特許第5765841号(P5765841)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2022.1.31 β版

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5765841
(24)【登録日】2015年6月26日
(45)【発行日】2015年8月19日
(54)【発明の名称】核酸マイクロアレイの品質検査方法
(51)【国際特許分類】
   C12Q 1/68 20060101AFI20150730BHJP
   G06F 19/20 20110101ALI20150730BHJP
   G01N 33/53 20060101ALI20150730BHJP
   G01N 33/543 20060101ALI20150730BHJP
   C12N 15/09 20060101ALN20150730BHJP
【ＦＩ】
   C12Q1/68 A
   G06F19/20
   G01N33/53 M
   G01N33/543 575
   !C12N15/00 F
【請求項の数】15
【全頁数】50
(21)【出願番号】特願2010-118362(P2010-118362)
(22)【出願日】2010年5月24日
(65)【公開番号】特開2011-4737(P2011-4737A)
(43)【公開日】2011年1月13日
【審査請求日】2013年2月8日
(31)【優先権主張番号】特願2009-128162(P2009-128162)
(32)【優先日】2009年5月27日
(33)【優先権主張国】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「個別化医療の実現のための技術融合バイオ診断技術開発／染色体解析技術開発／臨床診断用全自動染色体異常解析システムの開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】306037311
【氏名又は名称】富士フイルム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100115107
【弁理士】
【氏名又は名称】高松 猛
(74)【代理人】
【識別番号】100151194
【弁理士】
【氏名又は名称】尾澤 俊之
(74)【代理人】
【識別番号】100164758
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 博道
(73)【特許権者】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100115107
【弁理士】
【氏名又は名称】高松 猛
(72)【発明者】
【氏名】吉田 淳哉
(72)【発明者】
【氏名】金原 秀行
(72)【発明者】
【氏名】氏原 大
(72)【発明者】
【氏名】稲澤 譲治
(72)【発明者】
【氏名】井本 逸勢
【審査官】 一宮 里枝
(56)【参考文献】
【文献】 特表２００２−５０１７６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】 国際公開第２００７／０３３２１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】 Peterson, G., et al.，A co-printed oligomer to enhance reliability of spotted microarrays，Journal of Microbiological Methods，２００９年 ６月，vol. 77，p. 261-266
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｑ １／００−３／００
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５４３
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プローブ核酸が固定化されたスポットを複数有する核酸マイクロアレイの品質検査方法であって、
前記核酸マイクロアレイにおける任意のスポット（Ｘ１ｍ）は、標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）と、該プローブ配列（ａ’）とは異なる配列（ｂ’）とを含むプローブ核酸が固定化され、
以下の工程；
配列（ｂ’）に結合可能な配列（ｂ）を含み、標識された異常検出核酸（Ｂ）を該核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ１ｍ）に付与し、配列（ｂ’）と配列（ｂ）とをハイブリダイズする工程、
スポット（Ｘ１ｍ）でハイブリダイズした異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｍ）を得る工程、
該標識量値（Ｆｃ１ｍ）に基づいて、スポット（Ｘ１ｍ）が、ハイブリダイゼーション能力が正常でない異常スポットであるか否か判定する工程を含む方法であって、
前記核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ１ｉ）と、それと同一の配列を有するプローブ核酸を含む品質検査用の核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対がｎ対存在し、
スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対間において、スポット（Ｘ１ｉ）における異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｉ）と、スポット（Ｘ２ｉ）における異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ２ｉ）との各比較値（ＤＢｉ）を、ｎ対全てのスポット対について計算する工程、
ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を得る工程、及び
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差の大きさによって、スポット（Ｘ１ｍ）と、同一の配列を有するプローブ核酸が固定化されたスポット（Ｘ２ｍ）とが異常スポット対であるか否か判定する工程
を含む方法。ここでｎは２以上の整数である。ｉは整数を表し、１≦ｉ≦ｎかつ１≦ｍ≦ｎである。
【請求項2】
請求項１に記載の方法であって、
前記比較値（ＤＢｉ）が下記式（１）により算出されるものであり、
式（１） 比較値＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆｃ１））／（標識量値（Ｆｃ２））｝
代表値（Ａ）が、ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の平均値又はメディアン値であって、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差が、前記ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の標準偏差値より大きい場合に、スポット（Ｘ１ｍ）及びスポット（Ｘ２ｍ）を含む該スポット対を異常スポット対と判定する、方法。
【請求項3】
請求項１に記載の方法であって、
前記比較値（ＤＢｉ）が下記式（１）により算出されるものであり、
式（１） 比較値＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆｃ１））／（標識量値（Ｆｃ２））｝
代表値（Ａ）が、ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の平均値又はメディアン値であって、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差が０．６以上の場合に、スポット（Ｘ１ｍ）及びスポット（Ｘ２ｍ）を含む該スポット対を異常スポット対と判定する、方法。
【請求項4】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
同一の配列を有するプローブ核酸が固定化されているスポット対が複数存在し、
前記複数のスポット対のうち、前記核酸マイクロアレイ上のすべてのスポットが異常スポットと判断されても、少なくとも一つのスポットは異常スポットとして削除しない、方法。
【請求項5】
請求項４に記載の方法であって、
すべてのスポットが異常スポットと判断された場合に、異常スポットとして削除しないスポットが、前記複数のスポット対の比較値の中で代表値に最も近い比較値を示すスポット対に含まれる、方法。
【請求項6】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、
さらに、スポット（Ｘ１ｍとＸ２ｍ）が異常スポット対であるか否か判定する前記工程において異常スポットと判定されたスポット（Ｘ１ｍ）及び（Ｘ２ｍ）以外のスポット（Ｘ１ｉ）の標識量値（Ｆ１ｉ）を下記式（２）により補正した補正標識量値（Ｆ１’ｉ）を得る工程を含む、方法。
式（２） 補正標識量値（Ｆ１’ｉ）＝標識量値（Ｆ１ｉ）×（標識量値（Ｆｃ２ｉ）／標識量値（Ｆｃ１ｉ））
（ただし、「標識量値（Ｆ１ｉ）」とは、スポット（Ｘ１ｉ）で前記標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）とハイブリダイズした標的核酸（Ａ）の標識量値のことである。）
【請求項7】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、スポットに固定化されるプローブ核酸がＢＡＣ ＤＮＡ又はｃＤＮＡである、方法。
【請求項8】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、標識が蛍光によるものである、方法。
【請求項9】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、検体の核酸とは異なり、プローブ核酸上の配列に相補的な配列を持つ核酸である、方法。
【請求項10】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、正常細胞由来の核酸である、方法。
【請求項11】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、反復配列を含む核酸である、方法。
【請求項12】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、Ｃｏｔ−１ＤＮＡである、方法。
【請求項13】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、ベクター由来の核酸である、方法。
【請求項14】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）を、標的核酸１モルに対して、１モル以上使用する、方法。
【請求項15】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法におけるデータ処理を行うためのプログラムであって、
スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対において、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）との比較値（ＤＢｉ）を計算する手順、
ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を得る手順、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差の大きさによってスポット（Ｘ１ｍ）が異常スポットであるか否か判定する手順、
を実行するためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸マイクロアレイの使用時に、全てのスポットにハイブリダイズしうる核酸である異常検出核酸を用いることで、核酸マイクロアレイ上に存在するスポットのうちハイブリダイズ結果の評価に用いるには不適当なスポットである異常スポットを検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； ＣＧＨ）法は、全染色体を対象にしてゲノムコピー数異常を短時間で検出できる技術である（非特許文献１）。しかし、このＣＧＨ法ではその検出解像度に問題があり、一般に５〜１０Ｍｂ以上にわたる大きな領域で染色体異常が起こっていないと検出ができなかった（非特許化文献２）。
これに対して、数１０ｋｂ〜数Ｍｂレベルで起きたゲノム構造異常を検出できるツールとして新しく登場したのが、アレイＣＧＨ法である（非特許文献３、４）。
アレイＣＧＨ法は、従来のＣＧＨ法における染色体標本の代わりに、多数のクローン化したＤＮＡ断片をガラス等の基板上に高密度でアレイ化したマイクロアレイを使用して、ＣＧＨ解析を行うものである。この手法により、ゲノムのコピー数等の異常を網羅的かつ高解像度で検出することができ、癌等の疾患の原因となっているゲノムの構造異常を同定することが可能になる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ａ． Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８， ８１８−８２１ （１９９２）．
【非特許文献2】稲澤譲治， 水口真希， 臨床検査， ４９， ４９７−５０２ （２００５）．
【非特許文献3】Ｄ． Ｐｉｎｋｅｌ ｅｔ． ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０， ２０７−２１１ （１９９８）
【非特許文献4】井本逸勢， 稲澤譲治， 細胞工学， ２３， ３５５−３６１ （２００４）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
化学合成できないｃＤＮＡやＢＡＣクローン等の長鎖核酸をプローブとして用いた核酸マイクロアレイは、インクジェット方式やピンアレイ方式等によってプローブ核酸を基板上にスポッティングすることにより製造されている。このような方法で製造された核酸マイクロアレイは、スポッティングエラー等によるスポット量のバラツキが生じやすく、測定対象となる遺伝子に由来する蛍光シグナルに誤差が生じる場合があった。
【0005】
一方、核酸マイクロアレイは、ある一定数ごとに核酸マイクロアレイを取り出し、標準試料などを用いて実際にハイブリダイゼーションを行い、その蛍光スポット形状や標識量値を検出することによって、品質検査が行われている。この品質検査は、主に核酸マイクロアレイを製造している製造者若しくは核酸マイクロアレイの供給者が行うものである。
別の品質検査方法としては、核酸マイクロアレイを染料等で染色する方法もある。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社のＰＡＲＡＧＯＮ （ＴＭ） ＤＮＡマイクロアレイ品質管理染色キット等が市販されている。この方法では、染色、スキャン、洗浄等の複雑な操作が必要となる問題がある。また、核酸マイクロアレイを染色後、核酸マイクロアレイを本来の目的で使用するために、核酸マイクロアレイから反応した染料を取り除く洗浄工程が必要であり、洗浄工程を行っても染料がアレイに残留する等の問題もある。
【0006】
さらに、従来の核酸マイクロアレイに対する品質検査は、一般に抜きとり検査によって行われている。この方法では、すべての核酸マイクロアレイの検査を行っているわけではないので、使用者が使用する段階で不良品であることがわかる可能性がある。
【0007】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、核酸マイクロアレイ上のスポット量のバラツキ等によって生じる誤差を低減した核酸解析方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、従来の核酸マイクロアレイの品質検査方法より簡便な方法かつ確実に行うことができる核酸マイクロアレイの品質検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
さらに、標識異常検出核酸（標識補正核酸）を使用することで、各スポット単位で品質検査を行うことができる方法を見出し、これまでにない簡便な方法で品質検査が行える方法を新たに見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、前述の課題は、以下の手段により解決することができる。
〔１〕
プローブ核酸が固定化されたスポットを複数有する核酸マイクロアレイの品質検査方法であって、
前記核酸マイクロアレイにおける任意のスポット（Ｘ１ｍ）は、標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）と、該プローブ配列（ａ’）とは異なる配列（ｂ’）とを含むプローブ核酸が固定化され、
以下の工程；
配列（ｂ’）に結合可能な配列（ｂ）を含み、標識された異常検出核酸（Ｂ）を該核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ１ｍ）に付与し、配列（ｂ’）と配列（ｂ）とをハイブリダイズする工程、
スポット（Ｘ１ｍ）でハイブリダイズした異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｍ）を得る工程、
該標識量値（Ｆｃ１ｍ）に基づいて、スポット（Ｘ１ｍ）が、ハイブリダイゼーション能力が正常でない異常スポットであるか否か判定する工程を含む方法であって、
前記核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ１ｉ）と、それと同一の配列を有するプローブ核酸を含む品質検査用の核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対がｎ対存在し、
スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対間において、スポット（Ｘ１ｉ）における異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｉ）と、スポット（Ｘ２ｉ）における異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ２ｉ）との各比較値（ＤＢｉ）を、ｎ対全てのスポット対について計算する工程、
ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を得る工程、及び
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差の大きさによって、スポット（Ｘ１ｍ）と、同一の配列を有するプローブ核酸が固定化されたスポット（Ｘ２ｍ）とが異常スポット対であるか否か判定する工程
を含む方法。ここでｎは２以上の整数である。ｉは整数を表し、１≦ｉ≦ｎかつ１≦ｍ≦ｎである。
〔２〕
〔１〕に記載の方法であって、
前記比較値（ＤＢｉ）が下記式（１）により算出されるものであり、
式（１） 比較値＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆｃ１））／（標識量値（Ｆｃ２））｝
代表値（Ａ）が、ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の平均値又はメディアン値であって、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差が、前記ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の標準偏差値より大きい場合に、スポット（Ｘ１ｍ）及びスポット（Ｘ２ｍ）を含む該スポット対を異常スポット対と判定する、方法。
〔３〕
〔１〕に記載の方法であって、
前記比較値（ＤＢｉ）が下記式（１）により算出されるものであり、
式（１） 比較値＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆｃ１））／（標識量値（Ｆｃ２））｝
代表値（Ａ）が、ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の平均値又はメディアン値であって、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差が０．６以上の場合に、スポット（Ｘ１ｍ）及びスポット（Ｘ２ｍ）を含む該スポット対を異常スポット対と判定する、方法。
〔４〕
〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法であって、
同一の配列を有するプローブ核酸が固定化されているスポット対が複数存在し、
前記複数のスポット対のうち、前記核酸マイクロアレイ上のすべてのスポットが異常スポットと判断されても、少なくとも一つのスポットは異常スポットとして削除しない、方法。
〔５〕
〔４〕に記載の方法であって、
すべてのスポットが異常スポットと判断された場合に、異常スポットとして削除しないスポットが、前記複数のスポット対の比較値の中で代表値に最も近い比較値を示すスポット対に含まれる、方法。
〔６〕
〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の方法であって、
さらに、スポット（Ｘ１ｍとＸ２ｍ）が異常スポット対であるか否か判定する前記工程において異常スポットと判定されたスポット（Ｘ１ｍ）及び（Ｘ２ｍ）以外のスポット（Ｘ１ｉ）の標識量値（Ｆ１ｉ）を下記式（２）により補正した補正標識量値（Ｆ１’ｉ）を得る工程を含む、方法。
式（２） 補正標識量値（Ｆ１’ｉ）＝標識量値（Ｆ１ｉ）×（標識量値（Ｆｃ２ｉ）／標識量値（Ｆｃ１ｉ））
（ただし、「標識量値（Ｆ１ｉ）」とは、スポット（Ｘ１ｉ）で前記標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）とハイブリダイズした標的核酸（Ａ）の標識量値のことである。）
〔７〕
〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の方法であって、スポットに固定化されるプローブ核酸がＢＡＣ ＤＮＡ又はｃＤＮＡである、方法。
〔８〕
〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法であって、標識が蛍光によるものである、方法。
〔９〕
〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、検体の核酸とは異なり、プローブ核酸上の配列に相補的な配列を持つ核酸である、方法。
〔１０〕
〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、正常細胞由来の核酸である、方法。
〔１１〕
〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、反復配列を含む核酸である、方法。
〔１２〕
〔１〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、Ｃｏｔ−１ＤＮＡである、方法。
〔１３〕
〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、ベクター由来の核酸である、方法。
〔１４〕
〔１〕〜〔１３〕のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）を、標的核酸１モルに対して、１モル以上使用する、方法。
〔１５〕
〔１〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載の方法におけるデータ処理を行うためのプログラムであって、
スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対において、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）との比較値（ＤＢｉ）を計算する手順、
ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を得る手順、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差の大きさによってスポット（Ｘ１ｍ）が異常スポットであるか否か判定する手順、
を実行するためのプログラム。
本発明は、上記〔１〕〜〔１５〕に係る発明であるが、以下、それ以外の事項（例えば、下記（１）〜（２０））についても記載している。
（１）核酸マイクロアレイを用いて、標的配列（ａ）を有する標的核酸の量を調べる核酸解析方法であって、
前記核酸マイクロアレイは、プローブ核酸が固定化されたスポットを複数有し、
そのうちの任意のスポット（Ｘ１ｍ）は、標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）と、該プローブ配列（ａ’）とは異なる配列（ｂ’）とを含むプローブ核酸が固定化され、ここでｍは任意の整数を表し、
以下の工程；
配列（ｂ’）に結合可能な配列（ｂ）を含み、標識された異常検出核酸（Ｂ）を該核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ１ｍ）に付与し、配列（ｂ’）と配列（ｂ）とをハイブリダイズする工程、
スポット（Ｘ１ｍ）において、ハイブリダイズした異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｍ）を得る工程、
該測定された標識量値（Ｆｃ１ｍ）に基づいて、スポット（Ｘ１ｍ）が、ハイブリダイゼーション能力が正常でない異常スポットであるか否か判定する工程を含む、方法。
（２）上記（１）に記載の方法であって、さらに、
標識された標的核酸（Ａ）をスポット（Ｘ１ｍ）に付与し、プローブ配列（ａ’）と標的配列（ａ）とをハイブリダイズする工程、及び
スポット（Ｘ１ｍ）でハイブリダイズした標的核酸（Ａ）の標識量値（Ｆ１）を得る工程、を含む、方法。
（３）上記（１）又は（２）に記載の方法であって、
配列（ｂ’）と配列（ｂ）とをハイブリダイズする工程と、プローブ配列（ａ’）と標的配列（ａ）とをハイブリダイズする工程と、を同時に行い、かつ、
異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｍ）を得る工程と、標的核酸（Ａ）の標識量値（Ｆ１ｍ）を得る工程と、を同時に行う、方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、
スポット（Ｘ１ｍ）と同一のアレイ上又は異なるアレイ上に存在するスポットであって、スポット（Ｘ１ｍ）と同種のプローブ核酸を含むスポット（Ｘ２ｍ）において、異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ２ｍ）を得る工程を含み、
異常スポットであるか否かの判定を、標識量値（Ｆｃ１ｍ）及び標識量値（Ｆｃ２ｍ）の対比結果に基づいて行う、方法。
（５）上記（４）に記載の方法であって、
同一の核酸マイクロアレイ又は異なる核酸マイクロアレイ上に、同種のプローブ核酸を含む少なくとも２つのスポットからなるスポット対がｎ対存在し、
前記異常スポットであるか否か判定する工程が、
スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対において、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）との各比較値（ＤＢｉ）を得る工程、
ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を得る工程、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差の大きさによってスポット（Ｘ１ｍ）が異常スポットであるか否か判定する工程、を含む、方法。ここでｎは２以上の整数である。ｉは整数を表し、１≦ｉ≦ｎかつ１≦ｍ≦ｎである。
（６）上記（５）に記載の方法であって、
前記比較値（ＤＢｉ）が下記式（１）により算出されるものであり、
式（１） 比較値（ＤＢｉ）＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆｃ１ｉ））／（標識量値（Ｆｃ２ｉ））｝
代表値（Ａ）が、ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の平均値又はメディアン値であって、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差が、前記ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の標準偏差値より大きい場合に、スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）を含む該スポット対を異常スポット対と判定する、方法。
（７）上記（５）に記載の方法であって、
前記比較値（ＤＢｉ）が下記式（１）により算出されるものであり、
式（１） 比較値＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆｃ１ｉ））／（標識量値（Ｆｃ２ｉ））｝
代表値（Ａ）が、ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）の平均値又はメディアン値であって、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差が０．６以上の場合に、スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）を含むスポット対を異常スポット対と判定する、方法。
（８）上記（５）〜（７）のいずれか一項に記載の方法であって、
同種のスポット対が複数存在し、
前記複数の同種のスポット対のうち、すべてのスポットが異常スポットと判断されても、少なくとも一つのスポットは異常スポットとして削除しない、方法。
（９）上記（８）に記載の方法であって、
すべてのスポットが異常スポットと判断された場合に、異常スポットとして削除しないスポットが、複数の同種のスポット対の比較値の中で代表値（Ａ）に最も近い比較値を示すスポット対に含まれる、方法。
（１０）上記（５）〜（９）のいずれか一項に記載の方法であって、
さらに、下記式（２）により標識量値（Ｆ２ｉ）を補正した補正標識量値（Ｆ２’ｉ）を得る工程を含む、方法。
式（２） 補正標識量値（Ｆ２’ｉ）＝標識量値（Ｆ２ｉ）×（標識量値（Ｆｃ１ｉ）／標識量値（Ｆｃ２ｉ））
（１１）プローブ核酸が固定化されたスポットを複数有する核酸マイクロアレイの品質検査方法であって、
前記核酸マイクロアレイにおける任意のスポット（Ｘ１ｍ）は、標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）と、該プローブ配列（ａ’）とは異なる配列（ｂ’）とを含むプローブ核酸が固定化され、
以下の工程；
配列（ｂ’）に結合可能な配列（ｂ）を含み、標識された異常検出核酸（Ｂ）を該核酸マイクロアレイ上のスポット（Ｘ１ｍ）に付与し、配列（ｂ’）と配列（ｂ）とをハイブリダイズする工程、ここでｍは任意の整数を表し、
スポット（Ｘ１ｍ）でハイブリダイズした異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｍ）を得る工程、
該標識量値（Ｆｃ１ｍ）に基づいて、スポット（Ｘ１ｍ）が、ハイブリダイゼーション能力が正常でない異常スポットであるか否か判定する工程を含む、方法。
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の方法であって、スポットに固定化されるプローブ核酸がＢＡＣ ＤＮＡ又はｃＤＮＡである、方法。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の方法であって、標識が蛍光によるものである、方法。
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、検体の核酸とは異なり、プローブ核酸上の配列を持つ核酸である、方法。
（１５）上記（１）〜（１４）のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、正常細胞由来の核酸である、方法。
（１６）上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が反復配列を含む、方法。
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）がＣｏｔ−１ ＤＮＡである、方法。
（１８）上記（１）〜（１４）のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）が、ベクター由来の核酸である、方法。
（１９）上記（１）〜（１８）のいずれか一項に記載の方法であって、異常検出核酸（Ｂ）を、標的核酸１モルに対して、１モル以上使用する、方法。
（２０）上記（５）〜（１９）のいずれか一項に記載の方法におけるデータ処理を行うためのプログラムであって、
スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対において、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）との比較値（ＤＢｉ）を計算する手順、
ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を得る手順、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差の大きさによってスポット（Ｘ１ｍ）が異常スポットであるか否か判定する手順、を実行するためのプログラム。（２１）ハイブリダイゼーション用溶液、異常検出核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション用溶液、未標識核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液、未標識核酸及び異常検出核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション用溶液の中から選ばれる一つと核酸マイクロアレイを含み、異常検出核酸（Ｂ）、補正核酸、未標識核酸の中から選ばれる少なくとも一つを含む、キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係る核酸解析方法では、異なるスポットにハイブリダイズした異常検出核酸の標識量値同士を比較し、その比較値を検討することによって、異常スポットを検出し核酸マイクロアレイ間のデータのバラツキを低減することが可能となった。このことにより、標的核酸の標識量値における誤差を低減し、より正確なデータが得られる。
さらに、本発明の品質検査方法によれば、例えば、核酸マイクロアレイの製造元が、標識異常検出核酸を用いて核酸マイクロアレイとハイブリダイゼーションさせ、その標識量値を使用者に対して提供し、使用者はそのデータと実験で使用した核酸マイクロアレイの標識標的核酸と共にハイブリダイゼーションさせた標識異常検出核酸の標識量値とを比較することで、どのスポットが品質検査上問題のあるスポットなのかを知ることができる。
このことによって、使用者は核酸マイクロアレイのスポットごとの品質検査を容易に行うことができる。さらに、この品質検査法は、実験のために使用している標識異常検出核酸の標識量値を品質検査に対して流用しているので、品質検査のために特別な試薬を必要とせず、品質検査のための特別な工程も追加することなく、極僅かな工程の追加（その多くは、コンピュータプログラムで対応可能）のみで行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明に係る核酸マイクロアレイ解析方法の実施形態を示す模式図である。
【図2】本発明に係る核酸マイクロアレイ解析方法の実施形態を示す模式図である。
【図3】本発明に係る品質管理方法の実施形態を示す模式図である。
【図4】比較例１（異常スポットを削除しなかった場合）で得られたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図5】比較例１（異常スポットを削除しなかった場合）で得られたＦｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅの値をプロットした図である。
