0043】

本発明の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４特異的抗体は、ヒトＦＧＦ−Ｒ４、マウスＦＧＦ−Ｒ４及びラットＦＧＦ−Ｒ４に対して同時に活性である。

【0044】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、ＡＫＴ／ｐ３８細胞経路の阻害を誘導する。

【0045】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、Ｅｒｋ１／２細胞経路の阻害を誘導する。

【0046】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、ＦＧＦ−Ｒ４制御細胞シグナル伝達経路の阻害を誘導する。

【0047】

別の有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、腫瘍細胞の増殖の阻害を誘導する。

【0048】

更に別の有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、血管形成の阻害を誘導する。

【0049】

別の特に有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬は、他のＦＧＦ受容体に対するその親和性よりも１０倍大きなＦＧＦ−Ｒ４に対する親和性を有する。

【0050】

特に有利な一実施形態において、本発明による抗体は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体である。

【0051】

一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体は、可変領域が配列番号２９の配列又は配列番号３１の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖を含む。

【0052】

別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体は、可変領域が配列番号３０の配列又は配列番号３２の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である軽鎖を含む。

【0053】

別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体は、可変領域が配列番号２９のヌクレオチド配列又は配列番号３１の配列と同一の配列によってコードされる軽鎖を含む。

【0054】

また、本発明の対象は、可変領域が配列番号３３の配列、配列番号３５の配列、又は配列番号３７の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一の配列によってコードされる重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体でもある。

【0055】

また、本発明の対象は、可変領域が配列番号３４の配列、配列番号３６の配列、又は配列番号３８の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一である重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体でもある。

【0056】

また、本発明の対象は、配列番号３３及び／又は配列番号３５及び／又は配列番号３７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体でもある。

【0057】

また、本発明の対象は、配列番号３０又は３２の配列のヒト化配列が配列番号３４、３６又は３８の配列のヒト化配列と組み合わせて使用されるＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト化拮抗薬抗体でもある。

【0058】

別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号７３、７４、７５、７８、７９及び８０の配列のＣＤＲ、又は上述した配列とそれぞれ比較して１又は２つのアミノ酸だけ配列が異なるＣＤＲを含むが、これは、前記抗体のＦＧＦ−Ｒ４受容体結合特異性を改変しない。

【0059】

別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号８３、８４、８５、８８、８９及び９０の配列のＣＤＲ、又は上述した配列とそれぞれ比較して１又は２つのアミノ酸だけ配列が異なるＣＤＲを含むが、これは、前記抗体のＦＧＦ−Ｒ４受容体結合特異性を改変しない。

【0060】

別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号９３、９４、９５、９８、９９及び１００の配列のＣＤＲ、又は上述した配列とそれぞれ比較して１又は２つのアミノ酸だけ配列が異なるＣＤＲを含むが、これは、前記抗体のＦＧＦ−Ｒ４受容体結合特異性を改変しない。

【0061】

別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号１０３、１０４、１０５、１０８、１０９及び１１０の配列のＣＤＲ、又は上述した配列とそれぞれ比較して１又は２つのアミノ酸だけ配列が異なるＣＤＲを含むが、これは、前記抗体のＦＧＦ−Ｒ４受容体結合特異性を改変しない。

【0062】

本発明の好ましい一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号８３、８４、８５、８８、８９及び９０の配列のＣＤＲを含む。

【0063】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、重鎖可変領域が配列番号７６、８６、９６又は１０６の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒト抗体である。

【0064】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、軽鎖可変領域が配列番号７１，８１，９１又は１０１の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むヒト抗体である。

【0065】

また、本発明の対象は、配列番号７７、８７、９７又は１０７の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するタンパク質配列によってコードされる可変領域を含む重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0066】

また、本発明の対象は、配列番号７２、８２、９２又は１０２の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するタンパク質配列によってコードされる可変領域を含む軽鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0067】

また、本発明の対象は、配列番号７１及び７６のヌクレオチド配列、又は配列番号８１及び８６のヌクレオチド配列、又は配列番号９１及び９６のヌクレオチド配列、又は配列番号１０１及び１０６のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0068】

また、本発明の対象は、配列番号７２及び７７のポリペプチド配列、又は配列番号８２及び８７のポリペプチド配列、又は配列番号９２及び９７のポリペプチド配列、又は配列番号１０２及び１０７のポリペプチド配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0069】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、配列番号７２及び／又は配列番号７７と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一の配列を含む。

【0070】

別の有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体は、配列番号８２及び／又は配列番号８７と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一の配列を含む。

【0071】

別の有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体は、配列番号９２及び／又は配列番号９７と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一の配列を含む。

【0072】

別の有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体は、配列番号１０２及び／又は配列番号１０７と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一の配列を含む。

【0073】

好ましい一実施形態において、本発明の対象は、配列番号８２の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖を含み、配列番号８７の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一のポリペプチド配列の軽鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体である。

【0074】

更により好ましくは、本発明の対象は、配列番号８２及び８７のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体である。

【0075】

配列番号７７の配列の重鎖及び配列番号７２の軽配列から構成される抗体は、残りの本出願においてクローン８と呼ばれる。

【0076】

配列番号８７の配列の重鎖及び配列番号８２の軽配列から構成される抗体は、残りの本出願においてクローン３１と呼ばれる。

【0077】

配列番号９７の配列の重鎖及び配列番号９２の軽配列から構成される抗体は、残りの本出願においてクローン３３と呼ばれる。

【0078】

配列番号１０７の配列の重鎖及び配列番号１０２の軽配列から構成される抗体は、残りの本出願においてクローン３６と呼ばれる。

【0079】

本発明の技術分野は、これらの配列を含む抗体に限定されない。実際、この受容体に対する拮抗的作用を有する、ＦＧＦ−Ｒ４に特異的に結合する全ての抗体は、本発明の技術分野の一部である。

【0080】

本発明の対象は、細胞毒性薬とコンジュゲートするＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体でもある。

【0081】

本発明の対象は、血管形成を伴う疾患の治療におけるＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬の使用である。

【0082】

本発明の対象は、癌の治療におけるＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬の使用である。

【0083】

本発明の対象は、肝臓癌又は他の任意の種類の肝癌の治療におけるＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬の使用である。

【0084】

本発明の対象は、膵臓癌の治療におけるＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬の使用である。

【0085】

本発明の対象は、血管形成を伴う疾患の治療、及び肝臓癌又は他の任意の種類の肝癌の治療の両方において有用なＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的抗体である。

【0086】

本発明の対象は、血管形成を伴う疾患の治療において、肝臓癌又は他の任意の種類の肝癌の治療において、及び膵臓癌又は胃腸管の器官若しくはＦＧＦ−Ｒ４を発現する他の任意の器官の癌の治療において同時に有用なＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的抗体である。

【0087】

本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬及び賦形剤を含む医薬組成物である。

【0088】

本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体を患者に投与することを含む癌の治療方法である。

【0089】

本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体を患者に投与することを含む血管形成の病理学的増大を伴う疾患の治療方法である。

【0090】

本発明の対象は、
ａ．マウスを免疫化するステップ、
ｂ．マウスからリンパ節を採取するステップ、及び
ｃ．ハイブリドーマ上清をスクリーニングするステップ
を含む、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬モノクローナル抗体の選択方法である。

【0091】

本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体を産生する細胞系である。

【0092】

本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体拮抗薬抗体を産生する細胞系を培養することを含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体の作製方法である。

【0093】

本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬を含む薬物である。

【0094】

また、本発明の対象は、配列番号２、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、３０、３２、３４、３６、３８、７２、７３、７４、７５、７７、７８、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８７、８８、８９、９０、９２、９３、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９及び１１０、並びにこれらの配列の１つと少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％同一の配列から構成される群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもある。

【0095】

本発明の対象は、上記の通りのポリヌクレオチドを含む組換えベクター、又は上記の通りのポリペプチドをコードする組換えベクターである。

【0096】

本発明の対象であるＦＧＦ−Ｒ４受容体拮抗薬抗体の重鎖及び／又は軽鎖の発現を可能にするため、前記鎖をコードするポリヌクレオチドが発現ベクターに挿入される。これらの発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来エピソーム、及び当業者が前記鎖の発現のために適切であると考え得るベクターのいずれかであってよい。

【0097】

本発明の対象は、上記の通りの組換えベクターを含む宿主細胞である。
本発明の詳細な説明
本発明の対象は、血管形成及び腫瘍成長を阻害するための（ＦＧＦ−Ｒ１、Ｒ２又はＲ３との交差反応なしで）ＦＧＦ−Ｒ４に対して特異的な抗体の使用である。

【0098】

予想外に、本発明者らは、ＦＧＦ−Ｒ４が血管形成の制御に活性的及び特異的役割を果たすことを示した。

【0099】

ＦＧＦ−Ｒ４のこの機能は、以前に示されず、提案もされなかった。したがって、この受容体は、血管形成機能不全を示す病状を治療するための標的として使用され得る。したがって、前記受容体の活性を調節し得るＦＧＦ−Ｒ４リガンドは、多くの血管形成関連病状のための可能な治療剤である。

【0100】

したがって、本発明は、血管形成の調節不全を含み、その阻害を必要とする全ての病状の治療に使用され得る。腫瘍血管形成阻害剤として本発明による拮抗薬を用いる、包含される病状は、癌、又は血管形成の調節不全が報告されている病状、例えば、加齢性黄斑変性若しくはＡＲＭＤ、炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、大腸炎、潰瘍、若しくは腸管の任意の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、又は肥満の治療におけるものであってもよい。

【0101】

また、これらの抗体の使用は、腫瘍の成長の阻害においても示される。したがって、本発明による拮抗薬は、ＦＧＦ−Ｒ４の調節不全を伴う特定の癌、より詳しくは、肝臓癌、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌又は食道癌の治療のために使用され得る。

【0102】

本発明による拮抗薬の主要な利点の内の１つは、ＦＧＦ受容体、適例としてＦＧＦ−Ｒ４を特異的に標的とすることである。この特異性は、チロシンキナーゼドメインを阻害する化学的小分子が有し得る悪影響を限定することを可能にする。更に、ＦＧＦ−Ｒ４は、偏在して発現しないが、内皮細胞上で、例えば、肝細胞、胆管細胞、乳腺細胞、前立腺細胞、卵巣細胞、膵臓細胞又は腎臓細胞上で特に発現することから、これは、副作用を限定するＦＧＦ−Ｒ４活性の調節不全に関連する疾患の治療方法を提供する。

【0103】

「拮抗薬」という用語は、ＦＧＦ−Ｒ４の活性を低下させる又は完全に阻害する任意のリガンドを指す。したがって、この拮抗剤化合物は、ＦＧＦ−Ｒ４阻害剤とも呼ばれる。

【0104】

この拮抗薬は、他のＦＧＦＲ以外のＦＧＦ−Ｒ４受容体に特異的に結合し得る化学的分子、組換えタンパク質、オリゴ糖、多糖、オリゴヌクレオチド、抗体等の任意のＦＧＦ−Ｒ４リガンドであってよい。

【0105】

したがって、本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４特異的拮抗薬である。本発明によれば、ＦＧＦ−Ｒ４に特異的に結合する拮抗薬は、他のＦＧＦ受容体、即ち、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ２又はＦＧＦ−Ｒ３に結合しないリガンドを指す。特に、ＦＧＦ−Ｒ４特異的抗体は、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ２又はＦＧＦ−Ｒ３とのいかなる交差反応も示さない抗体である。

【0106】

「特異的結合」は、ある受容体に対する結合の強度を別の受容体と比較した差、この場合は、ＦＧＦ−Ｒ４に対する結合と、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ２又はＦＧＦ−Ｒ３に対する可能な結合との間の差が少なくとも１０倍であることを指す。

【0107】

本発明の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４リガンドは、オリゴ糖又は多糖である。

【0108】

「オリゴ糖」は、３から１０単位の単糖を含有する任意の糖ポリマーを指す。例えばフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）等の天然オリゴ糖、及び例えばヘパリン模倣抗血栓剤等の合成オリゴ糖が存在する。

【0109】

「多糖」という用語は、グリコシド結合によって相互に結合する１０超の単糖から構成される任意のポリマーを指す。合成多糖と同様に、例えばムコ多糖、フコイド、カラゲナン、細菌性エキソポリサッカライド等の天然多糖が存在する。したがって、低分子量フコイダン又は高硫酸化エキソポリサッカライドは、血管新生促進活性を示した（Ｃｈａｂｕｔら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００３年、６４：６９６−７０２頁、Ｍａｔｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５年、６９：７５１−９頁）。逆に、ヘパリン由来弱硫酸化オリゴ糖又はホスホマンノペントーススルフェートは、血管新生阻害特性を有することができる（Ｐａｒｉｓｈら、１９９９年、１５：３４３３−４１頁、Ｃａｓｕら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２００４年、１２：８３８−４８頁）。

【0110】

本発明の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４リガンドは抗体である。

【0111】

「抗体」という用語は、任意の種類の抗体又は誘導分子、例えばポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を指す。ヒト化抗体、ヒト抗体、多特異的抗体、キメラ抗体、抗体フラグメント、ナノ体等は、モノクローナル抗体から誘導される分子の中に含まれる。

【0112】

本発明の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４特異的拮抗薬は、ポリクローナル抗体である。

【0113】

「ポリクローナル抗体」は、幾つかのＢリンパ球クローンに由来する抗体の混合物から産生された、一連の異なるエピトープを認識する抗体である。

【0114】

有利な一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４特異的拮抗薬は、モノクローナル抗体である。

【0115】

「モノクローナル抗体」は、単一の種類のＢリンパ球から誘導される（クローン的に増幅される）抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体である。この集団を占める抗体は、小量で存在し得る可能な天然の突然変異を除いて同一である。これらの抗体は、単一のエピトープに対するものであり、したがって高度に特異的である。

