特許 5750785 乳酸菌増殖促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5750785

(24)【登録日】2015年5月29日

(45)【発行日】2015年7月22日

(54)【発明の名称】乳酸菌増殖促進剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20150702BHJP

   A23C 9/133 20060101ALI20150702BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   A23C9/133

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2011-536186(P2011-536186)

(86)(22)【出願日】2010年10月15日

(86)【国際出願番号】JP2010068119

(87)【国際公開番号】WO2011046194

(87)【国際公開日】20110421

【審査請求日】2013年7月25日

(31)【優先権主張番号】特願2009-238208(P2009-238208)

(32)【優先日】2009年10月15日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-6

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-7

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】杉山 政則

【審査官】 田中 耕一郎

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−２９５３５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−０３７５０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２８２５２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０５２１１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０１−１７９６４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０３−１７２１７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第２８３５５４８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特開２００９−１５３４１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４１７７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−１６３９７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−０１５３６６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

パイナップル属植物の果実又はその抽出物を有効成分とする乳発酵用の植物乳酸菌増殖促進剤であって、植物乳酸菌がラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７）又はラクトバチルス プランタルムＳＮ３５Ｎ株（ＮＩＴＥ Ｐ−６）である植物乳酸菌増殖促進剤。

【請求項2】

パイナップル属植物の果実が、果実処理物である請求項１記載の植物乳酸菌増殖促進剤。

【請求項3】

パイナップル属植物の果実又はその抽出物の存在下、ラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７）又はラクトバチルス プランタルムＳＮ３５Ｎ株（ＮＩＴＥ Ｐ−６）を用いて乳を発酵することを特徴とするはっ酵乳の製造方法。

【請求項4】

パイナップル属植物の果実若しくはその抽出物、又はパイナップル属植物の果実若しくはその抽出物と酒粕の存在下で培養したラクトバチルス プランタルムをスターターとして用いる請求項３記載のはっ酵乳の製造方法。

【請求項5】

スターター中のラクトバチルス プランタルムの菌数が培地１ｍＬ当たり２０億以上である請求項４記載のはっ酵乳の製造方法。

【請求項6】

はっ酵乳がドリンクタイプのはっ酵乳である請求項３〜５のいずれか１項記載のはっ酵乳の製造方法。

【請求項7】

はっ酵乳が固形タイプのはっ酵乳である請求項３〜５のいずれか１項記載のはっ酵乳の製造方法。

【請求項8】

請求項３〜５のいずれか１項記載のはっ酵乳の製造方法にて得られた固形はっ酵乳。

【請求項9】

固化率１００％の固形はっ酵乳である請求項８記載の固形はっ酵乳。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌増殖促進剤、及びこれを用いたはっ酵乳の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌は、一般的に発酵により乳酸を生産する微生物の総称であり、食品の風味、組織、栄養価の改善又は保存性付与等に重要な役割を果たしている。
従来から、乳酸菌を用いた発酵食品としては、例えばヨーグルト、チーズに代表される哺乳動物の乳を原料としたはっ酵乳製品を始め、各種の漬物・らっきょうに代表される野菜等の植物を原料とした漬物類、さらには味噌、醤油類が知られている。
また、近年、生きた乳酸菌の摂取による腸内菌叢の改善効果又は整腸作用等の様々な乳酸菌の生理的効果が明らかとなり、当該乳酸菌の生理作用を利用した食品、健康食品、医薬品等が研究開発されてきている。

【0003】

従って、乳酸発酵において、乳酸菌の増殖促進、菌体濃度の増加、発酵時間の短縮等が達成できれば、産業上の利用価値は極めて大きなものと云え、これまでに、乳酸菌増殖促進物質の探索が行われている。例えば、酒粕や酒粕抽出物又は酒粕の酵素分解物（特許文献１〜３参照）、大麦焼酎の蒸留残液（特許文献４参照）、ココアマス（特許文献５）、カルシウム塩（特許文献６）、バターミルク（特許文献７）、シチジン及びチミジン、麦芽汁発酵物（特許文献８）、バナナ抽出物（特許文献９）等に乳酸菌増殖促進作用があることが報告されている。
しかしながら、例えば酒粕には酒独特の臭いがあり、発酵食品の風味に悪影響を及ぼす可能性があるので、使用量を制限するか使用する発酵食品が限定される等の問題があった。

