特許 5760408 ステップグラジエント流路系

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5760408

(24)【登録日】2015年6月19日

(45)【発行日】2015年8月12日

(54)【発明の名称】ステップグラジエント流路系

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/34 20060101AFI20150723BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20150723BHJP

   G01N 30/20 20060101ALI20150723BHJP

【ＦＩ】

   G01N30/34 A

   G01N30/26 M

   G01N30/20 Z

【請求項の数】2

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2010-268560(P2010-268560)

(22)【出願日】2010年12月1日

(65)【公開番号】特開2012-117934(P2012-117934A)

(43)【公開日】2012年6月21日

【審査請求日】2013年11月21日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】植松 原一

【審査官】 後藤 大思

(56)【参考文献】

【文献】 実開昭６１−８９１６６（ＪＰ，Ｕ）

【文献】 特開２００３−２４７９８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平２−１３０４６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２２７０２９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３０／００−３０／９６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

押出液を送液する送液手段と、
第１の溶液を充填可能なループと前記ループに第１の溶液を充填する第１の充填手段とを設け、第１の充填手段で第１の溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第１の溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第１の流路切り替え手段と、
第ｎ（ｎは２以上）の溶液を充填可能なループと当該ループに第ｎの溶液を充填する第ｎの充填手段とを設け、第ｎの充填手段で第ｎの溶液を当該ループに充填可能な状態と当該ループに充填した第ｎの溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第ｎの流路切り替え手段と、
試料を充填可能なループと試料を充填可能なループに試料を充填する試料充填手段とを設けた試料導入手段と、
を備えた流路系であって、
第ｎの流路切り替え手段を第（ｎ−１）の流路切り替え手段に設けたループに、試料導入手段を第１の流路切り替え手段に設けたループに、それぞれ備えた前記流路系。

【請求項2】

押出液を送液する送液手段と、
第１の溶液を充填可能なループと前記ループに第１の溶液を充填する第１の充填手段とを設け、第１の充填手段で第１の溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第１の溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第１の流路切り替え手段と、
第ｎ（ｎは２以上）の溶液を充填可能なループと当該ループに第ｎの溶液を充填する第ｎの充填手段とを設け、第ｎの充填手段で第ｎの溶液を当該ループに充填可能な状態と当該ループに充填した第ｎの溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第ｎの流路切り替え手段と、
試料を充填可能なループと試料を充填可能なループに試料を充填する試料充填手段とを設けた試料導入手段と、
を備え、第ｎの流路切り替え手段を第（ｎ−１）の流路切り替え手段に設けたループに、試料導入手段を第１の流路切り替え手段に設けたループに、それぞれ備えた流路系と、
分析カラムおよび検出器と、
を備えた液体クロマトグラフ装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフ装置において溶離液のグラジエントを送液するための流路系に関する。特に本発明の流路系は、微小流量液体クロマトグラフィにおいてステップグラジエントを送液する際に好ましく使用することができる。

【背景技術】

【0002】

液体クロマトグラフィにおいて、目的成分を溶出させる方法としては、単一の溶離液（バッファ）を用いて溶出させるアイソクラティック溶出法と、溶離液（バッファ）の組成を変化させて溶出させるグラジエント溶出法とに大別される。このうち、後者のグラジエント溶出法は、分離できる試料成分の範囲が広いことから、液体クロマトグラフィを用いた分析で多く用いられている。

【0003】

グラジエント溶出法は、分析時間中に何らかの方法により溶離液（バッファ）の組成を変化させて、試料中の目的成分を溶出させる。溶離液（バッファ）の組成を変化させる方法の一例として、組成の異なる複数の溶離液（バッファ）と前記溶離液に対応する送液ポンプとを並列に配置し、総流量を一定に保ちながら各ポンプの流量を制御することで組成を変化させる、高圧グラジエント（吐出グラジエント）法があげられる。２種類の溶離液（バッファ）（１０ａ、１０ｂ）を２台の送液ポンプ（３１ａ、３１ｂ）で流量制御した場合の、高圧グラジエント送液装置の一態様を図１に、図１の装置で作成したグラジエントプロファイルの一例を図２に、それぞれ示す。溶離液（バッファ）の組成を変化させる方法の別の例として、１台のポンプで組成の異なる複数の溶離液（バッファ）を送液して組成を変化させる、低圧グラジエント（吸引グラジエント）法があげられる。低圧グラジエント（吸引グラジエント）法では、送液ポンプの吸引側に複数の溶離液（バッファ）を選択可能な切り替え手段（例えば電磁弁など）を設け、送液する溶離液（バッファ）を選択する。低圧グラジエント送液装置の一態様として、３種類（１０ａ、１０ｂ、１０ｃ）の溶離液（バッファ）を電磁弁（５３ａ、５３ｂ、５３ｃ）を用いて切り替える装置を図３に、図３の装置で作成したグラジエントプロファイルの一例を図４に、それぞれ示す。高圧グラジエント（吐出グラジエント）法は、溶離液（バッファ）組成を自由に変化させることができるものの、装置自体が高価であることから、研究や探索目的で使用されることが多い。一方低圧グラジエント（吸引グラジエント）法は、組成変化が溶離液（バッファ）数に限定されるものの、装置自体は安価であることから、分析対象が決まっているルーチン分析に使用されることが多い。

【0004】

汎用液体クロマトグラフィでは、分析カラムに送液する溶離液（バッファ）の流速を毎分１ｍＬ程度とするため、グラジエント溶出法で目的成分を溶出させる場合、高圧グラジエント法を用いてもよいし、低圧グラジエント法を用いてもよく、目的に応じて、より適切なグラジエント法を選択すればよい。

【0005】

しかしながら、分析カラムサイズを微小化する傾向がある近年の液体クロマトグラフィでは、分析カラムに送液する溶離液（バッファ）の流速が毎分数μＬから数十μＬ程度まで低下する。そのため、前述した高圧グラジエント法または低圧グラジエント法をそのまま適用することは困難である。その理由として、高圧グラジエント法の場合、分析カラムに送液する溶離液（バッファ）の流速を毎分数十μＬで分析を行なうには、その１００分の１の流速であっても一定の流量精度を維持するポンプが必要であり、装置設計が困難となるからである。一方、低圧グラジエント法の場合、送液ポンプの上流側に設けた切り替え手段で溶離液（バッファ）を切り替えるため、切り替え手段−ポンプ−カラム間の容量分だけ、溶離液（バッファ）の切り替えに遅れが生じるが、分析カラムへ導入する溶離液（バッファ）の流速を毎分数十μＬで分析を行なうと、切り替え手段−ポンプ−カラム間の容量が数百μＬ程度であっても遅れが１０分程度生じるため、事実上分析自体が困難となるからである。

