特許 5733609 藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5733609

(24)【登録日】2015年4月24日

(45)【発行日】2015年6月10日

(54)【発明の名称】藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150521BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

【請求項の数】3

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2010-547540(P2010-547540)

(86)(22)【出願日】2010年1月22日

(86)【国際出願番号】JP2010050843

(87)【国際公開番号】WO2010084969

(87)【国際公開日】20100729

【審査請求日】2013年1月18日

(31)【優先権主張番号】特願2009-13577(P2009-13577)

(32)【優先日】2009年1月23日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504174180

【氏名又は名称】国立大学法人高知大学

(73)【特許権者】

【識別番号】501168814

【氏名又は名称】国立研究開発法人水産総合研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100075409

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久一

(74)【代理人】

【識別番号】100129757

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久彦

(74)【代理人】

【識別番号】100115082

【弁理士】

【氏名又は名称】菅河 忠志

(74)【代理人】

【識別番号】100125243

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 浩彰

(72)【発明者】

【氏名】足立 真佐雄

(72)【発明者】

【氏名】長崎 慶三

(72)【発明者】

【氏名】外丸 裕司

【審査官】 名和 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，２０００年，Vol.16，pp.443-446

【文献】 Biochem Biophys Res Commun.，１９９４年，Vol.204，pp.187-194

【文献】 Journal of Microbiology and Biotechnology，２００６年，Vol.16，pp.952-960

【文献】 AQUATIC MICROBIAL ECOLOGY，２００８年，Vol.50，pp.103-112

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（１）〜（３）の何れかの構造を有することを特徴とするプロモーター。
（１） 配列番号１または配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２） 上記ポリヌクレオチド（１）の１以上、１０以下のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
（３） 上記ポリヌクレオチド（１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記ポリヌクレオチド（１）との相同性が９０％以上であり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド

【請求項2】

請求項１に記載のプロモーター、および任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とするベクター。

【請求項3】

請求項２に記載のベクターを調製する工程；および
上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程；
を含むことを特徴とする藻類の形質転換方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、藻類を形質転換するために用いられる新規のプロモーター、当該プロモーターを含むベクター、および当該ベクターを用いる藻類の形質転換方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

恒久的かつ安定的なエネルギー源である太陽光を利用することは、エネルギー対策を考える上で非常に重要である。植物類による光合成は、太陽光エネルギーを最も効率的に化学エネルギーへ変換できる優れたシステムであり、環境中の二酸化炭素や過剰栄養塩を吸収同化する上に、酸素も放出する。よって植物を利用する技術の開発は、エネルギー問題を解決し得るものとして期待されているところである。

【0003】

植物類の中でも藻類は、多量に存在する海水および淡水中に生息することからその量は莫大なものであり、また、著しい光合成能を有する。さらに、藻類の中には不飽和脂肪酸や抗腫瘍化合物などの有用化合物を生産するものがある。また、珪藻類の中には有用な無機物を生産するものがあるので、珪藻類によるバイオミネラリゼーションという技術が注目されている。このように、藻類は有用資源として重要な生物といえる。

【0004】

一般的に、生物を産業で利用する場合には、有用な遺伝子を導入する形質転換技術が用いられる。この形質転換技術は、遺伝子の機能を解明すべく、特定遺伝子をノックアウトしたりその働きを抑制したりするためにも用いられる。

【0005】

これまでにも、珪藻や緑藻を中心として藻類の形質転換が行われている。しかし、かかる方法は内在性のプロモーターを分離し、それに遺伝子を結合させて藻類に導入するものであった。それでは、内在性プロモーターの分離に多大な労力と時間がかかるために、決して効率的なものではなかった。また、藻類、とりわけ海産藻類の形質転換効率自体が極めて低いという問題もある。

【0006】

一方、藻類以外の植物や動物の形質転換では、内在性のプロモーターではなく、ウィルス由来のプロモーターが汎用されている。例えば、アブラナ科植物に感染するカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）より分離されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが、アブラナ科植物に限定されず幅広い植物の形質転換に利用されている。また、動物細胞の形質転換には、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）より分離されたＣＭＶプロモーターや、シアミンウィルス４０（ＳＶ４０）より分離されたＳＶ４０プロモーターが広く利用されている。

【0007】

それに対して、藻類の形質転換においては、外来性のウィルスプロモーターが用いられた例はほとんど知られていない。

【0008】

例えば非特許文献１には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いて珪藻Cycrotela crypticaを形質転換した実験例が記載されているが、形質転換体は得られなかったとされている。

【0009】

一方、非特許文献２には、ＣＭＶプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターを用いて珪藻Phaeodactylum tricornutumへＧＵＳ遺伝子を導入したところ、いずれの場合もＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）が発現したことが記載されている。

【0010】

さらに非特許文献３には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いて渦鞭毛藻AmphidiniumとSymbiodiniumへＧＵＳ遺伝子を導入したところ、ＧＵＳが発現したことが記載されている。しかし他文献（非特許文献４）によれば、懸命の努力にもかかわらず、他のグループが渦鞭毛藻類の形質転換に成功したとの報告はされていないとのことである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Dunahay，T.G.ら，Journal of Phycology（ジャーナル・オブ・ファイコロジー），vol.31，pp.1004-1012（1995）

