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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5750787
(24)【登録日】2015年5月29日
(45)【発行日】2015年7月22日
(54)【発明の名称】ヘルペスウイルス感染症の治療または予防のための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20150702BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20150702BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20150702BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20150702BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20150702BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20150702BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20150702BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20150702BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20150702BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 D
A61K39/395 S
A61P31/22
A61P43/00 111
A61K48/00ZNA
A61K31/7088
C12N15/00 G
C12Q1/02
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
【請求項の数】10
【全頁数】43
(21)【出願番号】特願2012-507090(P2012-507090)
(86)(22)【出願日】2011年3月25日
(86)【国際出願番号】JP2011057382
(87)【国際公開番号】WO2011118779
(87)【国際公開日】20110929
【審査請求日】2012年10月2日
(31)【優先権主張番号】特願2010-229537(P2010-229537)
(32)【優先日】2010年10月12日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2010-193101(P2010-193101)
(32)【優先日】2010年8月31日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2010-72717(P2010-72717)
(32)【優先日】2010年3月26日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100120880
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 綾子
(72)【発明者】
【氏名】川口 寧
(72)【発明者】
【氏名】有井 潤
(72)【発明者】
【氏名】荒瀬 尚
【審査官】
中尾 忍
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００９／１４６８５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Wadgaonkar,R.，et al.，“Mutation Analysis of the Non-Muscle Myosin Light Chain Kinase (MLCK) Deletion Constructs on CV1 Fibroblast Contractile Activity and Proliferation”，J. Cell Biochem.，２００３年 ２月１５日，Vol.88，No.3，P.623-634
【文献】
Cheshenco,N.，et al.，“Herpes simplex virus triggers activation of calcium-signaling pathways”，J. Cell Biol.，２００３年１０月２７日，Vol.163，No.2，P.283-293
【文献】
Hunsperger,E.A.，et al.，“Capsaicin-induced reactivation of latent herpes simplex virus type 1 in sensory neurons in culture”，J. Gen. Virol.，２００３年 ５月，Vol.84，No.5，P.1071-1078
【文献】
Li,Y.，et al.，“MYH9-siRNA and MYH9 Mutant Alleles: Expression in Cultured Cell Lines and Their Effects Upon Cell Structure and Function”，Cell Motil. Cytoskeleton，２００８年 ５月，Vol.65，No.5，P.393-405
【文献】
Jiang,J.，et al.，“Myosin IIB isoform plays an essential role in the formation of two distinct types of macropinosomes”，Cytoskeleton，２０１０年 １月，Vol.67，No.1，P.32-42
【文献】
Jacobelli,J.，et al.，“Myosin IIA and ICAM-1 Regulate the Interchange between Two Distinct Modes of T Cell Migration”，J. Immunol.，２００９年 ２月１５日，Vol.182，No.4，P.2041-2050
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
Ｃ１２Ｑ １／０２
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｇ０１Ｎ ３３／５０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢに対する抗体を含む、ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項2】
前記抗体が、配列番号：１又は７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記抗体が、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢにおける、ヘルペスウイルス感染時に細胞外に露出する領域に結合する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス１型、又はサイトメガロウイルスである、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
配列番号：３及び配列番号：４に記載の塩基配列からなる、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡを含むヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項6】
配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡをコードする核酸を含むヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項7】
配列番号：９及び配列番号：１０に記載の塩基配列からなる、非筋ミオシン重鎖ＩＩＢに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡを含むヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項8】
配列番号：１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む、非筋ミオシン重鎖ＩＩＢに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡをコードする核酸を含むヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項9】
ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬のスクリーニング方法であって、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢを発現する細胞を候補化合物で処理する工程と、
前記細胞にヘルペスウイルスを感染させる工程と、
前記細胞における非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢの細胞膜付近への移動を抑制する候補化合物、又は前記細胞へのヘルペスウイルスの侵入を阻害する候補化合物を選択する工程と、を含む方法。
前記細胞にヘルペスウイルスを感染させる工程と、
前記細胞における非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢの細胞膜付近への移動を抑制する候補化合物、又は前記細胞へのヘルペスウイルスの侵入を阻害する候補化合物を選択する工程と、を含む方法。
【請求項10】
ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬のスクリーニング方法であって
非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとｇＢとが結合できる条件下で、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとｇＢと候補化合物とを接触させる工程と、
非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとｇＢとの結合を阻害する候補化合物を選択する工程と、を含む方法。
非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとｇＢとが結合できる条件下で、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとｇＢと候補化合物とを接触させる工程と、
非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとｇＢとの結合を阻害する候補化合物を選択する工程と、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘルペスウイルス感染症の治療または予防のための医薬組成物等に関する。【背景技術】
【0002】
ヘルペスウイルスは、線状の2本鎖DNAをゲノムとしてもつDNAウイルスであり、正20面体のヌクレオカプシドがエンベロープに包まれた構成を有する。アルファ、ベータ、ガンマの3つの亜科に分類されるが、ウイルス学上重要なものはアルファヘルペスウイルス亜科に属している。アルファヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス、バリセロウイルス、マルディウイルス及びイルトウイルスに分類される。
【0003】
単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus; HSV）の重要な例として、ヒトを宿主とする単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）及び単純ヘルペスウイルス2（HSV-2）が挙げられる。HSVが皮膚や粘膜を介してヒトに感染すると、皮膚粘膜疾患の原因となり、致死的な脳炎を引き起こすこともある。また、初感染後、病態が治癒しても体内に潜伏感染し、頻繁に再活性化して回帰発症を引き起こす。
また、バリセロウイルスで重要な例として、ブタヘルペスウイルス1が挙げられる。ブタヘルペスウイルス1は仮性狂犬病ウイルスとも呼ばれ、ブタオーエスキー病の原因となる。
【0004】
ヘルペスウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス側及び細胞側の多くの因子が関与する複雑なプロセスによって行われる。ヘルペスウイルスはエンベロープを有し、エンベロープからグリコプロテインB及びグリコプロテインD（以下、それぞれ「gB」及び「gD」という場合もある。）の2つの糖タンパク質が突出している。宿主細胞への感染に際しては、これらのグリコプロテインが細胞表面の受容体に結合し、ウイルス粒子と細胞との間で膜融合が起こることが必要である。
【0005】
これまでに、gDは、細胞表面のHerpes Virus Entry Mediator（HVEM）及びネクチンをレセプターとすることが判明している（例えば、非特許文献１及び２を参照）。また、本発明者らは、Paired Immunoglobulin-like type 2 Receptor（PILR）がgBと特異的に結合することを見出し、HSVがPILR発現細胞に感染すること、PILR発現細胞に対するHSVの感染が抗PILR抗体で阻害されること、及び、gBとPILRとの会合によりHSVと細胞との細胞融合が誘導されることを確認した（例えば、特許文献１を参照）。PILRは、NK細胞、樹状細胞、マクロファージ、マスト細胞等の免疫細胞に発現するタンパク質である。
【0006】
また、バリセロウイルスに属する水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）もエンベロープタンパク質としてgBを有する。本発明者らは、VZVのgBが、Myelin Associated Glycoprotein（MAG）という神経組織特異的な分子に結合することを見出し、VZVがMAG発現細胞に感染すること、MAG発現細胞に対するVZVの感染が抗MAG抗体によって阻害されること、及び、gBとMAGとの会合によりVZVとMAG発現細胞との膜融合が誘導されることを確認した。MAGは、脳、脊髄、末梢神経組織に特異的に分布する細胞表面分子であり、神経細胞における軸索の伸長を制御することが知られている。また、さらに研究を進めた結果、HSVも、gBとMAGの結合を介して宿主細胞と膜融合することを見出した。（以上例えば、非特許文献３を参照）。
