特許 5743543 ヒト化抗ＣＸＣＲ５抗体、その誘導体及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5743543

(24)【登録日】2015年5月15日

(45)【発行日】2015年7月1日

(54)【発明の名称】ヒト化抗ＣＸＣＲ５抗体、その誘導体及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150611BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20150611BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150611BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150611BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150611BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150611BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150611BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20150611BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K16/28ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P37/06

   A61P19/02

   C12P21/08

【請求項の数】25

【全頁数】86

(21)【出願番号】特願2010-523100(P2010-523100)

(86)(22)【出願日】2008年8月27日

(65)【公表番号】特表2010-537636(P2010-537636A)

(43)【公表日】2010年12月9日

(86)【国際出願番号】US2008074381

(87)【国際公開番号】WO2009032661

(87)【国際公開日】20090312

【審査請求日】2011年8月24日

(31)【優先権主張番号】60/968,792

(32)【優先日】2007年8月29日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】レナータ・リー

(72)【発明者】

【氏名】ヴァンサン・ミコル

(72)【発明者】

【氏名】エリザベス・アレン

(72)【発明者】

【氏名】ノーマン・ルエッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ベアトリス・カメロン

(72)【発明者】

【氏名】トマス・オリギノ

(72)【発明者】

【氏名】ニコラ・ボラン

【審査官】 木原 啓一郎

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３６６３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３８２７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００３／００２６０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J Exp Med.，１９９８年 ２月１６日，Vol.187, No.4，p.655-660

【文献】 Blood，２００７年 ７月２５日，Vol.110, No.9，p.3316-3325

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＸＣＲ５の細胞外ドメインに特異的に結合する、単離した抗体またはそのフラグメントであって、
当該抗体またはそのフラグメントが、以下：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１７または配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（Ｖ_L）、および、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖（Ｖ_H）；
（ｄ）配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、および、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列を含む可変重鎖；
（ｅ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、および、配列番号３７のアミノ酸配列を含む可変重鎖；または
（ｆ）配列番号３９、配列番号４１または配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、および、配列番号４５または配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変重鎖
を含む、抗体またはそのフラグメント。

【請求項2】

ヒトＣＸＣＲ５の細胞外ドメインに特異的に結合する、単離した抗体またはそのフラグメントであって、
当該抗体またはそのフラグメントが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、および、配列番号３３のアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、抗体またはそのフラグメント。

【請求項3】

抗体またはそのフラグメントが１またはそれ以上の定常領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項4】

抗体またはそのフラグメントがＣ_H1、Ｃ_H2、Ｃ_H3又はその組み合わせを含む、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項5】

１またはそれ以上の定常領域がＩｇＧ抗体からのものである、請求項３に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項6】

ＩｇＧ抗体がＩｇＧ４抗体である、請求項５に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項9】

請求項８に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。

【請求項10】

抗体またはそのフラグメントが可変軽鎖を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項11】

抗体またはそのフラグメントが可変重鎖を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項12】

抗体またはそのフラグメントが一本鎖Ｆｖ抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項13】

薬剤学的に許容できる担体および治療上の有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、医薬組成物。

【請求項14】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、ＣＸＣＲ５病を治療するための薬剤。

【請求項15】

ＣＸＣＲ５病が膵臓がん、結腸がん、膀胱がん、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞白血病、狼瘡、シェーグレン症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、大腸炎、関節リューマチ、乾癬性関節炎、慢性炎症性疾患、または、拒絶を起こしている移植片である、請求項１４に記載の薬剤。

【請求項16】

ＣＸＣＲ５病が関節リューマチである、請求項１５に記載の薬剤。

【請求項17】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを作製する方法であって、
（ａ）非ヒトＣＸＣＲ５抗体の可変領域に相同性のヒト可変領域を同定すること；
（ｂ）該非ヒトＣＸＣＲ５抗体の可変領域の分子立体配座から、柔軟性であるアミノ酸及び該柔軟性残基に隣接しそして上記可変領域の分子立体配座を保持するアミノ酸を同定すること；
（ｃ）該ヒト可変領域において工程（ｂ）の上記同定アミノ酸に相同性のアミノ酸を同定すること；
（ｄ）工程（ｂ）の上記同定アミノ酸を工程（ｃ）の上記同定アミノ酸で置換してヒト化可変領域を生産すること；及び
（ｅ）工程（ｄ）の該ヒト化可変領域をヒト配列と結合させて、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを生産すること；
を含む方法。

【請求項18】

前記工程（ｂ）が分子動力学モデリングを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

工程（ｄ）が相補性決定領域から５オングストロームより遠く離れているアミノ酸を置換しないことを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

工程（ｄ）の前記ヒト化可変領域が、該ヒト化可変領域配列をヒト抗体配列の収集物の配列と比較することにより、ヒト抗体に類似していることを更に確認する、請求項１７に記載の方法。

【請求項21】

工程（ｄ）の前記ヒト化可変領域が、該ヒト化可変領域トラジェクトリーをヒト抗体トラジェクトリーの収集物の配列と比較することにより、ヒト抗体に類似していることを更に確認する、請求項１７に記載の方法。

【請求項22】

工程（ｄ）の該ヒト化可変領域がＢ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープを含まない、請求項１７に記載の方法。

【請求項23】

ＣＸＣＲ５病を治療するための薬剤を製造するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントの使用。

【請求項24】

ＣＸＣＲ５病が膵臓がん、結腸がん、膀胱がん、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞白血病、狼瘡、シェーグレン症候群、重症筋無力症、多発性硬化症、大腸炎、関節リューマチ、乾癬性関節炎、慢性炎症性疾患、または、拒絶を起こしている移植片である、請求項２３に記載の使用。

【請求項25】

ＣＸＣＲ５病が関節リューマチである、請求項２４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ＣＸＣＲ５抗体、及び不適当なＣＸＣＲ５活性若しくは代謝、又はその不適当な若しくは偶発的使用（例えば、病原体による）から生ずる、ヒトを含む哺乳動物の疾患又は障害の改善、治療又は予防におけるそれらの使用に関する。関心ある抗体は、ＣＸＣＬ１３などのリガンドの、ＣＸＣＲ５などのその受容体との結合をブロックすることができる。関心ある該抗体及びその誘導体を含む予防用、免疫療法用及び診断用組成物、並びにＢリンパ球などのＣＸＣＲ５⁺細胞の不適当な代謝及び／又は活性によって引き起こされる、ヒトを含む哺乳動物の疾患を予防又は治療する方法における、それらの使用も開示されている。このような疾患は、自己免疫欠損及び関節リウマチ（ＲＡ）などの炎症によって引き起こされる又は特徴付けられる疾患を含み、ここでＣＸＣＲ５がアップレギュレーションされる。

【背景技術】

【0002】

バーキットリンパ腫受容体（ＢＬＲ１）、ＣＤ１８５、ＭＤＲ１５及びＭＧＣ１１７３４７としても知られるＣＸＣＲ５は、ケモカイン受容体ファミリーのメンバーであるＧタンパク質結合受容体である。リガンドは、Ｂ細胞化学誘引物質であるＣＸＣＬ１３としても知られているＢＬＣである。
未処理のＣＸＣＲ５前駆体は、４２Ｋ_Dの分子量を有する３７２アミノ酸長である。
ＣＸＣＲ５は、Ｂ細胞遊走及び特定の解剖学的コンパートメント内の局在化の役割を果たしている。ノックアウトマウスは、末梢リンパ節を欠き、パイエル板をほとんど有さず、そしてＢ細胞レベルは低下している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明は、ＣＸＣＲ５に特異的に結合する新規なヒト化及びヒト抗体、並びにそのフラグメント及び誘導体を提供する。幾つかの抗体、及びそのＣＸＣＲ５結合フラグメントは、インビボ製造及び使用を通して安定な分子をもたらす鎖内ジスルフィド結合形成を妨げるように変化し得る。関心ある他の抗体は、ＦｃＲへの結合を最小化するように変化し得る。関心ある幾つかのＣＸＣＲ５抗体は、ＣＸＣＲ５への結合についてＣＸＣＬ１３と競合する。他の抗体はＣＸＣＲ５活性を減少させる。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明は、抗体の可変重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及びそれらの対応する核酸配列を含む。
本発明の別の実施態様は、相補性決定領域（ＣＤＲ）が得られた親分子のＣＸＣＲ５結合能力を保持する、１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域、又はＣＤＲ由来領域を含む結合分子を得るための、抗体のＣＤＲ配列を含む。
関心ある抗体は、Ｂリンパ球などのＣＸＣＲ５⁺細胞に結合するＣＸＣＬ１３、又は他のリガンドを抑制する抗体であり得る。

【0005】

本発明の別の実施態様は、本発明の抗体配列を内部に有する細胞系及びベクターを含む。
本発明の別の実施態様は、ＣＸＣＲ５機能及び代謝に関連する疾患及び障害の治療用の薬剤又は組成物の製造のための、抗体の使用である。
本発明の別の実施態様は、非定型又は異常ＣＸＣＲ５の生物学及び機能に関連する障害の治療における、これらの抗体の使用である。
更なる特徴及び利点は本明細書に記載されており、そして以下の詳細な説明から明白で
ある。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本発明は、それらは本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなしに変動し得るので、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、細胞系、ベクター、又は試薬に限定されない。更に、本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施態様を例示する目的のためであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。異なるように定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語並びにいずれの頭字語も、本発明の分野で当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似か又は均等のいずれの方法及び材料も、本発明の実施において使用することができ、そして典型的な方法、デバイス、及び材料だけが本明細書に記載されている。

【0007】

本明細書に記載のすべての特許及び刊行物は、本発明を用いて及び本発明で使用する可能性のある、それらの中に報告されているタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞及び方法を記載しそして開示する目的のために、参照することによりその全文が本明細書に組み入れられている。しかしながら、本明細書において、いずれも、本発明が先行発明を理由にこのような開示に先行する権利がないことを自認するものと解釈すべきではない。
関心あるＣＸＣＲ５関連方法及び生産物の作製と使用を教示する前に、幾つかの用語及び語句の以下の非限定的定義を、技術者をガイドするために提供する。

【0008】

「ＣＸＣＲ５」は、リンパ球、特にＢ細胞、そして特にナイーブＢ細胞で見出される天然の公知の分子；当該細胞から分離される当該分子；公知材料及び手段を用いて、そしてＣＸＣＲ５をコードする核酸を用いて組み換えにより製造されるこのような分子；及びＣＸＣＬ１３結合などの本発明の実施にとって適切な特性と特徴を保持する細胞外（ＥＣ）ドメインなどのＣＸＣＲ５の一部分にかかわる。可溶性ＣＸＣＲ５分子は、一般的に分子の最初の約６０個のアミノ酸、即ち、ＣＸＣＲ５のアミノ末端部分を含む、基本的にＣＸＣＲ５のＥＣドメインから成る。

【0009】

ＣＸＣＲ５は非プロミスカス受容体である。ＣＸＣＬ１３はＣＸＣＲ５のリガンドであり、そして濾胞樹状細胞などの間質細胞、及びリンパ系組織に構成的に発現する。ＣＸＣＬ１３は、Ｂ細胞、及びＢヘルパー濾胞Ｔ細胞、ＴＦＨと呼ばれるＴ細胞の小サブセットを特異的に引きつける。そのことは、免疫系におけるＴ細胞とＢ細胞集団間の多くの相互作用から鑑みて予測されるものではない。更に、活性化Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ５発現を誘導又はアップレギュレーションする。第３異所性胚中心（ＧＣ）へのリンパ球浸潤は、このような異型リンパ節様構造によりプリセットする特定の障害における疾患重症度及び耐性破壊の増大と良く相関することが見出されている。ＣＸＣＲ５−／−及びＣＸＣＬ１３−／−マウスなどのインビボマウスモデルを用いた場合、受容体か又はリガンドの不存在は、Ｔ及びＢ細胞局在化の変化及び可能な相互作用に因りＧＣ微細構造の変化をもたらす。また、これらのマウスは、重度のコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の発症から保護される。ＣＸＣＲ５はＲＡの病因とかかわりがあるマウスＢ細胞に選択的に発現することから、この受容体をブロックすることは罹患した個体の関節炎発症反応を調節すると考えられる。生物学的製剤（即ち、抗ＴＮＦα及び抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ）による関節リウマチの治療は臨床的に有効なことが示されている；特に、Ｂ細胞標的療法の患者は、臨床徴候及び症状の持続的改善を示している。成熟Ｂ細胞及びＢ細胞ヘルパーＴ細胞のみに発現するＣＸＣＲ５の選択的ターゲッティングは、Ｂ細胞発生に悪影響を及ぼさないか、又は患者を免疫無防備状態にしないと考えられる。リツキシマブと異なり、本抗体は細胞毒性を仲介しない中和抗体である。

【0010】

「ＣＸＣＲ５病」は、ＣＸＣＬ１３又は他のＣＸＣＲ５リガンドの過剰発現又はレベル増加、Ｂ細胞のレベル増加、Ｂ細胞活性のレベル増加、ＣＸＣＲ５のレベル増加又はＣＸ
ＣＲ５の不適当な代謝及び活性によって特徴付けられ又は引き起こされる、疾病、障害、疾患、病態、異常などである。

【0011】

「Ｂ細胞活性」は、局在性であり得る正常Ｂ細胞活性レベルより高く、又は抗体発現、Brutonチロシンキナーゼの存在又は活性、ＣＤ１９の発現又は存在、Ｂ細胞活性因子の発現又は存在などの、Ｂ細胞の生物学的発現又は機能のエビデンスを意味する。

【0012】

抗体鎖のポリペプチド配列に関する「実質的に同一」なる語句は、参照ポリペプチド配列に対し少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の配列同一性を示す抗体鎖と解釈してもよい。核酸配列に関する用語は、参照核酸配列に対し少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％又はそれ以上の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈してもよい。

【0013】

用語「同一性」又は「相同性」は、必要に応じて全配列に対する最大パーセント同一性を達成するために、配列をアラインしギャップを導入した後、そして配列同一性の一部としていずれの同類置換も考慮しないで比較される、対応する配列の残基と同一である候補配列中のヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基の割合を意味することができる。Ｎ末端又はＣ末端伸張も挿入も、同一性又は相同性の減少と解釈されないものとする。アラインメントの方法及びコンピュータプログラムは当技術分野で利用可能であり、そして公知である。配列同一性は配列解析ソフトウェアを用いて測定し得る。

【0014】

語句と用語、抗体又は抗原の「機能性フラグメント、変異体、誘導体又はアナログ」など、及びその形態は、関心ある完全長抗体又は抗原と共通する定性的な生物学的活性を有する化合物又は分子である。例えば、抗ＣＸＣＲ５抗体の機能性フラグメント又はアナログは、ＣＸＣＲ５分子に結合し得るもの若しくはＣＸＣＬ１３などのリガンドの能力を抑制し実質的に低下させ得るもの、又はＣＸＣＲ５に結合するアゴニスト若しくはアンタゴニスト抗体である。１例は、ｓｃＦｖ分子である。ＣＸＣＲ５に関しては、その変異体又はその誘導体は、天然のＣＸＣＲ５とは同一でなく、そしてなお本発明の目的のために使用し得る分子、例えば野生型ＣＸＣＲ５と同一でない一方、それでもなお野生型ＣＸＣＲ５に選択的に結合する抗体を誘導する免疫原として使用し得る分子である。

【0015】

「置換」変異体は、天然配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして同じ位置でその代りに挿入された異なるアミノ酸によって置き換えられた変異体である。置換は、分子中のただ１つのアミノ酸が置換される単一であるか、又は２つ又はそれ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換される複数であってよい。複数の置換が連続する部位にあってもよい。また、１つのアミノ酸は複数の残基によって置き換えられることができ、この場合、このような変異体は置換及び挿入の両方を含む。「挿入」変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が、天然配列中の特定の位置でアミノ酸に直接隣接して挿入されている変異体である。アミノ酸に直接隣接するとは、アミノ酸のα−カルボニルか又はα−アミノ官能基に連結することを意味する。「欠失」変異体は、天然アミノ酸配列中の１つ又はそれ以上のアミノ酸が除去されている変異体である。通常、欠失変異体は、分子の特定の領域中に１つ又は２つのアミノ酸を欠失している。

【0016】

用語「抗体」は最も広い意味で使用され、そして特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、又はポリペプチドが所望の生物学的活性を示す限り、１つ又はそれ以上のＣＤＲ若しくはＣＤＲ由来配列をもつ合成ポリペプチドをカバーする。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。一般的に、抗体は、規定された又は認識された特異性を有するＩｇと考えられる。従って、抗体が特異的標的への結合特異性を示すのに対して、免疫グロブリンは抗体及び標的特異性
を欠く抗体様分子の両方を含む。本発明の抗体は、いずれのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡなど）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ_2a、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡ₁、ＩｇＡ₂など）でもあり得る（「タイプ」及び「クラス」、並びに「サブタイプ」及び「サブクラス」は、本明細書中では同じように使用される）。１つの集団の人工的に操作されていないメンバーから得られる、即ち天然又は野生型抗体及び免疫グロブリンは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から成る、通常約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、１つの末端に多くの定常ドメインに続く可変ドメイン（Ｖ_H）を有する。各軽鎖は、１つの末端（Ｖ_L）に可変ドメインを、そして他の末端に定常ドメインを有する。「人工的に操作されていない」とは、異種抗原結合分子を含む又は発現するように処理されていないことを意味する。野生型は、抗原結合分子のアミノ酸を変えるために、変異誘発、組み換え法の使用などの操作の方式によって得られる対立遺伝子若しくは多型、又は変異体若しくは誘導体に比べて、１つの集団に見出される最も優勢な対立遺伝子若しくは種、又は操作されていない動物から得られる抗体を意味することができる。

【0017】

本明細書で使用される「抗ＣＸＣＲ５抗体」は、ＣＸＣＲ５のそのリガンドへの結合を阻害若しくは実質的に減少させ、又はＣＸＣＲ５活性を阻害する分子を含むがこれに限定されない、本明細書に定義されるようなヒトＣＸＣＲ５に特異的に結合する抗体又はそれに由来するポリペプチド(誘導体)を意味する。

【0018】

抗体の可変ドメインとの関連における「可変」なる用語は、抗体間及び抗体内の配列において広範囲に異なり、そしてその特定標的に対する特定抗体の特異的認識及び結合に使用される関連分子の特定部分を指す。しかしながら、その可変性は抗体の可変ドメインを通して等しく分布していない。可変性は、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方において、超可変領域としても知られる相補性決定領域（ＣＤＲ：即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）と呼ばれる３つのセグメントに濃縮されている。可変ドメインの最も高い保存部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域又は配列と呼ばれている。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々は、大部分βシート立体配置を取って、３つのＣＤＲに結合された４つのＦＲ領域を含み、それはループ結合を形成し、そして場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲはＦＲ領域にしばしば近接してまとまっており、そして他の鎖からのＣＤＲによって抗体の標的（エピトープ又は決定因子）結合部位の形成に寄与する (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)を参照)。本明細書で使用される免疫グロブリンアミノ酸残基のナンバリングは、特に明記されない限りKabat et al.の免疫グロブリンアミノ酸残基のナンバリング方式に従って行なわれる。１つのＣＤＲは、同種エピトープに特異的に結合する能力を保有し得る。

【0019】

用語「抗体フラグメント」は、インタクト若しくは完全長鎖又は抗体の一部、一般的には標的結合又は可変領域を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）₂及びＦｖフラグメントを含むが、それらに限定されない。「機能的フラグメント」又は「抗ＣＸＣＲ５抗体のアナログ」は、リガンドに結合し、又はシグナル伝達を開始する受容体の能力を抑制し若しくは実質的に低下させることができるものである。本明細書において使用される機能的フラグメントは、一般的に「抗体フラグメント」と同義語であり、そして抗体に関しては、リガンドに結合し、又はシグナル伝達を開始する受容体の能力を抑制し若しくは実質的に低下させることができる、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）₂などのフラグメントを意味し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、非共有結合において１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る（Ｖ_H−Ｖ_L二量体）。その立体配置では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、インタクト抗体中のようにＶ_H−Ｖ_L二量体の表面上で標的結合部位を決定する。総括すると、６つのＣＤＲはインタクト抗体に標的結合特異性を賦与する。しかしながら、単一可変ドメイン（又は標的に対して特異的
な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でも標的を認識し結合する能力を有することができる。

【0020】

「単鎖Ｆｖ」、「ｓＦｖ」又は「ｓｃＡｂ」抗体フラグメントは、これらのドメインが単一ポリペプチド鎖に存在する、抗体のＶ_H及びＶ_Lドメインを含む。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_H及びＶ_Lドメイン間にポリペプチドリンカー、しばしば柔軟性分子の、を更に含み、それはｓＦｖが標的結合に対して所望の構造を形成することを可能にする。

【0021】

用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L）に結合した重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を含むことができる。同じ鎖上の２つの可変ドメイン間で対になれないほど短いリンカーを用いることにより、二重特異性抗体ドメインは別の鎖の結合ドメインと対にさせられ、２つの抗原結合部位を作出する。

【0022】

Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の可変及び定常ドメイン、並びに重鎖の可変及び第１定常ドメイン（Ｃ_H1）を含む。Ｆａｂ′フラグメントは、抗体ヒンジ領域から１つ又はそれ以上のシステインを含めるために、Ｃ_H1ドメインのカルボニル末端での付加によってＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ′フラグメントは、Ｆ（ａｂ′）₂ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の切断により生成し得る。抗体の更なる酵素的及び化学的処理により、関心ある他の機能的フラグメントを得ることができる。

【0023】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、１つの集団の実質的均一抗体から得られる抗体を指し、即ち、この集団を構成する個々の抗体は、微量に存在する可能性のある自然発生の変異を除いて同一である。

【0024】

本明細書でのモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の１部分が特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しくはサブクラス（タイプ若しくはサブタイプ）に属する抗体の対応する配列と同一又は相同性であり、そして鎖の残部は、別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラス、及びそれらがＣＸＣＲ５へ結合し又はＣＸＣＲ５活性若しくは代謝に影響する所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントに属する、抗体中の対応する配列と同一又は相同性である「キメラ」抗体を特に含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984))。このように、１つのクラスの抗体からのＣＤＲは、異なるクラス又はサブクラスの抗体のＦＲに移植し得る。

【0025】

モノクローナル抗体は高度に特異性を有し、単一の標的部位、エピトープ又は決定因子に向けられる。更に、抗原の異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を一般的に含む従来の（ポリクローナル）抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は標的上の単一の決定基(エピトープ)に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は宿主細胞によって合成され、他の免疫グロブリンにより汚染されない点で有利であり、そしてその鎖の抗体をコードする関連遺伝子及びｍＲＮＡのクローニングをもたらす。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られている抗体の特性を示し、そして特定の方法によって抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体は、よく知られらた技術を用いてファージ抗体ライブラリーから分離し、又はポリクローナル調製品から精製し得る。本発明に従って使用される親のモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法により作製してもよく、又は当技術分野でよく知られた組み換え法で作製してもよい。

【0026】

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト抗体に比べて非ヒト免疫グロ
ブリンから由来する配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）₂又は抗体の他の標的結合部分配列）である。一般に、ヒト化抗体は、１つ及び通常は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられ、そこでは、すべての又は実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのドメインに対応し、そしてすべての又は実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン鋳型配列のドメインである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも１部分、一般的には選択された免疫グロブリン鋳型部分をも含む。一般に、目標はヒトにおいて最小限の免疫原性をもつ抗体分子を有することである。このように、１つ又はそれ以上のＣＤＲ中の１つ又はそれ以上のアミノ酸が、ＣＸＣＲ５又はＣＸＣＬ１３へ１つ又はそれ以上のＣＤＲの特異的結合機能を実質的に最小化することなしに、ヒト宿主に対して低い免疫原性のものにも変化し得ることは起こり得る。或いは、ＦＲは非ヒトであり得るが、最も免疫原性の高いそれらのアミノ酸はより低い免疫原性のアミノ酸に置き換えられる。それにもかかわらず、上記のようなＣＤＲ移植はヒト化抗体を得る唯一の方法ではない。例えば、フレームワーク残基が、ＣＤＲループの３次元構造及びそのリガンドに対する抗体の全体の親和性を決定する役割を有することは稀ではないことから、ＣＤＲ領域だけを修飾することは不十分であると考えられる。従って、いずれのヒト抗体も常に必要とは限らない。それで、ヒト化は、例えば、ごく数少ない残基、特に抗体分子上に露出し分子内に埋もれておらず、そしてそれ故に宿主免疫系に容易に近づけない残基の単なる置換によっても達成し得る。当該方法は、本明細書に示すように抗体分子上の「移動性」又は「柔軟性」残基に関するものであって、その目標は、エピトープ又は決定基に対する抗体の特異性を含むことなしに得られた分子の免疫原性を、減少又は減弱させることである。例えば、Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993)、国際公開第２００６／０４２３３３号及び米国特許第５８６９６１９号を参照されたい。

【0027】

適応免疫反応は２つの主アームを有する：Ｔリンパ球の細胞性免疫反応及び抗体分泌Ｂリンパ球の液性免疫反応。Ｂ細胞エピトープは、直鎖隣接アミノ酸であるか、又は立体配座的であり得る(Protein Science (2005) 14, 246)。対照的に、Ｔ細胞エピトープは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質、又はヒトの場合は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ又はクラスＩＩ分子との関連において存在する抗原性タンパク質から切断される短い直鎖ペプチドである。エピトープ提示は、ＭＨＣ−ペプチド結合及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）相互作用に依存する。ＭＨＣタンパク質は高度に多型であり、そして各々は１つの限定されたセットのペプチドに結合する。従って、宿主に存在するＭＨＣ対立遺伝子の特定の組み合わせは、感染時に認識される潜在性エピトープの範囲を限定する。

【0028】

Ｔ細胞の２つの基本タイプは、Ｔ細胞がそれぞれクラスＩ及びクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープを認識するかどうかを決定する、ＣＤ８及びＣＤ４タンパク質の発現により識別される。ＣＤ４⁺Ｔエピトープは、膜結合小胞における抗原提示細胞によるカプセル化後にプロセシングされ、そこで抗原はプロテアーゼによりＭＨＣクラスＩＩタンパク質に結合するペプチドフラグメントへ分解される。対照的に、ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、一般的に細胞内から発現するウイルス性又は自己抗原、免疫プロテアソームによるサイトゾル中の短ペプチドに切断されるタンパク質を認識する。切断後、ペプチドは、抗原プロセシング（ＴＡＰ）に関連した輸送体によりＨＬＡＩ抗原上へ負荷するために、小胞体中へ輸送される。ＣＤ４⁺Ｔ（ヘルパー）細胞エピトープは、タンパク質抗原に対するＴ細胞依存性免疫反応を推進するのに重要である。

【0029】

関心あるヒト化方法は、免疫認識中及び時点での抗体の分子柔軟性の効果に基づいている。タンパク質柔軟性は、タンパク質分子の分子運動に関係している。タンパク質柔軟性
は、タンパク質全体、タンパク質の一部又は単一アミノ酸残基が互いに著しく異なる立体配座のアンサンブルをもたらす能力である。タンパク質柔軟性についての情報は、タンパク質のＸ線結晶学実験（例えば、Kundu et al. 2002, Biophys J 83:723-732を参照されたい)、核磁気共鳴実験（例えば、Freedberg et al., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923を参照されたい) を実施することにより、又は分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実行することにより得ることができる。タンパク質のＭＤシミュレーションはコンピュータで実施され、互に原子の物理的相互作用を計算することにより、経時的にすべてのタンパク質原子の運動を明らかにすることを可能にする。ＭＤシミュレーションの出力は、シミュレーションの期間にわたる検討タンパク質のトラジェクトリー（trajectory）である。トラジェクトリーは、タンパク質立体配座のアンサンブルであり、シミュレーションの期間にわたって、例えば１ピコ秒（ｐｓ）毎に定期的にサンプリングされるスナップショットとも呼ばれる。タンパク質のアミノ酸残基の柔軟性を定量できるのは、スナップショットのアンサンブルを解析することによってである。このように、柔軟性残基とは、その中にその残基が存在するポリペプチドとの関連で異なる立体配座のアンサンブルを承認する残基である。ＭＤ法は当技術分野で公知であり、例えば、Brooks et al. 「タンパク質：動力学、構造及び熱力学の理論的展望」"Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics" (Wiley, New York, 1988)を参照されたい。幾つかのソフトウェアは、Amber (Case et al. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688), Charmm （Brooks et al. (1983) J Comp Chem 4:187-217; 及びMacKerell et al. (1998) 「計算機化学事典」"The Encyclopedia of Computational Chemistry" vol. 1:271-177, Schleyer et al., eds. Chichester: John Wiley & Sons）又はImpact (Rizzo et al. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900を参照されたい）などのＭＤシミュレーションを可能にする。

【0030】

大部分のタンパク質複合体は相対的に大きな平面埋没表面を共有し、そして結合パートナーの柔軟性がそれらの可塑性の起点を提供し、それらが互いに立体配座的に適応することを可能にすることが示されている（Structure (2000) 8, R137-R142)。それ自体、「誘導適合」の例は、タンパク質−タンパク質界面において主要な役割を果すことが示されている。加えて、タンパク質は多彩な形状、サイズ及び組成のリガンドを実際に結合すること（Protein Science (2002) 11:184-187)、及び立体配座多様性は、異なるパートナーを認識する能力の必須要素に思えること（Science (2003) 299, 1362-1367）を示す多数のデータが着実に増加している。柔軟性残基は、タンパク質−タンパク質パートナーの結合に関与している(Structure (2006) 14, 683-693)。

【0031】

柔軟性残基は、メモリーＢ細胞によって認識され、そして免疫原性反応を誘引する可能性がある相互作用領域のアンサンブルを与える種々の立体配座を取ることができる。従って、抗体は、修飾抗体によって示される立体配座及び認識領域のアンサンブルが、ヒト抗体によって取り入れられるものとできるだけ類似するように、フレームワークからの多数の残基を修飾することによってヒト化し得る。

【0032】

それは、以下による限定された数の残基を修飾することにより達成し得る：（１）親ｍＡｂの相同性モデルの構築及びＭＤシミュレーションの実行；（２）柔軟性残基の解析及び非ヒト抗体分子の最も柔軟性の残基の特定、並びに不均一性及び分解反応の原因と考えられる残基又はモチーフの同定；（３）親抗体に最も類似した認識領域のアンサンブル（ensemble）を示すヒト抗体の同定；（４）変異しようとする柔軟性残基、また変異される不均一性及び分解の原因と考えられる残基又はモチーフの決定；及び（５）公知のＴ細胞又はＢ細胞エピトープの存在のチェック。柔軟性残基は、シミュレーションの期間にわたって水性溶媒とタンパク質原子との相互作用を説明する、非明示溶媒モデルを使用して本明細書に示したＭＤ計算を用いて見出し得る。

【0033】

柔軟性残基のセットが可変軽鎖と重鎖内に特定されると、関心ある抗体のそれに酷似した１セットのヒト重鎖と軽鎖の可変領域フレームワークが特定される。それは、例えば、抗体のヒト生殖細胞系配列のデータベースに対する柔軟性残基のセットに関するＢＬＡＳＴ検索を用いて行うことができる。それは、親ｍＡｂの動力学を生殖細胞系の極限構造のライブラリーと比較することにより行うこともできる。ＣＤＲ残基及び隣接残基は、保存された抗原に対する高親和性を確保するために検索から除外される。

【0034】

従って、生殖細胞系抗体構造のライブラリーのトラジェクトリーと関心ある抗体の分子動力学トラジェクトリーの比較が行なわれた。１６Ｄ７を４９生殖細胞系構造のライブラリーと比較した。各抗体に保持される分子動力学トラジェクトリーは、分子動力学計算機シミュレーション時の分子動力学計算のアンサンブルであり、例えば、約１０の多様な立体配座が多様な起点として使用され、そして各起点に対して、約１０の分子動力学シミュレーションが行なわれる。ヒト抗体生殖細胞系の４９の３Ｄ相同性モデルを、７最高頻度ヒト軽鎖（ｖκ１、ｖκ２、ｖκ３、ｖκ４、ｖλ１、ｖｌλ２及びｖλ３）及び７最高頻度ヒト重鎖（ｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５及びｖｈ６）を体系的に組み合わせることにより構築した(Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597)。１６Ｄ７の柔軟性残基は、次いで関心ある抗体に最も近いトラジェクトリーを有する生殖細胞系構造の対応する残基に変換される。