【0004】

一方、パイナップルの果実は、加工食品や食品のフレーバーとして又は果実乳酸発酵物の発酵原料（特許文献１０）として用いられているが、パイナップル属植物の果実に乳酸菌増殖促進作用があることは全く知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平３−１７２１７１号公報

【特許文献2】特開平５−１５３６６号公報

【特許文献3】特許第２８３５５４８号公報

【特許文献4】特開２０００−３４２２４７号公報

【特許文献5】特開２００６−２２３２４４号公報

【特許文献6】特許第２６７３３３３号公報

【特許文献7】特開２０００−１０２３８０号公報

【特許文献8】特開平０３−１３００７１号公報

【特許文献9】特表２００９−５１４５１９号公報

【特許文献10】特開２００９−１５３４１９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、食品の風味を害することがない乳酸菌増殖促進剤、これを用いたはっ酵乳の製造方法を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、食品に使用可能な植物性素材について探索を重ねた結果、全く意外にも、パイナップル属植物の果実又はその抽出物に、乳酸菌、特に植物乳酸菌に対して優れた増殖促進作用があり、乳酸菌増殖促進剤として有用であることを見出した。

【0008】

すなわち、本発明は、パイナップル属植物の果実又はその抽出物を有効成分とする乳酸菌増殖促進剤を提供するものである。
また、本発明は、パイナップル属植物の果実又はその抽出物の存在下、乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸菌増殖促進方法を提供するものである。
また、本発明は、パイナップル属植物の果実又はその抽出物の存在下、乳酸菌を用いて乳を発酵することを特徴とするはっ酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記のはっ酵乳の製造方法にて得られた固形はっ酵乳を提供するものである。

【発明の効果】

【0009】

本発明の乳酸菌増殖促進剤を用いれば、乳酸菌、特に植物乳酸菌の増殖を促進することができる。また、本発明によれば、風味のよいはっ酵乳、特に、通常、植物乳酸菌を用いた発酵で製造が困難な固形タイプのはっ酵乳を短時間で効率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】各果汁又は各果汁・酒粕混合物による乳酸菌増殖促進効果を示す。

【図2】３６時間の乳酸発酵後の各はっ酵乳の固化状態を示す。 パイナップル果汁１又はパイナップル果汁１・酒粕（１％）をスターター培地、ラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株を種菌としてスターターを調製し、各スターターをそれぞれ、パイナップル果汁１（最終濃度５及び１０％（ｗ／ｖ））を含む乳培地〔Ｎｏ．１及び２、Ｎｏ．６及び７〕、パイナップルピューレ状（最終濃度５及び１０％（ｗ／ｖ））を含む乳培地〔Ｎｏ．３及び４、Ｎｏ．８及び９〕、又は無添加の乳培地〔Ｎｏ．５及び１０〕に接種したもの。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明において、「パイナップル属植物」とは、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）アナナス（Ａｎａｎａｓ）属植物又はその類縁植物（例えば、パイナップル科ブロメリア（Ｂｒｏｍｅｌｉｃａ）属植物のブロメリア・ピングイン（Ｂｒｏｍｅｌｉａ ｐｉｎｇｕｉｎ、英名ｐｉｎｇｕｉｎ））を意味する。これらのうち、パイナップル（学名：Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ 英：ｐｉｎｅａｐｐｌｅ）が好ましい。
当該パイナップルとしては、カイエン系、レッドスパニッッシュ系、ブランコ系及びクイーン系等の系統に分類される食用品種のパイナップルが好ましい。

【0012】

本発明において、パイナップル属植物の果実は、これに摩砕、細断、搾汁、乾燥等の物理的処理を施した果実処理物として用いるのが好ましい。果実処理物としては、具体的には、果汁、ペースト状、果肉スライス、残渣等が挙げられ、乳酸菌増殖促進作用の点から、果汁及びペースト状が好ましい。
ここで、「果汁」とは、果実、好ましくは果肉を搾汁して得られる液汁（１００％果汁）、濃縮果汁、濃縮還元果汁、及びこれらを希釈したものを云う。
また、「ペースト状」とは、果実、好ましくは果肉を破砕や摩砕したもの（ピューレ状）、及び更にピューレ状のものを裏ごししたもの（ピューレ）を云う。
また、「残渣」とは、果汁、ペースト状又は果肉スライス等の製造過程の廃棄部分（副産物）に上記物理的処理を施したものを云い、廃棄部分には果実表皮や果肉等が含まれる。
当該果実処理物は、適宜希釈、ｐＨ調整、殺菌処理、濃縮、濾過、乾燥又は粉末化したものを用いることができる。
例えば、果実処理物に、クエン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤を添加して、ｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ５〜６に調整したもの、また、殺菌処理（６０〜１２０℃で３０秒〜２０分間、９０〜１０５℃で１〜１０分間等）を施したものを用いることができる。

