特許 5737663 皮膚バリア機能改善剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5737663

(24)【登録日】2015年5月1日

(45)【発行日】2015年6月17日

(54)【発明の名称】皮膚バリア機能改善剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/60 20060101AFI20150528BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20150528BHJP

   A61K 31/7042 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20150528BHJP

   C07H 17/08 20060101ALI20150528BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/60

   A61Q19/00

   A61K31/7042

   A61P43/00 111

   A61P17/00

   A61P17/16

   C07H17/08

【請求項の数】9

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2013-510839(P2013-510839)

(86)(22)【出願日】2011年4月22日

(86)【国際出願番号】JP2011059985

(87)【国際公開番号】WO2012144080

(87)【国際公開日】20121026

【審査請求日】2014年3月31日

(73)【特許権者】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(73)【特許権者】

【識別番号】000113470

【氏名又は名称】ポーラ化成工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(74)【代理人】

【識別番号】100151596

【弁理士】

【氏名又は名称】下田 俊明

(72)【発明者】

【氏名】富永 真琴

(72)【発明者】

【氏名】曽我部 隆彰

(72)【発明者】

【氏名】木田 尚子

(72)【発明者】

【氏名】大場 愛

(72)【発明者】

【氏名】金丸 晶子

(72)【発明者】

【氏名】福田 寿之

【審査官】 弘實 謙二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００１−０４８７６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０７−１２６１４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２９２４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２７７１４９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ８／００− ８／９９

Ａ６１Ｑ１／００−９０／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式で示す化合物から選ばれる１種又は２種以上からなる、ＴＲＰＶ受容体活性化剤。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

（式中、水酸基はメトキシ基又はエトキシ基に置換されていてもよく、メトキシ基は水酸基又はエトキシ基に置換されていてもよい。）

【請求項2】

前記化合物が、３−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド、３，３'−ジ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、３，４，３'−トリ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド又は３’−Ｏ−メチル−３，４−メチレンジオキシエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１に記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤。

【請求項3】

前記ＴＲＰＶ受容体が、ＴＲＰＶ４である、請求項１または２に記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤を有効量含有する、皮膚外用剤。

【請求項5】

前記有効量が、皮膚外用剤全量に対して前記化合物の量として０．００００１〜１０質量％である、請求項４に記載の皮膚外用剤。

【請求項6】

皮膚バリア機能改善用である、請求項４又は５に記載の皮膚外用剤。

【請求項7】

タイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進用である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の皮膚外用剤。

【請求項8】

化粧料又は医薬部外品である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の皮膚外用剤。

【請求項9】

下記式で示す化合物から選ばれる１種又は２種以上からなる、ＴＲＰＶ受容体活性化剤を、適用が必要な部位に適用する工程を含む、皮膚バリア機能の改善方法（医療行為を除く）。

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

（式中、水酸基はメトキシ基又はエトキシ基に置換されていてもよく、メトキシ基は水酸基又はエトキシ基に置換されていてもよい。）

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚バリア機能改善剤及び皮膚バリア機能改善用の皮膚外用剤に関し、詳しくは、ＴＲＰＶ（Transient receptor potential vanilloid）受容体活性化剤及びそれを含有する皮膚外用剤に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚には、熱や痛みなどの外部刺激を生体内に伝える働きに加え、水分の蒸散を防いだり、外部刺激や物理的刺激から体内を保護するバリア機能が存する。皮膚バリア機能は、生体の機能維持に重要な働きをしているが、温度、湿度、皮膚の過度の摩擦、生活リズムの変調、ストレスなどにより機能が低下することが知られており、この様な原因により、皮膚の乾燥が進み、刺激に対し過敏になり、刺激を受け易くなる。さらに、この状態が進めば、体外からの細菌や有害物質の侵入による直接的な障害、アレルギ−反応などを引き起こし、アトピ−性皮膚炎や皮脂欠乏性湿疹などの皮膚障害の発症に繋がる。また、皮膚は、人目に触れ、見た目の美しさに直接影響するため、多くの女性にとって大きな関心事であり、肌状態を健康に保つために、皮膚バリア機能改善剤（例えば、特許文献１を参照）、肌荒れ改善剤（例えば、特許文献２を参照）、セラミド合成促進剤（例えば、特許文献３を参照）等を含有する皮膚外用剤等の様々な試みがなされている。

【0003】

１９８９年にショウジョウバエの光受容器異常変異株の原因遺伝子として同定された非選択性陽イオンチャネルのＴＲＰ（Transient receptor potential）チャネルは、アミノ酸配列の相同性により少なくとも９種類のサブファミリ−に分類されている。ＴＲＰチャネルに属する温度感受性受容体は、初めにＴＲＰＶ１の分子実体が解明され、現在に至るまで、哺乳類では、低温から高温までそれぞれの温度刺激により開口する９種類の温度感受性受容体（ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１）が報告されている。ＴＲＰＶ４は、当初、低侵透圧で活性化される浸透圧感受性受容体として発見され、感覚神経、視床下部、皮膚、腎臓、肺、内耳などの様々な組織で発現し、浸透圧刺激、機械刺激による痛みや炎症性の痛みの伝達に重要な役割を果たしている。また、細胞膜貫通型カルシウム流入チャネルとして機能するＴＲＰＶ４は、前記の物理的な刺激に加え、内在性カンナビノイド、アラキドン酸代謝物、４α−ホルボールエステル(４α−ＰＤＤ)(4alpha-phorbol 12,13-didecanoate）などの化合物によっても活性化される。ＴＲＰＶ４は、この様に、発現する組織や刺激応答の多様性から多くの生物活性を示すと考えられ、刺激及び痛みの認識、自閉症をはじめとする神経疾患症状にも深く関与する。また、これら以外の生物活性としては、ＴＲＰＶ４欠損マウスにおいて体重増加、総脂肪量及び内臓脂肪量の有意な抑制作用（例えば、特許文献４を参照）等のエネルギー代謝関連の活性が報告されている。また、表皮細胞に存在するＴＲＰＶ４に関する研究により、ＴＲＰＶ４は、水分蒸散センサ−としての機能を有し、４α−ホルボ−ルエステルによる活性化により、水分蒸散を抑制すること、皮膚バリア機能を亢進することが報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。

【0004】

タイトジャンクション（ＴＪ：Tight-junction）及びアドヘレンスジャンクション（ＡＪ：Adherens-junction）は、細胞の周囲にベルト状に存在し、隣り合った細胞同士を密着させることにより隙間を塞ぐと共に、連続的に細胞を繋ぎ止める細胞間接着構造体である。皮膚組織において、ＴＪは、顆粒層の表皮細胞に存在しており、水や物質が細胞間隙を透過するのを防ぎ、皮膚バリア機能を維持するために重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献３を参照）。また、ＡＪの正常な形成がＴＪの形成に重要な役割を果たすことも知られている。しかしながら、ＴＪ及びＡＪなどの細胞間接着構造体とＴＲＰＶの相互作用に関しては、これまで知られていなかった。このため、ＴＲＰＶとＴＪ及びＡＪなどの細胞間接着構造体との相互作用、取り分け、ＴＲＰＶ４の活性化によりＴＪ及び／又はＡＪの形成が促進される作用を有する成分には、新たな作用機序を有する皮膚バリア機能改善剤として相加又は加乗効果が期待出来る。

【0005】

ＴＲＰＶ、特に、ＴＲＰＶ４に作用する物質としては、ビフェニル誘導体（例えば、特許文献２を参照）、１，４−ジアミン誘導体（例えば、特許文献３を参照）等のＴＲＰＶ４アゴニスト、更には、ピペリジン及びピロリジン誘導体、チオフェン誘導体（例えば、特許文献４を参照）のＴＲＰＶ４アゴニスト（例えば、特許文献５、特許文献６、特許文献７を参照）が、疼痛、関節リュウマチ、神経障害、痛覚過敏などの症状に緩和、改善に有効であることが知られている。しかしながら、ＴＲＰＶ４アゴニストに皮膚バリア機能改善作用が存することは、４α−ホルボ−ルエステルによる活性化により、水分蒸散を抑制すること、皮膚バリア機能を亢進することが報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照）のみであり、その作用機序は解明されていなかった。また、細胞間接着構造体のＴＪ及びＡＪとＴＲＰＶに共に作用する成分、取り分け、表皮に存在するＴＲＰＶ４を活性化することよりＴＪ及び／又はＡＪの形成を促進する作用を有する成分が、皮膚バリア機能を向上させ、肌荒れ改善に有効であることも知られていなかった。