【0035】

柔軟性残基は次いで置換される。幾つかのヒト残基が類似の相同性を示す場合、その選択は、ヒト化抗体の溶液挙動に影響を与える可能性のある残基の性質によっても促進される。例えば、極性残基は疎水性残基上へ露出された柔軟性ループにおいて好適である。不安定性及び不均一性の潜在的原因となる残基は、ＣＤＲ中に見出される場合でも変異する。それは露出メチオニンを含んでもよい。なぜならば、スルホキシド形成が、酸素ラジカル、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドなどの酸不安定結合の蛋白質分解的切断（Drug Dev Res (2004) 61:137 154）、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ又はＣｙｓなどの小アミノ酸が続く露出アスパラギン残基で見出された脱アミド部位（J Chromatog (2006) 837:35-43）及びＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位などのＮグリコシル化部位に生じ得るからである。一般的に、露出メチオニンはＬｅｕにより置換され、露出アスパラギンはグルタミンにより又はアスパラギン酸塩により置換され、又はその結果の残基は変換され得る。グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に対して、Ａｓｎか又はＳｅｒ／Ｔｈｒ残基が変換し得る。

【0036】

結果の複合体配列について、公知のＢ細胞又は直線状Ｔ細胞エピトープの存在で調べられる。例えば、公的に入手可能な免疫エピトープデータベース(ＩＥＤＢ) （PLos Biol (2005) 3(3)e91）により検索が実施される。複合体配列中に公知エピトープが見出される場合、別のセットのヒト配列が遡及され置換される。

【0037】

米国特許第５６３９６４１号の再表面化法と異なり、Ｂ細胞媒介及びＴ細胞媒介免疫原性反応はこの方法により検討される。この方法は、ＣＤＲ移植で時に観察される活性の喪失の問題も回避する(米国特許第５５３０１０１号)。加えて、安定性及び溶解性問題も、エンジニアリング及び選択工程において検討され、低免疫原性、高抗原親和性及び生物物理的性質改善のために最適化された抗体をもたらす。

【0038】

抗体の再表面化方策と方法、及び異なる宿主内の抗体の免疫原性を減少させる他の方法は、例えば、米国特許第５６３９６４１号に開示されている。簡潔には、好ましい方法では、（１）抗体重鎖及び軽鎖可変領域のプールの位置アラインメントは、すべての可変領域に対するアラインメント位置が少なくとも約９８％同一である、重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面露出位置を誘導するために作り出される；（２）１セットの重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基は、齧歯類抗体(又はそのフラグメン
ト)などの非ヒト型に対して定義される；（３）齧歯類抗体表面露出アミノ酸残基のセットに最も密接に一致する、１セットの重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基が同定される；そして（４）工程（２）で定義される重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットは、結合特異性を保持する齧歯類などのヒト化型を誘導するために、齧歯類抗体のＣＤＲのいずれの残基の５Åのいずれの原子内にあるそれらのアミノ酸残基を除いて、工程（３）において定義される重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基で置換される。

【0039】

抗体は、ＣＤＲ移植(欧州特許公開第０２３９４００号；国際公開第９１／０９９６７号；及び米国特許第５５３０１０１号及び同第５５８５０８９号)、表面張り又は再表面化（欧州特許公開公報第０５９２１０６号；欧州特許公開公報第０５１９５９６号；Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814;及び Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973）及び鎖シャッフリング（米国特許第５５６５３３２号）を含む種々の他の技術によってヒト化し得る。ヒト抗体は、齧歯類などのトランスジェニック動物を用い、キメラ細胞などを用いるファージ・ディスプレー法を含むが、これに限定されない当技術分野で公知の種々の方法によって作製し得るが、米国特許第４４４４８８７号、同第４７１６１１１号、同第５５４５８０６号及び同第５８１４３１８号；及び国際公開第９８／４６６４５号、国際公開第９８／５０４３３号、国際公開第９８／２４８９３号、国際公開第９８／１６６５４号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９６／３３７３５号及び国際公開第９１／１０７４１号を参照されたい。

【0040】

「抗体ホモログ」又は「ホモログ」は、本明細書に示されるＣＸＣＲ５を特異的に結合するあらゆる分子を指す。従って、抗体ホモログは、天然又は組み換え抗体、修飾し又はしないにかかわらず、Ｆａｂ又はＦｖ分子、一本鎖抗体、１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域などを担持するポリペプチドなどの結合ＣＸＣＲ５などの、関心ある生物学的特性を保持する抗体の部分を含む。ホモログのアミノ酸配列は、自然抗体と同一である必要はなく、強化された又は他の有益な効果を有するポリペプチドを得るために、置換アミノ酸、挿入アミノ酸、欠失アミノ酸、タンパク質中に一般的に見られる２０種以外のアミノ酸などを担持させるように変化又は修飾し得る。

【0041】

相同配列を有する抗体は、本発明のＣＸＣＲ５抗体のアミノ酸配列と配列相同性を有するアミノ酸配列のそれらの抗体である。好ましくは、相同性は本発明抗体の可変領域のアミノ酸についてである。本明細書でアミノ酸配列に適用される「配列相同性」は、例えば、Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988)に従ったＦＡＳＴＡ検索法によって決定され、別のアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又はそれ以上の配列相同性を有する配列、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有する配列と定義される。

【0042】

キメラ抗体は、種々の抗体、種々のクラスの抗体、種々の動物種など種々の起源由来の抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域などと対になる、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域を有する抗体の種々の部分を有するものである。従って、ヒト化抗体は、キメラ抗体の１種である。キメラ抗体を生産する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; 及び米国特許第５８０７７１５号、同第４８１５６７号、及び同第４８１６３９７号を参照されたい。

【0043】

人工抗体は、一本鎖抗体、ｓｃＦｖフラグメント、キメラ抗体、二重特異性抗体（diabodies）、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）及びｍｒｕ(Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; and Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:5
48-557による総説を参照されたい）を含み、各々は抗原結合又はエピトープ結合能を有する。抗体の一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｖ_H及びＶ_Lドメインは、柔軟性ペプチドによって結合される。一般的には、リンカーは約１５アミノ酸である。リンカーが非常に小さい、例えば、５アミノ酸の場合、二価のｓｃＦｖ二量体である二重特性抗体が形成される。リンカーが３アミノ酸残基未満に減少する場合、それぞれ三重特異性抗体（triabodies）、及び四重特異性抗体（tetrabodies）と呼ばれる三量体及び四量体構造が形成される。抗体の最小結合単位は単一ＣＤＲで、一般的に十分な特異的認識及び結合能力を有する重鎖のＣＤＲ２又は３であり得るが、しかし本明細書に示される方法を実施して決定できるＣＤＲのいずれの組み合わせであってもよい。当該フラグメントは、分子認識単位又はｍｒｕと呼ばれる。幾つかのこのようなｍｒｕは短リンカーペプチドと互いに結合することができ、その結果、単一ｍｒｕよりも高い活性の人工結合タンパク質を形成する。

【0044】

関心ある抗体の機能的等価物も本発明の範囲内に含まれる。用語「機能的等価物」は、例えば、相同性配列を有する抗体、抗体ホモログ、キメラ抗体、人工抗体及び修飾抗体を含み、ここで、各機能的等価物は、ＣＸＣＲ５への結合能、ＣＸＣＲ５シグナル伝達能又は機能を阻害すること、又はＣＸＣＬ１３及びＣＸＣＲ５に対する他のリガンドの結合を阻害することによって定義される。当業者には当然のことながら、「抗体フラグメント」と称する分子群及び「機能的等価物」と称する群には重複がある。ＣＸＣＲ５結合能を保持する機能的等価物を生産する方法は、当業者に周知であり、そして、例えば、国際公開第９３／２１３１９号、欧州特許公開公報第２３９４００号、国際公開第８９／０９６２２号、欧州特許公開公報第３３８７４５号及び欧州特許公開公報第３３２４２４号に開示されている。

【0045】

本出願の機能的等価物は、修飾抗体、例えば、抗体に対してあらゆるタイプの分子の共有結合によって修飾される抗体をも含む。例えば、修飾抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、脱アミド化、リン酸化、アミド化、公知の保護／封鎖基による誘導体化、蛋白質分解切断、細胞内リガンドへの結合、毒素若しくは細胞毒性部分又は他のタンパク質などへの結合によって修飾されている抗体を含む。共有結合は、必ずしも抗イディオタイプ反応の発生に対して免疫性の抗体を誘導しない。修飾は、特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、代謝合成などを含む公知技術によって達成し得るが、これらに限定されない。加えて、修飾抗体は１つ又はそれ以上の非古典的アミノ酸を含有してもよい。

【0046】

多くの技術は、結合親和性の最適化を可能にする当業者が利用可能である。一般的には、それの技術は関心ある部位で種々のアミノ酸残基の置換にかかわり、次いで同種抗原又はエピトープに対する変異ポリペプチドの親和性のスクリーニング解析が続く。

【0047】

抗体が同定されそして分離されると、変異抗体又は突然変異体、又は突然変異タンパク質を発生させることはしばしば有用であり、ここで、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、例えば、抗体の１つ又はそれ以上の超可変領域において変化する。或いは、又は更に、フレームワーク残基の１つ又はそれ以上の変化（例えば置換）は、それらがＣＸＣＲ５に対する抗体変異体の結合親和性の改善をもたらす抗体中に導入し得る。修飾し得るフレームワーク領域残基の例は、直接抗原を非共有結合的に結合し（Amit et al., Science 233:747-753 (1986)）；ＣＤＲの立体配座と相互作用し／影響を及ぼし（Chothia et al., J
Mol Biol 196:901-917 (1987)）；及び／又はＶ_L−Ｖ_H界面に関与する（欧州特許第２３９４００号）例を含む。特定の実施態様では、１つ又はそれ以上の当該フレームワーク領域残基の修飾は、同種抗原に対する抗体の結合親和性の強化をもたらす。例えば、約１から約５のフレームワーク残基が、本発明の本実施態様において変化し得る。時として、これは、超可変領域残基が全然変化しない場合でも、前臨床試験に使用するために好適な抗
体変異体を生産するのに十分と考えられる。しかしながら、通常は、１つ又はそれ以上の超可変領域変化を含むことができる。定常領域も、所望の又は更に望ましいエフェクタ特性を得るために変化し得る。

【0048】

変化した超可変領域残基は、特に親抗体の当初の結合親和性が、ランダムに生産された抗体変異体が本明細書に教示される分析において変化した結合を容易にスクリーニングし得るほどに、ランダムに変化し得る。

【0049】

ＣＤＲ変異体などの抗体変異体を得るための１つの手順は、「アラニンスキャンニング変異誘発」である(Cunningham & Wells, Science 244:1081 1085 (1989); 及び Cunningham & Wells, Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991))。１つ又はそれ以上の超可変領域残基は、アラニン又はポリアラニン残基によって置換される。置換に対して機能的感受性を示すそれらの超可変領域残基は、次いで置換の部位で又はそれに対して更なる又は他の突然変異を誘導することによりリファインされる。このように、アミノ酸配列変異を導入する部位が設定される一方で、突然変異の性質はそれ自体を設定する必要はない。スキャンした残基の所望の特性に応じて、類似の置換が他のアミノ酸で試みられてもよい。

【0050】

修飾すべきアミノ酸残基を同定するより体系的な方法は、ＣＸＣＲ５結合に関与する超可変領域残基、及びＣＸＣＲ５結合とほとんど又は全然かかわりのないそれらの超可変領域残基を同定することを含む。非結合超可変領域残基のアラニンスキャンが実施され、各ａｌａ変異体でＣＸＣＲ５に対する結合増強の試験を行なった。別の実施態様では、ＣＸＣＲ５の結合に顕著に関与するそれらの残基が、修飾するために選択される。修飾は、残基の欠失又は関心ある残基に隣接する１つ又はそれ以上の残基の挿入に関与し得る。しかしながら、通常、修飾は別のアミノ酸による残基の置換にかかわる。保存的置換が最初の置換であり得る。当該置換が生物活性(例えば、結合親和性)の変化をもたらす場合、次いでより実質的な置換が得られるかを明らかにするために、別の保存的置換が行われ得る。

【0051】

抗体範囲での更に実質的な修飾及び生物特性の発現は、通常１部位に存在するものと更に実質的に性質が異なるアミノ酸を選択することによって達成される可能性がある。従って、当該置換は、（ａ）置換部分における、例えばシート又はヘリカル配座としてのポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の大きさを維持しながら行われ得る。

【0052】

例えば、天然アミノ酸は、以下のように共通の側鎖特性に基づく群に分けることができる：
（１）疎水性：メチオニン（Ｍ又はｍｅｔ）、アラニン（Ａ又はａｌａ）、バリン（Ｖ又はｖａｌ）、ロイシン（Ｌ又はｌｅｕ）及びイソロイシン（Ｉ又はｉｌｅ）；
（２）中性、親水性：システイン（Ｃ又はｃｙｓ）、セリン（Ｓ又はｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ又はｔｈｒ）、アスパラギン（Ｎ又はａｓｎ）及びグルタミン（Ｑ又はｇｌｎ）；
（３）酸性：アスパラギン酸（Ｄ又はａｓｐ）グルタミン酸（Ｅ又はｇｌｕ）；

【0053】

（４）塩基性：ヒスチジン（Ｈ又はｈｉｓ）、リジン（Ｋ又はｌｙｓ）及びアルギニン（Ｒ又はａｒｇ）；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：グリシン（Ｇ又はｇｌｙ）及びプロリン（Ｐ又はｐｒｏ）、並びに
（６）芳香族性：トリプトファン（Ｗ又はｔｒｐ）、チロシン（Ｙ又はｔｙｒ）及びフェニルアラニン（Ｆ又はｐｈｅ）。

【0054】

非保存的置換は、他の群からのアミノ酸によるアミノ酸交換を伴うことがあり得る。保
存的置換は、１群内で１つのアミノ酸の交換を別なものとすることを伴ってもよい。

【0055】

好ましいアミノ酸置換は、（１）蛋白質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）結合親和性を変化させ、そして（４）当該アナログの他の物理化学的又は機能的特性を賦与し又は改変する置換を含む。アナログは、天然ペプチド配列以外の配列の種々突然変異タンパク質を含むことができる。例えば、単一又は多重アミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）は、自然配列において（好ましくは分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチド部分において）行ない得る。保存的アミノ酸置換は、Ｒ群又は側鎖の大きさ又は立体配座の変化を除いては、親配列の構造的特性を実質的に変化させ得ない（即ち、置換アミノ酸は親配列に生じるヘリックスを切断せず、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向とならない）。「タンパク質、構造及び分子原理」（Proteins, Structures and Molecular Principles） (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); 「タンパク質構造概論」（Introduction to Protein Structure） (Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); 及び Thornton et al. Nature 354:105 (1991)。

【0056】

通常、改良された生物学的特性を有する抗体変異体は、親の抗ヒトＣＸＣＲ５抗体の重鎖か又は軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性又は類似性、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及びしばしば少なくとも９５％の同一性をもつアミノ酸配列を有することができる。親抗体配列についての同一性又は類似性は、必要ならば最大のパーセント配列同一性を達成するために配列をアラインしギャップを導入した後に、親抗体残基と同一（即ち、同じ残基）又は類似（即ち、上記の共通側鎖特性に基づく同じ群からのアミノ酸残基）の候補配列におけるアミノ酸残基の割合として、本明細書に記載されている。

【0057】

或いは、抗体変異体は、重鎖及び軽鎖のＦＲ及びＣＤＲ領域、又は抗ＣＸＣＲ５抗体のＦｃ領域の体系的突然変異によって生成し得る。抗体変異体を生成させる別の手順は、ファージ・ディスプレー法（Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992) 及びLowman
et al., Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)）を用いる親和性成熟の使用を含む。バクテリオファージ・コート・タンパク質融合（Smith, Science 228:1315 (1985); Scott & Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 8:309 (1990); Devlin et al. Science 249:404 (1990); Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992); 及び米国特許第５２２３４０９号 ）は、それらをコードするバクテリオファージ粒子の遺伝子型に対して、ディスプレーされたタンパク質又はペプチドの表現型を結合するのに有用なことは公知である。抗体のＦａｂドメインも、ファージ上にディスプレーされている（McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991); 及び Garrard et al. Biotechnol 9:1373 (1991))。

【0058】

一価ファージ・ディスプレー法は、ファージ粒子上で１セットのバクテリオファージ・コート・タンパク質の融合としてタンパク質変異体をディスプレーすることから成る（Bass et al., Proteins 8:309 (1990)）。種々のタンパク質の親和性成熟、又は平衡結合親和性の改善は、以前に変異誘発の連続適用、一価ファージ・ディスプレー法及び機能性解析（Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); 及び米国特許第５５３４６１７号)を通して、 例えば、 抗体のＣＤＲ領域を巡ることによって (Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 (1994); 及びYang et al., J Mol Biol 254:392 (1995))達成されている。

【0059】

配列中の規定位置で異なる多くの（例えば、１０⁶又はそれ以上の）タンパク質変異体のライブラリーは、その各々が特定のタンパク質変異体をコードするＤＮＡを含有する、
バクテリオファージ粒子上に構築できる。固定化抗原を使用したアフィニティ精製のサイクル後、個々のバクテリオファージ・クローンが分離され、そしてディスプレーされたタンパク質のアミノ酸配列がＤＮＡから推定される。

【0060】

抗体変異体の生産に続いて、親抗体に関連するその分子の生物活性が本明細書に教示されるように決定し得る。上記のように、そのことは、抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性又は物理的性質を決定することにかかわり得る。本発明の好適な実施態様では、１パネルの抗体変異体が調製され、そして抗原に対する結合親和性をスクリーニングされる。スクリーンから選択された１つ又はそれ以上の抗体変異体は、場合により抗体変異体が新しい又は改良された性質を有することを確認するために、１つ又はそれ以上の更なる生物活性分析にかけられる。好適な実施態様では、抗体変異体は、親抗体に類似又はより優れた／高い結合親和性を有するＣＸＣＲ５を結合する能力を保持する。

【0061】

そのように選択された抗体変異体は、時に抗体の使用目的に応じて更なる修飾に従ってもよい。当該修飾は、アミノ酸配列の更なる変化、異種ポリペプチドへの融合及び／又は共有結合修飾にかかわらせることができる。例えば、抗体変異体の固有の立体配座を維持するのに関与しないシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、そして異常架橋を抑制するために、一般的にセリンと置換してもよい。逆に、システインを、安定性を改善するために（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）抗体に付加してもよい。

【0062】

別のタイプの抗体変異体は、グリコシル化パターンの変化を有する。それは、抗体中に認められる１つ又はそれ以上の炭水化物部分を取り除くことにより、及び／又は抗体中に存在しない１つ又はそれ以上のグリコシル化部位を付加することにより達成し得る。抗体のグリコシル化は、一般的にＡｓｎへＮ−結合か又はＳｅｒ及びＴｈｒへＯ−結合される。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘはプロリンを除くあらゆるアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合に対する共通の認識配列である。Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース又はキシロースは、例えば、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンに結合するが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを使用してもよい。元の抗体の配列に対する１つ又はそれ以上のセリン又はトレオニン残基の付加又は置換は、Ｏ−結合グリコシル化の可能性を強化し得る。

【0063】

抗体の有効性を増強させるために、エフェクター融合に関し本発明の抗体を修飾することは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に誘導してもよく、それによりその領域において鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして生成したホモ二量体型抗体は、インターナリゼーション能力を改善し及び／又は補体媒介性殺細胞及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増加させると考えられるが、 Caron et al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992) and Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993)を参照されたい。或いは、二重Ｆｃ領域を有する抗体が改変でき、そしてその結果、補体溶解及びＡＤＣＣ能力を増強している可能性があるが、Stevenson et al.,「抗癌薬ドラッグデザイン３」（Anti-Cancer Drug Design 3）: 219 230 (1989)を参照されたい。

【0064】

抗体の共有結合修飾は本発明の範囲内に含まれる。それらは、化学合成により又は妥当な場合抗体の酵素的又は化学的切断によって行ってもよい。他のタイプの抗体の共有結合修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖と又はＮ−末端若しくはＣ−末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることによって分子中に導入される。

【0065】

システイニル残基は、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα−ハロ酢酸塩(及び対応のアミン)と反応させ、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得る
ことができる。システイニル残基は、また、例えば、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾアート、２−クロロメルクラ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化し得る。

【0066】

ヒスチジル残基は、ｐＨ５.５〜７.０でジエチルピロカルボナ−トとの反応により誘導体化することができる。ｐ−ブロモフェナシルブロミドも使用でき、反応は、ｐＨ６.０で０.１Ｍカコジル酸ナトリムにおいて好適に実施される。

【0067】

リジン残基又はα末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させて、残基の電荷を逆転させることができる。α−アミノ含有残基を誘導体化する他の好適な試薬は、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア及び２，４−ペンタンジオンなどのイミドエステルを含み、そしてアミノ酸はグリオキシル酸でトランスアミナーゼ触媒作用し得る。

【0068】

アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンなどの１つ又は幾つかの標準試薬との反応により修飾できる。アルギニン残基の誘導体化はしばしばアルカリ性反応条件を要求する。更に、試薬はリジン並びにアルギニンのε−アミノ基と反応してもよい。

【0069】

チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンで行なうことができる。例えば、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために、それぞれＮ−アセチルイミダゾール（imidizole）及びテトラニトロメタンが使用される。チロシル残基はラジオイムノアッセイで使用する標識タンパク質を製造するために、¹²⁵Ｉ又は¹³¹Ｉを用いてヨード化することができる。

【0070】

カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｃ＝Ｒ′）（ここで、Ｒ及びＲ′は異なるアルキル基であってよい）との反応により修飾し得る。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基へ変換し得る。

【0071】

グルタミニル及びアスパラギニル残基は、中性又は塩基性条件下に高頻度にそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化される。それらの残基の脱アミド型は本発明の範囲に含まれる。

【0072】

他の修飾は、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリニル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びいずれかのＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。

【0073】

別のタイプの共有結合修飾は、抗体に対するグリコシドの化学的又は酵素的結合を含む。それらの手順は、Ｎ−結合又はＯ−結合グリコシル化に対するグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としない。使用する結合様式によって、糖は以下のように結合し得る：（ａ）アルギニン及びホスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ
）システインなどの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニン又はヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンなどの芳香族残基；又は（ｆ）グルタミンのアミド基。当該方法は、国際公開公報第８７／０５３３０号及びAplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp. 259-306 (1981)に記載されている。

【0074】

抗体に存在するいずれかの糖質部分の除去は、化学的又は酵素的に達成し得る。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物、トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物への抗体の露出を要求することができ、その結果、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分又はすべての糖の切断をもたらすが、一方で抗体をインタクトの状態にする。化学的脱グリコシル化は、例えば、Hakimuddin et al. Arch Biochem Biophys 259:52 (1987) and in Edge et al., Anal Biochem 118:131 (1981）に記載されている。抗体上の糖質部分の酵素的切断は、例えばhotakura et al., Meth
Enzymol 138:350(1987)に記載のように、いずれかの種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼによって達成し得る。

【0075】

抗体の別タイプの共有結合修飾は、種々の非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンの１つに抗体を連結することを含むが、この方式は、米国特許第４６４０８３５号、同第４４９６６８９号、同第４３０１１４４号、同第４６７０４１７号、同第４７９１１９２号又は同第４１９７３３９号に示されている。

【0076】

突然変異体又は突然変異タンパク質の取得に好適な別の技術は、ファージ・ディスプレーによる親和性成熟である（Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992); 及びLowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)）。簡潔に言えば、幾つかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）は、変異して各部位にすべての可能なアミノ酸置換を生成する。このようにして生成した抗体変異体は、粒子上に認められるタンパク質への融合としてファージ粒子上に一価状態で提示される。種々の変異体を発現するファージは、一連の結合選択を通して循環することができ、続いて高親和性を表わすそれらの変異体の分離及び配列決定が行なわれる。

【0077】

新規な結合ポリペプチドを選択する方法は、構造的に関連するポリペプチドのライブラリーを活用することができる。例えば、ファージ・コートタンパク質に融合した構造的に関連するポリペプチドのライブラリーは、変異誘発により産生され、そして粒子の表面に提示される。次いで粒子は標的分子と接触し、そして標的に対して最大親和性を有するそれらの粒子は、低親和性の粒子から分離される。次いで高親和性バインダーは、好適な細菌宿主の感染により増幅し、そして競合的結合工程は繰り返される。この方法は、所望の親和性のポリペプチドが得られるまで繰り返される。

【0078】

或いは、多価ファージ（McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; and Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628）も、ランダム点突然変異（例えば、変異性ＤＮＡポリメラーゼの使用によって生成される）を発現させるために使用することができ、次いでＣＸＣＲ５へ親和性スクリーニングできるファージ抗体フラグメントのライブラリー（Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 254:889-896）を生成する。

【0079】

好ましくは、親和性成熟工程時に、複製可能な発現ベクターは転写調節要素の厳格な制御下にあり、そして１つのコピーより多い融合タンパク質を提示する粒子の量又は数が約１％より小さくなるように培養条件が調整される。同様に好ましくは、１つのコピーより多い融合タンパク質を提示する粒子の量は、単一コピーの融合タンパク質を提示する粒子量の約１０％より小さい。好ましくは、その量は２０％未満である。

【0080】

機能的等価物は、複数の抗体から生じるフレームワーク又は複合ＦＲ内の種々の抗体鎖の種々のＣＤＲを交換することにより生産し得る。このように、例えば、異なるＣＸＣＲ５抗体タイプ及びイソタイプを生産するために、種々のクラスの抗体が、異なる重鎖、例えば、ＩｇＧ_1-4、ＩｇＭ、ＩｇＡ_1-2又はＩｇＤの置換による所定セットのＣＤＲに対して可能である。同様に、本発明の範囲の人工抗体は、所定のセットのＣＤＲを完全合成フレームワーク内に組み込むことにより生産し得る。

【0081】

例えば、可変領域又は関心ある１つ又はそれ以上のＣＤＲを担持する好適なフレームワーク及びＦｃ部分は、エフクター機能を低減しているＩｇＧ分子から得ることができる。

【0082】

他の実施態様では、関心あるＣＸＣＲ５結合分子の特性を増強させるために、特定の修飾を、関心ある分子の抗原結合部位を担持する分子のフレームワーク部分及び／又はＦｃ部分に対して行ない得る。例えば、アミノ酸置換は関心ある特性を増強又は低減させるようになし得る。従って、ＩｇＧ４分子では、例えば、エフクター機能に影響を与え又はＦｃ結合に影響を与える領域で、ヒンジ領域において機能に影響を与えることが知られている部位での置換は、修飾に好適である。ＩｇＧ４分子では、Ｋａｂａｔ付番方式を用いた、アミノ酸２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５など、又はその組み合わせでの置換が、所望の特性を得るためになし得る。例えば、セリン２４１のプロリンへの置換は分子の三次構造及び四次構造を安定化させ（Mol Imm 30(1)105 108, 1993）、そしてロイシン２４８のグルタミン酸への置換は、エフェクター機能を減弱させる（J Imm 164(4)1925-1033, 2000; 及び Clin Imm 98(2)164-174, 2001）。

【0083】

別の有利な特性は、ＣＸＣＲ５を結合する抗体誘導体を得ることであるが、しかし、例えば、Ｂ細胞を激減させない。それは患者の抗体産生が障害されないことから有利であり得る。当該試薬による処置は、またＢ細胞以外のレベルで作用する特定の適応症に対する第２の薬剤による組み合わせ治療を促進する。それは、例えば、Ｔ細胞のレベルであってもよい。

【0084】

それ故に、例えば、１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ３は、２つの置換、Ｓ２４１Ｐ及びＬ２４８Ｅを含有するように処置された。プロリン及びグルタミン酸残基は、安定性及びエフェクター機能低減などのＩｇＧ４フレームワークを担持する関係のＣＸＣＲ５結合分子に所望の特性を賦与する。

【0085】

本発明の抗体フラグメント及び機能的等価物は、ＣＸＣＲ５へ検出可能な程度の特異的結合を有するそれらの分子を包含する。結合の検出可能な程度は、関心ある抗体の結合能の少なくとも１０〜１００％の範囲のすべての値、好ましくは少なくとも５０％、６０％又は７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含む。同様に関心ある抗体の結合能力の１００％より大きい親和性を有する等価物も含まれる。

【0086】

ＣＤＲは一般的にエピトープ認識及び抗体結合にとって重要である。しかしながら、同種エピトープを認識しそして結合する抗体の能力を妨害することなしにＣＤＲを含む残基に変化が加えられてもよい。例えば、エピトープ認識に影響を与えず、尚エピトープに対する抗体の結合親和性を増加させる変化が加えられてもよい。幾つかの研究は、一次抗体配列の知識、結合及び発現レベルなどのその特性に基づいて、抗体の配列において種々の位置での１つ又はそれ以上のアミノ酸変化を導入する効果を調べている (Yang et al., 1
995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; 及びVaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539)。

【0087】

このように、関心ある抗体の等価物は、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異誘発法、カセット変異誘発、変異性ＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング又はE. coli の突然変異誘発株などの方法を用いて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３の重鎖及び軽鎖の配列を変化させることにより生成し得る(Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; 及び Adey
et al., 1996, Chap. 16, pp. 277-291, 「ペプチド及び蛋白質のファージ・ディスプレー」(phage Display of Peptides and Proteins), eds. Kay et al., Academic Press)。一次抗体の核酸配列を変える方法は、改良された親和性の抗体をもたらすことができる（Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc
Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; 及びFurukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628）。

【0088】

「ポリペプチド選択」の繰返しサイクルは、例えば、サイクルの複数選択によって選択される、複数のアミノ酸変化による益々高い親和性結合のために選択するのに使用し得る。リガンド又は抗体ポリペプチドにおけるアミノ酸の選択の第１領域に関連する第１回の選択に続いて、リガンドの他の領域及びアミノ酸における追加回の選択が実施される。選択のサイクルは、所望の親和特性が達成されるまで繰り返される。

【0089】

改良抗体は、動物免疫、ハイブリドーマ形成及び特異的特性を有する抗体の選択の、標準的技術により作製される改良特性を有するそれらの抗体を含む。

【0090】

「アンタゴニスト」は、ＣＸＣＲ５によるシグナル伝達などの標的分子の１つ又はそれ以上の生物活性を抑制することができる分子を意味する。アンタゴニストは、リガンドにより活性化された細胞を無能力化又は殺細胞することにより、及び／又は受容体若しくはリガンド活性化（例えば、チロシンキナーゼ活性化）又は受容体へのリガンド結合後に細胞情報伝達を阻害することにより、リガンドへの受容体の結合を干渉することができ、逆もまた同様である。アンタゴニストは、受容体−リガンド相互作用を完全にブロックし、又は実質的に当該相互作用を低減する可能性がある。アンタゴニストによるすべての当該全ポイントの介入は、本発明の目的に対して同等であると考えてよい。従って、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１３又はＣＸＣＲ５の他のリガンド、又はＣＸＣＲ５の複合体及びＣＸＣＬ１３などのそのリガンド；ＣＸＣＲ５及びＣＸＣＬ１３などのリガンド間の相互作用に拮抗するＣＸＣＲ５又はＣＸＣＬ１３のアミノ酸配列変異体又は誘導体；免疫グロブリン領域（例えば、免疫付着因子）などの異種分子に場合により融合した可溶性ＣＸＣＲ５；別の受容体又は生体分子と関連してＣＸＣＲ５を含む複合体；ＣＸＣＲ５に結合する合成又は天然配列ペプチドなどに結合するアンタゴニストは、本発明の範囲内に含まれる。