【0006】

溶離液（バッファ）の流速を毎分数十μＬとする液体クロマトグラフィでグラジエント溶出を行なう方法がいくつか提案されている。特許文献１は、あらかじめ分析系と分断した状態で、シリンジポンプ内にグラジエントプロファイルを作成後、分析開始と同時にシリンジポンプと分析系とを接続し、分析カラムに送液する溶離液の組成変化を行なわせるグラジエント溶出法を開示している。しかしながら、特許文献１の方法は、１分析毎にシリンジポンプと分析系との接続／切断操作が必要であるため再現性が悪化する問題がある。また、高圧カラムを使用する場合、分析開始と同時に圧力低下が発生するため、元の圧力に戻るまでの時間、正確な測定ができない、という問題もある。

【0007】

特許文献２は、ナノフローレベル（ｎＬ／分）のリニアグラジエント溶出を安定的かつ連続的に達成する装置を開示している。ともに容量１μＬ程度の第１および第２のループを備えた流路切り替えバルブに、低圧グラジエントによる混合溶媒を供給するマイクロフローレベル（μＬ／分）の第１のポンプ、および作動液（押出液）を供給するナノフローレベル（ｎＬ／分）の第２のポンプをそれぞれ流路接続する。第１のループに第１のポンプから混合溶媒を満たす一方で第２のループに第２のポンプから押出液を注入する第１の状態と、第２のループに第１のポンプから混合溶媒を満たす一方で第１のループに第２のポンプから押出液を注入する第２の状態と、を交互に切り替える。このバルブ切り替え操作をたとえば１分間隔で繰り返すことにより、第１のポンプから供給される瞬間的な組成のグラジエント溶媒を１分ごとに抜き取って階段状の溶媒グラジエントを発生させることができる。特許文献２に開示の装置は、あらかじめグラジエントプロファイルを作成しておく必要はなく、連続運転に適しているが、溶媒の消費量が比較的多く、バルブ切り替えを頻繁に行なう必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】ＷＯ２００９／１５１０９６号

【特許文献2】特開２００６−２２７０２９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

前述した方法以外にも、流路切り替えバルブのスイッチングを用いたグラジエント溶出法がある。図５は、３種類の溶離液（バッファ）を用いたステップグラジエント送液装置を備えた、液体クロマトグラフ装置の一例を示している。前記装置は、
溶離液Ａ（バッファＡ）（１０ａ）を送液する送液ポンプ（３１）と、
溶離液Ｂ（バッファＢ）（１０ｂ）を分析カラムへ導入するための流路切り替えバルブ（５２ｂ）と、
溶離液Ｃ（バッファＣ）（１０ｃ）を分析カラムへ導入するための流路切り替えバルブ（５２ｃ）と、
試料（２０）を分析カラムへ導入するための試料導入バルブ（５１）と、
分析カラム（７０）と、
カラム恒温槽（８０）と、
検出器（９０）と、
を備え、送液ポンプ（３１）、流路切り替えバルブ（５２ｃ）、流路切り替えバルブ（５２ｂ）、試料導入バルブ（５１）、分析カラム（７０）、検出器（９０）の順に直鎖上に連結している。試料導入バルブ（５１）および流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）は、通常液体クロマトグラフ装置で用いられる、二位置切り替え六方バルブを用いることができる。前記六方バルブは、充填手段（不図示）でバルブに設けたループに溶離液（バッファ）または試料を充填可能な状態（ＯＦＦ状態）と、前記ループに充填した溶離液（バッファ）または試料を分析カラムへ導入可能な状態（ＯＮ状態）と、を切り替えることができる。

【0010】

初期化工程（平衡化工程）（図６ａ）では、流路切り替えバルブ（５２ｃ）、流路切り替えバルブ（５２ｂ）、試料導入バルブ（５１）はいずれもＯＦＦ状態とし、流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたループ（６２ｂ）にバッファＢ（１０ｂ）を、流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたループ（６２ｃ）にバッファＣを、試料導入バルブ（５１）に設けたループ（６１）に試料を、それぞれポンプやシリンジなどの充填手段を用いて充填する（図６ａ）。初期化工程（平衡化工程）では、分析カラム（７０）へはバッファＡ（１０ａ）のみが導入される。バッファＡによる平衡化完了後、試料導入バルブ（５１）をＯＮ状態にし、ループ（６１）に充填した試料（２０）をバッファＡで押し出す形で分析カラム（７０）に導入する。一定時間後、試料導入バルブ（５１）をＯＦＦ状態にするとともに流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態にし、ループ（６２ｂ）に充填したバッファＢをバッファＡで押し出す形で分析カラム（７０）に導入する（図６ｂ）。さらに一定時間後、流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態にするとともに流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態にし、ループ（６２ｃ）内に充填したバッファＣをバッファＡで押し出す形で分析カラム（７０）に導入する（図６ｃ）。これら一連の工程により、バッファＡ、バッファＢ、バッファＣの順にステップグラジエント溶出を行なうことができる。

【0011】

当該溶出法は、従来から知られている低圧グラジエント法と比較して、流路切り替えバルブから分析カラムまでのデットボリュームを大幅に少なくすることができるため、微小化したカラムを用いた液体クロマトグラフィにおけるグラジエント溶出法として適している。しかしながら、当該溶出法は、溶離液（バッファ）を切り替える度に、バルブの切り替えが伴う。例えば、図５の装置で溶離液（バッファ）が５種類の場合は、高圧状態で最低５回、流路切り替え操作が必要となる。流路切り替えバルブにおける流路切り替え時には、一時的に流路が閉塞するため、クロマトグラム圧力変動に由来するスパイク状のノイズが発生する。従来の液体クロマトグラフィのように比較的圧力が低い状態で使用する場合は特に問題ないが、近年主流になりつつある数μｍオーダーの充填材を使用したＵＰＬＣ（Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）用カラムでは、通常使用時でも圧力が数十ＭＰａ程度になる。そのため、ＵＰＬＣ用カラムを用いた液体クロマトグラフィにおいて当該溶出法を採用すると、切り替え時の圧力変動が大きくなるため、前記変動に由来するクロマトグラムのノイズも大きくなり、分析精度へ悪影響を及ぼす問題がある。

【0012】

そこで本発明は、液体クロマトグラフィ装置においてステップグラジエントを作成し送液するための流路系であって、溶離液（バッファ）の種類が増大しても高圧状態での切り替え回数を最小限にできる（圧力変動を最小限にできる）流路系を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