【0013】

また、本発明の乳酸菌増殖促進剤においては、パイナップル属植物の果実を用いる他、乳酸菌増殖促進作用を発揮し得る限りにおいて、当該果実（果実処理物を含む）の各種溶媒抽出物を用いることもできる。
抽出手段としては、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等が挙げられる。

【0014】

抽出溶媒としては、極性溶剤又は非極性溶剤の何れでもよいが、例えば、水；メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール類（好ましくは炭素数１〜４のアルコール類）；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；酢酸エチル等のエステル類；ｎ−ヘキサン等の炭化水素類；クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；超臨界二酸化炭素等が挙げられ、これらを単独又は２種以上混合して使用することができる。

【0015】

抽出条件は特に限定されるものではなく、例えば、４〜１２０℃、好ましくは８０〜１０５℃、で、１分〜数日間行うことができ、このとき、ｐＨ５〜６で行ってもよい。
パイナップル属植物の果実の抽出物は、不純物や夾雑物等を除去するため、適宜活性炭処理、液体クロマトグラフィー、液液分液、ゲルろ過、蒸留等の分離精製技術を用いてもよい。

【0016】

パイナップル属植物の果実又はその抽出物を乳酸菌増殖促進剤として適用可能な乳酸菌は、特に限定されず、例えば、ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ロイコノストック属細菌、ペディオコッカス属細菌、バチルス属細菌、ラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス属細菌、テロラジェノコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌等が挙げられる。
このうち、穀物、野菜、果物、花、薬用植物等の植物源から分離された植物乳酸菌は、一般的に、畜肉・乳等の動物源から分離された動物乳酸菌に比べて増殖能が低いため、固形タイプのヨーグルトを製造することが困難である。従って、本発明の乳酸菌増殖促進剤は、植物乳酸菌に対して、より有効的に適用できる。

【0017】

ここで、植物乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス ヒルガルディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）等のラクトバチルス属細菌；ロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）等のロイコノストック属細菌；エンテロコッカス ムンディティ、エンテロコッカス アビウム等のエンテロコッカス属細菌；テトラジェノコッカス ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）等のテトラジェノコッカス属細菌；ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカス アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）等のペディオコッカス属細菌；バチルス コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）等のバチルス属細菌等を挙げることができる。

【0018】

上記植物乳酸菌としては、より具体的には、ラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７）、ラクトバチルス プランタルムＳＮ２６Ｔ株（ＮＩＴＥ Ｐ−８）、ラクトバチルス プランタルムＳＮ３５Ｎ株（ＮＩＴＥ Ｐ−６）、ラクトバチルス プランタルムＳＮ３５Ｍ株（ＮＩＴＥ Ｐ−５）、ラクトコッカス ラクティス サブスペシース ラクティス ＳＮ２６Ｎ株（ＮＩＴＥ Ｐ−９）、エンテロコッカス スペシースＳＮ２１Ｉ株（ＮＩＴＥ Ｐ−１１）、エンテロコッカス ムンヅティＳＮ２９Ｎ株（ＮＩＴＥ Ｐ−１０）及びエンテロコッカスアビウム（ＮＩＴＥ ＢＰ−１４２）、ラクトバチルス プランタルムＪＣＭ １１４９株、ラクトバチルス プランタルムＪＣＭ ８３４８株、ラクトバチルス プランタルムＩＦＯ３０７０株（ＪＣＭ １０５７株）、ラクトバチルス ヒルガルディＮＢＲＣ１５８８６、ペディオコッカス・ペントサセウスＬＰ２８株等が挙げられる。
このうち、ラクトバチルス プランタルムが好ましく、特にラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７）及びラクトバチルス プランタルムＳＮ３５Ｎ株（ＮＩＴＥ Ｐ−６）が好ましい。