【0091】

「アゴニスト」は、ＣＸＣＲ５の１つ又はそれ以上の生物活性を活性化する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、複合体、大分子、小分子を含む化合物を意味する。アゴニストは、リガンドにより活性化された細胞のマイトジェンとして作用することにより、及び／又は受容体へのリガンド結合後に細胞不活性化又は情報伝達阻害に干渉することにより、リガンドへの受容体の結合と相互作用することができ、逆もまた同様である。アゴニストによる介入のすべてのこのようなポイントは、本発明の目的にとって均等であるとされるものとする。従って、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＬ１３又はＣＸＣＲ５の他のリガンド、又はＣＸＣＲ５の複合体及びＣＸＣＬ１３などのそのリガンド；ＣＸＣＲ５及びＣＸＣＬ１３などのリガンド間の相互作用を促進するＣＸＣＲ５又はＣＸＣＬ１３のアミノ酸配列変異体又は誘導体；免疫グロブリン領域（例えば、免疫付着因子）などの異種分子に場合により融合した可溶性ＣＸＣＲ５；別の受容体又は生体分子と関
連してＣＸＣＲ５を含む複合体；ＣＸＣＲ５に結合する合成又は天然配列ペプチドなどに結合するアゴニストは、本発明の範囲内に含まれる。アゴニストは、一般的に、例えば、信号を伝えるためにＣＸＣＲ５を直接活性化する実体である。

【0092】

用語「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養」はその後代を含む。当然のことながら、すべての後代は、計画的又は偶発的突然変異に因り、ＤＮＡ含量などにおいて正確には同一ではないと考えられる。起源細胞においてスクリーニングされる関心ある同じ機能又は生物学的特性を有する変異型後代が含まれる。本発明で使用される「宿主細胞」は、一般的にデザイン選択肢として選択される原核生物又は真核生物宿主である。

【0093】

核酸による細胞性生物、細胞又は細胞系の「形質転換」は、核酸が染色体外要素としてか又は染色体の統合により複製可能なように、及び場合により発現するように、核酸を標的細胞中に導入することを意味する。核酸による細胞又は生物の「トランスフェクション」は、いずれのコード配列が実際に発現するかどうかを問わず、細胞又は生物による核酸、例えば発現ベクターの取り込みを指す。用語「トランスフェクト宿主細胞」及び「形質転換した」は、核酸が導入された細胞を指す。代表的な原核生物宿主細胞は、E. coliの種々の菌株を含む。代表的な真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣又はヒト起源の細胞などの哺乳動物細胞である。導入された核酸配列は、宿主細胞と同じ種又は宿主細胞からの異なる種であってよく、又は幾つかの異種及び幾つかの同種核酸を含むハイブリッド核酸配列であってよい。形質転換は、ウイルス由来要素による形質導入又は感染によっても起こり得る。

【0094】

用語「ベクター」は、好適な宿主におけるトランス遺伝子の発現のための好適な制御配列に操作可能に結合し得る核酸、トランス遺伝子、外来遺伝子又は関心ある遺伝子を含む核酸構築物、担体を意味する。当該制御配列は、例えば、転写を達成するプロモーター、当該転写を調節する選択的オペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子又は可能なゲノム挿入そのものであってよい。好適な宿主へ形質転換したベクターは、宿主ゲノムに関係なく複製しそして機能し、又は幾つかの例では宿主細胞ゲノムに統合され得る。本明細書で、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが一般的に使用されるベクターの型であることから互換性をもって使用し得る。しかしながら、本発明は、ウイルス、核酸分子を担持する合成分子、リポソームなどの、同等の担体機能を果たし、そして当技術分野で公知か又はそうなる他のベクター型を含むことを意図している。

【0095】

治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農業用動物、非ヒト霊長類、及びイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園、スポーツ又はペット動物を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。

【0096】

関心ある抗体は、本明細書に記載の又は当技術分野で公知のアッセイにてスクリーニングされ、そして使用し得る。しばしばこのようなアッセイは、検出可能である試薬、即ち例えば標識した試薬を必要とする。本明細書で使用する場合の用語「標識」は、分子又はタンパク質、例えば抗体に直接的又は間接的に結合し得る検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出できる（例えば、放射標識、粒子又は蛍光標識）か、又は酵素標識の場合には検出できる基質化合物又は組成物の化学変化を触媒し得る。

【0097】

本明細書に包含される「固相」は、本発明の抗体などの実体又は分子を接着し得る非水性マトリックスを意味する。本発明に包含される固相の例は、ガラス（例えば、制御細孔ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで部分的又は完全に形成された固相を含む。特定の実施態
様では、状況により、固相は分析プレートのウェルを含むことができる；別の場合では精製カラムで使用し得る（例えば、アフィニティクロマトグラフィーカラム）。このように、固相は、紙、ビーズ、プラスチック、チップなどであってよく、ニトロセルロース、アガロース、ポリスチレン、シリコーンなど種々の材料から作られ、そして種々の立体配置を取り得る。

【0098】

細胞外ドメイン（ＥＣ）ドメインなどの可溶性ＣＸＣＲ５又はそのフラグメントは、関心ある抗体を作成する免疫原として使用できる。免疫原は天然源から得るか若しくは分離でき、又は組み換えにより作ることができる。ＣＸＣＲ５⁺細胞などの全細胞、天然源由来の細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｂ細胞系又は癌細胞系）、又はＣＸＣＲ５を発現させ、そしてできれば過剰発現させるための組み換え技術による形質転換(又はトランスフェクト)細胞を、関心ある抗体を作製する免疫原として使用してもよい。同様に、ＣＸＣＲ５又はＣＸＣＲ５のＥＣ領域に対応する合成ペプチド若しくは短縮ポリペプチドを担持する膜標品が、当技術分野で知られているように使用し得る。

【0099】

ＣＸＣＲ５の約６０アミノ酸長、又はその部分であるＥＣが免疫原として使用し得る。複合体などの抗体を調製するのに有用な免疫原の他の形態は、当技術分野において明らかである。このように、ＣＸＣＲ５又はその部分は、免疫原として使用するためにアルブミン又はＫＬＨなどの担体分子に結合し得る。勿論、ＣＸＣＲ５を発現する細胞では、それは好ましい免疫原又は免疫原の一部となるＥＣである。

【0100】

当技術分野で公知のＣＸＣＲ５をコードする遺伝子又はｃＤＮＡは、プラスミド又は他の発現ベクターでクローニングされ、そして当業者に周知の方法に従って多数の発現系のいずれかにおいて発現し、そして、例えば、下記を参照されたい。遺伝コードの縮重に因り、ＣＸＣＲ５タンパク質又はポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が、組み換えＣＸＣＲ５又はその機能的産物の発現の実施において使用し得る。ヌクレオチド配列は、宿主細胞に好ましい選択など可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することにより変化してもよい。組み合わせは、自然ＣＸＣＲ５をコードするヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝コードに従って行なわれ、そしてすべての該変異が検討され得る。このように、ＣＸＣＲ５をコードする配列は関心あるアミノ酸を発現するコドンを含むように記録し得るが、しかしながら、トリプレットコドンは、ヒト細胞などの宿主細胞の遺伝子発現装置に有利なものである。それらのポリペプチドのいずれかは、ラクダ科などの動物の免疫感作に、又はＣＸＣＲ５に結合する抗体を生成する他の系に使用し得る。

【0101】

上記のように、ＣＸＣＲ５免疫原は、有益な場合は、融合セグメントに結合したＣＸＣＲ５を有する融合タンパク質として発現することができ、それは一般的に１つ又はそれ以上の有利な機能を有するポリペプチドである。融合セグメントは、例えば、融合タンパク質が親和性クロマトグラフィーにより分離されそして精製し得ることによって、しばしばタンパク質の精製に有用であるが、しかし、免疫原性を増加させるのにも使用できる。融合タンパク質は、ＣＸＣＲ５ポリペプチドのカルボキシル及び／又はアミノ末端のいずれかに結合したタンパク質をコードする、融合核酸配列で形質転換した組み換え細胞を培養することにより産生し得る。融合セグメントは、免疫グロブリンＦｃ領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、二価金属イオンに結合できるポリヒスチジンセグメント及びマルトース結合タンパク質を含んでもよいが、これに限定されない。

【0102】

アミノ酸配列突然変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の種々の方法により調製し得る。方法は、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発及び関心ある分子の既調製突然変異体又は非突然変異体バージョンのカセット変異
誘発を含むが、これに限定されない（例えば、 Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488
(1985)を参照されたい）。

【0103】

本発明の抗体、又はフラグメント、誘導体又はそのアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖、本発明の一本鎖抗体又は本発明の抗体突然変異タンパク質）の組み換え発現は、本明細書に記載の抗体及び抗体のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を含む。抗体分子をコードするポリヌクレオチドが得られていると、抗体の産生のためのベクターは当技術分野で公知の組み換えＤＮＡ技術によって生産してもよい。発現ベクターは、配列並びに適切な転写及び翻訳調節シグナルをコードする抗体を含んで構築される。方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組み換えを含む。

【0104】

発現ベクターは、従来技術により宿主細胞に移行し、次いでトランスフェクト細胞は、本発明の抗体及びフラグメントを生産するために従来技術により培養される。本発明の１つの態様では、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターは、本明細書に詳述するように全免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞中に共発現し得る。

【0105】

種々の宿主／発現ベクター系が、本発明の抗体分子を発現するために利用し得る。当該発現系は、関心あるコーディング配列がそれによって作られその後精製されるベヒクルを発現するが、しかし配列をコードする適切なヌクレオチドで形質転換又はトランスフェクトする場合、その場で本発明の抗体分子を発現すると考えられる細胞をも現わす。E. coliなどの細菌細胞及び真核細胞は、一般的に組み換え抗体分子の発現、特に全組み換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター要素を担持するベクターと併せて、抗体の有効な発現系である（Foecking et al., Gene 45:101 (1986); and Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990))。植物及び植物細胞培養、昆虫細胞なども、当技術分野で公知の関心あるタンパク質を作製するのに使用してもよい。

【0106】

加えて、挿入配列の発現を調節し、又は所望の特異的方法で遺伝子産物を修飾し又はプロセシングする宿主細胞が選択される。タンパク質製品の当該修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング(例えば、切断)はタンパク質の機能にとって重要であると考えられる。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的及び特異的メカニズムを有する。適切な細胞系又は宿主系が、関心ある発現抗体の正しい修飾及びプロセシングを確実なものにするために選択し得る。それ故、一次転写物の適正プロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用できる。当該哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、３Ｔ３又は骨髄腫細胞を含むが、これらに限定されるものではない。

【0107】

組み換えタンパク質の長期、高収率産生のためには、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞系を改変してもよい。ウイルス起源の複製を含有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択可能なマーカーによって調節されたＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、人工細胞は強化培地中で１日から２日間増殖することが可能になり、そして次に選択培地に移される。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に抵抗性を賦与し、そして細胞が染色体中へプラスミドを安定的に統合し、そして細胞系中へ拡張することを可能にする。当該人工細胞系は抗体産生に有用であるばかりでなく、抗体分子と直接的又は間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価に有用である。

【0108】

多くの選択系が、ヘルペスシンプレックス ウイルスチミジンキナーゼ (Wigler et al.
, Cell 11:223 (1977))、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)), メチオニンスルホキシミドの存在下でのグルタミン酸シンターゼ選択（Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 及びLonza Group Ltd.のウェブサイト又は文献参照) 、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) 遺伝子を含み、それぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔ又はａｐｒｔ細胞において使用し得るが、これらに限定されない。同様に、代謝拮抗物質耐性が以下の遺伝子選択の基礎として使用し得る：メトトトレキサートに対する耐性を賦与するｄｈｆｒ(Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)); ミコフェノール酸に耐性を賦与するｇｐｔ(Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981))；アミノグリコシド、Ｇ−４１８に耐性を賦与するｎｅｏ(Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991))；及びハイグロマイシンに耐性を賦与するｈｙｇｒｏ（Santerre et al., Gene 30:147 (1984))。組み換えＤＮＡ工学の技術分野において公知の方法を、所望の組み換えクローンを選択するために定常的に応用してもよく、そして当該方法は、例えば、 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, 「遺伝子導入及び発現、実験室マニュアル」（Gene Transfer and Expression, A Laboratory
Manual）, Stockton Press (1990); Dracopoli et al., eds., 「ヒト遺伝学における最近のプロトコール」（Current Protocols in Human Genetics）, John Wiley & Sons (1994);及びColberre-Garapin et al., J Mol Biol 150:1 (1981)に記載されている。

【0109】

抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増加し得る（例えば、Bebbington et al., in DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能な場合、培養中に存在するインヒビターのレベル増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させることができる。増幅領域は抗体遺伝子に関与することから、抗体の産生も増加する可能性がある（Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983))。

【0110】

宿主細胞は、本発明の２つ又はそれ以上の発現ベクター、例えば、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターで同時遺伝子導入してもよい。２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含んでもよい。或いは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードしそして発現することができる、単一ベクターを使用してもよい。当該状況では、過剰な有毒遊離重鎖を避けるために、軽鎖は重鎖の前に入れるべきである（Proudfoot, Nature 322:52 (1986); and Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980))。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでもよい。

【0111】

本発明の抗体分子が動物によって産生され、化学的に合成され又は組み換えにより発現すると、それは免疫グロブリン分子の精製の技術分野で公知のいずれの方法によっても、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後のＣＸＣＲ５アフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーなど）、遠心分離、示差溶解度により、又はタンパク質精製のためのその他の標準技術により精製し得る。加えて、本発明の抗体又はそのフラグメントは、精製を促進するために、本明細書に記載の又は別の当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合し得る。

【0112】

以下の実施例に例示する組み換えＣＸＣＲ５タンパク質は、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成させるマウスを感作するために使用された。得られたモノクローナル抗体は、例えば、それへのＣＸＣＲ５リガンドの結合を阻害する有利な治療可能性のために選択された。選択された抗体は、次いでインビボで安定性を強化するなど有益な特性を得るために修飾された。

【0113】

本発明の抗体は、当技術分野で公知のいずれの好適な方法によって生成してもよい。本発明の抗体はポリクローナル抗体を含むが、ヒトでの使用を最適化するための、並びに抗体それ自体の使用を最適化するための抗体修飾に因り、モノクローナル抗体が特定の蛋白質の産生及び操作の容易さ故に好ましい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に公知である (Harlow et al.,「抗体：実験室マニュアル」（Antibodies: a Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)）。

【0114】

例えば、本明細書に例示する免疫原は、ＣＸＣＲ５に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導するために、ウサギ、マウス、ラクダ科、ラットなどを含む種々の宿主動物に投与し得るが、それらに限定されない。免疫原の投与は免疫剤、及び必要に応じてアジュバントの１回又はそれ以上の注射を必要とする。宿主の種により、種々のアジュバントが免疫反応を増加させるために使用でき、そしてフロイント（完全及び不完全）、鉱油、ゲル、ミョウバン（水酸化アルミニウム）、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノール及びＢＣＧ（Bacille Calmette-Guerin)及びCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。使用されるアジュバントの更なる例は、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコール酸エステル）を含む。免疫感作プロトコールは当技術分野で周知であり、そして選択された動物宿主に免疫反応を誘発するいずれの方法で実施してもよい。このように、種々の投与経路がデザイン選択として種々の時間経過にわたって使用できる。

【0115】

一般的には、免疫原は（アジュバントの有り又は無しで）、複数回の皮下又は腹腔内注射により、又は筋肉内若しくは静脈内投与で哺乳動物に注射される。免疫原は、自然細胞、自然変異細胞又は遺伝子工学細胞であってよい、ＣＸＣＲ５を産生又は過剰産生する細胞により生産されるポリペプチド、融合タンパク質又はその変異体を含む。特定の条件では、ＣＸＣＲ５を発現する全細胞を使用し得る。ポリペプチドの性質（即ち、疎水性パーセント、親水性パーセント、安定性、正味電荷、等電点など）に応じて、感作されている哺乳動物などの動物において免疫原性又はより免疫原性になるように、ＣＸＣＲ５又はその一部分が修飾又は結合されてもよい。例えば、ＣＸＣＲ５又はその一部分は担体に結合し得る。結合は、共有結合が形成されるように結合すべき免疫原及び免疫原性タンパク質へ活性化学的官能基を誘導体化することによる化学結合か、又は融合タンパク質ベースの方法若しくは当業者に周知の他の方法を通しての化学結合を含む。当該担体又は免疫原性タンパク質の例は、ＫＬＨ、卵白アルブミン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ダイズトリプシンインヒビター、及び無差別Ｔヘルパーペプチドを含むが、これらに限定されない。種々のアジュバントは上記のように免疫反応を増強するために使用し得る。

【0116】

好適な調製品が得られたならば、アフィニティクロマトグラフィー、パンニング、吸収などの公知の分離法により、複数の抗体から特定の抗体を分離することが可能である。このように、個々の抗体種が、更なる研究、例えば、１つ又はそれ以上のＣＤＲのアミノ酸配列を得るための配列を決定する検討のために得ることができる。

【0117】

本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975); U.S. Pat. No. 4,376,110; Harlow et al.,「抗体：実験室マニュアル」（ Antibodies: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)及びHammerling et al., 「モノクローナル抗体及びＴ細胞ハイブリドーマ」（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）, Elsevier (1981)に記載のようなハイブリドーマ技術、組み換えＤＮＡ法を使用して、例えば、トランスフェクトーマを作製及び使用して、又は当業者に公知の他の方法を使用して調製してもよい。モノクローナル抗体の生産に用いられる方法の他の例は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
技術（Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); and Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., 「モノクローナル抗体及びがん治療」（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985）を含むが、これらに限定されない。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＤを含むいずれの免疫グロブリンクラス、及びそのいずれのサブクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養することができる。

【0118】

ハイブリドーマ・モデルでは、マウス、ヒト化マウス、ヒト免疫系遺伝子を有するトランスジェニックマウス、ハムスター、ウサギ、ラット、ラクダ又はその他の適切な宿主動物などの宿主は、免疫感作されて、ＣＸＣＲ５に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘導する。或いは、リンパ球はインビトロで免疫感作し得る。次いでリンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986))。

【0119】

一般に、抗体産生ハイブリドーマの作製において、ヒト起源の細胞が所望される場合に末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、又は非ヒト哺乳動物起源が所望される場合に脾細胞若しくはリンパ節細胞が使用される。不死化細胞系は、通常形質転換哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシ又はヒト起源の骨髄腫細胞である。一般的には、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が用いられる。骨髄腫細胞は、好ましくは、非融合不死化細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又はそれ以上の物質を含有する好適な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は、一般的にヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（「ＨＡＴ培地」）、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を抑制する物質を含むことができる。

【0120】

好ましい不死化細胞系は、効率的に融合して、選択的抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を維持する細胞系であり、そしてＨＡＴ培地などの培地に対して高感受性である。これらのうち、骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, Calif.から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来などのマウス骨髄腫系細胞、及びthe American Type Culture Collection, Manassas, VA.から入手可能なＳＰ２／０、ＦＯ又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。

【0121】

ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生用に記載されている（Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); 及びBrodeur et al., 「モノクローナル抗体産生技術及びその応用」（Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications）, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987))。マウス骨髄腫細胞系ＮＳＯも使用してよい（European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK)。

【0122】

別の代替法は、ハイブリドーマを形成させる化学融合よりむしろ電気融合を用いることである。融合の代わりに、Ｂ細胞は、例えば、エプスタイン・バー・ウイルス又は別の形質転換遺伝子を用いて不死化し得るが、例えば、Zurawaki et al., 「モノクローナル抗体」（Monoclonal Antibodies）, ed., Kennett et al., Plenum Press, pp. 19 33. (1980）を参照されたい。免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス、及びヒトＢリンパ球を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスも使用することができる。

【0123】

ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地について、ＣＸＣＲ５に対するモノクローナル抗体の産生の測定が行われる。ハイブリドーマ細胞により産生したモノクローナル抗体の
結合特異性は、免疫沈降法により又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）又は固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合分析によって測定することができる。当該技術は当技術分野及び当業者に公知である。ＣＸＣＲ５に対するモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード解析によって測定できる（Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980))。

【0124】

所望の特異性、親和性、及び／又は活性をもつ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定後、クローンは限定希釈手順によりサブクローニングされ、そして標準方法により増殖され得る（Goding, 「モノクローナル抗体：原理と実際」（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）, Academic Press, pp. 59-103 (1986))。好適な培養培地は、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium（Ｄ−ＭＥＭ）又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖し得る。

【0125】

サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水又は血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、プロテインＧ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーなどの、従来の免疫グロブリン精製手順により好適に分離又は単離される。

【0126】

モノクローナル抗体産生の技術では種々の方法が存在し、その上、本発明はハイブリドーマでのそれらの単独産生に限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、米国特許第４８１６５６７号に記載のような組み換えＤＮＡ法によって作製してもよい。これに関連して、用語「モノクローナル抗体」は単一真核生物、ファージ又は原核生物クローン由来の抗体を指す。

【0127】

本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて直ちに単離され、そして配列が決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖、又はヒト、ヒト化若しくは他の起源由来の当該鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）（Innis et al.Innis et al. 「ＰＣＲプロトコール。方法と応用の手引書」（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications）, Academic (1990), and Sanger et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)）。ハイブリドーマ細胞は、当該ＤＮＡの起源としての機能を果たす。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に入れることができ、次いでそれは、組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を達成するために、他の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない、E. coli 細胞、 ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞中へトランスフェクトされる。ＤＮＡは、また、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対してコード配列を置換することによって（米国特許第４８１６５６７号; 及びMorrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984))、又は非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合で結合させることによって修飾し得る。当該非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置き換えられ、又はキメラ二価抗体を創製するために、本発明抗体の１つのＣＸＣＲ５結合部位の可変領域に置き換えることができる。

【0128】

抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当技術分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組換え体発現を含む。重鎖は、一般的に、重鎖架橋を阻止するためにＦｃ領域のいずれのポイントでも切断される。或いは、関連するシステイン残基は別のアミノ酸残基で置換され、又は架橋を阻止するために除去される。

【0129】

特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成し得る。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクト抗体の蛋白質分解を経由して導かれた（例えば、Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); 及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照されたい)。例えば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ′）₂フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント産生のため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ′）₂フラグメント産生のため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子の蛋白質分解的切断によって産生してもよい。Ｆ（ａｂ′）₂フラグメントは、可変領域、軽鎖可変領域及び重鎖の定常領域Ｃ_H1ドメインを含む。しかしながら、それらのフラグメントは、組み換え宿主細胞により直接産生し得る。例えば、抗体フラグメントは抗体ファージライブラリーから単離し得る。或いは、Ｆ（ａｂ′）₂−ＳＨフラグメントは、E. coliから直接的に回収され、そしてＦ（ａｂ′）₂フラグメントを形成するために化学的に結合し得る (Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992))。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ′）₂フラグメントは組み換え宿主細胞培養から直接単離し得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者には明らかである。他の実施態様では、最適な抗体は単一鎖Ｆｖフラグメント（Ｆν）である（国際公開第９３／１６１８５号）。

【0130】

ヒトの抗体のインビボ使用及びインビトロ検出分析を含む特定の使用に対しては、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を使用することが好ましいと考えられる。キメラ抗体の生産方法は当技術分野で公知であり、例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); 及び米国特許第５８０７７１５号；同第４８１６５６７号；及び同第４８１６３９７号を参照されたい。

【0131】

ヒト化抗体は、ＣＸＣＲ５を結合する非ヒト種で生成する抗体分子から由来し、そこからの１つ又はそれ以上のＣＤＲがヒト免疫グロブリン分子からＦＲ領域中へ挿入される。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植(欧州特許公開公報第２３９４００号；国際公開公報第９１／０９９６７号; 及び米国特許第５２２５５３９号 ; 同第５５３０１０１号及び同第５５８５０８９号)、表面張り又は再表面化 (欧州特許公開公報第５９２１０６号；欧州特許公開公報第５１９５９６号；Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., 「タンパク質工学」（Protein Engineering) 7:805 (1994); 及びRoguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994))、及び鎖シャッフリング(米国特許第５５５６３３２号)を含む当技術分野で公知の種々の技術を用いてヒト化し得る。

【0132】

ヒト化抗体は、非ヒト起源からの１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、一般的には「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化は、非ヒトＣＤＲ又はＣＤＲ配列の部分をヒト抗体の対応する配列の代わりに置き換えることにより、基本的にWinter及び共同研究者の方法（Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988);及びVerhoeyen et al.,
Science 239:1534 (1988))に従って実施し得る。従って、当該「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、その場合実質的にインタクトヒト可変ドメイン未満のものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際にヒト化抗体は、幾つかのＣＤＲ残基及び可能な幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似部位から置換される、ヒト抗体である。１つ又はそれ以上の重鎖ドメインを含むことができる重鎖定常領域、及びヒンジ領域は、特定のエフェクター機能など所望の効果を得るために、いずれのクラス又はサブクラスからであってもよい。

【0133】

しばしば、ヒトのフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させ、そして可能なら強化するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基と置換し得る。フレームワーク置換は、当技術分野で公知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用をモデル化すること
により、そして特定位置における異常なフレームワーク残基を特定する配列比較により同定されるが、例えば、米国特許第５５８５０８９号；及びRiechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照されたい。

【0134】

ヒト化抗体が、ＣＸＣＲ５に対して高親和性を保持し、そして他の好適な生物学的特性を保持又は獲得することは更に好ましい。それ故、ヒト化抗体は親の配列及び種々概念のヒト化産物の解析工程により、親及びヒト化配列の３次元モデルを用いて調製される。３次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、そして当業者に周知である。選択候補免疫グロブリン配列の推定３次元立体配座構造を図解して表示するコンピュータ・プログラムが市販されている。ディスプレーの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における特定残基の可能性のある役割の解析、即ち候補免疫グロブリンのＣＸＣＲ５結合能に影響を及ぼす残基の解析を可能にする。そのように、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性増加などの所望の抗体特性が最大化されるように、レシピエント及び移入配列から選択しそして組み合わせることができるが、ＣＸＣＲ５結合に直接及び最も実質的に影響を及ぼすのはＣＤＲ残基である。ＣＤＲが、例えば、より大きい親和性又はより大きい結合活性の結合などの関心ある増強され又は異なる特性を与えるために、それから得られた親抗体から得られるものと異なる１つ又はそれ以上のアミノ酸を含有するように、ＣＤＲ領域も修飾され得る。

【0135】

抗体の定常領域の特定部分は、抗体ホモログ、誘導体、フラグメントなどに親抗体に認められるものと異なる又はより優れた特性を与えるために操作又は変化し得る。それ故、例えば、多くのＩｇＧ４抗体は、ヒンジ領域近傍に鎖内ジスルフィド結合を形成する。鎖内結合は、会合軽鎖と共に重鎖を含む一価分子を形成する親の二価分子を不安定化することができる。

【0136】

ＩｇＧ４分子のヒンジ領域におけるアミノ酸修飾は、鎖内結合形成の可能性を低下させて、それにより二重特異性抗体形成の可能性を最小化するＩｇＧ４分子を安定化し得ることが観察された。安定性増強は産生、製造時に、並びにインビボで分子を解離させる可能性を最小にし得るので、治療抗体がＩｇＧ４分子ならばその修飾は有益であり得る。一価抗体は二価の親分子と同じ有効性を有しないと考えられる。例えば、二価ＩｇＧ４を患者に投与する場合、二価ＩｇＧ４の割合は２週間にわたって約３０％にまで減少する。２２８位置でのアミノ酸置換はＩｇＧ４安定性を強化する。２２８に存在するセリンは、残る１９アミノ酸の１つのように別のアミノ酸で置換し得る。当該変換は特に組み換え抗体でなし得るが、その場合、核酸コード配列は変異することができて、２２８位置で置換アミノ酸を与える。例えば、Ｓはプロリンで置換し得る。

【0137】

修飾に好適なアミノ酸の別のセットは、Ｆｃ受容体への結合及び結合抗体のインターナリゼーションにより、重鎖を含む分子の結合に影響を与えるヒンジの範囲内のアミノ酸を含む。当該アミノ酸は、ＩｇＧ１分子中において約２３３から約２３７まで（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）；（配列番号４９）約２５２から約２５６まで（Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ）(配列番号５０)、及びＬｙｓ₃₂₀、Ｌｙｓ₃₂₂及びＰｒｏ₃₂₉を含む、約３１８（Ｇｌｕ）から約３３１（Ｐｒｏ）までの残基を含む。

【0138】

完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いて、上記のファージ・ディスプレー法を含む当技術分野で公知の種々の方法で作製し得るが、米国特許第４４４４８８７号及び同第４７１６１１１号；及び国際公開第９８／４６６４５号、国際公開第９８／５０４３３号、国際公開第９８／２４８９３号、国際公開第９８／１６６５４号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９６／３３７３５号及び国際公開第９１／１０７４１号を参照されたい。Cole et al. and Boerder et al.の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に使
用可能である（Cole et al.,「モノクローナル抗体及び癌治療」（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）, Alan R. Liss (1985); and Boerner et al., J Immunol 147:86 (1991))。

【0139】

ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、特定のヒト免疫グロブリン遺伝子をも発現するトランスジェニックマウスを用いて生産することもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに又は相同的組み換えによりマウス胚性幹細胞中へ導入し得る。或いは、ヒト可変領域、定常領域及び多様性領域は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞中へ導入し得る。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組み換えによりヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々に又は同時に非機能性にしてもよい。具体的に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は内因性抗体産生を抑制する。修飾胚性幹細胞は拡張され、そしてキメラマウスを生産するために胚盤胞中へ微量注入される。次いでキメラマウスを繁殖させ、ヒト抗体を発現するホモ接合性新生仔を生産させるが、例えば、Jakobovitis et al., Proc Natl Acad
Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); 及びDuchosal et al., Nature 355:258 (1992))を参照されたい。

【0140】

トランスジェニックマウスは、ＣＸＣＲ５、例えば、そのＥＣドメインなどのＣＸＣＲ５の全部又は一部を用いて常法により免疫感作される。ＣＸＣＲ５に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫感作したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスにより固定されたヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化時に再配列し、そしてその後クラススイッチ及び体細胞変異を受ける。このように、当該技術を用いて、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を産生することが可能である。概観のためには、Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体の産生並びに当該抗体を産生するプロトコールの検討に対しては、例えば、国際公開公報第９８／２４８９３号；国際公開公報第９２／０１０４７号；国際公開公報第９６／３４０９６号；及び国際公開公報第９６／３３７３５号；欧州特許公開公報第０５９８８７７号；及び米国特許第５４１３９２３号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５５６９８２５号；同第５６６１０１６号；同第５５４５８０６号；同第５８１４３１８号；同第５８８５７９３号；同第５９１６７７１号；及び同第５９３９５９８号を参照されたい。加えて、Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San Jose, CA) 及びMedarex, Inc. (Princeton, NJ）などの企業は、上記に類似した技術を用いて、ＣＸＣＲ５に対するヒト抗体を提供することが可能である。

【0141】

また同様に、ヒトｍＡｂは、ヒト末梢血白血球、脾細胞又は骨髄を移植したマウスを免疫感作することにより作製し得る（XTL Biopharmaceuticals, Israelのトリオーマ技術）。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と称する技術を用いて生成し得る。そのアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体が同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために使用される（Jespers et al., Bio/technology 12:899 (1988))。

【0142】

組み換え技術を用いる場合、抗体変異体は細胞内の細胞周辺腔に産生され、又は直接培地中に分泌し得る。抗体変異体が最初の工程として細胞内に産生される場合、粒子状残屑、宿主細胞か又は溶解フラグメントは、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去し得る。Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992) は、E. coliの細胞周辺腔に分泌される抗体を分離する手順を記載している。簡潔にいうと、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３.５）及びＥＤＴＡに曝露する。細胞残屑は遠心分離により除去し得る。抗体変異体が培地中に分泌される場合、当該発現系からの上清は、一般的に先ず市販のタンパク
質濃縮フィルター、例えば、Amicon 又は Millipore Pellicon 限外濾過ユニットを用いて濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が蛋白質分解を阻害するために含まれてもよく、そして抗体が偶発的不純物の増殖を抑制するために含まれてもよい。