【0007】
しかしながら、PILR、MAGのいずれも極めて限られた種類の培養細胞でしか発現しない。in vivoにおいても、これらのgB受容体が発現するのは、概してミエロイド細胞とグリア細胞に限られる。一方、ヘルペスウイルスは、in vitroにおいては様々な培養細胞に感染することができ、in vivoにおいては、最初の感染部位としての上皮細胞と、潜伏感染の成立のための神経細胞を最も重要な標的とする。
従って、gBと結合してヘルペスウイルス受容体として機能する細胞表面分子は、PILRとMAGだけではないものと考えられた。
【0008】
gBとその受容体との結合を阻害するためには、抗gB抗体等を使用して、ウイルスにおける受容体結合部位をブロックする方法もある。しかしながら、抗gB抗体のようにウイルスに結合する物質を用いると、ウイルス自体が変異を起こして当該物質による阻害を回避する可能性がある。【0009】
一方、現在、抗ヘルペスウイルス薬としてはアシクロビルが広く用いられている。アシクロビルは、ヘルペスウイルス感染細胞においてリン酸化されると活性体となり、DNAポリメラーゼを阻害してウイルスの増殖を防ぐ。従って、感染細胞に対しては殺傷的に働くが、ウイルス感染そのものを防ぐことはできない。そのため潜伏感染ウイルスを体内から排除することができないので、回帰発症を阻止することや、感染の広がりを迅速に阻害することができない。また、アシクロビルに耐性を示すヘルペスウイルスも報告されている。【0010】
また、最近、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤の投与や、RNAi法によるミオシン軽鎖キナーゼの発現阻害により、HSV-1の前初期遺伝子（immediate early gene）の発現が抑制されることが報告された（非特許文献４を参照）。同文献では、ミオシン軽鎖キナーゼの阻害は、ウイルスと宿主細胞との結合、及び宿主細胞へのウイルスの取り込みには影響しなかったと述べられている。そのため、ミオシンIIは、宿主細胞へのウイルスの侵入に関与するのではなく、HSV-1が細胞に侵入した結果ミオシンIIが活性化され、細胞表面付近のアクチン細胞骨格を再配置して、HSV-1がアクチン皮質を通りやすくするのだろうとの仮説が立てられている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第WO2008/084710号パンフレット
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Montgomery, R.I. et al., Cell, 1996, 87：427-436
【非特許文献2】Geraghty, R.J. et al., Science, 1998, 280:1618-1620
【非特許文献3】Suenaga, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA doi:10.1073/pnas.0913351107
【非特許文献4】Koithan T. et al., The 34th International Herpesvirus Workshop, July 25 to 31, 2009, Ithaca, New York, USA, Abstract 4.31
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、多様な種類の細胞で発現し、ヘルペスウイルスの受容体として機能するタンパク質を見出し、当該受容体とヘルペスウイルスとの結合を阻害することによってウイルスの細胞への侵入を防止するヘルペスウイルス感染症の予防剤又は治療剤を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、上記非特許文献４の仮説とは異なり、ヘルペスウイルスが個体に感染を開始すると、筋細胞を含むすべての細胞に存在する非筋ミオシン重鎖IIA及び非筋ミオシン重鎖IIB（以下それぞれ「NMHC-IIA」、「NMHC-IIB」という場合もある。）が細胞表面に誘導され、そのC末端が細胞外に突出し、ヘルペスウイルス表面の糖タンパク質であるgBと結合することにより、宿主細胞のエントリーレセプターとして機能することを見出した。また、NMHC-IIA及びNMHC-IIBの細胞表面付近への移行は、ヘルペスウイルスが感染すると、非筋ミオシンIIA及び非筋ミオシンIIB（以下それぞれ「NM-IIA」、「NM-IIB」という場合もある。）の細胞内局在を制御するミオシン軽鎖キナーゼ（myosin light chain kinase; MLCK）の機能が亢進し、その結果NM-IIA及びNM-IIBの調節軽鎖（regulatory light chain; RLC）のリン酸化が亢進することによって起こることを確認した。
さらに、MLCKを阻害すること、NMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現を抑制すること、抗NMHC-IIA抗体を投与すること、MLCKのドミナントネガティブ変異体を投与すること等によって、ヘルペスウイルスの細胞への侵入を防ぐことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕グリコプロテインＢと非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとの結合を阻害する物質を有効成分として含むヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬組成物；
〔２〕前記グリコプロテインＢと非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとの結合を阻害する物質が、ミオシンＡＴＰａｓｅ活性阻害剤又はミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤である、上記〔１〕に記載の医薬組成物。
〔３〕前記ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤は、ML-7である、上記〔２〕に記載の医薬組成物；
〔４〕前記ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤は、MLCK経路阻害剤である、上記〔２〕に記載の医薬組成物；
〔５〕前記MLCK経路阻害剤は、カルモジュリンアンタゴニスト、カルシウムキレーター、及びカルシウムアンタゴニストからなる群より選択される、上記〔４〕に記載の医薬組成物：
〔６〕前記ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤は、ミオシン軽鎖キナーゼのドミナントネガティブ変異体である、上記〔２〕に記載の医薬組成物；
〔７〕前記グリコプロテインＢと非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとの結合を阻害する物質が、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢに対する抗体である、上記〔１〕に記載の医薬組成物；
〔８〕前記抗体が、配列番号：１又は７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する、上記〔７〕に記載の医薬組成物；
〔９〕前記抗体が、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢにおける、ヘルペスウイルス感染時に細胞外に露出する領域に結合する、上記〔７〕に記載の医薬組成物；
〔１０〕前記グリコプロテインＢと非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとの結合を阻害する物質が、非筋ミオシンＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢの発現を抑制する物質である、上記〔１〕に記載の医薬組成物；
〔１１〕前記非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢの発現を抑制する物質が、ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、及びこれらをコードする核酸からなる群より選択される、上記〔１０〕に記載の医薬組成物；
〔１２〕前記グリコプロテインＢと非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は非筋ミオシン重鎖ＩＩＢとの結合を阻害する物質が、可溶型非筋ミオシン重鎖ＩＩＡ又は可溶型非筋ミオシン重鎖ＩＩＢである、上記〔１〕に記載の医薬組成物；
〔１３〕前記ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス１型、又はサイトメガロウイルスである、上記〔１〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の医薬組成物；
〔１４〕配列番号：３及び配列番号：４に記載の塩基配列からなる、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡ；
〔１５〕配列番号：５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む、非筋ミオシン重鎖ＩＩＡに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡをコードする核酸；
〔１６〕配列番号：９及び配列番号：１０に記載の塩基配列からなる、非筋ミオシン重鎖ＩＩＢに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡ；
〔１７〕配列番号：１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む、非筋ミオシン重鎖ＩＩＢに対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡをコードする核酸；
〔１８〕ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬のスクリーニング方法であって、
NMHC-IIA又はNMHC-IIBを発現する細胞を候補化合物で処理する工程と、
前記細胞にヘルペスウイルスを感染させる工程と、
前記細胞におけるNMHC-IIA又はNMHC-IIBの細胞膜付近への移動、又は前記細胞へのヘルペスウイルスの侵入の少なくとも一方を測定する工程と、を含む方法；及び
〔１９〕ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬のスクリーニング方法であって、
NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBとが結合できる条件下で、NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBと候補化合物とを接触させる工程と、
NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBとの結合を測定する工程と、を含む方法
に、関する。
【発明の効果】
【0015】
本発明の医薬組成物は、多様な細胞でヘルペスウイルスのエントリーレセプターとして機能するNMHC-IIA又はNMHC-IIBと、ヘルペスウイルス表面の糖タンパク質gBとの結合を阻害するので、生体内におけるあらゆる細胞へのヘルペスウイルスへの感染を抑制することが可能である。また、本発明の医薬組成物は、ウイルスが細胞に侵入するのを防ぐため、感染細胞におけるウイルスの殺傷効果のみでなく、ある細胞から別の細胞に感染が広がるのを予防することにより、潜伏感染ウイルスを体内から排除して回帰発症を防ぐことも可能である。
また、本発明の医薬組成物に含まれる、NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBとの結合を阻害する物質として、抗体や核酸等の生体に由来する物質を用いれば、副作用が少なく安全性が高い医薬を得ることができる。
さらに、本発明の医薬組成物に含まれる、NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBとの結合を阻害する物質として、NM-IIA又はNM-IIBの阻害剤、抗NMHC-IIA抗体又は抗NMHC-IIB抗体、NMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現抑制物質等を用いれば、ヘルペスウイルスではなくレセプター（NMHC-IIA又はNMHC-IIB）側に作用するので、ウイルスの変異によって効果が失われることもない。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図11A】図１１Ａは、Vero細胞にHSV-1を感染させ、MLCK阻害剤（BAPTA−AM）の存在下又は非存在下で静置したあと、抗NMHC-IIA抗体を用いた免疫蛍光法によりNMHC-IIAの細胞内局在を解析した結果を示す。
【図12A】図１２Ａは、空の発現プラスミド（Vector）、又はMCLKのドミナントネガティブ変異体の発現プラスミド（Dn-MLCK）で形質転換したVero細胞にHSV-1を感染させ、抗リン酸化RLC抗体又は抗RLC抗体を用いたイムノブロッティングによりRLCのリン酸化を測定した結果を示す。
【図18A】図１８Ａは、ML-7による前処理を行って、又は行わないで、HSV-1を感染させたCos-1細胞表面をビオチン化し、アビジンビーズで免疫沈降を行い、次いで抗NMHC-IIB抗体でイムノブロッティングを行った結果を示す。
【図23】図２３は、NMHC-IIAをノックダウンした細胞に対するHSV-2の感染をフローサイトメトリーで測定した結果である。
【図24】図２４は、NMHC-IIBをノックダウンした細胞に対するHSV-2の感染をフローサイトメトリーで測定した結果である。