前記目的を達成するためになされた本発明は、以下の態様を包含する。

【0014】

本発明の第一の態様は、
押出液を送液する送液手段と、
第１の溶液を充填可能なループと前記ループに第１の溶液を充填する第１の充填手段とを設け、第１の充填手段で第１の溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第１の溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第１の流路切り替え手段と、
第ｎ（ｎは２以上）の溶液を充填可能なループと前記ループに第ｎの溶液を充填する第ｎの充填手段とを設け、第ｎの充填手段で第ｎの溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第ｎの溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第ｎの流路切り替え手段と、
を備えた流路系であって、
第ｎの流路切り替え手段を、第（ｎ−１）の流路切り替え手段に設けたループに備えた、前記流路系である。

【0015】

本発明の第二の態様は、試料を充填可能なループと前記ループに試料を充填する試料充填手段とを設けた試料導入手段を、さらに第１の流路切り替え手段出口側に備えた、前記第一の態様に記載の流路系である。

【0016】

本発明の第三の態様は、試料を充填可能なループと前記ループに試料を充填する試料充填手段とを設けた試料導入手段を、さらに第１の流路切り替え手段に設けたループに備えた、前記第一の態様に記載の流路系である。

【0017】

本発明の第四の態様は、
押出液を送液する送液手段と、
第１の溶液を充填可能なループと前記ループに第１の溶液を充填する第１の充填手段とを設け、第１の充填手段で第１の溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第１の溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第１の流路切り替え手段と、
第ｎ（ｎは２以上）の溶液を充填可能なループと前記ループに第ｎの溶液を充填する第ｎの充填手段とを設け、第ｎの充填手段で第ｎの溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第ｎの溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第ｎの流路切り替え手段と、
を備え、第ｎの流路切り替え手段を第（ｎ−１）の流路切り替え手段に設けたループに備えた、流路系と、
試料を充填可能なループと前記ループに試料を充填する試料充填手段とを設けた試料導入手段と、
分析カラムおよび検出器と、
を備えた液体クロマトグラフ装置である。

【0018】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0019】

本発明の流路系に備える流路切り替え手段は、前記手段に設けた充填手段により前記手段に設けたループに溶液（例えば、溶離液やバッファなど）を充填可能な状態（ＯＦＦ状態）と、前記ループに充填した溶液（例えば、溶離液やバッファなど）を本発明の流路系に備えた送液手段により送液された押出液により送液先へ送液可能な状態（ＯＮ状態）と、を相互に切り替え可能な手段であればよい。また、本発明の流路系に備える試料導入手段は、前記手段に設けた試料充填手段により前記手段に設けたループに試料を充填可能な状態（ＯＦＦ状態）と、前記ループに充填した試料を本発明の流路系に備えた送液手段により送液された押出液により送液先へ送液可能な状態（ＯＮ状態）と、を相互に切り替え可能な手段であればよい。なお、ここでいう送液先へ送液可能な状態とは、本発明の流路系を液体クロマトグラフ装置に備える場合、溶液または試料を分析カラムおよび検出器へ導入可能な状態のことをいう。本発明の流路系に備える流路切り替え手段および試料導入手段の一例として、液体クロマトグラフィで通常用いられる、二位置切り替え六方バルブがあげられる。

【0020】

本発明の液体クロマトグラフ装置において、流路系に備える押出液を送液する送液手段は、第１の流路切り替え手段がＯＦＦ状態では、押出液を直接分析カラムおよび検出器へ導入可能な手段であり、第１の流路切り替え手段がＯＮ状態では、押出液で押し出す形で、第１から第ｎ（ｎは２以上）の流路切り替え手段に設けたループに充填された溶離液（バッファ）を分析カラムおよび検出器へ導入可能な手段である。前記送液手段の一例として、液体クロマトグラフィで通常用いられる、プランジャポンプがあげられる。

【0021】

本発明の流路系によるグラジエント作成の概念図を図７に示す。本発明の流路系は、あらかじめ低圧下（例えば大気圧下）で、流路切り替え手段（バルブ）（５２）に設けたループ（６２）に溶離液Ａ（バッファＡ：本発明では押出液に相当する）を除いたグラジエントプロファイルを作成後、流路切り替え手段（バルブ）（５２）による流路切り替えを一度行なうことで、バッファＡにより前記グラジエントプロファイルを送液先へ送液可能な（図７に示す液体クロマトグラフ装置の場合、分析カラムおよび検出器へ導入可能な）流路系である。本発明の流路系は、ステップグラジエント溶出におけるステップ数（すなわち溶離液数）が増大しても、流路の切り替え回数は最小限で済むため、流路切り替えに伴う圧力変動も最小限に抑えられる。よって、分析精度や検出器のベースラインに及ぼす影響も最小限に抑えることができる。

【0022】

本発明の流路系の一態様を図８および図９に示す。図８ａは３種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、図８ｂは４種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、図９ａは５種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、図９ｂはｎ種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、本発明の流路系の一態様をそれぞれ示した図である。なお、図８および図９において、溶離液Ａ（バッファＡ）は押出液を兼ねている。また、図８ａと図８ｂは本発明の流路系と、分析カラム（７０）と、カラム恒温槽（８０）と、検出器（９０）と、を備えた液体クロマトグラフ装置の形で示している。代表して図８ａについて詳細に説明する。図８ａの流路系は、
溶離液Ａ（バッファＡ：押出液を兼ねる）（１０ａ）を送液する送液ポンプ（３１）と、
溶離液Ｂ（バッファＢ）（１０ｂ）を分析カラムへ導入するための第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）と、
溶離液Ｃ（バッファＣ）（１０ｃ）を分析カラムへ導入するための第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）と、
第１の流路切り替えバルブ出口側に設けた、試料（２０）を分析カラムへ導入するための試料導入バルブ（５１）と、
バッファＢを充填可能なループ（６２ｂ）と、
バッファＣを充填可能なループ（６２ｃ）と、
試料を充填可能なループ（６１）と、
を備え、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）は第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたループ（６２ｂ）に設けている。第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）、および試料導入バルブ（５１）は、通常液体クロマトグラフィで用いられる、二位置切り替え六方バルブを用いることができる。