【0143】

細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡ又はプロテインＧの適合性は、抗体変異体に存在するいずれの免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプによって決まる。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用し得る（Lindmark et al., J Immunol Meth 62:1 (1983))。プロテインＧは、マウスアイソタイプ及びヒトＩｇＧ３に対して使用し得る (Guss et al., EMBO J 5:1567 (1986))。親和性リガンドが結合するマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。制御細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体変異体がＣ_H3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂（JT Baker; Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラムなど）アニオン又はカチオン交換樹脂によるヘパリンアガロースクロマトグラフィーでのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技術も、回収する抗体又は変異体により利用可能である。

【0144】

予備精製工程に続いて、関心ある抗体又は変異体及び不純物を含む混合物は、約２.５〜４.５のｐＨで、溶離緩衝液を用いて、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０.２５Ｍ塩から）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよい。

【0145】

更に、本発明の抗体は、順に、当業者に周知の技術を用いてＣＸＣＲ５を「模倣」する抗イディオタイプ抗体を生成させるために使用し得る (例えば、 Greenspan et al., FASEB J 7:437 (1989);及びNissinoff, J Immunol 147:2429 (1991)を参照されたい)。例えば、ＣＸＣＲ５に結合し、そして多量体化及び／又はリガンドの結合を競合的に阻害する抗体は、ＣＸＣＲ５及び結合ドメインを「模倣」し、そしてその結果としてＣＸＣＲ５及び／又はそのリガンドに結合し中和する抗イディオタイプを生成させるために使用し得る。当該中和抗体又は当該抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、治療計画において、例えば、ＣＸＣＬ１３を中和するために使用し得る。

【0146】

本発明の抗体は二重特異性抗体であってよい。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体であり得る。本発明では、結合特異性の１つはＣＸＣＲ５に指向し、他方は細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、リガンド、組織特異抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスコード化エンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質、細菌表面タンパク質などのその他の抗原に向かうと考えられる。それ故、もう一方の特異性はＣＸＣＬ１３に対してであり得る。

【0147】

二重特異性抗体を作製する方法は周知である。伝統的に、二重特異性抗体の組み換え生産は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいている（Milstein et al., Nature 305:537 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダム組み合わせに因り、ハイブリドーマ(クアドローマ)は１０の異なる抗体分子の可能な混合物を産生するが、そのうちのただ１つが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常親和性クロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、 国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991)に開示されている。二重特異性抗体を作製する他の方法は、例えば、Kufer et al., Tren
ds Biotech 22:238-244, 2004において提供されている。

【0148】

所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは少なくともヒンジの一部、Ｃ_H2、及びＣ_H3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとによるものである。それは、融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する最初の重鎖定常領域（Ｃ_H1）を有してもよい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び必要に応じて免疫グロブリン軽鎖は別々の発現ベクターに挿入され、そして好適な宿主生物へ共形質転換される。二重特異性抗体を生成させる更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986)を参照されたい。

【0149】

ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明によって意図されるものである。ヘテロコンジュゲート抗体は２つの共有結合抗体から成る。当該抗体は、例えば、不要細胞に免疫系細胞を標的化するために提案されている（米国特許第４６７６９８０号）。抗体が、架橋剤を包含する方法を含む、合成タンパク質化学で公知の方法を用いてインビトロで調製し得ることも意図している。例えば、抗毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエステル結合を形成させることにより構築し得る。この目的に好適な試薬の例は、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート、並びに、例えば、米国特許第４６７６９８０号に開示されているものを含む。

【0150】

加えて、ＣＸＣＲ５に対する単一ドメイン抗体を生成させることができる。その技術の例は、ラクダ科重鎖Ｉｇ由来の抗体では国際公開公報第９４２５５９１号に、並びにファージ・ライブラリーからの単一ドメイン完全ヒト抗体の分離を記載している米国特許公開公報第２００３０１３０４９６号に記載されている。

【0151】

或いは、一本鎖抗体の生産のために記載されている技術 (米国特許第４９４６７７８号; Bird, Science 242:423 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988);及びWard, et al., Nature 334:544 (1989)) は、一本鎖抗体を産生するために適用し得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を経由してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖フラグメントを連結させることにより形成され、一本鎖ポリペプチドをもたらす。E. coli における機能的Ｆｖフラグメントのアセンブリー技術を使用してもよい（Skerra et al., Science 242:1038 (1988））。

【0152】

本発明は、ポリペプチドに対して組み換え技術により融合し又は化学的結合した（共有結合及び非共有結合による連結を含む）抗体を包括する。本発明の融合又は結合抗体は精製を容易にするために使用し得るが、例えば、国際公開公報第９３／２１２３２号；欧州特許公開公報第４３９０９５号；Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994); 米国特許第５４７４９８１号; Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992);及びFell et al., J Immunol 146:2446 (1991)を参照されたい。マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA）でもたらされたタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチド（配列番号５１）であってよく、とりわけその多くは市販されている、 Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989)。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ・ヘマグルチニン・タンパク質（Wilson et al., Cell 37:767 (1984)）由来のエピトープに相当する「ＨＡ」タグ及び「フラッグ」タグを含むが、これに限定されない。

【0153】

同様に、重鎖及び軽鎖Ｆｖ領域が結合している単一ペプチド鎖結合分子を創製することもできる。一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」）及びその構築方法は、例えば、米国特許第４９４６７７８号に記載されている。或いは、Ｆａｂは同様な手段により構築及び発現し得る。すべての全体的及び部分的ヒト抗体は全体的マウスｍＡｂよりも低免疫原性であり、そし
てフラグメント及び一本鎖抗体も低免疫原性である。

【0154】

抗体又は抗体フラグメントは、McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)に記載の技術を用いて生成した抗体ファージ・ライブラリーから分離することができる。Clarkson et al., Nature 352:624 (1991）及びMarks et al., J Mol Biol 222:581 (1991）は、ファージライブラリーを用いてそれぞれマウス及びヒト抗体の単離を記載している。以下の刊行物は、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992))、並びに非常に大きなファージ・ライブラリー（Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993））を構築する方策としてのコンビナトリアル感染、及びインビボ組み換えによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生について記載している。このように、それらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的モノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替法となる。

【0155】

抗ＣＸＣＲ５抗体は、当技術分野で公知の酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット法又は他の免疫化学的技術によって試験される。このように、Ｂ細胞又はＣＸＣＲ５を発現する細胞は、公知の技術を用いてそれへの抗体結合を検出するために使用することができ、又は組み換えにより発現したＣＸＣＲ５又はＥＣドメインなどのその一部分は、固相に吸着し、そして分析においてデザイン選択として設定される捕捉要素として使用し得る。

【0156】

特定の抗体ホモログがヒトＣＸＣＲ５に結合するかどうかを解明するために、いずれの通常の結合分析を使用してもよい。有用なＣＸＣＲ５結合分析は、ヒトＣＸＣＲ５への抗体の結合、及びそこから由来する機能を検出する、ＦＡＣＳ解析、ＥＬＩＳＡ分析、ラジオイムノアッセイなどを含む。本明細書に示されるヒトＣＸＣＲ５の完全長及び可溶形は、そのような分析に有用である。ＣＸＣＲ５又はその可溶性フラグメントに対する抗体又はホモログの結合は、抗体又はホモログが由来する種の免疫グロブリンに特異的な二次抗体の使用を通して、適宜検出し得る。

【0157】

特定の抗体又はホモログが、ヒトＣＸＣＲ５へのＣＸＣＬ１３又は他のリガンドの結合をブロックするか又はそれほどブロックしないかを解明するために、いずれの好適な競合分析も使用してもよい。有用な分析法は、ヒトＣＸＣＲ５に結合するためにＣＸＣＬ１３又は他のリガンドと競合する抗体又はホモログの能力を定量化する、例えば、ＥＬＩＳＡ分析、ＦＡＣＳ解析、ラジオイムノアッセイなどを含む。好ましくは、固定化抗体又はホモログへの標識ヒトＣＸＣＲ５の結合をブロックするリガンドの能力が測定される。

【0158】

ヒトＣＸＣＲ５への抗体又はホモログの結合能は、ヒトＣＸＣＲ５⁺細胞へのその結合能を試験することにより評価し得る。特定の抗体又はそのホモログが、ヒトＣＸＣＲ５へ結合するかどうかを究明するのに用いられる好適なＣＸＣＲ５⁺細胞は、細胞表面又はＢ細胞上で完全長ヒトＣＸＣＲ５をコードし、そしてＣＸＣＲ５を発現するＤＮＡで形質転換した哺乳動物組織培養細胞である。

【0159】

ＣＸＣＲ５⁺細胞への抗体又はホモログの結合は、試験中の抗体ホモログが由来するのと同じ種の免疫グロブリンに特異的な蛍光標識二次抗体で細胞を染色することにより検出することができる。蛍光活性化細胞選別装置（「ＦＡＣＳ」）は、いずれの結合も検出しそして定量化するのに使用できるが、一般的には、Shapiro, Practical Flow Cytometry,
Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y. (1985）を参照されたい。

【0160】

同様に、ヒトＣＸＣＲ５へのＣＸＣＬ１３などのリガンドの結合をブロックする抗体ホモログの能力は、過剰リガンドをＣＸＣＲ５⁺細胞でプレインキュベートし、そして結合リガンドが細胞への抗体又はホモログの結合をブロックする程度を定量化することにより
決めることができる。ＣＸＣＲ５⁺細胞への抗体ホモログの結合は、試験中の抗体ホモログが由来するのと同じ種の、免疫グロブリンに特異的な蛍光標識二次抗体を用いて、ＦＡＣＳ解析により定量化し得る。或いは、競合分析は、当技術分野で公知の標識又は抗体を用いて設定することができる。

【0161】

上記分析で使用されるＣＸＣＬ１３などのリガンドは、リガンドの遺伝子で形質転換した細胞により、又は本明細書に示される方法を実施して得られた、又は商業ベースで購入された単離ＣＸＣＬ１３によってもたらされてもよい。

【0162】

特定の抗体又はホモログが、インビボでＣＸＣＲ５⁺細胞数の無有意減少をもたらすかどうかを明らかにするために、抗体又はホモログの正常な免疫機能を有する哺乳動物への投与後２４時間以内に、哺乳動物から単離した循環ＣＸＣＲ５⁺細胞数が定量化され、そして不適切な特異性のイソタイプ整合抗体又はホモログが本発明の抗体又はホモログの代わりに投与された、前投与数又は対照哺乳動物数と比較される。ＣＸＣＲ５抗体若しくはその機能部分又は誘導体を投薬した動物中のＣＸＣＲ５⁺細胞数の定量化は、例えば、抗ＣＸＣＲ５抗体、並びにＴ細胞及びＢ細胞に特異的な標識抗体を結合する蛍光標識抗体で得られた細胞を染色し、続いてＦＡＣＳ解析をすることにより達成し得る。

【0163】

本発明の抗体は、抗体が認識し又は特異結合するＣＸＣＲ５のエピトープ又は一部に関して記載又は特定することができる。エピトープ又はポリペプチド部分は、例えば、Ｎ−末端及びＣ−末端位置により、隣接アミノ酸残基のサイズ、立体配座エピソードなどにより、本明細書に記載のように特定することもできる。

【0164】

本発明の抗体は、交差反応性に関して記載又は特定することもできる。ＣＸＣＲ５と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、及び少なくとも５０％同一性（当技術分野で公知のそして本明細書に記載の方法を用いて計算して）を有する、ＣＸＣＲ５ポリペプチドに結合する抗体も、本発明に含まれる。

【0165】

本発明の抗体は、関心あるＣＸＣＲ５への結合親和性に関して記載又は特定することもできる。抗ＣＸＣＲ５抗体は、約１０^-7Ｍ未満、約１０^-6Ｍ未満、又は約１０^-5Ｍ未満のＫ_Dで結合することができる。約１０^-8Ｍから約１０^-15Ｍ、約１０^-8Ｍから約１０^-12Ｍ、約１０^-9Ｍから約１０^-11Ｍ、又は約１０^-8Ｍから１０^-10Ｍの平衡解離定数又はＫ_Dを有するものなどの、関心ある抗体における高結合親和性は有利であり得る。本発明は、競合的結合を測定するための当技術分野で公知のいずれかの方法により、例えば、本明細書に記載のイムノアッセイにより測定して、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を与えることもできる。好ましい実施態様では、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％だけエピトープへの結合を競合的に阻害する。

【0166】

本発明は、関心ある抗体を含む複合体を含むこともできる。複合体は、２つの一次成分関心ある抗体及び細胞結合剤、又は細胞毒製剤などであってもよい二次成分を含む。
本明細書で使用する用語「細胞結合剤」は、細胞表面上の分子を特異的に認識し、そして結合する薬剤を指す。それ故、細胞結合剤は、ＣＤ抗原、ウイルス抗原などの病原体抗原、分化抗原、癌抗原、細胞特異的抗原、組織特異的抗原、Ｉｇ又はＩｇ様分子などであってよい。

【0167】

１つの実施態様では、細胞結合剤は、ＣＸＣＬ１３又はＣＸＣＲ５の複合体及びＣＸＣＬ１３などのそのリガンドを特異的に認識する。複合体は、細胞上で複合体のエフェクタ
ー機能が作用することを可能にし、及び／又は複合体が十分な時間細胞により内在化できるように、十分な期間標的細胞と接触していることができる。

【0168】

細胞結合剤は現在知られている、又は公知になっているいずれのタイプでもよく、そしてペプチド、非ペプチド、単糖類、核酸、リガンド、受容体など、又はその組み合わせを含む。細胞結合剤は、特異的か又は非特異的に細胞を結合できるいずれの化合物でもよい。一般的に、その薬剤は、抗体（特にモノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ビタミン、栄養素輸送分子（トランスフェリンなど）、又はその他の細胞結合分子若しくは物質であってよい。

【0169】

使用できる他の細胞結合剤の例は；ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体；及びＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）₂及びＦｖなどの抗体のフラグメントを含む（Parham, J. Immunol. 131:2895 2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974);及びNisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230 244 (1960))。

【0170】

二次成分は細胞毒性薬であってもよい。本明細書で使用される用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能、又は増殖を低下又はブロックし、及び又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。それ故、細胞毒性剤は、タキソール、ＤＭ１又はＤＭ４などのメイタンシノイド、ＣＣ−１０６５又はＣＣ−１０６５アナログ、リシン、マイトマイシンＣなどであり得る。幾つかの実施態様では、本発明の複合体のいずれの結合剤と同様に、細胞毒性剤は直接又は切断可能若しくは切断不能リンカーを介して、関心ある抗体に共有結合する。

【0171】

好適なメイタンシノイドの例は、メイタンシノール及びメイタンシノール・アナログを含む。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、そして哺乳動物細胞に対して高毒性である。
好適なメイタンシノール・アナログの例は、修飾芳香環を有するもの及び他の位置に修飾を有するものを含む。当該好適メイタンシノイドは、米国特許第４４２４２１９号；同第４２５６７４６号；同第４２９４７５７号；同第４３０７０１６号；同第４３１３９４６号；同第４３１５９２９号；同第４３３１５９８号；同第４３６１６５０号；同第４３６２６６３号；同第４３６４８６６号；同第４４５０２５４号；同第４３２２３４８号；同第４３７１５３３号；同第６３３３４１０号；同第５４７５０９２号；同第５５８５４９９号；及び同第５８４６５４５号に開示されている。

【0172】

修飾芳香環を有する好適なメイタンシノール・アナログの例は：（１）Ｃ−１９脱塩素（米国特許第４２５６７４６号）（例えば、アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ）還元によって製造される）；（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−のＣ−１９脱塩素（米国特許第４３６１６５０号及び同第４３０７０１６号）（例えば、Streptomyces若しくはActinomycesを用いた脱メチル化又は水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）を用いた脱塩素化によって製造される）；及び（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−脱塩素（米国特許第４２９４７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって製造される）を含む。

【0173】

他の位置の修飾を有する好適なメイタンシノール・アナログの例は：（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（Ｈ₂Ｓ又はＰ₂Ｓ₅とメイタンシノールの反応によって製造される）；（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ₂ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ₂ＯＨ又はＣＨ₂ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）（Nocardiaから製造される）；（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４３６４８６６号）(Streptomycesによるメイタンシノールの変換によって製造される)；（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号）(Trewia nudifloraから単
離される)；（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４３６２６６３号及び同第４３２２３４８号） (Streptomycesによるメイタンシノールの脱メチル化によって製造される)；そして（７）４，５−デオキシ（米国特許第４３７１５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元よって製造される）を含む。

【0174】

細胞毒性複合体はインビトロ法で製造してもよい。細胞毒性剤、薬剤又はプロドラッグを抗体に結合させるためには、一般的に結合基が使用される。好適な結合基は当技術分野で公知であり、そしてジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安的基、ペプチダーゼ不安定基及びエステラーゼ不安定基を含む。例えば、複合体は、ジスルフィド交換反応を用いて、又は関心ある抗体及び薬剤又はプロドラッグ間でチオエーテル結合を形成させることにより構築することができる。

【0175】

上記のように、本発明は、本明細書に開示のように抗体又はその機能的変異体をコードする孤立核酸配列、本発明のＣＸＣＲ５結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物、当該ベクターを含む宿主細胞、及びポリペプチドの製造のための組み換え技術を提供する。

【0176】

ベクターは、通常当技術分野で公知の成分を含有し、そして一般的に以下の１つ又はそれ以上の：シグナル配列、複製の起源、１つ又はそれ以上のマーカー又は選択遺伝子、翻訳を促進及び／又は強化する配列、エンハンサー要素などを含むが、それらに限定されない。従って、発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子由来のものなど、当該の好適な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に操作可能に結合されたヌクレオチド配列を含む。更なる調節配列の例は、オペレーター、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び／又は開始及びその終結などの転写及ぶ翻訳を調節する他の適切な配列を含む。ヌクレオチド配列は、調節配列が機能的に適切なポリペプチドのヌクレオチド配列に関連している場合に、「操作可能に結合」される。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列がそのヌクレオチド配列の転写を調節する場合に、例えば、抗体重鎖配列に操作可能に結合される。

【0177】

加えて、天然には重鎖及び／又は軽鎖配列と結びつかない適切なシグナルペプチドをコードする配列は、発現ベクターに取り込むことができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のヌクレオチド配列は、抗体がペリプラズムスペース又は培地中に分泌されるように、ポリペプチド配列へ枠組み内で融合され得る。対象とする宿主細胞中で機能しているシグナルペプチドは、適切な抗体又はその一部分の細胞外分泌を増強させる。シグナルペプチドは、細胞からの抗体の分泌時にポリペプチドから切断し得る。当該分泌シグナルの例は周知であり、そして、例えば、米国特許第５６９８４３５号；同第５６９８４１７号；及び同第６２０４０２３号に記載されているものを含む。

【0178】

ベクターは、プラスミド、一本鎖又は二本鎖ウイルスベクター、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡファージベクター、ファージミド、コスミド又はその他の関心あるトランス遺伝子の担体であってもよい。当該ベクターは、ＲＮＡ及びＤＮＡを細胞内に導入する周知の技術によりポリヌクレオチドとして細胞中へ導入してよい。ファージ及びウイルスベクターの場合に、ベクターは、感染及び形質導入の周知の方法によりパッケージ又はカプセル化ウイルスとして細胞中へ導入してもよい。ウイルスベクターは複製受容性又は複製欠損性であってよい。後者の場合には、ウイルス増殖は、一般的に宿主細胞を補完し、そして粒子を産生するのに必要な種々のウイルス補体を担持する、複数のベクターを使用する場合にのみ起こり得る。無細胞翻訳系も、本ＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてタンパク質を産生するのに用いることができる（例えば、国際公開公報第８６／０５８０７号及び国際公開公報第８９／０１０３６号；及び米国特許第５１２２４６４号を参照されたい）。

【0179】

本発明の抗体は、いずれの好適な宿主細胞からも発現し得る。本発明において有用な宿主細胞の例は、原核細胞、酵母又は高等真核細胞を含み、そして関心ある抗体コード配列を含む、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌 (例えば、 E. coli、 B. subtilis、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、Serratia、及びShigella、並びにBacilli、Pseudomonas 及び Streptomyces) ；抗体コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母 (例えば、 Saccharomyces、Pichia、Actinomycetes、Kluyveromyces、Schizosaccharomyces、Candida、Trichoderma、Neurospora、及びNeurospora、Penicillium、Tolypocladium及び Aspergillusなどの糸状菌)；抗体コード配列を含む、組み換えウイルス発現ベクター(例えば、Baculovirus)に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；又はタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ)に感染した、又は組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノム由来又は哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；又はワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含む組み換え発現構築物を持っている哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３又は３Ｔ３細胞）などの微生物を含むが、しかしそれらに限定されない。

【0180】

原核宿主細胞で用いる発現ベクターは、一般的に１つ又はそれ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を賦与し、又は独立栄養要求を満たすタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞の有用な発現ベクターの例は、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、ｐＧＥＭ１(Promega Biotec, Madison, WI)、ｐＥＴ（Novagen, Madison, WI）及びｐＲＳＥＴ（Invitrogen, Carlsbad, CA） シリーズのベクター（Studier, J Mol Biol 219:37 (1991）;及び Schoepfer, Gene 124:83 (1993））など市販のプラスミド由来のものを含む。組み換え原核宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列は、Ｔ７(Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987))、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系 (Chang et al., Nature 275:615 (1978）;及び Goeddel et
al., Nature 281:544 (1979))、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et
al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980))、及びｔａｃプロモーター（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990))を含む。

【0181】

酵母ベクターは、２μの酵母プラスミドからなどの複製配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化の配列、転写終結及び選択可能マーカー遺伝子の配列の起源をしばしば含む。酵母ベクターの好適なプロモーター配列は、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)) 、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼなどの他の糖分解酵素（Holland et al., Biochem 17:4900 (1978))、に対するプロモーターを含む。酵母発現で用いられる他の好適なベクター及びプロモーターは、Fleer et al., Gene 107:285 (1991）に更に記載されている。酵母及び酵母形質転換プロトコールの他のプロモーター及びベクターは当技術分野で周知である。酵母形質転換プロトコールは周知である。１つの当該プロトコールは、Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978）によって記載されており、それは選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換細胞を選択する。

【0182】

脊椎動物であれ無脊椎動物であれ、いずれの真核細胞培養も実行可能である。無脊椎動
物細胞の例は、植物及び昆虫細胞（Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol. 8, pp. 277-9, Plenum Publishing (1986）;及びMaeda et al., Nature 315:592 (1985))を含む。例えば、バキュロウイルス系は、異種タンパク質の産生に使用し得る。昆虫系では、Autographa californica 核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するベクターとして使用し得る。ウイルスは、Spodoptera frugiperda 細胞中で増殖する。抗体コード配列は、ＡｃＮＰＶプロモーターの制御下にクローニングされ得る（例えば、ポリヘドリン遺伝子）。同定されている他の宿主は、Aedes, Drosophila melanogaster及びBombyx moriを含む。トランスフェクションのための多様なウイルス株は、公に入手可能な、例えば、ＡｃＮＰＶのＬ−１変異体及びBombyx mori NPVのBm-5株である。更に、ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養も、当技術分野で公知のように宿主として利用してもよい。

【0183】

培養(組織培養)での脊椎動物細胞、及び脊椎動物細胞の増殖は常法が可能であるが、例えば、固有因子、支持細胞などを含む特殊培地を必要とする選好性細胞系が存在する。「組織培養」（Tissue Culture）, Kruse et al., eds., Academic Press (1973)を参照されたい。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、サル腎臓；ヒト胚腎臓系；子ハムスター腎細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞；ヒト頚部癌細胞(例えば、HeLa)；イヌ腎細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝細胞；マウス乳腺腫瘍；及びＮＳ０細胞である。

【0184】

宿主細胞は、抗体産生のベクターで形質転換され、そして成長因子、ビタミン、ミネラルなど、並びに使用する細胞及びベクターに適切なインデューサーを含有する従来の栄養培地で培養される。一般的に使用されるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列は、哺乳動物宿主細胞中の構造遺伝子配列の発現用に、他の遺伝要素、例えば、ＳＶ４０起源、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を与えるために使用し得る。ウイルス初期及び後期プロモーターは、両方が複製のウイルス起源をも含む可能性のあるフラグメンとしてウイルスゲノムから容易に得られることから、特に有用である。哺乳動物宿主細胞で用いる典型的発現ベクターは市販されている。

【0185】

Ham's F10, Minimal Essential Medium (MEM)、RPMI-1640 及びDulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。加えて、Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979) 及びBarnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980)、及び米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４５６０６５５号；同第５１２２４６９号；同第５７１２１６３号又は同第６０４８７２８号に記載のいずれの培地も、宿主細胞の培養培地として使用してもよい。これらのいずれの培地も、必要に応じてホルモン及び／又は他の増殖因子（インシュリン、トランスフェリン又は表皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなどの塩化物など；及びリン酸塩）、緩衝液（HEPESなど)、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、及びグルコース又は等価エネルギー源を補足することができる。その他の必要な補助剤はいずれも設計選択として適当な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、当技術分野で公知のように、細胞に適切でそしてトランス遺伝子の所望の発現を可能にするものである。

【0186】

関心あるポリヌクレオチドは取得することができ、そしてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は当技術分野で公知のいずれかの方法によって決定し得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られている場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成
したオリゴヌクレオチド（例えばKutmeier et al., Bio/Techniques 17:242 (1994）に記載) から組み立てられ、そして次に、例えば、ＰＣＲにより連結オリゴヌクレオチドを増幅させてもよい。

【0187】

或いは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、それを発現する細胞の核酸から生成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは利用できないが、抗体分子の配列が公知の場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、本発明の抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞に特異的なものと考えられる、ライブラリーなどの好適な起源から得ることができる。好適なプライマーがＰＣＲ増幅のために設定される。ＰＣＲによって生成した増幅核酸が、次いで当技術分野で周知のいずれかの方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローン化し得る。

【0188】

抗体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は本明細書に記載の関心ある等価物を得るために、ヌクレオチド配列を操作する当技術分野で公知の方法、例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Sambrook et al.,「分子クローニング、実験室手引き、第２版」Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.）, Cold Spring Harbor Laboratory (1990);及びAusubel et al., eds.,「分子生物学の最近のプロトコール」（Current Protocols in Molecular Biology）, John Wiley & Sons (1998)）を用いて、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するため、例えば、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を作出するために操作することができる。

【0189】

重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列可変領域は、周知の方法により、例えば、配列超可変性の領域を決定するために他の重鎖及び軽鎖可変領域の公知のアミノ酸配列と比較することにより、ＣＤＲの配列を特定するために精査することができる。通常の組み換えＤＮＡ技術を用いて、１つ又はそれ以上のＣＤＲをフレームワーク領域内に、例えば、上記に記載のように非ヒト抗体をヒト化するためにヒトフレームワーク領域に挿入することができる。フレームワーク領域及び１つ又はそれ以上のＣＤＲの組み合わせによって生成される関心あるポリヌクレオチドは、ＣＸＣＲ５、又は少なくともそのＥＤドメインを特異的に結合する抗体をコードする。例えば、当該方法は、１つ又はそれ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ又はそれ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失をもたらすために使用することができる。

【0190】

本発明の抗体又は抗体フラグメントは、ＣＸＣＲ５、及びそれ故インビトロ又はインビボで、生体試料中でＣＸＣＲ５を発現する細胞を検出するために使用し得る。１つの実施態様では、本発明の抗ＣＸＣＲ５抗体は、組織又は組織由来の細胞におけるＣＸＣＲ５の存在及びレベルを測定するために使用される。組織又は生検におけるＣＸＣＲ５のレベルは、例えば、本発明の抗体又は抗体フラグメントを用いたイムノアッセイで測定することができる。組織又はその生検は凍結又は固定化し得る。同様の又は他の方法は、ＣＸＣＲ５の他の特性、例えば、そのレベル、細胞局在、ｍＲＮＡレベル、その変異などを測定するために使用できる。

【0191】

上記方法は、例えば、がんであるか又はがんが疑われる対象者において、当該患者で測定したＣＸＣＲ５レベルが正常参照対象者又は標準と比較して、癌を診断するために使用できる。関心ある分析は、分化したリンパ系組織の発生と合わせて、Ｂ細胞浸潤及び濃度によって特徴付けられる関節炎又は自己免疫疾患を診断するために使用することができる。

【0192】

本発明は、研究又は診断応用に用いられる更に標識されたモノクローナル抗体、ヒト化
抗体及びそのエピトープ結合フラグメントを更に提供する。幾つかの実施態様では、標識は、放射性標識、蛍光体、発色団、造影剤又は金属イオンである。
当該標識抗体又はそのエピトープ結合フラグメントが、癌、関節炎、自己免疫疾患又は他のＣＸＣＲ５疾患を有することが疑われる対象者に投与される、診断の方法も提供され、そして対象者の体内の標識の分布が測定され又はモニタリングされる。

【0193】

本発明の抗体及びそのフラグメントは、親和性精製剤として使用してもよい。その工程では、抗体は、当技術分野で公知の方法を用いてデキストラン又はアガロース樹脂又は濾紙などの固相に固定化される。固定化抗体は、ＣＸＣＲ５を含有するサンプル又は精製すべき同じものを担持する細胞と接触され、そしてその後支持体は、関心ある固定化抗体に結合している精製すべきＣＸＣＲ５又は細胞を除くサンプル中のすべての物質を実質的に除去する好適な溶媒で洗浄される。最後に、支持体は、ＣＸＣＲ５又は細胞を関心ある抗体から遊離するグリシン緩衝液、ｐＨ５．０などの別の好適な溶媒で洗浄される。

【0194】

診断的適用では、関心ある抗体は、一般的に検出可能な部分で標識し得る。一般的に以下のカテゴリーに分類することができる多数の標識が利用可能である：（ａ）、³⁶Ｓ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、³Ｈ及び¹³¹Ｉなどのラジオアイソトープ（抗体は、例えば、「免疫学における最新のプロトコール」（Current Protocols in Immunology, vol. 12）, Coligen et al., ed., Wiley-Interscience, New York (1991）に記載の技術を用いてラジオアイソトープで標識され、そして放射能はシンチレーション計数を用いて測定し得る）；（ｂ）希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン及びテキサスレッドなどの蛍光標識、蛍光標識は、上記の「免疫学における最新のプロトコール」（Current Protocols in
Immunology）に開示の技術を用いて抗体に結合することができ、例えばそこでは蛍光は蛍光光度計を用いて定量化できる；（ｃ）種々の酵素基質標識が利用可能であり（米国特許第４２７５１４９号が概説を提示している）、酵素は、一般的に種々の技術を用いて測定し得る発色基質の化学変化を触媒し、例えば酵素は、分光光度法で測定し得る基質中の色変化を触媒することができ、又は酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させることができる。例えば、照度計を用いて蛍光の変化を定量化する技術は公知であり、又は標識は蛍光アクセプターにエネルギー供与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。抗体への酵素結合技術は、O'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981）に記載されている。

【0195】

このような標識が使用される場合、以下の様な好適な基質、例えば：（ｉ）セイヨウワサビペルオキシダーゼには基質としての水素ペルオキシダーゼ、ここで、水素ペルオキシダーゼは色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）には発色基質としてのｐ−ニトロフェニルホスフェート；及び（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）には発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの蛍光基質が利用できる。

【0196】

他の酵素−基質の組み合わせが当業者に利用可能である。一般概説としては、米国特許
第４２７５１４９号及び同第４３１８９８０号を参照されたい。

【0197】

時として、標識は間接的に抗体と結合される。例えば、抗体はビオチンと結合でき、そして上記のいずれのレポーターもアビジンと結合でき、又は逆もまた同様である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、そしてそれ故標識は間接的に抗体と結合できる。或いは、標識の間接的結合を達成するために、抗体は小型ハプテン(例えば、ジゴキシン)と結合され、そして上述の異なるタイプの標識又はレポーターの１つは抗ジゴキシン抗体と結合される。従って、標識の抗体又は突然変異タンパク質との間接結合は、二次抗体を用いて達成することができる。