【図25】図２５は、NMHC-IIA過剰発現細胞に対するHSV-2の感染をフローサイトメトリーで測定した結果である。
【図26】図２６は、NMHC-IIB過剰発現細胞に対するHSV-2の感染をフローサイトメトリーで測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明の実施形態を説明する。本発明に係る医薬組成物は、ヘルペスウイルス感染症の治療または予防のための医薬組成物であって、グリコプロテインBと非筋ミオシン重鎖IIA又は非筋ミオシン重鎖IIBとの結合を阻害する物質を含むことを特徴とする。
【0018】
ヘルペスウイルスとは、上述のとおり動物DNAウイルスであり、ヘルペスウイルス科のウイルスは、アルファ、ベータ、ガンマの3つの亜科に分類される。上述のとおり、アルファヘルペスウイルス亜科は、さらに、単純ヘルペスウイルス、バリセロウイルス、マルディウイルス、イルトウイルスに分類され、代表的なものとしては、HSV-1、HSV-2、水痘／帯状疱疹ウイルス、ブタヘルペスウイルス1（仮性狂犬病ウイルス）、ウシヘルペスウイルスなどが挙げられる。ベータヘルペスウイルス亜科に属するウイルスとしては、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）等、ガンマヘルペスウイルス亜科に属するウイルスとしては、EBウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等が知られている。
ガンマヘルペスウイルス亜科に属するウイルスとしては、リンフォクリプトウイルス属のエプスタイン・バーウイルス（EBウイルス）等が代表的である。
本発明に係る医薬組成物は、アルファ、ベータ、ガンマのいずれのヘルペスウイルス感染症に用いてもよい。例えば、アルファヘルペスウイルスのHSV-1、HSV-2、ブタヘルペスウイルス1（仮性狂犬病ウイルス）、ベータヘルペスウイルスのHCMV、ガンマヘルペスウイルスのEBウイルスの感染症に用いられる。
単純ヘルペスウイルスとは、ヘルペスウイルスの一種であり、上述のとおりHSV-1とHSV-2に分類される。HSV-1は、主に口唇ヘルペスを生じ、ヘルペス口内炎、ヘルペス角膜炎、単純ヘルペス脳炎等の原因となり得、三叉神経節に潜伏感染する。HSV-2は、主に性器ヘルペス、新生児ヘルペス、ヘルペス髄膜炎、ヘルペス脊髄炎等の原因となり得、脊髄神経節に潜伏感染する。
サイトメガロウイルスは、出生時や乳児期の感染のほとんどは不顕性感染であり、小児や成人においても多くは不顕性感染であるが、肝炎や単核症を起こすこともある。AIDS患者や悪性腫瘍患者など、免疫不全を起こしている患者では重症化する。このウイルスによる肺炎や網膜炎の治療にはガンシクロビルが用いられる。
ブタヘルペスウイルス1は、オーエスキー病ウイルスとも呼ばれ、その感染症は届出伝染病である。豚をはじめとする多くの動物に感染し、豚では不顕性感染が主であるが、豚以外の動物では神経症状を示して急性経過で死に至る。
EBウイルスは、多くの人が幼児期に不顕性に感染し、キャリヤーとなる。成人の感染は、伝染性単核症などの原因となり、バーキットリンパ腫や上咽頭がんの病因と考えられている。
【0019】
本明細書において感染とは、ウイルスが皮膚や粘膜を介して生体に侵入する過程、又は、ウイルス表面の糖タンパク質が細胞表面の受容体（エントリーレセプター）に会合して膜融合により細胞内に侵入する過程のいずれかを指す用語として用いられる。また、本明細書においてヘルペスウイルス感染症とは、症状の有無にかかわらずウイルスが生体内に侵入している状態をいい、持続感染、不顕性感染、潜伏感染を含む。【0020】
本明細書においてヘルペスウイルス感染症の治療または予防とは、その最も広い意味で用いられ、具体的には、ヘルペスウイルスの感染と関連する一つ又は複数の症状の緩和若しくは悪化の阻止、感染後の症状の発生の抑制、生体内におけるウイルスの細胞への感染の阻止（遅延又は停止）、生体内におけるウイルス数の減少等を生じさせることをいう。【0021】
グリコプロテインB（gB）とは、ヘルペスウイルス表面に存在する糖タンパク質の一つである。同様の糖タンパク質としてgD、gH及びgLがあるが、gB及びgDが細胞表面の受容体に結合する。膜融合を生じさせてウイルスが細胞に感染するためには、gB及びgDの双方が細胞表面の受容体に結合する必要がある。【0022】
非筋ミオシン重鎖IIA（NMHC-IIA）とは、非筋ミオシンII（NM-II）の重鎖アイソフォームの一つである非筋ミオシンIIA（NM-IIA）の重鎖サブユニットである。また、非筋ミオシン重鎖IIB（NMHC-IIB）とは、NM-IIの重鎖アイソフォームの一つである非筋ミオシンIIB（NM-IIB）の重鎖サブユニットである。
NM-IIは、筋細胞を含めたすべての細胞に存在し、細胞質分裂、細胞の移動、細胞の形態変化等の細胞運動において重要な役割を担うタンパク質である。NM-IIは、筋肉のミオシンと同様に、2本ずつの重鎖、必須軽鎖及び調節軽鎖の6つのサブユニットで構成され、2個の球状の頭部と細長い尾部（ロッドドメイン）からなる。頭部はATPase活性部位及びアクチン結合部位を含むモータードメインと、軽鎖結合部位であるネックとからなる。ロッドドメインはα-helical coiled-coil構造をとり、NM-IIが会合して双極性フィラメントを形成することに関与する。C末端（ロッドドメイン先端）はcoiled-coil構造をとらない。
脊椎動物のNM-IIは、Ca2+/カルモジュリン依存性のミオシン軽鎖キナーゼ（myosin light chain kinase; MLCK)によって調節軽鎖のSer19がリン酸化されるとATPase活性が上昇し、フィラメントを形成できるようになる。
脊椎動物には、3種類のNM-II重鎖アイソフォームが存在し、それぞれホモダイマーを形成してNM-IIA、NM-IIB、NM-IICとなる。このうちNM−IIAとNM-IIBはそのアミノ酸配列及び性質においてよく類似しており、NM-IIAとNM-IIBの重鎖のノックアウトマウスは、いずれも胎性致死となることが報告されている。また、NMHC-IIAとNMHC-IIBは、約80％の相同性をもつ。
後述する実施例に示すとおり、生体には、NMHC-IIA優位な細胞（例えば上皮細胞）、NMHC-IIB優位な細胞（例えば神経細胞）、及び、NMHC-IIA又はNMHC-IIBのいずれかのみが発現している細胞が存在することからも、互いに類似する機能を有するものと考えられる（例えば、Bresnik AR, Curr Opin Cell Biol. 1999 Feb;11(1):26-33.; Sellers JR, Biochim Biophys Acta. 2000 Mar 17;1496(1):3-22等、参照）。
【0023】
上述のとおり、これまでにもNM-IIとHSV-1感染との関連についての報告は存在したが、NM-IIはHSV-1の宿主細胞へのエントリーには関与せず、HSV-1が細胞にエントリーした後にNM-IIが活性化されるという内容であった（非特許文献４）。しかしながら、本発明者らは、後述する実施例に示されるとおり、ヘルペスウイルスが個体に感染を開始すると、Ca2+/カルモジュリン複合体がMLCKを活性化することによって、NMHC-IIA及びNMHC-IIBが細胞表面に誘導されることを実証した。そして、NMHC-IIA又はNMHC-IIBとウイルス表面のgBが結合すると、ウイルスと細胞の膜融合が起こってウイルスが細胞に侵入することを確認した。
この結合は、NM-IIAのC末端を含む断片を抗原として作製した抗体によって阻害されることから、ヘルペスウイルスが感染するとNMHC-IIA又はNMHC-IIBが細胞表面に移動してそのC末端が細胞外に露出し、ヘルペスウイルスのエントリーレセプターとして機能するものと考えられた。
なお、本明細書においてエントリーレセプターとは、ヘルペスウイルスが当該レセプターに結合することによって、その後のヘルペスウイルスと細胞との膜融合を引き起こすレセプターをいう。
【0024】
本明細書においてgBとNMHC-IIA又はNMHC-IIBとの結合を阻害する物質（以下、単に「結合阻害物質」という場合もある。）は、gBとNMHC-IIA又はNMHC-IIBとの結合を直接的又は間接的に阻害するものである限り特に限定されず、低分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等、あらゆる物質を用いることができる。具体的には、NM-IIA又はNM-IIBのATPase活性の阻害剤、ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）の阻害剤、抗NMHC-IIA抗体、抗NMHC-IIB抗体、NMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現抑制物質等が挙げられる。以下、これらについて説明する。【0025】
（NMHC-IIA若しくはNMHC-IIBのATPase活性の阻害剤、又はMLCKの阻害剤）本発明のNMHC-IIA若しくはNMHC-IIBのATPase活性の阻害剤、又はMLCKの阻害剤は、細胞内におけるNMHC-IIA又はNMHC-IIBの局在を変化させ、ヘルペスウイルスが感染したときにNMHC-IIA又はNMHC-IIBが細胞表面に移動することを防ぐ。
ATPase活性の阻害剤としては、例えば、ブレビスタチンが挙げられる。
【0026】
MLCKの阻害剤としては、ミオシン軽鎖キナーゼを選択的に阻害するものに加え、ミオシン軽鎖キナーゼの活性を阻害する限り、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、細胞透過性プロテインキナーゼ阻害剤等を用いることができる。具体的には、A3、Calphostin C、Goe6976、Goe7874、HA1077、Hypericin、K-252a、KT5823、ML-7、ML-9、Piceatannol、Staurosporine、W-5、W-7、W-12、W-13、Wortmannin等が挙げられるがこれらに限定されない。中でも、MLCKに対する選択性が高いML-7が好ましい。
また、MLCKはCa2+/カルモジュリン依存性であることから、MLCKの阻害剤として、MLCK経路を阻害するものを用いることもできる。本明細書において、MLCK経路とは、Ca2+とカルモジュリンが複合体を形成し、当該複合体が結合することによってMLCKが活性化され、MLCKがRLCをリン酸化する一連の反応を意味する。従って、MLCK経路を阻害するものとしては、Ca2+とカルモジュリンの複合体形成を阻害するものや、Ca2+/カルモジュリン複合体とMLCKとの結合を阻害するもの（例えば、カルモジュリンアンタゴニスト、カルシウムキレーター、カルシウムアンタゴニスト等）を挙げることができる。
カルシウムキレーターとしては、例えばBAPTA（O,O'−ビス（2‐アミノフェニル） エチレングリコール‐N, N,N',N'‐四酢酸テトラアセトキシエステル）、BAPTAのカルボキシル基をすべてアセトキシメチルエステル化して細胞に取り込ませやすくしたBAPTA-AMが挙げられるが、これらに限定されない。
また、MLCKの機能を阻害するものとして、MLCKのドミナントネガティブ変異体を用いることもできる。ドミナントネガティブ変異体をコードする遺伝子を含むベクターを投与して、生体内で当該変異体を発現させることが好ましい。かかるベクターは当業者が常法に従って作製することができる。例えば、プラスミド等のクローニングサイトに、MLCKのドミナントネガティブ変異体をコードするDNAを挿入する方法、アデノウイルスベクターのバックボーン配列をもつプラスミドと、それに相同的な配列をMLCKのドミナントネガティブ変異体をコードするDNAの両端に配置したシャトルプラスミドとの両方を細胞や大腸菌に導入し、相同組換えによってウイルスベクターを作製する方法、等が挙げられる。
【0027】
（抗NMHC-IIA抗体、抗NMHC-IIB抗体）本発明の抗NMHC-IIA抗体は、NMHC-IIAに特異的に結合し、その結果NMHC-IIAとgBの結合を阻害する。また、本発明の抗NMHC-IIB抗体は、NMHC-IIBに特異的に結合し、その結果NMHC-IIBとgBの結合を阻害する。
発明者らは、NMHC-IIAのC末端を含む断片（NMHC-IIAの1665位〜1960位に相当するペプチド；配列番号：１）を抗原として作製した抗体が、NMHC-IIAとヘルペスウイルスgBとの結合を阻害することを確認した。このことは、NMHC-IIAがウイルス感染によって細胞表面付近に移動すると、そのC末端が細胞膜外に突出してgBと結合することを示す。同様に、ウイルス感染によって細胞表面付近に移動し、C末端が細胞膜外に突出するNMHC-IIBについても、そのC末端を含む断片を抗原として作製した抗体によって、gBとの結合を阻害しうる。
【0028】
本発明の抗NMHC-IIA抗体は、NMHC-IIAとgBとの結合を阻害する限り特に限定されないが、例えば、NMHC-IIAのうち、ヘルペスウイルス感染時に細胞外に露出する領域に結合する抗体であることが好ましい。かかる抗体であれば、NMHC-IIAにおけるgBとの結合領域に結合することにより、NMHC-IIAとgBとの結合を阻害することができる。より具体的には、例えば、NMHC-IIAのC末端付近（例えばC末端から1000アミノ酸）における、約1〜約500アミノ酸、好ましくは約100〜約400アミノ酸程度、より好ましくは約200〜300アミノ酸程度の領域に結合する抗体が挙げられる。一例として、NMHC-IIAの1665位〜1960位に相当する領域に結合する抗体が挙げられる。
【0029】
また、本発明の抗NMHC-IIB抗体は、NMHC-IIBとgBとの結合を阻害する限り特に限定されないが、例えば、NMHC-IIBのうち、ヘルペスウイルス感染時に細胞外に露出する領域に結合する抗体であることが好ましい。かかる抗体であれば、NMHC-IIAにおけるgBとの結合領域に結合することにより、NMHC-IIBとgBとの結合を阻害することができる。より具体的には、例えば、NMHC-IIBのC末端付近（例えばC末端から1000アミノ酸）における、約1〜約500アミノ酸、好ましくは約100〜約400アミノ酸程度、より好ましくは約200〜300アミノ酸程度の領域に結合する抗体が挙げられる。一例として、NMHC-IIBの1672位〜1976位に相当する領域に結合する抗体が挙げられる。