【非特許文献2】Sakaue，Kら，Physiologia plantarum（フィジオロジア・プランタラム），vol.133，pp.59-67（2008）

【非特許文献3】Lohuis，M.R.ら，The Plant Journal（ザ・プラント・ジャーナル），vol.13，pp.427-435（1998）

【非特許文献4】Walker，T.L.ら，Journal of Phycology（ジャーナル・オブ・フィコロジー），vol.41，pp.1077-1093（2005）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

上述したように、その数は極めて少ないものの、カリフラワーモザイクウィルスに由来するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどのウィルスプロモーターを用いて藻類を形質転換した報告例はある。

【0013】

しかし、形質転換体が得られなかったり再現性が無いという報告もある。また、本発明者らの知見によれば、他の植物類の形質転換に汎用されているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、藻類に対する適用範囲が極めて狭い。藻類の存在量は莫大であり、また、様々な有用性を秘めた種があることから、形質転換に用いるプロモーターとしては幅広い種の藻類に適用可能であるものが望ましい。さらに、一般的に、藻類、とりわけ海産藻類の形質転換効率は非常に低いことから、高効率な形質転換技術の開発が切望されている。

【0014】

そこで本発明が解決すべき課題は、幅広い種の藻類に適用可能である上に、効率の高い形質転換技術を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、Chaetoceros debilis ＤＮＡウィルス（ＣｄｅｂＤＮＡＶ）の複製タンパク質をコードすると考えられる遺伝子の上流に位置するプロモーターが、目（モク）を超える複数の藻類を効率的に形質転換できることを見出して、本発明を完成した。

【0016】

本発明に係る新規プロモーターは、下記（１）〜（３）の何れかの塩基配列を有することを特徴とする。

【0017】

（１） ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド
（２） 上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
（３） 上記ポリヌクレオチド（１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド

【0018】

本発明に係るベクターは、上記新規プロモーター、および任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする。
また、本発明に係る藻類の形質転換方法は、上記ベクターを調製する工程；および、上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程；を含むことを特徴とする。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本発明に係るプロモーターを含むプラスミドベクターの構造の一例を示す図である。

【図2】本発明に係るプロモーターを含むプラスミドベクターの構造の一例を示す図である。

【図3】本発明方法により形質転換された藻類細胞等に含まれる導入遺伝子の有無の確認実験の結果を示す電気泳動写真である。

【図4】本発明方法により形質転換された藻類細胞等に含まれる導入遺伝子の有無の確認実験の結果を示す電気泳動写真である。

【図5】本発明に係るプロモーターのＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔを特定するための実験結果を示すグラフである。当該結果より、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流領域における−７２から−３３の間の配列中に、Ｃｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔが含まれていることが分かる。

【図6】本発明に係るプロモーターを含むプラスミドベクターの構造の一例を示す図である。

【図7】海産藻類であるC. fusiformisの形質転換実験の結果を示す写真である。（１）は本発明プロモーターを用いた場合の結果を示し、（２）は本発明プロモーターを用いない場合の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明に係る第一のプロモーターは、（１）ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド、を有する。

【0021】

ＣｄｅｂＤＮＡウィルスは、珪藻Chaetoceros debilisに感染するウィルスである。これまで藻類、とりわけ海産藻類に対して感染性を示すウィルスの報告例は少なかったが、近年、本発明者らは、ラフィド藻、渦鞭毛藻、珪藻などの藻類から様々なウィルスの分離に成功している。本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスは、本発明者らにより分離された海産藻類感染性ウィルスの一つである。

【0022】

複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するものであり且つ活発に発現するものであれば特に制限されないものとする。

【0023】

本発明において、コード領域とはｍＲＮＡを経てタンパク質に翻訳される部分をいうものをいい、非コード領域とはコード領域以外の部分をいう。即ち、非コード領域は、ＡＴＧなどの開始コドンの上流に位置する部分をいい、ｍＲＮＡに転写されない部分の他、ｍＲＮＡに転写はされるがタンパク質には翻訳されない部分を含むものとする。

【0024】

一般的に、プロモーターは、転写の鍵を握るＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔと、転写を促進または抑制するＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔを有し、遺伝子を導入する際には、特にＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔを利用することが重要である。Ｃｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔとしては、ＴＡＴＡボックス、イニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）、ダウンストリートエレメントなどが知られており、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔとしてはＣＡＡＴボックスやＧＡＴＡボックスなどが知られている。本発明者らがＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流域の塩基配列を調べたところ、ＣＡＡＴボックスＩである５’−ＣＡＡＴ−３’、ＧＡＴＡボックスである５’−ＷＧＡＴＡＲ−３’（式中、ＷはＡまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示す）、およびイニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）である５’−ＹＹＡ₊₁Ｎ（Ａ／Ｔ）ＹＹ−３’（式中、ＹはＣまたはＴを示す）が見られた一方で、真核生物などのプロモーターに見られるＴＡＴＡボックスは見られなかった。よって、上記遺伝子の上流配列中に見付かったＩｎｒが、羽状目珪藻と中心目珪藻の両方でＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔとして働き、形質転換が可能になると考えられたが、その一方で、上記Ｉｎｒと酷似した配列のＩｎｒを含む羽状目珪藻内在性プロモーター（Ｃｆ ｆｃｐＡ−１Ａ）を用いると、中心目珪藻を形質転換することができない。結論として、本発明に係るポリヌクレオチド（１）で高い形質転換能を発揮できるのは、少なくともＴＡＴＡボックスやイニシエーターエレメントなどのためではなく、全く未知の配列がＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔとして働いている可能性が高いといえる。