【図6】実施例１において、異常スポットが全体の３％となるように異常スポットを削除した場合に、得られたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図7】実施例１において、異常スポットが全体の５％となるように異常スポットを削除した場合に、得られたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図8】実施例１において、異常スポットが全体の１０％となるように異常スポットを削除した場合に、得られたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図9】実施例１において、比較値と代表値との差が０．６以上のものを異常スポットとして削除した場合に、得られたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図10】異常スポット削除率と常染色体部位の分散値（ＳＴＤＥＶ）との関係を示した図である。
【図11】実施例１において、異常スポットが全体の３％となるように異常スポットを削除した場合に、得られたＲａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図12】実施例２において、核酸マイクロアレイ１と２のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）をプロットした図である。
【図13】図１２のプロットから品質管理上問題となるスポット対（Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値の平均値と各スポット対のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値との差が０．６）を削除した結果を示す図である。
【図14】実施例２において、核酸マイクロアレイ２と３のスポット対間で計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ） 値をプロットした図である。
【図15】図１４のプロットから核酸マイクロアレイ１と２、核酸マイクロアレイ１と３との間で計算した品質検査上問題のあるスポット対を削除した結果を示す図である。
【図16】図１４の一部拡大図である。
【図17】図１５の一部拡大図である。
【図18】実施例３において、削除対象とするスポット対の一例を示す図である。
【図19】実施例４において、異常スポットを削除していない場合のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図20】実施例４において、同一アレイ内及び異なるアレイ間で異常スポットを削除した場合の結果を示す図である。
【図21】実施例５（標識異常検出核酸（標識補正核酸）として正常細胞由来の核酸を使用した場合）において、異常スポットを削除していない場合のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図22】図２１のプロットから、異常スポットを削除した結果を示す図である。
【図23】図２２のプロットから、さらに異常スポットを削除した結果を示す図である。
【図24】実施例６（標識異常検出核酸（標識補正核酸）としてベクター由来の核酸を使用した場合）において、異常スポットを削除していない場合のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットした図である。
【図25】図２４のプロットから、異常スポットを削除した結果を示す図である。
【図26】図２５のプロットから、さらに異常スポットを削除した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
（原理の説明）
以下、本発明の好適な実施形態について図面に基づいて説明する。なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
図１及び２に本実施形態に係る核酸解析方法を説明するための模式図を示す。
まず、図１に示すように試料核酸及び異常検出核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液を調製する。
本実施形態においては、２種類の検体（検体（Ａ１）及び検体（Ａ２））について核酸解析を行う。すなわち、試料核酸は、検体（Ａ１）から試料核酸（Ａ１）を、検体（Ａ２）から試料核酸（Ａ２）をそれぞれ調製する。試料核酸の調製方法の詳細は後述する。これらの試料核酸（Ａ１）及び（Ａ２）には、何らかの標的核酸（ａ）が含まれているものとする。
また、標的核酸（ａ）の配列とは異なる配列（ｂ）を含む異常検出核酸（Ｂ）を用意する。配列（ｂ）は、核酸マイクロアレイ上に存在する実質的にすべてのスポットに固定化されているプローブ核酸に結合可能な配列であることが好ましい。このような配列としては、繰り返し配列（反復配列）を含む配列が挙げられる。異常検出核酸（Ｂ）は正常細胞由来の核酸であることが好ましく、ベクター由来の核酸又はＣｏｔ−１ ＤＮＡであることが最も好ましい。
これらの試料核酸（Ａ１）、（Ａ２）及び異常検出核酸（Ｂ）に対し、後述する標識化合物を用いて標識を行い、必要に応じて後述する精製を行った後、標識された試料核酸（Ａ１）、（Ａ２）（標識試料核酸（Ａ１）、（Ａ２））及び標識された異常検出核酸（Ｂ）（標識異常検出核酸（Ｂ））をそれぞれ含むハイブリダイゼーション用溶液（Ａ１）、（Ａ２）を得る。
【0013】
核酸マイクロアレイは、同種のアレイを各ハイブリダイゼーション用溶液に対して１つずつ用意する。すなわち、本実施形態における核酸解析はいわゆる単色法によるものである。検体（Ａ１）の解析を行うための核酸マイクロアレイをアレイ（Ａ１）、検体（Ａ２）の解析を行うための核酸マイクロアレイをアレイ（Ａ２）とする。
このアレイ（Ａ１）及び（Ａ２）は、プローブ核酸が固定化されたスポットを複数有している。なお、アレイ（Ａ１）及び（Ａ２）は同種のプローブ核酸が同様に配列されたものである。また、アレイ（Ａ１）及び（Ａ２）のスポットのうち、任意のスポット（Ｘ１）は、標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）を含むプローブ核酸が固定化されている。また、任意のスポット（Ｘ１）を含むすべてのスポットには、標的配列（ａ’）とは異なる配列（ｂ’）を含むプローブ核酸が固定化されている。配列（ｂ’）は、前記異常検出核酸（Ｂ）に含まれる配列（ｂ）と結合可能であるものとする。
【0014】
次に、標識試料核酸（Ａ１）、（Ａ２）をアレイ（Ａ１）及び（Ａ２）にそれぞれ添加し、標識異常検出核酸（Ｂ）をアレイ（Ａ１）及び（Ａ２）の両方に添加し、標的配列（ａ）とプローブ配列（ａ’）、及び配列（ｂ）と配列（ｂ’）とをハイブリダイズする。
添加する方法は特に限定されないが、アレイ（Ａ１）への標識試料核酸（Ａ１）及び標識異常検出核酸（Ｂ）の添加を同時に行い、アレイ（Ａ２）への標識試料核酸（Ａ２）及び標識異常検出核酸（Ｂ）の添加を同時に行うことが好ましい。
本実施形態においては、図１に示すように、予め作製した標識試料核酸（Ａ１）と標識異常検出核酸（Ｂ）とを含むハイブリダイゼーション用溶液（Ａ１）、標識試料核酸（Ａ２）と標識された異常検出核酸（Ｂ）とを含むハイブリダイゼーション用溶液（ＡＢ）を、アレイ（Ａ１）及び（Ａ２）にそれぞれ添加する。
【0015】
ハイブリダイズは、市販のハイブリダイザーを用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションにおける温度は、２５〜５０℃の範囲で行うことが好ましく、３０〜４５℃の範囲で行うことがより好ましく、３７〜４２℃の範囲で行うことがさらに好ましい。
また、ハイブリダイゼーションの時間は、８〜９６時間とすることが好ましく、１２〜７２時間とすることがより好ましく、１６〜４８時間とすることがさらに好ましい。
ハイブリダイズ後、適宜洗浄等を行う。洗浄は、ＳＳＣ溶液（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；クエン酸緩衝液）、ホルムアミド／ＳＳＣ溶液、ＳＳＣ／ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液などを用いて行なうことができる。
【0016】
ハイブリダイズは、標的核酸とプローブ核酸とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが好ましい。具体的なハイブリダイズの条件としては、例えば、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った後、洗浄条件として、（１）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、３０秒間、（２）５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、１５分間、（３）２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、３０分間、（４）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、５分間の洗浄を行うことが挙げられる。
【0017】
ハイブリダイズ及び洗浄後、アレイ（Ａ１）及び（Ａ２）のスポットごとに、標識試料核酸（Ａ１）に含まれる標識標的核酸由来の標識量、標識試料核酸（Ａ２）に含まれる標識標的核酸由来の標識量、標識異常検出核酸（Ｂ）由来の標識量を読み取る。
各標識量値は、例えば、標識異常検出核酸（Ｂ）の標識として蛍光化合物を使用した場合は、蛍光スキャナーなどを使用して蛍光値を測定することによって得られる。
ここで、アレイ（Ａ１）と（Ａ２）はそれぞれ少なくともｎ個のスポットを有する。ｎは整数を表す。以下、アレイ（Ａ１）、（Ａ２）上に存在するスポットをそれぞれスポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）とする。ｉは整数を表し、１≦ｉ≦ｎである。
アレイ（Ａ１）上のスポット（Ｘ１ｉ）から読み取った標識試料核酸（Ａ１）由来の標識量値を（Ｆ１ｉ）とし、標識異常検出核酸（Ｂ）由来の標識量値を（Ｆｃ１ｉ）とする。
一方、アレイ（Ａ２）上のスポット（Ｘ２ｉ）から読み取った標識試料核酸（Ａ２）由来の標識量値を（Ｆ２ｉ）とし、標識異常検出核酸（Ｂ）由来の標識量値を（Ｆｃ２ｉ）とする。
【0018】
次に、標識異常検出核酸（Ｂ）の標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）の比較を行い、異常スポットを検出する。
本実施形態では、アレイ（Ａ１）、（Ａ２）上のスポット（Ｘ１ｉ）、（Ｘ２ｉ）が同種のスポットであり、スポット対を構成する。
ここで異常スポットとは、核酸マイクロアレイ上に存在するスポットのうちハイブリダイゼーション能力が正常ではなく、ハイブリダイズ結果の評価に用いるには不適切なスポットであり、試料核酸中に含まれる標的配列（ａ）の検出には不適当なスポットをいう。主に核酸マイクロアレイの製造時においてプローブ核酸の量が不均一にスポットに固定化されていることに起因するものと考えられる。ハイブリダイズした異常検出核酸の量を複数のスポット間で比較すると、本来はその値は一定であることが期待され、量に差がある場合は当該複数のスポットの少なくとも何れかが異常なスポットであることがわかる。そして該複数のスポットにおける量の代表値等と比較して異常に量が多いか少ないスポットを異常スポットと推定できる。
標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）の比較は、アレイ（Ａ１）及びアレイ（Ａ２）上にある同種のスポットからなるスポット対間で行う。同種のスポットとは、実質的に同一のプローブ核酸が固定化されているスポットをいう。
具体的には、アレイ（Ａ１）上の同種のスポット（Ｘ１ｉ）と、これと同種のスポットであるアレイ（Ａ２）上のスポット（Ｘ２ｉ）のスポット対間において、その標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）の下記式（１）により比較値（ＤＢｉ）を計算し、これをアレイ上のすべてのスポット対で行う（図２（ａ））。すなわち、アレイ（Ａ１）及び（Ａ２）上にｎ対（ｎは２以上の整数）のスポット対があるとすると、ｎ個の比較値が得られることになる。
式（１） 異常検出核酸（Ｂ）の比較値（ＤＢｉ）＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆｃ１ｉ））／（標識量値（Ｆｃ２ｉ））｝
【0019】
なお、本発明で言う比較値とは、スポット対間の標識量値を比較することによって得られた数値を意味する。上記本実施形態では、比較値として、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）の比のＬｏｇ値を使用しているが、比較値を得る方法は、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）とを数値によって比較し、両者の差が定量的に数値化できる方法であればいかなるものでもかまわない。他の比較値としては、例えば、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）の比、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）の差等を使用することができる。
【0020】
次に得られたｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を計算する。代表値としては、例えば、平均値又はメディアン値（中央値）をあげることができる。メディアン値とは、ある数値の集合を順番に並べた時、その集合体の数の半分の位置に相当する数値である。さらに、統計的に算出された代表値などを使用することができる。
【0021】
さらに、上記で得られた比較値（ＤＢｉ）の代表値（Ａ）からのずれの大きさによって、異常スポットの判定を行う。
例えば、予め閾値を設定しておき、比較値（ＤＢｉ）と代表値（Ａ）との差が閾値以上である場合に、そのスポット対が異常スポットであると判定することができる。閾値としては、例えば０．６等とすることができる。また、比較値（ＤＢｉ）と代表値（Ａ）との差が、ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）における標準偏差値より大きい場合を異常スポットとしても良い。
【0022】
図２（ｂ）に、上記式（１）により算出された比較値（ＤＢ）（Ｌｏｇ比）のプロットを模式的に表した図を示す。図２（ｂ）においては、中間値を０とした場合の比較値（ＤＢ）のプロットを示している。
アレイ（Ａ１）及び（Ａ２）においては、実質的に同一のプローブに対して、同一の標識異常検出核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションしているので、スポット対を構成しているスポット間のプローブ核酸の固定量が同じであれば、標識異常検出核酸（Ｂ）のハイブリダイゼーション量はそれぞれのスポット間で同一となり、そのＬｏｇ比はゼロとなることから、Ｘ軸上にすべての点が集まるはずである。
しかし、実際には、スポット間のプローブ核酸量にはバラツキがあるため、図２（ｂ）に示したように、Ｘ軸から離れた点が現れることがある。
これは、両アレイ間で標識異常検出核酸のハイブリダイゼーション量が異なっていることを示し、標識異常検出核酸（Ｂ）のハイブリダイゼーションがスポット間で実質的に同一であるとすると、このことは、プローブ核酸のスポット量が核酸マイクロアレイ間で異なっている可能性が非常に高いことを示している。
【0023】
なお、異常スポットとして判定する際、全体のスポット対又は興味の対象としているスポットのスポット対の総数に対する異常スポットの数を限定することで、異常スポットとなる範囲を決定してもよい。
すなわち、この場合は以下の手順で異常スポットを判定する。
まず、全体のスポット対若しくは興味の対象としているスポット対に対して標識量値の代表値を計算し、その代表値から各スポットの標識量値との差を計算する。
次に、このずれをその大きなもの順に並べ、全体のスポット対若しくは興味の対象としているスポットのスポット対の数に対して、ずれの大きいものから順番に、ある特定の割合以上のものを異常スポットとすることができる。
本発明では、この割合が３０％より小さい数に相当するスポット数を異常スポットとすることができる。
また、ずれを大きなもの順に並べ、全体のスポット対若しくは興味の対象としているスポットのスポット対の総数に対して、ずれの大きいものから順番に１０％より小さい割合に相当する数を異常スポットとすることがより好ましい。
また、ずれを大きなものから順に並べ、全体のスポット対若しくは興味の対象としているスポットのスポット対の数に対して、ずれの大きいものから順番に５％より小さい割合に相当する数を異常スポットとすることがさらにより好ましい。
また、ずれを大きなものから順に並べ、全体のスポット対若しくは興味の対象としているスポットのスポット対の数に対して、ずれの大きいものから順番に３％より小さい割合に相当する数を異常スポットとすることが最も好ましい。
【0024】
その他、異常スポットの判定は、全スポット対あるいは特定のスポット領域に対して、フーリエ変換を行い、その高周波成分を異常スポットとすることにより行うこともできる。
【0025】
次に、異常スポットと判定されたスポットを削除する。
すなわち、異常スポットと判定されたスポット（Ｘ１ｍ）及び（Ｘ２ｍ）を含むスポット対における標的核酸の標識量値（Ｆ１ｍ）及び（Ｆ２ｍ）を、以降の標的核酸の標識量値のデータ処理には使用しないようにする。ｍは任意の整数を表す。
【0026】
次に、アレイ（Ａ１）の標識標的核酸の標識量値（Ｆ１ｉ）及びアレイ（Ａ２）の標識標的核酸の標識量値（Ｆ２ｉ）から下記式（３）によりＬｏｇ比を計算する（図２（ｃ））。
なお、前述のように異常スポットと判定されたスポットを含むスポット対における標的核酸の標識量値（Ｆ１ｉ）及び（Ｆ２ｉ）については、この計算に含めない。
式（３） 標識標的核酸の比較値（ＤＡｉ）
＝Ｌｏｇ２｛（標識量値（Ｆ１ｉ））／（標識量値（Ｆ２ｉ））｝
【0027】
図２（ｄ）に、上記式（３）により算出された比較値（ＤＡ）（Ｌｏｇ比）のプロットを模式的に表した図を示す。