【0030】
本明細書において「抗体」は抗体断片も含むものとし、本発明の抗NMHC-IIA抗体又は抗NMHC-IIB抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2抗体、scFv、二重特異抗体、合成抗体等であり得る。これらの抗体は、当業者に公知の方法に従って作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、NMHC-IIA又はNMHC-IIBで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、NMHC-IIA又はNMHC-IIBで免疫した動物の血清等から得ることができる。
ここで、免疫に用いるNMHC-IIA又はNMHC-IIBは、ヒト由来であっても他の動物由来であってもよく、また、全長を用いることも断片を用いることもでき、当業者が適宜決定することができる。断片である場合、例えば、NMHC-IIA又はNMHC-IIBにおける、ヘルペスウイルス感染時に細胞外に露出する領域の断片を用いることができる。また、例えば、NMHC-IIA又はNMHC-IIBのC末端付近（例えばC末端から1000アミノ酸）における、約1〜約500アミノ酸、好ましくは約100〜約400アミノ酸程度、より好ましくは約200〜300アミノ酸の断片とすることができる。例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるNMHC-IIAの1665位〜1960位の296アミノ酸からなる断片（以下、「NMHC-IIAのC末端断片」という場合もある。）や、配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるNMHC-IIBの1672位〜1976位の305アミノ酸からなる断片（以下、「NMHC-IIBのC末端断片」という場合もある。）を用いてもよい。
【0031】
また、一旦NMHC-IIA又はNMHC-IIBとヘルペスウイルスとの結合を効率よく阻害する非ヒトモノクローナル抗体が得られれば、これを遺伝子組換え法により産生することもできる。例えば、当該抗NMHC-IIAモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから標準的な手法により全RNAを調製し、市販のキットを用いて抗NMHC-IIA抗体をコードするmRNAを調製した後、逆転写酵素を用いてcDNAを合成すれば、抗NMHC-IIA抗体をコードするDNAを得ることができる。かかるDNAを含む発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトし、適当な条件で培養することにより、抗NMHC-IIA抗体を発現させることができる。抗NMHC-IIB抗体も同様に発現させることができる。【0032】
また、上記cDNAを鋳型とするPCR法によって、CDR領域をコードするDNAを得ることもできる。かかるCDR領域をコードするDNAを利用して、常法に従って遺伝子組換え法によりヒト抗体やヒト化抗体を作製することもできる。例えば、非ヒト抗体に由来するCDR領域をコードするDNAと、ヒト抗体のフレームワーク領域を連結するように設計したDNAをPCR法により合成し、さらにヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結することによって、ヒト抗体をコードするDNAを得ることができる。かかるDNAを公知の方法（制限酵素を利用する方法等）で、発現ベクター（例えば、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソーム）に挿入し、当該発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトさせ、形質転換体を得る。なお、発現ベクターは、さらに抗体遺伝子の発現を調節するプロモータ、複製起点、選択マーカー遺伝子等を含むことができる。プロモータ及び複製起点は、宿主細胞とベクターの種類によって適宜選択することができる。
次に、形質転換体を適当な条件で培養することにより、抗NMHC-IIA抗体又は抗NMHC-IIB抗体のヒト抗体を発現させることができる。
宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞（CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞等）、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞（サッカロミセス属、アスペルギルス属等）といった真核細胞や、大腸菌（E.Coli）、枯草菌などの原核細胞を用いることができる。
【0033】
発現させた抗体は、公知の方法（例えば、プロテインA等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等）を適宜組み合わせて単離・精製することができる。本発明の抗NMHC-IIA抗体又は抗NMHC-IIB抗体が、Fab断片、F(ab')2抗体、scFv等の低分子抗体である場合は、低分子抗体をコードするDNAを用いて上記方法で発現させることもでき、また、抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製することもできる。
【0034】
（NMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現抑制剤）本発明のNMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現抑制剤は、細胞内におけるNMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現を抑制する物質である限り特に限定されないが、例えば、RNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、及びこれらをコードする核酸を挙げることができる。NMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現自体を阻害することにより、ヘルペスウイルス感染時にレセプターとして機能するNMHC-IIA又はNMHC-IIBを減少させ、ヘルペスウイルスが細胞内に侵入するのを防ぐことが可能である。
【0035】
RNAi効果は、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。標的特異性が非常に高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。RNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、siRNAが挙げられる。siRNAは、哺乳動物細胞に用いられる場合、通常19〜30塩基程度、好ましくは21塩基〜25塩基程度の二本鎖RNAである。但し、本発明のNMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現抑制剤としては、酵素（Dicer）により切断されてsiRNAとなり得るより長い二本鎖RNAであってもよい。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、一般に、その一方が標的核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、他方がこれに相補的な配列を有する。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、互いに3'末端に2塩基の突出塩基（オーバーハング）を有していることが一般的であるが、オーバーハングを有しないブラントエンド型であってもよい。例えば、25塩基のブラントエンドRNAは、インターフェロン応答遺伝子の活性化を最小にし、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぎ、血清中で安定性が非常に高いという利点を有し、in vivoでの使用にも適している。
RNAi効果を有する二本鎖核酸は、標的遺伝子の塩基配列に基づき、公知の方法に従って設計することができる。また、RNAi効果を有する二本鎖核酸は、二本鎖RNAであってもよいし、DNA-RNAキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸や各種の修飾が施された核酸であってもよい。
【0036】
本発明のRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、NMHC-IIAをコードする遺伝子における配列番号：２に記載の塩基配列を含む領域を標的とするものが好ましい。かかる二本鎖核酸としては、例えば、配列番号：３に記載の塩基配列を有するRNAと、配列番号：４に記載の塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNAが挙げられる。また、本発明のRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、NMHC-IIBをコードする遺伝子における配列番号：８に記載の塩基配列を含む領域を標的とするものが好ましい。かかる二本鎖核酸としては、例えば、配列番号：９に記載の塩基配列を有するRNAと、配列番号：１０に記載の塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNAが挙げられる。
【0037】
アンチセンス核酸は、標的遺伝子（基本的には転写産物であるmRNA）に相補的な塩基配列を有し、一般的には10塩基長〜100塩基長、好ましくは15塩基長〜30塩基長の一本鎖核酸である。アンチセンス核酸を細胞内に導入し、標的遺伝子にハイブリダイズさせることによって遺伝子の発現が阻害される。アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現阻害効果が得られる限り、標的遺伝子と完全に相補的でなくてもよい。アンチセンス核酸は、公知のソフトウエア等を用いて当業者が適宜設計することができる。アンチセンス核酸は、DNA、RNA、DNA-RNAキメラのいずれであってもよく、また修飾されていてもよい。【0038】
リボザイムは、標的RNAを触媒的に加水分解する核酸分子であり、標的RNAと相補的な配列を有するアンチセンス領域と、切断反応を担う触媒中心領域から構成されている。リボザイムは当業者が公知の方法に従って適宜設計することができる。リボザイムは一般的にはRNA分子であるが、DNA-RNAキメラ型分子を用いることもできる。【0039】
上述したRNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、リボザイムのいずれかをコードする核酸も、本発明のNMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現抑制剤として用いることができる。かかる核酸を含むベクターを細胞内に導入すれば、細胞内でRNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、及びリボザイムが発現し、それぞれNMHC-IIA又はNMHC-IIBの発現抑制効果を発揮する。RNAi効果を有する二本鎖核酸をコードする核酸としては、二本鎖のそれぞれをコードするDNAを用いてもよいし、二本鎖核酸がループを介して連結されてできる一本鎖核酸をコードするDNAを用いてもよい。後者の場合、細胞内で転写により得られる一本鎖RNAは、その相補的な部分が分子内でハイブリダイズし、ヘアピン型の構造を取る。このRNAはshRNA（short hairpin RNA）と呼ばれる。shRNAは細胞質に移行すると酵素（Dicer）によってループ部分が切断され、二本鎖RNAとなって、RNAi効果を発揮する。
上述した配列番号：２に記載の塩基配列を標的とする二本鎖RNAは、配列番号：５に記載のDNAを用いて細胞内でshRNAを発現させることによって得ることもできる。また、配列番号：８に記載の塩基配列を標的とする二本鎖RNAは、配列番号：１１に記載の塩基配列からなるDNAを用いて細胞内でshRNAを発現させることによって得ることもできる。
【0040】
（可溶型NMHC-IIA又は可溶型NMHC-IIB）本発明の可溶型NMHC-IIAは、細胞外でヘルペスウイルスgBと結合し、その結果、細胞表面のNMHC-IIAとgBとの結合を阻害する。
可溶型NMHC-IIAは、gBとの結合能を有し、NMHC-IIA若しくはその変異体の全部又は一部を含む分子である。
可溶型NMHC-IIAがNMHC-IIAの一部を含む場合、gBとの結合能を有する限りどの部分を含んでいてもよいが、例えば、NMHC-IIAのロッドドメインやC末端断片とすることができる。
可溶型NMHC-IIAは、NMHC-IIAの全部又は一部と、他の可溶型タンパク質との融合タンパク質であってもよい。かかる可溶型タンパク質としては、例えば、IgGタンパク質やそのFc領域が好ましく用いられる。
可溶型NMHC-IIAは、当業者が遺伝子組換え法により作製することが可能である。
【0041】
一方、本発明の可溶型NMHC-IIBは、細胞外でヘルペスウイルスgBと結合し、その結果、細胞表面のNMHC-IIBとgBとの結合を阻害する。可溶型NMHC-IIBは、gBとの結合能を有し、NMHC-IIB若しくはその変異体の全部又は一部を含む分子である。
可溶型NMHC-IIBがNMHC-IIBの一部を含む場合、gBとの結合能を有する限りどの部分を含んでいてもよいが、例えば、NMHC-IIBのロッドドメインやC末端断片とすることができる。
可溶型NMHC-IIBは、NMHC-IIBの全部又は一部と、他の可溶型タンパク質との融合タンパク質であってもよい。かかる可溶型タンパク質としては、例えば、IgGタンパク質やそのFc領域が好ましく用いられる。
可溶型NMHC-IIBは、当業者が遺伝子組換え法により作製することが可能である。
【0042】
（医薬組成物）本発明の医薬組成物は、経口的又は非経口的に、全身にあるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
【0043】