【0025】

上記ポリヌクレオチド（１）としては、配列番号１および配列番号５の塩基配列を有するものを挙げることができる。なお、配列番号５の塩基配列は、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流配列中のＩｎｒの約３０塩基上流からの約４０塩基に相当し、当該配列中には、ＩｎｒはもとよりＣＡＡＴボックスやＧＡＴＡボックスも認められない。

【0026】

本発明に係る第二のプロモーターは、（２）上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド、である。

【0027】

上記ポリヌクレオチド（２）において、欠失、置換または付加されるヌクレオチドの数としては、１以上、２００以下が好ましく、１以上、１００以下がより好ましく、１以上、７０以下がさらに好ましく、１以上、３０以下がさらに好ましく、１以上、２０以下がさらに好ましく、１以上、１０以下がさらに好ましく、１以上、５以下が特に好ましい。

【0028】

本発明に係る第三のプロモーターは、（３）上記ポリヌクレオチド（１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド、である。

【0029】

上記ポリヌクレオチド（３）において、ストリンジェントな条件とは、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄することをいう。

【0030】

また、上記ポリヌクレオチド（２）および（３）において、任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチドとは、藻類細胞内に導入されることによって、その下流に結合された任意のタンパク質をコードする遺伝子を発現させることができるものをいう。

【0031】

上記ポリヌクレオチド（２）および（３）において、上記ポリヌクレオチド（１）との相同性としては、５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。

【0032】

上記ポリヌクレオチド（１）〜（３）は、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスまたはその変異体の複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流から分離することができる。但し、化学的に合成してもよい。これらポリヌクレオチド（１）〜（３）は、鋳型からＰＣＲにより増幅して用いることができる。

【0033】

本発明に係るベクターは、上記プロモーターと、任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有する。

【0034】

ベクターの種類は、藻類細胞へ導入され得るものであれば特に制限されず、プラスミドベクター、ウィルスベクターの何れも用いることができる。但し、藻類、とりわけ海産藻類に感染するウィルスの研究は十分に進んでいるとはいい難いので、好適にはプラスミドベクターを用いる。

【0035】

ここで「任意のタンパク質」は特に限定されるものではなく、生産の望まれる有用なタンパク質であればよい。

【0036】

本発明に係るベクターには、一般的なベクターに含まれるその他の配列を含んでいてもよい。かかる配列としては、例えば、本発明ベクターが導入された藻類を特定するための選択マーカー遺伝子や、藻類細胞で働くターミネーターを挙げることができる。

【0037】

本発明ベクターの調製方法としては、常法を用いることができる。例えば、上記各配列とドナーベクターとを制限酵素で切断した後にアニーリングし、ＤＮＡリガーゼにより結合させればよい。或いは、クロナーゼ反応を利用した簡便な公知方法により、各配列をベクターにクローニングすることも可能である。

【0038】

本発明に係る藻類の形質転換方法は、上記ベクターを調製する工程；および、上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程；を含むことを特徴とする。

【0039】

本発明ベクターの調整方法は、上述したとおり、当業者公知の方法を用いることができる。

【0040】

本発明ベクターの藻類細胞への導入方法としては、パーティクルガン法、ガラスビーズ攪拌法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法などの公知方法を用いることができる。但し、海産藻類の場合、塩濃度の高い培地で増殖せしめる必要があるので、エレクトロポーレーション法は適切でない。

【0041】

本発明ベクターにより形質転換された藻類細胞は、導入されている選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することにより特定することができる。

【実施例】

【0042】

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

【0043】

実施例１ 本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターの分離
（１） 海産藻類に感染するウィルスのゲノムＤＮＡの抽出
Tomaru，Y.ら，Aquatic Microbial Ecology，vol.50，pp.103-112（2008）に記載の方法に従って、中心目珪藻Chaetoceros debilisを宿主とするChaetoceros debilis ＤＮＡウィルス（ＣｄｅｂＤＮＡＶ） ＣｄｅｂＤＮＡＶ１８株からゲノムを抽出した。