【0116】

「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原の部位を指す。抗原がポリマー、例えばタンパク質又は多糖である場合、エピトープは、隣接残基又は非隣接残基から構成され得る。

【0117】

本発明の有利な一実施形態において、抗ＦＧＦ−Ｒ４拮抗薬抗体は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体のＤ２−Ｄ３ドメインに属するエピトープに結合する。

【0118】

更により有利な一実施形態において、前記抗体は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体のアミノ酸１４４から３６５を含むドメインに含まれるエピトープに結合する。

【0119】

更により有利な一実施形態において、前記抗体は、ＦＧＦ−Ｒ４受容体のＤ２ドメインに含まれるエピトープに結合し、このエピトープは、配列番号７０の配列に記載されるアミノ酸１４５から２４２に対応する。

【0120】

免疫グロブリンとしても公知である抗体は、ジスルフィド架橋によって結合する２つの同一の重鎖（「ＶＨ」）及び２つの同一の軽鎖（「ＶＬ」）から構成される。各鎖は、定常領域及び可変領域を含む。各可変領域は、抗原のエピトープへの結合を主に担う「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）又は「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含む。

【0121】

「ＶＨ」という用語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）’フラグメントの重鎖を含む抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。

【0122】

「ＶＬ」という用語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）’フラグメントの軽鎖を含む抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。

【0123】

「抗体フラグメント」という用語は、前記抗体の任意の部分：Ｆａｂ（抗原結合フラグメント）Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、Ｆｃ（結晶化可能フラグメント）を指す。好ましくは、これらの機能性フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃの種類のフラグメント又は二重抗体であり、前記二重抗体は、一般にそれらが誘導されるキメラ又はヒト化モノクローナル抗体と同じ結合特異性を有する。本発明によれば、本発明の抗体フラグメントは、酵素、例えばペプシン又はパパインによる消化等の方法によって及び／又は化学還元によるジスルフィド架橋の開裂によってキメラ又はヒト化モノクローナル抗体から得られ得る。

【0124】

「ＣＤＲ領域又はＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、１９９１年、及び以降の版）によって定義される通りの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖超可変領域を示すことが意図される。３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲがある。１つのＣＤＲ又は複数のＣＤＲという用語は、抗体の、抗原又はそれが認識するエピトープに対する親和性結合を担う大部分のアミノ酸残基を含有するこれらの領域の内の１つ若しくは複数又はこれらの領域の内の全てさえも必要に応じて示すために本明細書において使用される。可変ドメインの最も保存された領域は、ＦＲ（「フレームワーク」）領域又は配列と呼ばれる。

【0125】

本発明の他の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４特異的拮抗薬は、キメラ抗体である。

【0126】

「キメラ抗体」という用語は、定常領域又はその部分が、可変領域が異なる種の定常領域に結合するように改変、置換又は交換される、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体を指す。

【0127】

また、「キメラ抗体」という用語は、可変領域又はその部分が、定常領域が異なる種の可変領域に結合するように改変、置換又は交換される、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体をも指す。

【0128】

キメラ抗体の作製方法は、当業者に公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２頁、Ｏｉら、１９８６年、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４頁、Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１−２０２頁、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号及び第４，８１６，３９７号を参照すること。

【0129】

前記抗体のこれらのキメラバージョンは、キメラモノクローナル抗体を生成するためにヒト由来のＣｋａｐｐａ及びＣＨ（ＩｇＧ１）定常ドメインへのＶＬ及びＶＨ可変領域の融合を含むことができる。

【0130】

また、ＣＨ（ＩｇＧ１）ドメインは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対するＦｃフラグメントの親和性を増大させ、それにより前記抗体のエフェクター機能を増大させるために点突然変異によって改変することも可能である（Ｌａｚａｒら、２００６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：４００５−４０１０頁、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：８８８２−８８９０頁）。

【0131】

本発明は、抗体のヒト化バージョンを含む。

【0132】

「ヒト化抗体」という用語は、主にヒト免疫グロブリン配列を含む抗体を指す。この用語は、ヒト配列の又はヒト配列中に見出される残基の組み込みによって改変された非ヒト免疫グロブリンを一般に指す。

【0133】

一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は一部が非ヒト親配列から誘導される部分に対応し、ＦＲ領域の全て又は一部がヒト免疫グロブリン配列から誘導されるものである１つ又は典型的には２つの可変ドメインを含む。したがって、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、特に選択されるヒト免疫グロブリン鋳型の一部を含むことができる。

【0134】

したがって、目的は、ヒトにおいて免疫原性が最小限である抗体を有することである。したがって、１つ又は複数のＣＤＲにおける１又は２つアミノ酸は、ＦＧＦ−Ｒ４への抗体の特異的結合機能を実質的に低下させることなく、ヒト宿主に対してより免疫原性でないものによって改変され得ることが可能である。同様に、フレームワーク領域の残基はヒトでなくてよく、それらが抗体の免疫原性に寄与しないことから、それらが改変されないことが可能である。

【0135】

ヒトに対してより免疫原性でない抗体を得るように非ヒト親抗体を改変するための当業者に公知の幾つかのヒト化方法が存在する。ヒト抗体との全体的配列同一性は、必ずしも必要とされない。これは、全体的配列同一性が必ずしも低下した免疫原性の予測的指標でないからであり、限定された数の残基の改質は、ヒトにおける大きく低下した免疫原性を有するヒト化抗体をもたらす可能性がある（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７）４４、１９８６−１９９８頁）。

【0136】

各種方法は、例えば、ＣＤＲグラフティング（ＥＰＯ０２３９４００、ＷＯ９１／０９９６７、並びに米国特許第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号）、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰＯ０５９２１０６、ＥＰＯ０５１９５９６、Ｐａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍ２８（４／５）：４８９−４９８頁、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ７（６）：８０５−８１４頁、及びＲｏｇｕｓｋａら、１９９４年、ＰＮＡＳ９１：９６９−９７３頁）、又は鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）である。

【0137】

本発明は、特に、可変部分が以下の技術に従って改変されるヒト化抗体に関する。

【0138】

抗ＦＧＦ−Ｒ４マウス抗体４０−１２の対応する鎖に最も類似の軽鎖及び重鎖は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋとの比較により同定される（Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｚ．Ｆｅｎｇ、Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｔ．Ｎ．Ｂｈａｔ、Ｈ．Ｗｅｉｓｓｉｇ、Ｉ．Ｎ．Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ、Ｐ．Ｅ．Ｂｏｕｒｎｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、２８：２３５−２４２頁）。配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０年１０月２１５：４０３−４１０頁）。これらは、可変ドメインの軽鎖及び重鎖の相同性モデルを構築するために使用されたそれぞれＰＤＢコード１ＮＤＭ及び１ＥＴＺに対応する三次元構造である。続いて、これらの三次元モデルは、ＭＯＥソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）において実施される標準手順を使用して最小化されるエネルギーである。続いて、抗体のこれらの最小化された三次元のモデルの分子力学（ＭＤ）シミュレーションは、Ａｍｂｅｒソフトウェアによって実施される（Ｄ．Ａ．Ｃａｓｅ、Ｔ．Ｅ．Ｃｈｅａｔｈａｍ、ＩＩＩ、Ｔ．Ｄａｒｄｅｎ、Ｈ．Ｇｏｈｌｋｅ、Ｒ．Ｌｕｏ、Ｋ．Ｍ．Ｍｅｒｚ，Ｊｒ．、Ａ．Ｏｎｕｆｒｉｅｖ、Ｃ．Ｓｉｍｍｅｒｌｉｎｇ、Ｂ．Ｗａｎｇ及びＲ．Ｗｏｏｄｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔ．Ｃｈｅｍ．２００５年、２６：１６６８−１６８８頁）。このシミュレーションは、一般化ボルン暗溶媒において１．１ナノ秒の期間の間５００Ｋの温度でタンパク質骨格原子に適用される調和的制約条件で行われる（Ｇａｌｌｉｃｃｈｉｏ及びＬｅｖｙ、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ２００４年、２５：４７９−４９９頁）。したがって、１０の多様な立体配座は、シミュレーションの最後のナノ秒の間、１００ピコ秒毎に１つの三次元立体配座でこの第１のシミュレーションから抽出される。次いで、これらの１０の多様な立体配座は、一般化ボルン暗溶媒において２．３ナノ秒間、２７℃の温度で、タンパク質骨格に対する制約なしで、それぞれ分子力学シミュレーションに供される。水素原子を含む結合は、ＳＨＡＫＥアルゴリズムを使用して限定され（Ｂａｒｔｈら、Ｊ Ｃｏｍｐ Ｃｈｅｍ、１９９５年、１６：１１９２−１２０９頁）、時間ステップは１フェムト秒であり、シミュレーションは、一定体積及び２７℃の一定温度でランジュバン方程式に基づいて実行された。次いで、１０の分子力学シミュレーションの各々について、１ピコ秒毎に１回の頻度で抽出される最後の２，０００の立体配座は、ヒト化すべき抗体の各アミノ酸について、アミノ酸の平均又はメドイド立体配座に対する原子配置の偏差を定量するために使用される。ＭＯＥソフトウェアのＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＳＶＬ）は、以下に記載される解析の全てをコード化するために使用される。アミノ酸のメドイド立体配座は、アミノ酸の全ての立体配座の原子の位置から算出される平均立体配座に最も近い分子力学から誘導される立体配座である。メドイド立体配座を検出するために使用される距離は、アミノ酸の２つの立体配座の原子の間のスカラー距離の二乗平均平方根（ＲＭＳＤ）である。同様に、メドイド立体配座と比較したアミノ酸の１つの立体配座の原子の位置の偏差は、シミュレーションの１つの立体配座のアミノ酸の原子とメドイド立体配座の同じ原子との間のスカラー距離のＲＭＳＤを算出することによって定量される。続いて、１０の分子力学シミュレーション全てに亘って平均された所定のアミノ酸（ｉ）の原子の位置のＲＭＳＤ（Ｆｉ）と１０の分子力学シミュレーション全てに亘って平均された抗体の全てのアミノ酸の位置のＲＭＳＤ（Ｆｍ）とを比較することによって、アミノ酸が、潜在的にＴ細胞受容体と相互作用し、免疫系の活性化を誘発し得ると考えられるのに十分柔軟であるのかが決定される。アミノ酸ｉは、Ｚｉ＝（Ｆｉ−Ｆｍ）／Ｆｍと定義されるその柔軟性スコアＺｉが０．１５を越える場合、柔軟であると考えられる。したがって、４５のアミノ酸が、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）及びそのごく近傍を除いて抗体の可変ドメインにおいて柔軟であると同定される。ＣＤＲのごく近傍は、ＣＤＲのα炭素と５オングストローム（Å）以下の距離のα炭素を有する任意のアミノ酸と定義される。

【0139】

次いで、１０の分子力学シミュレーション（１０×２ｎｓ）が同じプロトコルを使用して実行された各々について、シミュレーションの２０ナノ秒（１０×２ｎｓ）の間の抗体の６０の最も柔軟なアミノ酸の運動が、ヒト抗体生殖細胞系の４９の相同性モデルの対応するアミノ酸の運動と比較される。６０の最も柔軟なアミノ酸は、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）及びそのごく近傍を含まない。７つの最もよく認められるヒト軽鎖（ｖｋ１、ｖｋ２、ｖｋ３、ｖｋ４、ｖｌａｍｂｄａ１、ｖｌａｍｂｄａ２、ｖｌａｍｂｄａ３）と７つの最もよく認められるヒト重鎖（ｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）とを系統的に組み合わせることによって、４９のヒト抗体生殖細胞系モデルが構築された（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、Ｖｏｌ．３３、Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ５９３−Ｄ５９７）。

【0140】

４９のヒト生殖細胞系モデルとのヒト化すべき抗体の類似性は、１Åの分解能を有する固有の三次元立方格子によって１０の分子力学シミュレーションの経過を通じて抗体の６０の柔軟なアミノ酸の特異的原子の位置をサンプリングすることにより定量される。これは四次元類似性と呼ばれる。使用される三次元格子は、４４５，７４０の点で構成され、ＰＤＢコード８ＦＡＢに対応するヒト抗体の三次元構造を使用して初期化される。また、８ＦＡＢ構造は、三次元格子においてサンプリングされる抗体の全ての立体配座を配置するためにも使用される。この目的のため、抗体の分子力学のメドイド立体配座は、８ＦＡＢ構造上に重ね合わせられる。この重ね合わせは、２つの立体配座の慣性モーメントを整列配置した後、両方の立体配座のα炭素原子の間のスカラー距離の最適化を行うことから成る。抗体の分子力学の全ての残りの立体配座は、同じ方法を使用してメドイド立体配座上へ重ね合わせられる。

【0141】

比較される一対の抗体について２つの種類のサンプリングが実施され、２つの類似性（静電気の類似性及び親油性の類似性）が得られる。次いで、全体の類似性を得るためにこれらの２つの類似性が加えられる。第１のサンプリング（静電気のサンプリング）は、アミノ酸側鎖の全ての原子を考慮する。格子の１つの点の値ｘは、Ａｍｂｅｒ９９力場において記載される通りの原子部分電荷で重み付けされた三次元ガウス関数ｆ（ｘ）をアミノ酸側鎖の原子に適用することによって得られる（Ｃｉｅｐｌａｋ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．２００１年、２２：１０４８−１０５７頁）。ｆ（ｘ）関数は、３本のデカルト座標軸上に適用され、以下の式：