【0006】

３−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド（以下、「化合物１」と記載することがある）、３，３'−ジ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「化合物２」と記載することがある）、３，４，３'−トリ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「化合物３」と記載することがある）、３’−Ｏ−メチル−３，４−メチレンジオキシエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「化合物４」と記載することがある）は、既知化合物であり、例えば、化合物１に付いては非特許文献４、非特許文献５、化合物２に付いては非特許文献６、化合物３に付いては非特許文献７、化合物４に付いては非特許文献８に記載がある。また、これらの化合物の作用としては、化合物１に付いては美白作用、しみ、くすみ改善作用（非特許文献９，１０）、化合物２に付いては一酸化窒素放出促進作用又はＴＮＦ−α放出促進作用（非特許文献１１）、化合物３に付いては一酸化窒素放出促進作用又はＴＮＦ−α放出促進作用（非特許文献１１）、化合物４に付いては抗酸化作用（非特許文献８，１２）が知られている。しかしながら、これらの化合物について、ＴＲＰＶ受容体活性化作用、ＡＪ及び／又はＴＪ形成促進作用、皮膚バリア機能改善作用等について検討されたことはなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２００７−００１９１４号公報

【特許文献2】特開２００８−０４４８５７号公報

【特許文献3】特開２００６−２３２７６９号公報

【特許文献4】特開２００６−１９９６４７号公報

【特許文献5】特開２００９−０８４２０９号公報

【特許文献6】特表２００９−５０７８５５号公報

【特許文献7】特表２００８−５１２４７５号公報

【特許文献8】特開２００９−５２７４９５号公報

【特許文献9】特表２００９−５１９９７６号公報

【特許文献10】特表２００９−５２３１７６号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Denda M. et. al.，J. Invest. Dermatol，127（3）, 654-659（2007）

【非特許文献2】Denda M.，International Journal of Cosmetic Science，31， 79-86（2009）

【非特許文献3】Kurasawa M. et. al.，Biochemical and Biophysical Research Communications， 381, 171-175(2009)

【非特許文献4】Xue, Pei-Feng et. al.、Biochemical Systematics and Ecology, 4（11）, 825-828（2006）

【非特許文献5】Yazaki Yoshikazu et. Al.、Phytochemistry、15（7）, 1180-1182（1976）

【非特許文献6】Nawwaret. al.、Phytochemistry、21(7), 1755-1758（1982）

【非特許文献7】Li, Xing-Cong et. al.、Magnetic Resonance in Chemistry, 37(11), 856-859（1999）

【非特許文献8】F. Khallouki et al., Food and Chemical Toxicology (2007), 45(3), 472-485

【非特許文献9】Ismael Leon-Rivera, G. et al. 、Journal of Natural Products （2008）, 71（5）, 914-917

【非特許文献10】Jang, Dae-Sik et al.、Natural Product Sciences （2007）, 13（2）, 160-163

【非特許文献11】Zeitschrift fuer Naturforschung, C, Journal of Biosciences （2008）、63（11/12）、794-800

【非特許文献12】Atta-Ur-Rahamann, Planta Medica (2001), 67(4), 335-339

【発明の概要】

【0009】

本発明は、この様な状況下において為されたものであり、皮膚バリア機能改善に好適な、新規なＴＲＰＶ受容体活性化剤及び同活性化剤を含有する皮膚外用剤を提供することにある。

【0010】

この様な実情に鑑みて、本発明者等は、皮膚バリア機能改善に好適な皮膚外用剤を求めて、鋭意、努力を重ねた結果、新規なＴＲＰＶ受容体活性化剤及びそれを含有する皮膚外用剤が、その様な特性を備えていることを見出した。更に、詳細な検討を加えた結果、ミソハギ科サルスベリ属、又は、アカネ科カギカズラ属に属する植物より得られる植物抽出物にＴＲＰＶ受容体活性化作用が存することを見出し、同抽出物よりＴＲＰＶ受容体活性化作用を有する化合物を単離し、発明を完成させるに至った。本発明は、以下に示す通りである。

【0011】

＜１＞ 下記式で示す化合物から選ばれる１種又は２種以上、又はＴＲＰＶ受容体活性化剤として有効量の同化合物を含有する植物の抽出物からなる、ＴＲＰＶ受容体活性化剤。

【0012】

【化1】

【0013】

【化2】

【0014】

【化3】

【0015】

【化4】

【0016】

（式中、水酸基はメトキシ基又はエトキシ基に置換されていてもよく、メトキシ基は水酸基又はエトキシ基に置換されていてもよい。）

【0017】

＜２＞ 前記化合物が、３−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド、３，３'−ジ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、３，４，３'−トリ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド又は３’−Ｏ−メチル−３，４−メチレンジオキシエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである、＜１＞に記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤。
＜３＞ 前記抽出物が、ミソハギ科サルスベリ属に属する植物、アカネ科カギカズラ属に属する植物より得られる抽出物である、＜１＞又は＜２＞に記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤。
＜４＞ 前記ミソハギ科サルスベリ属に属する植物、アカネ科カギカズラ属に属する植物が、ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビ−ルである、＜３＞に記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤。
＜５＞ 前記ＴＲＰＶ受容体が、ＴＲＰＶ４である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤。
＜６＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のＴＲＰＶ受容体活性化剤を有効量含有する、皮膚外用剤。
＜７＞ 前記有効量が、皮膚外用剤全量に対して前記化合物の量として０．００００１〜１０質量％である、＜６＞に記載の皮膚外用剤。
＜８＞ 皮膚バリア機能改善用である、＜６＞又は＜７＞に記載の皮膚外用剤。
＜９＞ タイトジャンクション及び／又はアドヘレンスジャンクションの形成促進用である、＜６＞〜＜８＞のいずれかに記載の皮膚外用剤。
＜１０＞ 化粧料又は医薬部外品である、＜６＞〜＜９＞のいずれかに記載の皮膚外用剤。
＜１１＞ 下記式で示す化合物から選ばれる１種又は２種以上、又はＴＲＰＶ受容体活性化剤として有効量の同化合物を含有する植物の抽出物からなる、ＴＲＰＶ受容体活性化剤を、適用が必要な部位に適用する工程を含む、皮膚バリア機能の改善方法。

【0018】

【化5】

【0019】

【化6】

【0020】

【化7】

【0021】

【化8】

【0022】

（式中、水酸基はメトキシ基又はエトキシ基に置換されていてもよく、メトキシ基は水酸基又はエトキシ基に置換されていてもよい。）
＜１２＞ ＴＲＰＶ受容体活性化のための、下記式で示す化合物から選ばれる１種又は２種以上、又はＴＲＰＶ受容体活性化剤として有効量の同化合物を含有する植物の抽出物。

【0023】

【化9】

【0024】

【化10】

【0025】

【化11】

【0026】

【化12】

【0027】

（式中、水酸基はメトキシ基又はエトキシ基に置換されていてもよく、メトキシ基は水酸基又はエトキシ基に置換されていてもよい。）

【0028】

本発明によれば、新規なＴＲＰＶ受容体活性化剤及び同活性化剤を含有する皮膚外用剤を提供することが出来る。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ＴＥＲ値測定によるＴＲＰＶ４活性化剤（４α−ＰＤＤ）のＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用を示す図である。

【図2】ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量測定によるＴＲＰＶ４活性化剤（４α−ＰＤＤ）のＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用を示す図である。

【図3】ｓｉ−ＲＮＡトランスフェクションによるＴＲＰＶ４ノックダウン効率を示す図である。

【図4】ＴＲＰＶ４ノックダウンによる正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）の細胞間接着関連遺伝子の発現量を示す図である。

【図5】ＴＲＰＶ４ノックダウン細胞におけるＴＥＲ値の経時変化を示す図である。

【図6】ＴＲＰＶ４ノックダウン細胞におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量測定の結果を示す図である。

【図7】ＴＲＰＶ４とＡＪ関連タンパク質との免疫沈降及び免疫ブロットの結果を示す図（写真）である。

【図8】ＮＨＥＫにおける温度変化及びＴＲＰＶ４の活性化による活性型Ｒｈｏ量の変化を示す図（写真）である。

【図9】ＮＨＥＫにおけるＡＪ関連タンパク質の局在への温度変化及びＴＲＰＶ４活性化の影響を示す図（写真）である。

【図10】ＮＨＥＫにおけるＴＪ関連タンパク質の局在への温度変化及びＴＲＰＶ４活性化の影響を示す図（写真）である。

【図11】ＮＨＥＫにおけるＴＥＲ値の経時変化への温度変化及びＴＲＰＶ３、４活性化の影響を示す図である。

【図12】（Ａ）ヒト肌組織におけるバリア機能回復率の経時変化への温度変化及びＴＲＰＶ４活性化の影響を示す図である。 （Ｂ）バリア破壊後のヒト肌組織における温度変化及びＴＲＰＶ３、４の活性化によるビオチン透過性の変化を示す図（写真）である。

【図13】化合物１の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図14】化合物１の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用（対照）を示す図である。

【図15】化合物３の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図16】化合物３の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用（対照）を示す図である。