【0044】

具体的には、まず、ウィルス液（１０ｍＬ）を０．２２μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製，Millex-GS，孔径：０．２２μｍ）で濾過することにより、藻細胞の破片などを除いた。得られた濾液に４０％ポリエチレングリコール６０００溶液（Ｗｏｋｏ社製）を最終濃度が１０ｗ／ｖ％となるように加え、４℃にて一晩静置した。当該液を遠心分離用チューブ（Ｎａｌｇｅｎ社製，UltraBottle Assemblies）に移し、超遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ社製，Ultracentrifuge L8-70M）を用いて５７，０００×ｇ、４℃で１．５時間遠心分離した後、その上清を除いた。得られた沈殿にリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム，１０ｍＭリン酸水素ナトリウム，ｐＨ７．２，５ｍＬ)を加え混合することによりウィルス粒子を洗浄した。再度、２１７，０００×ｇ、４℃で４時間遠心分離し、同様に上清を除いた後、得られた沈殿を滅菌した精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，ｍｉｌｌｉＱ（登録商標），３００μＬ）に溶解した。当該溶液を１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移し、プロテイナーゼＫと１０％サルコシルを、それぞれ最終濃度が１ｍｇ／ｍＬおよび１ｗ／ｖ％となるように加え、５５℃にて１．５時間インキュベートした。その後、常法を用いてフェノール／クロロホルム処理とクロロホルム処理を行い、得られた上清に、その１０分１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を加え、さらにその２．５倍量のエタノールを加えた。当該溶液を−８０℃にて１時間静置した。その後、微量高速遠心機（ＫＵＢＯＴＡ社製，KUBOTA3740）を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離を行い、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させた。これを滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（２０μＬ）に溶解してＤＮＡ溶液を得た。さらに、上記文献（Tomaru，Y.ら（2008））に記載のCetyl trimethyl ammonium bromide法（ＣＴＡＢ法）を用いて精製した。まず、上記ＤＮＡ溶液にＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を加え、その全量を２００μＬにした。当該ＤＮＡ溶液にＣＴＡＢ溶液（１．６Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，２ｗ／ｖ％ＣＴＡＢ，２００μＬ）を加え、６５℃にて１時間インキュベートした。当該溶液にクロロホルム（４００μＬ）を加え、５分間振とう攪拌した後、前述した微量高速遠心機を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。当該溶液に２倍量のエタノールを加え、−８０℃にて１時間静置した。その後、同微量高速遠心機を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、得られた沈殿を７０％エタノールにより洗浄した後、乾燥させた。当該沈殿を滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（３００μＬ）に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。

【0045】

（２） ＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターの分離
上記（１）で得たＣｄｅｂＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡの配列情報を、Ｂｌａｓｔ（ＤＤＢＪ）を用いてデータベースと比較し、さらにＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ（ＮＣＢＩ）を用いて、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスＤＮＡに含まれるＯＲＦを検索し、ウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域を検出した。この配列中の翻訳開始点と思われるＡＴＧ配列の上流＋１０７から−３７０の領域を、ＣｄＰ１Ｌ／ａｔｔＢ１プライマー（配列番号２）およびＣｄＰ１−２Ｒ／ａｔｔＢ４プライマー（配列番号３）を用いたＰＣＲ反応により増幅させた。なお、配列番号２における５〜３１の塩基配列および配列番号３における５〜２９の塩基配列は、後述するプラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を示す。また、得られたＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。なお、配列番号１に示されているＡＴＧは開始コドンであり、プロモーターには含まれない。

【0046】

ＰＣＲ反応の条件を以下に示す。ＰＣＲ反応液として、１０×バッファー（ＴａＫａＲａ社製，５μＬ）、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社製，４μＬ）、Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製，０．２５μＬ，５Ｕ／μＬ）、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡ（１μＬ）、および２種のプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ，各５μＬ）を混合し、最後に滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を全量が５０μＬとなるように添加混合した。次いで、９８．０℃で１０秒間、４５．０℃で３０秒間、７２．０℃で６０秒間のサイクルを４０回繰り返し、最後に７２．０℃で５分間反応させた。

【0047】

フラグメントの増幅を確認するために電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＡＥバッファー（トリス酢酸緩衝液）と、アガロースＳ（ニッポンジーン社製）１．５％ゲルを用いた。電気泳動用試料として、ＰＣＲ産物各９μＬに１０×ローディングバッファー（ＴａＫａＲａ社製）を１μＬずつ添加し、混合したものを用いた。また、ＤＮＡ分子量マーカーとして１００ｂｐラダー（ＴＯＹＯＢＯ社製，コードＮｏ．ＤＮＡ−０３０Ｘ，２μＬ）を用い、同時に泳動した。また、Ｍｕｐｉｄ電気泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ社製）を用い、１００Ｖの条件下で約３０分間泳動した。泳動終了後、臭化エチヂウムを用い、定法（Sambrook and Russell 2001）により染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。

【0048】

実施例２ 本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターを含むベクターの調製
（１） 各エントリークローンプラスミドの調製
上記実施例１で得たＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーター、導入遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）（Drocourt，D．ら，Nucleic Acids Research，18，p.4009（1990））、およびCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーター（Poulsen，N．ら，FEBS Journal，272，pp.3413-3423（2005））がそれぞれ導入されたエントリークローンプラスミドベクターを、Multisite Gateway（登録商標） Pro Kit（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて調製した。