図２（ｄ）において、異常スポットと判定されたスポット対における標識標的核酸の比較値（ＤＡｍ）を点線の円で示している。図２（ｄ）に示すように、異常スポットと判定されたスポット対における標識標的核酸の比較値（ＤＡｍ）のプロットは、本来あるべき位置とずれた位置に現れることが多い。すなわち、図２（ｄ）に示す模式図のパターンでは、異常スポットと判定されたスポット対は、本来Ｘ軸上にプロットされるべき（つまり、Ｌｏｇ比（Ｆ２／Ｆ１）＝ゼロ）であると予測される。
【0028】
さらに、異常スポットと判定されたスポット（Ｘ１ｍ）及び（Ｘ２ｍ）以外のスポットについて、標識標的核酸の標識量値（Ｆ１）及び（Ｆ２）を補正する。
具体的には、下記式（２）により標識量値（Ｆ２ｉ）の補正標識量値（Ｆ２’ ｉ）を得る。
式（２） 補正標識量値（Ｆ２’ ｉ）＝標識量値（Ｆ２ｉ）×（標識量値（Ｆｃ１ｉ）／標識量値（Ｆｃ２ｉ））
【0029】
これを核酸マイクロアレイ上のすべてのスポット、若しくは、興味の対象とするスポットについて計算することで補正を行う。
図２（ｅ）に、補正後の標識標的核酸の標識量値（Ｆ１）及び（Ｆ２’）のＬｏｇ比のプロットを模式的に表した図を示す。補正を行うことにより、図２（ｄ）と比較して、さらにデータのバラツキが減少する。
なお、本発明においては、このような標識量値（Ｆ１）及び（Ｆ２）の補正は必ずしも行う必要はないが、標的核酸の量をより正確に調べる上ではかかる補正を行うことが好ましい。
【0030】
以上の実施形態では、異常スポットを判定した後、標識標的核酸の標識量値の補正を行っているが、この順番は、逆に行ってもかまわない。
【0031】
（品質検査方法の説明）
次に、本発明に係る品質検査方法の実施形態について説明する。
図３は、本実施形態に係る品質検査方法の手順を模式的に表した図である。
図３に示すように、まず、品質検査用の核酸マイクロアレイ（Ａ０）を用意し、標識された異常検出核酸（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション用溶液を核酸マイクロアレイ（Ａ０）に付与し、標識された異常検出核酸（Ｂ）とプローブ核酸とをハイブリダイズする。
次に、ハイブリダイズした核酸マイクロアレイ（Ａ０）から、スポットごとにその標識量値Ｆｃ０を得る。標識量値（Ｆｃ０）は、例えば、標識された異常検出核酸（Ｂ）の標識として蛍光化合物を使用した場合は、蛍光スキャナーなどを使用して蛍光値を測定することによって得られる。
【0032】
品質検査用の標識量値を算出するための核酸マイクロアレイではない、すなわち、実際の試料をハイブリダイゼーションする核酸マイクロアレイ（図では、核酸マイクロアレイ１〜Ｎ（Ｎは２以上の整数））に対しては、標識された異常検出核酸（標識補正核酸）を用いた図１と図２の方法で標識試料核酸と標識された異常検出核酸とを用いることによってハイブリダイゼーションを行い、そこから得られた標識された異常検出核酸の標識量値と、品質検査用の核酸マイクロアレイ、すなわち、図３では、核酸マイクロアレイ０から得られた標識された異常検出核酸由来の標識量値とを比較することで、正常にスポットされていると仮定している核酸マイクロアレイ０のスポット量との違いを数値データとして得ることが出来、この数値データがあらかじめ決められた範囲を超えたものを品質検査上の規格外のスポットとして、以降のデータ処理や結果の判断に使用しないようにすることができる。
【0033】
規格値は、核酸マイクロアレイの製造者若しくは核酸マイクロアレイの供給者が決めることが好ましいが、使用者が決めてもかまわない。なお、品質検査を行うことは、核酸マイクロアレイ上のすべてのスポットに対して行うことが望ましいが、興味あるスポットを対象として行うこともできる。また、核酸マイクロアレイ０の標識量値は、数枚の核酸マイクロアレイを試験して得られた数値を用いても良い。この際の、数値を算出する方法としては、代表値、例えば、平均値などを用いたり、代表値から大きくはずれた標識量値を省き、残った標識量値の間で、代表値、例えば、平均値を計算したりするなどの方法で行うことができる。
【0034】
また、使用者が独自に品質検査用の標識された異常検出核酸の標識量値を決めることもできる。例えば、核酸マイクロアレイ１からｎを使用すると仮定して、核酸マイクロアレイ１から得られた標識された異常検出核酸の標識量値を品質検査用の基準値とし、その値と核酸マイクロアレイ２からｎから得られた、それぞれの標識された異常検出核酸の標識量とを比較することで品質検査を行うこともできる。
【0035】
また、品質検査を行った後に、図１や図２の様に、実際の試料に対して使用する核酸マイクロアレイ、すなわち、核酸マイクロアレイ１〜ｎの間で、マイクロアレイ実験を行い、それらの核酸マイクロアレイ間で異常スポットを検出し、検出した異常スポットを削除若しくは明示することもできる。
例えば、核酸マイクロアレイ１に対して、正常細胞由来の標識試料核酸と標識された異常検出核酸をハイブリダイゼーションさせ、核酸マイクロアレイ２に対して、異常細胞由来の標識試料核酸と標識された異常検出核酸をハイブリダイゼーションさせ、それぞれの核酸マイクロアレイから得られた標識された異常検出核酸の標識量値（蛍光値）と、核酸マイクロアレイ０から得られた標識された異常検出核酸の標識量値（蛍光値）とを比較、すなわち、核酸マイクロアレイ０と核酸マイクロアレイ１の間、及び核酸マイクロアレイ０と核酸マイクロアレイ２との間の標識された異常検出核酸の標識量値を比較することで、品質検査上問題のあるスポットを最初に削除することができる。
【0036】
次に、核酸マイクロアレイ１と核酸マイクロアレイ２との標識された異常検出核酸から得られた標識量値を比較することで異常スポットを検出若しくは明示することができる。この様にすることで、仮に、実際の試料に対して使用する核酸マイクロアレイ、すなわち、核酸マイクロアレイ１〜ｎの間で、ある特定のスポットに対するプローブ核酸のスポット量が、これらの核酸マイクロアレイ間で工場出荷時の規定のスポット量とずれており、そのずれたスポットに対するスポット量がほぼ同一の場合には、例え、核酸マイクロアレイ１〜ｎの間で標識された異常検出核酸の標識量値の比較による異常スポットの検出を行ったとしても、異常スポットとして検出されない可能性があるが、本発明の方法によれば、この様な場合でも、工場出荷時の標識された異常検出核酸の標識量値とのずれで、異常スポットを検出することができる。なお、核酸マイクロアレイ０、核酸マイクロアレイ１からｎで使用する標識された異常検出核酸は同一ロットで調製されたものであることが好ましい。
【0037】
なお、本発明でいうところの品質検査とは、核酸マイクロアレイ上の各スポットが正しくスポットされたと考えられる核酸マイクロアレイと、品質検査対象の核酸マイクロアレイ、例えば、使用者が使用する核酸マイクロアレイとを比較したとき、この核酸マイクロアレイが製造者の意図とする性能を有しているかどうかを検査することを言う。
本発明では、使用者が核酸マイクロアレイを使用する段階で、核酸マイクロアレイの検査を行うことが出来ること、すなわち、すべての核酸マイクロアレイで品質検査ができること、核酸マイクロアレイのスポットごとに品質検査を行うことが出来ることが最大の特徴である。この様にすることで、従来、抜き打ち検査では発見できなかった、抜き出されなかった核酸マイクロアレイを検査することができる。
【0038】
また、従来、核酸マイクロアレイ上に結合したプローブ核酸に対して、染色作用のある標識化合物で染色する方法により、スポットごとに検査が可能であり、かつ、すべての核酸マイクロアレイの検査が可能であったが、この方法では、染色反応、洗浄反応、乾燥工程、標識量値の読み取り、染色化合物のプローブ核酸からの除去、洗浄、乾燥と、非常に多くのプロセスを必要とし、さらに、染色化合物の核酸マイクロアレイ上への残存による標識試料核酸の標識量値への影響や、洗浄工程を繰り返すことによるプローブ核酸の核酸マイクロアレイからの脱離による核酸マイクロアレイの性能低下など、種々の問題点があった。
【0039】
しかし、本発明の品質検査方法では、使用時に品質検査を行うことが出来るので、あらかじめ標識化合物でプローブ核酸を染色しておく必要が無く、さらに、洗浄や乾燥は試料核酸と共に行われるので品質検査用の洗浄、乾燥も必要もなく、スポットごとに、かつ、すべての核酸マイクロアレイの検査を行うことができる。さらに、品質検査に使用した標識された異常検出核酸は、異常スポットの検出に用いることや、標識補正核酸として用いて標識試料核酸の標識量値の補正に用いることもできる。
【0040】
図３に示したように、核酸マイクロアレイ０に対して、標識された異常検出核酸のみをハイブリダイゼーションしてもよいが、このハイブリダイゼーション時に、標識された異常検出核酸とは異なる別の核酸と共にハイブリダイゼーション反応を行ってもかまわない。例えば、標識試料核酸をハイブリダイゼーションしても良い。また、標識試料核酸の中でも、正常細胞由来の標識試料核酸を同時にハイブリダイゼーションさせることもできる。この様にすることで、例えば、品質検査用の標識された異常検出核酸の標識量値と共に、正常細胞由来の標識試料核酸の標識量値を得ることができる。これらの標識量値は、使用者にデジタルデータとして供給することもでき、この様にすることで、使用者は、品質検査を行えるだけではなく、異常細胞由来の試料核酸さえ準備すれば、正常細胞由来の標識試料核酸を準備する必要が無く、直ちに核酸マイクロアレイ実験が行えるようになる。これにより、操作工程の大幅な短縮化が可能であると共に、核酸マイクロアレイの使用量が減り、さらに、試薬の使用量が減ることから、実験コストが大幅に低下する。
【0041】
また、抜き打ち検査とともに、本発明の品質検査法とを併用することもできる。すなわち、例えば、核酸マイクロアレイの製造者（製造者は核酸マイクロアレイの供給者を含むものとする）が一定数ごとに核酸マイクロアレイの抜き打ち検査を行い、ここで合格したロットと品質検査用の標識試料核酸の標識量値とともに製造出荷し、各使用者が本発明の方法によって、核酸マイクロアレイ実験を行うと共に品質検査を行うことができる。
【0042】
（同種のプローブを含む場合）
異常スポットは、例えば、同一プローブを複数個スポットしている場合、そのすべてを異常スポットと判断した場合には、そのすべてを削除しても良く、部分的に削除しても良い。しかし、すべてを異常スポットとして削除すると、そのプローブに関する情報が全く得られなくなってしまう。そこで、すべてのスポットが異常スポットと判断されても、少なくとも一つのスポットは異常スポットとして削除しないことが好ましく、その場合、異常スポットとして削除しないスポットが、複数の同種のスポット対の比較値の中で代表値に最も近い比較値を示すスポット対に含まれることが好ましい。またすべてを削除した場合は、使用者に対して、異常スポットのすべてを削除したことを知らせることができるようにすることが好ましい。例えば、コンピュータ上のソフトウェアによって、本発明の計算を自動的に行うことができるが、ソフトウェアによって画面上に、異常スポットの一覧を文字としても、また画像としても表示させることもでき、さらに、その中ですべての異常スポットを削除した場合や同一プローブをスポットしたスポット間の多くのスポット対を異常スポットとして削除した場合には、特に強調して画面上に若しくは紙面上に表示させることが望ましい。また、同一プローブをスポットしたスポット間の多くのスポット対を異常スポットとして削除した場合やそのすべてを削除した場合には、そのスポット対だけ敷居値、例えば、計算した標識された異常検出核酸（標識補正核酸）から計算された標識量値同士のＬｏｇ比に対する敷居値を変えることができるようにしておくことも好ましい。例えば、特定の種類のプローブ核酸がスポットされたスポット対だけ敷居値を下げること、すなわち、異常スポットの数を減らすことで、そのスポットから情報を得ることができるようにすることができる。
【0043】
異常スポットを検出するための比較を行うスポット対の組み合わせは、最も好ましくは、同一のプローブ核酸がスポットされており、核酸マイクロアレイ内のスポット位置が同一のものであるものが好ましい。スポット位置が同一のものとは、例えば、スポットが同一のＣｏｌｕｍｎ番号、同一のＲｏｗ番号である。しかし、本発明では、同一のプローブ核酸がスポットされていれば、特にスポット位置にこだわる必要はない。例えば、同一のプローブ核酸がスポットされていれば、例えばこのことは、スポット対が、異なるＣｏｕｌｍｎ番号、異なるＲｏｗ番号同士であってもよいことを示している。また、同一のプローブ核酸がスポットされていれば、二枚の核酸マイクロアレイ間のハイブリダイゼーション条件が異なっていてもかまわない。さらに、異常スポットとして検出されない濃度範囲において、意図的にプローブ核酸の濃度を変えてスポットしても良い。本発明で言うところの“そのスポットに対応する”とは、これらの様なスポットの組み合わせのことを言う。
また、使用する核酸マイクロアレイは、必ずしも全く同じスポット配置同士である必要性はない。すなわち、同一のプローブ核酸がスポットされているのならば、それぞれの種類のプローブ核酸がどのような配置でスポットされていてもかまわない。すなわち、異なった配置を持つ核酸マイクロアレイ同士でも、同一のプローブ核酸対が存在していれば、それらの間で比較することができる。
【0044】
また本発明では、全スポットに対して計算を行い、異常スポットを見出すこともできるが、注目している領域若しくはスポット群に対して計算を行うこともできる。すなわち、多くの核酸マイクロアレイのスポットは、その生産性の観点から個別に設計された核酸マイクロアレイを個々に生産するよりも、その生産効率の向上などを目的として、予め想定されたプローブをスポットしておくことで大量生産を行うことが行われる。その様な場合には、使用者が必要としないプローブも含まれる可能性があり、その様な箇所に対して異常スポットを検出する対象にしてしまうことで、異常スポットの多くがその様な箇所に集中してしまったり、反対に、興味のある領域に対して異常スポットが集中してしまったりすることも考えられる。その様な場合も考えられるので、本発明では、核酸マイクロアレイ上に搭載されている全スポットを計算対象とする必要はなく、部分的な領域を計算対象とすることもできる。
本発明で使用する標識された異常検出核酸は、同一ロットのものであることが好ましい。これは例えば、２つの核酸マイクロアレイ間で比較を行う場合、標識された異常検出核酸の濃度や標識効率が異なっていると、正しく補正できないからである。但し、これらの濃度や、標識効率などの標識された異常検出核酸（標識補正核酸）の物性値が異なっていても、どう異なっているかがわかっているのならばこの限りではない。
本発明では、標識試料核酸、標識された異常検出核酸の標識量値に対して、代表値を計算して以降の処理に用いることができる。例えば、それらの蛍光値の平均値を用いることができる。また本発明では、標識試料核酸、標識された異常検出核酸（標識補正核酸）の標識量値を数値変換した値に対する代表値を用いることができる。例えば、２つの標識試料核酸の蛍光値同士を除したものや、その除したものの対数値、さらに、標識補正核酸による補正を行った後の標識試料核酸の蛍光値などに対する平均値などを用いることができる。
【0045】
本発明は、単色法（一色法）でも使用可能であるし、二色法あるいはそれ以上の多色法でも使用可能である。
例えば、単色法の場合、核酸マイクロアレイＡに対して、標識試料核酸Ａ１と標識された異常検出核酸とをハイブリダイゼーションさせ、核酸マイクロアレイＢに対して、標識試料核酸Ｂ１と標識された異常検出核酸とをハイブリダイゼーションさせ、標識された異常検出核酸同士の標識量値から異常スポットを検出することが可能である。
例えば、二色法の場合、核酸マイクロアレイＡに対して、標識試料核酸Ａ１、標識試料核酸Ａ２と標識された異常検出核酸とをハイブリダイゼーションさせ、核酸マイクロアレイＢに対して、標識試料核酸Ｂ１、標識試料核酸Ｂ２と標識された異常検出核酸とをハイブリダイゼーションさせ、標識された異常検出核酸同士の標識量値から異常スポットを検出することが可能である。
それ以上の、多色法の場合も同様に行うことができる。
【0046】
本発明では、検出した異常スポットを削除若しくは明示することができる。削除とは、異常スポットを検出した時点から、使用者がデータを解釈するまでの間で、異常スポット由来のデータを削除する工程を行うことであり、少なくとも使用者がデータを解釈する時点で異常スポット由来のデータが削除されているものを言う。内部的に削除対象の異常スポットに関するデータが存在していたとしても、例えば、核酸マイクロアレイの結果をグラフ化して表示する場合、グラフ上に削除対象のデータが存在しなければ良い。また、コンピュータ上で削除するスポットを取り扱う際には、一般的に、変数に保存して取り扱うことが多いが、変数からデータを削除しても良く、また、別の変数に削除の位置、例えば、ｉｎｄｅｘ番号などを記憶させておくこと、すなわち、変数からデータを削除せずに、ｉｎｄｅｘ番号などを頼りに削除スポットを取り扱っても良い。
明示とは、使用者に対して何らかの方法を用いて、異常スポット由来のデータであることを使用者に対して知らせる行為のことを言い、その手段に関してはいかなるものであってもかまわない。例えば、コンピュータに接続されたディスプレイやプロジェクターによって映し出されたスクリーン上に、異常スポット由来のデータであることを示しても良いし、紙に異常スポット由来のデータであることを印刷してもかまわない。
また、明示には、異常スポット以外のスポット（正常スポットと呼ぶことにする）とは異なった記号、例えば、正常スポットを○で示し、異常スポットを●で示すことができる。さらに、品質検査によって問題とされたスポット（この場合も本発明では異常スポットと呼ぶことがある。）を、異常スポットと同じ記号で示すこともできるし、正常スポット、異常スポットと異なる記号で示すこと、例えば、△で示すこともできる。さらに、異常スポット若しくは品質検査で問題とされたスポットの少なくとも一方若しくは両方を表示しないこと、すなわち、正常スポットのみ表示することで、これらを正常スポットと区別することができることから、本発明ではこの様な場合でも明示しているという。
【0047】
以下、本実施形態において用いる各部材、材料、処理等の詳細について説明する。
＜核酸マイクロアレイ＞