【図17】化合物１のＴＥＲ値測定（ＴＪ及び／又はＡＪの形促進作用）の結果を示す図である。

【図18】化合物３のＴＥＲ値測定（ＴＪ及び／又はＡＪの形促進作用）の結果を示す図である。

【図19】化合物４のＴＥＲ値測定（ＴＪ及び／又はＡＪの形促進作用）の結果を示す図である。

【図20】ＴＲＰＶ４発現細胞における４α−ＰＤＤの細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図21】ＴＲＰＶ４発現細胞における本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図22】ＴＲＰＶ４発現細胞における本発明のオオバナサルスベリ抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図23】Ｍｏｃｋ細胞における本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図24】Ｍｏｃｋ細胞における本発明のオオバナサルスベリ抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図25】ＴＲＰＶ４発現細胞における細胞外カルシウムイオンフリ−環境における本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図26】ＴＲＰＶ４発現細胞における細胞外カルシウムイオンフリ−環境での本発明のオオバナサルスベリ抽出物の細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図27】Ｍｏｃｋ細胞における細胞外カルシウムイオンフリ−環境での本発明のアセンヤク抽出物の細胞内カルシウム濃度の増加作用を示す図である。

【図28】マウスＴＲＰＶ４発現細胞に対する細胞外カルシウムイオンフリ−環境及びカルシウム存在環境でのアセンヤクエキスの細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用を示す図である。

【図29】本発明の植物抽出物のＴＥＲ値測定（ＴＪ及び／又はＡＪの形促進作用）の結果を示す図である。

【図30】本発明の植物抽出物のＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量測定（ＴＪ及び／又はＡＪの機能向上作用）の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

＜本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤＞
ＴＲＰチャネルは、低温から高温までそれぞれの温度刺激により開口する９種類の温度感受性受容体（ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＡ１）が知られている。これらの内、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４は、表皮細胞に存在することが報告されている。ＴＲＰＶは、細胞膜貫通型のカルシウムイオンチャネルの分子実体であり、細胞内カルシウムイオン濃度を調整することにより、皮膚バリア機能に深く関与するとされている。特に、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＶ４は、水分蒸散、皮膚バリア機能に深く関与していることが示唆されている。しかしながら、その作用機序は、詳細には解明されていない。本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶに直接的又は間接的に作用する受容体活性化剤である。本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶ４に作用する受容体活性化剤である。また、本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、上記受容体を活性化する作用を有する。本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、細胞間脂質及び表皮細胞内におけるカルシウムイオン濃度を調整し、皮膚バリア機能を向上させる。また、本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶ４に対し直接的又は間接的に作用することによりＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を発揮し、皮膚バリア機能を向上させる。すなわち、本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶ４活性化作用を介しＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用を発揮する物質であり、相加又は相乗的な皮膚バリア機能向上作用が発現することが期待される。なお、本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶ受容体活性化効果以外の効果を有する可能性もある。本発明においては、ＴＲＰＶ受容体活性化剤として、ＴＲＰＶ受容体活性化効果を妨げない限りＴＲＰＶ受容体活性化以外の効果を有するものであっても、使用することができる。

【0031】

本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、下記式で示す化合物から選ばれる１種又は２種以上、又はＴＲＰＶ受容体活性化剤として有効量の同化合物を含有する植物の抽出物からなるものである。

【0032】

【化13】

【0033】

【化14】

【0034】

【化15】

【0035】

【化16】

【0036】

なお、上記式中において、水酸基はメトキシ基又はエトキシ基に置換されていてもよく、メトキシ基は水酸基又はエトキシ基に置換されていてもよい。

【0037】

前記化合物として好ましい化合物は、３−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド（化合物１）、３，３'−ジ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物２）、３，４，３'−トリ−Ｏ−メチルエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物３）、又は３’−Ｏ−メチル−３，４−メチレンジオキシエラグ酸 ４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物４）である。

【0038】

上記化合物としては、同化合物を含有する植物より精製・単離された化学物質、動植物由来の同化合物をＴＲＰＶ受容体活性化剤として有効量含む抽出物が好適に例示出来、かかる成分を唯１種のみ含有することも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。ここで、本発明の動植物由来の抽出物とは、動物又は植物由来の抽出物、具体的には、抽出物自体、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。かかる成分の内、好ましいものとしては、ミソハギ科サルスベリ属、アカネ科カギカズラ属に属する植物より得られる抽出物が好適に例示出来、より好ましくは、ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビ−ルより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリは、熱帯アジア原産の常緑小高木であり、日本においては、沖縄及び九州などで多く栽培されている。また、オオバナサルスベリの葉は糖尿病薬に用いるほか、葉を乾燥させることによりバナバ茶を製造し、漢方、サプリメント等として使用されている。アカネ科カギカズラ属ガンビ−ルは、マラッカ海峡沿岸地方を原産とする植物であり、ガンビ−ルの葉より得られる乾燥水製エキスをアセンヤク（阿仙薬）と呼び、抗線溶活性作用、抗血栓作用、抗腫瘍作用などが知られている。

【0039】

本発明における前記の植物より得られる抽出物は、日本においては、自生又は生育された植物、漢方生薬原料等として販売される日本産のものを用い抽出物を作製することも出来るし、丸善株式会社などの植物抽出物を取り扱う会社より販売されている市販の抽出物を購入し、使用することも出来る。前記植物より得られる抽出物の作製に用いる植物部位には、特段の限定がなされず、全草を用いることが出来るが、勿論、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位のみを使用することも可能である。抽出に際し、植物体などの抽出に用いる部位は、予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物製造においては、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮するなどにより除去することが出来る。しかる後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ−などで分画精製し、所望の抽出物を得ることが出来る。
上記化合物は、上記のようにして得られる抽出物において、所望によりさらに水抽出法又は有機溶媒抽出法を行い、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ−などで分取精製すること等によって、得ることが出来る。

【0040】

前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ルなどのアルコ−ル類、１，３−ブタンジオ−ル、ポリプロピレングリコ−ルなどの多価アルコ−ル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフランなどのエ−テル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示出来る。

【0041】

また、本明細書によって、上記化合物の構造が明らかとなったため、公知の化学的合成方法に基づいて、上記化合物を製造してもよい。化学的合成により製造された化合物も、本発明に使用することができる。
前記化合物１〜４に表される化合物及びその誘導体は、薬理学的に許容できる酸又は塩基と共に処置して塩の形で、皮膚バリア機能改善剤として使用することもできる。例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩などの鉱酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩、アンモニウム塩、モノエタノールアミン塩、ピペリジン塩等の有機アミン塩、リジン塩、アルギン酸塩等の塩基性アミノ酸塩などが好適に例示出来る。

【0042】

本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤のＴＲＰＶの活性化作用の評価方法としては、ＴＲＰＶの活性化作用が評価可能な方法であれば、特段の限定なく適用することが出来るが、特に、細胞内カルシウムイオン濃度を指標としたＴＲＰＶの活性化作用の評価方法が好ましい。また、前記ＴＲＰＶの活性化作用の評価方法の内、ＴＲＰＶ４の活性化作用を評価する方法が好ましい。これは、ＴＲＰＶ４が、表皮細胞に存することが確認されており、皮膚バリア機能への関与が期待されるためである。前記ＴＲＰＶの活性化作用を評価する方法の内、さらに好ましいものとしては、ＴＲＰＶ４の発現が確認された細胞、より好ましくは、ＴＲＰＶ４を過剰発現した細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を指標としてＴＲＰＶ４の活性化作用を判別する方法が好ましい。ＴＲＰＶ４の活性化作用を判別するための指標となる細胞内カルシウムイオン濃度を測定する方法としては、細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する方法であれば特段の限定なく適用することが出来るが、操作の簡便性、測定感度及び精度などの面から、例えば、Sokabe T, Tsujiuchi S, Kadowaki T, Tominaga M.: Drosophila painless is a Ca²⁺-requiring channel activated by noxious heat.: J Neurosci.， 2008 Oct 1;28(40):9929-38に記載のカルシウムイメ−ジング法又はパッチクランプ法が好ましい。

【0043】

かかるＴＲＰＶの活性化作用の評価方法によれば、ＴＲＰＶ４の発現が確認された細胞、又はＴＲＰＶ４を過剰発現した細胞における細胞内カルシウムイオン濃度をカルシウムイメージング法又はパッチクランプ法などにより確認し、細胞内カルシウムイオン濃度の程度が、被験物質非存在下（対照）に比して、被験物質存在下で増加した場合、ＴＲＰＶの機能が活性化されていると判断され、これによってｉｎ ｖｉｖｏの皮膚に適用した場合には、角層又は表皮顆粒層のＴＲＰＶのカルシウムイオン透過作用が促進され、以って、皮膚バリア機能が向上されると判定される。この有効性は、前記細胞内カルシウムイオン濃度において、被験物質の非存在下では全く増加が認められないのに比して、被験物質の存在下では、好ましくはイオノマイシン（陽性対照）を１００％としたときに、２０％以上の濃度の増加、さらに好ましくは３０％以上の濃度の増加が観測された場合に有効と判別される。又、その程度が著しいほど、皮膚バリア機能の向上作用は著しいと判別される。