【0142】

【数1】

［式中、ｘ及びｕは、それぞれ格子点ｘ及びサンプリングされた原子のデカルト座標であり、ｓ＝ｒ／１．６（ｒ＝原子の共有結合半径）である］に対応する。サンプリングは、アミノ酸の全ての立体配座について繰り返され、得られた結果は、三次元格子の全ての点ｘで平均される。第２のサンプリング（親油性サンプリング）は、アミノ酸側鎖の親油性原子のみを考慮する。格子の１点の値ｘは、重み付けなしで同じガウス関数ｆ（ｘ）によって算出される。その結果、比較される２つの抗体の分子力学シミュレーションからの立体配座の２つの集合は、同じ三次元格子によってサンプリングされる。抗体ａと抗体ｂとの間の静電気類似性（ｓｉｍ−ｅｌｅｃ）は、以下の式：

【0143】

【数2】

によって測定される。親油性類似性は、既に記載された親油性サンプリングによって生成されるデータに適用される同じ式によって算出される。

【0144】

したがって、ヒト生殖細胞系モデルｖｌａｍｂｄａ２−ｖｈ２は、マウス抗体４０−１２の柔軟なアミノ酸に対してこれらの６０の柔軟なアミノ酸の最も高い四次元類似性（総類似性＝５８％）を示す。したがって、ヒト生殖細胞系モデルｖｌａｍｂｄａ２−ｖｈ２は、４５の柔軟なアミノ酸に焦点を合わせると共にヒト化すべき抗体をヒト化するために使用された。作製される突然変異を決定するため、マウス抗体４０−１２のモデルの三次元構造は、最適化されるアミノ酸のα炭素の位置で最も高い類似性を示す生殖細胞系から誘導されるモデルのものに重ね合わせられた。柔軟であると同定されたアミノ酸は、最も高い類似性を示すモデルの配列において対応するアミノ酸によって突然変異する。

【0145】

考えられる望ましくない配列モチーフは、以下のものである。アスパルテート−プロリン（酸性媒質における易動性のペプチド結合）、アスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン（グリコシル化部位、Ｘ＝プロリン以外の任意のアミノ酸）、アスパルテート−グリシン／セリン／スレオニン（柔軟なゾーンにおけるスクシンイミド／イソアスパルテートの可能な形成）、アスパラギン−グリシン／ヒスチジン／セリン／アラニン／システイン（曝露されたアミド分解部位）、メチオニン（曝露されたゾーンにおける酸化）。したがって得られたヒト化配列は、配列がＢ及びＴリンパ球によって認識されることが公知のいかなるエピトープも含まないことを確認するようにＢＬＡＳＴ配列比較アルゴリズムによってＩＥＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ：ｆｒｏｍ ｖｉｓｉｏｎ ｔｏ ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２００５年３月；３（３）：ｅ９１）の配列と最後に比較される。配列が望ましくない配列を有する残基を含む場合、それらも次いで改変される。コンポジット配列がＩＥＤＢにおいて列挙される公知のエピトープを含む場合、次いで高い類似性を示す別の生殖細胞系構造鋳型がモデルとして使用される。

【0146】

より有利には、本発明による抗体は、配列番号３４の配列、配列番号３６の配列又は配列番号３８の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する配列と組み合わせて、使用される配列番号３０の配列又は配列番号３２の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する配列を含む。

【0147】

一実施形態において、本発明による抗体は、配列番号３０の配列の可変軽鎖及び配列番号３４の配列の可変重鎖を含む。

【0148】

別の一実施形態において、抗体は、配列番号３２の配列の可変軽鎖及び配列番号３８の配列の可変重鎖を含む。

【0149】

別の一実施形態において、抗体は、配列番号３０の配列の可変軽鎖及び配列番号３６の配列の可変重鎖を含む。

【0150】

別の一実施形態において、抗体は、配列番号３２の配列の可変軽鎖及び配列番号３４の配列の可変重鎖を含む。

【0151】

別の一実施形態において、抗体は、配列番号３２の配列の可変軽鎖及び配列番号３６の配列の可変重鎖を含む。

【0152】

別の一実施形態において、抗体は、配列番号３０の配列の可変軽鎖及び配列番号３８の配列の可変重鎖を含む。

【0153】

また、本発明の対象は、ＦＧＦ−Ｒ４特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。かかる抗体は、当業者に公知の方法に従ってファージディスプレイによって得られ得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ．ら、１９９０年；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＨＲら、２００５年）。米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ技術等の他の技術は、ヒト抗体の調製に利用可能である。

【0154】

特定の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、重鎖可変領域が配列番号７６、８６、９６又は１０６の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する配列を含むヒト抗体である。

【0155】

別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的拮抗薬抗体は、軽鎖可変領域が配列番号７１、８１、９１又は１０１の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する配列を含むヒト抗体である。

【0156】

また、本発明の対象は、配列番号７７、８７、９７又は１０７の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる可変領域を含む重鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0157】

また、本発明の対象は、配列番号７２、８２、９２又は１０２の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる可変領域を含む軽鎖を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0158】

また、本発明の対象は、配列番号７１及び７６のヌクレオチド配列又は配列番号８１及び８６のヌクレオチド配列又は配列番号９１及び９６のヌクレオチド配列又は配列番号１０１及び１０６のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0159】

また、本発明の対象は、配列番号７２及び７７のポリペプチド配列又は配列番号８２及び８７のポリペプチド配列又は配列番号９２及び９７のポリペプチド配列又は配列番号１０２及び１０７のポリペプチド配列を含むＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体でもある。

【0160】

特に好ましくは、ＦＧＦ−Ｒ４受容体特異的ヒト拮抗薬抗体は、配列番号８２及び８７のポリペプチド配列を含む。

【0161】

したがって改変されるアミノ酸配列はまた、哺乳類の細胞における作製の間に翻訳後修飾によって改変することも可能である。特に、フコース生合成において不十分な安定ラインの使用は、Ｆｃ（Ｎ２９７位）のＮ−グリカンが部分的に又は完全にフコースを欠くモノクローナル抗体を作製することを可能にすることができ、ＡＤＣＣエフェクター効果を増大させることを可能にする（Ｋａｎｄａら、２００６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：６８０−６８８頁、及びＲｉｐｋａら、１９８６年Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ２４９：５３３−５４５頁）。

【0162】

本発明の別の一実施形態において、ＦＧＦ−Ｒ４特異的拮抗薬は、コンジュゲート抗体である。

【0163】

前記抗体は、細胞毒性薬とコンジュゲートすることができる。本明細書において、「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能若しくは成長を低下若しくは抑止させる又は細胞の破壊を引き起こす物質を示す。

【0164】

一実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、抗原を発現する細胞に対して細胞毒性を有する「プロドラッグ」を形成するようにメイタンシノイド等の薬物とコンジュゲートすることができる。

【0165】

本発明の細胞毒性薬は、細胞死を生じさせる又は細胞死を誘導する又は各種の方法で細胞生存度を減少させる任意の化合物であってよい。好ましい細胞毒性薬としては、例えば、上記で定義されたメイタンシノイド及びメイタンシノイド類似体、タキソイドＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類似体、ドラスタチン及びドラスタチン類似体が挙げられる。これらの細胞毒性薬は、本出願において記載される通りの抗体、抗体フラグメント、機能的等価物、改善された抗体及びその類似体とコンジュゲートする。

【0166】

コンジュゲート抗体は、インビトロでの方法によって調製され得る。リンカー基は、薬物又はプロドラッグを抗体に結合させるために使用される。適切なリンカー基は、当業者に周知であり、特に、ジスルフィド基、チオエーテル基、不安定酸性基、感光性基、不安定ペプチダーゼ基及び不安定エステラーゼ基を含む。好ましいリンカー基は、ジスルフィド基及びチオエーテル基である。例えば、コンジュゲートは、ジスルフィド交換反応を用いることによって又は抗体と薬物若しくはプロドラッグとの間にチオエーテル架橋を形成することによって構築され得る。

【0167】

メトトレキサート、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、ツブリシン及びツブリシン類似体、デュオカルマイシン及びデュオカルマイシン類似体、ドラスタチン及びドラスタチン類似体等の化合物はまた、本発明のコンジュゲートの調製にも適切である。分子は、血清アルブミン等の中間体分子を介して抗体分子に結合することもできる。例えば特許出願ＵＳ０９／７４０９９１に記載される通りのドキソルビシン及びドキソルビシン化合物もまた、有用な細胞毒性薬であり得る。

【0168】

本発明の対象である抗体は、細胞障害性分子又は化合物と組み合わせられ得る。また、それらは、他の血管形成経路に作用する血管新生阻害化合物とも組み合わせられ得る。

【0169】

「ＦＧＦ−Ｒ４を発現する細胞」という表現は、その天然型において又は突然変異型においてＦＧＦ−Ｒ４受容体を発現する任意の真核細胞、とりわけ哺乳類細胞、特にヒト細胞を指す。ＦＧＦ−Ｒ４は、例えばＦＧＲ−Ｒ４の細胞外ドメイン、特にＤ２−Ｄ３ドメインを含むその全体の型又は切断型であってもよい。ＦＧＦ−Ｒ４は、キメラ型においても組み換えられ得る。

【0170】

本発明の化合物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内等の投与の目的のために医薬組成物の形で製剤化され得る。好ましくは、医薬組成物は、注射可能製剤のために医薬的に許容し得る担体を含む。それらは、特に滅菌等張性食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム等、又はかかる塩の混合物）又は必要に応じて滅菌水若しくは生理的食塩水を添加することによって注射可能溶質を形成し得る乾燥、特に凍結乾燥組成物であってよい。

【0171】

血管形成が腫瘍性であっても非腫瘍性であっても、標的とされる病状は、血管形成に関連する全ての疾患であり得る。

【0172】

標的とされる病状は、癌（腫瘍血管形成の阻害剤として本発明を使用することによる）、特に肝臓癌、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌若しくは皮膚癌、又は血管形成の調節不全が報告されている病状、例えば、加齢性黄斑変性若しくはＡＲＭＤ、炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、大腸炎、潰瘍、若しくは腸管の任意の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、又は肥満の治療におけるものであってもよい。

【0173】

腫瘍成長に直接及ぼす作用を有する阻害剤として、抗ＦＧＦ−Ｒ４抗体を、癌、特に肝臓癌及び他の肝癌、並びに膵臓癌を治療するために使用することも可能である。

【0174】

本発明を以下の実施例によって示すが、限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

【0175】

【図1A】インビトロにおいて（図１Ａ）、ＨＵＶＥＣ型のヒト内皮細胞は、血管形成として公知の擬管のネットワークを形成することができる。このネットワークは、１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２の添加によって刺激される。この誘導は、ＦＧＦ−Ｒ４に特異的なリガンドである１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９を添加することによっても得られ得るが、一方で１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４（ＦＧＦ−Ｒ４を活性化しないリガンド）は、血管形成を刺激することができない。同様に、インビボにおける（図１Ｂ）、マウスの背部上のスポンジインプラントにおける血管形成の誘導のマウスモデルにおいて、ＦＧＦ２は、対照と比較してこれらのスポンジのヘモグロビン含有率の増加を特徴とするスポンジへの機能性新血管の漸増を誘導することができる。ＦＧＦ１９もまた、スポンジにおけるこの血管形成を誘導することができる。

【図1B】インビトロにおいて（図１Ａ）、ＨＵＶＥＣ型のヒト内皮細胞は、血管形成として公知の擬管のネットワークを形成することができる。このネットワークは、１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２の添加によって刺激される。この誘導は、ＦＧＦ−Ｒ４に特異的なリガンドである１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９を添加することによっても得られ得るが、一方で１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４（ＦＧＦ−Ｒ４を活性化しないリガンド）は、血管形成を刺激することができない。同様に、インビボにおける（図１Ｂ）、マウスの背部上のスポンジインプラントにおける血管形成の誘導のマウスモデルにおいて、ＦＧＦ２は、対照と比較してこれらのスポンジのヘモグロビン含有率の増加を特徴とするスポンジへの機能性新血管の漸増を誘導することができる。ＦＧＦ１９もまた、スポンジにおけるこの血管形成を誘導することができる。

【図2A】ｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇ（配列番号４０）の発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４６１４の地図である。

【図2B】ｈＦＧＦＲ４−Ｓｔｒｅｐｔａｇ（配列番号６９）の発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４６１３の地図である。

【図3】ｈＦＧＦＲ４（Ｄ２、Ｄ３）−Ｈｉｓｔａｇ（配列番号４２）の発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４６１５の地図である。

【図4】ｍＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇ（配列番号４４）の発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４６２１の地図である。

【図5】（配列番号Ｎｏ．４６の配列の）ｈＦＧＦＲ１−Ｆｃの発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４３２８の地図である。

【図6】（配列番号４８の配列の）ｈＦＧＦＲ２−Ｆｃの発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４３２７の地図である。

【図7】ＥＬＩＳＡプレートに、４種のヒトＦＧＦ受容体を被覆する。これらの各種ＦＧＦ−Ｒを認識する抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２及び６４−１２の能力をＥＬＩＳＡアッセイによって測定する。クローン４０−１２（黒色の棒グラフ）は、ＦＧＦ−Ｒ４に特異的である。クローン６４−１２（灰色の棒グラフ）は、更に、ＦＧＦ−Ｒ３を非常に弱く認識する。