【0198】

本発明の別の実施態様では、抗体は標識される必要はなく、そしてその存在はその抗体、別な形態の二次抗体に結合する標識化抗体を用いて検出し得る。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどいずれの公知のアッセイ方法において用いることができる。Zola, 「モノクローナル抗体：技術の手引き」（Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques） (CRC Press, Inc. 1987)。

【0199】

競合結合分析は、限定量の抗体と結合するために試験サンプルと競合する標識化標準の能力に依存する。試験サンプル中の抗原の量は、抗体に結合することになる標準の量に反比例する。結合することになる標準の量の測定を容易にするために、抗体は一般的に競合の前又は後に不溶化される。結果として、抗体に結合される標準及び試験サンプルは、結合しないで残る標準及び試験サンプルから分離することができ、好都合である。

【0200】

サンドイッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々は検出すべき標的の異なる免疫原部分、決定因子又はエピトープに結合できる。サンドイッチアッセイでは、分析しようとする試験サンプルは、固体支持体に直接的又は間接的に固定化される一次抗体により結合され、そしてその後直接的又は間接的に標識化された二次抗体が結合した試験サンプルに結合し、その結果不溶性の３部分複合体を形成する（例えば、米国特許第４３７６１１０号を参照されたい）。二次抗体は、それ自体検出可能な部分で標識化し（直接サンドイッチアッセイ）、又は抗免疫グロブリン抗体若しくは検出可能な部分で標識化される（間接サンドイッチアッセイ）他の好適な結合対のメンバー（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、酵素／基質）を用いて測定してもよい。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイで、その場合に検出可能部分は酵素である。
免疫組織化学のためには、細胞又は組織サンプルは新しいか若しくは凍結され、又はパラフィン包埋されてもよく、そして、例えば、ホルマリンなどの防腐剤で固定し得る。

【0201】

抗体は、またインビボ診断アッセイのために使用してもよい。一般的に、抗体変異体は、ＣＸＣＲ５を発現する部位が免疫シンチグラフィーを用いて局在化されるように放射性ヌクレオチド(¹¹¹Ｉｎ、⁹⁹Ｔｃ、¹⁴Ｃ、¹³¹Ｉ、³Ｈ、³²Ｐ又は³⁵Ｓ)で標識化される。

【0202】

本発明は、また、例えば抗体、そのフラグメント、ホモログ、その誘導体など、例えば標識化又は細胞毒性複合体、及び特定の細胞型を殺細胞するための抗体、複合体の使用説明書などを含むキットをも包含する。説明書は、抗体、複合体などをインビトロ、インビボ又はエキソビボで使用するための指示書を含んでいてもよい。抗体は液体形態にあっても、又は一般的には凍結乾燥した固体としてあってもよい。キットは、使用目的に合わせて、緩衝液、再構成溶液及び他の必要成分などの適切な他の試薬を含み得る。又は診断アッセイを行うための治療上の使用のためなど、その使用のための説明書と所定量での試薬との包装組み合わせが考えられる。酵素などによって抗体を標識化する場合、キットは酵素によって必要とされる基質及びコファクター（例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を与える基質前駆体）を含むことができる。加えて、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩
衝液又は溶解緩衝液）などの他の添加剤が含まれてもよい。種々の試薬の相対量は、使用者自由度、スペースの節約、試薬節約などをもたらす試薬溶液の濃縮物で提供するために変動し得る。試薬は、賦形剤を含む通常は凍結され、乾燥粉末として供給されるが、これは溶解に際して適切な濃度を有する試薬溶液を与える。

【0203】

本発明の抗体は哺乳動物を処置するのに使用し得る。１つの実施態様では、関心ある抗体又はその等価物は、例えば、前臨床データを取得する目的で非ヒト哺乳動物に投与される。処置される典型的な非ヒト哺乳動物は、前臨床研究が行なわれる非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類及び他の哺乳動物を含む。このような哺乳動物により、抗体で治療すべき疾患の動物モデルを樹立することができ、又は関心ある抗体の毒性を研究するために使用し得る。それぞれのそれら実施態様では、投与量増加検討は哺乳動物で行なわれ得る。

【0204】

抗体に結合した治療用部分などの二次成分を有する又は有しない抗体は、単独で又は細胞毒性因子との組み合わせで投与される治療薬として使用できる。本発明は、ＣＸＣＲ５仲介疾患、障害又は病態を治療するために、本発明の抗体を動物、哺乳動物、又はヒトに投与することを含む、抗体に基づく治療に関する。動物又は対象者は、特定の障害、例えばＣＸＣＲ５に関連する障害と診断されている哺乳動物など、特定の治療を必要としている哺乳動物であってよい。ＣＸＣＲ５に対する抗体は、例えば、関節炎、一般的には炎症性疾患、移植拒絶、がん及び自己免疫疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明の抗ＣＸＣＲ５抗体、又は複数の本抗体若しくはその等価物のカクテル、又は種々の起源の他の抗体との組み合わせで治療的許容量を投与することにより、疾患徴候は治療した哺乳動物、特にヒトにおいて軽減又は予防され得る。

【0205】

本発明の治療用化合物は、本発明の抗体（本明細書に記載のフラグメント、アナログ、等価物及びその誘導体）及び本明細書に記載の本発明の抗体をコードする核酸（本明細書に記載のフラグメント、アナログ及びその誘導体）、及び本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体は、本明細書に記載の疾患、障害、又は病態のいずれか１つ又はそれ以上を含む、ＣＸＣＲ５の異常発現及び／又は活性に関連する疾患、障害又は病態を治療、抑制又は予防するために使用することができるが、これらに限定されない。ＣＸＣＲ５の異常発現及び／又は活性に関連する疾患、障害又は病態の治療及び／又は予防は、それらの疾患、障害又は病態に関連する少なくとも１つの症状を緩和することを含むが、これに限定されない。本発明の抗体は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の薬学的に許容される組成物で与えられてもよい。「生理学的許容性」、「薬学的許容性」などの用語は、連邦又は州政府の規制当局により認可されていること、又は動物及び特にヒトに使用するための米国薬局方又は他の一般承認薬局方に記載されていることを意味する。

【0206】

抗ＣＸＣＲ５抗体は、任意の許容される様式で哺乳動物に投与することができる。導入の方法は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、硬膜外、吸入及び経口経路を含むが、これらに限定されず、そして免疫抑制療法で必要ならば病巣内投与を含む。非経口注入は、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内又は腹腔内投与を含む。抗体又は組成物は、任意の都合のよい経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜内面（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通した吸収により投与してもよく、そして他の生物活性剤と併せて投与してもよい。投与は全身的又は局所的であり得る。加えて、本発明の治療抗体又は組成物は、脳室内及び硬膜下腔内の注射を含む任意の好適な経路により中枢神経系内に導入することが望ましい場合があり；脳室内注射は、例えば、Ommayaリザーバなどのリザーバに取り付けた脳室内カテーテルにより容易にし得る。加えて、抗体はパルス注入により、特に抗体の投与量を漸減させて好適に投与し得る。好ましくは、投薬は注射、特に静脈内又は皮下注射により行なわれるが、一部は投与が短期か又は長期かによって決まる。

【0207】

種々の他のデリバリーシステムが公知であり、そして例えばリポソームへのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル（Langer, Science 249:1527 (1990); Treat et al., 「感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム」（Liposomes in the Therapy of Infectious
Disease and Cancer）; Lopez Berestein et al., eds., p. 353-365 (1989); 及びLopez-Berestein, ibid., p. 317-327を参照されたい）、及び化合物を発現することができる組み換え細胞；受容体仲介エンドサイトーシス（例えば、Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)を参照されたい）；レトロウイルス又は他のベクターなどの一部として核酸の構築を含み、本発明の抗体を投与するのに使用できる。

【0208】

活性成分は、また、例えばコアセルベーション技法、又は界面重合により調製されたミクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−ミクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）ミクロカプセル（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)中に、コロイド状ドラッグ・デリバリー・システムで、又はマクロエマルジョンで取り込まれる（entrapped）。その様な技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980) に開示されている。

【0209】

肺内投与は、また、例えば吸入器又は噴霧器の使用により、及びエアゾール化剤を用いた製剤により用いることができる。抗体は、また、患者の肺内へ、ドライパウダー組成物の形態で投与してもよい（米国特許第６５１４４９６号を参照）。

【0210】

特定の実施態様において、本発明の治療抗体又は組成物を、処置を必要とする局所領域へ投与することは望ましい場合があり；例えば、限定するものではないが、注射により、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、又はインプラントを用いての局所注入、局所投与により実施でき、ここで、該インプラントは、シラスティック（silastic）膜などの膜、又は繊維を含む多孔性、非多孔性又はゼラチン状の物質である。好ましくは、本発明の抗体を投与する場合、タンパク質が吸収又は吸着しない物質を使用するよう注意を払うことである。

【0211】

また、別の実施態様において、抗体は、制御された放出システムで送達可能である。一実施態様においては、ポンプを用いることができる（Langer, Science 249:1527 (1990);
Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); 及びSaudek et al., N Engl J Med 321:574 (1989)を参照）。別の実施態様においては、高分子物質を用いることができる(「制御放出の医学的応用」（Medical Applications of Controlled Release), Langer et al., eds., CRC Press (1974); 「制御されたバイオアベイラビリティー、薬物製品設計及び性能」(Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance), Smolen et al., eds., Wiley (1984); Ranger et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983)を参照、また、Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann Neurol 25:351 (1989); 及び Howard
et al., J Neurosurg 71:105 (1989)も参照)。更に別の実施態様において、制御放出システムは、治療標的の近傍に置くことが可能である。

【0212】

ポリペプチド又は抗体の治療製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、当該分野で典型的に用いられる任意選択の「薬学的に許容される」担体、希釈剤、賦形剤又は安定剤、即ち緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、ノニオン性界面活性剤、酸化防止剤、及びその他の多岐に亘る添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水性液剤として保存用に調製してもよい（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed. (1980)を参照）。その様な添加剤は、一般的には、使用される投与量及び濃度では、その受容者に対しては非毒性であり、それ故、賦形剤、希釈剤、担体などは薬学的に許容される。

【0213】

「単離された」又は「精製された」抗体は、細胞物質又は細胞若しくは組織源又はタンパク質が誘導される培地からの汚染するその他のタンパク質を実質的に含まず、又は化学合成される場合、化学前駆体若しくはその他の化学物質も実質的に含まない。語句「実質的に細胞物質を含まない」とは、ポリペプチド／タンパク質が単離される又は組み換え技術によって生産される細胞の細胞成分から、ポリペプチド／タンパク質が分離される抗体の製剤を含む。従って、実質的に細胞物質を含まない抗体は、汚染タンパク質の含量が、３０％、２０％、１０％、５％、２.５％又は１％（質量％）未満である抗体の製剤である。抗体が組み換え技術で生産される場合、実質的に培地を含まないのが好ましく、即ち、培地は、タンパク質製剤の体積の約２０％、１０％、５％、２.５％又は１％未満を表す。抗体が化学合成で製造される場合、それには実質的に化学的前駆体、又はその他の化学物質及び試薬を含まないのが好ましく、即ち関心ある抗体は、タンパク質の合成に関与した化学前駆体又はその他の化学物質から分離される。従って、そのような抗体の製剤は、約３０％、２０％、１０％、５％又は１％（乾燥質量％）未満の化学前駆体又は関心ある抗体以外の化合物を有する。本発明の好ましい実施態様においては、抗体は単離され、又は精製される。

【0214】

本明細書で用いられる、語句「検出できないほど低いレベルの凝集」とは、例えば、サイズ排除高速クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）で測定して、タンパク質の質量で、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、そしてしばしば０.５％以下の凝集を含むサンプルを意味する。

【0215】

本明細書で用いられる、用語「検出できないほど低いレベルの断片化」とは、例えば、ＨＰＳＥＣにより測定して、単一ピークで、又は例えば還元キャピラリーゲル電気泳動法（ｒＣＧＥ）で測定して、２ピーク（重鎖及び軽鎖）で、総タンパク質の８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上を含み、総タンパク質のそれぞれ５％を超える、４％を超える、３％を超える、２％を超える、１％を超える又は０.５％を超える量を有するその他の単一ピークを含まないサンプルを意味する。本明細書で用いられるｒＣＧＥは、抗体又は抗体型又はそれから誘導される分子中におけるジスルフィド結合を還元するのに十分な還元条件下での、キャピラリーゲル電気泳動法を意味する。

【0216】

ＣＸＣＲ５抗体又はその結合断片を含む液体製剤との関連で、本明細書で用いられる用語「安定性」及び「安定な」は、所定の製造、調製、移送及び保存条件下での、熱的及び化学的アンフォールディング、凝集、分解又は断片化に対する、製剤における抗体又はその抗原結合フラグメントの抵抗性を意味する。本発明の「安定な」製剤は、所定の製造、調製、移送及び保存条件下で、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は９９.５％以上の生物学的活性を保持する。前記抗体製剤の安定性は、ｒＣＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドのゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びＨＰＳＥＣを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の方法によって、凝集、分解又は断片化の程度で、標準サンプルと比較して評価することができる。

【0217】

用語「担体」は、治療薬が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを意味する。その様な生理学的担体は、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成起源を含む、水及びオイルなどの滅菌液体であり得る。水は、薬剤組成物が静脈内に投与される場合、好適な担体である。生理食塩水の液剤、及びデキストローズ及びグリセリン水性液剤は、また、液状担体、特に注射可能な液剤として使用できる。好適な薬学的賦形剤としては、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じて、組成物は、また、マイナーな
量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤を含んでもよい。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤、デポー剤などの形態をとることができる。組成物は、坐剤として、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて製剤化することができる。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬グレードの標準的な担体を含む。好適な担体の例としては、“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Martinに記載されている。その様な組成物は、有効量の抗体を、好ましくは精製形態で、患者に適切な投与形態を提供するために、好適な量の担体と一緒に含む。当技術分野で公知の通り、製剤はその投与様式に適するよう構築される。

【0218】

緩衝剤は、生理学的条件に近似する領域にｐＨを維持することに役立つ。緩衝剤は、好ましくは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明で使用するのに好適な緩衝剤としては、クエン酸緩衝剤（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウムの混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）及び酢酸緩衝剤（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）の様な有機及び無機酸、及びその塩が挙げられる。リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなどのトリメチルアミン塩及びその他の公知の緩衝剤を用いることができる。

【0219】

保存剤は微生物の増殖を抑制するために加えることができ、そして０.２〜１％（質量／体積）の範囲内の量を加えることができる。本発明において使用するための好適な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウム（benzyaconium）ハライド（例えば、クロリド、ブロミド、ヨージド）、メキサメトニウムクロリド、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。

【0220】

等張化剤は、本発明の液体組成物の生理学的等張性を確保するために存在し、そして多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの三価又はそれ以上の糖アルコールを含む。多価アルコールは、その他の成分の相対量を考慮して、約０.１〜約２５質量％、好ましくは１〜５質量％存在してもよい。

【0221】

安定剤は、増量剤から、治療剤を可溶化し、又は変性若しくは容器壁への接着を防ぐために役立つ添加剤に到る、機能範囲となり得る、広いカテゴリーの賦形剤を意味する。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、アラビトール、エリトリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ｍｙｏ−イノシトール（myoinisitol）、ガラクチトール、グリセリンなどで
、イノシトールなどのシクリトールを含む有機糖類又は糖アルコール類；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセリン、α−モノチオグリコール及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（即ち、＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；糖類：キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖類；ラクトース、マルトース及びスクロースなどの二糖類；ラフィノースなどの三糖類；デキストランなどの多糖類などが挙げられる。安定剤は、０.１〜１０,０００（活性タンパク質の部分当りの質量比）の範囲内で存在する。

【0222】

追加の種々の賦形剤としては、増量剤（例えば、澱粉）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン又はビタミンＥ）及び共溶媒（cosolvents）が挙げられる。

【0223】

本明細書における製剤は、また、処置されている特定の適応症用として、必要に応じて、１種より多い活性化合物、好ましくは、互いに逆影響を与えない補完的活性を有する物質を含んでもよい。例えば、免疫抑制剤を更に提供することは望ましい。その様な分子は、意図した目的に対して有効な量の組合せで、好適に存在する。

【0224】

本明細書で用いられる用語「界面活性剤」は、両親媒性構造を有する有機物質、即ち、相反する溶解性の傾向を有する複数の基、典型的には、油溶性炭化水素鎖及び水溶性のイオン性の基により構成される。界面活性剤は、表面活性部分の電荷に依存して、アニオン性、カチオン性、及びノニオン性界面活性剤に分類される。界面活性剤は、しばしば、種々の薬剤組成物及び生物学的物質の製剤のための、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤及び分散剤として用いられる。

【0225】

ノニオン性界面活性剤又は洗浄剤（また、「湿潤剤」としても知られている）は、治療剤の可溶化を促進するため、及び撹拌誘導による凝集に対して治療タンパク質を保護するために加えてもよく、それは、また、タンパク質を変性させずに、製剤をせん断表面応力下に暴露することを可能とする。好適なノニオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニック（登録商標）ポリオール、及びポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）、ＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）など）が挙げられる。ノニオン性界面活性剤は、約０.０５〜約１.０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０.０７〜約０.２ｍｇ／ｍｌの範囲内に存在してもよい。

【0226】

本明細書で用いられる用語「無機塩」は、炭素を含まず、酸性水素又は酸の一部又は全部を、金属又は金属の様に機能する基により置換した任意の化合物を意味し、そして、しばしば、薬剤組成物及び生物学的物質の製剤中における張度調整化合物として用いられる。最も一般的な無機塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ₂ＰＯ₄などがある。

【0227】

本発明は、約５.０〜約７.０、又は約５.５〜約６.５、又は約５.８〜約６.２、又は約６.０のｐＨを有する抗ＣＸＣＲ５結合化合物、又はそのフラグメントの液体製剤を提供する。

【0228】

本発明は、医師のオフィス、又は実験室内で見られる、市販の冷蔵庫及び冷凍庫内での温度、例えば約−２０℃〜約５℃の温度で安定な液体製剤を包含し、ここで、該安定性は、例えば、サイズ排除高速クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により、約６０日間、約１２０日間、約１８０日間、約１年間、約２年間又はそれ以上の期間の保存目的のため評価される。本発明の液体製剤は、また、例えばＨＳＰＥＣによって評価して、室温で、使用
前、１時間、２時間又は約３時間など少なくとも数時間安定性を示す。

【0229】

用語「小分子」及びその類似用語は、ペプチド、ペプチド擬似体、アミノ酸、アミノ酸ホモログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドホモログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、分子量が１０,０００ｇ／モル以下である有機又は無機化合物（即ち、ヘテロ有機化合物及び／又は有機金属（ganometallic）化合物を含む）、分子量が５,０００ｇ／モル以下である有機又は無機化合物、分子量が１,０００ｇ／モルである有機又は無機化合物、分子量が５００ｇ／モル以下である有機又は無機化合物、及びそれらの化合物の塩、エステル及び薬学的に許容される形態が挙げられるが、それらに限定されない。

【0230】

従って、がんの症例では、例えば本発明の抗体は、単独で、又は従来の化学療法剤（パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン及びドキソルビシン）、抗ＥＧＦＲ薬（ゲフィチニブ、エルロチニブ及びセツキシマブ）、抗血管新生薬（ベバシズマブ及びスニチニブ）、並びにインターフェロンα及びサリドマイドなどの免疫調節薬を含む、他のタイプのがん治療剤との組み合わせで投与し得る。

【0231】

別の実施態様では、関節リウマチ（ＲＡ）などリウマチ性疾患の症例では、関心あるＣＸＣＲ５結合分子を含む組み合わせ療法が使用できる。例えば、ヒト化ＣＸＣＲ５抗体は、例えばメトトレキセート、及びレフルノミド（Mader & Keystone, J Rheum 34 Supp(16-24) 2007, Gaffo et al., Am J Health Syst Pharm 63:2451-2465, 2006)などのピリジン合成阻害剤を含む、疾患修飾性抗リウマチ薬などの小分子と共に投与することができるが、それに限定されない。

【0232】

関心ある種々の形態のＣＸＣＲ５結合分子は、非Ｂ細胞減少性であり得ることから、本分子は、相加的又は相乗的エンドポイントをもたらす重複作用メカニズムを有する他の薬剤と組み合わせることができる。従って、例えば、第２薬物は、Ｔ細胞軸などにおいてサイトカインのレベルで作用するものであってよい。

【0233】

本明細書で使用される用語の「一つの治療薬」及び「複数の治療薬」は、異常ＣＸＣＲ５及び／又はＣＸＣＬ１３代謝及び活性に関連する疾患、障害、疾病などの治療、管理又は軽減に使用し得る任意の薬剤を指す。それらは異常Ｂ細胞レベル又はＢ細胞活性で現われることがあり得る。同様に異常ＣＸＣＲ５及び／又はＣＸＣＬ１３代謝及び活性に関連する障害などの治療において、薬理効果を有する公知化合物も含まれる。

【0234】

加えて、本発明の抗体は、異種ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチド又は毒素などの種々のエフェクター分子に結合することができ、例えば、国際公開第９２／０８４９５号；国際公開第９１／１４４３８号；国際公開第８９／１２６２４号；米国特許第５３１４９９５号；及び欧州特許出願公開第３９６３８７号を参照されたい。抗体又はそのフラグメントは、細胞毒素（例えば、静菌又は殺細胞薬）などの治療部分、治療薬又は放射活性金属イオン（例えば、²¹³Ｂｉなどの、例えばαエミッター）に結合し得る。細胞毒素又は細胞毒性薬は、細胞にとって有害な任意の薬剤を含む。その例として、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（anthracindione）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール並びにプロマイシン及びそのアナログ又はホモログが含まれる。治療薬としては、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル及びダカルバジン）、アルキル化薬（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シク
ロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン)、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ダウノマイシン及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗マイトジェン薬（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。

【0235】

このような治療薬部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Arnon et al., 「モノクローナル抗体及びがん治療」（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56, Alan R. Liss (1985); Hellstrom et al., 「制御ドラッグデリバリー」（Controlled Drug Delivery）, 2nd ed., Robinson et al., eds., p. 623-53, Marcel Dekker (1987); Thorpe, 「モノクローナル抗体'84: 生物学的及び臨床応用」（Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications）, Pinchera et al., eds., p. 475-506 (1985); 「がんの検出及び治療のためのモノクローナル抗体」（Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy）, Baldwin et al., eds., p. 303-16, Academic Press (1985);及びThorpe, et al., Immunol Rev 62:119 (1982）を参照されたい。或いは、抗体は、二機能性抗体などの抗体ヘテロ接合体を形成させるために二次抗体に結合することができ、例えば米国特許第４６７６９８０号を参照されたい。

【0236】

本発明の複合体は、所定の生物学的反応を修飾するために使用することができ、その治療薬又は薬物部分は古典的な化学治療薬に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってよい。このようなタンパク質としては、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、アポトーシス剤、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭＩ（国際公開第９７／３３８９９号）、ＡＩＭＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号）、Ｆａｓリガンド(Takahashi et al.,
Int Immunol, 6:1567 (1994))、ＶＥＧＦ（国際公開第９９／２３１０５号）；血栓薬；抗血管新生薬、例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン；又は、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）又は他の増殖因子などの生物学的応答調節薬を含むことができる。

【0237】

インビボ投与で使用される製剤は滅菌しなければならない。それは、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により達成できる。例えば、本発明の液剤は、０.２μｍ又は０.２２μｍフィルターを用いて、濾過により滅菌し得る。

【0238】

徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは成形品の形態、例えばフィルム又はマトリックスである。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体で構成される注射用マイクロスフェアなど）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸などの重合体は１００日を超えて分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、短時間でタンパク質を放出する。合理的な方策が、関与メカニズムに応じて安定化のために考案し得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換を通して分子間Ｓ
−Ｓ結合形成であることが発見されれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水率を調節し、適切な添加剤を使用し、アミノ酸置換及び特異的重合体マトリックス組成物を開発することにより達成し得る。

【0239】

抗体又はその変異体の組成物は、良質の医療のための原則（good medical practice）と整合性を保つ形で製剤化され、投薬されそして投与され得る。これに関連した検討の要因としては、治療されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床病態、障害の原因、薬剤のデリバリー部位、投与方法、投与計画、及び医師に公知の他の要因が含まれる。投与すべき抗体又は変異体の「治療的有効量」は、このような考察によって決定され、そしてＣＸＣＲ５疾患、病態又は障害を予防し、軽減し又は治療するために必要な最小量であり得る。

【0240】

抗体、又はその変異体は、場合により問題の障害を予防又は治療するために、現在使用されている１つ又はそれ以上の薬剤で製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療のタイプ及び上述の他の要因によって決まる。これらは一般的に、前項で使用した同じ投与量及び投与経路で、又は前項で用いた投与量の約１から９９％で使用される。

【0241】

本明細書に記載の用語「有効量」は、ＣＸＣＲ５疾患の重症度及び／又は期間を低減し、その１つ又はそれ以上の症状を軽減し、ＣＸＣＲ５疾患の進行を抑制し若しくはＣＸＣＲ５疾患の退行をもたらすのに十分な、又はＣＸＣＲ５疾患若しくはその１つ又はそれ以上の症状の発生、再発、発症、又は進行の抑制をもたらし、又はＣＸＣＲ５疾患の治療に有用な別の治療法（例えば、別の治療薬）の予防的及び／又は治療的効果を増強し若しくは改善するのに十分な治療量を意味する。例えば、関心ある治療法は、ベースライン又は正常レベルに基づくＢ細胞レベルの上昇を、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％だけ低減し得る。別の実施態様では、有効量の治療薬又は予防薬は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％だけ関節炎又は移植拒絶などのＣＸＣＲ５疾患の症状を低減する。同様に用語「治療的有効量」も、本明細書では同等の意味で使用される。

【0242】

特定の疾患又は病態に対する使用又は治療において有効と考えられる治療用ポリペプチド、抗体又はそのフラグメントの量は、疾患又は病態の性質に依存し、そして標準的な臨床的技術によって決定し得る。可能であれば、本発明の用量反応曲線及び薬剤組成物は、先ずインビトロで誘導され得る。好適な動物モデル系が利用可能であるならば、この場合も用量反応曲線が得られ、そして当技術分野で公知の好適なヒト投薬実施方法を外挿するために使用することができる。しかしながら、当技術分野の一般的な知識に基づき、炎症作用の低減を促進するのに有効な薬剤組成物は、例えば、約５〜２０ｎｇ／ｍｌ、そして好ましくは約１０〜２０ｎｇ／ｍｌの局所治療薬濃度を与えることができる。本発明の更なる特定の実施態様では、Ｂ細胞依存性自己免疫症状又は移植拒絶に関与する細胞の増殖又は生存を軽減するのに有効な薬剤組成物は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの局所治療薬濃度を与えることができる。

【0243】

好ましい実施態様では、治療用ポリペプチド、抗体又はそのフラグメントの水性液剤は、皮下注射により投与し得る。各用量は約０．５ｍｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重、又はより好ましくは約３ｍｇから約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってよい。投与量は、特定の疾患、患者集団、投与様式など、当技術分野で公知の製薬学的方法を行って、経験的に確認し得る。

【0244】

皮下投与の投与スケジュールは、疾患のタイプ、疾患重症度及び治療薬に対する対象者（subject）の感受性を含み、多くの臨床学的因子に依存して、週１回から連日まで変動してもよい。

【0245】

本発明は、抗体又はそのＣＸＣＲ５結合フラグメントの液剤を調製する方法を提供し、該方法は、例えば適切な分子量（ｍｗ）カットオフ（例えば、そのＦ（ａｂ′）₂フラグメントでは３０Ｋ_Dカットオフ、及びＦａｂフラグメントでは１０Ｋ_Dカットオフ）の半透膜を用いて、そして場合により、同じ膜を用いて濃縮抗体分画を製剤緩衝液中に透析濾過して、約１５ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで精製抗体の分画を濃縮することを含む。

【0246】

加えて、本発明は、インビボにおいて半減期を向上した関心ある生産物のＫ_D安定性などの安定な液体製剤をも包含する。このように、関心ある抗体は、対象（subject）、好ましくはヒトにおいて、３日より大きい、７日より大きい、１０日より大きい、１５日より大きい、２５日より大きい、３０日より大きい、３５日より大きい、４０日より大きい、４５日より大きい、２か月より大きい、３か月より大きい、４か月より大きい、５か月より大きい半減期を有する。

【0247】

インビボでの抗体の血清循環を延長させるために、種々の技術が使用し得る。例えば、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの不活性高分子は、多機能性リンカーの存在又は不存在下に、抗体のＮ−末端若しくはＣ−末端へＰＥＧの部位特異的結合を通して、又はリジン残基に存在するεアミノ基を経由して抗体に結合し得る。生物学的活性の最小ロスにつながる直鎖状又は分枝鎖状重合体誘導体化が使用できる。結合の程度は、抗体に対するＰＥＧ分子の適切な結合を確保するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により厳密にモニターし得る。未反応ＰＥＧは、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧ複合体から分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法、例えば、本明細書に記載の免疫アッセイにより、結合活性及びインビボ有効性を試験することができる。

【0248】

インビボで向上した半減期を有する抗体も、１つ又はそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入又は欠失）を導入することにより、ＩｇＧ定常ドメイン、又はそのＦｃＲ結合フラグメント（Ｆｃ又はヒンジＦｃドメインフラグメントなど）中に作成し得るが、例えば国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第９７／３４６３１号；及び米国特許第６２７７３７５号を参照されたい。

【0249】

更に抗体は、抗体をインビボでより安定にし、又はインビボでより長い半減期を持たせるためにアルブミンに結合させ得る。その技術は当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号；国際公開第９３／１５２００号；国際公開第０１／７７１３７号；及び欧州特許出願公開第４１３６２２号を参照されたい。抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾することもできる。

【0250】

１つの実施態様では、組成物は、人間に対する静脈内投与に適合した薬剤組成物として常法に従って製剤化される。一般的には、静脈内投与用組成物は、無菌等張水性緩衝液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤及び注射部位の疼痛を緩和するリドカイン、又は他の「カイン系」麻酔薬などの局所麻酔薬を含んでもよい。一般的には、成分は、例えば活性剤の量を示すアンプル又は小袋などの密封容器中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、単位投薬形態において別々に又は合わせて混合して供給される。組成物を注入によって投与する場合には、無菌の医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入瓶を用いて調剤し得る。組成物を注射によって投与する場合には、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが、成分を投与前に混合できるように、例えば、キットで供給し得る。

【0251】

本発明は、本発明の液剤が、関心ある生産物の量を示すアンプル又は薬袋（sachet）などの密閉容器に包装されているものを提供する。本発明の液剤は、抗体又は抗体フラグメントの量及び濃度を示す密封容器に入れてもよい。本発明の液剤は、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、又は３００ｍｇ／ｍｌのＣＸＣＲ５抗体を、例えば、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ又は２０ｍｌの量にして密封容器で供給し得る。

【0252】

上述の障害の治療に有用な物質を含む製品が提供される。その製品は容器及びラベルを含む。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ及び試験管を含む。容器はＣＸＣＲ５病態又は疾患の診断、予防又は治療に有効な組成物を入れることができ、そして無菌アクセスポイントを有してもよい（例えば、容器は静脈注射液バッグ又は皮下注射針により穿刺できる栓を有するバイアルであってもよい）。容器上の又はそれに付随したラベルは、組成物を選択の病態の処置に使用することを指示する。製品は、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含んでもよい。それは更に、緩衝液、賦形剤、フィルター、注射針、シリンジ及び使用説明書付きの添付文書を含む、市販及び使用者観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。