【0044】

なお、イオノマイシン（陽性対照）に対する、被験物質による細胞内カルシウムイオン濃度の増加率は、被験物質の添加により細胞内カルシウムイオン濃度が増加した細胞を無作為に３ないしは５個選択し、各々被験物質添加後のカルシウムイオン濃度から初期値、即ち添加前のカルシウムイオン濃度を減じて被験物質によるカルシウムイオン濃度増加量を算出し、引き続きイオノマイシン（陽性対照）添加後のカルシウムイオン濃度から初期値、即ち添加前のカルシウムイオンの濃度を減じて陽性対照によるカルシウムイオン濃度増加量を算出し、被験物質によるカルシウムイオン濃度増加量を陽性対照によるカルシウムイオン濃度増加量で除し、さらに１００を乗じた数字の平均値として算出される。

【0045】

本発明のＴＲＰＶ活性化作用を有する成分を評価するために用いる細胞としては、ＴＲＰＶ発現が確認されている細胞であれば、特段の限定なく適用することが出来るが、測定感度及び精度の面から、ＴＲＰＶ過剰発現細胞を使用することがより好ましい。特に、ＴＲＰＶ１過剰発現細胞の作製に関しては、例えば、特開２００９−０８２０５３号公報に記載の方法に従い、また、ＴＲＰＶ４過剰発現細胞の作製に関しては、前記方法を基に、後記の方法によりＴＲＰＶ４過剰発現細胞を作製することが出来る。

【0046】

本発明におけるＴＲＰＶ４活性化作用の評価に使用するＴＲＰＶ４の発現が確認されている細胞に関しては、ＴＲＰＶ４を発現している細胞であれば特段の限定なく適用出来、より好ましいものとしては、ＴＲＰＶ４発現ベクタ−を宿主細胞に導入することによりＴＲＰＶ４を過剰発現させた細胞が好ましい。また、ＴＲＰＶ４を過剰発現させる宿主細胞としては、細菌の細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ-７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等が好適に例示出来る。前記宿主細胞としては、ＴＲＰＶ４発現ベクタ−を取り込み、効率的にＴＲＰＶ４が発現され、且つ、培養が容易であることが好ましい。また、ＴＲＰＶ４発現ベクタ−の作製においては、ＴＲＰＶ４をコ−ドするcＤＮＡであれば特段の限定なく使用することが出来、より好ましいものとしては、哺乳動物細胞用ベクタ−であるｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）にＴＲＰＶ４をコ−ドした核酸をライゲ−トしたものが好適に例示出来る。前記ＴＲＰＶ４をコ−ドした核酸としては、全ての塩基配列をコ−ドしたものを、例えば、ｍＲＮＡを抽出し、これに逆転写酵素を作用させｃＤＮＡとしたものを使用することも出来るし、ＴＲＰＶ４主要機能をコ−ドした部分のみを適切なプライマ−を選択し、ＰＣＲにより増幅させて、これを用いてライゲ−トすることも出来る。特に好ましいものとしては、配列番号１に示すオリゴヌクレオチドが例示出来、かかる配列のオリゴヌクレオチドは、配列番号２と配列番号３のプライマーを用いて抽出されたＤＮＡ或いは、ｃＤＮＡをＰＣＲ反応に付すことにより、得ることができる。

【0047】

本発明のＴＲＰＶ活性化作用を有する成分の評価に使用することが出来る前記ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞は、当該細胞におけるＴＲＰＶ４の機能発現、蛋白質レベルでの発現、蛍光物質の共導入などを指標とし、選択することが出来る。前記ＴＲＰＶ４をコ−ドする核酸が、細胞中で発現することができるように宿主細胞に導入されている細胞の選択には、適切な選択培地を用いることが出来る。例えば、ＤＭＥＭやＲＰＭＩ培地にＦＢＳ等の増殖因子を加えたものなどが好適に例示出来る。

【0048】

前記ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコ−ス、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質）、血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳなど）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどを成分とする培地であればよい。前記培地は、市販されている培地であってもよい。前記ＴＲＰＶ４を過剰発現する細胞の培養に用いられる培地としては、かかる細胞に適した培地であればよく、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。例えば、用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、高グルコ−ス及び１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。

【0049】

本発明におけるＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶ、取り分け、表皮細胞に存在するＴＲＰＶ４を活性化することにより、ＴＪ及び／又はＡＪの形成を促進することにより皮膚バリア機能向上作用を発現する。ＴＲＰＶ（特に、ＴＲＰＶ４）と細胞間接着構造体のＴＪ及び／又はＡＪとの皮膚バリア機能向上に関する相互作用は、以下の試験結果により確認される。即ち、ＴＲＰＶ４リガンドである４α−ＰＤＤ（４α−ホルボ−ルエステル）によるＴＲＰＶ４活性化による、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用と同様の作用が確認された場合は、即ち、そのＴＲＰＶ４活性化作用を有する成分は、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進作用により皮膚バリア機能向上作用を奏しているということが出来る。

【0050】

本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤によるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を評価する方法としては、例えば、非特許文献３に記載された３次元表皮モデル又は生体皮膚を用いたビオチン標識拡散トレ−サ−による細胞間物質移動確認法、培養細胞シ−トを用いたＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ細胞間物質透過試験法、フリ−ズフラクチャ−法によるＴＪストランド観察によるストランドの出来具合で機能を類推する方法、更には、特開２００７−１７４９３１号公報に記載の経上皮細胞電気抵抗値（TER：transepithelial electric resistance）を測定する方法等が例示出来るが、操作の簡便性や測定精度等の面から、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過性試験法、経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ値）を測定する方法が好適に例示出来る。

【0051】

かかるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用の評価方法によれば、支持体上で構築した表皮角化細胞層膜における細胞間物質移動の程度を、細胞間物質透過性又は経上皮細胞電気抵抗値（ＴＥＲ値）の測定などにより確認し、細胞間物質移動の程度が、被験物質非存在下（対照）に比して、被験物質存在下で抑制された場合、又はＴＥＲが被験物質非存在下（対照）に比して、被験物質存在下で増加した場合、表皮角化細胞層膜のＴＪ及び／又はＡＪが緻密に構築されていると判断され、これによってｉｎ ｖｉｖｏの皮膚に適用した場合には、角層又は表皮顆粒層の物質透過抑制作用が向上し、以って、皮膚バリア機能が向上されると判定される。

【0052】

＜本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤を含有する皮膚外用剤＞
本発明の皮膚外用剤は、必須成分としてＴＲＰＶ受容体活性化剤を含有することを特徴とする。本発明におけるＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶに直接的又は間接的に作用する受容体活性化剤である。前記ＴＲＰＶ受容体活性化剤の内、より好ましいものとしては、ＴＲＰＶ４受容体活性化剤が好適に例示出来る。また、本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、ＴＲＰＶ、取り分け、ＴＲＰＶ４を活性化する作用を有する。本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、精製・単離された化学物質、動植由来の抽出物、その分画精製物などの混合精製物のいずれでもよい。本発明の皮膚外用剤には、前記ＴＲＰＶ受容体活性化剤を、唯１種含有させることも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。本発明の皮膚外用剤は、ＴＲＰＶ受容体活性化剤を配合することにより、ＴＲＰＶを活性化させ、ＴＪ及び／又はＡＪの形成を促進し、皮膚バリア機能改善（向上）効果を発揮する。
ここで、皮膚（細胞間）バリア機能改善効果とは、皮膚の持つ（又は皮膚細胞間における）バリア機能［例えば、経皮水分蒸散抑制機能（皮膚からの水分の蒸散を防ぐ機能）、及び物質透過性抑制機能（皮膚への物質の侵入を防ぐ機能）など］を改善する効果であって、肌荒れ予防又は改善効果等とも換言することができるものである。

【0053】

本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤は、皮膚外用剤全量に対し、化合物の総量として０．００００１質量％〜１０質量％、より好ましくは、０．０００１質量％〜５質量％、さらに好ましくは、０．００１質量〜３質量％含有させることが好ましい。これは、ＴＲＰＶ受容体活性化剤の含有量が、少なすぎるとＴＲＰＶ活性化作用、並びに、ＴＲＰＶ活性化によるＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を介した皮膚バリア機能向上作用が発揮されず、多すぎても、効果が頭打ちになり、この系の自由度を損なう場合が存するためである。また、かかる成分は、ＴＲＰＶ、取り分け、ＴＲＰＶ４が存在する表皮細胞への作用、標的部位への集積性及び選択性に優れ、高い安全性及び安定性を有するために、医薬、医薬部外品、食品、化粧料などへの使用が好ましく、より好ましくは、化粧料又は医薬部外品である。