【図8A】活性拮抗薬抗体４０−１２及びその不活性対照６４−１２は、基底血管形成にそれ自体無効である。一方で、３０μｇ／ｍｌ（約２００ｎＭ）の投与量で、抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体４０−１２は、ＨＵＶＥＣ細胞のＦＧＦ２誘導血管形成を阻害することができるが、一方で対照抗体６４−１２は、そうすることができない（図８Ａ）。 ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｎｍにより標識されたＦＧＦ２は、３００−１９細胞によって発現したＦＧＦ−Ｒ４に結合することができる（白色の棒グラフ）。この相互作用は、標識されないＦＧＦ２（黒色の棒グラフ）又は抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２（暗灰色の棒グラフ）によって解離され得るが、一方で対照抗体６４−１２は、そうすることができない（淡灰色の棒グラフ）（図８Ｂ）。

【図8B】活性拮抗薬抗体４０−１２及びその不活性対照６４−１２は、基底血管形成にそれ自体無効である。一方で、３０μｇ／ｍｌ（約２００ｎＭ）の投与量で、抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体４０−１２は、ＨＵＶＥＣ細胞のＦＧＦ２誘導血管形成を阻害することができるが、一方で対照抗体６４−１２は、そうすることができない（図８Ａ）。 ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｎｍにより標識されたＦＧＦ２は、３００−１９細胞によって発現したＦＧＦ−Ｒ４に結合することができる（白色の棒グラフ）。この相互作用は、標識されないＦＧＦ２（黒色の棒グラフ）又は抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２（暗灰色の棒グラフ）によって解離され得るが、一方で対照抗体６４−１２は、そうすることができない（淡灰色の棒グラフ）（図８Ｂ）。

【図8C】３ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２によって誘導されるインビトロでの血管形成に対する１０μｇ／ｍｌのクローン８、３１、３３及び３６から誘導される抗ＦＧＦＲ４抗体の効果を示す図である。クローン８（図８Ｃ）並びに３１、３３及び３６（図８Ｄ）は、ＨＵＶＥＣ細胞のＦＧＦ−２誘導血管形成を阻害する。

【図8D】３ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２によって誘導されるインビトロでの血管形成に対する１０μｇ／ｍｌのクローン８、３１、３３及び３６から誘導される抗ＦＧＦＲ４抗体の効果を示す図である。クローン８（図８Ｃ）並びに３１、３３及び３６（図８Ｄ）は、ＨＵＶＥＣ細胞のＦＧＦ−２誘導血管形成を阻害する。

【図9A】Ｈｅｐ３ｂヒト肝臓癌細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９によって刺激する。この刺激は、ウェスタンブロット法によって観察される、ｃＦｏｓ及びＪｕｎＢタンパク質の合成、並びにＥｒｋ１／２のリン酸化を生じさせるＦＧＦ−Ｒ４特異的細胞シグナル伝達を誘導する（図９Ａ）。次いで、各バンドを定量する。この定量化は、棒グラフの形で表される（図９Ｂ）。１００μｇ／ｍｌの抗体４０−１２は、ＦＧＦ−Ｒ４特異的細胞シグナル伝達の誘導を完全に阻害するが、一方で対照抗体は、効果を有さない。具体的には、抗体４０−１２は、３時間の刺激の後でＦＧＦ１９によって誘導されるＪｕｎＢ及びｃＦｏｓの合成と更にＥｒｋ１／２のリン酸化とを完全に抑止する。

【図9B】Ｈｅｐ３ｂヒト肝臓癌細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９によって刺激する。この刺激は、ウェスタンブロット法によって観察される、ｃＦｏｓ及びＪｕｎＢタンパク質の合成、並びにＥｒｋ１／２のリン酸化を生じさせるＦＧＦ−Ｒ４特異的細胞シグナル伝達を誘導する（図９Ａ）。次いで、各バンドを定量する。この定量化は、棒グラフの形で表される（図９Ｂ）。１００μｇ／ｍｌの抗体４０−１２は、ＦＧＦ−Ｒ４特異的細胞シグナル伝達の誘導を完全に阻害するが、一方で対照抗体は、効果を有さない。具体的には、抗体４０−１２は、３時間の刺激の後でＦＧＦ１９によって誘導されるＪｕｎＢ及びｃＦｏｓの合成と更にＥｒｋ１／２のリン酸化とを完全に抑止する。

【図9C】ＦＧＦ−１９（３０ｎｇ／ｍｌ）によってＨｅｐ３ｂ細胞において誘導されるＥｒｋ１／２のリン酸化に対する抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２の阻害効果は、抗ホスホＥＲｋ１／２ ＥＬＩＳＡによって確認される。また、抗体４０−１２は、ＦＧＦ−２（１ｎｇ／ｍｌ）又は１０％の血清（ＦＣＳ）によって刺激されるＨｅｐ３ｂ細胞におけるＥｒｋ１／２のリン酸化を阻害することもできる。

【図9D】クローン８、３１、３３及び３６から誘導される抗体を使用してＨｅｐ３ｂ細胞上のＥＬＩＳＡによって得られたＦＧＦ−１９（３０ｎｇ／ｍｌ）によって誘導されるＥｒｋ１／２リン酸化の阻害率を示す図である。

【図10A】Ｈｅｐ３ｂ細胞の増殖は、血清（図１０Ａ）又はＦＧＦ１９（図１０Ｂ）を添加することによって刺激され得る。血清による誘導は、１００μｇ／ｍｌの抗体４０−１２によって部分的に阻害されるが、一方で対照抗体は効果を有さない（図１０Ａ）。ＦＧＦ１９によって誘導される増殖は、１０μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２によって完全に抑止されるが、一方で同じ投与量の対照抗体は、そうすることができない（図１０Ｂ）。

【図10B】Ｈｅｐ３ｂ細胞の増殖は、血清（図１０Ａ）又はＦＧＦ１９（図１０Ｂ）を添加することによって刺激され得る。血清による誘導は、１００μｇ／ｍｌの抗体４０−１２によって部分的に阻害されるが、一方で対照抗体は効果を有さない（図１０Ａ）。ＦＧＦ１９によって誘導される増殖は、１０μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２によって完全に抑止されるが、一方で同じ投与量の対照抗体は、そうすることができない（図１０Ｂ）。

【図11A】抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２は、腫瘍血管形成を阻害することによってＲｉｐＴａｇマウスモデルの膵腫瘍の発育を低下させるができる。Ｒｉｐ１−Ｔａｇ２モデルは、トランスジェニックマウスが膵島のインスリン産生β細胞におけるＳＶ４０Ｔ抗原を発現するマウスモデルである（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、９−１５：１１５−２２頁）。このＴ抗原は、見かけ上の効果なしで、生後４−５週間まで膵臓の胚発育の間発現する。次いで、Ｔ抗原を発現する膵島の一部が、次の５週間の間に、血管系の活性化を伴う血管形成膵島の形成の方に、次いで腺腫瘍型の小さな腫瘍の発育の方に進行する。数週間後、幾つかの腺腫瘍が発育し、侵食癌を形成する（図１１Ａ）。 これらのＲｉｐ１−Ｔａｇ２マウスを、２５ｍｇ／ｋｇの投与量で抗体４０−１２又は対照抗体によってＷｅｅｋ１０から１３の間に週に１回皮下で治療する。１３週間後、マウスを屠殺する。腫瘍体積、更には膵臓１つ当たりの腫瘍の数、及び血管密度を決定する。抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２による治療は、腫瘍体積を有意に５５％減少させることを可能にするが、一方で対照抗体は、効果を示さない（図１１Ｂ）。抗体４０−１２はまた、対照と比較して膵臓１つ当たりの腫瘍の数を３４％減少させることをも可能にする（図１１Ｃ）。腫瘍体積のこの減少は、小血管、中血管又は大血管の数のいずれについても血管密度の減少を伴う（図１１Ｄ）。

【図11B】抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２は、腫瘍血管形成を阻害することによってＲｉｐＴａｇマウスモデルの膵腫瘍の発育を低下させるができる。Ｒｉｐ１−Ｔａｇ２モデルは、トランスジェニックマウスが膵島のインスリン産生β細胞におけるＳＶ４０Ｔ抗原を発現するマウスモデルである（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、９−１５：１１５−２２頁）。このＴ抗原は、見かけ上の効果なしで、生後４−５週間まで膵臓の胚発育の間発現する。次いで、Ｔ抗原を発現する膵島の一部が、次の５週間の間に、血管系の活性化を伴う血管形成膵島の形成の方に、次いで腺腫瘍型の小さな腫瘍の発育の方に進行する。数週間後、幾つかの腺腫瘍が発育し、侵食癌を形成する（図１１Ａ）。 これらのＲｉｐ１−Ｔａｇ２マウスを、２５ｍｇ／ｋｇの投与量で抗体４０−１２又は対照抗体によってＷｅｅｋ１０から１３の間に週に１回皮下で治療する。１３週間後、マウスを屠殺する。腫瘍体積、更には膵臓１つ当たりの腫瘍の数、及び血管密度を決定する。抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２による治療は、腫瘍体積を有意に５５％減少させることを可能にするが、一方で対照抗体は、効果を示さない（図１１Ｂ）。抗体４０−１２はまた、対照と比較して膵臓１つ当たりの腫瘍の数を３４％減少させることをも可能にする（図１１Ｃ）。腫瘍体積のこの減少は、小血管、中血管又は大血管の数のいずれについても血管密度の減少を伴う（図１１Ｄ）。

【図11C】抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２は、腫瘍血管形成を阻害することによってＲｉｐＴａｇマウスモデルの膵腫瘍の発育を低下させるができる。Ｒｉｐ１−Ｔａｇ２モデルは、トランスジェニックマウスが膵島のインスリン産生β細胞におけるＳＶ４０Ｔ抗原を発現するマウスモデルである（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、９−１５：１１５−２２頁）。このＴ抗原は、見かけ上の効果なしで、生後４−５週間まで膵臓の胚発育の間発現する。次いで、Ｔ抗原を発現する膵島の一部が、次の５週間の間に、血管系の活性化を伴う血管形成膵島の形成の方に、次いで腺腫瘍型の小さな腫瘍の発育の方に進行する。数週間後、幾つかの腺腫瘍が発育し、侵食癌を形成する（図１１Ａ）。 これらのＲｉｐ１−Ｔａｇ２マウスを、２５ｍｇ／ｋｇの投与量で抗体４０−１２又は対照抗体によってＷｅｅｋ１０から１３の間に週に１回皮下で治療する。１３週間後、マウスを屠殺する。腫瘍体積、更には膵臓１つ当たりの腫瘍の数、及び血管密度を決定する。抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２による治療は、腫瘍体積を有意に５５％減少させることを可能にするが、一方で対照抗体は、効果を示さない（図１１Ｂ）。抗体４０−１２はまた、対照と比較して膵臓１つ当たりの腫瘍の数を３４％減少させることをも可能にする（図１１Ｃ）。腫瘍体積のこの減少は、小血管、中血管又は大血管の数のいずれについても血管密度の減少を伴う（図１１Ｄ）。

【図11D】抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２は、腫瘍血管形成を阻害することによってＲｉｐＴａｇマウスモデルの膵腫瘍の発育を低下させるができる。Ｒｉｐ１−Ｔａｇ２モデルは、トランスジェニックマウスが膵島のインスリン産生β細胞におけるＳＶ４０Ｔ抗原を発現するマウスモデルである（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、９−１５：１１５−２２頁）。このＴ抗原は、見かけ上の効果なしで、生後４−５週間まで膵臓の胚発育の間発現する。次いで、Ｔ抗原を発現する膵島の一部が、次の５週間の間に、血管系の活性化を伴う血管形成膵島の形成の方に、次いで腺腫瘍型の小さな腫瘍の発育の方に進行する。数週間後、幾つかの腺腫瘍が発育し、侵食癌を形成する（図１１Ａ）。 これらのＲｉｐ１−Ｔａｇ２マウスを、２５ｍｇ／ｋｇの投与量で抗体４０−１２又は対照抗体によってＷｅｅｋ１０から１３の間に週に１回皮下で治療する。１３週間後、マウスを屠殺する。腫瘍体積、更には膵臓１つ当たりの腫瘍の数、及び血管密度を決定する。抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２による治療は、腫瘍体積を有意に５５％減少させることを可能にするが、一方で対照抗体は、効果を示さない（図１１Ｂ）。抗体４０−１２はまた、対照と比較して膵臓１つ当たりの腫瘍の数を３４％減少させることをも可能にする（図１１Ｃ）。腫瘍体積のこの減少は、小血管、中血管又は大血管の数のいずれについても血管密度の減少を伴う（図１１Ｄ）。

【図12】ヒト又はマウスのＦＧＦ−Ｒ４の完全細胞外ドメイン、更にそのＤ１ドメインから欠失したＦＧＦ−Ｒ４の細胞外ドメインを認識する抗体４０−１２及び６４−１２の能力がＥＬＩＳＡによって測定される。クローン４０−１２は、等しく３つのＦＧＦ−Ｒ４構築物と結合することができるが、一方でクローン６４−１２は、ＦＧＦ−Ｒ４のマウスの型をあまり認識しない。

【図13A】ＦＧＦ２／ＦＧＦ−Ｒ４結合に対する抗ＦＧＦＲ４抗体クローン４０−１２の拮抗的効果を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｎｍによって標識されるＦＧＦ２との競合結合実験によって測定する。クローン４０−１２は、同じ有効性（それぞれヒト、マウス又はラット複合体について３５００、４１１０及び３９４０ｎｇ／ｍｌ、即ち２３、２７及び２６ｎＭ）によってＦＧＦ−Ｒ４受容体のヒト、マウス又はラット型をコードするｃＤＮＡによってトランスフェクトされたマウス３００−１９細胞上のヒト（図１３Ａ）、マウス（図１３Ｂ）及びラット（図１３Ｃ）ＦＧＦ２の結合を抑止することができる。