【0023】

図８ａのうち、流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）付近を拡大した図を図１０に示す。初期化工程（平衡化工程）では、送液ポンプ（３１）により送液されたバッファＡ（１０ａ）は第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ１からＰＢ２を経由し分析カラム（７０）へ導入される。第１の充填手段（不図示）により送液されたバッファＢ（１０ｂ）は第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ５からＰＢ６、ループ（６２ｂ）に設けた、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ１からＰＣ２、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ３からＰＢ４、を経由後、廃液として排出され、これによりループ（６２ｂ）を含めた、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ５からＰＢ４までの流路がバッファＢで充填されることになる。なお、実際に分析カラムに導入するバッファＢは、ループ（６２ｂ）に充填したバッファＢのうち、ポートＰＣ２からポートＰＢ３までのループに充填されたバッファＢである。第２の充填手段（不図示）により送液されたバッファＣ（１０ｃ）は第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ５からＰＣ６、ループ（６２ｃ）、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ３からＰＣ４、を経由後、廃液として排出され、これによりループ（６２ｃ）を含めた、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ５からＰＣ４までの流路がバッファＣで充填されることになる。なお、実際に分析カラムに導入するバッファＣは、ループ（６２ｃ）に充填されたバッファＣである。バッファＢをループ（６２ｂ）に充填するための第１の充填手段およびバッファＣをループ（６２ｃ）に充填するための第２の充填手段に特に制限はなく、一例としてシリンジやポンプがあげられる。また、充填方法も特に制限はなく、シリンジなどを用いて手動で充填してもよいし、ポンプなどの自動送液手段を用いて充填してもよい。

【0024】

図８ａ（図１０）に示す、本発明の流路系を備えた液体クロマトグラフ装置を用いた、グラジエント溶出法について図１１および図１２を用いて詳細に説明する。

【0025】

工程１ 初期化およびバッファＢ／Ｃ／試料充填工程（図１１ａ）
２つの流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）および試料導入バルブ（５１）をＯＦＦ状態とし、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたループ（６２ｂ）にバッファＢを、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたループ（６２ｃ）にバッファＣを、試料導入バルブ（５１）に接続したループ（６１）に試料を、充填手段（不図示）を用いてそれぞれ充填する。なお、バッファＡは第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）、試料導入バルブ（５１）を経由し、分析カラム（７０）へ導入される。

【0026】

工程２ 試料導入工程（図１１ｂ）
バッファＡによる分析カラム（７０）平衡化およびバッファＢ／Ｃ／試料のループへの充填完了後、試料導入バルブ（５１）をＯＮ状態にすることで、ループ（６１）に充填した試料をバッファＡ（押出液）で押し出す形で分析カラム（７０）に導入し、バッファＡによる試料成分の溶出を開始する。

【0027】

工程３ バッファＢ／Ｃ連結工程（図１２ａ）
第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）をＯＮ状態にし、バッファＢを充填したループ（６２ｂ）とバッファＣを充填したループ（６２ｃ）とを連結する。なお、本操作は低圧下（例えば、大気圧下）で行なうため、操作に伴うループ（６２ｂ、６２ｃ）内の圧力変動は生じない。

【0028】

工程４ バッファＢ／Ｃ導入工程（図１２ｂ）
工程２の操作から一定時間経過後、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態にし、バッファＡを送液する流路と工程３で連結したバッファＢおよびバッファＣを充填した流路（すなわちループ（６２ｂ）およびループ（６２ｃ））とを連結する。これにより、バッファＡ（押出液）で押し出される形でバッファＢ、バッファＣの順に分析カラム（７０）へ導入され、バッファＢによる試料成分の溶出、引き続きバッファＣによる試料成分の溶出を行なう。

【0029】

なお、前記工程のうち、工程２（試料導入工程）と工程３（バッファＢ／Ｃ連結工程）は逆に行なってもよい。

【0030】

図８（図１０）に示す本発明の流路系において、分析カラムに導入するバッファの流速をＦ、バッファＡによる試料成分の溶出を開始（工程２）してから第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態にする（工程４）までの時間をＴ１、バッファＢを充填するループ（６２ｂ）のうち分析カラムへ導入される容量（図１０のポートＰＣ２からポートＰＢ３までに充填されたバッファＢの容量）をＶｂ、バッファＣを充填するループ（６２ｃ）の容量をＶｃとし、配管のデットボリュームを無視すると、分析カラムへの導入時間は、バッファＡでＴ１、バッファＢでＶｂ／Ｆ、バッファＣでＶｃ／Ｆとなる。一例として、Ｆが毎分１０μＬ、Ｔ１が５分、Ｖｂが３０μＬ、Ｖｃが６０μＬとすると、分析カラムへの導入時間は、バッファＡで５分、バッファＢで３分（３０／１０）、バッファＣで６分（６０／１０）となる。

【0031】

本発明の流路系の別の態様を図１３および図１４に示す。図１３ａは３種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、図１３ｂは４種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、図１４ａは５種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、図１４ｂはｎ種類の溶離液（バッファ）を用いたときの、本発明の流路系の別の態様をそれぞれ示した図である。なお、図１３および図１４において、溶離液Ａ（バッファＡ）は押出液を兼ねている。また、図１３および図１４では本発明の流路系と、分析カラム（７０）と、検出器（９０）と、を備えた液体クロマトグラフ装置の形で示している。代表して図１３ａについて詳細に説明する。図１３ａの流路系は、
溶離液Ａ（バッファＡ：押出液を兼ねる）（１０ａ）を送液する送液ポンプ（３１）と、
溶離液Ｂ（バッファＢ）（１０ｂ）を分析カラムへ導入するための第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）と、
溶離液Ｃ（バッファＣ）（１０ｃ）を分析カラムへ導入するための第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）と、
試料（２０）を分析カラムへ導入するための試料導入バルブ（５１）と、
バッファＢを充填可能なループ（６２ｂａ、６２ｂｂ、６２ｂｃ）と、
バッファＣを充填可能なループ（６２ｃ）と、
試料を充填可能なループ（６１）と、
を備え、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）は第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたループ（６２ｂｂ）とループ（６２ｂｃ）との間に設けており、試料導入バルブ（５１）は第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたループ（６２ｂａ）とループ（６２ｂｂ）との間に設けている。第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）、および試料導入バルブ（５１）は、通常液体クロマトグラフィで用いられる、二位置切り替え六方バルブを用いることができる。