【0019】

後記実施例に示すように、パイナップル属植物の果実又はその抽出物の存在下、乳酸菌を増殖させることによって乳酸発酵が速やかに進行する。従って、パイナップル属植物の果実又はその抽出物は、乳酸菌増殖促進剤として、乳酸発酵を行う際に用いることにより、乳酸菌増殖促進効果を発揮し、各種発酵物を短時間で効率よく製造することが可能となる。
発酵は、パイナップル属植物の果実又はその抽出物の存在下、公知の方法に従って、発酵原料に乳酸菌を接種して行えばよい。例えば、乳等の発酵原料（好ましくは、原料を含む培地１Ｌ中、乳（乾燥物換算）０．１〜２０％（ｗ／ｖ）含有）に、パイナップル属植物の果実又はその抽出物を、培地１Ｌ中、乾燥物換算で、好ましくは０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．５〜２（ｗ／ｖ）％になるように添加し、これに乳酸菌を接種して、２５〜４５℃で１０〜８０時間培養することにより行うことができる。以下に、はっ酵乳を製造する場合を例に挙げて、説明する。

【0020】

例えば、ヨーグルト発酵を行う場合、無脂乳固形分の濃度を８．０％（ｗ／ｖ）以上に調整した乳を主原料とする水溶液を、６５〜１３０℃の温度で１秒〜３０分の時間、加熱殺菌を行ない、次いで３０〜４５℃の温度まで冷却して、乳を含む液体培地（以下、「乳培地」とも云う）を調製する。この乳培地に、培地１Ｌ中、本発明のパイナップル属植物の果実又はその抽出物を乾燥物換算で０．１〜５％（ｗ／ｖ）になるように添加し、パイナップル属植物の果実又はその抽出物を含む乳培地を調製する。続いて、この培地に、スターターとして調製され、高濃度となっている乳酸菌を、０．１〜６％（ｗ／ｖ）接種する。接種後、３０〜４５℃の温度で３〜７２時間、乳酸菌量が１０００万個／ｍＬ以上になるまで発酵を行ない、発酵終了後、１０℃以下まで冷却したものをヨーグルトとする。

【0021】

また、例えば、はっ酵乳飲料の場合、乳（水溶液中、１％（ｗ／ｖ）以上含有）又はこれにその他の原料を調合した水溶液を、６５〜１３０℃の温度で１秒〜３０分の時間、加熱殺菌を行い、次いで３０〜４５℃まで冷却する。続いて、これに乳酸菌をスターターとして０．１〜６％（ｗ／ｖ）接種する。接種後、本発明のパイナップル属植物の果実又はその抽出物の存在下、３０〜４５℃の温度で１２〜７２時間、発酵を行い、発酵終了後、冷却したものをはっ酵乳飲料とする。はっ酵乳飲料は、そのまま飲料としてもよく、さらに希釈又は殺菌を行ってもよい。このとき、乳等の原料を調合した水溶液１Ｌ中、本発明のパイナップル属植物の果実又はその抽出物の含有量は、乾燥物換算で、０．１〜２％（ｗ／ｖ）であるのが好ましい。

【0022】

上記はっ酵乳の製造に際しては、発酵原料として乳以外に、ゼラチン、寒天、糖類、香料、果肉、窒素源、ｐＨ調整剤、他の乳酸菌増殖促進成分等の通常はっ酵乳の製造に使用されている原料を使用することもできる。例えば、蔗糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース等の糖類；ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、還元水飴等の糖アルコール類；アスパルテーム、アセスルファムカリウム等の高甘味度甘味料；蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤；カラギーナン、キサンタンガム、グァーガム等の増粘剤；クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の酸味料；レモン果汁、オレンジ果汁、キュウイ果汁、ナシ果汁等の果汁類；ビタミン類；カルシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類；甘草、桂枝、生姜等の生薬；あるいは香草、グルタミン酸ナトリウム、クチナシ色素、シリコーン、リン酸塩等の食品添加物等を使用することが可能である。

【0023】

発酵原料である、乳としては、動物乳、例えば牛乳、ヤギ乳、めん羊乳等が挙げられ、特に牛乳が好ましい。斯かる乳は、未殺菌乳及び殺菌乳の何れであってもよく、また、これらの乳から調製した濃縮乳もしくは練乳、これらの脱脂乳、部分脱脂乳又これらを乾燥して粉末にした粉乳等であってもよい。