【図13B】ＦＧＦ２／ＦＧＦ−Ｒ４結合に対する抗ＦＧＦＲ４抗体クローン４０−１２の拮抗的効果を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｎｍによって標識されるＦＧＦ２との競合結合実験によって測定する。クローン４０−１２は、同じ有効性（それぞれヒト、マウス又はラット複合体について３５００、４１１０及び３９４０ｎｇ／ｍｌ、即ち２３、２７及び２６ｎＭ）によってＦＧＦ−Ｒ４受容体のヒト、マウス又はラット型をコードするｃＤＮＡによってトランスフェクトされたマウス３００−１９細胞上のヒト（図１３Ａ）、マウス（図１３Ｂ）及びラット（図１３Ｃ）ＦＧＦ２の結合を抑止することができる。

【図13C】ＦＧＦ２／ＦＧＦ−Ｒ４結合に対する抗ＦＧＦＲ４抗体クローン４０−１２の拮抗的効果を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｎｍによって標識されるＦＧＦ２との競合結合実験によって測定する。クローン４０−１２は、同じ有効性（それぞれヒト、マウス又はラット複合体について３５００、４１１０及び３９４０ｎｇ／ｍｌ、即ち２３、２７及び２６ｎＭ）によってＦＧＦ−Ｒ４受容体のヒト、マウス又はラット型をコードするｃＤＮＡによってトランスフェクトされたマウス３００−１９細胞上のヒト（図１３Ａ）、マウス（図１３Ｂ）及びラット（図１３Ｃ）ＦＧＦ２の結合を抑止することができる。

【図14A】ｈＦＧＦＲ４＿Ｄ１：Ｆｃの発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４７９４の地図である。

【図14B】プラスミドｐＸＬ４７９４によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３系において分泌されたｈＦＧＦＲ４＿Ｄ１：Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。

【図15A】ｈＦＧＦＲ４＿Ｄ２：Ｆｃの発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４７９６の地図である。

【図15B】プラスミドｐＸＬ４７９６によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３系において分泌されたｈＦＧＦＲ４＿Ｄ２：Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。

【図16A】ｈＦＧＦＲ４＿Ｄ３：Ｆｃの発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４７９９の地図である。

【図16B】プラスミドｐＸＬ４７９９によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３系において分泌されたｈＦＧＦＲ４＿Ｄ３：Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。

【0176】

（実施例）

【実施例1】

【0177】

血管形成の制御の際のＦＧＦ−Ｒ４の役割の実証
血管形成の制御におけるＦＧＦ−Ｒ４の役割を実証するため、インビトロでの血管形成実験を、幾つかのＦＧＦ：ＦＧＦ２（ＦＧＦ受容体のほとんどを活性化するリガンド）、ＦＧＦ１９（ＦＧＦ−Ｒ４を特異的に活性化するリガンド）及びＦＧＦ４（ＦＧＦ−Ｒ４を活性化しないリガンド）によって刺激したＨＵＶＥＣ型のヒト内皮細胞によって実施した。

【0178】

これを行うため、コラーゲン（ラットＴａｉｌコラーゲン、Ｉ型：Ｂｅｃｔｏｎ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ３５４２３６）中に６倍に希釈した１６０μｌのマトリゲル（成長因子減少型Ｍａｔｒｉｇｅｌ：Ｂｅｃｔｏｎ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ３５６２３０）をチャンバースライド（Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｅｌｌｗａｒｅコラーゲン、Ｉ型、８ウェル培養スライド：Ｂｅｃｔｏｎ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ３５４６３０）の各ウェル内に分注することによってゲルを調製した。ゲルを、重合することができるように３７℃で１時間維持する。次に、ヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ ｒｅｆ：Ｃ−１２２００−Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を、４００μｌのＥＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃ３１２１）＋２％のＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌのｈＥＧＦ中において１５×１０^３個／ウェルで播種した。このプロトコルは、９６−ウェルプレート：９６ウェルプレート（ＢｉｏｃｏａｔコラーゲンＩ ｃｅｌｌｗａｒｅ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ３５４４０７）のウェル１つにつき６０μｌに応用され得る。マトリゲルの１／３と、１ｍｇ／ｍｌの終濃度のコラーゲンと、ＮａＯＨ（０．０２６×μｌにおけるコラーゲンの体積）と、１×ＰＢＳとを混合することによってマトリックスを調製し、次いで水によって体積を調整する。５％のＣＯ_２の存在下で３７℃で２４時間、１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ、１３３−ＦＢ−０２５）又は１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ、２３５−Ｆ４−０２５）若しくはＦＧＦ１９（Ｒ＆Ｄ、９６９−ＦＧ−０２５）によって内皮細胞を刺激する。２４時間後、形成された微小管のネットワークの長さを、コンピュータを利用した画像解析システム（Ｉｍａｇｅｎｉａ Ｂｉｏｃｏｍ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して測定し、各ウェルにおける擬管の全長を決定する。微小毛細血管ネットワークの全長の平均を、６つの複製の平均に対応する各条件についてμｍにおいて算出する。

【0179】

ＦＧＦ２又はＦＧＦ１９による刺激は、新しい細管の形成の誘導を可能にするが、一方でＦＧＦ４は、効果を有さない（図１Ａ）。これらの結果は、ＦＧＦ−Ｒ４の特異的活性化が、新血管の形成を誘導することを可能にし、したがってＦＧＦ−Ｒ４がインビトロにおいて血管形成を制御すると結論することを可能にすることを示す。

【0180】

インビトロにおけるデータとのインビボにおける相関性を、マウスにおけるセルロースインプラントにおいてインビボにおける血管形成誘導のモデルを使用して得た。このモデルは、Ａｎｄｒａｄｅら（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７年、５４、２５３−６１頁）によって記載されるモデルの応用である。

【0181】

動物（先天的に白色のＢＡＬＢ／ｃ Ｊマウス）を、腹腔内投与されるキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、１０ｍｇ／ｋｇ）／ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ１０００、１００ｍｇ／ｋｇ）混合物によって麻酔する。動物の背部を剃り、Ｈｅｘｏｍｅｄｉｎｅ（登録商標）によって消毒する。５ｍｌの無菌空気の注射によってマウスの背部の皮下に空気のポケットを作製する。タンパク質又は試験すべき生成物を含有する５０μｌの滅菌溶液が含浸された滅菌セルロースインプラント（直径１ｃｍ、２ｍｍ厚のディスク、Ｃｅｌｌｓｐｏｎ（登録商標）ｒｅｆ０５０１）を導入するため、動物の上背部上に約２ｃｍの切開を行う。次いで切開を縫合し、Ｈｅｘｏｍｅｄｉｎｅ（登録商標）によって洗浄する。インプラントの注入後の日の間、マウスは、インプラントにおいて、ガス麻酔（５％のイソフルラン（Ａｅｒｒａｎｅ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ））下で皮膚を介した注射（５０μｌ／インプラント／日）によってタンパク質又は生成物の投与を受けた。

【0182】

スポンジのインプラントの７日後、マウスを、腹腔内投与される致死量のペントバルビタールナトリウム（ＣＥＶＡ ｓａｎｔｅ ａｎｉｍａｌｅ）によって屠殺する。次いで、皮膚及びスポンジを除去するため、スポンジの周囲約１ｃｍの皮膚を、瘢痕を回避して切除する。次いで、スポンジを幾つかの部分に切り、１ｍｌの溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ、Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲｉｂｏｌｙｓｅｒ（登録商標）チューブ内に配置する。細胞破砕機（ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）ＦＰ１２０）において、チューブを、２０秒間、ｆｏｒｃｅ４で４回連続的に振盪する。次いで、チューブを、２０℃で２０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を、ヘモグロビンアッセイを待つ間、−２０℃で凍結する。

【0183】

アッセイの日に、チューブを、融解後に再度遠心分離し、ヘモグロビン濃度を、標準範囲のウシヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ）に対する４０５ｎｍの分光光度計における読み取りによってＤｒａｂｋｉｎ試薬（Ｓｉｇｍａ、体積／体積）によって測定する。各試料におけるヘモグロビン濃度を、標準範囲に基づいて実施される多項回帰に従ってｍｇ／ｍｌで表す。結果を、各群について平均値（±ｓｅｍ）で表す。群間差をＡＮＯＶＡによって試験した後、値の平方根におけるダネット検定を行う。

【0184】

このモデルにおいて、１部位につき５０ｎｇの、５回の再注射のＦＧＦ１９は、１部位につき５ｎｇのＦＧＦ２と同じ有効性によって、新しく形成された成熟血管によって有意にスポンジのコロニー形成を誘導することができる。スポンジにおける機能的血管の存在は、ヘモグロビンの存在によって実証される（図１Ｂ）。これらの結果は、ＦＧＦ−Ｒ４の特異的活性化が機能的血管の漸増を可能にすることを示しており、このことは、ＦＧＦ−Ｒ４もインビボにおける血管形成を制御することを示す。

【実施例2】

【0185】

イムノゲン及び抗原として使用されるＦＧＦＲタンパク質の記載
ＦＧＦＲ成長因子受容体、及び特にＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ２、ＦＧＦ−Ｒ３、ＦＧＦ−Ｒ４の細胞外ドメインを、標識（Ｈｉｓｔａｇ）又は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合する。

【0186】

ヒトＦＧＦ−Ｒ４の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡは、Ｌ１３６Ｐ突然変異を有するＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＦＧＦ−Ｒ４＿ＨＵＭＡＮ１−３６５位に記載されるタンパク質に対応する。細胞外ドメインにおけるＣ末端の位置においてＨｉｓｔａｇを含むタンパク質を発現するため、図２において表される真核生物発現ベクターｐＸＬ４６１４にそれをクローン化した。

【0187】

配列番号４０の配列のｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇと呼ばれるタンパク質を、出願ＷＯ２００８／０６５５４３に記載されるように２種のＮ−グリカングリコシル化酵素、即ち、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を可能にするプラスミドｐＸＬ４６１４、並びにヘルパープラスミドｐＸＬ４５４４及びｐＸＬ４５５１を使用してＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における一過性トランスフェクションによって作製した。

【0188】

ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞培養液上清において発現するｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇタンパク質を、Ｎｉ−キレート化セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｒｅｆ．１７−０５７５−０１）上のクロマトグラフィーによって精製し、イミダゾール緩衝液において溶出を行い、次いでＰＢＳ緩衝液において配合した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ．１４１９０−０９４）。Ｓａｄｄｉｃら、２００２年（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４：２３−３６及びＡｎｕｍｕｌａら、１９９８年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ８：６８５−６９４頁）によって記載される通りの単糖組成物の分析及びＮ−グリカンのシアル酸の定量化は、タンパク質が非常に高度にシアル酸付加された（９１％）ことを実証することを可能にした。したがって、タンパク質は、十分な薬物動態学的性質を有するための全ての特性を有した。

【0189】

同様の方法において、ｈＦＧＦＲ４−Ｓｔｒｅｐｔａｇタンパク質（配列番号６９）を、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＩＢＡ、ｒｅｆ．２−１２０６）上のクロマトグラフィーによって精製し、デスチオビオチン緩衝液において溶出を行い、次いでＰＢＳ緩衝液において配合する。

【0190】

ｈＦＧＦＲ４（Ｄ２、Ｄ３）−Ｈｉｓｔａｇタンパク質は、配列番号４２の配列に対応する。ｃＤＮＡを、図３において表される真核生物発現プラスミドｐＸＬ４６１５にクローン化し、ｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇタンパク質と同様の条件下でタンパク質を作製し、精製した。

【0191】

ｍＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇタンパク質（配列番号４３）をコードするｃＤＮＡを、図４において表される真核生物発現プラスミドｐＸＬ４６２１にクローン化し、ｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇタンパク質と同様の条件下でタンパク質を作製し、精製した。

【0192】

ｈＦＧＦＲ１−Ｆｃタンパク質（配列番号４６）は、Ｃ末端の位置においてヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合するヒトＦＧＦ−Ｒ１ ＩＩＩｃの細胞外ドメインを含む。ｃＤＮＡを、図５において表される真核生物発現プラスミドｐＸＬ４７２８にクローン化し、タンパク質を、ｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇタンパク質と同様の条件下で作製し、次いで、タンパク質Ｇセファロースアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のクロマトグラフィーによって精製し、１００ｍＭのグリシン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７）において溶出を行い、次いでＰＢＳ緩衝液において配合した。

【0193】

ｈＦＧＦＲ２−Ｆｃタンパク質（配列番号４８の配列）は、Ｃ末端の位置においてヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合するヒトＦＧＦ−Ｒ２ ＩＩＩｃの細胞外ドメインを含む。ｃＤＮＡを、図６において表される真核生物発現プラスミドｐＸＬ４３２７にクローン化し、タンパク質を、ｈＦＧＦＲ１−Ｆｃタンパク質と同様の条件下で作製し、次いで精製した。

【0194】

ｈＦＧＦＲ３−Ｆｃタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにヒトＦＧＦ−Ｒ３ ＩＩＩｃの細胞外ドメインを融合するタンパク質であり、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した（ｒｅｆ：７６０−ＦＲ）。

【0195】

ｈＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにヒトＦＧＦ−Ｒ４の細胞外ドメインを融合するタンパク質であり、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した（ｒｅｆ：６８５−ＦＲ）。