また、本発明の医薬組成物には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、gBとNMHC-IIA又はNMHC-IIBとの結合を阻害する物質（有効成分）とともに投与可能な材料を意味する。製剤上許容しうる担体は、薬理学的及び製剤学的に許容されるものであればよく、特に制限されない。例えば、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤、賦形剤、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるがこれらに限定されない。【0044】
本発明の医薬組成物は、通常の医療製剤の形態に製剤化することができる。当該医療製剤は、上記担体を用いて適宜調製される。医療製剤の形態としては特に限定はなく、治療目的に応じて適宜選択して使用される。その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤、乳剤）等が挙げられる。これら製剤は、通常用いられる方法により製造すればよい。【0045】
また、本発明の医薬組成物が核酸を含む場合、リポソーム、高分子ミセル、カチオン性キャリア等のキャリアに核酸を封入して製剤化することができる。また、プロタミンのような核酸キャリアを利用してもよい。これらのキャリアに抗体等を結合させて、患部を標的化することも好ましい。また、核酸にコレステロール等を結合させて血中滞留性を高めることも可能である。また、本発明の医薬組成物が、siRNA等をコードする核酸を含み、投与された後細胞内で発現させるものである場合、当該核酸を、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターに挿入し、細胞内に投与することもできる。【0046】
また、本発明の医薬組成物に含まれる有効成分の量は、当業者が有効成分の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、抗NMHC-IIA抗体又は抗NMHC-IIB抗体の場合、投与量は、0.025〜50mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kgであり、より好ましくは0.1〜25mg/kg、さらに好ましくは0.1〜10mg/kg又は0.1〜3mg/kgとすることができるが、これに限定されない。本発明の医薬組成物は、ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療を目的として、ヒト又はヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、サル）等に投与することができる。
【0047】
（治療方法）本発明は、上述した本発明に係る医薬組成物を治療有効量投与することを特徴とするヘルペスウイルス感染症の予防又は治療方法も包含する。本明細書において、治療有効量とは、ヘルペスウイルスの感染と関連する一つ又は複数の症状の緩和若しくは悪化の阻止、感染後の症状の発生の抑制、生体内におけるウイルスの細胞への感染の阻止（遅延又は停止）、生体内におけるウイルス数の減少等を生じさせる量を意味する。
本発明の治療方法は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、サル）を対象して用いられる。
【0048】
（スクリーニング方法）本発明は、ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療のための医薬のスクリーニング方法も提供する。
本発明に係るスクリーニング方法の一態様は、
NMHC-IIA又はNMHC-IIBを発現する細胞を候補化合物で処理する工程と、
前記細胞にヘルペスウイルスを感染させる工程と、
前記細胞における、NMHC-IIA又はNMHC-IIBの細胞膜付近への移動、又は前記細胞へのヘルペスウイルスの侵入の少なくとも一方を測定する工程と、を含む。
NMHC-IIA又はNMHC-IIBを発現する細胞は、もともとこれらを発現する細胞であってもよいし、もともと発現しない細胞又は発現量の少ない細胞を、NMHC-IIA又はNMHC-IIBをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換して発現させてもよい。もともとNMHC-IIAを発現する細胞としては、例えばVero細胞を用いることができ、NMHC-IIBを発現する細胞としては、Vero細胞やCos-1細胞を用いることができる。また、もともとNMHC-IIAの発現がほとんど見られない細胞としては、HL60細胞を用いることができ、NMHC-IIBの発現がほとんど見られない細胞としては、IC21細胞を用いることができる。
【0049】
候補化合物は、低分子化合物、高分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等どのような物質であってもよい。候補化合物での処理は、感染に先立って行ってもよいし、感染させる工程と並行して行ってもよく、また感染させた後で行うこともでき、候補化合物の性質に応じて当業者がその方法を決定することができる。【0050】
NMHC-IIA又はNMHC-IIBの細胞膜付近への移動は、後述する実施例に示すとおり、蛍光標識した抗NMHC-IIA抗体又は抗NMHC-IIB抗体をNMHC-IIA、NMHC-IIBに結合させ、蛍光顕微鏡で検出することによって、観察することができる。また、ヘルペスウイルスの細胞内への侵入は、後述する実施例に示すとおり、ヘルペスウイルスとして、緑色蛍光タンパク質（GFP）や、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）の発現カセットを有する遺伝子組換えヘルペスウイルスを感染させることにより、蛍光顕微鏡で容易に観察することができる。こうして選択された医薬は、NMHC-IIA又はNMHC-IIBが、ヘルペスウイルスのgBの受容体として機能することを阻害し、ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療薬として有用である。
【0051】
また、本発明に係るスクリーニング方法の別の態様は、NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBとが結合できる条件下で、NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBと候補化合物とを接触させる工程と、
NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBとの結合を測定する工程と、を含む。
NMHC-IIA又はNMHC-IIBは、単離されたものを用いてもよく、NMHC-IIA又はNMHC-IIBを発現する細胞を用いてもよい。また、gBとの結合部位を含む部分ペプチドや、可溶型のものを用いてもよい。また、gBは、gBを表面に有するウイルスを用いてもよいし、後述する実施例1に示すように、ウイルスを感染させた細胞を用いてもよい。
NMHC-IIA又はNMHC-IIBとgBとの結合を測定する工程は、免疫沈降法、フローサイトメトリー等、タンパク質間の相互作用を検出する公知の方法を当業者が適宜選択して行うことができる。
【実施例】
【0052】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。【0053】
〔ウイルス〕以下の実施例に用いた各種のウイルスは以下のとおりである。
YK711及びYK712
それぞれ、Myc-TEV-Flag(MEF)tagで標識したgB（MEF-gB）、又はMyc-TEV-Flag(MEF)tagで標識したgH（MEF-gH）を発現する組換えHSV-1である。Katoらの方法（Kato, A. et al. J Virol82, 6172-6189 (2008)）に従い、pYEbac102を含むE. coli GS1783（Jarosinski, K. et al. J Virol 81, 10575-87.）を用いて、2段階Red組換え法（two-step Red-mediated mutagenesis；Jarosinski, K. et al. J Virol 81, 10575-87.）により調製した。
調整方法の概略を図８に示す。
野生型HSV-1(F)、gB欠損ウイルス及びその復帰変異ウイルス（gB欠損ウイルスにおいて欠失しているgB配列が回復されたもの）
Satohら及びKawaguchiらの方法に従って用意した（Kawaguchi, Y. et al. J Virol 73, 4456-60., Satoh, T.et al. Cell 132, 935-44.）。
HSV-1 GFP
UL3遺伝子及びUL4遺伝子の遺伝子間領域において、Egr-1プロモータの制御下に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）の発現カセットを有する遺伝子組換えHSV-1である。
HSV-2 GFP
UL50遺伝子及びUL51遺伝子の遺伝子間領域において、サイトメガロウイルスプロモータの制御下に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）の発現カセットおよびbacmidを有する遺伝子組換えHSV-2である（J. Virol. 83: 11624-11634, 2009.）。
PRV GFP
gG locusにおいて、ヒトサイトメガロウイルスプロモータの制御下にEGFPを有する組換え仮性狂犬病ウイルスPRV151。Dr. L. W. Enquistから提供を受けた。
HSV-1 GFP及びPRV GFPは、培養細胞中で野生型ウイルスと同様に成長し、感染した細胞内においてのみ蛍光タンパク質を発現する。
【0054】
〔融合タンパク質、ペプチド等〕実施例で用いた融合タンパク質やペプチドは、以下のプラスミドを用いて発現させた。
pGEX-NMHC-IIArod
グルタチオンS-トランスフェラーゼとNMHC-IIAのC末端断片（配列番号：１）との融合タンパク質（GST-NMHC-IIArod）を産生するためのプラスミドである。NMHC-IIAのC末端断片のコード領域をpEGFP-ARF296（Sato, M.et al. Mol Biol Cell 18, 1009-17.）からPCRにより増幅することにより構築し、得られたDNA断片をpGEX-4T3（GE Healthcare社）に、GSTとともにインフレームにクローニングした。
pGEX-NMHC-IIBrod
グルタチオンS-トランスフェラーゼとNMHC-IIBのC末端断片との融合タンパク質（GST-NMHC-IIBrod）を産生するためのプラスミドである。NMHC-IIBのC末端断片のコード領域をpEGFP-BRF305（Sato, M.et al. Mol Biol Cell 18, 1009-17.）からPCRにより増幅することにより構築し、得られたDNA断片をpGEX-4T3（GE Healthcare社）に、GSTとともにインフレームにクローニングした。
pME-Ig-NMHC-IIArod及びpME-Ig-NMHC-IIBrod
可溶型NMHC-IIA、可溶型NMHC-IIBである、IgとNMHC-IIA又はNMHC-IIBのC末端断片との融合タンパク質（それぞれ、NMHC-IIArod-Ig及びNMHC-IIBrod-Ig）を産生するためのプラスミドである。
pME-Ig-NMHC-IIArodは、pGEX-NMHC-IIArodと同様の方法で作製した。但し、pGEX-4T-3の代わりに修正したpME18S発現ベクターを用いた。修正pME18S発現ベクターは、N末端にマウスCD150リーダーセグメントを含み、C末端にヒトIgG1のFc領域を含む。Fc領域は、細胞のFc受容体への結合親和性を低下させるために、266位及び267位のロイシンをそれぞれアラニンとグルタミンに変異させ、HSV-1のFc受容体（gE）への結合親和性を低下させるために、467位のヒスチジンをアルギニンに変異させた。
pME-Ig-NMHC-IIBrodも同様の方法で作製した。但し、pME-Ig-NMHC-IIBrodには、NMHC-IIBのC末端断片（配列番号：７）のコード領域は、pEGFP-BRF305（Sato, M.et al. Mol Biol Cell 18, 1009-17.）からPCRにより増幅することにより構築した。
pMxs-NMHC-IIA-puro
プラスミド11347（Addgene社）由来のNMHC-IIAのオープンリーディングフレームは、pMxs-puro（Morita, S. et al. Gene Ther 7, 1063-6.）にクローニングした。このプラスミドをpMxs-NMHC-IIA-puroと呼ぶ。
Flag-MYH10発現ベクター
Uchiyama Y et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 18;107(20):9240-5.の方法に従って作製した。
pEP98-gB、pPEP99-gD、pPEP101-gL、及びpPEP100-gH（HSV-1糖タンパク質発現プラスミド）
HSV-1のgB、gD、gL、及びgHを発現させるためのプラスミドである。Northwestern Universityから入手した（Pertel, P. E.et al. Virology 279, 313-24）。
pT7EMCLuc
融合効率の定量のために用いた。T7 RNAポリメラーゼをコードするpCAGT7、及びT7プロモータ制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドである（Okuma, K.et al. Virology 254, 235-44.）。
pSSSP-NMHC-IIA、pSSSP-NMHC-IIB及びpSSSP-Cre
NMHC-IIA、NMHC-IIBに対するshRNAを発現する安定なcell lineを産生するために、pSSSP-NMHC-IIA及びpSSS-NMHC-IIBを以下の方法で構築した。
NMHC-IIAに対するshRNAをコードするDNA（配列番号：５）を、pmU6のBbsI部位及びEcoRI部位にクローニングした。得られたプラスミドのBamHI-EcoRIフラグメント（U6プロモータ及びNMHC-IIAに対するshRNAをコードする配列を含む）を、pSSSPのBamHI及びEcoRI部位にクローニングし、pSSSP-NMHC-IIAを得た。pSSSPは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスベクターpMXの誘導体である。