【0054】

本発明の皮膚外用剤においては、前記必須成分以外に、通常医薬、医薬部外品、食品、化粧料で使用される任意成分を含有することが出来る。化粧料であれば、この様な任意成分としては、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリ−ブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、オレイルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、オクチルドデカノ−ル等の高級アルコ−ル、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコ−ル、ジプロピレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオ−ル、１，２−ペンタンジオール等の多価アルコ−ル類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。本発明の皮膚外用剤の製造は、本発明のＴＲＰＶ受容体活性化剤を含有させる以外は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。

【0055】

これらの必須成分、任意成分を常法に従って処理し、ロ−ション、乳液、エッセンス、クリ−ム、パック化粧料、洗浄料などに加工することにより、本発明の皮膚外用剤は製造できる。皮膚に適用させることの出来る剤型であれば、いずれの剤型でも可能であるが、有効成分が皮膚に浸透して効果を発揮することから、皮膚への馴染みの良い、ロ−ション、乳液、クリ−ム、エッセンスなどの剤型がより好ましい。

【実施例】

【0056】

以下に、実施例をあげて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ、限定されないことは言うまでもない。

【0057】

＜試験例１：ＴＲＰＶ受容体活性化剤を用いたＴＥＲ値測定試験＞
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−カルシウムイオン含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２：倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて培養した。Millicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にトランズウェル（コーニング社製、３４６０-Ｃｌｅａｒ）をセットし、上層０．５ｍＬ、下層１．５ｍＬの前記培養液を入れ、前記トランズウェル上層に前記NHEKを２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²で播種し、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて２４時間培養した。前記ＮＨＥＫが１００％コンフルエントまで増殖したことを確認し、１．５ｍＭ塩化カルシウム添加Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、３３℃、５％二酸化炭素気流下にて４８〜７２時間培養して、表皮角化細胞層膜を構築した。その後、１０μＭ ４α−ＰＤＤ（シグマ社製）、３ｍＭカンファー（Camphor）（シグマ社製）又はメタノ−ル（ベヒクル、和光純薬株式会社製）をそれぞれ添加した１．５ｍＭ 塩化カルシウム添加Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、ＴＲＰＶ４／ＴＲＰＶ３不活性温度領域である２４℃、５％二酸化炭素気流下にて培養した。各物質を含有する培地に交換後、０、３、６、９時間後にＴＥＲ値を測定した。ＴＥＲ値は、サンプルをクリ−ンベンチ内で３０分間馴化した後、Millicell ERS（ミリポア社製）を用いて測定を行った。結果を図１に示す。

【0058】

皮膚バリア機能に深く関与する表皮細胞においては、ＴＲＰＶ３及びＴＲＰＶ４の特異的な発現が確認されている。図１の結果より、ＴＲＰＶ４不活性温度領域において、ＴＲＰＶ４リガンドである４α−ＰＤＤ存在下で培養したＮＨＥＫは、非存在下で培養したＮＨＥＫに比して、統計学的に有意なＴＥＲ値の上昇が確認された。一方、ＴＲＰＶ３リガンドのカンファー存在下で培養したＮＨＥＫにおいては、非存在下に比して、ＴＥＲ値の上昇は認められなかった。ＴＥＲ値の上昇、即ち、ＴＪ及び／又はＡＪ形成促進による皮膚バリア機能向上作用は、ＴＲＰＶ４の特異的な活性化により発揮されることが示された。

【0059】

＜試験例２：ＴＲＰＶ受容体活性化剤を用いたＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験＞
前記のＴＥＲ値測定試験において、測定に使用した培地交換後９時間後のサンプルの培地を除去した。前記トランズウェル上層に０．５ｍＬのＡｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒ（１．４５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭグルコース、１ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを含有するＰＢＳ）、下層に１．５ｍＬのＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｅｒ（１．４５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭグルコースを含有するＰＢＳ）を添加し、３時間培養した。Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを回収した後、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＡｐｉｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒにより標準曲線群（１００ｍｇ／ｍＬ〜０ｍｇ／ｍＬ）を作製する。回収したＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ｂｕｆｆｅｒを９６ｗｅｌｌに２００ｍＬずつ添加した後、分光光度計（励起４８５／５３５ｎｍ）にて測定した。結果を図２に示す。

【0060】

図２の結果より、ＴＲＰＶ４温度不活性化領域において、ＴＲＰＶ４リガンドである４α−ＰＤＤ存在下で培養したＮＨＥＫは、非存在下で培養したＮＨＥＫに比して、統計学的に有意なＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量の抑制が確認された。一方、ＴＲＰＶ３リガンドのカンファー存在下においては、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量の抑制は認められなかった。ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過量の抑制、即ち、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進による皮膚バリア機能向上作用は、ＴＲＰＶ４の特異的な活性化により発揮されることが示された。

【0061】

＜試験例３：ｓｉ−ＲＮＡ トランスフェクション試験＞
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、サブコンフルエントになるまで培養した後、トリプシンＥＤＴＡにより剥離、回収し、６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに７．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて２時間培養した。また、以下の手順に従い、ｓｉ−ＲＮＡトランスフェクション（ｖｏｌｕｍｅは１ ｗｅｌｌ分で記載）を行った。５００μＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに、５μＬの１０μM ｓｉ−ＲＮＡ（On TargetTplus SMARTpool L-004195-00-0005、Human TRPV4、NM 147204、Target Sequence：配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７の配列を有するｓｉ−ＲＮＡの混合物）を加え、次に１５μＬのＨｉｐｅｒＦｅｃｔを加えてボルテックスにより混合した後、室温で１０分間静置した。ウェルに滴下し緩やかに拡散させ、３７℃、５％二酸化炭素気流下で２４時間培養した後、１．５ｍＭ塩化カルシウム含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、経時的にＴＥＲ値及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過性を測定した。また、ｓｉ−ＲＮＡによるＴＲＰＶ４ノックダウン効率は、Hs TRPV4 1 SG QuantiTect Primer Assay（キアゲン社製: QT00077217、配列非公開）をプライマ−として、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＴＲＰＶ４ ｍＲＮＡ発現量を求め、これにより確認した。結果を図３〜図６に示す。尚、これらのｓｉ−ＲＮＡのトランスフェクション試験は、市販のデザイン済みsi−RNA ON−TARGET plus SMART pool Human TRPV4（Thermo scientific社製）を使用し、行った。

【0062】

図３及び図４の結果より、ＮＨＥＫにおけるｓｉ−ＲＮＡトランスフェクションにより、極めて高いノックダウン効率でＴＲＰＶ４ ｍＲＮＡの発現を抑制し、その抑制作用は、ＴＲＰＶ４に特異的であった。また、図５及び図６の結果により、ＮＨＥＫに比して、ＴＲＰＶ４をノックダウンしたＮＨＥＫ（ＴＲＰＶ４／ＫＤ）は、統計学的に有意なＴＥＲ値の抑制が確認された。さらに、ＴＲＰＶ４／ＫＤは、統計学的に有意なＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ透過性の増加が確認された。

【0063】

前記の試験１〜３の結果は、ＴＲＰＶ、取り分け、ＴＲＰＶ４を活性化することにより、ＴＪ及び／又はＡＪの形成が促進され、皮膚バリア機能が向上することを示している。この様に、ＴＲＰＶ受容体活性化作用を有する成分は、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を介し、皮膚バリア機能向上作用を発揮し、皮膚バリア機能改善剤として有用である。

【0064】

＜試験例４：ヒト正常表皮角化細胞におけるＴＲＰＶ４の発現＞
ヒト正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）における、ＴＲＰＶ４タンパク質及びＴＲＰＶ４結合分子の存在を確認するために、免疫沈降を行った。抗体は、ポリＡｂ抗β−カテニン（ケミコン社製）、ｍＡｂ抗Ｅ−カドヘリン（タカラバイオ社製）及びポリＡｂ抗ＴＲＰＶ４（ＴＲＰＶ４のＮ末端ペプチドに対して、調製した）を用いた。
結果を図７に示す。左レーンは、ＮＨＥＫの膜画分を、抗β−カテニン抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）し、得られたコンプレックスのサンプルを分離し、抗Ｎ末端ＴＲＰＶ４抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）したものである。黒三角は、β−カテニンと共沈降したＴＲＰＶ４の位置を示す。右レーンは、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いて再ブロットしたものである。黒三角は、Ｅ−カドヘリンを示す。すなわちＴＲＰＶ４は、細胞膜に存在するβ−カテニンおよびＥ−カドヘリンと共免疫沈降された。β−カテニン及びＥ−カドヘリンはＡＪの主要構成タンパク質であることから、ＴＲＰＶ４が、ヒト角化細胞中にＡＪコンプレックスの一部として存在することが示唆された。