【0196】

ｈＦＧＦＲ４タンパク質の細胞外部分の各種サブドメインを、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合した。Ｄ１サブドメインは、構築物ＳＡＢＶＡ４７９４（配列番号１１２、並びに図１４Ａ及び１４Ｂ）に含まれる。Ｄ２サブドメインは、構築物ＳＡＢＶＡ４７９６（配列番号１１４、並びに図１５Ａ及び１５Ｂ）に含まれる。Ｄ３サブドメインは、構築物ＳＡＢＶＡ４７９９（配列番号１１６、並びに図１６Ａ及び１６Ｂ）に含まれる。これらの３つのサブドメインは、それぞれ、ＳＡＢＶＡ４７９４については１位から１７９位、ＳＡＢＶＡ４７９６については１位から３２位、更に１４５位から２４２位、ＳＡＢＶＡ４７９９については１位から３２位、更に２２８位から３６０位（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＦＧＦ−Ｒ４＿ＨＵＭＡＮにおいて記載される位置）で延長する。これらを、ＦＧＦＲ１−Ｆｃタンパク質と同様の条件下でプラスミドｐＸＬ４７９４（配列番号１１１のコード配列）、ｐＸＬ４７９６（配列番号１１３のコード配列）及びｐＸＬ４７９９（配列番号１１５のコード配列）を使用して作製した。

【実施例3】

【0197】

抗ＦＧＦ−Ｒ４モノクローナル抗体の生成及びスクリーニング
Ａ−免疫化によって得られる抗体
６から８週齢の５匹のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（各々は、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら（１９９７年、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１６：３８１３８９）によって記載されるＲＩＭＭＳ法及びＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｒｅｆ０３８００）に記載される融合プロトコルによって合計２４μｇのｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇによって免疫化される）におけるｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇイムノゲンによる免疫化によってモノクローナル抗体を得た。

【0198】

最後の注射の２日後、マウスを屠殺し、リンパ節を、ポリエチレングリコール（ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹ、ｒｅｆ．０３８０６）の存在下で５：１の比率でＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８０）と融合した。細胞懸濁液を、５％のＣＯ_２の存在下、３７℃でインキュベートされるペトリ皿に無菌的に分注した。インキュベーションの１２日後に出現したコロニーを単離し、９６ウェルプレートにおいて培地Ｅ（ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹ、ｒｅｆ．０３８０５）において培養した。

【0199】

ｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇによる免疫化によって得られたモノクローナル抗体の一次スクリーニングを、捕獲抗原としてｈＦＧＦＲ４−Ｓｔｒｅｐｔａｇを使用してＥＬＩＳＡアッセイによって実施した。捕獲抗原は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）に結合した。続いて、ハイブリドーマ培養液上清を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ９０４４−１：５００００に希釈）を使用して検出を行った。明示化をＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ｒｅｆ ＵＰ６６４７８０）によって実施し、測定を４５０ｎｍでプレートリーダによって実施した。試験した４４４のハイブリドーマの中で、１２９が、ｈＦＧＦＲ４−Ｓｔｒｅｐｔａｇ抗原とＥＬＩＳＡアッセイによって陽性であり、これらのハイブリドーマの内の１２０もまた、ｈＦＧＦＲ４−Ｆｃダイマータンパク質と陽性であった。

【0200】

ＦＧＦ−Ｒ４特異的抗体だけを選択するために、ｈＦＧＦＲ４−Ｓｔｒｅｐｔａｇタンパク質を捕獲抗原として使用してＥＬＩＳＡアッセイによって二次スクリーニングを行い、次いで実施例２に記載されるｈＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ｈＦＧＦＲ２−Ｆｃ及びｈＦＧＦＲ３−Ｆｃタンパク質によって行った。捕獲抗原は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）に結合した。続いて、ハイブリドーマ培養液上清を添加し、次いで、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ９０４４−１：５００００に希釈）を使用して検出を行った。明示化をＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ｒｅｆ ＵＰ６６４７８０）によって実施し、測定を４５０ｎｍでプレートリーダによって実施した。抗原とＥＬＩＳＡアッセイによって陽性反応を示した１２９のハイブリドーマの中で、８４のハイブリドーマがｈＦＧＦＲ４−Ｓｔｒｅｐｔａｇと陽性であり、ｈＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ｈＦＧＦＲ２−Ｆｃ、ｈＦＧＦＲ３−Ｆｃのいずれとも親和性を有さなかった。それらの成長及びそれらの形態の機能として、３９のハイブリドーマを保存した。それらのアイソタイプを、ＳＥＲＯＴＥＣキット（ｒｅｆ．ＭＭＴ１）を使用して決定し、９５％がＩｇＧ１であった。

【0201】

抗ＦＧＦＲ４抗体による阻害を特徴付けるため、Ｂａｆ／３改変細胞のＦＧＦ２誘導増殖についての試験において三次スクリーニングを行った。

【0202】

抗ＦＧＦＲ４拮抗薬抗体を発現するマウスハイブリドーマを、限界希釈法によってクローン化した。指数増殖期において培養したハイブリドーマ細胞を使用して、コード配列（ｃＤＮＡ）を、Ｏｌｉｇｏｔｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ、ｒｅｆ７２０２２）を使用してｍＲＮＡの抽出の後決定し、Ｇｅｎｅ Ｒａｃｅｒキット、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ Ｌ１５００）及び下記の表２に記載されるプライマーによるＲＡＣＥ−ＲＴ法によるｃＤＮＡの作製及び増幅、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、ｒｅｆ．Ｆ−５３０Ｓ）、表２に記載されるプライマー及び温度条件を使用するｃＤＮＡフラグメントの増幅を行った。ＶＨ（重鎖ＨＣの可変領域）又はＶＬ（軽鎖ＬＣの可変領域）に対するコード領域を含む増幅フラグメントを、Ｐｒｏｍｅｇａ、ｒｅｆ Ａ１３７ＡからのｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローン化し、得られたプラスミドの挿入物を配列決定し、それにより各可変ドメインのコード配列を、抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２及び抗ＦＧＦＲ４抗体６４−１２に対応する少なくとも６つのプラスミドにおいて５’−３’及び３’−５’方向において解析した。配列、コンティグ及びアラインメントの解析を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において利用可能なソフトウェアを使用して行った。

【0203】

抗ＦＧＦＲ４抗体の可変領域をコードするコンセンサス配列を含むプラスミドを保存した。下記の表２に示すように、プラスミドｐＸＬ４６９１は、抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２の配列番号５の配列のＶＨをコードする配列を含み、プラスミドｐＸＬ４６９３は、抗ＦＧＦＲ４抗体６４−１２の配列番号１９の配列のＶＨをコードする配列を含む。

【0204】

下記の表２に示すように、プラスミドｐＸＬ４６９０は、抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２の配列番号８の配列のＶＬをコードする配列番号７のヌクレオチド配列を含み、プラスミドｐＸＬ４６９２は、抗ＦＧＦＲ４抗体６４−１２の配列番号２２の配列のＶＬをコードする配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。

【0205】

表２−逆転写酵素及びＰＣＲ反応の操作条件及び解析−プラスミドｐＸＬ４６９０からｐＸＬ４６９３の同定。

【0206】

【表1】

【0207】

それぞれ抗ＦＧＦＲ４抗体６４−１２及び抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２の軽可変領域及び重可変領域のアミノ酸配列は異なる。使用され、得られ、推測される配列の数を表７に示す。

【0208】

抗体４０−１２及び６４−１２を、Ｔ５００フラスコにおいて作製した。培養液上清を、７日後に採取した。抗ＦＧＦＲ４抗体を、タンパク質Ｇにおいて親和性精製し、次いでＰＢＳに対して透析し、滅菌濾過し、４℃で保存した。

【0209】

精製された拮抗薬抗体は、６．５×１０^−９Ｍ（抗ＦＧＦＲ４ ４０−１２）及び５．７５×１０^−８Ｍ（抗ＦＧＦＲ４ ６４−１２）のＫ_Ｄを有する。

【0210】

Ｂ−ファージディスプレイ法を使用して選択される抗体
ｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇによるファージディスプレイによって得られたモノクローナル抗体の一次スクリーニングを、捕獲抗原としてｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇを使用してＥＬＩＳＡアッセイによって行った。捕獲抗原は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−２酵素結合プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）に結合した。続いて、ファージを感染させた大腸菌からの培養液上清を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｒｅｆ．２７−９４２１−０１、１：５０００に希釈）を使用して検出を行った。明示化をＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ｒｅｆ ＵＰ６６４７８０）によって実施し、光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定を４５０ｎｍで行った。

【0211】

ＦＧＦ−Ｒ４特異的抗体だけを選択するために、ｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇタンパク質を捕獲抗原として使用してＥＬＩＳＡアッセイによって二次スクリーニングを行い、次いで実施例２に記載されるｈＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ｈＦＧＦＲ２−Ｆｃ及びｈＦＧＦＲ３−Ｆｃタンパク質によって行った。捕獲抗原は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−２酵素結合プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）に結合した。続いて、ファージを感染させた大腸菌からの培養液上清を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｒｅｆ．２７−９４２１−０１、１：５０００に希釈）を使用して検出を行った。明示化をＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ｒｅｆ ＵＰ６６４７８０）によって実施し、光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定を４５０ｎｍで行った。

【0212】

選択されたＦＧＦ−Ｒ４特異的クローンを配列決定し、ＨＥＫ２９３細胞の一過性のトランスフェクションのための発現ベクターに再クローン化した。

【0213】

このために、第一ステップにおいて、Ｆａｂをコードする領域、即ち、抗体の軽鎖、細菌リボソーム結合部位、及び抗体の重鎖可変領域を、リストリクションによってファージミドから抽出し、哺乳類細胞のためのＩｇＧ発現プラスミド、真核生物抗体シグナル配列の下流側、及びヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域の上流側に挿入する。第二ステップにおいて、細菌リボソーム結合部位と重鎖のための細菌シグナルペプチドとを含む領域をＩＲＥＳ配列及び真核生物シグナル配列に対して交換する。ＩｇＧは、ＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションによって発現する。この方法は、Ｔ．Ｊｏｓｔｏｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２８９（２００４）６５−８０頁において詳細に記載されている。

【0214】

本発明において使用され得るヒトＩｇＧ１定常領域配列の例は、配列番号１１７の配列である。

【0215】

抗体発現ベクターを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの培養液上清を使用して、抗ＦＧＦＲ４抗体による阻害を特徴付けるため、実施例４に記載される改変Ｂａｆ／３細胞のＦＧＦ２誘導増殖についての試験において三次スクリーニングを行った。このスクリーニングは、クローン８、３１、３３及び３６の抗体を同定することを可能にした。対応配列を表７に記載する。

【実施例4】

【0216】

ＢａＦ／３ ＦＧＦ−Ｒ４−ｈＭｐｌマウスクローン系及び細胞増殖プロトコルの確立
５’位におけるキメラＦＧＦ−Ｒ４−ｈＭｐｌ受容体の前のＨＡ標識の存在を得るため、突然変異ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａベクターに、ｈＭｐｌの細胞内ドメインを有する翻訳融合としてＦＧＦ−Ｒ４の細胞外及び膜貫通ドメインをクローン化した。

【0217】

突然変異ｐＥＦ６Ａの構築
ｐＤｉｓｐｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｖ６６０−２０）のＩｇＧｋのシグナルペプチドの下に配置されるＨＡ標識と会合するＭＣＳ（マルチクローニング部位）を一体化するため、ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｖ９６１−２０）を改善させた。これを行うため、ＨＡ標識及びそのシグナルペプチドと会合するＭＣＳを、配列番号５１の配列のセンスプライマーと配列番号５２の配列の後方プライマーとの間でＰＣＲによって増幅し、それによって、５’位においてＫｐｎｌ制限部位を、３’位においてＸｂａｌ制限部位を挿入することが可能になった。ＰＣＲフラグメントを、Ｋｐｎｌ及びＸｂａｌ酵素によって消化させ、次いで同じ酵素によって切開されるｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ Ａベクターにクローン化した。最後に、ＭＣＳの第１のＢａｍＨＩ部位を、新しく形成されたベクターをＫｐｎｌ及びＳｐｅｌ酵素によって消化し、これらの部位の間に、相互にハイブリダイズされ、ＢｓｒＧＩ酵素部位を含む配列番号５３及び配列番号５４の配列のプライマーを挿入することによってＢｓｒＧＩ部位と置換した。得られたベクターを、ｐＥＦ６ｍｕｔ−ＨＡと呼んだ。

【0218】

ｐＥＦ６ｍｕｔ−ＨＡ−ＦＧＦ−Ｒ４−ｈＭｐｌベクターの構築
Ｍｐｌの細胞内ドメインを、Ｓａｃｌ消化部位の挿入を可能にする配列番号５５の配列のセンスプライマーと一般にｒｅｖＢＧＨと呼ばれる配列番号５６の配列の後方プライマーとの間のベクターｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｋ９６１０−２０）において増幅した。次いで、生成したＰＣＲフラグメントを、Ｓａｃｌ及びＮｏｔｌ酵素によって消化させた。

【0219】

ＦＧＦ−Ｒ４の細胞外及び膜貫通ドメインを、一対のプライマーを使用して増幅した（センス：配列番号５７の配列、後方：配列番号５８の配列）。これらのプライマーは、５’位においてＢａｍＨＩ酵素部位を、３’位においてＳａｃｌ酵素部位を挿入することを可能にする。次いで、得られたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＳａｃｌ酵素によって消化させた。