pSSSP-NMHC-IIBも、pSSSP-NMHC-IIAと同様に作製した。但し、NMHC-IIBに対するshRNAをコードするDNAとして、配列番号：１１に記載の塩基配列からなるDNAを使用した。
コントロールとして、Creリコンビナーゼに対するshRNAをコードするpSSSP-Creを（Haraguchi, T., et al. FEBS Lett 581, 4949-54.）に従って用意した。
【0055】
〔細胞及び培地〕実施例で用いた細胞は、以下のとおりである。
CHO-hPILRα細胞及びCHO-hNectin-1細胞：それぞれヒトPILRα又はヒトNectin-1を安定に発現する形質転換体である（Arii, J. et al. J Virol. 83, 4520-7.）
HL60/NMHC-IIA細胞及びHL60/puro細胞：pMXs-NMHC-IIA又はpMxs-puroを含む組換えレトロウイルスによって形質転換されたピューロマイシン耐性を有するHL60細胞である。具体的には、plat-GP細胞を、pMxs-NMHC-IIA-puro又はpMxs-puroとpMDGとにより共形質転換した。2日後、上清を回収した。HL60細胞に、レトロウイルスを含む形質転換plat-GP細胞の上清を感染させて形質導入し、維持培地に0.5μg/mlのピューロマイシンを加えて形質転換された細胞を選択した。
IC21/NMHC-IIB細胞及び、IC21/puro細胞：Flag-MYH10発現ベクター又はpMxs-puroを含む組換えレトロウイルスによって形質転換されたピューロマイシン耐性を有するIC21細胞である。具体的には、IC21細胞をFlag-MYH10発現ベクターまたはpMxs-puroで形質転換し、2日後から0.25μg/mlのpuromycinを含む維持培地で培養して、形質転換された細胞を選択した。
199培地、Ham F-12培地、1％FCSを加えたRPMI1640培地、1％FCSを加えた199倍地を、様々な種類のVero細胞、CHO細胞、HL60細胞、IC21細胞、HEL細胞へのウイルス感染に用いた。
【0056】
〔抗体〕実施例で用いた抗体は、以下のとおりである。
gB（1105）、Flag（M2）及びMyc（PL14）に対するマウスモノクローナル抗体：それぞれGoodwin Institute社、Sigma社及びMBL社から購入した。
NMHC-IIAのC末端に対するウサギポリクローナル抗体：Sigma社から購入した。当該抗体は、NMHC-IIAのC末端の11アミノ酸（配列番号：６）をエピトープとして認識する。
実施例4に用いたNMHC-IIAのC末端断片に対するウサギポリクローナル抗体（抗NMHC-IIA血清）：上記pGEX-NMHC-IIArodをE.coliで発現させたGST-NMHC-IIArodでウサギを免疫し、通常のプロトコル（MBL社）に従って精製した。免疫したウサギの血清を、抗NMHC-IIArodポリクローナル抗体として用いた。コントロールとなるウサギ血清は、MBL社から購入した。
NMHC-IIBのC末端に対するウサギポリクローナル抗体：Sigma社から購入した。当該抗体は、NMHC-IIBのC末端（1965位から1976位）の12アミノ酸（配列番号：１２）をエピトープとして認識する。
抗リン酸化RLC抗体及び抗RLC抗体は、Cell signaling Technology社から購入した。
【0057】
実施例1：gBと結合する新規HSVエントリーレセプターの探索<マウス胎児繊維芽細胞（MEF細胞）におけるエントリーレセプターの探索>
MEF細胞又はIC21細胞（マウスマクロファージ様細胞）に、4℃で2時間、YK711を感染させた後、細胞を37℃に移して2分後に回収した。2mMのDTSSP（Piers社）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、4℃で2時間処理した後、RIPA緩衝液（1% NP-40, 0.1% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl [pH7.4], 1mM EDTA）中で溶解させた。
遠心分離後に得られた上清を、抗mycモノクローナル抗体（MBL社）を用いた第一の免疫沈降に供し、免疫沈降物をAcTEVプロテアーゼ（Invitrogen社）と反応させた。また、上記上清を、抗Flagモノクローナル抗体（Sigma社）を用いた第二の免疫沈降に供し、免疫沈降物を変性ゲル中で電気泳動によって分離し、銀染により可視化した。
これにより、繊維芽細胞という生体内に広く分布する細胞において、gBと結合するタンパク質を検出することができる。
結果を図１Ａに示す。
次に、MEF細胞のみで見られたバンド（矢印）を切り出し、ゲル中でトリプシン消化を行い、質量分析に供した。質量分析の結果、バンドの一つがNMHC-IIAと同定された。
【0058】
<NMHC-IIAとNMHC-IIBの発現>Vero細胞及びCos-1細胞において、NMHC-IIA、及びNMHC-IIAと類似した機能を有するNMHC-IIBの発現を、それぞれ抗NMHC-IIA抗体、抗NMHC-IIB抗体を用いて検出した。結果を図１６Ａに示す。Vero細胞には、両方発現していたが、Cos-1細胞にはNMHC-IIBのみ発現していた。
【0059】
<免疫沈降>PILRとMAG以外のHSVのエントリーレセプターを見出すために、膜透過性を有しないクロスリンカーを用いたタンデムアフィニティー精製法を、質量分析法を用いるプロテオミクス技術と組み合わせた方法（Oyama, M. et al. Mol Cell Proteomics 8, 226-31.）を用いた。具体的な方法は以下のとおりである。
Vero細胞に、YK711、YK712又はHSV-1(F)を4℃で2時間感染させた。細胞を37℃に移し、2分後に回収してPBSで洗浄し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含むTNE緩衝液（1% NP-40, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl [pH7.8], 1mM EDTA）中で溶解させた。遠心分離後の上清を、プロテインA-セファロースビーズと4℃で30分インキュベートしてクリアにした。短い遠心分離の後、上清を、抗Flag抗体又は抗gB抗体と4℃で2時間反応させた。続いてプロテインA-セファロースビーズを加え、回転させながらさらに4℃で1時間反応させた。免疫沈降物は、短時間の遠心分離によって回収し、TNE緩衝液できれいに洗浄した後、抗NMHC-IIA抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
結果を図１Ｂに示す。
MEF-gBを発現するYK711又は野生型HSV-1(F)を感染させたVero細胞の細胞溶解物において、NMHC-IIAは、MEF-gB又は野生型gBと共に沈降した。
また、Vero細胞に変えてCos-1細胞を用いて同様の実験を行い、最後に抗NMHC-IIB抗体を用いたイムノブロッティングによって解析した結果を図１６Ｂ及びＣに示す。図１６Ｂは、YK711またはYK712を感染させた結果であり、図１６Ｃは、野生型HSV-1(F)を感染させた結果である。
NMHC-IIAの場合と同様に、MEF-gBを発現するYK711、又は野生型HSV-1(F)を感染させたCos-1細胞の溶解物において、NMHC-IIBはMEF-gB又は野生型gBと共に沈降し、NMHC-IIBもgBと結合することが確認された。
【0060】
<野生型HSV-1(F)、gB欠損ウイルス、又は復帰変異ウイルスと可溶性NMHC-IIA C末端断片との結合>NMHC-IIArod-IgはCos-1細胞に産生させた。293T細胞にHSV-1を感染させ、12h後に感染細胞を回収した（A）。また、別の293T細胞にHSV-1糖タンパク質発現プラスミドをリポフェクタミンを用いて導入し、18時間後に細胞を回収した（B）。細胞はNMHC-IIArod-Igと氷上で30分反応させた。細胞を2％FCS入りPBSで洗浄後、二次抗体(PE標識anti-human IgG抗体)と氷上で30分反応させた。細胞は再び2％FCS入りPBSで洗浄し、flow cytometerによって解析を行った。
（A）及び（B）の結果をそれぞれ図２Ａ及びＢに示す。
gB欠損ウイルス感染細胞（YK701(dgB)-infected）は、NMHC-IIArod-Ig（NMHC-IIAのC末端断片とIgとの融合タンパク質）によって認識されなかった（図２Ａ中段）。一方、野生型HSV-1(F)感染細胞（F-infected）、及び野生型gBを発現するgB欠損ウイルスの復帰変異ウイルス感染細胞（YK702(repair)-infected）は、NMHC-IIArod-Igに認識された（図２Ａ上段及び下段）。
この結果と一致して、HSV-1のgBトランスフェクタントはNMHC-IIArod-Igに認識され、HSV-1のgDトランスフェクタントは認識されなかった（図２Ｂ）。
これらの結果から、NMHC-IIAのC末端領域がHSV-1のgBと相互作用していることが示唆された。
次に、NMHCIIBrod-IgをCos-1細胞に産生させ、293T細胞にHSV-1糖タンパク質発現プラスミドをリポフェクタミンを用いて導入し、上記（B）と同様の実験をNMHC-IIBについて行った。結果を図１７Ａ及びＢに示す。gBを表面に発現する細胞は、NMHC-IIBrod-Igで染色され、NMHC-IIBもC末端領域がHSV-1のgBと相互作用していることが示唆された。
【0061】
実施例2：HSV-1侵入時におけるNMHC-IIAの細胞内での移動Vero細胞に、野生型HSV-1(F)を4℃で2時間感染させ、37℃に移した後、0分後、2分後、及び15分後に、抗NMHC-IIA抗体を用いた免疫蛍光法（FITC標識した二次抗体を使用）により、NMHC-IIAの細胞内での局在を分析した。
mock感染させた細胞と、HSV-1(F)を4℃で感染させた細胞（0分後）では、NMHC-IIAは細胞質全体に分布していた。HSV-1が侵入を開始すると（37℃に移して2分後及び15分後）、NMHC-IIAの細胞膜付近における濃度が有意に高くなった（図３Ａ）。
また、mock感染させた細胞、又は野生型HSV-1(F)を4℃で2時間感染させた後37℃に移して15分経過した細胞の細胞表面タンパク質をビオチン化し、アビジンビーズによる免疫沈降を行い、続いて抗NMHC-IIA抗体によるイムノブロッティングを行った。
より具体的には、Vero細胞に、MOI=5のHSV-1(F)を4℃で2時間感染させた。細胞を37℃に移して、2分後及び15分後に氷冷したBPSで4回洗浄し、開裂可能なsulfo-NHS-SS-Biotin（Pierce社）を用いて、15分ずつ2回ビオチン化した。
0.2％BSAを加えて氷冷したDMEMで1回洗浄し、10％FCSを加えたPBSで2回洗浄した後、細胞は、mock処理に供するか、又は、細胞表面のタンパク質から残存したビオチン標識を除去するために、新たに用意した還元溶液（15.5mg of glutathione/ml、75mM NaCl、0.3％のNaOH、10％の仔ウシ血清）による処理を、4℃で20分、2回行った。
0.2％BSAを加えたDMEMで2回洗浄し、1％BSAを加えた5mg/mlのヨードアセトアミド（PBS中）でフリーのSH基をクエンチした後、細胞を回収し、プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含むRIPA緩衝液中で可溶化させた。アビジンビーズで沈澱させ、抗NMHC-IIA抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
結果を図３Ｂに示す。
正常Vero細胞の細胞表面においてNMHC-IIAが発現していること、及び、ウイルス侵入に伴ってNMHC-IIAの細胞表面における量が上昇することを確認した。
さらに、MEF-gBを発現するHSV-1（YK711）を感染させた細胞で抗Flag抗体と共に沈降したNMHC-IIAはビオチン化されていたが、MEF-gHを発現するHSV-1（YK712）を感染させた細胞では、ビオチン化されたNMHC-IIAと同等の分子量を有するタンパク質は検出されなかった（図３Ｃ）。
これらの結果は、HSV-1の侵入により、NMHC-IIAの細胞表面での濃度が増大し、細胞表面のNMHC-IIAがgBと相互作用することを示している。
HSV-1の侵入から15分以内に細胞表面における発現が上昇するというNMHC-IIAの性質は、これまでに報告されたHSV-1のエントリーレセプターには見られないNMHC-IIAに特有のものである。この性質は、HSV-1は細胞への吸着から侵入までに10分から15分のタイムラグがあるという過去の報告と一致するものであり、その現象を説明するものである。このようなタイムラグは、ワクシニアウイルスやインフルエンザウイルスの感染では見られない。
【0062】
実施例3-1：NMHC-IIAの細胞内局在の制御によるHSV-1感染の阻害NM-IIAの細胞内局在は、NM-IIAのサブユニットである調節軽鎖（Regulatory light chain; RLC）がミオシン軽鎖キナーゼ（myosin light chain kinase; MLCK）でリン酸化されることによって一部制御される。
そこで、MLCKの特異的阻害剤であるML-7が、NMHC-IIAの再配置に及ぼす影響を調べた。具体的には、Vero細胞を様々な濃度のML-7で30分間前処理し、同濃度のML-7存在下で、24穴プレートにおいて、HSV-1 GFPをMOI=1で接種した。接種材料を除去した後、細胞に、同濃度のML-7を含む培地を与えた。
感染の5時間、6時間又は12時間後に、細胞を蛍光顕微鏡（Olympus IX71）で観察するか、Cell Questソフトウエア（Becton Dickinson）を使用してFACSCaliburで分析した。
また、インフルエンザウイルスを用いて同様の実験を行った。
結果を図４に示す。
ウイルス侵入時の、細胞膜付近におけるNMHC-IIA濃度の上昇は、ML-7によって阻害された(図４Ｂ)。