【0253】

本発明の別の側面では、抗体又はその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療により、ＣＸＣＲ５の異常発現及び／又は活性に伴う疾患又は障害を治療、抑制又は予防するために投与される。遺伝子治療は、関心ある発現した又は発現し得る核酸の対象者への投与により行なわれる治療法を指す。本発明の実施態様では、核酸は、治療効果を仲介する標的宿主細胞中の及びそれによるコード化タンパク質を産生する。実現可能な遺伝子治療の方法は、いずれも、本発明に従って使用し得る。

【0254】

遺伝子治療の方法の一般概説としては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488
(1993); Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991); Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573 (1993); Mulligan, Science 260:926 (1993); Morgan et al., Ann Rev Biochem 62:191 (1993);及びMay, TIBTECH 11:155 (1993)を参照されたい。

【0255】

１つの側面では、化合物は、抗体、又はその機能的結合フラグメントを含み、該核酸配列は、好適な宿主において抗体又はそのフラグメント又はキメラタンパク質又はその重鎖若しくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。具体的には、このような核酸配列は、抗体コード領域に機能可能に連結するプロモーターを有し、該プロモーターは誘導型又は構成型であって、そして場合により組織特異的であり、及び他の調節配列である。

【0256】

別の特定の実施態様では、抗体コード配列及びその他の任意の所望配列が、ゲノムの所
望の部位で相同組み換えを促進する領域によって隣接するように核酸分子が使用され、その結果抗体コード化核酸の染色体内発現をもたらす（Koller, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:8932 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435 (1989))。格別な実施態様では、発現抗体分子は一本鎖抗体である；或いは、核酸配列は抗体の重鎖及び軽鎖の両方、又はそのフラグメントをコードする配列を含む。組み込みのための別法は、特異的核酸配列、ジンクフィンガーなどを認識する特定の転写因子を用いることを含む。

【0257】

核酸の患者内への送達は、患者が核酸又は核酸運搬ベクターに直接曝露される場合の直接か、又は細胞がインビトロにおいて先ず核酸で形質転換され、次いで患者に移植される場合の間接かであり得る。

【0258】

１つの実施態様では、核酸配列はインビボで直接投与され、そしてコード化産物を産生するように発現する。それは当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として配列をコードする抗体を構築することにより、そしてベクターが細胞内になるようにそれを投与することにより、例えば欠損又は弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスベクター（米国特許第４９８０２８６号参照）を用いた感染により、裸のＤＮＡの直接注入により、マイクロパーティクルの衝撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）の使用により、親水性核酸を結合し、そして細胞と融合する能力を有する両親媒性化合物を含む合成組成物などの非ウイルスベクターを用いて（この場合、一般にはこのように膜と結合する疎水性部分を含み、脂質又は細胞表面受容体又はトランスフェクション剤、リポソームへのカプセル化、マイクロパーティクル、又はマイクロカプセルでコーティングする）、核に侵入することが知られているペプチドへの連結のベクターを投与することにより、受容体仲介エンドサイトーシス（例えば、 Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987）参照）（受容体を特異的に発現する標的細胞型に使用し得る）を受けるリガンドへの連結のベクターを投与することなどにより、達成し得る。別の実施態様では、リガンドがエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含む核酸−リガンド複合体を形成することができ、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする。更に別の実施態様では、核酸は、特異的受容体をターゲッティングすることにより、インビボで細胞特異的取り込み及び発現の標的にし得る（例えば、国際公開第９２／０６１８０号；国際公開第９２／２２６３５号；国際公開第９２／２０３１６号；国際公開第９３／１４１８８号及び国際公開第９３／２０２２１号を参照されたい）。

【0259】

ベクターに関しては、例えば、レンチウルスベクターが当技術分野で公知のように使用し得る。レンチウルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組み込みのための成分を含有する。遺伝子治療に使用する抗体をコードする核酸配列は、患者への遺伝子送達を容易にする１つ又はそれ以上のベクターにクローニングされる。例えば、レンチウルスベクターは、造血幹細胞へトランス遺伝子を送達するのに使用し得る。遺伝子治療におけるレトロウルスベクターの使用を説明する参考文献は：Clowes et al., J Clin Invest 93:644 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467 (1994); Salmons et al., Human Gene Therapy 4:129 (1993);及びGrossman et al., Curr Opin Gen and Dev 3:110 (1993）である。

【0260】

アデノウイルスも、本発明において使用できる。アデノウイルスに基づくデリバリーシステムの標的は、例えば肝臓、中枢神経系、内皮細胞及び筋肉である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染し、初期のレトロウイルスベクターに優る利点となる。Kozarsky et al., Curr Opin Gen Dev 3:499 (1993) は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を提示している。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3 (1994) は、アカゲザルの呼吸上皮へ遺伝子を導入するアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld et al., Science 252:431 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143 (1992); Mastrangeli et al., J Clin Invest 91:225 (1993); 国
際公開公報第９４／１２６４９号;及びWang et al., Gene Therapy 2:775 (1995)に見出すことができる。

【0261】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子治療に使用し得る (Walsh et al., Proc Soc Exp Biol Med 204:289 (1993);及び米国特許第５４３６１４６号；同第６６３２６７０号；及び同第６６４２０５１号)。

【0262】

遺伝子治療の別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション又はウイルス感染のような方法による組織培養の細胞への遺伝子導入を含む。通常は、導入の方法は細胞への選択可能なマーカーの導入を含む。次いで、細胞は導入遺伝子を取り込み、そして発現しているそれらの細胞を分離するために選択下に置かれる。それらの細胞は、次いでヒトに送達される。

【0263】

このように、核酸は得られた組み換え細胞のインビボ投与に先立ち細胞中へ導入され得る。当該導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体仲介遺伝子導入、ミクロ細胞仲介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含み、当技術分野で公知のいずれの方法によっても行い得るが、これらに限定されない。外来遺伝子の細胞への導入に関する多数の技術が当技術分野で公知であり（例えば、Loeffler
et al., Meth Enzymol 217:599 (1993); Cohen et al., Meth Enzymol 217:618 (1993);
and Cline Pharm Ther 29:69 (1985)を参照されたい) 、そしてレシピエント細胞の必要な発達及び生理機能が破壊されないことを条件として、本発明に従って使用してもよい。本技術は、核酸が細胞により発現し、遺伝性でそして細胞後代により発現するように、細胞への核酸の安定導入を導く筈である。

【0264】

得られた組み換え細胞は、当技術分野で公知の種々の方法により患者に送達し得る。組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）は好ましくは静脈内投与される。使用する想定細胞量は所期の効果、患者の状態などによって決まり、そして当業者によって決定され得る。

【0265】

核酸が遺伝子治療の目的で導入し得る細胞は、任意の所望の、利用可能な細胞タイプをも含み、そして上皮細胞、内皮細胞、ケラチン細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球及び顆粒球などの血液細胞；種々の幹細胞又は前駆細胞、特に造血幹細胞又は前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものを含むが、これらに限定されない。

【0266】

１つの実施態様では、遺伝子治療に使用される細胞は患者の自家細胞である。本発明の抗体をコードする核酸配列が、トランス遺伝子が細胞又はその後代によって発現するように細胞中に導入され、次いで組み換え細胞が治療効果のためにインビボで投与される。特定の実施態様では、幹細胞又は前駆細胞が使用される。分離されそしてインビトロで維持し得るいずれの幹細胞又は前駆細胞でも、本発明の実施態様に従って潜在的に使用することができる（例えば、国際公開公報第９４／０８５９８号; Stemple et al., Cell 71:973 (1992); Rheinwald Meth Cell Bio 21A:229 (1980);及びPittelkow et al., Mayo Clinic Proc 61:771 (1986)を参照されたい)。ＣＸＣＲ５は、例えば、Ｂ細胞に発現することから、血液細胞及び骨髄細胞が好適な宿主細胞となる。しかしながら、幹細胞宿主の使用に関する本発明の範囲は、関心あるトランス遺伝子を胚及び胚性幹細胞に投与することにより、トランスジェニック生物を作るためのトランス遺伝子の作製及び使用を意図しない。

【0267】

本発明は、例えば、本発明の液体製剤の有効量を対象者に投与することにより、ＣＸＣ
Ｒ５疾患又はその１つ若しくはそれ以上の症状の治療、予防及び改善の方法を提供する。対象は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、カニクイザルなどのサル、及びヒト）である。好ましい態様では、対象はヒトである。

【0268】

ＣＸＣＲ５は、膵臓、結腸及び膀胱などの特定のがん細胞に、並びにＴ細胞白血病（Qinping et al., Oncogene 24:573-584, 2005)、及びＢ細胞白血病（Burkel et al., Blood, Jul 2007; doi:10.1182/blood-2007-05-089409）で発現し、そしてＣＸＣＲ５の刺激はがん細胞の増殖と相関する（Meijer et al., Canc Res 66:9576 9582, 2006）。

【0269】

このように、関心ある抗体又はその誘導体は、ＣＸＣＲ５を発現するがん細胞の増殖を調節するために使用することができ、そのがんは、本明細書で教示した診断アッセイによるＣＸＣＲ５発現の存在を測定することにより同定される。関心ある抗体は、悪性細胞の浸潤を低減し、アポトーシス抵抗性を低減し、そして増殖を最小化することができる。このような患者は、次いで本明細書に示されるように関心ある抗体又はその誘導体のがん細胞増殖阻害量を投与される。

【0270】

自己免疫疾患は、狼蒼（Ishikawa et al., J Exp Med 193:1393-1402, 2001) 及びシェーグレン症候群（Salomonsson et al., Scan J Imm 55:336-342, 2002; and Barone et al., Arth Rheum 52(6)1773 1784, 2005）などのＣＸＣＬ１３の異常及び／又は高発現に、又は重症筋無力症(Sims et al., J Imm 167:1935-1944, 2001; Saito et al., J Neuroimm 55:336-342, 2005; 及びTackenberg et al., Eur J Imm 37:849 863, 2007）などのＣＸＣＲ５の高発現に関連している。それ故、関心ある抗体は、高レベル又は高活性のＣＸＣＬ１３又はＣＸＣＲ５リガンドの作用を最小化するために使用される。高レベルのＢ細胞、高レベルのＣＸＣＲ又は高レベルのＣＸＣＬ１３、又は他のＣＸＣＲ５リガンドによって特徴付けられる自己免疫疾患では、関心ある抗体の細胞活性阻害量が本明細書で教示したように投与される。

【0271】

異常ＣＸＣＲ５発現は、多発性硬化症において観察される（Brain 129(Pt 1)200-211, ２００６）。
大腸炎では、ＣＸＣＲ５はＧＡＬＴの形成及び機能の役割を有する（Carlsen et al., Gut, 2002, 51(3)364-367）。腸粘膜固有層内へのＢ細胞のＣＸＣＲ５仲介遊走及び浸潤、及び一般的な粘膜浸潤（Mazzucchelli et al., J Clin Invest, 1999, 104(10)R49-R54）、及び異所性胚中心を含む潰瘍性大腸炎病巣におけるその発現は、関心ある抗体によって阻害される。

【0272】

Ｂ細胞減少は、特定の状況下で症状を軽減するのに、そして関節リウマチなどの特定の適応症において、治療的に有益であり得る（Oligino & Dalrymple, Arth Res Ther 5(Suppl 4)S7-S11, 2003)。ＣＸＣＲ５は、関節リウマチに罹っていない特定の個体の組織と比較して、関節炎患者の滑膜組織で高レベルに発現する(Schmutz et al., Arth Res Ther 7:R217-R229, 2005)。従って本発明の抗体及びその誘導体の特定の形態は、Ｂ細胞集団を減少させることができ、そして関節におけるＢ細胞の浸潤及び相互作用を抑制することができる。従って、治療は、関節炎と診断された患者に関心ある抗体のＢ細胞レベル低減量を投与することを含むことができる。該抗体は罹患した関節に局所的に投与し得る。

【0273】

異所性リンパ球新生は、乾癬性関節炎（Canete et al., Ann Rheum Dis, Jan 12, 2007, doi:10:1136/ard.2006.062042)、一般的には慢性炎症性疾患 (Aloisi & Pujol-Borrell, Nat Rev Imm 6:205-217, 2006) を含む幾つかの病態に、及び慢性（Baddoura et al., Am J Trans 5:510-516, 2005) 及び急性（DiCarlo et al., Am J Trans 7:201-210, 2007）の両方の拒絶を起こしている移植片に認められる。ＣＸＣＬ１３及びＣＸＣＲ５は心臓
移植に存在していた (DiCarlo et al., 上記を参照)；そしてＣＸＣＬ１３は乾癬性関節炎に存在していた（Canete et al., 上記を参照)。ＣＸＣＬ１３及び／又はＣＸＣＲ５の存在は、正常結節に見られるようにＢ細胞及びＴ細胞領域での異所性リンパ濾胞の発生に関連している。アロ抗原のＢ細胞抗原提示も、急性心臓同種移植モデルに関連していた（Noorchashm et al., J Imm 177:7715-7722, 2006)。

【0274】

このように、関心ある抗体は、炎症及び移植拒絶を減弱させるのに使用できる。患者は、その場合Ｂ細胞活性阻害量の抗体を、炎症を減弱させ、異所性胚中心発生を最小化し、移植片へのＢ細胞動員を最小化し、そして移植手順の前又は後のＢ細胞アロ抗原提示を最小化するために投与される。

【0275】

本発明は、幾つかの実施態様を記述する以下の非限定的な実施例により、当業者の利益のために例証されるものであり、そこで本発明が実施され得る。

【実施例】

【0276】

［実施例１］
免疫原の作成
抗ＣＸＣＲ５モノクローナル抗体を、ＤＮＡを全長コード化したヒトＣＸＣＲ５で形質転換したＣＨＯ細胞に産生させ、細胞表面（「ｒ−ＣＸＣＲ５−ＣＨＯ細胞」）に発現させることは可能である。ＣＸＣＲ５シーケンスは、細胞の形質転換に用いられる。
ＣＸＣＲ５のオープン・リーディング・フレームは、pCDNA3.1neo#DESTなどの発現ベクター中に置かれ、その後、３００−１９細胞へトランスフェクションされる（免疫原）。

【0277】

また、ＭＮＹＰＴＬＥＭＤＬＥＮＬＥＤＬＦＷＥＬＤＲＬＤＮＹＮＴＳＬＶＥＮＨＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸配列を有するＣＸＣＲ５−ＥＣドメインは、Ｃ末端のシステインによりＫＬＨに結合され、そして免疫原として使用される。ＣＸＣＲ５を発現する細胞、又はＣＸＣＲ５−ＥＣドメインは、腹腔内（ＩＰ）投与される（細胞：５×１０⁶／ペプチド：０．２ｍｌ又は５０μｇ／緩衝剤：１００μｌ、場合により、フロイント完全アジュバントなどのアジュバント：１００μｌと混合される）。抗原の注射は、任意の種々の公知方法を用いて、例えばＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより、例えばＦＡＣＳにより単離することができる例えばＣＸＣＲ５⁺細胞、及び陽性の対照群として例えば市販のMAB190（R & D Systems社）を用いて、血清中にＣＸＣＲ５抗体の高力価が検出されるまで２週毎に繰り返された。

【0278】

ＣＸＣＲ５を発現する細胞は、１０％透析処理済ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補足したRPMI（Invitrogen、Carlsbad、CA）中、３７℃、５％ＣＯ₂環境下で保持した。上記の培地を、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）を補足したリン酸緩衝化（Ｃａ／Ｍｇフリー）生理食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）で置換し、そしてその緩衝液中で細胞を採取することにより、細胞を注射用として調製した。採取した細胞を、５００×ｇで、約５分間遠心分離にかけペレット化し、１回ＣＭＦ−ＰＢＳ中でペレットを再懸濁して洗浄し、そして前と同様に遠心分離し、計数し、ＣＭＦ−ＰＢＳ中で細胞ペレットを再懸濁することにより、注射用として適切な体積（５×１０⁶細胞／０．２ｍｌ）になるように調整した。

【0279】

既述の通り、ＣＸＣＲ５の発現は、例えば、MAB190（R&D）、クローンＲＦ８Ｂ２及び２Ｇ８（２Ｇ８はラット抗マウスＣＸＣＲ５抗体であり、その他の購入した抗体は、抗ヒトＣＸＣＲ５抗体である）（ＢＤ）、及び２Ｃｌ（Abnova社）、並びに当業者に公知の方法を行って作成したｈＣＸＣＲ５へ導く種々のポリクローナル抗体など、市販のＣＸＣＲ５抗体を用いて、ＦＡＣＳ分析により、モニターした。

【0280】

プラスミドの構築を容易にし、ＣＸＣＲ５の発現を増強するため、ＣＸＣＲ５の核酸コ
ード配列の始めの１３５個の塩基対を含むリーダーペプチド配列に対応する、オリゴヌクレオチドを作成した。オリゴヌクレオチドは、ゆらぎコーディング位置において、ＧＣ含量をより低下させるため幾つかの変更を有した。全てのヌクレオチド配列変化はサイレント、即ちアミノ酸配列の変化は発生しなかった。オリゴヌクレオチドを一緒にアニールした後、遺伝子操作したリーダーペプチドのコーディング配列を、ＰＣＲ−ＳＯＥ（Ho et al., Gene 77:51 (1989);及びHorton et al., BioTechniques 8:528 (1990)）によりコーディング配列の残りの部分に連結した。

【0281】

ＣＸＣＲ５の発現は、免疫原として使用する前に検証した。細胞を１０％ＦＢＳ、０．２ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸溶液を含むＲＰＭＩ（Invitrogen社、Carlsbad、CA）で培養し、次いで約３〜５×１０⁵細胞／ウエルをＴ７５フラスコ内に播種し、そして約２４〜４８時間成長させた。
形質転換又はトランスフェクションした細胞は、ＣＸＣＲ５発現したプラスミドを有ししない細胞が抗生物質選択により排除されるまで約２週間培養した。安定細胞株の細胞は溶解することができ、タンパク質を得、そしてそれをウエスタン・ブロット（Western blot ）分析にかけた。

【0282】

安定して又は一過性でトランスフェクションした細胞は、ＦＡＣＳ分析によるなどＣＸＣＲ５の細胞表面発現を検出するための方法を用いて、ＣＸＣＲ５の発現をアッセイした。代替として、細胞を溶解することができ、そしてタンパク質を、例えばウエスタン・ブロット分析（Western blot analysis）により調査する。トランスフェクションした細胞を培養皿から採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、そして脱イオン水中再懸濁し、２倍の体積のタンパク質サンプルローディング緩衝液と混合し（BioRad、Hercules、CA）、次いで約１００℃で１０分間加熱した。膜タンパク質を、２倍の体積のタンパク質サンプルローディング緩衝液と混合し、１００℃で１０分間加熱した調整培地を用いて、分析した。サンプルは、４〜１２％グラジェントＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。タンパク質を移す前、ＰＢＳＴ（０.０５％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）を有するＰＢＳ）中の５％無脂肪のドライミルクで、少なくとも１時間ブロックして、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜（BioRad、Hercules、CA）に移した。

【0283】

ＣＸＣＲ５は、ＣＸＣＲ５特異的一次抗体を有する膜をブロッキング緩衝液中、振盪しながら室温で少なくとも１時間インキュベートすることにより検出した。膜を少なくとも３回洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中のレポーター結合二次抗体を膜に加え、そして振盪しながら室温で少なくとも１時間インキュベートした。膜はＰＢＳＴで３回洗浄し、そして例えば化学発光基質を用いて展開した。

【0284】

［実施例２］
抗ＣＸＣＲ５−ｍＡＢＳの作成
約４〜６週齢のＡ／Ｊ又はＢＡＬＢ／ｃＪマウス（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）を、ＣＸＣＲ５トランスフェクション細胞又はＥＣペプチドで免疫した。１群のマウスを、０日目、ＫＬＨ結合ペプチドとアジュバント（ＣＦＡ）を１：１で混合したエマルジョンで腹腔内で抗原刺激し、２０日目、ＩＦＣ（不完全フロイントアジュバント）と共にそのペプチドで、及び／又はアジュバントなしのＰＢＳ中の細胞で、腹腔内で追加免疫し、そして最後に４４日目、ＩＦＣ中混合したＫＬＨ−ペプチド及び／又は助剤なしのＰＢＳ中の細胞で、静脈内で追加免疫した。別の群のマウスは、０日目、腹腔内で抗原刺激し、１５、３９、５３及び６７日目、腹腔内で追加免疫し、そして最後に、８１日目、静脈内で追加免疫した（全ての注射は、助剤なしのＰＢＳ中の細胞で）。両群のマウスに対して、各注射は、約２００μｌの体積中、約３×１０⁶〜２×１０⁷ の細胞を含んでいた。代替として、ペプチド及び／又は細胞の免疫は、例えばＦＡＣＳ分析又はＥＬＩＳＡで確認して、望ましい抗ＣＸＣＲ５の力価が得られるまで、２週間毎に１回の割で３〜６回行った
。

【0285】

最後の注射の後３日、マウスを、場合により血清中の抗ＣＸＣＲ５抗体力価を試験し、犠牲にして、脾臓を取り出し、Petri皿の無血清ＤＭＥＭ（Gibco）（約１０ｍｌ）中に置いた。脾細胞を、鉗子を用いて被膜（capsule）から剥がし、そして無血清ＩＭＤＭ（Cellgro, Herndon, VA）（１０ｍｌ）で、３７℃で２回洗浄した。脾臓細胞懸濁液をコニカル型チューブ（１５ｍｌ）に移し、そして約２〜５分間かけて組織細片を落とした。脾細胞を含む上清を新鮮なコニカル型チューブ（１５ｍｌ）に移し、そして融合するまでＩＭＤＭで更に３回洗浄した。マウスからの脾細胞はプールできる。

【0286】

場合により、対照の脾臓フィーダー細胞の単細胞懸濁液（５ｍｌ）を、本質的に免疫脾臓細胞について上述したように、非免疫マウスから調製し、必要になるまでインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）内に置いた。
免疫脾臓細胞に対する融合のパートナーは、Ｐ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３又はＳＰ２／０（ATCC, Manassas, VA）、又はＦＯ＿Ｂリンパ芽球（ATCC, CRL-1646）などのヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）−感受性、非分泌骨髄腫細胞株であり得る。融合の前に、リンパ球を、ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ（３７℃；７％ＣＯ₂）中に保持し、リンパ球が融合の日に対数的成長が起こる相に存在することを確実にした。代替の選択メカニズムは、典型的には融合の１日後に加えられるアザセリンを用いることに依存する。

【0287】

用いた融合のプロトコールは、Lerner（Yale J Biol Med, 1981, 54(5)387-402）、及びGetter（Somatic Cell Genet, 1977, 3(2)231-236）に説明されているプロトコールの混成型である。融合の前に、プールした脾細胞を３回無血清ＩＭＤＭで洗浄し、そして計数した。また、融合の直前に、対数相の骨髄腫細胞を、３回無血清ＩＭＤＭで洗浄し、そして計数した。リンパ球は、無血清ＩＭＤＭ中、１×１０⁷細胞／ｍｌに再懸濁した。各々の融合のために、１〜１.５×１０⁸の脾細胞を、コニカル型ポリプロピレンチューブ（５０ｍｌ）中、１〜３×１０⁷の骨髄腫細胞と混合し、そして細胞を１回無血清ＩＭＤＭで洗浄した。脾細胞の骨髄腫細胞に対する比率は５：１であった。チューブを５００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、細胞をペレット化した。上清を吸引した後、ペレットをチューブの底を軽く叩いて、穏やかに再懸濁させた。次いで、チューブを３７℃の水の入ったビーカー内に置いた。全てのその後の融合工程はそのビーカー内で行った。

【0288】

次に、３７℃に予備加熱したポリエチレングリコール１５００（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）（１ｍｌ）を、約１分かけて徐々に各々の細胞ペレットに加え、その間チューブを穏やかに揺動させた。細胞をＰＥＧ中で約１分間インキュベートし、その後無血清ＩＭＤＭ（１ｍｌ）を各ペレットに３０秒かけて滴下して添加し、次いで無血清ＩＭＤＭ（９ｍｌ）を各ペレット上に１分かけて加えた。両方のチューブを、５００×ｇで、室温で１０分間遠心分離にかけ、上清を吸引した。細胞ペレットを、１００ｍｌの濾過した完全なハイブリドーマ生産培地（１０％ＦＢＳ（SeraCare, Millford, MA）、０.２ｍＭのＬ−グルタミン、１×非必須アミノ酸溶液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０.０１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ溶液（Invitrogen）及び１×ＨＴサプリメント（Invitrogen））を混合したＩＭＤＭ（Cellgro）（５００ｍｌ））に再懸濁した。

【0289】

細胞の懸濁液（各１００ｍｌ）を１０個の９６ウエルの平底のマイクロタイタープレートに、約１００μｌ／ウエルの体積で入れた。プレートを、３７℃、７％ＣＯ₂のインキュベーター内に維持した。２日目の後融合で、ＩＭＤＭ中の５.７μＭのアザセリンを融合細胞に、ウエル当たり１００μｌで加えることによって細胞を選択した。上清は、一次スクリーニングのために、典型的には後融合１０〜１４日目で、クローンを含むウエルから回収した。融合効率は７５〜９９％であった（スクリーニングされるクローンを発生し
た可能性のあるウエル９６０のうち７２０〜９５０）。

【0290】

一次スクリーニングは、ヒトＣＸＣＲ５に結合する抗体を検出するために設計された放射免疫測定法（ＲＩＡ）で行うことができる。ＲＩＡを行なうため、ＰＢＳ中のアフィニティ精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ_cフラグメント特異的）（Cappell, Cochranville, PA）を９６ウエルのＰＶＣマイクロタイタープレート（５０μｌ／ウエル）に加え、そして４℃で終夜インキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧをプレートから取り除き、そしてウエルを、１００μｌ／ウエルの５％ＦＣＳ／ＰＢＳを用いて、室温で１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、正味の融合細胞の培養上清をウエルに加え（５０μｌ／ウエル）、そして室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０.０５％Tween-20で３回洗浄した。次に、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ中の¹²⁵Ｉ−ＣＸＣＲ５（５０μｌ）（約２０，０００ｃｐｍ）をそれぞれのウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。最後に、ウエルを３回、ＰＢＳ／０.０５％ Tween-20で洗浄した。洗浄緩衝液を払い出した後、ウエルをプレートを切断することにより分離し、そしてγ線カウンターで分析した。培養上清の代わりに、５％ＦＣＳ／ＰＢＳを加えたウエルがバックグラウンド・ウエルとして機能した。

【0291】

精製したＣＸＣＲ５を、Bolton-Hunter試薬（New England Nuclear, Boston, MA）の供給者により実質的に説明されているように、Bolton-Hunter方法に従い、¹²⁵Ｉで標識化した。¹²⁵Ｉ−ＣＸＣＲ５の品質は、標識化手順が市販のＣＸＣＲ５抗体（R & D or Becton
Dickinson, Mountain View, CA）により認識されるエピトープを破壊しないことを確認することによりモニターした。
ＲＩＡにおいて、上清サンプルがバックグラウンドより約１０倍標識化されていれば、クローンは、一次スクリーニングにおいて陽性であるとされる。陽性のクローンは、引き抜かれ（pulled）、増殖され（expanded）、冷凍保存される。

【0292】

１次融合細胞のスクリーニングは、抗体が未変性のＣＸＣＲ５エピトープを認識するか否かを決定するよう設計されている。このことは、蛍光標識ヤギ抗マウス第二抗体を結合して可視化する、モノクローナル抗体で染色したＣＸＣＲ５⁺細胞上に表示される、細胞表面ＣＸＣＲ５のＦＡＣＳ分析で達成される。上清サンプルが、ＦＡＣＳ分析において、バックグラウンドより約１０倍標識されていれば、クローンは、一次スクリーニングにおいて陽性であるとされる。また、抗体が結合したＣＸＣＲ５エピトープを局在化させるため、ＣＸＣＲ５抗体との競合分析が行われた。陽性のクローンは選択され、増殖され、冷凍して保存された。

【0293】

［実施例３］
抗ＣＸＣＲ５−ｍＡＢＳについての細胞ベースの結合アッセイ
抗ＣＸＣＲ５−ｍＡＢＳを特徴付けるために、細胞ベースの結合アッセイを用いた。例えば、上述したｈＣＸＣＲ５／ＨＥＫ２９３などのＣＸＣＲ５発現トランスフェクション細胞を用いることができる。全長ヒトＣＸＣＲ５のオープン・リーディング・フレームは、ベクター、例えばｐＣＤＮＡ３．１ｎｅｏＤＥＳＴ（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にクローン化した。ＣＸＣＲ５のコーディング領域は、テンプレートとしてヒト脳及び肝臓ＲＮＡ（Ambion, Inc., Austin, TX）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより合成した。最終的なプラスミドコンストラクト、ＣＸＣＲ５／ＣＤＮＡ３．１ｎｅｏは、全長ＣＸＣＲ５タンパク質を発現した。ＣＸＣＲ５を発現する安定細胞株は、標準的な及び市販のLipofectamine 2000キットを用いて、ＣＸＣＲ５／ｐＣＤＮＡ３．１ｎｅｏプラスミドコンストラクトのＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞（ATCC No. CRL-1573）へのトランスフェクションにより作成した。トランスフェクション後、細胞を終夜ＤＭＥＭ中で培養し、次いでネオマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含む培地に再播種し、そして１２〜１４日間培養した。単離した単一コロニーを採取し、十分なクローン細胞が増幅されるまで、個々のウエル内で成
長させた。ネオマイシンに耐性で、そして高レベルのＣＸＣＲ５タンパク質を発現する安定なクローンは、ポリクローナル抗ＣＸＣＲ５抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN）、又は特別に作成したポリクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析により同定した。

【0294】

また、天然でＣＸＣＲ５を発現するヒトHS Sultan 細胞（ATCC No. CRL-1484）は、ＦＡＣＳ分析により、ＣＸＣＲ５を発現することを確認した。HS Sultan 細胞は、１０％ウシ胎児血清、０．２ｍＭのグルタミン、及び０．１％のpen／strep溶液（１００μｇ／ｍｌのペニシリンと１０μ／ｍｌのストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。

【0295】

細胞ベースの抗体結合は、FMAT（商標）（蛍光マクロ共焦点（fluorescence macro-confocal）−ハイスループットスクリーニング）8100 HTS、又は8200細胞検出システム（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用い、製造業者によって提供されるプロトコールに従って評価できる。ＣＸＣＲ５を天然で発現する細胞株、又はＣＸＣＲ５発現コンストラクトを安定にトランスフェクションされた細胞株を、９６のウエルプレートに播種した。代替として、一過性でトランスフェクションさせた２９３Ｔ又はＣＨＯ細胞は、９６のウエルプレートに播種した。細胞は、ウエル当たり５，０００〜３０，０００細胞の密度で播種した。２０〜２４時間後、抗ＣＸＣＲ５−ｍＡＢＳ及びFMAT結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体をウエルに一緒に加え、そして、１時間、２時間、４時間又は終夜室温でインキュベートした。
細胞ベースの抗体結合は、また、ＣＸＣＲ５を発現するＨＥＫ２９３／ＣＸＣＲ５安定細胞株を用いたＦＡＣＳで評価した。細胞をＰＢＳ中の抗ＣＸＣＲ５−ｍＡｂsと共にインキュベートした。３回の洗浄後、細胞を蛍光分子結合二次抗体（BD Sciences, Palo Alto, CA）と共にインキュベートした。