【0220】

次いで、ｈＭｐｌをコードするＤＮＡの増幅物と、ＦＧＦ−Ｒ４をコードするＤＮＡの増幅物とを、ＢａｍＨＩ−Ｎｏｔｌによって切開したｐＥＦ６ｍｕｔ−ＨＡベクターに同時にクローン化した。得られた構築物を、「ｐＥＦ６ｍｕｔ−ＨＡ ＦＧＦ−Ｒ４αＩＩＩｃ−ｈＭｐｌ２」と呼んだ。次いで、配列番号６０の配列をＦＧＦ−Ｒ４の膜貫通ドメイン（配列番号５９のタンパク質配列）と取り替えるため、この構築物を部位特異的変異誘発によって改善した。これを行うため、「ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００５１８）を、配列番号６１の配列のセンスプライマーと配列番号６２の配列の後方プライマーと共に使用した。得られた新しいキメラ構築物を、ｐＥＦ６ｍｕｔ−ＨＡ ＦＧＦ−Ｒ４αＩＩＩｃｍｕｔ−ｈＭｐｌ２と呼んだ。

【0221】

ＦＧＦ−Ｒ４αＩＩＩｃｍｕｔ−ｈＭｐｌ２構築物によるＢａＦ／３マウス系のトランスフェクションによる安定系の作製
「ｐＥＦ６ｍｕｔ−ＨＡ ＦＧＦ−Ｒ４αＩＩＩｃｍｕｔ−ｈＭｐｌ２」構築物を、ＢａＦ／３マウス細胞のゲノムにエレクトロポレーションによって安定して導入した。得られた系を、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２３４−ＦＳＥ−０２５）及び１００ｎｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｈ３１４９）の存在下で選択した。次いで、トランスフェクトされ、選択された系は、クローン型である。

【0222】

ＢａＦ／３ ＦＧＦＲ４−ｈＭｐｌ細胞系による細胞増殖プロトコル
ＢａＦ／３ ＦＧＦＲ４―ｈＭｐｌ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ２３４−ＦＳＥ）及び３ｎｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ Ｈ３１４９）を補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ．３２４０４−０１４）（１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ｒｅｆ．ＳＨ３００７０．０３）、２ｍＭグルタミン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、ｒｅｆ１１１４０−０３５）、１×ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、ｒｅｆ１１３６０−０３９））において培養し、維持した。Ｄａｙ１に、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２と３ｎｇ／ｍｌのヘパリンとを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地において細胞を０．４×１０^６個／ｍｌで播種する。翌日、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２と３ｎｇ／ｍｌのヘパリンとを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地における０．２×１０^６個／ｍｌの５０μｌのＢａＦ／３ ＦＧＦＲ４−ｈＭｐｌ細胞懸濁液を９６ウェルプレート（Ｐｏｒｖａｉｒ、ｒｅｆ２１４００６）に分注した後、試験される抗体を含む５０μｌのハイブリドーマ上清を分注した。次いで、プレートを３７℃で２４から３０時間、５％ＣＯ_２で配置した。細胞増殖を読み取るため、ＡＴＰの量を、１００μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｒｅｆ Ｇ７５７１）を添加することによって定量し、ルミノメータを使用してルミネセンスを読み取った。

【0223】

この試験において２０ｎｇ／ｍｌの添加剤ＦＧＦ２と３ｎｇ／ｍｌのヘパリンとを含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地よりも５０％弱いシグナルを示すクローンを選択した。

【0224】

ＦＧＦ−Ｒ４に特異的な抗ＦＧＦＲ４抗体を、Ｂａｆ／３−ＦＧＦＲ４−ｈＭｐｌ細胞と以下の２０ｎｇ／ｍｌの添加剤ＦＧＦ２及び３ｎｇ／ｍｌのヘパリンとによってインキュベートした際、細胞増殖に対する拮抗薬効果を認めた。試験した３９のハイブリドーマの中で、１４が、ＦＧＦ２の存在下でＢａｆ／３−ＦＧＦＲ４−ｈＭｐｌ細胞のＦＧＦ誘導細胞増殖を阻害することができる。

【0225】

抗ＦＧＦＲ４拮抗薬抗体４０−１２及び６４−１２がマウスタンパク質ｍＦＧＦＲ４及びヒトタンパク質ｈＦＧＦＲ４（Ｄ２、Ｄ３）に対する親和性を有したことがＥＬＩＳＡ（図１２）によって示された。

【0226】

最後に、抗ＦＧＦＲ４抗体の親和定数を決定するため、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＢｌＡｃｏｒｅ ２０００）によって最後のスクリーニングを行った。ハイブリドーマ培養液上清中に存在するＦＧＦ−Ｒ４タンパク質と抗ＦＧＦＲ４抗体との間の相互作用を、抗Ｆｃ抗体に抗ＦＧＦＲ４抗体が結合し、それ自体がＣＭチップに結合した後で解析した。Ｃａｎｚｉａｎｉら、２００４年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２５：３０１−３０７頁のプロトコルに従って動態を測定する。

【0227】

１０^−８から１０^−９Ｍの親和定数及び１０^−３から１０^−５ｓ^−１の解離速度を有するものの中の２つの抗体を選択した。これらの抗体の特性は、下記の表１に記載される。

【0228】

Ｋ_Ｄを決定するために使用される参照方法は、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ）である。

【0229】

【表2】

【0230】

【表3】

【実施例5】

【0231】

抗ＦＧＦＲ４抗体の特異性
Ａ−ＦＧＦ−Ｒ４に対する抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２の特異性
各抗体の特異性を、実施例４に記載されるプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによって確立する。このようにして、各ＦＧＦ−Ｒに結合する各抗体の能力を観察する。この実験は、抗体４０−１２がＦＧＦ−Ｒ４だけを認識し、したがってＦＧＦ−Ｒ４に対して特異的であることを明らかに示す。抗体６４−１２は、主にＦＧＦ−Ｒ４に結合し得るが、ＦＧＦ−Ｒ３にも弱く結合する（図７）。

【0232】

Ｂ−ＦＧＦ−Ｒ４に対する抗ＦＧＦＲ４抗体８、３１、３３及び３６の特異性
各抗体の特異性を、以下のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによって確立する。Ｆａｂ形態の抗体を示すその表面におけるファージの懸濁液を、大腸菌細菌の感染によって生成する。捕獲抗原は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−２酵素結合皿（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）に結合した。続いて、ファージ懸濁液を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３ファージマウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｒｅｆ．２７−９４２１−０１、１：５０００に希釈）を使用して検出を行った。明示化をＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ｒｅｆ ＵＰ６６４７８０）によって実施し、光学密度（ＯＤ）測定を４５０ｎｍで行った。得られた結果を表２にまとめる。

【0233】

このようにして、各ＦＧＦ−Ｒに結合する各抗体の能力を観察する。この実験は、抗体８、３１、３３、３６がＦＧＦ−Ｒ４だけを認識し、したがってＦＧＦ−Ｒ４に対して特異的であることを明らかに示す。

【0234】

【表4】

【実施例6】

【0235】

血管形成に対する、抗体４０−１２の、及びクローン８、３１、３３、３６に由来する抗体の拮抗的効果（インビトロ）
ヒト内皮細胞血管形成の経過に亘る抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体４０−１２の生物学的活性を決定するため、１から３０μｇ／ｍｌの漸増投与量で抗体４０−１２又は対照抗体の存在下でＦＧＦ２によって刺激されるＨＵＶＥＣ細胞を使用してインビトロにおける血管形成実験を行った（図８Ａ及び８Ｂ）。

【0236】

この関連において、活性抗ＦＧＦＲ４拮抗薬モノクローナル抗体４０−１２は、３０μｇ／ｍｌ又は２００ｎＭの投与量でＨＵＶＥＣ細胞のＦＧＦ２誘導血管形成を阻害することができるが、対照抗体６４−１２は効果を有さない。更に、抗体４０−１２は、それ自体基底血管形成に対して影響を及ぼさない。

【0237】

これらの結果は、ＦＧＦ−Ｒ４特異的拮抗薬抗体が血管形成を阻害することができることを示す。

【0238】

抗体４０−１２について、ファージディスプレイから誘導されるクローン８、３１、３３及び３６の抗ＦＧＦＲ４抗体を、ＨＵＶＥＣ型のヒト内皮細胞のＦＧＦ−２誘導血管形成を阻害するそれらの能力に関して評価した。これらの４つの抗体は、ＦＧＦ−２によって得られた血管形成のインビトロにおける刺激を抑止し、前記抗体は、１０μｇ／ｍｌの投与量である（図８Ｃ及び８Ｄ）。

【実施例7】

【0239】

ヒト肝臓癌細胞に対する、抗体４０−１２の、及びクローン８、３１、３３及び３６に由来する抗体の拮抗的効果（インビトロ）
抗ＦＧＦＲ４拮抗薬モノクローナル抗体４０−１２の抗腫瘍効果を決定するため、増殖及びそれをもたらすシグナル伝達経路がリガンド−受容体対：ＦＧＦ１９／ＦＧＦ−Ｒ４に依存するＨｅｐ３ｂヒト肝臓癌細胞において実験を行った。

【0240】

最初に、Ｈｅｐ３ｂ細胞の増殖をもたらすＦＧＦ−Ｒ４依存性シグナル伝達経路の研究をウェスタンブロット法によって行った。この細胞シグナル伝達は、ｃＦｏｓ及びＪｕｎＢタンパク質の新合成と、更にＥｒｋ１／２のリン酸化とを含む（Ｌｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２００７年、１４：２７２７７−８４頁）。これを行うため、５×１０^５の細胞を、２ｍｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン）において直径３５ｍｍの皿に播種する。２４時間後、細胞を、１．８ｍｌの無血清培地中において、２４時間、欠失の条件に供する。次いで、対照抗ＦＧＦＲ４抗体又は抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２の非存在下又は存在下で、１０倍に濃縮した２００μｌのＦＧＦ１９によって細胞を３時間刺激する。次いで培地を除去し、細胞を、冷たいＰＢＳによって１回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を補充した７５μｌのＲＩＰＡ緩衝液によって、４℃で３０分間、皿上で溶解する。次いで、総タンパク質抽出物を、１３０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離し、上清をウェスタンブロット法によって解析する。次いで、膜を、ＴＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ、５％乳汁において周囲温度で２時間インキュベートし、次いで、抗ｃＦｏｓ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｒｅｆ２２５０）、抗ＪｕｎＢ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｒｅｆ３７４６）及び抗ホスホＥｒｋ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｒｅｆ４３７７）一次抗体を１／１０００^ｔｈで添加し、ゆっくりと振盪しながら４℃で終夜インキュベートする。膜を、ＴＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎによって３回すすぎ、ＨＲＰに結合させた二次抗体を４℃で４時間インキュベートし、ＴＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ、５％乳汁において１／２０００^ｔｈに希釈する。次いで、Ｃｈｅｍｉｇｅｎｉｕｓ装置（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用してウェスタンブロット法の結果を定量する。各種抗体によって得られたバンドの強度を、ＨＲＰに直接結合し、１／３０００^ｔｈで使用する抗アクチン抗体によって得られたバンドの強度によって重み付ける（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｒｅｆ Ｓｃ−８４３２−ＨＲＰ）。

【0241】

３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９は、ＪｕｎＢ及びｃＦｏｓタンパク質の合成、更にＨｅｐ３ｂ細胞におけるＥｒｋ１／２のリン酸化を誘導する。タンパク質のこの新合成及びＥｒｋのリン酸化は、１００μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２によって完全に阻害されるが、一方で対照抗体は阻害効果を有さない。ウェスタンブロット法の膜（図９Ａ）において観察されるこれらの効果を定量し、各膜のバンドの強度をグラフの形で表す（図９Ｂ）。

【0242】

第２に、細胞増殖実験自体を実施した。５０００の細胞を、１０％ＦＣＳと２ｍＭグルタミンとを含む１００μｌのＤＭＥＭ培地において９６ウェルプレートに播種する。２４時間後、細胞を、２４時間無血清培地において血清除去する。次いで、対照抗体又は抗ＦＧＦＲ４拮抗薬モノクローナル抗体４０−１２の非存在下又は存在下で、Ｈｅｐ３ｂ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ Ｒ＆Ｄにおける内部製造）又は１０％の血清が補充される１００μｌの無血清培地によって７２時間刺激する。３日後、細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して定量する。

【0243】

血清及びＦＧＦ１９がＨｅｐ３ｂ増殖を刺激し得ることは、これらの実験から明らかになる。抗ＦＧＦＲ４拮抗薬抗体４０−１２は、１００μｇ／ｍｌでこの血清誘導増殖を部分的に阻害するが、一方で対照抗体は、いかなる阻害活性も示さない（図１０Ａ）。更に、１０μｇ／ｍｌの抗体４０−１２は、ＦＧＦ１９によって誘導される増殖を完全に抑止する（図１０Ｂ）。対照抗体は、効果を有さない。

【0244】

このことは、本発明の対象である抗ＦＧＦＲ４拮抗薬抗体がＦＧＦ１９依存性又はＦＧＦ−Ｒ４依存性腫瘍の関連において抗腫瘍治療剤として使用され得、この抗体が肝臓癌の治療において特に効果的であることを実証する。

【0245】

Ｈｅｐ３ｂ細胞に対する抗ＦＧＦＲ４抗体の効果の研究を単純化するため、ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を検出し、その後ＦＧＦ−１９（実施例８に記載される実験に相関する）、ＦＧＦ−２又はウシ胎仔血清によるこれらの細胞を刺激するために開発された。