【0065】

＜試験例５：温度変化及びＴＲＰＶ４活性化のヒト正常表皮角化細胞における分化過程への影響＞
ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーは、表皮角化細胞の分化において、重要な役割を果たすことが報告されている。Ｒｈｏファミリーは、細胞内のカルシウムイオン濃度の増加により活性化され、アクチン形成、細胞間接着形成及び表層アクチン形成を含む角化細胞の分化を仲介する。ＴＲＰイオンチャネルは活性化すると、細胞外から細胞内へカルシウムイオンを流入させ、細胞内カルシウムイオン濃度の増加を促す。そこで、ＴＲＰＶ３及びＴＲＰＶ４が活性化される３３℃、並びに活性化温度閾値以下の２８℃で培養したＮＨＥＫ中における、活性型Ｒｈｏの発現量を評価した。
カルシウムイオンスイッチによる分化誘導後、ＮＨＥＫを３３℃又は２８℃で２４時間培養した。その後、２８℃で培養したＮＨＥＫを、１０μＭの４α−ＰＤＤ又は３ｍＭのカンファーで処理し、８時間培養した。これらの各々のＮＨＥＫについて活性型Ｒｈｏの発現量をウェスタンブロッティング法を用いて評価した。
結果を図８に示す。活性型Ｒｈｏの発現量を上部パネルに示す。１５μgの全タンパク質を投入量としてロードした（下部パネル）。
２８℃で培養したＮＨＥＫの活性型Ｒｈｏの発現は、３３℃で培養したＮＨＥＫの活性型Ｒｈｏの発現よりも低かった。２８℃における活性型Ｒｈｏの発現量は、ＴＲＰＶ４活性化物質である４α−ＰＤＤの添加により、顕著に増加したが、ＴＲＰＶ３活性化物質であるカンファーによっては、増加しなかった。
これは、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４の活性化温度閾値以下ではＲｈｏ活性の増強には不十分であるが、ＴＲＰＶ４の化学的活性化によって特異的に補われることを示しており、ＴＲＰＶ４が仲介する細胞内カルシウムイオン流入がＲｈｏの活性化に関与することが示唆された。

【0066】

次に、３３℃又は２８℃で培養、もしくは２８℃でＴＲＰＶ４およびＴＲＰＶ３を化学的に活性化したＮＨＥＫにおけるＡＪ及びＴＪ関連タンパク質（Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、アクチン及びオクルディン）の局在を比較するために、免疫蛍光染色を行った。
結果を図９に示す。カルシウムイオンスイッチによる分化誘導後、ＮＨＥＫを３３℃又は２８℃で２４時間培養した。その後、２８℃で培養したＮＨＥＫを、１０μＭの４α−ＰＤＤ又は３ｍＭのカンファーで処理した。これらのＮＨＥＫの細胞間接着形成過程をタイムコース（０−４８時間）で確認した。細胞膜周辺を取り囲むアクチン（原図では緑）、細胞間接着部に存在するβ−カテニン（原図では紫）及びＥ−カドヘリン（原図では赤）を、拡大イメージで示す。白矢印は、β−カテニン及びＥ−カドヘリンからなるＡＪの“ジッパー構造”を示す。
カルシウムイオンスイッチによる分化誘導から４時間後、３３℃および２８℃で培養したＮＨＥＫは共に、ＡＪ関連タンパク質であるβ−カテニンとＥ−カドヘリンが細胞膜辺縁部に沿って局在し、特徴的な“ジッパー構造"を示し、初期の細胞間接着は、培養温度に関係なく形成されることが示唆された。３３℃における２４及び４８時間後、細胞は互いに層をなし、周囲の表層アクチンは、明らかにハニカム様ネットワークを示した。対して、２８℃における細胞間接着は、２４及び４８時間後であっても、初期の形成段階のままであった。この未成熟な分化は、４α−ＰＤＤの添加により回復したが、カンファーでは回復されなかった。

【0067】

さらに、カルシウムイオンスイッチによる分化誘導から４８時間後、ＴＪ関連タンパク質であるオクルディンの免疫蛍光染色を行い、その局在を確認した。抗体は、ｍＡｂ抗オクルディン（インビトロジェン社製）を用いた。
結果を図１０に示す。ＴＪ関連タンパク質の一つであるオクルディン（原図では赤）は、分化誘導から４８時間後において、３３℃で培養したＮＨＥＫでは連続して細胞間接着部に沿って局在したのに対し、２８℃においてはオクルディンの細胞間接着部における局在は断続的であった。また、ＡＪ関連タンパク質の場合と同様に、２８℃においてオクルディンは、４α−ＰＤＤにより細胞接着部に沿って連続的に局在したが、カンファーでは局在しなかった。
ＲＴ−ＰＣＲ法によるＡＪおよびＴＪ関連ｍＲＮＡの発現レベルを確認したところ、４α−ＰＤＤの添加によるこれらのｍＲＮＡの発現量変化は確認されなかった。
これらの結果から、ＴＲＰＶ４活性化はＡＪおよびＴＪ関連分子の発現量に関与するのではなく、ヒト正常表皮角化細胞の分化過程におけるＡＪの構造形成を促し、結果としてＴＪ形成を促進することが示唆された。

【0068】

＜試験例６：温度変化及びＴＲＰＶ４活性化によるヒト角化細胞及びヒト皮膚組織におけるバリア機能への影響＞
皮膚におけるバリア機能は、大きく角層バリア機能と表皮細胞間（ＴＪ）バリア機能に大別される。本検討では、ＮＨＥＫのＴＪバリア機能が、温度及びＴＲＰＶ４活性化により影響を受けるかを評価するために、ＴＪバリア機能を評価する際に指標とする経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）値を、Millicell-ERS（ミリポア社製）を用いて測定した。
カルシウムイオンスイッチによる分化誘導を行ったＮＨＥＫを３３℃（◇）もしくは２８℃（□）で培養し、培養開始から２４時間後に、２８℃で培養したＮＨＥＫに４α−ＰＤＤ（△）又はカンファー（○）を添加してＴＲＰＶ４およびＴＲＰＶ３活性化の増強を行った。
結果を図１１に示す。矢印は、増強のタイミングを示す。データは、５回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．で示す。（＊＊：Ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ．：有意ではない。）繰り返し測定のある二元配置分散分析を行った後、ボンフェローニ法により、有意差検定を行った。Ｐ＜０．０５の値を有意と判断した。
２８℃で培養したＮＨＥＫのＴＥＲ値は、３３℃で培養したものに比べ有意に低く、２８℃におけるオクルディンの断片化した免疫蛍光シグナルの結果（図１０）を支持した。上記試験例１にも示したとおり、２８℃で増強を行ったＮＨＥＫのＴＥＲ値は、ＴＲＰＶ活性化物質無と比べて、４α−ＰＤＤにより有意に増強されたが、カンファーでは増強されなかった。
これらのことは、ヒト角化細胞のＴＪバリア機能は、ＴＲＰＶ４活性化温度閾値以下で低減するが、増強によってＴＲＰＶ４を特異的に活性化することで克服されることを示唆した。
さらに、上記のようなＴＪバリア機能の変化が、ＴＲＰＶ４の関与によって特異的に引き起こされる現象であることを確認するために、ｓｉ−ＲＮＡを用いたＮＨＥＫのＴＲＰＶ４ノックダウンを行った。ＴＲＰＶ４をノックダウンしたＮＨＥＫのＴＥＲ値は、コントロールｓｉ−ＲＮＡをトランスフェクションしたＮＨＥＫ（Ｍｏｃｋ）に比べ、有意に低減した（図５）。
これらのことは、ヒト角化細胞のＴＪバリア機能は、ＴＲＰＶ４の発現が抑制されることで、低減することを示唆した。