【0032】

図１３ａのうち、流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）および試料導入バルブ（５１）付近を拡大した図を図１５に示す。初期化工程（平衡化工程）では、送液ポンプ（３１）により送液されたバッファＡ（１０ａ）は第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ１からＰＢ２を経由し分析カラム（７０）へ導入される。第１の充填手段（不図示）により送液されたバッファＢ（１０ｂ）は流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ５からＰＢ６、ル−プ（６２ｂｃ）、流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ１からＰＣ２、ループ（６２ｂｂ）、試料導入バルブ（５１）に設けたポートＰＩ１からＰＩ２、ループ（６２ｂａ）、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ３からＰＢ４、を経由後、廃液として排出され、これによりループ（６２ｂａ、６２ｂｂ、６２ｂｃ）を含めた、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）に設けたポートＰＢ５からＰＢ４までの流路がバッファＢで充填されることになる。なお、実際に分析カラムに導入するバッファＢは、ループ（６２ｂａ）およびループ（６２ｂｂ）に充填されたバッファＢである。第２の充填手段（不図示）により送液されたバッファＣ（１０ｃ）は第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ５からＰＣ６、ループ（６２ｃ）、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ３からＰＣ４、を経由後、廃液として排出され、これによりループ（６２ｃ）を含めた、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）に設けたポートＰＣ５からＰＣ４までの流路がバッファＣで充填されることになる。なお、実際に分析カラムに導入するバッファＣは、ループ（６２ｃ）に充填されたバッファＣである。試料充填手段（不図示）により送液された試料（２０）は試料導入バルブ（５１）に設けたポートＰＩ５からＰＩ６、ループ（６１）、試料導入バルブ（５１）に設けたポートＰＩ３からＰＩ４、を経由し廃液として排出され、これによりループ（６１）を含めた試料導入バルブ（５１）に設けたポートＰＩ５からＰＩ４までの流路が試料で充填されることになる。なお、実際に分析カラムに導入する試料は、ループ（６１）に充填された試料である。バッファＢをループ（６２ｂ）に充填するための第１の充填手段、バッファＣをループ（６２ｃ）に充填するための第２の充填手段および試料を充填するための試料充填手段に特に制限はなく、一例としてシリンジやポンプがあげられる。また、充填方法も特に制限はなく、シリンジなどを用いて手動で充填してもよいし、ポンプなどの自動送液手段を用いて充填してもよい。

【0033】

図１３ａ（図１５）に示す、本発明の流路系を備えた液体クロマトグラフィ装置を用いた、グラジエント溶出法について図１６を用いて詳細に説明する。

【0034】

工程１ 初期化およびバッファＢ／Ｃ／試料充填工程（図１６ａ）
第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）、試料導入バルブ（５１）はいずれもＯＦＦ状態とし、ループ（６２ｂａ、６２ｂｂ、６２ｂｃ）にバッファＢを、ループ（６２ｃ）にバッファＣを、ループ（６１）に試料を、充填手段（不図示）を用いてそれぞれ充填する。なお、バッファＡは第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）を経由し、分析カラム（７０）へ導入される。

【0035】

工程２ バッファＢ／試料／バッファＣ連結工程（図１６ｂ）
バッファＡによる分析カラム（７０）平衡化ならびにバッファＢ／Ｃ／試料のループへの充填完了後、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）および試料導入バルブ（５１）をＯＮ状態にし、バッファＢを充填したループ（６２ｂａ、６２ｂｂ、６２ｂｃ）、試料を充填したループ（６１）およびバッファＣを充填したループ（６２ｃ）を連結する。なお、本操作は低圧下（例えば、大気圧下）で行なうため、操作に伴うループ（６２ｂａ、６１、６２ｂｂ、６２ｃ、６２ｂｃ）内の圧力変動は生じない。

【0036】

工程３ バッファＢ／試料／バッファＣ導入工程（図１６ｃ）
工程２から一定時間経過後、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態にし、バッファＡを送液する流路と、工程２で連結したバッファＢ、試料およびバッファＣを充填した流路（すなわちループ（６２ｂａ）、ループ（６１）、ループ（６２ｂｂ）、ループ（６２ｃ）、ループ（６２ｂｃ））とを連結する。これにより、バッファＡ（押出液）で押し出される形でループ（６２ｂａ）に充填したバッファＢ、ループ（６１）に充填した試料、ループ（６２ｂｂ）に充填したバッファＢ、バッファＣの順に分析カラム（７０）へ導入され、試料の導入ならびにバッファＢによる試料成分の溶出およびバッファＣによる試料成分の溶出を行なう。

【0037】

なお、本発明の流路系の別の態様において、バッファＡとバッファＢは異なる組成であってもよいし、同じ組成であってもよい。

【発明の効果】

【0038】

本発明の流路系は、
押出液を送液する送液手段と、
第１の溶液を充填可能なループと前記ループに第１の溶液を充填する第１の充填手段とを設け、第１の充填手段で第１の溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第１の溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第１の流路切り替え手段と、
第ｎ（ｎは２以上）の溶液を充填可能なループと前記ループに第ｎの溶液を充填する第ｎの充填手段とを設け、第ｎの充填手段で第ｎの溶液を前記ループに充填可能な状態と前記ループに充填した第ｎの溶液を送液手段で送液された押出液により送液可能な状態とを切り替え可能な、第ｎの流路切り替え手段と、
を備えた流路系であって、
第ｎの流路切り替え手段を、第（ｎ−１）の流路切り替え手段に設けたループに備えていることを特徴としている。

【0039】

流路切り替え手段のスイッチングにより溶離液を切り替えることで、ステップグラジエントを送液する装置は、これまでもあった（例えば図５および図６の装置）が、本発明の流路系は図５および図６の装置と比較し、高圧状態での流路切り替え数を減らすことができる。例えば、５種類の溶離液（バッファ）を用いたステップグラジエント送液において、図５および図６のような一般的な流路切り替え手段（バルブ）の切り替えによりステップグラジエントを送液する場合は、図１７ａに示すように、１回の分析で、試料の導入に１回、溶離液（バッファ）の切り替えに４回の合計５回圧力変動が生じる。一方、本発明の流路系の一態様（図９ａ）では、図１７ｂに示すように１回の分析で、試料の導入に１回、溶離液（バッファ）の切り替えに１回の合計２回の圧力変動で済む。さらに、本発明の流路系の別の態様（図１４ａ）では、図１７ｃに示すように、１回の分析で、試料および溶離液（バッファ）導入時の１回の圧力変動で済む。

【0040】

ｎ種類の溶離液（バッファ）を用いてステップグラジエントを作成し送液する場合の、１分析あたりの高圧状態での切り替え回数の一覧を表１に示す。

【0041】

【表1】

表１に示すように、一般的なバルブ切り替えによるステップグラジエントでは、溶離液（バッファ）数の増大に伴い、高圧状態での切り替え（すなわち圧力変動）の回数も増加する。一方、本発明の流路系の一態様（図８および図９）では溶離液（バッファ）数が増大しても高圧状態での切り替え（すなわち圧力変動）は常に２回で済み、本発明の流路系の別の態様（図１３および図１４）では溶離液（バッファ）数が増大しても高圧状態での切り替え（すなわち圧力変動）は常に１回で済む。よって、例えば本発明の流路系を、液体クロマトグラフ装置に備えたとき、液体クロマトグラフ装置に備えた検出器に余分なノイズを与えることがなくなり、クロマトグラムに現れるスパイク状のノイズも抑えられるため、より高精度な分析が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】高圧グラジエント送液装置を備えた液体クロマトグラフ装置の従来からある態様を示している。