【0049】

詳しくは、プラスミドの構築のためのクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有する、上記実施例１で得たＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーター溶液を、３０％ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で精製した。即ち、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーター溶液（２５μＬ）に、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（７５μＬ）を加えて１００μＬの溶液とした。当該溶液に３０％ＰＥＧ８０００／３０ｍＭ塩化マグネシウム溶液（５０μＬ）を加えて混合し、微量高速遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製，KUBOTA3740）を用いて１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、上清を取り除き、得られた沈殿を滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１０μＬ）に溶解した。次に、当該溶液（５０ｆｍｏｌｅｓ）とドナーベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，ｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ１−Ｐ４，１００ｎｇ／μＬ）を混合し、当該溶液へ滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を加えることにより計８μＬの混合液とした。なお、当該ドナーベクターは、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有する。当該混合液へ、さらにＢＰクロナーゼ（商標）II Enzyme Mix（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２μＬ）を加えて混合し、２５℃で１時間反応させた。その後、反応液にプロテイナーゼＫ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１μＬ）を加え、３７℃で１０分間処理した。当該反応液（２．５μＬ）を、One Shot（登録商標）Mach１（登録商標）T1^R chemically competent cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。その後、４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移し、２分間静置した。次いで、ＳＯＣ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（２７５μＬ）を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン，０．５％イーストエクストラクト，１％ＮａＣｌ，１．５％アガー）に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン（タイテック社製）内で３７℃にて一晩（１０時間程度）倒置培養した。得られたコロニーは、白金耳を用いてＬＢ液体培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有するＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターが導入されたエントリークローンプラスミドを抽出した。

【0050】

また、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有するゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）を上記実施例１と同様に増幅し、上記と同様にしてＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ４ｒ−Ｐ３ｒへ導入し、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有する抗生物質耐性遺伝子が導入されたエントリークローンプラスミドを得た。

【0051】

さらに、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有するCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーターを上記実施例１と同様に増幅し、上記と同様にしてＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ３−Ｐ２へ導入し、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有するターミネーターが導入されたエントリークローンプラスミドを得た。

【0052】

（２） ディスティネーションプラスミドの調製
Gateway（登録商標） Vector Conversion System with One Shot（登録商標） ccdB Survival（登録商標） Competent Cells（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、pBluescript SK-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）へＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＲ配列を持つReading Frame Casetteを組み込むことにより、ディスティネーションプラスミドを調製した。

【0053】

まず、pBluescript SK-（２μｇ）に対し、制限酵素ＥｃｏＲＩ ２０Ｕ（ＴＯＹＯＢＯ社製，１０Ｕ／μＬ）を用いて、３７℃にて３時間消化した。当該反応液へ常法に従ってエタノールを添加することにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。次に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。即ち、回収したＤＮＡへ、１０×バッファー（５μＬ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ社製，２μＬ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，０．５Ｕ／μＬ，１μＬ）および滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（４２μＬ）を加え、計５０μＬとなるように反応液を調製した。この反応液を１２℃にて１５分間インキュベートした。この反応液に滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（３５０μＬ）を直ちに加え、常法に従ってフェノール／クロロホルム処理とクロロホルム処理をした後、続いてエタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。次に、制限酵素にて切断したプラスミドの再環状化を防ぐために、ＣＩＡＰ（ＴａＫａＲａ社製，Calf intestine Alkaline Phosphatase）を用いて、その切断断片の５’末端の脱リン酸処理を行った。平滑化処理を施したＤＮＡに１０×ＣＩＡＰバッファー（５μＬ）とＣＩＡＰ（０．１Ｕ／μＬ，１μＬ）を加え、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水により計５０μＬになるように反応液を調製した。当該反応液を３７℃にて１５分間、続いて５６℃にて１５分間インキュベートした後、ＣＩＡＰ（０．１Ｕ／μＬ，１μＬ）を再び加え、３７℃にて１５分間、続いて５６℃にて１５分間インキュベートした。当該反応液に、１０％ＳＤＳ溶液（２．５μＬ）、５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（０．５μＬ）、プロテイナーゼＫ溶液(２０ｍｇ／μＬ，０．５μＬ）をそれぞれ加えた後、５６℃にて３０分間、続いて７５℃にて１０分間インキュベートした。その後、常法に従ってフェノール/クロロホルム処理とクロロホルム処理を施した。次に、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１０μＬ）に溶解した。

【0054】

得られた平滑末端を有するpBluescript SK-と、Reading Frame Casette A（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，ＲｆＡ）とを混合し、pGEM-T Vector Systems Kit（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）添付のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。まず、オートクレーブ滅菌した０．２ｍＬ容のＰＣＲ用チューブに、２×ラピッドライゲーションバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，５μＬ）、pBluescript SK-（１００ｎｇ／μＬ，０．５μＬ）、ＲｆＡ（５ｎｇ／μＬ，２μＬ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，３Ｕ／μＬ，１μＬ）および滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１．５μＬ）を加え、計１０μＬとなるように反応液を調製した。この反応液を室温にて１時間保存し、４℃にて一晩（１６時間以上）インキュベートした。このライゲーション溶液（５μＬ）をccdB Survival Competent Cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，５０μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。その後、４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移し、２分間静置した。次いでＳＯＣ（２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（３００μＬ）を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン内で３７℃にて一晩倒置培養した。

【0055】

得られたコロニーは、白金耳を用いてＬＢ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ディスティネーションプラスミドを抽出した。

【0056】

（３） エクスプレッションクローンプラスミドベクターの調製
Multisite Gateway Pro Kit（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、上記実施例２（１）で得たエントリークローンプラスミドと、上記実施例２（２）で得たディスティネーションプラスミドとの間でＬＲクロナーゼ反応を行うことにより、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子およびターミネーターが連結されたエクスプレッションクローンプラスミドベクターを調製した。