【0246】

これを行うため、５００００個のＨｅｐ３ｂ細胞を、１０％ＦＣＳと２ｍＭグルタミンとを含有する１００μｌのＤＭＥＭ培地において９６ウェルの黒色の明確なボトムプレート（ＣＯＳＴＡＲ、ｒｅｆ３６０３）に播種する。２４時間後、細胞を、２ｍＭグルタミンを含む無ＦＣＳ ＤＭＥＭ培地において２４時間欠失の条件に供する。次いで、培地を抜き取り、ＦＧＦ又はＦＣＳと、更に各種の投与量の評価される抗体とを含む３７℃の前平衡した１００μｌの欠乏培地と置換する。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で３時間インキュベートする。次いで、刺激培地を抜き取り、ウェルを４℃のＰＢＳですすぎ、細胞を、ＰＢＳにおける２００μｌの４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を添加することによって周囲温度１５分間固定する。ＰＦＡを抜き取り、細胞を、２００μｌのＰＢＳによって３回洗浄する。直接Ｈｅｐ３ｂ細胞上のホスホ−Ｅｒｋ１／２を検出するための抗体標識化を、非特異的部位を１００μｌの飽和緩衝液（２１．２５ｍｌのＰＢＳ、１．２５ｍＬの１０％非免疫性ヤギ血清（Ｚｙｍｅｄ、ｒｅｆ５０−０６２Ｚ）、７５μｌのトリトンＸ１００）によって２時間飽和させることによって開始する。飽和緩衝液を、１％ＢＳＡと０．３％トリトンＸ１００を含むＰＢＳ緩衝液において１／１００^ｔｈに希釈した５０μｌの抗ホスホＥｒｋ１／２一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｒｅｆ４３７７）によって置換する。一次抗体を４℃で細胞と共に終夜インキュベートする。次いで、それを２００μｌのＰＢＳの３回の洗浄によってすすぎ、４時間、１％ＢＳＡと０．３％トリトンＸ１００とを含むＰＢＳ緩衝液において１／５０００^ｔｈに希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ｒｅｆ Ａ１１００８）に結合した抗ウサギ二次抗体を使用して明示化する。次いで、二次抗体を２００μｌのＰＢＳの３回の洗浄によってすすぎ、次いで１００μｌのＰＢＳを各ウェルに添加する。蛍光を、ＦＩＴＣフィルタを用いてＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって読み取る。

【0247】

この手法は、３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１９がＨｅｐ３ｂ細胞におけるＥｒｋ１／２のリン酸化を誘導し、４０−１２が３μｇ／ｍｌの投与量からこの刺激を抑止することができることを確認することを可能にする（図９Ｃ）。また、ＦＧＦ−２及び血清は、系を誘導することもできる。後の２つの場合、抗体４０−１２は、より高投与量（３０−１００μｇ／ｍｌ、図９Ｃ）でＦＧＦ−２及び血清の効果を阻害する。

【0248】

また、ＥＬＩＳＡによるホスホ−Ｅｒｋ１／２の検出は、インビトロにおける血管形成モデルにおいて活性である抗ＦＧＦＲ４抗体が、３μｇ／ｍｌの投与量でＦＧＦ−１９によって誘導されるＥｒｋ１／２のリン酸化の７０％から９５％を抑止することもできることを示すことをも可能にした（図９Ｄ）。

【0249】

有利には、本発明の抗体は、特に肝臓癌のモデルにおいて、腫瘍発育を伴う病理学的血管形成とそれ自体で肝臓の腫瘍成長との両方に対する拮抗的影響を有する。

【実施例8】

【0250】

膵臓癌のマウスモデルにおける抗体４０−１２の拮抗的効果
この薬理学的モデルのため、Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ遺伝的背景を有する雌性Ｒｉｐ１−Ｔａｇ２マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する。出生後Ｗｅｅｋ９から開始して、動物は、５％のショ糖が補充された飲料水を飲む。マウスを、週に１回、２５ｍｇ／ｋｇの投与量で抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２又は対照抗体の皮下注射によって、介入治療プロトコルにおいてＷｅｅｋ１０からＷｅｅｋ１２．５まで治療する（図１４Ａ）。このプロトコルは、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅの「Ｃｏｍｉｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）」によって承認される。我々の畜産施設、動物への注目、更に治療プロトコルは、治療期間後、又は腫瘍負荷及び／又は副作用によって義務的な研究から中止する際に屠殺される脊椎動物の保護におけるＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎによって置かれる原理に従う。

【0251】

腫瘍負荷を測定するため、実験終了後に安楽死によって動物を屠殺し、新たに切除された膵臓から腫瘍を顕微解剖する。ｍｍ^３における腫瘍体積を、球状体の体積を求めるため式［体積＝０．５２×（幅）^２×（長さ）］を適用してキャリパを使用して測定する。マウス１匹当たりの腫瘍負荷を、各マウスの腫瘍の体積の累加によって算出する。

【0252】

血管密度の組織化学的解析のため、動物を麻酔し、膵臓を回収し、ａｃｃｕｓｔａｉｎ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）において終夜固定し、次いでパラフィン中に埋め込む。５μｍ厚の切片を各試料について調製する。内皮細胞を、３７℃で１０分間、切片をトリプシン（Ｚｙｍｅｄ、ｒｅｆ００−３００３）と共に、次いでラットにおいて産生される１／５０^ｔｈに希釈される抗マウスＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートすることによって検出する。抗体によって標識された領域を明示化するため、切片を、ビオチン結合抗ラット抗体によって３０分間、次いでＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ）によって更に３０分間、最後にＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ、ｒｅｆ ＳＫ４１００）によって５分間インキュベートする。次いで、切片を、１／１０^ｔｈに希釈されるヘマトキシリン（Ｄａｋｏ、Ｓ−３３０９）によって染色する。×２００の総拡大倍率で、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｅ−８００）に載置されるカメラによって写真を撮影する。ソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｌａｂ、Ｂｉｏｃｏｍ）を使用して画像を解析する。腫瘍中における血管を、それらの表面積（５から２０μｍ^２の間の小血管、２１から１００μｍ^２の間の中血管、１０１μｍ^２から開始する大血管）に従って計数し、分類する。１つの場所につき標識される要素の総数に対応する血管密度を決定するため、膵臓１つにつき２つのスライドを解析する。

【0253】

このモデルにおいて、１０から１２週目の間の週に１回の２５ｍｇ／ｋｇの抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２を使用する皮下治療は、有意に５５％腫瘍負荷を減少させることを可能にし（図１１Ｂ）、膵臓１つ当たりの腫瘍の数を３４％減少させる傾向を有するが（図１１Ｃ）、対照治療は効果を有さない。抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２による腫瘍発育のこの阻害は、抗ＣＤ３１抗体によって標識された全ての血管の大きさの群における血管の数の観察された減少（図１１Ｄ）に対応する総血管密度の３１％の有意な減少を伴う（図１１Ｄ）。

【0254】

これらのインビボにおける結果は、抗ＦＧＦＲ４拮抗薬抗体が腫瘍における血管の漸増及び形成を阻害することができることを明らかに示す。腫瘍血管新生のこの阻害は、膵臓１つ当たりの腫瘍の数及び総腫瘍体積の減少を伴う。

【0255】

有利には、本発明の抗体は、病理学的血管形成と肝臓腫瘍成長（肝臓癌のモデル）及び膵臓腫瘍成長との両方に対する拮抗的影響を有する。

【実施例9】

【0256】

ヒト、マウス及びラットＦＧＦ−Ｒ４との抗体の交差反応性
第１に、競合結合実験を行った。これを行うため、ＦＧＦ２に、供給業者の推奨に従ってＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ｎｍＣ−５マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１０２５４）を２つの遊離システイン上で標識した。このＦＧＦ２−ＡＦ４８８は、１０ｎｇ／ｍｌで、トランスフェクトされた３００−１９細胞の表面において発現したヒトＦＧＦ−Ｒ４に結合することができる（図８）。過剰な非標識ＦＧＦ２の添加がＦＧＦ２／ＦＧＦ−Ｒ４相互作用を置き換えることを可能にすることから、この結合は特異的である（図８Ａ）。同じ実験を、抗体４０−１２又は添加される対照抗体６４−１２の投与量の増加と共に行った。拮抗薬抗体４０−１２だけは、３５００ｎｇ／ｍｌのＩＣ_５０、即ち２３ｎＭによってＦＧＦ２−ＡＦ４８８／ＦＧＦ−Ｒ４結合を置き換えることができるが、このことは、この抗体の拮抗的効果がＦＧＦ／ＦＧＦ−Ｒ４結合を置き換えるその能力に起因することを示す。

【0257】

第２に、ヒト以外の種におけるＦＧＦ／ＦＧＦ−Ｒ４結合を抑止するクローン４０−１２の能力を決定する目的のため、解離実験を、上述のマウス、ラット及びヒトＦＧＦ２／ＦＧＦ−Ｒ４の対を使用して行った。これを行うため、ヒトＦＧＦ２と同じ方法で、マウスＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ、ｒｅｆ３１３９−ＦＢ−０２５）又はラットＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ、ｒｅｆ３３３９−ＦＢ−０２５）にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を標識した。マウス又はラットＦＧＦ−Ｒ４受容体によってトランスフェクトされた３００−１９系を使用して解離実験を行った。結果は、抗ＦＧＦＲ４拮抗薬抗体４０−１２が、ヒト系におけるものと同じ有効性によってマウス又はラット系においてＦＧＦ２／ＦＧＦ−Ｒ４結合を解離することができることを示す。実際、ＩＣ_５０の値は、ヒト、マウス又はラットＦＧＦ２／ＦＧＦ−Ｒ４複合体についてそれぞれ３５００、４１１０及び３９４０ｎｇ／ｍｌ、即ち２３、２７及び２６ｎＭである（それぞれ図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃ）。齧歯類ＦＧＦ−Ｒ４と結合するこの能力を、ＥＬＩＳＡによって確認した。抗体４０−１２は、ヒトＦＧＦ−Ｒ４とマウスＦＧＦ−Ｒ４との両方に結合する（図１２）。

【0258】

これらの結果は、抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２を齧歯類（少なくともマウス及びラット）における薬理学的モデルにおいて使用することが可能であり、得られた結果がヒトにおける有効性を予測することを示す。

【0259】

同様に、クローン８、３１、３３及び３６に由来する抗体において実施された研究は、これらの抗体がヒトＦＧＦ−Ｒ４及びマウスＦＧＦ−Ｒ４の両方を認識することを示す（下記の表４）。

【0260】

【表5】

【実施例10】

【0261】

抗ＦＧＦ−Ｒ４抗体によって認識されるエピトープの決定
Ａ−抗ＦＧＦＲ４抗体４０−１２によって認識されるエピトープの決定
ＥＬＩＳＡアッセイによって、抗体４０−１２によって認識されるＦＧＦＲ４の特異的ドメインを決定するためにスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡにおいて、ＦＧＦ−Ｒ４のＤ１ドメインの欠失型を用いることにより、抗体４０−１２が、ＦＧＦ−Ｒ４のＤ２−Ｄ３ドメインと相互作用したことが確立された（図１２）。

【0262】

第２のスクリーニングを、実施例２において記載されるように捕獲抗原としてｈＦＧＦＲ４タンパク質のＤ１ドメイン（ＳＡＢＶＡ４７９４）又はＤ２ドメイン（ＳＡＢＶＡ４７９６）又はＤ３ドメイン（ＳＡＢＶＡ４７９９）を含む構築物を使用してＥＬＩＳＡアッセイによって行った。捕獲抗原は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）に結合した。続いて、ハイブリドーマ４０−１２を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ９０４４−１：５００００に希釈）を使用して検出を行った。明示化をＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ｒｅｆ ＵＰ６６４７８０）によって実施し、光学密度（ＯＤ）測定を４５０ｎｍ実施した。得られた結果を表５にまとめる。

【0263】

【表6】

【0264】

したがって、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＦＧＦＲ４タンパク質の細胞外部分のＤ２ドメインを認識する。

【0265】

更に、ＦＣＳによって変性されたＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質は、ウェスタンブロット解析において抗体４０−１２によって認識されず、このことにより、ＦＧＦＲ４のＤ２ドメイン上の４０−１２によって標的とされるエピトープが立体構造型であることが示される。

【0266】

Ｂ−抗ＦＧＦＲ４抗体８、３１、３３、３６によって認識されるエピトープの決定
抗体８、３１、３３及び３６によって認識されるＦＧＦＲ４の特異的ドメインを決定するため、Ｄ２及びＤ３ドメイン（配列番号４２）又はｈＦＧＦＲ４−Ｈｉｓｔａｇタンパク質（ＳＡＢＶＡ４６１４、配列番号４０）のいずれかを含む構築物を捕獲抗原として使用するＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングを行った。捕獲抗原は、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４酵素結合プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）に結合した。続いて、抗体８、３１、３３及び３６の分泌を可能にするプラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの培養液上清を添加し、次いでペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧウサギ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ｒｅｆ．Ｐ０２１４、１：５０００に希釈）を使用して検出を行った。明示化をＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２基質（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、ｒｅｆ ＵＰ６６４７８０）によって実施し、光学密度（ＯＤ）測定を４５０ｎｍで行った。得られた結果を以下の表６にまとめる。

【0267】

【表7】

【0268】

したがって、抗体８、３１、３３及び３６は、ＦＧＦＲ４タンパク質の細胞外部分のＤ２−Ｄ３ドメインを認識する。

【0269】

【表8】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]