【図2】図１の高圧グラジエント送液装置で作成したグラジエントプロファイルの一例を示している。

【図3】低圧グラジエント送液装置を備えた液体クロマトグラフ装置の従来からある態様を示している。ａは初期化工程、ｂはバッファＢ導入工程、ｃはバッファＣ導入工程における流路構成を示しており、太線はバッファの流路を示している。

【図4】図３の低圧グラジエント送液装置で作成したグラジエントプロファイルの一例を示している。

【図5】ステップグラジエント送液装置を備えた液体クロマトグラフ装置の従来からある態様を示している。

【図6】図５のステップグラジエント送液装置を用いて各バッファを送液する際の流路構成を示している。ａはバッファＡ、ｂはバッファＢ、ｃはバッファＣを送液する場合における流路構成を示しており、太線はバッファの流路を示している。

【図7】本発明の流路系によるステップグラジエント作成の概念図を示している。

【図8】本発明の流路系の一態様を示している。ａは３種類のバッファ使用時の、ｄは４種類のバッファ使用時の、流路系の一態様をそれぞれ示している。

【図9】本発明の流路系の一態様を示している。ａは５種類のバッファ使用時の、ｂはｎ種類のバッファ使用時の、流路系の一態様をそれぞれ示している。

【図10】図８ａの流路系のうち、流路切り替えバルブ付近を拡大した図を示している。太線は分析カラムに導入するバッファが充填される領域を示している。

【図11】図８ａの流路系を用いたステップグラジエント送液を示している。ａは初期化およびバッファＢ／Ｃ／試料充填工程、ｂは試料導入工程における流路系をそれぞれ示している。

【図12】図８ａの流路系を用いたステップグラジエント送液を示している。ａはバッファＢ／Ｃ連結工程、ｂはバッファＢ／Ｃ導入工程における流路系をそれぞれ示している。

【図13】本発明の流路系の別の態様を示している。ａは３種類のバッファ使用時の、ｄは４種類のバッファ使用時の、流路系の一態様をそれぞれ示している。

【図14】本発明の流路系の別の態様を示している。ａは５種類のバッファ使用時の、ｂはｎ種類のバッファ使用時の、流路系の一態様をそれぞれ示している。

【図15】図１３ａの流路系のうち、流路切り替えバルブ付近を拡大した図を示している。太線は分析カラムに導入するバッファまたは試料が充填される領域を示している。

【図16】図１３ａの流路系を用いたステップグラジエント送液を示している。ａは初期化およびバッファＢ／Ｃ／試料充填工程、ｂはバッファＢ／試料／バッファＣ連結工程、ｃはバッファＢ／試料／バッファＣ導入工程における流路系をそれぞれ示している。

【図17】５種類のバッファを用いてステップグラジエントを行なった時の模式的な圧力変動を示している。ａは従来からある送液装置（図５）を、ｂは本発明の流路系の一態様（図９ａ）を、ｃは本発明の流路系の別の態様（図１４ａ）を、それぞれ用いたときの圧力変動を示している。

【図18】実施例１で使用した装置の全体構成を示している。

【図19】実施例１において、流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるまでの時間を変化（０分、５分、１０分）させたときの、検出器の出力変化を示している。

【図20】実施例１において、ループ（６２ｂ）の容量を変化（９７．１μＬ、１４５．７μＬ、１９４．３μＬ、２３８．４μＬ）させたときの、検出器の出力変化を示した図である。

【図21】実施例１において、ループ（６２ｃ）の容量を変化（９７．１μＬ、１４５．７μＬ、１９４．３μＬ、２３８．４μＬ）させたときの、検出器の出力変化を示した図である。

【図22】実施例２および３で使用した液体クロマトグラフ装置の全体構成を示している。

【図23】実施例４で使用した液体クロマトグラフ装置の全体構成を示している。

【図24】実施例２で検証したグラジエントプロファイル（ステップグラジエント条件）を示している。

【図25】図２４に示す各グラジエントプロファイルを用いて試料分析した結果（クロマトグラム）を示している。下段がプロファイル１、中段がプロファイル２、上段がプロファイル３で試料分析したときのクロマトグラムを示し、矢印は流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるタイミングを示している。

【図26】実施例３で実施した試料分析のクロマトグラム（上段）および圧力変動（下段）の一例を示している。

【図27】実施例３で実施した試料分析（１０回）のクロマトグラム（ａ）および圧力変動（ｂ）を示している。

【図28】実施例４で実施した試料分析のクロマトグラム（上段）および圧力変動（下段）の一例を示している。

【図29】実施例４で実施した試料分析（１０回）のクロマトグラム（ａ）および圧力変動（ｂ）を示している。

【実施例】

【0043】

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0044】

実施例１
図８ａに示す本発明の流路系を備えた液体クロマトグラフ装置のうち、分析カラム（７０）の代わりに抵抗管（１００）を備えた装置を用いて、本発明の流路系の効果を検証した。

【0045】

本実施例で用いた装置の全体構成を図１８に示す。送液ポンプ（３１）はＵＮＩＦＬＯＷＳ社製のポンプを、流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）はレオダイン製７０１０を、検出器（９０）は東ソー製ＵＶ−８０２０（マイクロセル、波長２５４ｎｍ）を、それぞれ使用した。溶離液Ａ（バッファＡ）（１０ａ）として純水を、溶離液Ｂ（バッファＢ）（１０ｂ）として０．１％アセトン水溶液を、溶離液Ｃ（バッファＣ）（１０ｃ）として０．２％アセトン水溶液を、それぞれ使用した。アセトンは紫外吸収を有するため、アセトンの組成変化を紫外検出器でモニターして検証した。

【0046】

まず、２つの流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）をともにＯＦＦ状態にし、送液ポンプ（３１）により送液されるバッファＡを検出器（９０）に直接導入し、バッファＢをループ（６２ｂ）に、バッファＣをループ（６２ｃ）に充填手段（不図示）を用いてそれぞれ充填する。各ループにバッファを充填した後、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態にして、バッファＢとバッファＣとを大気圧下で連結する。一定時間経過後、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態にすることで、まずバッファＡ、その後バッファＡで押し出す形でバッファＢ、バッファＣの順に検出器（９０）に導入する。

【0047】

図１９は、図１８においてループ（６２ｂ、６２ｃ）の容量は固定し、流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるまでの時間を変化させたときの、検出器の出力変化を示した図である。なお、ループ（６２ｂ）のうち実際に検出器へ導入される部分（第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）出口側）は内径０．７５ｍｍ×３３０ｍｍのポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）チューブからなり容量は１４５．７μＬ、ループ（６２ｃ）は内径０．７５ｍｍ×５４０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は２３８．４μＬ、各バッファの流速は毎分１３μＬ、である。図１９より、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）を切り替えるタイミング（すなわち検出器へのバッファＡの導入時間）を変化させても、検出器へのバッファＢおよびバッファＣの導入時間は変化しないことから、ステップグラジエントが適正に行なわれていることがわかる。