【0057】

具体的には、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子、ターミネーターがそれぞれ組み込まれた３種のエントリークローンプラスミド（それぞれ１０ｆｍｏｌｅｓ）とディスティネーションベクター（２０ｆｍｏｌｅｓ）を混合し、さらに滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を加えることにより計８μＬの混合液を調製した。当該液にLR Clonase II PLUS Enzyme Mix（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２μＬ）を加えて混合し、２５℃にて１６時間を反応させた。その後、当該反応液にプロテイナーゼＫ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１μＬ）を加え、３７℃にて１０分間処理した。当該反応液（２．５μＬ）を、One Shot（登録商標） Mach1（登録商標） T1^R chemically competent cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。次いで４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移して２分間静置した。その後、ＳＯＣ（２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（２７５μＬ）を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン内で３７℃にて一晩倒置培養した。得られたコロニーを、白金耳を用いてＬＢ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてエクスプレッションクローンプラスミドベクターを抽出した。

【0058】

（４） ＤＮＡ配列の確認
目的とするエクスプレッションクローンプラスミドベクターが作製されたことを確認するために、Ｄｉｄｅｏｘｙ法を用いて塩基配列を決定した。

【0059】

上記実施例２（３）にて調製したエクスプレッションクローンプラスミドベクター（２００ｎｇ）を鋳型として用いて、サイクルシークエンシングＰＣＲを行った。その反応条件を以下に示す。反応液（１０μＬ）は、鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ，２μＬ）、Big Dye Terminator Cycle Sequencing ver．3.1（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，０．５μＬ）、５×シークエンシングバッファー（２μＬ）、プライマー（１．６ｐｍｏｌ／μＬ，０．６６μＬ）、滅菌蒸留水（４．８４μＬ）からなる。プライマーは、Ｍ１３Ｍ３プライマー（配列番号４）を用いた。反応条件としては、９５℃で５分間加熱した後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分の反応を４０サイクル行った。反応後、反応液を１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム（１μＬ）、９９．５％エタノール（２５μＬ）および１２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（１μＬ）を加え、指ではじきよく混合させた後、１５分間室温で放置した。１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離後、上清をイエローチップで丁寧に除き、７０％エタノール（３５μＬ）を加え、よく混合した。再び、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清をイエローチップで完全に取り除き、蓋を開けたまま室温で１０分間放置して沈殿を乾燥させた。

【0060】

乾燥させたペレットにホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，１０μＬ）を加え、高知大学総合研究センター遺伝子実験施設内のABI PRISM（登録商標）3100-Avant Genetic Analyzer （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。あらかじめ、遺伝子解析ソフト Vector NTI Advance Ver10.0（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，http://www.invitrogen.com/vntigateway）を用いて、ディスティネーションプラスミドの塩基配列に、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子およびターミネーターの塩基配列を組み込むことにより、エクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列を作成した。次に、このコンピューター上にて作成したエクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列と、上記の方法により実験的に決定したエクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列とを、Vector NTI Advance Ver10.0のAlignXを用いてアライメントを行うことにより比較することにより、上記実施例２（３）で調製したエクスプレッションクローンプラスミドベクターに目的遺伝子が導入されていることを確認した。

【0061】

得られたエクスプレッションクローンプラスミドベクターの構造を図１に示す。

【0062】

実施例３ 本発明に係るＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターを含むベクターの調製
抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）（Krugelら，１９９３年）を用い、ターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーター（Poulsen，N．ら，Journal of Phycology，42，pp.1059-1065（2006））を用い、上記実施例２と同様にＣｄｅｂＤＮＡウィルスプロモーターを含むベクターを調製した。

【0063】

得られたエクスプレッションクローンプラスミドベクターの構造を図２に示す。

【0064】

比較例１〜４ 従来ウィルスプロモーターを含むベクターの調製
上記実施例２と同様にして、羽状目珪藻の内在性プロモーターを有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）とターミネーターとしてCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例１）、および、中心目珪藻の内在性プロモーターを有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）とターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例２）を調製した。

【0065】

また、上記実施例２と同様にして、カリフラワーモザイクウィルス由来のプロモーター（ＣａＭＶプロモーター）を有し、また、抗生物質耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）とターミネーターとしてCylindrotheca fusiformisのｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例３）、および、抗生物質耐性遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）とターミネーターとしてThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーターが導入されたプラスミドベクター（比較例４）を調製した。

【0066】

実施例４ 羽状目珪藻の形質転換
上記実施例２、上記比較例１および上記比較例３のプラスミドベクターを用い、羽状目珪藻Phaeodactylum tricornutumを形質転換した。

【0067】

具体的には、各プラスミドベクターを平均粒子径１．１μｍのタングステン粒子Ｍ１７に付着させた。別途、羽状目珪藻P．tricornutumを１プレートあたり５×１０⁷ｃｅｌｌｓを固相培地に塗抹した。パーティグルガン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System）を用い、上記タングステン粒子を、Ｈｅガス圧１３５０ｐｓｉまたは１１００ｐｓｉで細胞に打ち込んだ。次いで、ゼオシン１５０μｇ／ｍＬを含む１．０％寒天ｆ／２培地にて当該細胞を培養した。結果を表１に示す。

【0068】

また、上記抗生物質含有培地で生育した細胞のコロニーが形質転換していることを、ＰＣＲにて確認した。生育した細胞のコロニーを１００ｍＬの培地を用いて培養し、藻類細胞を回収した後、上記実施例１（１）と同様の方法によりゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入した抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の条件は、基本的には上記実施例１（２）と同様とし、サイクル数は４０サイクル、アニーリング温度は６０℃とした。得られた増幅ＤＮＡを分析した電気泳動写真を図３に示す。