【0024】

本発明のはっ酵乳の製造において、スターターとして用いる乳酸菌の培養は、特に限定されるものではなく、培地、培養条件等は公知の方法を採用して行えばよいが、上述した本発明のパイナップル属植物の果実又はその抽出物をそのまま、又はこれにｐＨ調整や殺菌処理等をしたもの、更にはこれらに酒粕を添加したものを培地として用いるのが好ましい。
スターター培地１Ｌ中のパイナップル属植物の果実又はその抽出物の含有量は、特に限定されないが、乾燥物換算で、０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、より１０〜２０％（ｗ／ｖ）であるのが好ましく、これに酒粕を併用する場合には、パイナップル属植物の果実又はその抽出物：酒粕の質量比が、乾燥物換算で、１：０．０１〜０．１、より１：０．０５〜０．０９であるのが好ましい。斯かる条件で培養した乳酸菌をスターターとして用いることにより、発酵促進効果をより向上させることができる。
ここで、「酒粕」として、市販品や酒粕の凍結乾燥品や噴霧乾燥品を用いればよいが、「もろみ」から清酒を搾り取った後の残りかす、すなわち、酵母を大量に培養した酒母に蒸米と麹を加えて、約３週間アルコール発酵を行って、発酵産物である「熟成もろみ」とし、これより清酒を搾った残りかすを用いてもよい。また、酒粕の代わりに米焼酎の粕もしくは米焼酎粕を凍結乾燥や噴霧乾燥処理したものでもよい。

【0025】

斯くして得られる本発明の乳酸菌増殖促進剤を用いて製造された発酵物（はっ酵乳）は、後記実施例に示すように乳酸発酵が速やかに進行し、すなわち、通常、増殖能がきわめて低く、固形タイプのはっ酵乳を製造することは難しいとされている植物乳酸菌を用いた場合でも、速やかに固形状（固形はっ酵乳）となる。しかも当該はっ酵乳には優れた風味やパイナップル特有の香気が付与され、さらに食感、外観やはっ酵乳の色合いにも優れる。

【0026】

本発明のはっ酵乳の製造方法によれば、適宜乳酸菌増殖能を調整することができ、プレーンタイプ、ソフトタイプ、ドリンクタイプ、固形（ハード）タイプ、フローズンタイプ等、いずれの形態のはっ酵乳も製造することが可能である。

【実施例】

【0027】

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。

【0028】

実施例１：各果汁を用いた発酵乳固化試験
＜使用する菌＞
ラクトバチルス プランタルムの一種Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＮ１３Ｔ株又はＬ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＳＮ３５Ｎ株を用いた。
これらは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）へ、ラクトバチルスプランタルムＳＮ１３Ｔ株（ＮＩＴＥ Ｐ−７）及びラクトバチルス プランタルムＳＮ３５Ｎ株（ＮＩＴＥ Ｐ−６）として寄託されているものである（寄託日：平成１６（２００４）年７月６日）。
＜果汁の調製＞
パイナップル果汁として、沖縄産パイナップル果実由来の果汁（果汁１００％：株式会社パイナップルワイナリー製）〔以下、「パイナップル果汁１」と云う〕、又はコスタリカ産パイナップル果実由来の果汁（果汁１００％）〔以下、「パイナップル果汁２」と云う〕を用いた。これらは、パイナップル科パイナップル属植物のパイナップルの果実を搾汁した液汁である。何れの果汁も果汁由来の混濁が認められたが、コスタリカ産パイナップル果汁の方が沖縄産パイナップル果汁より、濁っていた。
このとき、パイナップル果汁１又は２（５０ｍＬ）を凍結乾燥すると、平均８ｇであった。
パイナップル果汁１又は２にクエン酸Ｎａを添加してｐＨを５〜６に調整したものを、１００〜１０４℃で５〜１０分加熱殺菌して殺菌済パイナップル果汁１又は２（全量中のパイナップル果実の含有量は、乾燥物換算で１６％（ｗ／ｖ））とした。
また、オレンジ、キウイ又はナシの果肉についてもパイナップルの果実に準じて、殺菌済オレンジ果汁、殺菌済キウイ果汁、又は殺菌済ナシ果汁を調製した。

【0029】

＜スターターの調製＞
無菌下で、スターター培地５ｍＬに、乳酸菌を植菌し、３７℃で２４時間種培養を行い、スターターを調製した。スターター培地として、上記殺菌済パイナップル果汁１をそのまま用いた。

【0030】

＜乳培地の調製＞
脱脂粉乳（ＰＭ）１３％（ｗ／ｖ）水溶液（ｐＨをクエン酸ナトリウム溶液で５．０〜５．５に調整したもの）を１２１℃、１５分間高圧滅菌し、殺菌済乳培地を調製した。