【0296】

いくつかのｍＡｂｓは、いずれかの組み換えプラスミドコンストラクトから発現したＣＸＣＲ５に結合するという結果が示された。例えば、クローン１１Ｄ６、１４Ｃ９、１９Ｈ５、Ｈ２８、５４Ｇ６、Ｇ７、５６Ｈ６、７９Ｂ７及び１６Ｄ７、並びに後者の抗体のヒト化変異体１６Ｄ７、１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ３、１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ２、１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ１及び１６Ｄ７−ＨＣ２−ＬＣ１、陰性対照のＩＬ１３抗体、ＣＡ１３、陽性対照のＭＡＢ１９０、２Ｃ１、及びＲＦ８Ｂ２、ＩＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂに対する３種のマウスアイソタイプ対照、及びラットのＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（ＲＦ８Ｂ２にマッチした）の、ＣＸＣＲ５発現のためトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞との結合を試験した。２Ｃ１及びＭＡＢ１９０陽性対照抗体は、ＣＸＣＲ５細胞に結合する。ＲＦ８Ｂ２は、中間結合レベルを示した。陰性の対照抗体は、バックグラウンド結合のみを示した。ＣＡ１３を除く全ての抗体は、親抗体の１６Ｄ７と７９Ｂ７と同様の結合プロファイル及び滴定動力学でｈＣＸＣＲ５／ＨＥＫ２９３細胞と結合した。

【0297】

ＣＸＣＲ５／ネオプラスミドを含む一過性でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞も、また、上記した免疫蛍光法で染色し、そして蛍光顕微鏡で観察した。細胞ベースのＦＭＡＴ及びＦＡＣＳ分析により、ｍＡｂｓが、組み換えプラスミドコンストラクトから、又は培養細胞中の天然タンパク質としてのいずれかで発現したＣＸＣＲ５に正に結合することを確認する。陽性の結合シグナルは、ＦＭＡＴの読み出しシグナルに基づき分析され、それは、バックグラウンド結合及びその他の陰性のハイブリドーマクローンより有意に高い（ｐ＞０.０１）。
１６Ｄ７、１４Ｃ９、１９Ｈ５、Ｈ２８、５４Ｇ６、Ｇ７、５６Ｈ６及び７９Ｂ７などの作成したＣＸＣＲ５−ｍＡｂｓは、ＥＣドメインと結合し、細胞上のＣＸＣＲ５に対するＣＸＣＬ１３の結合をブロックする。

【0298】

［実施例４］
BIACOREアフィニティ分析
ヒト及びマウス由来のＣＸＣＲ５（アミノ酸１〜５９）のＮ末端ＥＣ領域を、末端ビオチンタグを用いて合成し、そしてフォワードBiacoreアッセイに用いた。そのアッセイでは、ペプチドをBiacoreチップ上に固定化し、次いでチップ上での抗体のペプチドとの相互作用の動力学が測定される。合成ペプチドは、Biacoreチップ上に、約２０応答ユニット（ＲＵ）毎に固定化された。ｍＡｂ’ｓは、製造業者の推奨（GE Healthcare, Piscataway, NJ）に従って、動力学測定のためチップに暴露した。

【0299】

マウス抗ｈＣＸＣＲ５−ｍＡｂクローン、１６Ｄ７は、２．１６^-12Ｍの計算値Ｋ_dを有し、マウス／ヒトＩｇＧ４キメラ１６Ｄ７（ヒトＩｇＧ４−Ｆｃ上にグラフトした１６Ｄ７−ＶＨ及びＶＬ領域、その配列は当該技術で公知であり、場合により、そのコドンは、クローニング、末端の増幅、領域の質量確認、及び部分のクローニングなどの標準的方法を用いて最適化される）は、１．４１^-12ＭのＫ_dを有し；そして種々の１６Ｄ７のヒト化変異体について、ここで、変異体の構造及びその重鎖及び軽鎖の誘導は、特定の重鎖に対しては「ＨＣ＿」、そして特定の軽鎖に対しては「ＬＣ＿」の用語で表示され、それらはＩｇＧ４の骨格上にグラフトされ、ここでその鎖の組成は以下に与えられる通りである：１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ１は３．１１^-12ＭのＫ_dを有し；１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ２は１．４１^-12ＭのＫ_dを有し；１６Ｄ７−ＨＣ２−ＬＣ１は２．４０^-12ＭのＫ_dを有し；１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ３は１．２１^-12ＭのＫ_dを有し；１６Ｄ７−ＨＣ３−ＬＣ４は４．９２^-12ＭのＫ_dを有し；１６Ｄ７−ＨＣ３−ＬＣ５は１．８４^-10ＭのＫ_dを有し；そして１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ６は９．１７^-11ＭのＫｄを有する。

【0300】

ヒト化ＳＡＲ１１３２４４、１６Ｄ７ヒト化変異体の１つの形態の１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ３［これは、Ｓ２４１Ｐ及びＬ２４８Ｅ置換（公知の方法及び試薬を使い、導入した置換、Kabatナンバリングを使用）を有する］を、予め固定化したマウス抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体によりBiacoreチップ上に捕え、その後、リバースアッセイフォーマットBiacoreアッセイに用いた。そのアッセイでは、タグのないヒトＣＸＣＲ５のＮ末端ペプチド（アミノ酸１〜５９個）とｍＡｂ’ｓとの相互作用の動力学が測定された。ＳＡＲ１１３２４４のＫ_Dは、１.１３±０.０８^-11Ｍと定量された。チップ表面上に固定化されたビオチン化ヒトペプチド及び検体としてＳＡＲ１１３２４４を用いたフォワード・アッセイで定量したＫ_D値は、リバース・アッセイを用いて得られた値と符合した。

【0301】

［実施例５］
抗ＣＸＣＲ５−ＭＡＢＳ結合活性のウェスタンブロット分析
変性条件下で抗ＣＸＣＲ５−ｍＡｂのＣＲＣＲ５への結合活性、及びＣＸＣＲ５及びヒト細胞株におけるその他のＣＸＣＲ５関連のタンパク質の発現レベルを評価するために、ウェスタンブロットを行なった。また、タンパク質のサンプルは、Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬キット（Pierce, Rockland, IL, Cat # 78501）を用い、製造業者の指示書に従って、安定的にトランスフェクションした細胞から調製され、それに、等量の２×タンパク質のローディング緩衝液を加えた後、７０℃で１０分間加熱した。全てのサンプルは、４〜１２％のグラジエントのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の電気泳動法で分離した。タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜へ移動させ、そして抗ＣＸＣＲ５−ｍＡｂｓを、一次検出抗体としてウエスタンブロット膜に適用した。Alexa680結合二次抗体を検出用として用い、そして膜をOdyssey Infrared Imaging system（Licor, Lincoln, Nebraska）を用いて、又は電気化学発光（ＥＣＬ）を用いてスキャンした。ヒトＣＸＣＲ５に対する陽性の対照抗体を、本明細書で教示したように作成した。

【0302】

［実施例６］
ＣＸＣＲ５のインターナリゼーションをモニタリングするためのＦＡＣＳアッセイ
バフィーコート細胞を健常ボランティア（Gulf Coast Blood Center, Houston, TX）か
ら得る。ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的なFicoll-Hypaqueグラジエント法により単離した。ＰＢＭＣは、９６ウエルプレート中、４℃で培養した（０.５×１０⁶細胞／ウエル）。各々のウエルは、モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下／不存在下で、１０％ＦＢＳを補充したＲＡＭＩ１６４０（０.２ｍｌ）を含有する。３０分後、培地を、１０％ＦＢＳを補充し抗体を補充しない、新鮮な冷ＲＰＭＩ１６４０で置き換えた。細胞を３７℃で、加湿した、５％ＣＯ₂を含む組織培養チャンバーへ移した。モノクローナル抗体処理細胞を３７℃に移した後、直ちに、２時間後、又は２４時間後、収穫した。細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、そして１％のＢＳＡを含む冷ＰＢＳ（ＰＢＳＢ）中で３０分間インキュベーターした。その後、細胞をＰＥ結合抗ヒトＣＸＣＲ５で染色した（BD Biosciences）。３０分後、細胞を３回ＰＢＳＢで洗浄し、そして１％のパラホルムアルデヒド溶液に終夜固定した。翌日、ＣＸＣＲ５の存在を、BD FACSCalibur(商標）システムフロー血球計算器（BD Biosciences, San Jose, CA）で分析した。

【0303】

［実施例７］
ＦＬＩＰＲアッセイ
細胞内カルシウムの変化を、９,０００細胞／ウエルをプレートに蒔き、終夜インキュベートすることにより測定した。細胞は、ヒトＣＸＣＲ５で安定的にトランスフェクションしたＲＢＬ−２Ｈ３系統であった。細胞を洗浄し、次いで、２．５ｍＭのプロベニシド（probenicid）を含む２ｍＭのｆｌｕｏ−４／ＡＭ（Molecular Probes）をローディングした。細胞をＣＸＣＲ５−ｍＡＢに暴露し、次いで、アッセイ緩衝液で洗浄した。細胞を１０ｎＭのＣＸＣＬ１３（Ｒ＆Ｄ）に暴露した。細胞内のＣａ⁺²の変化を３８４ＢＦＬＩＰＲ装置（Molecular Devices）を用いて記録した。市販されている抗ヒトＣＸＣＲ５−ｍＡｂs、及びマウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂを対照として用いた。

【0304】

以下に議論する通り、キメラ１６Ｄ７（ｈＩｇＧ₄キメラ）、１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ１、１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ２、１６Ｄ７−ＨＣ２−ＬＣ１、１６Ｄ７ＨＣ１ＬＣ３、１６Ｄ７−ＨＣ３−ＬＣ４、１６Ｄ７−ＨＣ３−ＬＣ５及び１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ６などのｍＡｂ−１６Ｄ７の数種のヒト化バージョンを構築し、そしてそれらの生物学的活性をカルシウム・フラックスで証明されるように試験した。
陰性対照のＣＡ１３は別として、ヒト化抗体は、安定的にＣＸＣＲ５を発現するトランスフェクション細胞で、親１６Ｄ７抗体のシグナル中和活性と同等のシグナル中和活性を示した。

【0305】

［実施例８］
走化性アッセイ
ＣＸＣＲ５⁺HS-Sultan細胞（ATCC CRL1484）を、トランスウエルプレート（Millipore）の上段チャンバーへ、０．５×１０⁶細胞／ウエルの条件で、１００ｎＭのＣＸＣＬ１３（R&D）の存在下、又はＣＴＸ緩衝液（ＲＰＭＩ、フェノールレッドなしで、１％ＦＢＳ、０.５％ＢＳＡ及び１ｎＭのピルビン酸ナトリウムを含む）の存在下で加え、下段のチャンバーへ遊走する細胞を評価した。２つのチャンバーを組み立て、そして２時間インキュベートした。比色試薬（Promega）を加え、そしてＯＤ₄₉₀で読み取りを行った後、下段のチャンバー内の細胞を計数した。

【0306】

ＣＸＣＲ５特異的遊走は、遊走する細胞の全数と自発的に遊走する細胞数の間の差として測定される。抗ＣＸＣＲ５を試験する場合、細胞を上段チャンバーに加える前に、抗体と共に３０分間インキュベートした。抗体阻害の度合は、抗体の存在下での特異的遊走の、抗体不存在下での遊走量に対する比である。その比を１００％で掛けてパーセント阻害率を得ることができる。

【0307】

実施例７の抗体を、走化性を中和する能力について、親１６Ｄ７抗体と比較した。陰性
対照ｍＡｂ−ＣＡ１３は別として、全てのヒト化抗体は、１６Ｄ７及び７９Ｂ７、１４Ｃ９、１９Ｈ５、Ｈ２８、５４Ｇ６、Ｇ７、５６Ｈ６のそれに匹敵するプロファイルで、走化性を中和した。Ｒ＆Ｄ−ＭＡＢ１９０は中間の活性を有し、一方Ｈ２８及びAbnova抗体２Ｃ１は、リガンド誘導細胞遊走を完全には中和しなかった。

【0308】

［実施例９］
初代ヒトＢ細胞の反応性評価
ヒトＰＢＭＣを、全血から、Accuspinカラム（Sigma）を用いて単離した。次いで、ＰＢＭＣを、BD染色緩衝液（Becton Dickinson）に、２，０００万細胞／ｍｌで再懸濁した。マウス抗ヒトＣＸＣＲ５モノクローナル抗体（１μｇ）をＰＭＭＣ（５０μｌ）に加え、そして４℃で２０分間結合させた。細胞を２回BD染色緩衝液で洗浄した。二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥＦ_(ab′)（Beckman Coulter）（５０μｌ）を１／１００に希釈して、ＰＢＭＣ抗体カクテルに加え、そして４℃で２０分間結合させた。細胞を３回BD染色緩衝液で洗浄した。マウス抗ヒトＣＤ２０−ＦＩＴＣ（BD製）及びＣＤ４ＡＰＣ（BD製）をそれぞれ１／５０希釈で含むカクテルを、細胞に加え、次いで４℃で２０分間インキュベートし、Ｂ／Ｔ細胞の特異性を評価した。細胞を３回BD染色緩衝液で洗浄し、そしてBD染色緩衝液（２５０μｌ）に再懸濁し、そしてFACStar PlusでＦＡＣＳ分析にかけた。マウス抗ヒトＣＸＣＲ５抗体（R&D;mAb190）を陽性対照として用いた。滴定曲線をヒト化抗体について作成し、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）を濃度に対してプロットした。
実施例７のヒト化抗体のヒトＰＭＢＣへの結合を試験した。
抗体は、陰性対照ＣＡ１３は別にして、ヒトＢ細胞に結合し、そして同一の滴定プロファイルを示した。陰性の対照群ＣＡ１３は、バックグラウンド結合のみを示した。BDクローンＲＦ８Ｂ２のヒトＰＢＭＣへの結合は不十分であった。

【0309】

［実施例１０］
カニクイザルＢ細胞の反応性評価
カニクイザル（cyno）の全血は、Bioreclamation, Inc. (Hicksville, NY)から入手した。血液は遠心分離後BD細胞調製チューブ（ＣＰＴ）で送られた。血漿層に含まれるcynoＰＢＭＣを、ＣＰＴチューブから５０ｍｌのチューブに移し、グラジェントゲル層を元のまま残した。チューブをＰＢＳ（５ｍｌ）で、すべての細胞を完全に抽出するまで洗浄し、そしてその洗浄物を新しい５０ｍｌのチューブに加えた。cynoＰＢＭＣは、１，２００ＲＰＭで、４℃で１０分間で遠心分離した。ペレットをBD染色緩衝液（１ｍｌ）に再懸濁した。１アッセイ当たり１００万個の細胞を使用した。マウス抗ヒトＣＸＣＲ５モノクローナル抗体（１μｇ）（精製した）をＰＢＭＣ（５０μｌ）に加え、そして４℃で２０分間結合させた。細胞を２回BD染色緩衝液で洗浄した。二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ−Ｆ_(ab')（Beckman Coulter）（５０μｌ）を１／１００に希釈し、そして細胞に加え、４℃で２０分間結合させた。細胞を３回BD染色緩衝液で洗浄した。マウス抗ヒトＣＤ２０ＦＩＴＣ（BD製）及びＣＤ４−ＡＰＣ（BD製）をそれぞれ１／２０希釈で含むカクテルを細胞に加えて、４℃で２０分間インキュベートし、Ｂ／Ｔ細胞の特異性を評価した。細胞を３回BD染色緩衝液で洗浄し、そしてBD染色緩衝液（２５０ｍｌ）に再懸濁し、FACStarPlusでＦＡＣＳ分析にかけた。市販のマウス抗ヒトＣＸＣＲ５−ｍＡｂ（R&D; MAB190）を陽性対照として用いた。

【0310】

ヒトＣＸＣＲ５に対して反応性である本発明のマウスモノクローナル１１Ｄ６を、ＩｇＧのアイソタイプ対照と比較した。１６Ｄ７のヒト化バージョン、及び市販のＭＡＢ１９０を、カニクイザルＣＸＣＲ５に対する反応性について試験した。また、７９Ｂ７も試験した。
ＣＤ２０及びＣＸＣＲ５に対して陽性の細胞は、ＭＡＢ１９０及び１１Ｄ６で見出された。一方、１６Ｄ７及びそのヒト化変異体、並びに、Ｇ７及びBD製 ＲＦ８Ｂ２及びAbnova製 ２Ｃ１は、カニクイザルＢ細胞に対して結合しなかった。また、１４Ｃ９、１９Ｈ
５、Ｈ２８、５４Ｇ６、５６Ｈ６及び７９Ｂ７は、カニクイザルＢ細胞に対して結合した。
本発明のＣＸＣＲ５抗体は、末梢血液細胞を研究するために使われた。Ｂ細胞がＣＸＣＲ５を発現し、そして少なくとも１つの実験において、約１０％の末梢Ｔ細胞がＣＸＣＲ５を発現することが見出された。

【0311】

［実施例１１］
抗ＣＸＣＲ５−ｍＡＢＳの配列
マウスモノクローナル抗体は、市販のアイソタイピングキットを用いて、アイソタイプを判別した（isotyped）。１６Ｄ７及び他の抗ＣＸＣＲ５−ｍＡｂの可変配列を配列決定した。全ＲＮＡを約５００万個の融合細胞から、Qiagen Qianeasy miniprepキットを用いて、キット手順書に従い単離した。第一ストランドｃＤＮＡをInvitrogen Superscript kit（Cat 11904-018）を用いて、キット手順書に従って合成した。

【0312】

重鎖及び軽鎖の可変領域は、最初に縮重したＰＣＲプライマー及びTaqポリメラーゼ（Roche）を用いて、Wang et al. J Immunol Methods. 233:167-77, 2000に記載の方法に基づいて増幅した。

【0313】

重鎖：左プライマー：
１：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣ （配列番号２）；
２：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ（配列番号３）；
重鎖：右プライマー：
ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号４）；
軽鎖：左プライマー；
ＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ（配列番号５）；軽鎖：右プライマー；
ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号６）；
ここで、ＲはＡ又はＧのいずれかであり；ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣのいずれかであり；ＭはＡ又はＣのいずれかであり；ＷはＡ又はＴのいずれかであり；ＳはＧ又はＣであり；そしてＹはＣ又はＴである。

【0314】

ＰＣＲ産物は、Invitrogen TOPO TA cloning（登録商標）kit（Cat #: 45-0641）を用いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）中にクローン化した。そしてＴ３及びＴ７プライマーを用いて配列決定した。次いで、配列を遺伝子バンクデータベースでBLAST検索して、全可変領域のクローニング用にリーダー配列を導き出した。データベースでのBLAST検索結果を基にして、以下のプライマー（Chardes et al., FEBS Letters 452:386-394, 1999）を、Pfxポリメラーゼ（Invitrogen）を用いて選択した。

【0315】

重鎖；
左プライマー；
ＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＲＴＣＣ（配列番号７）；
右プライマー；
ＣＧＡＣＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＧＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣ（配列番号８）；
軽鎖；
左プライマー；
ＷＴＣＴＣＴＲＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧ（配列番号９）；
右プライマー；
ＣＧＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧ（配列番号１０）；

【0316】

ＰＣＲ産物は、Invitrogen Zero Blunt（登録商標) TOPO（登録商標）ＰＣＲクローニング・キット (Cat 45-0245)を用いて、pCRBluntII(登録商標)-TOPO(登録商標)中にクローン化した。そしてＴ７プライマーを用いて配列決定した。
一度軽鎖及び重鎖の配列が決定すれば、核酸は、再コード化して（recoded）、例えばヒト宿主細胞での発現を最適化することができる。

【0317】

［実施例１２］
トランスフェクトーマ（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＯＭＡＳ）
ＮＳ０−ｅｕ細胞を、密度１×１０⁶細胞／ｍｌになるように増殖した。細胞を指数増殖期に保持し、培地をトランスフェクションの前日に変更した。トランスフェクションの当日、４０×１０⁶の細胞を洗浄した。次いで、軽鎖ＤＮＡなどの線状化した核酸（１０μｇ）、及び例えば線状化した重鎖ＤＮＡ（１０μｇ）を、細胞懸濁液（全ＤＮＡ体積を５０μｌ未満にすべきである）に加え、そしてその培養物を氷上で１５分間インキュベートした。ＤＮＡ及び細胞混合物を冷却したキュベット（０.４ｃｍ）に移し、そして電気的パルス（７５０Ｖ、２５μＦ）を印加した。電気的パルスを印加した後、キュベットを直ちに氷上に置き、そして１０〜１５分間氷上に保持した。細胞を収集し、プレート上に置いた。細胞を５％ＣＯ₂培養器内で１２〜１６日間、又はコロニーが出現するまでインキュベートした。細胞コロニーの上清、又は懸濁培地中の細胞成長をＥＬＩＺＡで試験した。陽性のトランスフェクトーマを、新鮮な培地でクローン化した。更に陽性のトランスフェクトーマをスクリーニングするため、滴定ＥＬＩＺＡ又はバイアコール（Biacore)アッセイのいずれかを行った。増殖したトランスフェクトーマをシェーカーフラスコ内に保持し、そして抗体又はその誘導体を上清から収集した。

【0318】

［実施例１３］
インビボ・アッセイ
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、確立したヒトＲＡモデルであるが、ＴＮＦαに対する抗体（Williams et al., PNAS 1992, 89:9784-9788）、及びＣＴＬＡ−４及びＴＮＦαの融合タンパク質に対する抗体（Webb et al., Eur J Immunol. 1996, 26:2320-2328; and Wooley et al., J Immunol. 1993, 151:6602-6607）の有効性を実証するために用いられている。ラット抗マウスＣＸＣＲ５モノクローナル抗体、クローン１０３８は、ＣＩＡモデルのマウスでその輪郭が示されるが、ここで、ＤＢＡ／１Ｊマウスは免疫され、チキンコラーゲンタイプＩＩで追加免疫された。疾患の重症度（これは動物足の腫脹／炎症の測定によって視覚的に評点されるが）は週２回モニタリングし、研究終了時に集めた関節を、炎症、パンヌス、軟骨破壊及び骨侵食における変化について評価した。クローン１０３８を、予防の投与計画で投与した場合、アイソタイプで処理されたマウスと比較して、疾患の重症度と関節病理の双方を有意に低下させた（反復測定ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０.０５）。

【0319】

インビボ走化性における１６Ｄ７−ＨＣ１−ＬＣ３の有効性を評価するために急性マウスモデルを採用した。簡潔に言えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び好中球など免疫担当細胞上でｈｕＣＸＣＲ５を選択的に発現するＣ５７／Ｂｌ６マウス（８〜１６週齢）は、ＣＤ１１ａプロモーターを用いる従来の伝統的な遺伝子組み換えによって作成された。インビボ走化性モデルは、好中球誘導モデル（neutrophil-driven model）である。ｈｕＣＸＣＬ１３リガンド（２０μｇ）（R&D）を腹腔内投与すると、ｈｕＣＸＣＲ５受容体を発現するマウス好中球は、ｈｕＣＸＣＬ１３グラジェントに応じて腹膜内空洞へ遊走した。ｈｕＣＸ
ＣＬ１３の腹腔内投与の８０分後、腹膜内空洞の洗浄により細胞を回収し、フルオロサイトメトリー分析を用いて、ｈｕＣＸＣＬ１３の注入に反応して腹腔内空洞内に特異的に遊走した、腹膜洗浄サンプル（２ｍｌ）中のｈｕＣＸＣＬ５発現好中球の数を定量した。好中球は、Ｌｙ６Ｇ、ＣＤ１９及びＣＤ１１ｂなどの表現型マーカーで同定した。ｈｕＣＸＣＬ１３の注入の２４時間前での、ヒト化抗ｈＣＸＣＲ５、１６Ｄ７−ＨＣ１ＬＣ３の２種類の異なった投与レベル（７．５μｇ又は１５μｇ）での皮下投与は、好中球のアイソタイプ陰性の対照のレベルと比較して、統計学的に差のないレベルを本質的に示す２種のＣＸＣＲ５抗体で処理されたサンプルと比較した場合、ｈｕＣＸＣＲ５発現好中球の、ｈｕＣＸＣＬ１３に反応した腹膜内空洞への遊走を低下させるのに有効であることが示された。１.５μｇでは、ヒト化ＣＸＣＲ５抗体は、試験したＣＸＣＲ５抗体のより高い用量と比較して、好中球遊走の阻害は低レベルであった。

【0320】

［実施例１４］
再表面形成（resurfacing）
マウス１６Ｄ７クローンの再表面形成は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:969、及び米国特許第５６３９６４１号に記載の工程に従った。
１６Ｄ７のＶ_L及びＶ_Hの配列は、核酸データバンク（Nucleic Acids Research, 28:235-242 (2000)）に対してＢＬＡＳＴ検索を行い、又はインターネットを経由してタンパク質データバンク（ＰＤＢ）にアクセス可能であり、それは、３Ｄの生体高分子の座標を含み、そして１６Ｄ７のアミノ酸配列に最も類似した１０個の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を検索した。ＰＤＢの同定コードは配列を同定するために用いた。

【0321】

可変軽鎖についての最も近い１０個のホモログは、
１ＭＪＵ（J Mol Biol 332:423-435, 2003）；
１ＡＥ６（Proteins 29:161-171, 1997）；
１ＱＹＧ（Pozharski et al., 「結合サイトの刻印：３種のコカイン類似体との複合体における抗コカイン抗体の構造研究」（"Carving a Binding Site: Structural Study of
an Anti-Cocaine Antibody" in "Complex with Three Cocaine Analogs"）；
１ＵＺＧ （J Virol 79:1223, 2005）；
１ＵＢ５（Beuscher et al., 「青及び紫蛍光温度での青蛍光抗体１９Ｇ２の構造及び力学」（"Structure and Dynamics of Blue Fluorescent Antibody 19G2 at Blue and Violet Fluorescent Temperatures"）；
１ＲＵＲ（Proc Natl Acad Sci USA 110:2247-2252, 2004,；
１ＦＰＴ (Nat Struct Biol 2:232-243, 1995）；
１ＱＦＵ（Nat Struct Biol 6:530-534, 1999）；
１ＮＡＫ（Virology 315:159-173 , 2003）；及び
１ＣＧＳ（J Mol Biol 236:247-274, 1994）；（余分な配列は除去した）
であり、そして可変重鎖についての最も近い１０個のホモログは、
１ＦＮＳ（Nat Struct Biol 7:881-884, 2000）；
１ＯＡＫ（Nat Struct Biol 5:189194, 1998）；
１ＶＦＢ（Proc Natl Acad Sci 91:1089-1093, 1994）；
１ＣＩＣ（Nature 348:254-257, 1990）；
１ＧＩＧ（Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50:768-777, 1994）；
１Ｔ４Ｋ（J Mol Biol 343:1269-1280, 2004）；
１Ａ７Ｐ（Marks et al.）；
１ＦＥ８（J Biol Chem 276:9985-9991 2001);
１ＤＬ７（J Exp Med 191:2101-2112, 2000）;及び
１ＹＹ８（Cancer Cell 7:301-311, 2005）；
であった。軽鎖及び重鎖についての最も近いホモログは、それぞれ、１ＭＪＵ及び１ＦＮＳであった。これら２つの配列は可変領域の相同性モデルを構築するために用いられ、そ
れは、続いて、ＣＨＡＲＭＭ２２力場を用いた、原子座標位置の共役勾配最少化法（J Comput Chem (1983) 4, 187; J Comput Chem (1986) 7, 591）により、ＭＯＥスイート（MOE suite）（Chemical Computing Group, Quebec, CA）で行われているように、エネルギー最少化される。そのモデルは、ＣＤＲ位置と、抗体分子のフレームワーク残基を位置づけるために用いた。個々の抗体可変領域についての１０個の最も近いホモログの可変領域残基に対する溶媒のアクセッシビリティーを計算し、Excelの表計算ソフトにおいて、Scitegic手順で行われているように平均化した（Hill & Lewicki (2006) Statistics: Methods and Applications, Statsoft, Tulsa, OK）。３０％を超える平均アクセッシビリティーを有する位置は、表面残基であると考えられた。２５％〜３０％の間の平均アクセッシビリティーを有する位置は、更に、ＣＤＲループへの近接に依存すると考えられた。

【0322】

マウス１６Ｄ７の可変領域の表面位置を、ヒト抗体配列における対応位置と比較した。３０％を超える接近可能な表面積を示すそれらの残基のみを、隣接溶媒に暴露される残基である、２５％を超える接近可能な表面積を示すいくつかの残基と共に、探索のため保持した。全ての免疫グロブリン配列におけるいくつかの保存された残基を、探索の集束性を高めるために含めた。生殖細胞系の配列のみ、ヒットしたものを分析するために保持した。最も同一性の高い表面残基を備え、ＣＤＲから５オングストローム以内に入る位置に特別考慮して、ヒト抗体可変領域の表面を、マウス１６Ｄ７抗体の可変領域の表面残基を置換するために選択した。

【0323】

いずれの配列も、公知の、免疫エピトープデータベース（IEDB, Immune Epitope Database and Analysis Resource web site; PLoS Biol. 2005;3(3):e91）に掲記されたＢ細胞又はＴ細胞のエピトープを含まなかった。

【0324】

マウス１６Ｄ７の可変領域の元の配列は：
軽鎖（ＣＤＲ部は下線を付した）；
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰＲＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶ ＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰ ＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥ ＩＫ（配列番号１１）；及び
重鎖（ＣＤＲ部は下線を付した）；
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＲＫＤＮＳＱＳＱＶＦＬ ＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１２）；
であった。

【0325】

軽鎖の探索のために表面残基の残されたセットとしては、Ｄ１、Ｖ３、Ａ７、Ｐ９、Ｐ１５、Ｒ１６、Ｅ１７、Ｓ１８、Ｐ４５、Ｇ４６、Ｑ４７、Ｄ６５、Ｒ７９、Ｒ８２、Ｅ８６、Ｋ１０８、Ｅ１１０及びＫ１１２が含まれた。

【0326】

軽鎖のための検索要求は、上記で定義された表面残基のセットであり、そしてＢＬＡＳＴ検索のプロトコールの集束のために含められた保存されたアミノ酸、Ｃ２３、Ｗ４０、Ｑ４３、Ｙ９１、Ｃ９３、Ｆ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０６及びＴ１０７を含む。全てのその他のアミノ酸は、２０個の天然アミノ酸のいずれかであり得る。ＢＬＡＳＴ検索は、ＩＭＧＴ（International Immunogenetics Information Systems website, Molec Immunol,
2004, 40:647-659）で編集された、ヒト遺伝子ライン抗体位配列のデータベースに対して為された。最も良好に合致したものは、軽鎖ＬＣ４から誘導されたＸ７２４８２（タンパク質＿ｉｄ＝ＣＡＡ５１１５０．１）であることが見出された。ＬＣ５及びＬＣ６は、軽鎖における潜在的な問題残基に対処することが示唆されるＶＬ４（ＶＬは可変軽鎖を意
味する）の２つの変異体：Ｌｅｕ（ＬＣ５＆ＬＣ６）に突然変異された１個の暴露されたメチオニン（Ｍ５１）、及びアスパラギンＮ５３がセリン残基に変わっている１つの可能性のある脱アミド化サイト（ＬＣ６）である。合計して、３つのバージョンが、親マウス１６Ｄ７クローンに比較した場合、４〜６個の突然変異を含む可変軽鎖に対して提案された。対応する突然変異を以下の表１に示す。逐次及びKabatナンバリングで示される。

【0327】

可変重鎖に対する表面残基の保持されたセットとしては、Ｑ１、Ｑ３、Ｋ５、Ｓ７、Ｐ９、Ｌ１１、Ｓ１５、Ｑ１６、Ｓ２０、Ｐ４１、Ｇ４２、Ｋ４３、Ｓ６１、Ａ６２、Ｋ６４、Ｓ６５、Ｒ７０、Ｓ７４、Ｑ７５、Ｑ８６、Ｔ８７、Ｄ８８、Ｑ１０３、Ｌ１０６、Ａ１１１、Ａ１１２及びＫ１１３（逐次ナンバリング）が挙げられる。検索の集束のためのＢＬＡＳＴ検索要求に含まれる不変アミノ酸としては、Ｃ２２、Ｗ３６、Ｉ３７、Ｑ３９、Ｄ８９、Ｙ９３、Ｃ９５、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１０４及びＴ１０５がある。ＢＬＡＳＴ探索は、ＩＭＧＴで編集されたヒト生殖細胞系抗体配列データベースに対して為された。重鎖（ＨＧ３）に対する１つのバージョンを保持した。ＡＦ０６２２６６（タンパク質＿ｉｄ＝ＡＡＣ１８３０４．１）及びＡＹ３９３０８２（タンパク質＿ｉｄ＝ＡＡＳ８６０１８．１）の２つのＶ_H領域は、これは表面残基セットに対して最も良好な合致スコアを示したが、等価の類似性スコアを示し、そして同一の表面残基を示した。その結果、重鎖について、１０個の突然変異を有する単一の配列のみが保持された。異なった表面残基を有するより低いスコアリングを有する配列は、潜在的に溶解性をより低下させる極性の低い残基を有するので保持されなかった。