【0069】

図３中、「Ｍ」は分子量マーカーであり、「１」は抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）が導入されたプラスミドベクターのレーン、「２」はP．tricornutum野生株のレーン、「３〜５」はカリフラワーモザイクウィルス由来のプロモーターと抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）を含むプラスミドベクターで形質転換した株のレーン、「６〜８」は本発明に係るプロモーターと抗生物質遺伝子（ｂｌｅ）を含むプラスミドベクターで形質転換した株のレーンである。

【0070】

実施例５ 中心目珪藻の形質転換
上記実施例３、上記比較例２および上記比較例４のプラスミドベクターを用い、上記実施例４と同様にして、中心目珪藻Chaetoceros sp．を形質転換した。ただし、細胞を培養する培地には、５００μｇ／ｍＬノールセオスリシンを添加した。結果を表１に示す。

【0071】

【表1】

【0072】

また、上記抗生物質含有培地で生育した細胞のコロニーが形質転換していることを、上記実施例４と同様にしてＰＣＲにて確認した。得られた増幅ＤＮＡを分析した電気泳動写真を図４に示す。

【0073】

図４中、「Ｍ」は分子量マーカーであり、「１」は抗生物質遺伝子（ｎａｔ）が導入されたプラスミドベクターのレーン、「２」はChaetoceros sp．野生株のレーン、「３〜４」は本発明に係るプロモーターと抗生物質遺伝子（ｎａｔ）を含むプラスミドベクターで形質転換した株のレーンである。

【0074】

実施例６ 本発明に係るプロモーターのＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔ領域の特定
配列番号３のプライマーに加え、配列番号６〜９のプライマーを用いた以外は上記実施例１と同様にして、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の翻訳開始点の上流部位である＋１０７から、−７２、−３２、−２および＋３４までの塩基のＤＮＡ断片を、それぞれ増幅した。これらのエントリークローンと、上記実施例３において調製したノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）を含むエントリークローンおよびThalassiosira pseudonana由来のｆｃｐターミネーターを含むエントリークローンを用い、上記実施例２と同様にして、上記各エントリークローン、ｎａｔおよびｆｃｐターミネーターを連結したプラスミドを調製した。これらプラスミドは、図２と同様の構造を有する。これらプラスミドに加え、比較例２のプラスミドと、プロモーターを連結していないプラスミド（ｐＮａｔ／ＴｐｆｃｐＴｅｒ）を用い、上記実施例４と同様の方法により形質転換を行った。結果を図５に示す。

【0075】

図５のとおり、上記複製タンパク質遺伝子の翻訳開始点の上流部位における＋１０７から−３７０までの塩基配列（配列番号１）および＋１０７から−７２までの塩基配列をプロモーターとして用いた場合には形質転換できた一方で、＋１０７から−３２、−２および＋３４までの塩基配列をプロモーターとして用いた場合には、形質転換できなかった。かかる結果により、藻類の形質転換に有用なＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔは、上記複製タンパク質遺伝子の翻訳開始点の上流部位における−７２から−３３の間の配列（配列番号５）に存在している可能性が高いと結論付けられた。なお、形質転換が偶然起こっている可能性もあるため、プロモーターを有しないプラスミドでも同様の実験を行ったが、形質転換率は無視できる程度のものであった。また、中心目のプロモーターを用いて同様の実験を行ったところ、本発明プロモーターを用いた場合の方が、形質転換効率は明らかに高かった。

【0076】

実施例７ 本発明プロモーターによる様々な海産藻類の形質転換
本発明のプロモーターが、様々な珪藻種に対して適用か否か確認するために、上記実施例と異なる羽状目珪藻であるC. fusiformisを用いて形質転換を行った。ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の翻訳開始点の上流部位である＋１０７から−７２までの塩基に加え、ゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）と、C. fusiformisのｆｃｐ遺伝子由来のターミネーターを組み込んだプラスミド（図６）を用いた。上記実施例４と同様に、プラスミドをタングステン粒子に固定化し、形質転換を行った。対照として、上記プロモーターを組み込まない以外は同様のプラスミド（ｐＢｌｅ／ＣｆｆｃｐＴｅｒ）を用い、同様の実験を行った。本発明プロモーターを組み込んだプラスミドを用いた場合の珪藻の写真を図７（１）に、本発明プロモーターを組み込んでいないプラスミドを用いた場合の珪藻の写真を図７（２）に示す。

【0077】

図７（２）のとおり、本発明プロモーターを組み込んでいない場合、おそらく形質転換されていないため、抗生物質により珪藻は死滅してしまった。それに対して本発明プロモーターを用いた場合、図７（１）のとおり、珪藻は形質転換されて抗生物質耐性を獲得したため、良好に生存している。このように上記実施例で用いた以外の珪藻も、本発明プロモーターを用いれば、形質転換が可能であることが明らかとなった。