本発明でいう核酸マイクロアレイとは、固体基板上にプローブ核酸を高密度に結合させたものをいう。基板に用いる固体材料としては、一般的に使用されるスライドガラスなどのガラス素材のほか、プラスチック材料など、プローブ核酸が結合可能な材料であれば良く、特に限定されない。基板形状は、平面状、突起状物の頂上、粒子状、細管の内部などとすることができ、特に限定しない。さらに、ゲル状物質の内部にプローブ核酸を封じ込めた形態のものも使用することができる。
また、核酸マイクロアレイは、スポッターなどによって製造されたＤＮＡマイクロアレイや半導体技術によって製造されたＤＮＡチップも含む。
さらに、一枚の基板上に、複数個の核酸マイクロアレイを設けた多検体核酸マイクロアレイに対しても、その一つ一つを核酸マイクロアレイと呼んでいる。このようなアレイは、ハイブリダイゼーションを行う際に、互いに試料核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液が混合しないように工夫されていることが望ましい。
なお、本発明における核酸解析方法では、市販品の核酸マイクロアレイを使用してもよい。
【0048】
＜プローブ核酸＞
プローブ核酸は、核酸マイクロアレイの基板上に固定化されている核酸をいう。本発明におけるプローブ核酸は、標的配列（ａ）と相補的なプローブ配列（ａ’）、及び、配列（ｂ）に結合可能な配列（ｂ’）を含んでおり、標的配列（ａ）を含む標的核酸及び配列（ｂ）を含む異常検出核酸（Ｂ）とハイブリダイゼーションすることが可能である。
プローブ核酸と標的核酸（Ａ）とは、完全なハイブリダイゼーションでもよく、部分的なハイブリダイゼーションでもよい。少なくとも標的核酸の塩基数の５０％以上がハイブリダイゼーションしていることが好ましい。
プローブ核酸は、化学合成した核酸、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）などを使用することができ、ＢＡＣ ＤＮＡ又はｃＤＮＡであることが好ましい。さらに、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸をプローブ核酸として使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることができる。また、キメラ型核酸を用いることもできる。例えば、核酸内にＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することができる。
【0049】
プローブ核酸を固体基板上に結合させる方法は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）を代表とする光脱離基を結合させたアミダイトモノマーを用い、マスクを使用して、一ヌクレオチドずつ化学合成する方法やインクジェット方式でアミダイトモノマーを固体基板上にスポットし、望んだ配列を化学合成する方法、電極上で溶液のｐＨを変化させそのｐＨ変化を利用して保護基を脱離することにより基板上で核酸を合成する方法、あらかじめ化学合成した核酸を精製し基板上にスポットする方法、スポッターを用いてｃＤＮＡをスポットする方法などを用いることができる。スポット方式も、インクジェット方式、ピンアレイ方式などを用いることができる。
【0050】
＜プローブ核酸の固定化＞
核酸マイクロアレイの固体基板上にプローブ核酸を固定化するには、固体基板上にプローブ核酸を化学的に結合させることにより行うことができる。結合とは、共有結合、イオン結合、静電的相互作用、ファンデルワールス結合、ホスト−ゲスト結合、金属結合などを含む。また、プローブ核酸を固体基板上に結合する場合、リンカーを介して結合してもかまわない。
【0051】
＜スポット対＞
本発明におけるスポット対とは、同種のプローブ核酸をスポットしたスポットの関係のことをいう。複数枚の核酸マイクロアレイに適用する場合には、同種のプローブのスポットで、一般的に、ブロック番号、Ｃｏｌｕｍｎ番号、Ｒｏｗ番号が同じであるスポットのことを主として言う。なお、この場合、同一のプローブがスポットされていれば、必ずしも同一のブロック番号、Ｃｏｌｕｍｎ番号、Ｒｏｗ番号である必要性はない。
【0052】
＜相補的＞
本発明で言うところの相補的とは、それぞれの核酸に属している核酸塩基が互いに水素結合を解して相互作用していることを言い、例えば、Ａ（アデニン）に対して、Ｔ（チミン）が２本の水素結合によって相互作用していることなどを言う。また、相補的とは、核酸の塩基対のすべてが互いに相互作用していることと共に、５０％以上の塩基対が相互作用していれば、本発明では相補的と呼ぶことにしている。
【0053】
＜検体＞
本発明でいう検体とは、核酸マイクロアレイを用いて、核酸の発現量や存在量、コピー数等の測定を行う対象となる細胞等をいう。
検体としては、例えば、正常細胞又は異常細胞を用いることができる。
正常細胞とは、実質的に変異を受けていない細胞のこという。これに対し、異常細胞とは、正常細胞の遺伝子に何らかの変異を受けた遺伝子を持つ細胞のことである。
例えば、癌を発症していない健常者から入手した細胞を正常細胞とし、癌を発症した患者から入手した細胞を異常細胞とすることができる。また、癌を発症した患者でも、癌ではない正常な部位から得た細胞も、正常細胞とすることができる。また、薬品などの試薬を添加することで細胞内の遺伝子を変化させた細胞を異常細胞とし、薬品を添加していない細胞を正常細胞とすることもできる。
また、検体として、ＬＣＭ（Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）処理を行ったものを用いることもできる。
【0054】
＜試料核酸＞
検体から抽出した核酸のことである。例えば、正常細胞から抽出した核酸、異常細胞（例えば、がん細胞）から抽出した核酸を試料核酸として使用することができる。
【0055】
＜試料核酸の調製（精製及び断片化等）＞
検体から試料核酸を調製する際には、精製処理を行い、タンパクや脂質等の細胞溶解物を除去する必要がある。精製を行わないと、蛍光等による標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質等細胞溶解物がバックグラウンドノイズに大きな影響を与え、核酸マイクロアレイの性能を著しく低下させるからである。
精製の方法は、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を用いることができる。
精製処理は下記の断片化処理後に行っても良い。
【0056】
検体から抽出した試料核酸に対し、断片化処理を行ってもよい。断片化処理としては、酵素処理、超音波処理、機械的破砕処理、化学的処理等が挙げられる。
【0057】
試料核酸に対し、サブトラクション法による処理を行っても良い。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。サブトラクション法としては、例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法、ＲＤＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ＤｓＤＤ（Ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）法等を用いることができる。
サブトラクション法による処理を行うことによって、核酸マイクロアレイの精度を上げることもできる。特に、検体としてがん細胞を用いる場合、がん組織の中には、がん細胞と共に多量の正常細胞が含まれているため、核酸マイクロアレイの性能が著しく低下する場合があるが、サブトラクション法によって、その性能低下をある程度防ぐことができる。
【0058】
＜標識試料核酸＞
標識標的核酸とは、試料核酸に対して何らかの標識化合物によって標識した試料核酸をいう。標識後の精製処理を行ったものも行っていないものも本発明では標識試料核酸と言う。
【0059】
＜未精製標識試料核酸＞
未精製標識試料核酸とは、試料核酸を標識した後の精製処理を行わずに得た標識試料核酸のことである。この精製処理とは、標識処理を行った後の未反応の標識化合物や酵素などを取り除く処理のことであり、試料核酸を調製するための精製処理は含めない。
精製を行わないので、この未精製標識試料核酸には、標識工程において添加した種々の未反応化合物、例えば、プライマー、酵素、ヌクレオチド、バッファー中に含まれるイオンなどが含まれている。
さらに、未精製標識試料核酸に対して、共存する酵素を失活させる目的で、加熱やＥＤＴＡ添加などの処理を行った後の核酸も未精製標識試料核酸というものとする。
【0060】
＜精製標識試料核酸＞
精製標識標的核酸とは、未精製標識標的核酸に対して、試料核酸の標識後の精製処理を行うことによって得た試料核酸のことを言う。
【0061】
＜異常検出核酸＞
異常検出核酸は、全てのスポットにおいて、少なくともプローブ核酸の一部にハイブリダイズしうる配列を有し、対象としているスポットにおけるハイブリダイズ能力の異常、具体的には該スポットに固定化されているプローブ核酸の量に起因する異常を検知し、更には異常スポット間のプローブ核酸量のスポット量を検出するために使用する核酸のことである。そのため、異常検出核酸は、核酸マイクロアレイ上の異常検出を行う全スポットに固定化されているプローブ核酸とハイブリダイゼーション可能であればよく、どの様な配列、鎖長でも良い。ここで、全スポットとは、同一溶液の検体又は標準が反応する可能性がある全スポットを表し、通常は単一の核酸マイクロアレイ上のスポット全てのことであるが、これに限定されない。
異常検出核酸としては、たとえば、反復配列やベクター、大腸菌のゲノムなど、アレイを作製する上で、全てのスポットに存在すると考えられる配列を有する核酸であれば使用出来る。
また、ハイブリダイゼーションが可能であれば、どの様な核酸でも良く、ＤＮＡやＲＮＡの様な天然型の核酸や、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸を使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることが出来る。また、キメラ型核酸を用いることも出来る。例えば、核酸内にＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とが混合したものや天然型核酸と修飾型核酸とが混合したものを使用することが出来る。
【0062】
異常検出核酸は、検体の核酸とは異なり、プローブ核酸上の配列を持つ核酸であることがより好ましく、例えばプローブとしたライブラリそのものの核酸や、ベクター、プローブとしたライブラリのクローニングベクターなどの配列を有する核酸を用いることが特に好ましい。
ベクターとしては、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ウィルスなど種種のベクターが挙げられる。異常検出核酸としては、アレイを作製するときに用いたベクターの核酸や、そのベクターと同じ配列をもつ核酸であれば何を用いても構わない。
【0063】
また、異常検出核酸として、固定化したプローブに用いたライブラリの核酸配列か、或いは正常細胞由来の核酸を使用することもできる。正常細胞由来の核酸は、予め核酸配列に異常が無いことが既知である配列であることが好ましい。例えば、試料核酸が正常細胞と異常細胞の場合、一つ目の核酸マイクロアレイ（Ａ１）に対して、異常細胞由来の標識試料核酸と正常細胞由来の標識された異常検出核酸、二つ目の核酸マイクロアレイ（Ａ２）に対して、正常細胞由来の標識試料核酸と正常細胞由来の標識された異常検出核酸とを付与する態様である。この態様では、正常細胞由来の標識された異常検出核酸の標識量値から異常スポットを検出することができる。
【0064】
異常検出核酸として、反復配列を用いることも好ましい。反復配列とは、リピート配列ともいい、ある塩基数ごとに制限酵素認識部位のように繰り返し出現する配列であり、短い塩基配列のパターンが何度も繰り返す配列、例えば、ｐｏｌｙ ｄ（ＡＴ）やｐｏｌｙ ｄ（ＧＣ）などや、一単位が数千塩基対に及ぶ長い配列が何度も繰り返す配列などをあげることが出来、ヒト等の高等生物中にはゲノム中に高頻度で出現することが知られている。本発明においては、例えばインビトロジェン社で販売されているＣｏｔ−１ ＤＮＡを好適に用いることが出来る。
例えば、マンマリアンＢＡＣ−ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合には、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いることが好ましい。Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、通常、核酸マイクロアレイ測定時にマンマリアンから得られた検体の反復配列をブロックするために使用される核酸であり、マンマリアンＢＡＣプローブを用いた核酸マイクロアレイの場合、通常そのプローブには反復配列が実質的に多くのＢＡＣプローブに含まれている。
例えば、プローブに繰り返し配列（反復配列）を有するＢＡＣ−ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイの場合、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを添加し、標的核酸及びプローブ核酸上に存在するその反復配列にあらかじめ非特異的にハイブリダイゼーションし、ブロックすることで、ターゲット核酸側に存在する反復配列がプローブ核酸側に存在するプローブ核酸と非特異的にハイブリダイゼーションする事を防止し、特異的なハイブリダイゼーションに由来する蛍光値を選択的に検出できるようにしている。本発明では、そのＣｏｔ−１ ＤＮＡの少なくとも一部を標識化して（好ましくは未標識Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとともに）用いることによって、特異的なハイブリダイゼーションの検出感度を高め、かつスポット差を低減させることが可能であることを見出した。
また、プローブ核酸中に共通に存在する核酸配列部分に実質的に相補的な核酸配列を有する、合成オリゴヌクレオチドを異常検出核酸として用いることもできる。
【0065】
本発明では、試料核酸に対して、異常検出核酸の使用量をモル比で１以上用いることが好ましい。モル比を１以上用いることによって、核酸マイクロアレイの性能が向上するからである。
異常検出核酸の大きさは、５ｂｐ以上であることが好ましく、１０ｂｐ以上であることがより好ましく、２０ｂｐ以上であることが更に好ましく、５０ｂｐ以上であることが特に好ましい。また１Ｍｂｐ以下であることが好ましく、５００ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることが更に好ましく、５００ｂｐ以下であることが特に好ましい。
異常検出核酸の使用量は、標的核酸１モルに対して、０．５モル以上であることが好ましく、１モル以上用いることがより好ましく、３モル以上用いることがより好ましく、更に８モル以上用いることが最も好ましい。
なお、異常検出核酸の使用量の上限は、標的核酸１モルに対して、１０１４モルが好ましく、１０１０モルがより好ましい。
【0066】
異常検出核酸（Ｂ）は、互いに比較に使用する核酸マイクロアレイ間で、その濃度などの物性値が十分に分かっていれば、その濃度などの物性値が異なってもよいが、より好ましくは、同一濃度、同一ロットのものが良い。
【0067】
＜標識異常検出核酸（Ｂ）＞
標識異常検出核酸とは、異常検出核酸に対して標識化合物を結合させた異常検出核酸のことを言い、標識後の精製処理を行ったものも精製処理を行っていないものでも本発明では標識された異常検出核酸と言う。
【0068】
＜未精製標識異常検出核核酸・精製標識異常検出核核酸＞
前述の未精製標識試料核酸・精製標識試料核酸と同様、未精製標識異常検出核酸とは、標識された異常検出核酸に対して精製処理を行わない標識異常検出核酸のことであり、精製標識異常検出核酸とは、標識された異常検出核酸に対して精製処理を行うことによって得た、標識異常検出核酸のことである。
【0069】
＜未標識核酸＞
未標識核酸とは、標識されていない核酸のことをいう。
種々核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液には、未標識核酸を添加してもよい。
未標識核酸としては、例えば、繰り返し配列（反復配列）をブロックするためのＣｏｔ−１ ＤＮＡや核酸マイクロアレイのバックグラウンドノイズを低減させる作用を主として有するｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙｄＡ、等を用いることができる。本発明では、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを好適に用いることができる。
【0070】
＜標識＞
標識とは、検出可能な物質を標的核酸に対して結合することを意味する。検出可能な物質としては、特に限定されず、例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を起こす化合物等を挙げることができる。中でも、蛍光物質を使用することが好ましい。
【0071】
蛍光物質としては、特に限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ３， Ｃｙ５， Ｃｙ７、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ， Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、青色蛍光タンパク（ＢＦＰ，）、黄色蛍光タンパク（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク（ＲＦＰ）、Ａｌｅｘａ、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＤＡＰＩ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、希土類蛍光ラベル剤 （４， ４’−ｂｉｓ（１’’， １’’， １’’， ２’’， ２’’， ３’’， ３’’−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４’’， ６’’−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６’’−ｙｌ）−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏ−ｏ−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ（ＢＨＨＣＴ））、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸなどを用いることができる。