【0031】

〔はっ酵乳固化試験〕
上記＜スターターの調製＞に従って、スターター（ラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株）を調製した。
上記＜果汁の調製＞に記載の殺菌済パイナップル果汁１又は２を用い、無菌下で、パイナップル果汁の最終濃度が、培地１Ｌ中、０％又は１．０％（ｗ／ｖ）（全量中、パイナップル果実が、乾燥物換算で、０．１６％（ｗ／ｖ））になるように乳培地に添加し、パイナップル果汁無添加の乳培地又は１．０％（ｗ／ｖ）パイナップル果汁乳培地を本培養培地として調製した。
調製した各本培養培地１ｍＬを各１．５ｍＬ容ポリエチレン製マイクロチューブに入れた。更に、上述の調製したスターター（種菌）が１．０％（ｗ／ｖ）となるように、各マイクロチューブに入れ、マイクロチューブを密閉後、３７℃、４０時間振とう培養し、はっ酵乳を製造した。
また、殺菌済パイナップル果汁を上記の殺菌済オレンジ果汁、殺菌済キウイ果汁、又は殺菌済ナシ果汁に代えた以外は、上記と同様にして、振とう培養を行い、はっ酵乳を製造した。
各はっ酵乳の固化状況を確認した。

【0032】

【表1】

【0033】

パイナップル果汁１を用いると、はっ酵乳は７０％程度固化し、また、パイナップル果汁２を用いると、培養４０時間経過後にははっ酵乳が完全固化した。これに対し、キュウイ果汁やナシ果汁を用いるとはっ酵乳は５０％程度の固化、オレンジ果汁でははっ酵乳は２０％程度の固化にとどまっていた。すなわち、パイナップル果汁を用いれば、乳酸菌の増殖を促進すると共にはっ酵乳を固化させることができることが確認された。

【0034】

実施例２：パイナップル果汁又は酒粕を用いたはっ酵乳固化試験
＜酒粕及び酒粕乳培地の調製＞
酒粕として、市販品の酒粕を噴霧乾燥したものを用いた。
酒粕噴霧乾燥品（以下「酒粕ＳＤ」とも云う）を最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）になるように、上記の乳培地に添加し、酒粕１．５％（ｗ／ｖ）含有の本培養培地を調製した。

【0035】

〔はっ酵乳固化試験〕
スターター培地として上記＜果汁の調製＞に記載の殺菌済パイナップル果汁１を用い、乳酸菌として上記ラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株又はラクトバチルス プランタルムＳＮ３５Ｎ株を用いて、上記＜スターターの調製＞に従って、２種のスターターをそれぞれ調製した。

【0036】

乳培地に上記殺菌済パイナップル果汁２を添加した本培養培地、又は酒粕ＳＤを添加した本培養培地を用い、実施例１の〔はっ酵乳固化試験〕に従って、上記各スターターを種菌として用いて３７℃、４８時間振とう培養を行い、はっ酵乳を製造し、この固化状態を確認した。
また、コントロールとして、乳培地に何も添加しないものを本培養培地として同様にはっ酵乳を製造した。

【0037】

【表2】

【0038】

表２に示すように、パイナップル果汁を用いると、何れのラクトバチルス プランタルム菌株でも乳酸菌の増殖能が促進され、はっ酵乳が固化された。
従来、植物乳酸菌は、動物乳酸菌に比べて増殖能が低く、植物乳酸菌で固形タイプはっ酵乳を得ることは非常に困難で、ドリンクタイプのはっ酵乳が主流であった。この結果から、植物乳酸菌のように増殖能が低いものであっても、パイナップル果汁を用いれば非常に乳酸菌の増殖能が高まると共に、はっ酵乳が固化できることが確認された。
また、ポジティブコントロールとして、酒粕を乳培地中０．１５％（ｗ／ｖ）で用いたが、酒独特の臭いがあり、はっ酵乳の匂いや風味が損なわれていたのに対し、パイナップル果汁を用いた場合には、はっ酵乳に優れた風味やパイナップル特有の香気が付与されるので、商品的価値の高いはっ酵乳を製造することができた。

【0039】

実施例３：スターター培地としてパイナップル果汁又はパイナップル果汁・酒粕混合物を用いた乳酸菌増殖促進効果試験
＜パイナップル果汁・酒粕混合物の調製＞
上記酒粕ＳＤを最終濃度１．０％（ｗ／ｖ）になるように、上記殺菌済パイナップル果汁１に添加し、パイナップル果汁１・酒粕混合物を調製した。このとき、パイナップル果汁：酒粕の質量比は、乾燥物換算で１６：１であった。