【0048】

図２０は、図１８においてループ（６２ｃ）の容量および第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるまでの時間を固定し、ループ（６２ｂ）の容量（ループ（６２ｂ）のうち第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）出口側の容量）を変化させたときの、検出器の出力変化を示した図である。なお、ループ（６２ｃ）は内径０．７５ｍｍ×５４０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は２３８．４μＬ、各溶離液（バッファ）の流速は毎分１３μＬ、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるまでの時間は０分、である。図２０より、ループ（６２ｂ）の容量を変化させても、バッファＡからバッファＢに切り替わるタイミングおよびバッファＣの検出器への導入時間は変化しないことから、ステップグラジエントが適正に行なわれていることが分かる。

【0049】

図２１は、図１８においてループ（６２ｂ）の容量および第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるまでの時間を固定し、ループ（６２ｃ）の容量を変化させたときの、検出器の出力変化を示した図である。なお、ループ（６２ｂ）のうち実際に検出器へ導入される部分（第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）出口側）は内径０．７５ｍｍ×５４０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は２３８．４μＬ、各溶離液（バッファ）の流速は毎分１３μＬ、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるまでの時間は０分、である。図２１より、ループ（６２ｃ）の容量を変化させても、バッファＢからバッファＣに切り替わるタイミングおよびバッファＢの検出器への導入時間は変化しないことから、ステップグラジエントが適正に行なわれていることがわかる。

【0050】

実施例２
図８ａに示す本発明の流路系を備えた液体クロマトグラフ装置を用いて、本発明の流路系の効果を検証した。

【0051】

本実施例で用いた液体クロマトグラフ装置の全体構成を図２２に示す。送液ポンプ（３１）はＵＮＩＦＬＯＷＳ製ポンプを、流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）はレオダイン社製７０１０を、試料導入バルブ（５１）はレオダイン社製７４１０を、分析カラム（７０）は逆相クロマトグラフィ用カラム（東ソー製ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−１００Ｖ：粒径３μｍ、内径１ｍｍ、長さ３５ｍｍ）を、カラム恒温槽（８０）は東ソー製ＣＯ−８０２０を、検出器（９０）は東ソー製ＵＶ−８０２０（マイクロセル、波長２５４ｎｍ）を、それぞれ使用した。溶離液Ａ（バッファＡ）（１０ａ）としてアセトニトリル／水（３５／６５）を、溶離液Ｂ（バッファＢ）（１０ｂ）としてアセトニトリル／水（４５／５５）を、溶離液Ｃ（バッファＣ）（１０ｃ）としてアセトニトリル／水（６０／４０）を、それぞれ使用した。試料（２０）は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル（Ｃ１）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル（Ｃ２）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル（Ｃ３）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル（Ｃ４）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシル（Ｃ６）、ｐ−ヒドロ安息香酸ｎ−ヘプチル（Ｃ７）の混合物を使用し、１分析あたり０．５μＬを分析カラムに導入した。

【0052】

ループ（６２ｂ）のうち実際に検出器へ導入される部分（第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）出口側）は内径０．７５ｍｍ×３３０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は１４５．７μＬ、ループ（６２ｃ）は内径０．７５ｍｍ×５４０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は２３８．４μＬ、各溶離液（バッファ）の流速は毎分１５μＬ、にそれぞれ固定し、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えるまでの時間を変化させて、試料の分析を行なった。

【0053】

２つの流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）がＯＦＦ状態では、送液ポンプ（３１）により送液されるバッファＡを直接分析カラム（７０）に導入することで初期化および平衡化が行なわれ、バッファＢは充填ポンプ（３２ｂ）によりループ（６２ｂ）に、バッファＣは充填ポンプ（３２ｃ）によりループ（６２ｃ）にそれぞれ充填される。初期化（平衡化）の終了および各ループへの溶離液（バッファ）充填後、試料導入バルブ（５１）を用いて試料充填ポンプ（不図示）によりループ（６１）に充填された試料を導入することで分析カラム（７０）に試料を導入し、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態にして、バッファＢとバッファＣとを大気圧下で連結する。一定時間経過後、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態にすることで、まずバッファＡ、その後バッファＡで押し出す形でバッファＢ、バッファＣの順に分析カラム（７０）へ導入し試料中の目的成分の溶出を行なう。

【0054】

検証は表２および図２４に示す３種類のグラジエントプロファイル（ステップグラジエント条件）を用いて行なった。

【0055】

【表2】

プロファイル１では、試料注入後１１分で第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えることで、まずバッファＡを１１分間、次にバッファＢを約９．７分間、その次にバッファＣを約１５．９分間、分析カラムに導入して試料を分析する。プロファイル２では、試料注入後１８分で第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えることで、まずバッファＡを１８分間、次にバッファＢを約９．７分間、その次にバッファＣを約１５．９分間、分析カラムに導入して試料を分析する。プロファイル３では、試料注入後３３分で第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態に切り替えることで、まずバッファＡを３３分間、次にバッファＢを約９．７分間、その次にバッファＣを約１５．９分間、分析カラムに導入して試料を分析する。

【0056】

前記３つのプロファイルで試料を分析した結果のクロマトグラムを図２５に示す。プロファイル１（図２５の下段）では、Ｃ１およびＣ２がバッファＡにより、Ｃ３およびＣ４がバッファＢにより、Ｃ６およびＣ７がバッファＣによりそれぞれ溶出されていることがわかる。プロファイル２（図２５の中段）では、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３がバッファＡにより、Ｃ４がバッファＢにより、Ｃ６およびＣ７がバッファＣによりそれぞれ溶出されていることがわかる。プロファイル３（図２５の上段）では、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４がバッファＡにより、Ｃ６およびＣ７がバッファＣによりそれぞれ溶出されていることがわかる。

【0057】

実施例３
図８ａに示す本発明の流路系を備えた液体クロマトグラフ装置の分析精度を確認するために、再現性を検証した。

【0058】

本実施例で用いた液体クロマトグラフ装置は、ループ（６２ｃ）を内径０．７５ｍｍ×６２０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなる容量２８７．０μＬのループに、各溶離液（バッファ）の流速を毎分１３μＬに、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態にする時間を１１分固定に、それぞれした他は、実施例２と同じである。なお、２つの流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）および試料導入バルブ（５１）は実施例２のバルブに自動化機構を付加したものを使用している。