【0078】

実験結果の考察
（１） 形質転換能について
上記実施例４〜５の結果のとおり、羽状目珪藻の内在性プロモーターを用いた場合には、羽状目珪藻は良好に形質転換できる一方で、中心目珪藻は全く形質転換できなかった。植物一般の形質転換によく用いられるカリフラワーモザイクウィルスプロモータの場合でも同様であり、羽状目珪藻は形質転換できたが、中心目珪藻は全く形質転換できていない。

【0079】

それに対して、本発明に係るプロモーターを用いた場合には、羽状目珪藻についてはP. tricornutumとC. fusiformisの２種、中心目についてはChaetoceros sp.を形質転換することができた。これら３種の珪藻は、珪藻綱全体の分子系統樹において、それぞれの目の中でも系統的に離れた分類群に属するものである。よって、これらの種に適用可能な本発明プロモーターは、様々な珪藻に適用可能と考えられる。

【0080】

以上の結果により、珪藻は羽状目珪藻と中心目珪藻に大きく分類されるところ、従来のプロモーターの特異性が高いのに対して、本発明に係るプロモーターは特異性が低く、様々な珪藻の効率的な形質転換に幅広く用いられ得ることが示された。

【0081】

（２） 本発明プロモーターの塩基配列について
一般的に、真核生物のプロモーター領域には、転写を開始させる転写結合因子が結合するコアプロモーター領域と、その上流に位置する遺伝子転写調節領域が存在する。ウィルスプロモーターにおいても同様に、ＴＡＴＡボックス（５’−ＴＡＴＡＷＡＷ−３’（式中、ＷはＡまたはＴを表す））やイニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）といった真核生物のコアプロモーター領域によく見られるモチーフ配列が存在することが知られている。このことを踏まえ、本発明に係る配列番号１のプロモーターの塩基配列をPLACE Signal Scan Search（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）を用いて解析し、比較した。

【0082】

その結果、本発明プロモーターにＴＡＴＡボックスは見られなかったが、上流領域にＣＡＡＴボックスＩである５’−ＣＡＡＴ−３’（−９７〜−９４）、ＧＡＴＡボックスである５’−ＷＧＡＴＡＲ−３’（−１６２〜−１６７）、さらにイニシエーターエレメントであると考えられる５’−ＣＣＡ₊₁ＴＡＣＣ−３’（−２〜＋５）を見出した。

【0083】

このイニシエーターエレメントは、哺乳類の５’−ＹＹＡ₊₁ＮＷＹＹ−３’（Javahery，R．ら，Molecular and Cellular Biology，14，pp．116-127（1994））、卵菌類の５’−ＹＣＡ₊₁ＴＴＹＹ−３’（Mcleod，Aら，Eukaryotic Cell，3，pp．91-99（2004））、ショウジョウバエの５’−ＴＣＡ₊₁ＫＴＹ−３’（式中、ＫはＧまたはＴを表す）（Purnell，B．A．ら，Genes & Development，8，pp．830-842（1994））、 トリコモナスの５’−ＴＣＡ₊₁ＹＷ−３’（Liston，D．R．ら，Molecular and Cellular Biology，19，pp．2380-2388（1999））、およびC. fusiformisのプロモーターであるｆｃｐＡ−１Ａ中の５’−ＣＣＡ₊₁ＴＴＣＣ−３’（Poulsen，N．ら，FEBS Journal，272，pp.3413-3423（2005））というＩｎｒ配列に類似している。

【0084】

これら情報からは、配列番号１のプロモーター中に見出されたイニシエーターエレメントが、Ｃｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔとして羽状目珪藻と中心目珪藻の両方に働き、形質転換できたとも考えられる。しかし、当該イニシエーターエレメントに類似するC. fusiformisのプロモーターであるｆｃｐＡ−１Ａを用いても、中心目珪藻を形質転換することはできない。

【0085】

よって、本発明に係るポリヌクレオチド（１）が高い形質転換能を示すのは、少なくともＴＡＴＡボックスやイニシエーターエレメントなどのためではなく、全く未知の配列がＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔとして働いている可能性が高い。

【0086】

（３） 本発明プロモーターのＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔについて
上記実施例６の結果により、本発明プロモーターのＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔは、ＣｄｅｂＤＮＡウィルスの複製に関係すると考えられるタンパク質をコードする領域の−７２から−３３の間の配列（配列番号５）に存在している可能性が高いと考えられる。配列番号５の配列は、当該複製タンパク質遺伝子の上流域に位置するイニシエーターエレメントのおよそ３０から７０塩基上流側に位置していることから、当該イニシエーターエレメントがＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔとして機能したとは考え難い。当該配列番号５の配列番号をPLACE Signal Scan Search（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）で解析したが、既知のモチーフ配列を見出すことはできなかった。よって、本発明プロモーターのＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔは、これまで知られていない新規なものであると考えられる。

【0087】

上記の実験結果のとおり、本発明プロモーターを用いれば目を超えて珪藻類を形質転換可能である理由として、配列番号５の配列に含まれる新規な配列がＣｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔとして機能したと考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0088】

本発明に係るプロモーターを含むベクターを用いれば、様々な種類の藻類を効率的に形質転換し得る。よって本発明を用いれば、高い光合成能を有し、有用物質の産生能を有するなど優れた特性を有する上に、多量に存在するものでありながら、形質転換が難しくこれまで十分にその技術が検討されていなかった藻類を、“目（モク）”などを超えて幅広く且つ効率的に形質転換することが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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