【0040】

〔乳酸菌増殖促進効果試験〕
スターター培地として、上記実施例１に記載の殺菌済パイナップル果汁１又は上記パイナップル果汁１・酒粕混合物をそのままの状態で使用した。
上記実施例１の＜スターターの調製＞に従って、上記各スターター培地に上記ラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株を接種した後、菌を培養し、このときの菌数を測定した。

【0041】

【表3】

【0042】

ラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株を、パイナップル果汁１で培養すると、培地１ｍＬ当たり１５０億の乳酸菌数となったことから、パイナップル果実そのものに乳酸菌増殖促進効果があることが確認された。複数回の実験により、培地１ｍＬ当たり、２０億以上は恒常的に増えることを確認している。また、パイナップル果汁に酒粕を添加したパイナップル果汁１・酒粕混合物で培養すると、チャンピオンデータとしては培地１ｍＬ当たり７００億の乳酸菌数となったことから、更に酒粕を併用することによって乳酸菌増殖促進効果がより高まることも見出した。すなわち、何れもスターター培地として良好であるが、特にパイナップル果汁・酒粕混合物が好ましいと考えられた。

【0043】

実施例４：スターター培地として各果汁、各果汁・酒粕混合物を用いた乳酸菌増殖促進効果試験
＜果汁、果汁・酒粕混合物の調製＞
パイナップル果汁として、濃縮果汁（野村乳業製）を１００％果汁に希釈した濃縮還元果汁を用いた。濃縮還元果汁に、炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨを５．７に調整したものを、１００℃で８分加熱殺菌して殺菌済パイナップル果汁３とした。
上記酒粕ＳＤを最終濃度１．０％（ｗ／ｖ）になるように、上記殺菌済パイナップル果汁３に添加し、パイナップル果汁３・酒粕混合物を調製した。このとき、パイナップル果汁：酒粕の質量比は、乾燥物換算で１６：１であった。
また、人参果汁、リンゴ果汁及びバナナ果汁についてもパイナップル果汁３に準じて、濃縮果汁からそれぞれ殺菌済果汁と、各果汁・酒粕混合物を調製した。

【0044】

〔乳酸菌増殖促進効果試験（１）〕
スターター培地として、上記それぞれの殺菌済果汁又は各果汁・酒粕混合物をそのままの状態で使用した。
上記実施例１の＜スターターの調製＞に従って、各スターター培地に、あらかじめＭＲＳ培地にて培養したラクトバチルス プランタルムＳＮ１３Ｔ株（Ｌ．ｐ．１３Ｔ）の培養液（これを前前培養液と呼ぶ）を各スターター培地１００ｍＬに対して１ｍＬ接種した（最終濃度で１（Ｖ／ｖ）％）後、３７℃で２４時間菌を培養した。各スターター培地から１ｍＬを採取し、０．８５％Ｎａｃｌで・１０倍から１０^１０倍までの希釈系列を作製して希釈後、ＢＣＰアガー培地（日水製薬株式会社）に１ｍＬ接種して嫌気的条件下で培養後、菌数を測定した。結果を図１に示す。

【0045】

図１より、パイナップル果実にラクトバチルス プランタルムの増殖促進効果があることが確認された。これに対し、人参果汁、リンゴ果汁及びバナナ果汁では、ラクトバチルス プランタルムに対する増殖促進効果が弱かった。

【0046】

〔乳酸菌増殖促進効果試験（２）〕
スターター培地として、上記殺菌済パイナップル果汁３又はパイナップル果汁３・酒粕混合物をそのままの状態で使用した。各スターター培地にペディオコッカス・ペントサセウスＬＰ２８株を接種した以外は、上記乳酸菌増殖促進効果試験（１）と同様にして菌を培養後、菌数を測定した。なお、ペディオコッカス・ペントサセウスＬＰ２８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）へ、ＮＩＴＥ Ｐ−７００として寄託されているものである（寄託日：平成２１（２００９）年１月２７日）。
その結果、ペディオコッカス・ペントサセウスＬＰ２８株を、パイナップル果汁３で培養すると、培地１ｍＬ当たり２２億の乳酸菌数となったことから、パイナップル果実そのものにペディオコッカス・ペントサセウスの増殖促進効果があることが確認された。また、パイナップル果汁に酒粕を添加したパイナップル果汁３・酒粕混合物で培養すると、培地１ｍＬ当たり２４億の乳酸菌数となったことから、更に酒粕を併用することによって乳酸菌増殖促進効果がより高まることも見出した。