HSV-1 GFPによる感染もML-7によって用量依存的に阻害されたが(図４Ａ)、インフルエンザによる感染にはML-7は影響しなかった(図４Ｃ)。
これらの結果は、HSV-1侵入時にNMHC-IIAが細胞表面に移動することを含むNM-IIAの制御が、効率的なHSV-1感染に必要とされることを示した。
NMHC-IIAの移動は、ウイルス侵入の直後におこるシグナルパスウェイの調節によって制御されるものと考えられる。HSV-1の侵入は、細胞膜及び細胞内のカルシウム濃度の急激な上昇を惹起し（Cheshenko, N. et al. Mol Biol Cell 18, 3119-30）、これがMLCKを介したNM-II RLCのリン酸化を引き起こす。
NM-II RLCをリン酸化してNM-IIの局在を制御するMLCKの特異的阻害剤が、ウイルス侵入時におけるNMHC-IIAの移動、及びHSV-1感染を阻害するという今回示された事実は、HSV-1侵入によるカルシウムシグナリングパスウェイの活性化が、NMHC-IIAの移動を引き起こし、gBとの相互作用によるウイルスエントリーを仲介するという仮説をサポートするものである。
【0063】
次に実施例2と同様の方法で、ML-7による前処理を行ったCos-1細胞、又は行っていないCos-1細胞に野生型HSV-1(F)を感染させ、細胞表面タンパク質をビオチン化し、アビジンビーズによる免疫沈降を行った後に、抗NMHC-IIB抗体を用いてイムノブロッティングを行った。結果を図１８Ａに示す。HSV-1を感染させると細胞膜付近におけるNMHC-IIB濃度が上昇したが、ML-7で処理すると当該濃度は著しく低下した。
また、実施例3と同様に、Cos-1細胞を様々な濃度のML-7で30分間前処理し、同濃度のML-7の存在下で、24穴プレートにおいて、HSV-1 GFPをMOI=1で接種し、接種材料を除去した後、細胞に同濃度のML-7を含む培地を与えた。さらに、HSV-1 GFPに代えてインフルエンザウイルスを用いて同様の実験を行った。
結果を図１８Ｂ及びＣに示す。図１８Ｂに示すとおり、HSV-1による感染は、ML-7によって用量依存的に阻害された、インフルエンザウイルスの感染はML-7による影響を受けなかった（図１８Ｃ）。NMHC-IIBしか発現していないCos-1細胞においてもこのような現象が観察されたことから、NMHC-IIBもHSV-1侵入時に細胞表面に移動し、HSV-1エントリーのための受容体として機能することが示された。
【0064】
実施例3-2：NMHC-IIAの細胞内局在の制御によるHSV-2感染の阻害HSV-2 GFPについて、実施例3-1と同様の実験をVero細胞を用いて行った。
結果を図２２に示す。HSV-2 GFPによる感染もML-7によって用量依存的に阻害された。
【0065】
実施例4-1：抗NMHC-IIA抗体によるHSV-1感染の阻害Vero細胞、CHO-hNectin-1細胞、CHO-hPILRα細胞、及びHL60/NMHC-IIA細胞を様々な濃度の抗NMHC-IIA血清又はコントロール血清で30分間前処理した。
24穴プレートで、Vero細胞又はCHO-hNectin-1細胞に、HSV-1 GFPをMOI=1で接種した。1時間ウイルス吸着を行った後、接種材料を除去し、細胞に適切な培地を与えた。
また、24穴プレートで、CHO-hPILRα細胞にHSV-1 GFPをMOI=1で接種し、32℃、1100gで1時間遠心分離した。1時間ウイルス吸着を行った後、接種材料を除去して細胞を洗浄し、適切な培地を与えた。
感染の5時間、6時間又は12時間後に、細胞を蛍光顕微鏡（Olympus IX71）で観察するか、Cell Questソフトウエア（Becton Dickinson）を使用してFACSCaliburで分析した。
結果を図５に示す。
抗NMHC-IIA血清は、CHO-hNectin-1細胞へのHSV-1の感染を阻害した。CHO-hNectin-1細胞は、元来HSV-1感染に耐性を有するCHO-K1細胞を、gD受容体のnectin-１を形質導入することにより、HSV-1感受性細胞に変換したものである。反対に、抗NMHC-IIA血清は、CHO-hPILRα細胞へのHSV-1感染を阻害しなかった。これは、CHO-K1細胞がもう一つのgB受容体であるPILRαを過剰発現することによってHSV-1への十分な感受性を獲得したことによるものと考えられる。
CHO-hNectin-1及びCHO-hPILRα細胞は、いずれもNMHC-IIAを内在的に発現する。このCHO-hPILRα細胞における競合的な結果は、NMHC-IIAがHSV-1に対する機能的なgB受容体であるという結論をさらに裏付けるものである。
【0068】
実施例5-1：NMHC-IIA又はNMHC-IIBのノックダウンによるHSV-1感染の阻害NMHC-IIAの発現をRNAi法によってノックダウンし、ウイルス感染への影響を調べた。
具体的にはVero細胞を、pSSSP-NMHC-IIA又はpSSSP-Creで形質転換し、維持培地に2.5μg/mlのピューロマイシンを加えて形質転換された細胞を選択した。pSSSP-Creで形質転換したピューロマイシン耐性細胞をVero-shCreと呼ぶ。pSSSP-NMHC-IIAで形質転換したコロニー群をそれぞれ単離し、抗NMHC-IIA抗体によるイムノブロッティングにより、NMHC-IIAに対するshRNAを安定に発現する細胞をスクリーニングした。
24穴プレートで、Vero-shCreまたはVero-NMHC-IIA細胞にHSV-1 GFPまたはインフルエンザウイルスをMOI=1で接種した。1時間ウイルス吸着を行った後、接種材料を除去し、細胞に適切な培地を与えた。
感染の6時間後（HSV-1）又は7時間後（インフルエンザウイルス）に、Cell Questソフトウエア（Becton Dickinson）を使用してFACSCaliburで分析した。
結果を図６Ａ、Ｂに示す。
HSV-1 GFPの感受性は、NMHC-IIAをノックダウンした細胞（Vero-shNMHC-IIA）で、関連のないshRNAを発現する細胞（Vero-shCre）と比較して低下した（図６Ａ）。一方で、NMHC-IIAのノックダウンは、インフルエンザウイルスの感染にはほとんど影響しなかった（図６Ｂ）。
実施例4及び5の結果は、NMHC-IIAを内在的に発現する細胞において、HSV-1がNMHC-IIAを機能的レセプターとして利用していることを示す。
また、Vero細胞は、NMHCII-A及びgD受容体であるNectin-1を内在的に発現している（Milne, R. S. et al. Virology 281, 315-328 (2001).）。
Vero細胞上のgD受容体もHSV-1感染を仲介することが既に知られていることから、Vero細胞へのHSV-1感染にgBとNMHC-IIAとの結合が必要であることがここで実証されたことにより、HSV-1の細胞への侵入にはgD及びgBの両方に対する受容体が必要であるという仮説が正しいことが示された。
【0069】
次に、Cos-1細胞におけるNMHC-IIBの発現をRNAi法によってノックダウンした。具体的には、Cos-1細胞を、pSSSP-NMHC-IIB又はpSSSP-Creで形質転換し、維持培地に2.5μg/mlのピューロマイシンを加えて形質転換された細胞を選択した。pSSSP-Creで形質転換したピューロマイシン耐性細胞をCos-1-shControlと呼ぶ。pSSSP-NMHC-IIBで形質転換したコロニー群をそれぞれ単離し、抗NMHC-IIB抗体によるイムノブロッティングにより、NMHC-IIBに対するshRNAを安定に発現する細胞をスクリーニングした。24穴プレートで、Cos-1-shControl（図中shControl）またはCos-1-NMHC-IIB細胞（図中shNMHC-IIB）にHSV-1 GFPまたはインフルエンザウイルスをMOI=1で接種した。1時間ウイルス吸着を行った後、接種材料を除去し、細胞に適切な培地を与えた。
感染の6時間後（HSV-1）又は7時間後（インフルエンザウイルス）に、Cell Questソフトウエア（Becton Dickinson）を使用してFACSCaliburで分析した。
結果を図１９Ａ〜Ｃに示す。NMHC-IIBのノックダウンによって（図１９Ａ）、HSV-1の感染が低下したが（図１９Ｂ）、インフルエンザイウイルスの感染は変化しなかった。
【0070】
実施例5-2：NMHC-IIA又はNMHC-IIBのノックダウンによるHSV-2感染の阻害実施例5-1の方法に従って、NMHC-IIAの発現をノックダウンしたVero細胞に、HSV-2 GFPをMOI=1で接種した。コントロールには、Vero-shCreを用いた。
結果を図２３に示す。NMHC-IIAをノックダウンした細胞では、HSV-2感染が抑制されることが確認された。
【0071】
また、同様に、実施例5-1の方法に従って、NMHC-IIBの発現をノックダウンしたCos-1細胞に、HSV-2 GFPをMOI=1で接種した。結果を図２４に示す。NMHC-IIBをノックダウンした細胞においても、HSV-2感染が抑制されることが確認された。
【0072】
実施例6：膜融合アッセイHSV-1を含むエンベロープウイルスは、ウイルス感染のためにエンベロープと宿主細胞の細胞膜との融合を必要とする。HSV-1との膜融合におけるNMHC-IIAの役割を調べるため、膜融合アッセイを行った。
具体的には、24穴プレートで、Vero細胞をpEP98-gB、pPEP99-gD、pPEP101-gL、pPEP100-gH（6C）若しくはpMD (VSV-G発現vector)、およびpCAGT7を形質転換し、形質転換体をエフェクター細胞として用いた。
また、24穴プレートで、Vero-shCre又はVero-shNMHC-IIA 1-3細胞をpT7EMCLucで形質転換し、形質転換体を標的細胞として用いた。
内部コントロールとして、CMVプロモータで制御されるRenillaルシフェラーゼ遺伝子をコードするpRL-CMV（Promega社）で、共形質転換した。
形質転換の6時間後、エフェクター細胞を0.04％EDTA（PBS中）で分離し、維持培地で一回洗浄し、標的細胞と18時間共培養した。その後、ホタルルシフェラーゼ及びRenillaルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega社）とluminometer（Promega社）によりそれぞれ定量した。ホタルルシフェラーゼ活性は、Renillaルシフェラーゼにより標準化した。
結果を図６Ｃ、Ｄに示す。
NMHC-IIAをノックダウンしたVero細胞を、HSV-1 gB、gD、gH、及びgLを一過性に発現するVero細胞と共培養すると、コントロールshRNAを発現するVero細胞をHSV-1の糖タンパク質を発現するVero細胞と共培養した場合に比較して、膜融合は明らかに減少した（図６Ｃ）。
対照的に、NMHC-IIAのノックダウンは、VSVエンベロープGタンパク質仲介性の膜融合にほとんど影響しなかった(図６Ｄ)。これらの結果は、NMHC-IIAが、HSV-1エンベロープの糖タンパク質との結合を介した効率的な膜融合に必要であることを示す。また、gBとNMHC-IIAとの相互作用が、HSV-1感染における膜融合に関与することが示唆された。
【0073】
同様に、HSV-1との膜融合におけるNMHC-IIBの役割を調べるための膜融合アッセイを行った。具体的には、24穴プレートで、Cos-1細胞をpEP98-gB、pPEP99-gD、pPEP101-gL、pPEP100-gH（6C）若しくはpMD (VSV-G発現vector)、およびpCAGT7を形質転換し、形質転換体をエフェクター細胞として用いた。
また、24穴プレートで、Cos-1-shControl又はCos-1-shNMHC-IIB 1-3細胞をpT7EMCLucで形質転換し、形質転換体を標的細胞として用いた。
内部コントロールとして、CMVプロモータで制御されるRenillaルシフェラーゼ遺伝子をコードするpRL-CMV（Promega社）で、共形質転換した。
形質転換の6時間後、エフェクター細胞を0.04％EDTA（PBS中）で分離し、維持培地で一回洗浄し、標的細胞と18時間共培養した。その後、ホタルルシフェラーゼ及びRenillaルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega社）とluminometer（Promega社）によりそれぞれ定量した。ホタルルシフェラーゼ活性は、Renillaルシフェラーゼにより標準化した。
結果を図１９Ｄ、Ｅに示す。NMHC-IIBのノックダウンしたCos-1細胞を、HSV-1 gB、gD、gH、gLを共発現するCos-1細胞と共培養すると、コントロールに比較して膜融合が著しく減少した（図１９Ｄ）。一方、NMHC-IIBのノックダウンは、VSV G依存的な細胞融合には影響しなかった。これらの結果は、NMHC-IIBも、HSV-1エンベロープの糖タンパク質との結合を介した効率的な膜融合に必要であること、また、gBとNMHC-IIBとの相互作用が、HSV-1感染における膜融合に関与することが示唆された。
【0074】
実施例7-1：HSV-1の細胞への侵入に対するNMHC-IIAの関与の確認NMHC-IIAを高レベル且つ安定に発現するHL60細胞（HL60/NMHC-IIA）を樹立した。ヒト前骨髄球株HL60細胞は、NMHC-IIAの発現レベルが低く（Toothaker, L. E. et al. Blood 78, 1826-1833 (1991).）、また、比較的HSV-1の感染に耐性を有することが報告されている（Pientong, C. et al. Virology 170, 468-476 (1989).）。
24穴プレートで、HL60/NMHC-IIA細胞にHSV-1 GFPをMOI=1で接種し、32℃、1100gで1時間遠心分離した。1時間ウイルス吸着を行った後、接種材料を除去して細胞を洗浄し、適切な培地を与えた。
感染の5時間、6時間又は12時間後に、細胞を蛍光顕微鏡（Olympus IX71）で観察するか、Cell Questソフトウエア（Becton Dickinson）を使用してFACSCaliburで分析した。
結果を図７に示す。
図７Ａに、HL60/NMHC-IIA細胞へのNMHC-IIAの過剰発現をウェスタンブロット法で確認した結果を示す。