【0069】

さらに、新鮮ヒト皮膚組織を用いたｅｘ ｖｉｖｏ評価により、角層バリア破壊後の皮膚バリア機能の回復における温度の影響を評価した。このとき用いたヒト皮膚組織は、インフォームドコンセントによって患者の同意を得た後に、外科的手術によって切除された皮膚組織（バイオプレディック社製及び順天堂浦安病院）である。これらのヒト皮膚組織を、Skin Long Term Culture Medium（バイオプレディック社製）を用いて前培養した後、Ｃ４０ＳＨ０２粘着テープ（生化学工業株式会社製）でストリッピング処理を行い角層を完全除去することで、バリア破壊を行った。角層除去によるバリア破壊の直後に、１０μＭの４α−ＰＤＤ、３ｍＭのカンファーをそれぞれ含む水溶液、又は水のみ５０μｌを、ヒト皮膚組織の角層除去部位に直接投与し、３３℃又は２８℃で培養した。皮膚バリア機能の回復は、VAPO SCAN AS-VT100RS（株式会社アサヒテクノラボ）により経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定し、これを下記式に適用して皮膚バリア機能回復率（％）を算出し、評価した：
（角層バリア破壊直後のＴＥＷＬ−各測定点におけるＴＥＷＬ）／（角層バリア破壊直後のＴＥＷＬ−角層バリア破壊前のＴＥＷＬ）×１００
また、２％ EZ-link sulfo-NHS-LC-ビオチン（ピアス社製）を、細胞間物質透過マーカーとして皮内に注入し、マーカーの細胞間透過性を、免疫蛍光染色により評価した。
結果を図１２（Ａ）に示す。（Ａ）は、バリア破壊後１．５、４及び２４時間における皮膚組織のバリア回復率を示す。各ラベルは以下を示す。◇：３３℃水投与、□：２８℃水投与、△：２８℃４α−ＰＤＤ投与、○：２８℃カンファー投与。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．で示す。
バリア破壊後２４時間における、３３℃及び２８℃で培養した場合の皮膚組織のバリア機能回復率は、２８℃で培養した皮膚組織において、３３℃で培養した皮膚組織に比べ、明らかに低減していた。４α−ＰＤＤ又はカンファーで処理した皮膚組織のバリア回復率について、２８℃で培養した皮膚組織と比較した結果、４α−ＰＤＤで処理した皮膚組織は、２８℃で培養した皮膚組織と比べ、高い回復率を示したが、カンファーで処理した皮膚組織は、２８℃で培養した皮膚組織と比べ、低い回復率を示した。
これらの結果は、以下に示す、細胞間物質透過の評価によっても支持される。

【0070】

結果を図１２（Ｂ）に示す。（Ｂ）は、角層バリア破壊後２４時間における皮膚組織断面の免疫蛍光画像を示す。矢印は、表皮顆粒層に局在する主要なＴＪ関連タンパク質のひとつであるオクルディン（原図では緑）を示す。白三角は、オクルディンの位置を通過した物質透過マーカー（原図では赤）を示す。
３３℃で培養した皮膚組織において、物質透過マーカーはオクルディンが局在する表皮顆粒層の最表層部において、透過が遮断された。対して、２８℃で培養した皮膚組織では、物質透過マーカーは、オクルディンが局在する表皮顆粒層の最表層よりも上部へ漏出した。２８℃における物質透過マーカーの漏出は、４α−ＰＤＤにより抑制されたが、カンファーでは抑制されず、細胞間接着とりわけＴＪの強固さは、ＴＲＰＶ４の活性化に依存することを示した。
発明者等の先の報告では、表皮ＴＪが、角化細胞に極性を与え、ラメラボディ分泌を促進することにより、角層バリア形成において重要な役割を持つことを示した。したがって、ＴＲＰＶ４の活性化は、ＴＪバリア機能だけではなく、角層バリア機能をも調節していることが示唆される。
以上の結果から、すなわち、ＴＲＰＶ４の活性化温度閾値以下の低温では、皮膚バリア回復が遅れるが、ＴＲＰＶ４の活性化により特異的に補われることが示された。

【0071】

［実施例１］
＜ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリからの化合物１〜４の単離精製＞
ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリより得られる植物抽出物は、医薬部外品原料規格２００６に従い製造することも出来るし、丸善製薬株式会社、山川貿易株式会社等より市販されている植物抽出物を購入し、使用することも出来る。本実施例においては、山川貿易株式会社より購入した、ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリより得られた植物抽出物を使用した。
ミソハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリより得られた植物抽出物（9950g、山川貿易株式会社製）を濃縮した後、酢酸エチル及び水を加え、液液分配を行い、得られた水層画分をダイアイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）に通し、カラム吸着部を５０％メタノ−ル及び１００％メタノ−ル（和光純薬工業株式会社製）により順次溶出した。前記の溶出部の内、１００％メタノ−ル溶出分（745mg）に関し、分取ＨＰＬＣにて物質ピ−クを単離した。分取条件は、以下の通りである。

【0072】

＜分取ＨＰＬＣ条件＞
化合物１,３
[カラム] Inertsil ODS-3 (GL Sciences Inc.) 5μm φ30 x 500 mm
[溶媒] グラジエント，A液 CH₃CN, B液 0.1% TFA in H₂O，0-300 min: 15〜25 % A, 300-360 min: 25% A
[流速] 9.5 mL/min, 検出：UV 240 nm，1 Fr. =3 min.

【0073】

化合物２
[カラム] Develosil C30-UG-5 (5μm) φ20 x 250 mm
[溶媒] 25% CH₃CN＋0.05%TFA
[流速] 6.5 mL/min, 検出：UV 240 nm，1 Fr. =4 min.

【0074】

化合物４
[カラム] TSKgel ODS-80Ts（5μm）4.6mmI.D.×25cm（東ソー株式会社）
[溶媒] グラジエント,A液 0.1%TFA in H₂O， B液：CH₃CN, 0-80min B10〜B90%, 80-110min B90%
[流速] 1.0mL/min, 温度: 40℃, 検出: UV210-400nm（Max）

【0075】

前記の手順に従い単離精製された化合物１〜４の化学構造及び物理恒数を以下に示す。尚、化合物１〜４の化学構造は、核磁気共鳴（¹Ｈ及び¹³Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル及び文献情報を基に決定した。

【0076】

【化17】

＜化合物１： 3-O-methylellagic acid 4'-O-α-L-rhamanopyranoside＞

【0077】

¹H-NMR（400 MHz、DMSO-d₆) δ： 1.16（3H、 d、 J=6.5 Hz）、3.34（1H、m）、3.54（1H、m）、3.73（1H、m）、3.98 （1H、m）、4.07（3H、s）、5.56（1H、br s）、7.48（1H、s）、7.79（1H、s）．
¹³C-NMR (400 MHz、DMSO-d₆) δ： 17.9、61.5、70.1、70.3、70.5、71.6、99.9、107.9、110.5、111.5、111.7、112.3、114.3、136.5、139.7、141.3、141.9、148.8、150.2、158.5、158.8．

【0078】

【化18】

＜化合物２： 3，3'-di-O-methylellagic acid 4'-O-β-D-glucopyranoside＞

【0079】

¹H-NMR(400 MHz、DMSO-d₆) δ： 3.20-3.45（4H、m）、3.53（1H、m）、3.73（1H、m）、4.01（3H、s）、4.05（3H、s）、5.02（1H、d、J=7.5 Hz）、7.67（1H、s）、7.82（1H、s）．

【0080】

【化19】

＜化合物3： 3，4，3’-tri-O-methylellagic acid 4'-O-β-D-glucopyranoside＞

【0081】

¹H-NMR（400 MHz、DMSO-d₆) δ： 3.20-3.45（4H、m）、3.52（1H、m）、3.71（1H、m）、4.02（3H、s）、4.06（3H、s）、4.11（3H、s）、5.16（1H、d、J=7.5 Hz）、7.67（1H、s）、7.85（1H、s）．

【0082】

【化20】

＜化合物4： 3'-O-methyl-3,4-methylenedioxyellagic acid 4'-O-β-D-glucopyranoside＞

【0083】

¹H-NMR（400 MHz、DMSO-d₆) δ： 3.19（1H、m）、3.35（1H、m）、3.38（1H、m）、3.44（1H、m）、3.52（1H、m）、3.71（1H、br d、J=11.5Hz）、4.11（3H、s）、5.16（1H、d、J=7.5Hz）、6.40（2H、s）、7.57（1H、s）、7.86（1H、s）．

【0084】

［実施例２］
＜化合物１〜４の細胞間バリア機能評価試験＞
前記の手順に従い精製された化合物１〜４に関し、カルシウムイメ−ジングによるＴＲＰＶ４活性化作用評価試験を行った。化合物１及び３の結果を図１３〜１６に示す。

【0085】

後記の実施例５に記載の試験方法に従い行った、カルシウムイメ−ジングによるＴＲＰＶ４活性化作用評価試験において、本発明の化合物１及び３をカルシウム含有溶液Ａ〔組成：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭグルコ−ス、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）〕中にてｍｏｕｓｅ ＴＲＰＶ４／ｐｃＤＮＡ 導入ＨＥＫ２９３細胞（以下、ｍＶ４／ＨＥＫ２９３）に処理すると、顕著な細胞内カルシウムイオン濃度の増加が確認された（図１３及び図１５）。一方、対照となるｐｃＤＮＡ導入ＨＥＫ２９３細胞（以下、ｐｃＤＮＡ／ＨＥＫ２９３）では細胞内カルシウムイオン濃度の変化は確認されなかった（図１４及び１６）。
以上より、本発明の化合物による細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用は、ＴＲＰＶ４特異的な細胞外からのカルシウムイオン流入によるものであることが推察できる。