【0072】
さらに、標識のための物質として、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｉｎ：ＤＩＧ）、ビオチンなども利用することもできる。ビオチンを利用した例としては、プローブに結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加えると紫色の発色が見られ検出に使用することができる。
また、非酵素的な標識も利用することもできる。例えば、ＵＬＳ ａｒｒａｙＣＧＨ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬｏｇｙ ＢＶ社）などがある。
【0073】
標識法は、直接標識法、間接標識法いずれの標識法を本発明では用いても良い。直接標識法とは、例えば、標的核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素を結合させたヌクレオチド誘導体をヌクレオチドとともに混合しておき、一段階で標識標的核酸を合成する方法である。間接標識法とは、標的核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素が結合できる置換基を持ったヌクレオチド誘導体、例えば、アミノアリル基を持ったヌクレオチド誘導体と天然型のヌクレオチドとともに混合しておき、この置換基を持った標的核酸を合成し、次に、アミノアリル基を介して標識化合物を結合させ、標識標的核酸を得る方法である。本発明では、その簡便さから、直接標識法を用いるほうが好ましい。
本発明では、標識化合物を標的核酸に導入する方法として、ランダムプライマー法（プライマーエクステンション法）、ニックトランスレーション法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、末端標識法などを用いることができる。特に、本発明ではランダムプライマー法を好適に用いることができる。
【0074】
なお、未精製の標識試料核酸や未精製の標識異常検出核酸を含む溶液中には、酵素などがそのまま残存しており、調製後、溶液中に残存する酵素の活性を失活させておくことが好ましい。これは、例えば、未精製標識試料核酸をＣｙ３、未精製標識異常検出核酸をＣｙ５で標識した場合、両者を混合する時、溶液中に酵素が残存していると、残存した酵素によって未精製標識試料核酸がＣｙ５、未精製標識異常検出核酸がＣｙ３で更に標識される可能性があるからである。
酵素の失活方法としては、酵素の失活が可能な方法であればどのような方法でもかまわないが、ＥＤＴＡを添加する方法、５０℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方若しくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、５０℃以上が好ましく、６０℃以上が更に好ましい。加熱時間は、１分以上あれば良く、最も好ましくは、６５℃以上で５分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
【0075】
＜標識量値＞
本発明でいう標識量値とは、標識核酸がプローブ核酸とハイブリダイゼーションし、そこから読み取られた標識化合物から発せられる標識値のことを言う。より具体的には、例えば、標識標的核酸や標識異常検出核酸（標識補正核酸）が核酸マイクロアレイ上に結合しているプローブ核酸とハイブリダイゼーション反応を行った後、未反応の標識標的核酸や標識補正核酸、更に、所定の洗浄条件で脱離する、主として部分的にしかハイブリダイゼーションしなかった標識標的核酸や標識異常検出核酸（標識補正核酸）などを除去した後、核酸マイクロアレイを乾燥させ、蛍光スキャナーなどで読み取った蛍光値などをあげることができる。
また、標識量値は、数学的な処理を行った後の数値も標識量値とすることができる。例えば、蛍光スキャナーＧｅｎｅＰｉｘ （Ｒ）などでは、一つのスポットをいくつもの領域に分けて、例えば、１０μｍ四方ごとにデータを取り込み、それらの代表値、例えば、平均値やメディアン値などを出力している。この様に、一般的には、読取装置で読み取った標識量値は、多くのピクセルからの標識量値に対して数学的な処理を行った後の値であり、本発明では、この様な場合も標識量値と言うものとする。
【0076】
＜ハイブリダイゼーション調製溶液＞
本発明でいうハイブリダイゼーション調製溶液とは、ハイブリダイゼーションを好適に行う役割を持った溶液のことである。ハイブリダイゼーション調製溶液には、緩衝液を含むことが好ましいが、必ず必要というわけではない。ハイブリダイゼーション調製溶液として、例えば、核酸マイクロアレイの場合、核酸濃度を高める作用を持った硫酸デキストラン、核酸の融解温度を下げる作用を持ったホルムアミド、その溶液のｐＨを一定に保つための緩衝液からなるバッファーの混合物を例として挙げることができる。
【0077】
また、ハイブリダイゼーション調製溶液の組成として、排除体積を有する化合物、融解温度を低下させる化合物、溶液を一定のｐＨに維持する化合物の中の少なくとも二種の組み合わせからなる溶液を用いることが好ましい。
排除体積効果を持つ物質として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、特開２０００−３２５０９９号公報）やデキストラン硫酸等を使用することができる。
融解温度を低下させる化合物として、ホルムアミド、グリセロール、ホルムアルデヒド、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＧｕＳＣＮ、ヨウ素などを使用することができる。
【0078】
緩衝液としては、ｐＨを一定に保つことができるものであれば、どの様な緩衝液をも用いることができるが、生化学用に一般的に使用されているものが好ましい。例えば、ＳＳＣやグッド緩衝液を用いることが好ましい。グッド緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ （２−ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ） ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ （ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ｍｅｔｈａｎｅ）、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ） −１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｘｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ （２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｎｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＡＰＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ （ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【0079】
＜ハイブリダイゼーション用溶液＞
本発明で言うハイブリダイゼーション用溶液とは、未標識核酸やその他の試薬を混入した溶液のことであり、標識標的核酸や標識異常検出核酸が核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを好適にする性質を持った溶液のことであり、プローブ核酸と標識標的核酸や標識異常検出核酸との配列の一致度が高いハイブリダイゼーションを促進し、その一方で、配列の一致度が低いハイブリダイゼーションを抑制する働きを持った溶液のことである。例えば、核酸マイクロアレイ用のハイブリダイゼーション用溶液の一般的な組成として、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．２％ＳＤＳ、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡ、ｐｏｌｙＡ、ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡのハイブリダイゼーション用溶液が用いられる（細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ１ ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、村松正明、那波宏之監修）。また、例えば、核酸マイクロアレイの場合には、ホルムアミド、デキストラン硫酸、２０×ＳＳＣ、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ、ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、２０％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション用溶液が用いられる（井本逸勢、稲澤譲治、細胞工学 Ｖｏｌ．１２３， ｐ３５５， ２００４）。
【0080】
また、核酸マイクロアレイのノイズなどを改善する化合物も含むことができる。その様な作用がある物質として、変性サケ精子ＤＮＡやｐｏｌｙ（Ａ）、 ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｔＲＮＡ、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡ、マウスＣｏｔ−１ ＤＮＡなどを用いることができる。
この他に本発明では、特開２００５−０８７１０９号後方に記載されているように、ハイブリダイゼーション用溶液の組成の一つとして、リン脂質、デンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）、４級アンモニウム塩であるベタイン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２， １３７−１４４（１９９３））、ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， １５８５−１５８８ （１９８５）） 、市販されているハイブリダイゼーション用溶液、例えば、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ （東洋紡績株式会社）、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ）などを用いることもできる。
【0081】
界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、また、ノニオン性界面活性剤を用いることもできる。アニオン性界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウムを用いるのが好ましい。他に、Ｎ−ラウリルサルコシド、ラウリル硫酸リチウムなどが用いられている。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）やＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）などが知られており、本発明では、これらの界面活性剤を使用することができる。
【0082】
＜ハイブリダイゼーション用溶液の濃縮＞
標識標的核酸を含まず、それ以外の核酸を含んだハイブリダイゼーション用溶液は、濃縮を行っておくことが望ましい。すなわち、この種々核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液には、標識異常検出核酸、未標識核酸や界面活性剤などが添加され、更に、標識標的核酸などを混合した後のハイブリダイゼーション用溶液は、その溶液量増加のために、標識標的核酸、標識異常検出核酸（標識補正核酸）、未標識核酸などの濃度が低下し、核酸マイクロアレイの性能が低下する可能性があるからである。そこで、本発明では、標識標的核酸を含む核酸と混合する前の種々核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の濃縮を行っておくほうが好ましい。この濃縮操作は、使用者が行っても良いが、製造者が濃縮を行うことによって予め調製した溶液をキットなどに添付しておくことが望ましい。すなわち、あらかじめ、製造者が調製しておくことにより、使用者は濃縮を行う必要がなく、標識標的核酸さえ準備しておけば、本ハイブリダイゼーション用溶液と混合するだけで、核酸マイクロアレイに使用することができるからである。また、このハイブリダイゼーション用溶液に、標識異常検出核酸が入っている場合には、標識異常検出核酸（標識補正核酸）の濃度や種類、ロット番号などを統一しておくほうが好ましく、製造者がこれらの揃った溶液を供給することで、使用者は、精度の高い核酸マイクロアレイ実験が容易に行えるからである。
【0083】
＜精製＞
本発明で言うところの精製とは、抽出、分離、分取と同異義語の意味で使用している。
また、そのための手段として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を含むことができる。また、本発明では、溶媒置換も広い意味で精製と呼んでいる。そのためエタノール沈殿やイソプロパノール沈殿も本発明では、精製と呼んでいる。
【0084】
＜単色法＞
本発明での単色法とは、別名、一色法と呼ばれる方法で、一つの核酸マイクロアレイに対して、一種類の標識化合物で標識した実質的に一種類の標識標的核酸、及び標識標的核酸とは異なる標識化合物で標識した実質的に一種類の標識異常検出核酸（標識補正核酸）を用い、更に、もう一つの核酸マイクロアレイに対して、一種類の標識化合物で標識した実質的に一種類の前記とは別の標識標的核酸、及び標識標的核酸とは異なる標識化合物で標識した実質的に一種類の前記と同一の標識異常検出核酸（標識補正核酸）を用い、一つ目の核酸マイクロアレイから得られた標識標的核酸の標識量値と二つ目の核酸マイクロアレイから得られた標識標的核酸の標識量値を比較する方法のことである。また、それぞれの核酸マイクロアレイから得られた標識補正核酸の標識量値を用いて標識標的核酸の標識量値を補正した標識量値同士で比較検討する方法のことも単色法と呼んでいる。
この様に本発明では、一つの核酸マイクロアレイに対して、互いに比較の対象とする試料に対する標識化合物の数が一種類のものを単色法と呼んでいる。すなわち、前記の例の場合、標識標的核酸と標識補正核酸との二種類の標識化合物を用いているが、比較に直接的に関与しているのは標識標的核酸のみであるので、本発明では、標識標的核酸と標識補正核酸の二種の標識化合物を用いていても、単色法と呼んでいる。
【0085】
＜二色法＞
本発明での二色法とは、一つの核酸マイクロアレイに対して、一種類の標識化合物で標識した実質的に一種類の標識標的核酸、それとは異なる標識化合物で標識した実質的に一種類のそれとは異なる標的核酸から調製された標識標的核酸及び前記２種の標識標的核酸とは異なる標識化合物で標識した実質的に一種類の標識異常検出核酸を用い、標識標的核酸同士の比較により結果を得る方法であるが、その際に、標識異常検出核酸（標識補正核酸）を用いた異常スポットの削除を行うことができる。すなわち、更にもう一枚の核酸マイクロアレイを準備し、少なくとも標識異常検出核酸をハイブリダイゼーションさせておき、この標識異常検出核酸の標識量値と、前記の核酸マイクロアレイから得られた標識異常検出核酸の標識量とを比較することで、異常スポットを検出し、前記の核酸マイクロアレイから異常スポットに相当するスポットを削除又は明示することができる。
【0086】
＜標識量値を読み取る方法＞
核酸マイクロアレイにおける標識量値を読み取る方法としては、種々の方法を用いることができる。標識化合物として蛍光物質を用いた場合は、蛍光スキャナーが最も好適に用いられる。蛍光スキャナーとしては、例えば、ＦＬＡ−８０００（富士フイルム株式会社）やＧｅｎｅＰｉｘ （Ｒ） ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）などがある。
【0087】
＜データの提供＞
本発明では、あらかじめ標識標的核酸、標識異常検出核酸（標識補正核酸）を核酸マイクロアレイに対してハイブリダイゼーションさせ、それらの標識量値を電子データとして提供することもできる。例えば、核酸マイクロアレイの場合には、標的核酸として、正常細胞由来の標識標的核酸の標識量値、異常検出核酸として標識Ｃｏｔ−１ ＤＮＡや標識されたベクター由来の核酸の標識量値を、電子データによって提供することが可能である。
これらのデータを利用することで、使用者は、比較する細胞を準備することなく、比較される細胞、例えば、異常細胞のみを準備すれば良く、更に、標識工程などの工程も、従来、二種類の標識工程を行う必要があったが、一種類の標識工程のみを行えば良く、工程が短縮化し、時間の節約や使用試薬量の低減を行うことができる。なお、標識異常検出核酸は、両者共通のものを使用することが望ましい。更には、標識異常検出核酸の電子データと、その標識異常検出核酸をキットに同梱することが好ましい。
【0088】
（プログラム）
核酸マイクロアレイ測定を実施し得られたデータを処理する際、効率よくデータ処理を行うため、プログラムを用いたデータ処理を実施することが可能である。特に、核酸マイクロアレイが多数のスポットを有し、多数の比較値（ＤＢ）を計算する場合等に有効である。
すなわち、本発明のプログラムの好ましい態様は、
スポット（Ｘ１ｉ）及びスポット（Ｘ２ｉ）からなるスポット対において、標識量値（Ｆｃ１ｉ）と標識量値（Ｆｃ２ｉ）との比較値（ＤＢｉ）を計算する手順、
ｎ個の比較値（ＤＢ１）〜（ＤＢｎ）からそれらの代表値（Ａ）を得る手順、
比較値（ＤＢｍ）と代表値（Ａ）との差の大きさによってスポット（Ｘ１ｍ）が異常スポットであるか否か判定する手順、を実行するためのプログラムである。