【0059】

実施例２で使用した試料を用いて１０回分析を行なった。そのうちの１回の分析におけるクロマトグラム（上段）および圧力変動（下段）を図２６に、１０回全ての分析におけるクロマトグラム（ａ）および圧力変動（ｂ）を図２７に、１０回分析を行なったときの再現性結果を表３および表４にそれぞれ示す。

【0060】

【表3】

【0061】

【表4】

圧力変動（図２６の下段）を確認すると、試料注入時（０分）、および流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態にする時点（試料注入後１１分）で、スパイク状の圧力変動が生じているものの、バッファＢからバッファＣへの切り替え時には前記圧力変動が生じていないことが分かる。なお、試料注入後２０分から圧力が徐々に低下しているが、これはバッファＢからバッファＣに切り替わったことによる粘度の低下が原因であり、流路切り替えバルブの１回の切り替えによりバッファ切り替えが正常に行なわれていることの証でもある。クロマトグラム（図２６の上段）より、Ｃ１およびＣ２がバッファＡにより、Ｃ３およびＣ４がバッファＢにより、Ｃ６およびＣ７がバッファＣによりそれぞれ溶出されていることがわかる。溶出時間のＣＶ（変動係数）は０．１１７％から０．３１８％（表３ａ）、ピーク高さのＣＶは０．２４６％から１．０５２％（表３ｂ）、ピーク面積のＣＶは０．１７０％から１．３３８％（表４ｃ）であり、良好な再現性が得られていることがわかる。

【0062】

実施例４
図１３ａに示す本発明の流路系を備えた液体クロマトグラフ装置の分析精度を確認するために、再現性を検証した。

【0063】

本実施例で用いた液体クロマトグラフ装置の全体構成を図２３に示す。送液ポンプ（３１）はＵＮＩＦＬＯＷＳ製ポンプを、流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）はレオダイン社製７０１０を、試料導入バルブ（５１）はレオダイン社製７４１０を、分析カラム（７０）は逆相クロマトグラフィ用カラム（東ソー製ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−１００Ｖ：粒径３μｍ、内径１ｍｍ、長さ３５ｍｍ）を、カラム恒温槽（８０）は東ソー製ＣＯ−８０２０を、検出器（９０）は東ソー製ＵＶ−８０２０（マイクロセル、波長２５４ｎｍ）を、それぞれ使用した。溶離液Ａ（バッファＡ）（１０ａ）としてアセトニトリル／水（７０／３０）を、溶離液Ｂ（バッファＢ）（１０ｂ）としてアセトニトリル／水（５／９５）を、溶離液Ｃ（バッファＣ）（１０ｃ）としてアセトニトリル／水（４５／５０）を、それぞれ使用した。試料（２０）は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル（Ｃ１）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル（Ｃ２）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル（Ｃ３）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル（Ｃ４）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシル（Ｃ６）、ｐ−ヒドロ安息香酸ｎ−ヘプチル（Ｃ７）の混合物を使用し、１分析あたり０．５μＬを分析カラムに導入した。

【0064】

ループ（６２ｂａ）は内径０．７５ｍｍ×３３０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は１４５．７μＬ、ループ（６２ｂｂ）は内径０．７５ｍｍ×２２０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は９７．１μＬ、ループ（６２ｃ）は内径０．７５ｍｍ×６８０ｍｍのＰＥＥＫチューブからなり容量は３００．３μＬ、各溶離液（バッファ）の流速は毎分１５μＬ、にそれぞれ固定し、２つの流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）および試料導入バルブ（５１）の切り替えにより、ステップグラジエントによる試料の分析を行なった。

【0065】

最初は、２つの流路切り替えバルブ（５２ｂ、５２ｃ）および試料導入バルブ（５１）を全てＯＦＦ状態とし、送液ポンプ（３１）により送液されるバッファＡを直接分析カラム（７０）に導入することで、分析カラムの洗浄が行なわれ、バッファＢは第１の充填ポンプ（３２ｂ）によりループ（６２ｂａ、６２ｂｂ、６２ｂｃ）に、バッファＣは第２の充填ポンプ（３２ｃ）によりループ（６２ｃ）に、試料（２０）は試料充填ポンプ（不図示）によりループ（６１）にそれぞれ充填する。各ループへの溶離液（バッファ）または試料充填後、第２の流路切り替えバルブ（５２ｃ）および試料導入バルブ（５１）をＯＦＦ状態からＯＮ状態にし、試料、バッファＢ、バッファＣを大気圧下で連結する。前記連結および分析カラムの洗浄後、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＦＦ状態からＯＮ状態にすることで、ステップグラジエントによる試料の分析を開始する。まず、バッファＡで押し出す形でループ（６２ｂａ）に充填したバッファＢを分析カラム（７０）へ導入し、分析カラム（７０）の初期化（平衡化）を行なう。次に、ループ（６１）に充填した試料を分析カラム（７０）へ導入する。その後、ループ（６２ｂｂ）に充填したバッファＢを分析カラム（７０）へ導入し、分析カラム（７０）導入口側に試料が濃縮される。そして、ループ（６２ｃ）に充填したバッファＣを分析カラム（７０）へ導入し、実際の試料分析を行なう。第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態にしてから１９分後、第１の流路切り替えバルブ（５２ｂ）をＯＮ状態からＯＦＦ状態にすることで、再びバッファＡが分析カラム（７０）へ導入される。

【0066】

１０回分析を行なったうちの１回の分析におけるクロマトグラム（上段）および圧力変動（下段）を図２８に、１０回全ての分析におけるクロマトグラム（ａ）および圧力変動（ｂ）を図２９に、１０回分析を行なったときの再現性結果を表５および表６にそれぞれ示す。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４がバッファＣにより、Ｃ６およびＣ７がバッファＡによりそれぞれ溶出されていることがわかる。溶出時間のＣＶ（変動係数）は０．０８６％から０．１９０％（表５ａ）、ピーク高さのＣＶは０．２５６％から１．５９９％（表５ｂ）、ピーク面積のＣＶは０．３４９％から５．４３４％（表６ｃ）であり、良好な再現性が得られていることがわかる。

【0067】

【表5】

【0068】

【表6】

【符号の説明】

【0069】

１０：溶離液（バッファ）
２０：試料
３１：送液ポンプ
３２：溶離液（バッファ）充填ポンプ
４０：合流ブロック
５１：試料導入バルブ
５２：流路切り替えバルブ
５３：電磁弁
６１：試料（サンプル）ループ
６２：溶離液（バッファ）ループ
７０：分析カラム
８０：カラム恒温槽
９０：検出器
１００：抵抗管

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】