HL60細胞におけるNMHC-IIAの過剰発現は、HSV-1 GFPが感染するHL60/NMHC-IIA細胞の割合を、コントロールのHL60/puro細胞に比較して著しく増大させた（図７Ｂ及びＣ）。
HL60/NMHC-IIA細胞へのHSV-1 GFPの感染は、抗NMHC-IIA血清により用量依存的に阻害され、コントロール血清は、同細胞へのHSV-1 GFPの感染にわずかしか影響を与えなかった（図７Ｄ）。
さらに、NMHC-IIAの過剰発現は、HL60細胞のブタアルファヘルペスウイルスへの感受性も増強し、GFP発現仮性狂犬病ウイルス（PRV GFP）による感染、及びHL60/NMHC-IIAにおけるPRV GFPの感染は抗NMHC-IIA血清により特異的に阻害された（図７Ｅ）。
これらの結果は、NMHC-IIAがHSV-1感染を仲介することを示し、NMHC-IIAを介するウイルスの細胞への侵入は、他のアルファヘルペスウイルスにも保存されていることが示唆された。
【0075】
実施例7-2：HSV-1の細胞への侵入に対するNMHC-IIBの関与の確認本来NMHC-IIBの発現レベルが低いIC21細胞で、NMHC-IIB細胞を過剰発現させた（図２０Ａ）。このIC21/NMHC-IIB細胞に、HL60/NMHC-IIAと同様の方法で、HSV-1 GFPを接種し、観察した。
結果を図２０Ｂに示す。IC21細胞におけるNMHC-IIBの過剰発現は、HSV-1 GFPが感染する細胞の割合を、コントロール（IC21/puro細胞）に比較して、著しく増大させた（図２０Ｂ及びＣ）。これらの結果は、NMHC-IIBもHSV-1感染を仲介することを示す。
【0076】
実施例7-3：HSV-2の細胞への侵入に対するNMHC-IIAの関与の確認ウイルスをHSV-2 GFPとして、実施例7-1と同様の実験を行った。結果を図２５に示す。NMHC-IIAの過剰発現は、HSV-2 GFPが感染する細胞の割合を増大させた。この結果は、NMHC-IIAがHSV-2感染も仲介することを示す。
【0077】
実施例7-4：HSV-2の細胞への侵入に対するNMHC-IIBの関与の確認ウイルスをHSV-2 GFPとして、実施例7-3と同様の実験を行った。結果を図２６に示す。NMHC-IIBの過剰発現は、HSV-2 GFPが感染する細胞の割合を増大させた。この結果は、NMHC-IIBがHSV-2感染も仲介することを示す。
【0078】
実施例8：アシクロビル（ACC）との作用点の比較24 well plateのVero細胞を、それぞれ抗NMHC-IIA血清またはコントロール血清、ML-7(20μM)、ACC (40μM) で30分処理し、HSV-1 GFPをMOI＝１で接種した。1時間後ウイルス液を除去し、維持培地に交換した。ML-7およびACC処理細胞はそれぞれ薬剤入りの維持培地で培養した。感染6時間後細胞を回収し、蛍光強度をflowcytometerで解析した。図はいずれも相対的な蛍光強度として示した。
Vero細胞へのHSV侵入は、HSV複製阻害薬であるACCによって阻害されない（図９Ａ）ものの、MLCK阻害薬ML-7(図９Ｂ)やNMHC-IIA抗血清(図９Ｃ)によって阻害された。ACCはすでに広く使われている抗ヘルペスウイルス薬であるが、NMHC-IIAをターゲットとする薬剤・抗体は、ACCとは全く別の作用点であるといえる。
【0079】
実施例9：HSV-1感染によるRLCのリン酸化Vero細胞を、20μMのML-7で30分mock処理または処理し、野生型HSV-1にML-7の存在下又は非存在下でMOI=50で4℃で2時間mock暴露または暴露した。37℃に移してから15分後に、抗リン酸化RLC抗体又は抗RLC抗体を用いたイムノブロッティングによってRLCのリン酸化を測定した。
結果を図１０に示す。HSV-1の感染により、RLCのリン酸化が亢進すること、及び、MLCKの選択的阻害剤であるML-7により、当該亢進が阻害されることが確認された。
【0080】
実施例10：カルシウムキレーターによるHSV-1感染の抑制Vero細胞を、50μMのBAPTA-AM で30分mock処理または処理し、野生型HSV-1にML-7の存在下又は非存在下でMOI=50で4℃で2時間mock暴露または暴露した。37℃に移してから15分後に、抗NMHC-IIA抗体を用いた免疫蛍光法により解析した。
結果を図１１Ａに示す。BAPTA−AMは、MLCKの活性化に必須なCa2+のキレーターである。BAPTA-AMの存在下では、HSV-1が感染しても、NMHC-IIAが細胞膜付近に移行しないことが確認された。
また、Vero細胞を、50μMのBAPTA-AM で30分mock処理または処理し、野生型HSV-1にML-7の存在下又は非存在下でMOI=50で4℃で2時間mock暴露または暴露した。37℃に移してから15分後に、イムノブロッティングによりRLCの発現及びリン酸化を測定した。
結果を図１１Ｂに示す。BAPTA-AMの存在下では、RLCの発現量は変化しなかったが、HSV-1感染によるRLCのリン酸化の亢進が抑制されることが確認された。
次に、Vero細胞に、図示された濃度のBAPTA-AMの存在下又は非存在下で、HSV-1 GFPをMOI=1で感染させた。感染から5時間後に、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度（MFI）を測定した。データは、平均値と標準誤差で示す（n=3）。データは、BAPTA-AM非存在下での測定値で標準化した。
結果を図１１Ｃに示す。BAPTA-AMの濃度依存的に、MFIが減少した。このことは、カルシウムキレーターによってMLCKの活性が阻害されると、細胞内に侵入するHSV-1が減少することを示す。
一方、Vero細胞に、50μMのBAPTA-AMの存在下又は非存在下で、インフルエンザウイルスをMOI=1で感染させた。感染から7時間後にフローサイトメトリーでMFIを測定した。データは、平均値と標準誤差で示す（n=3）。BAPTA−AMの非存在下における平均値は、100％相対的MFIで標準化した。
結果を図１１Ｄに示す。相対的MFIは、BAPTA−AMの存在／非存在に影響を受けず、インフルエンザウイルスの感染は、カルシウムキレーターによって抑制されないことが確認された。
【0081】
次に、Vero細胞に代えてCos-1細胞を用い、様々な濃度のBAPTA-AMの存在下、又は非存在下で、HSV-1 GFPをMOI=1で感染させた。Vero細胞の場合と同様に、蛍光強度を測定した。結果を図２１Ａに示す。BAPTA-AMの濃度依存的にMFIが減少した。このことは、カルシウムキレーターによってMLCKの活性を阻害すると、NMHC-IIBのみ発現している細胞においても同様に、細胞内に侵入するHSV-1が減少することを示す。また、HSV-1に代えて、インフルエンザウイルスを感染させた場合、カルシウムキレーターによる感染への影響は観察されなかった。【0082】
実施例11：MLCKのドミナントネガティブ変異体によるHSV-1の感染の抑制空の発現プラスミド（Vector）、又はMCLKのドミナントネガティブ変異体の発現プラスミド（Dn-MLCK）で形質転換したVero細胞を、4℃で2時間、mockインキュベートし、又は野生型HSV-1にMOI=50で暴露した。
続いて37℃に移して、15分後に、抗リン酸化RLC抗体又は抗RLC抗体を用いたイムノブロッティングによりRLCの発現及びリン酸化を測定した。結果を図１２Ａに示す。データは、独立した3つの実験の代表例を示す。
VectorはpCI-neoでPromegaから購入した。ドミナントネガティブ変異体発現プラスミドはJ. Physiol 570: 219-235, 2006のものを使用した。
Vectorで形質転換した細胞では、HSV-1の感染によりRLCのリン酸化が増加したが、ドミナントネガティブ変異体で形質転換した細胞では、当該増加が抑制された。
図１２Ｂに、同結果から、全RLCタンパク質量に対するリン酸化RLCタンパク質の相対量を求めた結果を示す。相対量は、Vectorで形質転換した後mock感染させた細胞（Mock+Vector）におけるRLCのリン酸化量を100とし、Vector又はDn-MLCKで形質転換した後HSV-1を感染させた細胞（それぞれHSV-1＋Vector、HSV-1＋Dn-MLCK）におけるRLCのリン酸化量を求めた結果である。データは、平均値と標準誤差で示した（n=3、two-tailed Student's t-test）。HSV-1＋Vectorでは、RLCのリン酸化が著しく亢進し、またMLCKのドミナントネガティブ変異体によって、当該リン酸化の亢進がほとんど抑制されていることを確認した。
次に、Vector又はDn-MLCKで形質転換したVero細胞に野生型HSV-1 GFP (図１２Ｃ)、又はインフルエンザウイルス(図１２Ｄ)を、MOI=1で感染させ、感染から5又は7時間後にフローサイトメトリーでそれぞれ解析し、平均蛍光強度（MFI）を求めた。データは、平均値と標準誤差で示す（n=3、two-tailed Student's t-test）。Vectorを感染させた細胞における平均値は、100％相対MFIで標準化した。
Vectorで形質転換した細胞にHSV-1を感染させた場合と比較して、Dn-MLCKで形質転換した細胞におけるHSV-1の侵入は60％程度であり、HSV-1の侵入が著しく抑制されていることが確認された。一方、インフルエンザウイルスを感染させた場合は、Dn-MLCKで形質転換した場合、むしろインフルエンザの侵入が増加した。
以上、実施例９〜１０の結果は、MLCKシグナルによって、NMHC-IIAの細胞内局在の変化やHSV感染が制御されていること、従って、このMLCKシグナルを阻害することによってHSV-1感染を抑制できることを、さらに示すものである。
【0083】
実施例12：マウス角膜感染モデルに対するMLCK阻害剤の効果 (感染前投与)ICRマウス(メス5週齢)の角膜を注射針で軽く傷つけたのち、20μMのML-7入り培地または、ML-7を含まない培地を10分間隔で二回点眼した。さらに、10分インキュベート後、HSV-1(F)株を5×105PFU/eyeで接種したのち、涙中のウイルス力価、角膜炎症状、マウスの生存を調べた。
結果を図１３に示す。ウイルス接種2日後のウイルス力価（図１３Ａ）、5日後の角膜炎症状（図１３Ｂ）のいずれも、ML-7処理をおこなったマウスは、未処理のマウスに比べて有意に低下していた（A;p<0.001, B;p<0.05）。さらに、ML-7処理群ではマウスの生存率も有意に上昇していた（図１３Ｃ）。
これらの結果は、HSV-1によるNMHC-IIAの利用が生体内においてもおこなわれていることを示すと同時に、ML-7のようなNMHC-IIAの制御にかかわる薬剤が、新しくヘルペスウイルスの治療・予防薬、特に予防薬として使用できる可能性を示唆する。
【0084】
実施例13：マウス角膜感染モデルに対するMLCK阻害剤（ML-7）の効果 (感染同時投与)28匹ずつのICR（メス/5週齢）マウスの角膜を注射針で傷つけたのち、20μMのML-7入り培地または、ML-7を含まない培地とMedium199に希釈した5×105のHSV-1(F)を同時点眼し、21日観察を行った。
結果を図１４に示す。図１３と比して、ML-7処理群ではマウスの生存率がさらに有意に上昇していた。
【0085】
実施例14：マウス角膜感染モデルに対するMLCK阻害剤（BAPTA-AM）の効果28匹ずつのICR（メス/5週齢）マウスの角膜を注射針で傷つけたのち、50μMのBAPTA-AMを10分間隔で2回点眼した。さらに、10分インキュベート後、Medium199に希釈した5×105のHSV-1(F)を点眼し、21日観察を行った。Mock-treat群は50μMのBAPTA-AMの代わりに0.2％DMSO in Medium199を使用した。
結果を図１５に示す。BAPTA−AM処理群の生存率は、Mock-treat群に比較して有意に高かった。この結果は、MLCK阻害剤が、ヘルペスウイルス感染症の治療・予防薬として有用であることをさらに示すものである。
【配列表フリーテキスト】
【0087】
配列番号：１は、NMHC-IIAのC末端領域（1665位〜1960位）のアミノ酸配列である。配列番号：２は、NMHC-IIAに対するsiRNAの標的配列の一例である。
配列番号：３は、NMHC-IIAに対するsiRNAの一例の一本鎖である。
配列番号：４は、NMHC-IIAに対するsiRNAの一例の一本鎖である。
配列番号：５は、NMHD-IIAに対するshRNAの一例をコードするDNAである。
配列番号：６は、実施例で用いたNMHC-IIAのC末端に対するウサギポリクローナル抗体が認識するエピトープである。
配列番号：７は、NMHC-IIBのC末端領域（1672位〜1976位）のアミノ酸配列である。
配列番号：８は、NMHC-IIBに対するsiRNAの標的配列の一例である。
配列番号：９は、NMHC-IIBに対するsiRNAの一例の一本鎖である。
配列番号：１０は、NMHC-IIBに対するsiRNAの一例の一本鎖である。
配列番号：１１は、NMHD-IIBに対するshRNAの一例をコードするDNAである。
配列番号：１２は、実施例で用いたNMHC-IIBのC末端に対するウサギポリクローナル抗体が認識するエピトープである。
【図2A】
【図2B】
【図4A】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7B】
【図7D】
【図7E】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図11C】
【図11D】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13】
【図14】
【図15】
【図17A】
【図17B】
【図18B】
【図18C】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図20C】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図1A】
【図1B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4B】
【図7A】
【図7C】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図18A】
【図19A】
【図20A】
【図20B】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]