【0086】

また、化合物１、３、４に関し、前記の試験例１に記載の試験方法に従い行ったＴＥＲ測定による正常ヒト表皮角化細胞の細胞間バリア機能評価試験の結果を、図１７〜図１９に示す。縦軸は、ＴＥＲ値（Ω・ｍ²）、横軸は、カルシウムスイッチによる分化誘導後のＴＥＲ測定時間を表す。この結果より、本発明の化合物は、対照となるＤＭＳＯ添加群と比較して顕著なＴＥＲ値の増加を示し、細胞間バリア機能の促進作用が認められた。

【0087】

［実施例３］
＜本発明のＴＲＰＶ受容体活性化作用を有する植物抽出物の製造方法＞
本発明の植物抽出物（ミツハギ科サルスベリ属オオバナサルスベリ、アカネ科カギカズラ属ガンビ−ルより得られる抽出物）は、医薬部外品原料規格２００６に従い製造することも出来るし、丸善株式会社等により市販されている植物抽出物を購入し、使用することも出来る。本実施例においては、丸善株式会社より購入した植物抽出物を使用した。

【0088】

［実施例４］
＜ヒトＴＲＰＶ４を発現する細胞の作製＞
下記の実験手順に従い、ヒトＴＲＰＶ４発現細胞を作製した。ヒトＴＲＰＶ４をコ−ドするｃＤＮＡ〔配列番号１：（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ ０２１６２５）の９０ｂｐ〜２７０５ｂｐのポリヌクレオチド〕を、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドをプライマ−として、ＰＣＲを行い、増幅し、哺乳動物細胞用ベクタ−である商品名：ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）のＭＣＳのＢａｍＨＩサイト及びＸｈｏＩサイト間に挿入し、ヒトＴＲＰＶ４発現ベクタ−を得た。得られたヒトＴＲＰＶ４発現ベクタ−（０．５μｇ相当量）とＤｓＲｅｄ（０．１μｇ相当量）、プラスリ−ジェント（商品名、カタログ番号：１１５１４−０１５、インビトロジェン社製）６μＬ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１、インビトロジェン社製）１００μＬとを混合し、混合物１を得た。また、リポフェクタミン（登録商標、カタログ番号：１８３２４−０１２、インビトロジェン社製）４μＬとＯＰＴＩ−ＭＥＭ １００μＬとを混合し、混合物２を得た。一方、ＨＥＫ２９３細胞（５×１０⁵個／直径３５ｍｍシャ−レ）を１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて、３７℃、５％二酸化炭素気流下にて７０％のコンフルエントまで培養した。その後、得られた細胞に、前記混合物１と混合物２との混合物を添加した。これにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＶ４発現ベクタ−を導入し、ＴＲＰＶ４発現細胞を得た。また、同様の方法で、ヒトＴＲＰＶ４を挿入していないベクタ−を作製し、これをＨＥＫ２９３細胞に導入してＭｏｃｋ細胞を作製した。

【0089】

［実施例５］
＜ＴＲＰＶ活性化作用評価１：本発明における植物抽出物のカルシウムイメ−ジング法によるＴＲＰＶ４活性化作用評価＞
本発明の植物抽出物を、溶液Ａ〔組成：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭグルコ−ス、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）〕に添加し、試験液を作製した。各試験液中における植物抽出物の濃度は、０．１質量％とした。前記の実施例４に従い作製されたＴＲＰＶ４発現細胞もしくはＭｏｃｋ細胞を、１〜２０μｇ／ｍｌのＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を含む１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で６０〜９０分間インキュベ−ション（３７℃、５％二酸化炭素気流下）して、ＴＲＰＶ４発現細胞もしくはＭｏｃｋ細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入した。ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入後のＴＲＰＶ４発現細胞もしくはＭｏｃｋ細胞を、カルシウムイメ−ジング装置倒立顕微鏡のチャンバ−（RC-26G; Warner Instruments社製）に入れ、溶液Aにて洗浄した。続いて、前記試験液をチャンバ−に入れて循環させながら、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度とを測定した。その後、前記試験液を用いた場合の励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比（３４０ｎｍでの蛍光強度／３８０ｎｍでの蛍光強度）を算出した。細胞内カルシウムイオン濃度の変化（カルシウムイオン濃度の増加）に対する被験物質による亢進作用は、IPLabソフトウェア（Scanalytics社製）により解析した。また、陽性対照としてＴＲＰＶ４リガンドである４α−ホルボ−ルエステル（４α−ＰＤＤ）を用いて同様の評価を実施した。結果を図２０〜図２２に示す。

【0090】

図２０〜図２２の結果より、陽性対照の４α−ＰＤＤは、顕著な細胞内カルシウムイオン濃度の増加が認められ、この評価系の客観性が確認された。また、本発明の植物抽出物は、ＴＲＰＶ４発現細胞において顕著な細胞内カルシウムイオン濃度の増加が確認された。一方、Ｍｏｃｋ細胞においては確認されなかった（図２３及び２４）。さらに、カルシウムイオンフリ−の溶液Ｂ〔組成：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭグルコ−ス、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）〕に本発明の植物抽出物としてアセンヤク抽出物を添加したところ、ＴＲＰＶ４発現細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の変化は確認されず（図２５及び２６）、Ｍｏｃｋ細胞においても確認されなかった（図２７及び図２８）。このことから、アセンヤクエキスによる細胞内カルシウムイオン濃度の増加作用は、ＴＲＰＶ４を介した細胞外からのカルシウムイオン流入であることがわかる。

【0091】

［実施例６］
＜ＴＪ及びＡＪの形成促進作用評価１：本発明における植物抽出物のＴＥＲ値測定＞
前記の試験例１に記載の試験方法に従い、本発明の植物抽出物のＴＥＲ値を測定した。結果を図２９に示す。図２９において、縦軸は、ＴＥＲ値（Ωｍ²）、横軸は、測定時間を表す。図２９の結果より、本発明の植物抽出物は、顕著なＴＥＲ値の増加を示す、ＴＪ及び／又はＡＪの機能促進作用が認められた。

【0092】

［実施例７］
＜ＴＪ及びＡＪの形成促進作用評価２：本発明における植物抽出物のＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験＞
前記の試験例２に記載の試験方法に従い、本発明の植物抽出物のＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過性を評価した。結果を図３０に示す。図３０の結果より、本発明の植物抽出物は、顕著なＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過性の抑制が認められ、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用が認められた。

【0093】

図２９及び図３０に示した結果より、本発明の植物抽出物は、前記のＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用評価（ＴＥＲ値測定及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ物質透過試験）において、共にＴＪ及びＡＪ形成促進作用を示した。前記結果より、本発明の植物抽出物は、ＴＲＰＶ活性化作用、並びに、ＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用を有し、ＴＲＰＶ活性化作用を介するＴＪ及び／又はＡＪの形成促進作用による皮膚バリア機能改善効果を有する。

【0094】

［実施例８］
＜本発明の組成物＞
＜本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分を含有する組成物（皮膚外用剤）の製造＞
表１及び２に示す処方に従って、本発明の皮膚バリア機能向上作用を有する成分を含有する組成物（皮膚外用剤）であるロ−ション化粧料を作製した。即ち、処方成分を８０℃で攪拌し、可溶化し、しかる後に、攪拌下冷却して、ロ−ション化粧料［化粧料１又は化粧料２（皮膚外用剤１又は２）］を得た。また、同様の操作を行い本発明の組成物（皮膚外用剤）の「皮膚バリア機能向上作用を有する成分」を「水」に置換した比較例１も作製した。

【0095】

【表1】

【0096】

【表2】

【0097】

［実施例９］
＜本発明の皮膚外用剤の肌荒れ改善試験＞
パネラ−を使用し、本発明の皮膚外用剤である化粧料１、化粧料２、比較例１に付いて、テ−プストリッピングによって作成した肌荒れモデルでの、肌荒れ改善作用を評価した。即ち、左右の前腕に１cm×１cmの部位を４つずつ規定し、テ−プストリッピングを各部位１５回行い、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）をインテグラル社製の「テヴァメ−タ−」で計測した。その後、一日一度検体を５０μＬ塗布し、この作業を６日間続け、７日目に再度ＴＥＷＬを計測した。最初の日のＴＥＷＬ値から７日目のＴＥＷＬ値を減じ、最初の日のＴＥＷＬ値で除し、１００を乗じてＴＥＷＬ改善率（％）を算出した。ｎ数は１５とした。結果を表３に示す。これより、本発明の皮膚外用剤は肌荒れ改善作用に優れることがわかる。

【0098】

【表3】

【産業上の利用可能性】

【0099】

本発明は、化粧料原料（但し、医薬部外品を含む）として好適な皮膚バリア機能向上作用を有する成分であり、化粧料などの皮膚外用剤に応用出来る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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