【表1】

【0328】

軽鎖に対して、３つのバージョン（ＬＣ４、ＬＣ５及びＬＣ６）が提案された。可変鎖の再表面化を通して導入された個々の突然変異は小文字で記載され、そして下線が付され、合わせてＣＤＲ部も下線が付されている。可変領域の再表面化配列を以下にリストアップするが、不変領域（ＩｇＧ４）は含まれていない。
ＬＣ４：
ＤＩＶＭＴＱｓＡｌＳ ＶＡＶＴＰｇＥＳＶＳ ＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬ ＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷ ＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱ ＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ ＧＳＧＴＡＦＴＬｋＩ ＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶ ＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰ ＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥ
ＩＫ（配列番号１３）；
ＬＣ５：
ＤＩＶＭＴＱｓＡｌＳ ＶＡＶＴＰｇＥＳＶＳ ＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬ ＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷ ＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱ ＬＬＩＹＲｌＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ ＧＳＧＴＡＦＴＬｋＩ ＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶ ＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰ ＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥ
ＩＫ（配列番号１４）；
ＬＣ６：
ＤＩＶＭＴＱｓＡｌＳ ＶＡＶＴＰｇＥＳＶＳ ＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷ ＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱ ＬＬＩＹＲｌＳｓｎＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ ＧＳＧ
ＴＡＦＴＬｋＩ ＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶ ＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥ ＩＫ（配列番号１５）。

【0329】

１つのバージョンは重鎖（ＶＨ３）について提案された（ＶＨは可変重鎖を意味する）。可変鎖の再表面化を通して導入された個々の突然変異は小文字で記載され、そして下線が付され、かつＣＤＲ部も下線が付されている。不変領域配列（ＩｇＧ４）は含まれていない；
ＨＣ３：
ＱＶＱＬｑＥＳＧＰＧ ＬＶＡＰＳｅＳＬＳＩ ＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮ ｐｓＬＫＳＲＬＳＩｓ ＫＤＮＳｋＳＱＶＦＬ ＫＭＮＳＬｔａａＤＴ ＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ ｓ（配列番号１６）。

【0330】

ヌクレオチド配列は、ＯＥ−ＰＣＲにより作成され、そしてエピソーム発現ベクターｐＸＬ４２１４のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化された（Durocher et al.,
NAR, 2002, 30(2), E9）。配列は、ヒト細胞における発現用としてコドンの最適化を行った。Ｖ_Lは、ＩＧＫＣ（ＡＡＨ９３０９７）と融合した。Ｖ_Hは、ＩＧＨＧ４（ＡＡＨ２５９８５）と融合し、Ｃ−末端のＬｙｓ（ＩＧＨＧ４ΔＫ）が欠けていた。配列は、二重鎖配列決定法により検証された。

【0331】

ＬＣ４：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＳＡＬＳＶＡＶＴＰＧＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号１８）；
ＬＣ５：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＳＡＬＳＶＡＶＴＰＧＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＬＳＮＬＡ
ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号２０）；

【0332】

ＬＣ６：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＳＡＬＳＶＡＶＴＰＧＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＬＳＳＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２１）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧ
ＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号２２）；

【0333】

ＨＣ３：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＥＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＴＡＡＤＴＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２３）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣ
ＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号２４）。

【0334】

［実施例１５］
ヒト化
１６Ｄ７のＶ_L及びＶ_H配列をＢＬＡＳＴ検索し、そして可変軽鎖の最も近いホモログは、１ＭＨ５、１ＭＪＪ及び１ＭＪＵ（J Mol Biol 332:423-435, 2003)であって、等価の類似性スコアを有した。１ＭＪＵは、１．２２オングストロームの解像度で測定された高い正確さの結晶構造故にテンプレートとして保持された。重鎖の最も近いホモログは、１ＦＮＳであることが見出された（Nat Struct Biol 7:881-884, 2000）。構造、１ＭＪＵ及び１ＦＮＳ、を用いて可変ドメインのホモロジーモデルを構築し、それは、続いて標準手順を用いてエネルギー最小化された。１６Ｄ７の３Ｄ相同モデルの分子力学（ＭＤ）の計算は、続いて、一般化Bornインプリシット溶媒（generalized Born implicit solvent）（Gallicchio & Levy, J Comput Chem 2004, 25:479-499を参照）中で、１．７ナノ秒間行なった。

【0335】

ＭＤは、２９８．１５°Ｋでのガウス分布からの速度の初期化で開始し、次いで３００ｐｓの平衡期間が続いた。ＭＤの間、全ての結合を、SHAKEアルゴリズムを用いて拘束し（Barth. Etal., J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209を参照）、時間ステップはフェムト秒（ｆｓ）であり、そしてVerlet積分アルゴリズムに基づくシミュレーションは、正準ＮＶＴ（粒子の数、体積及び温度）集団（ensemble）で、２９８．１５°Ｋの温度にて行なった。生成期間中、１，７００のスナップショットが、１ｐｓ毎に１つ保存された。マウス抗体の１，７００の立体配座は集合を構成し、それについて、最も柔軟性のある残基を同定するために以下の分析を行った。ＭＯＥ分子モデリング環境（Molecular Operating Environment (MOE), Chemical Computing Group, Quebec, Canada）内において利用可能である科学計算用ベクトル言語（Scientific Vector Language (SVL)）を用いて、以下の分析をコード化した。第１に、各スナップショット、Ｎは、場合により、ＭＤのモデリング及び計算中発生する全体の回転及び並進運動を制御するため、その前のスナップショットデータ、Ｎ−１に最適に重ね合わされた。重ね合わせは、２つのスナップショットからの対応する原子の全てのペア間の平均二乗距離の平方根（Root Mean Square Distance (RMSD)）を最小化することにより得られた。重ね合わせの実行において、抗体骨格の重い原子のみが考慮された。同様の重ね合わせ方法を用いて、各々のスナップショットはメドイド（medoid）スナップショットに重ね合わせた。メドイド・スナップショットは、全ての立体配座の平均座標から最も近いデカルト（Cartesian）座標を備えた抗体の立体配座である。

【0336】

各抗体残基ｉについて、立体配座ｊとメドイド参照立体配座ｋの重い原子の間のＲＭＳＤを計算した。ＲＭＳＤは次式：

【数1】

式中、ｄ_lkは残基ｊの重い原子ｌとそのカウンターパートのメドイド参照立体配座ｋの間のオングストロームで表わされるユークリッド（Euclidesn）距離として定義される；
を有する。重い原子ｌの対合（pairwise association）について、アミノ酸、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒについての側鎖の重い原子の対称性も考慮した。参照立体配座ｋは残基毎に変化し、そして検討した残基ｉのすべての立体配座の平均座標への最も近いユークリッド（Euclidesn）距離を有するメドイド立体配座ｋに相当する。次いで、各々の残基ｉについて、１,７００のＲＭＳＤ値の分布が得られ、それはＭＤ中の残基ｉの座標変化を反映するものでった。検討した抗体の全ての残基の全てのＲＭＳＤ
値を集合することにより、全てのＲＭＳＤのグローバル分布が得られ、全てのＲＭＳＤのグローバル分布は、次に、参照分布として使用された。残基ｉが高度に柔軟性があるならば、残基ｉの観察された平均ＲＭＳＤ、ｍ_i、が全ての残基ｍ_gに対するグローバル平均ＲＭＳＤより有意に高いかどうかを決定するために、統計的検定を行った。サンプルが大きいので（例えば、クローン１６Ｄ７の分析に対して１,７００）、「観測されたｍ_i値は、グローバルｍ_g値より低い」という帰無仮説での片側ｚ検定（one-tailed Z-test）（Dorofeev & Grant, 「現実のサンプル調査の統計学、非簡略化ランダムサンプル及び重み付けデータ」（“Statistics for real-life sample surveys. Non-simple-random samples and weighted data”）2006. Cambridge University Press）を用いて、統計的因子Ｚ_iを、次式：

【数2】

式中、ｍ_iは残基ｉのＲＭＳＤ分布から計算された平均ＲＭＳＤであり、ｍ_gはグローバルＲＭＳＤから計算された平均ＲＭＳＤであり、ｓｄ_iは残基ｉのＲＭＳＤ分布から計算された標準偏差であり、そしてｎはサンプルサイズであり、即ち、１６Ｄ７クローンの分析についてはｎ＝１７００である；
に従って計算した。計算されたＺ_iは、次に、有意水準９９．９％レベルの対立仮説、即ち、「観測値ｍ_iはグローバルｍ_gより高い」ことを評価するために、標準的な正規分布の累積確率と比較した。それは、Ｚ_i≧３．０８に対応する。統計値Ｚ_iは、柔軟性スコアとして見ることができ、分子量又は抗体残基の重い原子の数とは相関しない（１６Ｄ７抗ＣＸＣＲ５モデルのＭＤを分析する場合、ｒ²＝０．０１４及び０．０００９である）。

【0337】

軽鎖についての柔軟性残基のセットは、以下の残基（逐次ナンバリング）：Ｄ１、Ｔ１４、Ｐ１５、Ｒ１６、Ｅ１７、Ｑ４７、Ｄ６５、Ｓ７２、Ｒ７９、Ｒ８２、Ｅ８６、Ｋ１０８、Ｅ１１０及びＫ１１２を含み；そして、重鎖については、以下の残基：Ｑ１、Ｖ２、Ｑ３、Ｌ１１、Ｓ１５、Ｑ１６、Ｓ６１、Ａ６２、Ｋ６４、Ｓ６５、 Ｒ７０、Ｄ７２、Ｑ７５、Ｋ８１、Ｍ８２、Ｎ８３、Ｑ８６、Ｑ１０３、Ｓ１１０、Ａ１１１、Ａ１１２及びＫ１１３を含む。１６Ｄ７の柔軟部分を、２００５年９月版のImMunoGeneTics データベース・ウェブサイトにおけるヒト抗体配列の対応する部分と比較した。

【0338】

有意に高い柔軟性スコアを示すこれらの残基と、柔軟性残基の３Ｄ構造を保持する幾つかのフランキングの残基は、検索のため保持された。
最も同一性の高い柔軟性残基を有するヒト抗体可変領域が、ＣＤＲの５．０オングストローム以内に入る位置に特別に配慮して、マウス１６Ｄ７の抗体可変領域の柔軟性残基を置換するために選択された。得られたヒト化配列は、UniProtKB/SwissProtデータベースにおいて配列の同一性をＢＬＡＳＴ検索し、合理的な仮定が為されていることの確信を得た。全ての配列は、多くのヒト抗体に対して高度に類似性を示した。更に、いずれの配列も、ＩＥＤＢデータベースにリストアップされた公知のＢ細胞又はＴ細胞エピトープを含んでいなかった。

【0339】

軽鎖（ＬＣ１、ＬＣ２及びＬＣ３）の場合、ＩＥＤＢにおいて最もよく合致した配列は、ＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡ（配列番号２５）であり、それはＣＤＲ２をカバーするが、しかし、ＩＥＤＢデーターベース内でのＢＬＡＳＴ検索から得られた５６％の配列同一性によって代表されるように、有意な残基の差異を有する。

【0340】

重鎖（ＨＣ１及びＨＣ２）の場合、ＩＥＤＢにおける最もよく合致した配列は、ＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＩ（配列番号２６）であり、それはＣＤＲ３のスタート前に位置してい
る。その配列は、ペプチドＳＥＤＳＡＬＹＹＣＡＲＤ（配列番号２７）と６１％の配列同一性を示し、そのため潜在的なヒトＴ細胞エピトープとは思えない（J. Exp. Med., (1995), 181, 1540）。

【0341】

マウス１６Ｄ７可変領域の元の配列は：
軽鎖（ＣＤＲ部は下線を付した）：
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰＲＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥ ＩＫ（配列番号２８）；そして
重鎖（ＣＤＲ部は下線を付した）：
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＲＫＤＮＳＱＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ Ａ（配列番号２９）。

【0342】

重鎖（ＨＣ１＆ＨＣ２）について２つのバージョン、及び軽鎖について３つのバージョン（ＬＣ１、ＬＣ２及びＬＣ３）が示唆された。重鎖の両バージョンは、ＡＦ２６２０９６／ＡＡＦ７９９８７及びＡＢ０６３６５７／ＢＡＣ０１２８５．１からそれぞれ誘導される。２つの配列は、等価な類似性スコアを示すが、しかし、突然変異を起こさせる残基のセットは相対的に異なるように見え、そして異なった物理化学的特性を示すため保存した。ＬＣ１配列は、ＢＡＣ０１６８２／ＡＢ０６４０５４．１から誘導され、そして突然変異を起こすのは２つの残基のみである。ＬＣ２及びＬＣ３は、軽鎖における潜在的な問題残基に対処することが示唆されるＬＣ１の変異体：Ｌｅｕに突然変異した露出されたメチオニン（Ｍ５１）（バージョン３及び４）及びアスパラギン、Ｎ５３、がセリン残基に変っている１つの潜在的脱アミド化部位である。これら全ての組合せが保持されたわけではないが、しかし４つは対処すべき最も重要な点をカバーしている。Kabatナンバリングを用いている。

【0343】

【表2】

【0344】

可変鎖のヒト化を経由して導入された突然変異は小文字で示し、かつ、下線を付し、そしてＣＤＲは下線を付した。不変領域は含まれていない。
ＬＣ１：
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰｇａＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷ ＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶ ＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥ ＩＫ（配列番号３０）；
ＬＣ２：
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰｇａＳＶＳ ＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷ ＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲｌＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶ ＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３１）；
ＬＣ３：
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰｇａＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷ ＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲｌＳｓＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬ
ＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶ ＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３２）；
ＨＣ１：
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳｅＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮｐｓＬＫＳＲＬＳＩｓＫＤＮＳｋＳＱＶＦＬＫｖｔＳＬｔＴＤＤＴ ＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号３３）；
ＨＣ２：
ｅＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰｇｇＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮａｐＬＫｇＲＬＳＩｓＫＤＮＳｋＳＱＶＦＬｑＭＮＳＬｋＴＤＤＴ ＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳｓ （配列番号３４）

【0345】

キメラコンストラクトの配列は、以下の通りである：
キメラＬＣ配列
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰＲＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３５）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号３６）；

【0346】

キメラＨＣ配列
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＲＫＤＮＳＱＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥ
ＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３７）；

【0347】

ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号３８）；

【0348】

ヒト化ＶＬ配列
ＬＣ１：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰＧＡＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（
配列番号３９）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号４０）；

【0349】

ＬＣ２：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰＧＡＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＬＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４１）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号４２）；

【0350】

ＬＣ３：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰＧＡＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＬＳＳＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４３）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号４４）；

【0351】

ヒト化ＶＨ配列
ＨＣ１：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＥＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＶＴＳＬＴＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４５）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＴ
ＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ（配列番号４６）；

【0352】

ＨＣ２：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＧＧＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮＡＰＬＫＧＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＱＭＮＳＬＫＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４７）；
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧ
ＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ （配列番号４８）。

【0353】

［実施例１６］
分子動力学トラジェクトリーに基づくヒト化
１６Ｄ７のＶ_L及びＶ_H配列をタンパク質データベース（ＰＤＢ）でBLAST検索し（Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28 :235-242)、そして可変軽鎖の最も近いホモログは、１ＭＨ５、１ＭＪＪ及び１ＭＪＵ（J Mol Biol 332:423-435, 2003)であり、等価の類似性スコアを有する。１ＭＪＵは、最大で１．２２オングストロームの解像度で測定されている高い正確さの結晶構造故にテンプレートとして保持された。重鎖の最も近いホモログは、１ＦＮＳであることが見出された （Nat Struct Biol 7:881-884, 2000）。構造、１ＭＪＵ及び１ＦＮＳは、続いて標準的手順を用いてエネルギー最小化された可変ドメインのホモロジーモデルを構築するために使用された。

【0354】

１６Ｄ７の３Ｄ相同性モデル（ＭＤ）の分子動力学シミュレーションを、続いて一般化Bornインプリシット溶媒（Gallicchio & Levy, J Comput Chem 2004, 25:479-499参照）において１.１ナノ秒（ｎｓ）間行なった。ＭＤシミュレーションは５００Ｋでのガウス分布からの速度の初期化により開始し、その後２００ピコ秒（ｐｓ）の平衡期間が続く。ＭＤシミュレーション中、すべての結合をSHAKEアルゴリズム（Barth. et al., J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209参照）を用いて拘束し、時間ステップは１フェムト秒（ｆｓ）で、そしてVerlet積分アルゴリズムに基づいたシミュレーションを、基準ＮＶＴ（粒子の数、体積及び温度）集合で５００Ｋの温度にて行なった。このシミュレーションは、骨格原子に加えられる調和拘束（harmonic constraint）によって行なわれる。１０の多様な立体配座が、この最初のシミュレーションの最後の１ｎｓ間に１００ｐｓ毎に１つ引き出される。

【0355】

これらの１０の多様な立体配座は、次いで骨格上の拘束なしに、一般化Bornインプリシ
ット溶媒中で、２.３ｎs間３００Ｋの温度で、１０の分子動力学シミュレーションを行なうために１０の多様な開始点として使用される。各ＭＤシミュレーションは２９８.１５Ｋでのガウス分布からの速度の初期化により開始し、その後３００ｐｓの平衡期間が続く。すべての結合をSHAKEアルゴリズム（Barth. et al., J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209参照）を用いて拘束し、時間ステップは１ｆｓで、そしてVerlet積分アルゴリズムに基づいたシミュレーションを、正準ＮＶＴ（粒子の数、体積及び温度）集合で２９８.１５Ｋの温度にて行なった。次いで、生成期間中、２，０００のスナップショットが１ｆｓ毎に１つ保存された。ＭＯＥ分子モデリング環境、(Molecular Operating Environment (MOE)、Chemical Computing Group, Quebec, Canada) 内で利用可能な、科学計算用ベクトル言語（Scientific Vector Language） (ＳＶＬ)が以下の処理後プロトコールをコードするために使用された。

【0356】

最初に、各スナップショットＮは、ＭＤモデリング及び計算の間に起こる全体の回転及び並進運動を切り捨てるために、その前のスナップショット、スナップショットＮ−１上に最適に重ね合わせた。重ね合わせは、２つのスナップショットから対応する原子の全ペア間の平均二乗距離の平方根（ＲＭＳＤ）を最小化することにより得られた。抗体骨格の重い原子のみが重ね合わせ操作において考慮された。同じ重ね合わせ法を用いて、各スナップショットは次いでメドイド（medoid）スナップショット上に重ね合わせた。メドイド・スナップショットは、全立体配座の平均座標から最も近いデカルト（Cartesian）座標を備えた抗体の立体配座である。各１０ＭＤシミュレーションについて、最後の２，０００の立体配座が、マウス抗体の各アミノ酸について、アミノ酸のメドイド立体配座に関する原子位置の偏差を定量化するために使用される。各抗体残基ｉについて、立体配座ｊ及びメドイド参照立体配座ｋの重い原子間のＲＭＳＤを算出した。ＲＭＳＤは次式：

【数3】

式中、ｄ_lkは残基ｊの重原子ｌとそのカウンターパートのメドイド参照立体配座ｋの間のオングストロームで表わされるユークリッド距離として定義される；
を有する。重い原子ｌの対合について、アミノ酸、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ及びＴｙｒの側鎖の重い原子の対称性も考慮した。参照立体配座ｋは残基毎に変化し、そして検討した残基ｉの全立体配座の平均座標への最も近いユークリッド距離を有するメドイド立体配座ｋに相当する。

【0357】

ヒト化突然変異は、ヒト抗体生殖細胞系が、それらの最も柔軟なアミノ酸の観点からマウス抗体と最も類似しているかを定量することにより見出される。そうするために、マウス抗体の６０の最も柔軟なアミノ酸の動きを、分子動力学シミュレーションの２０ｎｓ（１０×２ｎｓ）の間、ヒト抗体生殖細胞系の４９の相同性モデルの対応するアミノ酸の動きと比較するが、その各々について１０回の分子動力学シミュレーションを、同じプロトコールを用いて行なった。ヒト抗体生殖細胞系の４９の３Ｄ相同性モデルは、７つの最高頻度ヒト軽鎖（ｖκ１、ｖκ２、ｖκ３、ｖκ４、ｖλ１、ｖλ２、ｖλ３）及び７つの最高頻度ヒト重鎖（ｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）によって構築された（Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597)。

【0358】

６０の最も柔軟なアミノ酸は、ＣＤＲにおけるいずれのアミノ酸も除外し、そしてその直近隣接、即ち３Ｄ相同性モデルに見られるようにＣＤＲアミノ酸のいずれのα炭素に対しても５オングストローム未満の距離にα炭素を有するアミノ酸を除外する。

【0359】

柔軟性は、所定のアミノ酸（ｉ）のＲＭＳＤ（Ｆｉ）を、既に定義した１０回の分子動力学シミュレーションにわたって平均化したそのメドイド立体配座と、そして同じ１０回の分子動力学シミュレーションにわたって平均化したマウス抗体の全アミノ酸のＲＭＳＤ（Ｆｍ）と比較することにより定量化される。Ｚｉ＝（Ｆｉ−Ｆｍ）／Ｆｍとして定義した柔軟性スコアＺｉが０．１５を超える場合、アミノ酸はＴ細胞受容体と相互作用し、そして免疫応答を誘発する可能性があるほどに十分柔軟性であると考えられる。
柔軟性推定プロトコールを平均化したこの分子動力学を用いて、２３アミノ酸は、ＣＤＲ領域及びその直近隣接を除外してマウス１６Ｄ７抗体の可変領域において柔軟性であると考えられた。

【0360】

軽鎖の柔軟性残基のセットは、以下の残基（逐次ナンバリング）：Ｒ１６、Ｅ１７、Ｒ４４、Ｇ４６、Ｑ４７、Ｓ４８、Ｒ７９、Ｒ８２、Ｅ８４、Ｅ８６、及びＥ１１０；そして重鎖では以下の残基Ｋ５、Ｐ４１、Ｇ４２、Ｋ４３、Ｋ６４、Ｒ７０、Ｄ７２、Ｎ７３、Ｓ７４、Ｑ７５、Ｑ８６、及びＱ１０３を含む。

【0361】

４９のヒト生殖細胞系相同性モデルに対するマウス抗体の四次元類似性は、特有の三次元立方格子を利用して、１０回の分子動力学シミュレーションの全ピコ秒スナップショットを用いて、６０の柔軟性アミノ酸の特定原子の位置をサンプリングすることによって定量化される。この格子は１オングストロームの解像度を有する。三次元格子は４４５，７４０点で作られ、そして抗体に基づくヒト抗体結晶学的モデルの三次元構造、８ＦＡＢ (Biochem 30:3739-3748, 1991）を用いて開始している。８ＦＡＢモデルは、三次元格子においてサンプリングされる抗体のすべてのピコ秒スナップショット立体配座を位置決めするためにも使用される。この目的のために、抗体の分子動力学のメドイド立体配座が８ＦＡＢモデルに重ね合わされる。この重ね合わせは２つのモデルの慣性モーメントを整列すること（aligning）から成り、続いて両モデルのα炭素間のスカラー距離の最小化が行なわれる。分子動力学シミュレーションのすべての残りの立体配座は、同じ方法を用いてメドイド立体配座に重ね合わされる。

【0362】

比較される１対の抗体について、２つの類似性（静電類似性及び親油類似性）をもたらす２タイプのサンプリングが行なわれる。これらの２つの類似性は、次いで全類似性を得るために加えられる。静電サンプリングは、アミノ酸側鎖のすべての原子を考慮する。格子の１点、ｘでの値は、Amber99力場（Cieplak et al.; J. Comp. Chem. 2001, 22 :1048-1057）に記載の原子部分電荷で重み付けされた、三次元ガウス関数ｆ（ｘ）を適用することにより得られる。ｆ（ｘ）関数は、以下の式：

【数4】

式中、ｘ及びｕは、それぞれ格子点及びサンプリングしたアミノ酸原子のデカルト座標であり、そしてｓ＝ｒ／１．６（ｒ＝原子の共有結合半径（covalence radius））である；
を用いて３つのデカルト座標軸に適用される。サンプリングはアミノ酸のすべての立体配座で繰り返され、そして得られた結果は三次元格子の全点で平均化される。親油サンプリングは、アミノ酸側鎖の親油性原子のみを考慮する。格子の１点での値は重み付けなしに同じガウス関数ｆ（ｘ）で計算される。結果として、比較されている２つの抗体の分子動力学シミュレーションからの、ピコ秒スナップショット立体配座の２つのアンサンブルは、同じ三次元格子によりサンプリングされる。抗体ａと抗体ｂ間の静電類似性（ｓｉｍ−ｅｌｅｃ）は、以下の式：

【数5】

で計算することができる。親油類似性は、同じ式を既述の親油サンプリングで生成されたデータに適用して計算される。

【0363】

ヒト生殖細胞系モデルｖλ２−ｖｈ４は、マウス抗体１６Ｄ７の６０の最も柔軟性であるアミノ酸に関して、その６０の最も柔軟性であるアミノ酸の最大四次元類似性（全類似性＝５０％）を示す。ヒト生殖細胞系モデルｖλ２−ｖｈ４は、次いで１６Ｄ７柔軟性残基を置き換えるために使用された。予め、２つの配列のアミノ酸は対応する３Ｄ相同性モデルのα炭素の最適重ね合わせに従ってアラインされた。不要なモチーフは、上記の段落４１に既述のＢＬＡＳＴ検索を用いて、得られたヒト化配列において検索された。加えて、公知のＢ細胞又はＴ細胞エピトープが、上記の段落４４に記載のＩＥＤＢデータベースを用いて、得られたヒト化配列において検索された。

【0364】

軽鎖（ＬＣ７）についてＩＥＤＢにおける最良の配列適合（match）は、ＣＤＲ２をカバーするＰＧＫＡＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬ（配列番号５２）であった。この配列はＨＬＡ−ＤＲＢ１ ０４０４^*への結合を示すペプチドＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬ（配列番号５３）と７３％の配列同一性を示すが、ヒトでの免疫原性は立証されていない (J Immunol (1995) 155, 5655)。

【0365】

重鎖（ＨＣ４及びＨＣ５）についてＩＥＤＢにおける最良の適合は、ＣＤＲ１をカバーするＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰＰＧ（配列番号５４）であったが、ＩＥＤＢデータベース内でのＢＬＡＳＴ検索から得られた４０％配列同一性により代表されるものとは、有意な残基の相違を有する。

【0366】

重鎖（ＨＣ４及びＨＣ５）について２つのバージョン及び軽鎖（ＬＣ７）について１つのバージョンが得られた。重鎖の両バージョンはヒト生殖細胞系モデルｖλ２−ｖｈ４に由来する。ＨＣ５は、潜在的な問題残基：アスパラギン、Ｎ６０がプロリン残基に変えられる１つの潜在的脱アミド化部位に対処するための、付加的突然変異を有するＨＣ４の変異体である。

【0367】

可変鎖のヒト化を通して導入された突然変異は小文字で示され、下線が付与され、ＣＤＲも下線が付与されている。定常領域は含まれていない。
ＬＣ７：
ＤＩＶＭＴＱＡＡＰＳＶＡＶＴＰｇｑＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹＷＦＬＱｈＰＧｋａＰＱ ＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬｔＩＳｇＶｑＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰ ＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ （配列番号５５）
ＨＣ４：
ＱＶＱＬｑＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩｓＫＤｔＳｋＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬｔＴＤＤＴ ＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫ （配列番号５６）
ＨＣ５：
ＱＶＱＬｑＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＤＧＴＴＹＹｐＳＡＬＫＳＲＬＳＩｓＫＤｔＳｋＳＱＶ
ＦＬＫＭＮＳＬｔＴＤＤＴ ＡＭＹＹＣＡＲＩＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫ （配列番号５７）

【0368】

【表3】

【0369】

［実施例１７］
薬物動態学
本研究は、適切な数の動物（例えば、１試験に４匹；単回投与で２匹及び反復投与で２匹、週５回投与）、２.０〜５.４ｋｇ体重及び２〜７歳の範囲の健常な専用飼育雄カニクイザルで行なわれた。動物は、２処置群に割り付けて、１群には対照ＩｇＧ４抗体を投与し、１群にはヒト化１６Ｄ７を投与した。各群のサルには、例えば、２〜３ｍＬ／ｋｇの投与量で２.５〜１０ｍｇ／ｋｇを単回静脈内ボーラスで、又はｉ.ｖ.で週５回投与した。血液サンプルは、各用量投与後種々の時点で採取し、血漿にまで処理した。血漿サンプルは、ＥＬＩＳＡを用いてＩｇＧ４及びＣＸＣＲ５のｍＡｂの総濃度を分析した。

【0370】

［実施例１８］
比較研究
幾つかの本抗体を並列実験で市販の抗体と比較した。R & D Systemsから入手できるＭＡＢ１９０は、マウスｍＡｂである。ＲＦ８２Ｂは、BDから入手できる抗ヒトＣＸＣＲ５である。クローン２Ｃ１は、Abnovaから入手可能なＧＳＴタグを有するマウスｍＡｂである。本明細書に記載の種々のヒト化抗体は、当技術分野で公知の試薬及び方法を用いてアイソタイプを判断した。例えば、本明細書に示されるものはκ軽鎖を有し、多くはＩｇＧ１であるが、一方で４６Ｃ９、６８Ｄ３、Ｈ２８はＩｇＧ２ａである。大部分の抗体は、
ＣＸＣＲ５のアミノ末端に結合し、そして幾つかの抗体は、互いに同じエピトープ又は領域に結合するために競合する。

【0371】

ＢＤ抗体は、ヒトＰＢＭＣに良好には結合しなかった。
一方、その抗体は一般的にカニクイザルの細胞に結合しなかったが、本発明の１４Ｃ９、１９Ｈ５、Ｈ２８、５４Ｇ６、５６Ｈ６及び７９Ｂ７は結合した。
１６Ｄ７は市販抗体よりも少なくとも１０倍高い親和性で、そして他の抗体よりも１００倍かけ離れて優れていることが見出された。

【0372】

［実施例１９］
スケールアップ
各モノクローナル抗体変異体は、懸濁培養によるHEK293 FS（商標）細胞で、293fectin（商標）(Invitrogen)を用いて複合体化された重鎖又は軽鎖をコードする、２つの発現プラスミドの一過性のトランスフェクションによって生産された。分泌タンパク質は、トランスフェクション後８日で採取し、遠心分離した。タンパク質は、２５ｍＭクエン酸、ｐＨ３、０.１５ＭＮａＣｌ緩衝液でカラムから溶離後プロテインＡ（ProSepvA, Millipore）でのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。モノクローナル抗体はＰＢＳで製剤化し、０.２２μｍで濾過した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度測定により定量した。各バッチは、還元又は非還元下にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Nupage Bistris/ MES-SDS 10％) によって分析して、各サブユニット及び単量体の純度及び分子量を決定した。各タンパク質ロットも、ゲル濾過（Tricorn 10/300 GL Superdex 200）で分析して、単量体の均質性及び高分子量種の存在を測定した。

【0373】

２４０ｍＬの培養液から、総量で３０〜４０ｍｇの８種の１６Ｄ７変異体モノクローナル抗体が得られ、そしてその後のインビトロ及びインビボ試験の結果適切な品質を有していた。

【0374】

当業者は、単に型どおりの実験だけを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様の多くの等価物を理解し又は確認するであろう。このような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]