【0047】

実施例５：パイナップル果汁、パイナップルピューレ状又はパイナップル果汁・酒粕含有乳培地を用いた乳酸菌増殖促進効果試験
＜ピューレ状の調製＞
パイナップル果実をミキサーで摩砕したもの（ピューレ状）を得た。このとき、ピューレ状５０ｍＬを乾燥すると、８ｍｇであった。
パイナップルピューレ状にクエン酸Ｎａを添加してｐＨを５〜６に調整したパイナップルピューレ状を、１００〜１０４℃で５〜１０分加熱殺菌して殺菌済パイナップルピューレ状（全量中のパイナップル果実の含有量は、乾燥物換算で１６％（ｗ／ｖ））とした。

【0048】

〔はっ酵乳固化試験〕
上記実施例３記載の２種のスターター（パイナップル果汁１又はパイナップル果汁１・酒粕混合物をスターター培地として使用）を用いた。
上記実施例１に記載の殺菌済パイナップル果汁１、上記実施例３に記載のパイナップル果汁１・酒粕混合物、上記殺菌済パイナップルピューレ状を、それぞれ乳培地に添加して、本培養培地とした。このとき、各本培養培地の調製法は、実施例１の方法に準じて行い、各本培養培地中のパイナップル果汁の含有量は、培地１Ｌ中、０％、５％（ｗ／ｖ）（全量中のパイナップル果実の含有量は、乾燥物換算で０．８％（ｗ／ｖ））、１０％（ｗ／ｖ）（全量中のパイナップル果実の含有量は、乾燥物換算で１．６％（ｗ／ｖ））とした。
上記実施例１のはっ酵乳の製造法に従って、上記各スターターを各本培養培地に接種後３６時間培養し、はっ酵乳を製造し、この固化状態を確認した。なお、コントロールとして、乳培地のみの本培養培地を用いた。

【0049】

【表4】

【0050】

パイナップル果汁をスターター培地として調製したスターターを、パイナップル果汁１を１０％（ｗ／ｖ）で含有する本培養培地に接種し、１６時間培養するとはっ酵乳の固化率が１００％となった。なお、３６時間培養後のはっ酵乳の固化状態を図２に示す。
一方、パイナップル果汁１に酒粕を１％（ｗ／ｖ）添加した混合物をスターター培地とした場合、１６時間培養するとはっ酵乳の固化率が１００％となった。このとき、本培養培地中の酒粕の含有量は０．０１％（ｗ／ｖ）と微量になるので、はっ酵乳の固化は本培養培地に含まれるパイナップル果実によるものと考える。また、このスターターで製造されたはっ酵乳に酒独特の臭いはなく、しかもパイナップル特有の香りや風味が付与されていた。
更に、ピューレ状を５％（ｗ／ｖ）になるように乳培地に添加した場合、１６培養すると、はっ酵乳の固化率が１００％となったのに対し、パイナップル果汁１を５％（ｗ／ｖ）になるように乳培地に添加した場合、２４時間〜３６時間で、はっ酵乳の固化率が１００％となった（図２参照）。このことから、果汁よりも、食物繊維質を多く含むようなピューレ状の方が、乳酸菌の増殖性を高めると共に、はっ酵乳の固化も良好になると考えた。
また、植物乳酸菌は増殖が遅く、しかも発酵乳を固化することが困難であったが、パイナップルの果汁又はピューレ状を用いれば、植物乳酸菌による乳酸発酵を促進させて１６〜２４時間で発酵乳を固化させることができたので、発酵時間も短縮することも可能となると考えた。

【0051】

このようにパイナップル果実には乳酸菌、特に植物乳酸菌の増殖促進作用があるため、パイナップル果実を乳培地に添加し、乳酸発酵をすることによって風味や香りが良好な固形タイプのはっ酵乳を製造することが可能となった。
更に、スターター調製の際、パイナップル果実に酒粕を０．５〜１．５％程度添加したスターター培地を用いた方が、乳酸菌の増殖促進効果がより高くなると共に、これを用いても酒独特の臭いがなく、パイナップルの風味や香りのある固形タイプのはっ酵乳を製造することも可能となった。

【図1】

【図2】