該プログラムは、通常コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録した形態で提供される。該記録媒体は、コンピュータが読み取り可能なものであれば特に限定されない。本発明の記録媒体は、可搬型又は固定型の両方の媒体が含まれ、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、ハードディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
本発明のプログラムは、上記記録媒体に記録されて流通させることも、コンピュータの記録装置に記録しておき、ネットワークを通じて他のコンピュータに転送する形態で流通させることもできる。
【0089】
（核酸解析キット）
本発明の核酸解析キットは、プローブ核酸が固定化されているスポットを複数有する核酸マイクロアレイと、前記核酸マイクロアレイ上に固定化されたプローブ核酸に含まれる配列（ｂ’）に結合可能な配列（ｂ）を含む異常検出核酸とを含む。異常検出核酸は、予め標識されていても、ユーザーが使用時に標識を行ってもよい。また、該異常検出核酸は、イオン強度を調整する成分、界面活性剤等を含むハイブリダイゼーション溶液として提供されることも好ましい。
【実施例】
【0090】
以下に実施例及び比較例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
以降、実施例１、３〜６は、それぞれ、参考例１、３〜６に読み替えるものとする。
なお、以下の実施例において、Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅとは、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡに対して、Ｃｙ３で標識したものを示す。同様に、Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅとは、Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ（あるいはｍａｌｅ）に対して、Ｃｙ５で標識したものを示す。また、Ｃｙ３−ＭａｌｅやＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡも同様に、それぞれの標識化合物で標識した核酸であることを示す。
【0091】
［比較例１］ 異常スポットを削除しなかった場合の核酸マイクロアレイの解析結果
＜未精製標識試料核酸の調製＞
１．７ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）に、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｆｅｍａｌｅ （Ｐｒｏｍｅｇａ社， カタログ番号Ｇ１５２）を３μＬ（０．７５μｇ）、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ， ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ， ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、アレイＣＧＨ用のラベリングシステム（ＢｉｏＰｒｉｍｅ （Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の２．５ｘＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬ入れ、ブロックインキュベータ（ＢＩ−５３５Ａ、株式会社アステック）内にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブをブロックインキュベータから取り出し、３７℃に設定したブロックインキュベータの中へ入れ、１５分間静置した。
【0092】
ＢｉｏＰｒｉｍｅ（Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの１０ｘｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ （Ｒ） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍのＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、標識化反応と同時に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【0093】
上記操作をＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍａｌｅ （Ｐｒｏｍｅｇａ社， カタログ番号Ｇ１４７）に対しても行い、以上の操作にて、二種の未精製標識試料核酸を得た。なお、Ｍａｌｅ ＤＮＡに対しても、標識化合物として、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。
【0094】
＜未精製標識異常検出核酸の調製＞
１．７ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）にＣｏｔ−１ ＤＮＡ （インビトロジェン社、カタログ番号１５２７９−０１１）を６μｇ（６μＬ）、水を５μＬ、２．５ｘＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、３７℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａの中に入れ、１５分間静置した。１０ｘｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、１５分間加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【0095】
＜標識異常検出核酸Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
未精製標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２０μＬ、未標識核酸Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ ６２μＬ（６２μｇ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．７ｍＬマイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を８μＬ、−２０℃のエタノールを３６０μＬ添加し、混合後、１０分間−８０℃で放置した。その後、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００を用いて、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま１０分間放置し、残存するエタノールを除去した。１０分後、ホルムアミドを４０％、ＳＳＣ、デキストラン硫酸を０．０７５ｍｇ／μＬに調製したハイブリダイゼーション調製溶液を５２μＬ、１０％ＳＤＳを８μＬ添加し、３０分間静置した。
３０分後、攪拌することで沈殿物を溶解し、その後、十分に攪拌した。
【0096】
＜標識試料核酸、標識異常検出核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
＜未精製標識試料核酸の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅ ＤＮＡの未精製標識試料核酸を２０μＬ、＜標識異常検出（補正）核酸Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製した溶液を６０μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。また同様に、＜未精製標識試料核酸の調製＞で調製したＭａｌｅ ＤＮＡの未精製標識試料核酸を２０μＬ、＜標識異常検出核酸Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション調製溶液の調製＞で調製した溶液を６０μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。
【0097】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
使用した核酸マイクロアレイは、ＢＡＣクローン（ＲＰＣＩ，ＲＰ１１ ＢＡＣライブラリ）から調製したプローブＤＮＡ８００種をそれぞれ２つずつガラス基板上にスポットした、合計１６００個のスポットを有している。以下核酸マイクロアレイの作製方法。まず、ＢＡＣクローンを大量培養後、イオン交換カラム（ＱＩＡＧＥＮ社、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ １００ Ｃａｔ．Ｎｏ．１２１４５）を用いて抽出・精製しＢＡＣ ＤＮＡを得た。その後、ＢＡＣ ＤＮＡを４塩基認識酵素、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩで消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅することによりプローブＤＮＡが得られる。プローブＤＮＡの長さは１０００〜３０００ｂｐ程度である。プローブＤＮＡのガラス基板へのスポットはＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）を使用した。
ブロッキング溶液（松浪硝子工業株式会社）を約２００ｍＬ、ガラス容器に入れ、そこへ核酸マイクロアレイを入れ、２０分間ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲ， ＳＷ−４（十慈フィールド株式会社）を用いて、スライドガラスを上下に移動させながら、ブロッキング反応を行った。２０分後、核酸マイクロアレイをブロッキング溶液から取り出し、水２００ｍＬを入れた容器の中に入れた。３分間、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄し、３分後、再び新しい水を２００ｍＬ入れた容器の中に入れ、ＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、エタノールを２００ｍＬ入れた容器の中に移し、再びＳＬＩＤＥ ＷＡＳＨＥＲを用いて洗浄した。３分後、核酸マイクロアレイを取り出し、卓上遠心機スピンドライヤーｍｉｎｉ２３５０（トミー工業株式会社）を用いて遠心を行い、核酸マイクロアレイを乾燥させた。
【0098】
ブロッキング後、沸騰水に核酸マイクロアレイを２分間浸し、ついで、−２０℃の７０％エタノールに２分間、−２０℃の８５％エタノールに２分間、−２０℃の１００％エタノールに２分間浸し、その後、スピンドライヤーで１分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。なお、上記の操作は、二枚の核酸マイクロアレイを同時に処理することで行った。
【0099】
＜ハイブリダイゼーション＞
＜標識試料核酸、標識異常検出核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製した二種の試料溶液を、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、それぞれ７５℃で１６分間熱処理を行った。その後、４２℃で３０分以上熱処理を行った。それぞれの溶液を、ハイブリダイザーを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【0100】
ハイブリダイザーは、ＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００（アロカ株式会社）を用いた。ハイブリダイゼーション温度は、３７℃、ハイブリダイゼーション時間は、１６時間行った。ハイブリダイゼーションの間、ローラーで攪拌するように設定した。Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液を、それぞれの核酸マイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイザーのスタートボタンを押した。洗浄条件は、（１）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、３０秒間、（２）５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、１５分間、（３）２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、３０分間、（４）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、５分間に設定し、洗浄中は、ローラーを用いて攪拌するように設定した。ハイブリダイザーによるハイブリダイゼーションを行った後、マイクロアレイをハイブリダイザーから取り出し、２×ＳＳＣを入れた５０ｍＬのスミロンチューブの中にマイクロアレイを入れ、数分後、マイクロアレイを取り出して、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ Ｍｏｄｅｌ２３５０で１分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
【0101】
＜データ取り込み＞
洗浄した二枚のマイクロアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ （Ｒ） ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、スキャニングを行った。
【0102】
＜データ処理＞
下記の式を用いて、データ処理を行った。
未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＦ、未精製標識試料核酸Ｃｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦＭ、Ｆｅｍａｌｅ側の標識異常検出（補正）核酸の蛍光値をＦｃ１、Ｍａｌｅ側の標識異常検出（補正）核酸の蛍光値をＦｃ２とすると、補正後のＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの標識量値ＦＭ’を以下の式により計算した。
ＦＭ’＝ＦＭ×Ｆｃ１／Ｆｃ２
【0103】
さらに以下の式により、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）を計算した。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）＝Ｌｏｇ２（ＦＦ／ＦＭ’）
なお、アレイ間で比較するスポット対は、同一のＢｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一のＣｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一のＲｏｗ Ｎｕｍｂｅｒを用い、核酸マイクロアレイ上に配置されているすべてのスポットについてＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）を計算した。
【0104】
また、Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の値｛Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）は、Ｆｅｍａｌｅ側のスポットの蛍光値とＭａｌｅ側のスポットの蛍光値の比｝も下記の式を用いて同様に計算した。
Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）＝ＦＦ／ＦＭ’
次に同種のプローブ核酸をスポットした２つのスポットのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ又はＲａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の平均値を計算した。
なお、ノーマライゼーション法として、グローバルノーマライゼーションを行った。
【0105】
＜結果＞
図４にＬｏｇ Ｒａｔｉｏ値、図５にＦｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅの値を、染色体番号順にプロットした図を示す。なお、図４，５におけるプロットは、同種のプローブをスポットした２つのスポットの平均値である。○が常染色体に相当する部分を、●がＸ染色体に相当する部分を示している（以下の図についても同様。）
【0106】
［実施例１］ 異常スポットを削除した場合の核酸マイクロアレイの解析結果
比較例１の結果に対して、以下の方法によって異常スポットを数値計算により検出した。
Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅをハイブリダイゼーションした核酸マイクロアレイから得られたＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ１、Ｃｙ３−Ｍａｌｅをハイブリダイゼーションした核酸マイクロアレイから得られたＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ２とし、比較値（ＤＢ）として、それらのＬｏｇ比｛Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）｝を以下の式に従って計算した。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ２／Ｆｃ１）
なお、Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅをハイブリダイゼーションした核酸マイクロアレイとＣｙ３−Ｍａｌｅをハイブリダイゼーションしたそれぞれの核酸マイクロアレイの同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ
Ｎｕｍｂｅｒ及び同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒを持つスポット対同士で比較値（ＤＢ）を計算し、核酸マイクロアレイ上にスポットされたすべてのスポットについて比較値（ＤＢ）を計算した。
【0107】
次に、上記で計算した比較値（ＤＢ）の中間値（Ｍ）として平均値を計算し、中間値がゼロになるように、すべての比較値（ＤＢ）を補正した。
次に、中間値（Ｍ）と比較値（ＤＢ）との差を計算した後、その計算値に対して、絶対値ＡＢＳ｛Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）｝を全スポット対に対して計算した。中間値をゼロに補正しているので、この値の数値の大きいものほど中間値からの差が大きいことを示しており、この差の大きいものから順番に、全スポット対の数、すなわち本実施例では１６００個に対して、３％、５％、１０％の個数、すなわち、それぞれ４８個、８０個、１６０個のスポット対を異常スポットとした。また、この値が０．６を超えるものすべてのスポット対を異常スポットとした。
異常スポットの検出後、異常スポットに対応する比較例１で計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の値を削除した。
【0108】
なお、上記の異常スポットの削除の際、同種のプローブ核酸がスポットされた２つスポットが両方とも異常スポットとして検出された場合は、その両方を削除せず、ＡＢＳ｛ Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）｝の値の大きいＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の値を削除し、小さいＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の値は削除しなかった。
例えば、異常スポットの削除の個数が全スポットの１０％の場合には、２つの同一のプローブ核酸をスポットしたスポットの両方が異常スポットとして検出された例が幾つか見られたが、この場合には、それらの２つのうちの比較値（ＤＢ）がより中間値から遠いほうを異常スポットとした。
さらに具体的には、同一のプローブ核酸をスポットした１１０番目と１１１番目の両方のスポット対が異常スポットとして検出されたが、１１０番の比較値（ＤＢ）が１．４５に対して、１１１番目が０．４１３となり、本来は両方を異常スポットとするところであるが、より比較値（ＤＢ）が中間値から遠い１１０番目のスポットの方のみを削除した。１１０番目のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値が−０．４６７に対して、１１１番目が−０．１９１となり、これらの値はより０に近い方が正解なので、比較値（ＤＢ）が中間値から近いほうを残すことの有効性をこの結果は示している。
次に、比較例１と同様に、同種のプローブ核酸をスポットした２つのスポットのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の平均値を計算した。
【0109】
＜結果＞
以上の結果を図６〜１１に示す。
図６は、全体のスポット対１６００個のうち、比較値と中間値との差が大きいものから上位３％（４８個）に相当する比較値を持つスポット対を異常スポットとして削除した場合のプロットを示す。
図７は、同様に大きいものから上位５％（８０個）に相当する比較値を持つスポット対を異常スポットとして削除した場合のプロットを示す。
図８は、同様に大きいものから上位１０％（１６０個）に相当する比較値を持つスポット対を異常スポットとして削除した場合のプロットを示す。
【0110】
図４と、図６〜８とを比較すると、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏが±０．２５の範囲外のスポットが図４では多数確認されたが、図６〜８では数点程度にまで減少している。
また、常染色体部分のバラツキ（理論上はＸ軸上にすべての点が集まる）が、異常スポットを削除することによって減少していることがわかる。
さらに、異常スポットを５％、１０％削除した図７と８では、常染色体とＸ染色体部分との分離が良くなった。すなわち、異常スポットを削除していない図４では、常染色体部分の○のＬｏｇ Ｒａｔｉｏの部分とＸ染色体部分の●の部分とが多くのスポット対から計算された比較値が重なっているのに対して、異常スポットを３％削除した図６の結果では、１点のみが重なっているだけで、更に、図７と図８の５％以上の異常スポットを削除した場合には、Ｘ染色体部位のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ値下限と常染色体部位のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ値の上限とが十分に離れている。
これらの結果は、仮に、Ｘ染色体部分が増幅若しくは欠失部分に相当すると仮定すると、異常スポットを削除することによって、診断精度の高い核酸マイクロアレイが得られることを示している。
【0111】
図９には、比較値と中間値の差によって異常スポットを削除する際に、閾値を予め設定してその範囲外のものを異常スポットとする方法を用いた場合を示す（つまり、この場合は異常スポットの数が実験ごとに異なる。）。ここでは、中間値と比較値との差が０．６以上の比較値を持つスポット対を異常スポットとして判定した。図４と比較すると、常染色体部分のバラツキが小さくなり、常染色体とＸ染色体との分離が良くなっていることがわかる。
【0112】
さらに、図１０に、異常スポット削除率と常染色体部位の分散値（ＳＴＤＥＶ）との関係を示す。異常スポットを削除しなかった場合には、ＳＴＤＥＶが約０．１３となり、異常スポットを削除したものは、０．９〜１．２と小さくなった。
これらの結果は、異常スポットを削除することによってデータのバラツキが減少し、より精度の高い核酸マイクロアレイの結果が得られることを示している。
【0113】
また、図１１に、全体スポットのうち３％のスポットを異常スポットとして削除した場合のＲａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットしたものを示す。
図５と比較すると異常スポットを削除することで常染色体部分とＸ染色体部分とがよりはっきりと分離していることがわかる。
【0114】
［実施例２］ 標識異常検出核酸を用いた核酸マイクロアレイの品質検査
本実施例では、核酸マイクロアレイ１を製造者が所有し、核酸マイクロアレイ２と３とを使用者が所有していると仮定する。
＜未精製標識試料核酸の調製＞
比較例１の＜未精製標識試料核酸の調製＞と同様の方法で、Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとを調製した。
【0115】
＜未精製標識異常検出（補正）核酸の調製＞
比較例１の＜未精製標識異常検出（補正）核酸の調製＞と同様の方法で、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。なお、核酸マイクロアレイ１〜３にハイブリダイゼーションする標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡはすべて同一の調製ロットから小分けしたものを使用した。
【0116】
＜標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
比較例１の＜標識異常検出（補正）核酸Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞と同様の方法で調製した。
【0117】
＜標識試料核酸、標識異常検出（補正）核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
比較例１の＜標識試料核酸、標識異常検出（補正）核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞と同様の方法で調製した。ただし、標識異常検出（補正）核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液は、標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液に未精製標識試料核酸の代わりに２０μＬの水を添加し、混合することで調製した。
【0118】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で前処理を行った。なお、ここでは、５７６種のＢＡＣプローブＤＮＡを３個ずつスポットした核酸マイクロアレイを用いた。
【0119】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。ただし、核酸マイクロアレイ１に対しては、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１を含むハイブリダイゼーション用溶液をハイブリダイゼーションさせた。核酸マイクロアレイ２に対しては、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡとを含むハイブリダイゼーション用溶液をハイブリダイゼーションさせた。核酸マイクロアレイ３に対しては、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡとＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡとを含むハイブリダイゼーション用溶液をハイブリダイゼーションさせた。
【0120】
＜データ取り込み＞
比較例１の＜データ取り込み＞と同様の方法でデータの取り込みを行った。
【0121】
＜データ処理及び結果＞
核酸マイクロアレイ１のＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ１、核酸マイクロアレイ２のＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ２、核酸マイクロアレイ３のＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ３とし、核酸マイクロアレイ１と２との間、核酸マイクロアレイ１と３との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるスポット対間で下記の式を用いて、比較値｛Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）｝を計算した。
核酸マイクロアレイ１と２の間に対するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ１／Ｆｃ２）
核酸マイクロアレイ１と３の間に対するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ１／Ｆｃ３）
【0122】
次に、それぞれのアレイ間のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）の平均値を計算し、その平均値がゼロになるようにすべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を補正した。次に、すべてのスポット対に対して、個々のスポット対と平均値との差の絶対値を計算することで、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）差を得た。その結果を図示したものが図１２である。
図１２は核酸マイクロアレイ１と２に対して、上記の様に計算して得られたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）差を染色体順に図示したものである。（なお、核酸マイクロアレイ１と３の間に対して、上記の様に計算して得られたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）差も同様に計算したが、図示していない。）
【0123】
本実施例では、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）差が０．６以上のものを品質管理上問題となるスポットと定義し、その値以上のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）差を持つ、スポット対を構成している核酸マイクロアレイ２若しくは核酸マイクロアレイ３のスポットを削除した。
図１３は、図１２の結果から０．６以上のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）差を持つスポット対を削除した結果を示したものである。その結果、約２０個のスポットが品質検査上問題となるスポットであった。核酸マイクロアレイ１と３との間でも図示しなかったが同様の計算を行った。
【0124】
次に、核酸マイクロアレイ２と３との間で比較を行った。まず、核酸マイクロアレイ２と３との間で標識異常検出核酸を標識補正核酸として用いて、以下の式を用いることにより核酸マイクロアレイ３にハイブリダイゼーションさせたＣｙ３−Ｍａｌｅ側の蛍光値の補正を行った。なお、核酸マイクロアレイ２のＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ２、核酸マイクロアレイ２のＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値をＦ２、核酸マイクロアレイ３のＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡの蛍光値をＦｃ３、核酸マイクロアレイ３のＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値をＦ３とした。
補正後のＣｙ３−Ｍａｌｅの蛍光値＝Ｆ３×Ｆｃ２／Ｆｃ３
上記の数式を用いて、核酸マイクロアレイ上の同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるすべてのスポット対に対して計算を行った。
【0125】
次に、Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値と上記で得られた補正後のＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値とを用いて、以下の式により核酸マイクロアレイ２と３との間で形成可能なすべてのスポット対間でＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）を計算した。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）＝Ｌｏｇ２（Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値／Ｃｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの補正後蛍光値）
【0126】
上記によって計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）を染色体順に図示した結果を、図１４に示した。この結果でも、常染色体とＸ染色体とが十分に分離しており、良好な結果といえる。
【0127】
次に、核酸マイクロアレイ１と２、核酸マイクロアレイ１と３との間で得られた品質管理上問題となるスポット対を構成しているＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）を持つスポット対を削除した。なお、ある上記アレイ間のスポット対に対して、どちらか一方のアレイ間にしか品質管理上問題となるスポット対が存在しなかったとしても削除対象とした。
図１５は、図１４の結果から核酸マイクロアレイ１と２、核酸マイクロアレイ１と３との間で計算した品質検査上問題のあるスポット対を削除したものである。図１４と比べて、更に常染色体部分のバラツキが低減した。例えば、図１４の０．２以上のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）が１７個あったが、図１５では、７個にまで減っており、これらのことはより精度の高い核酸マイクロアレイであることを示している。
更に、核酸マイクロアレイ２と３との間で検出した異常スポットを削除する方法とを併用した結果を図１７に示した。Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ側のＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡの標識値をＦｃ２、Ｃｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡ側のＣｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡの標識値をＦｃ３とすると、核酸マイクロアレイ２と３との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるスポット対間でＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を用いた下記の計算式により、核酸マイクロアレイ上のすべてのスポット対間で計算を行った。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ２／Ｆｃ１）
【0128】
次に、計算したすべてのスポット対間のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）からその平均値を算出し、計算によって算出した平均値がゼロになるように、上記の計算したすべてのスポット対間のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を補正した。次に、補正後のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）に対して、絶対値を計算し、その値が０．６以上のものを異常スポットとし、対応するスポット対に由来するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の計算結果を、図１６の結果から削除した。その結果を図示したのが図１７である。
なお、図１６は、図１４の中から１１００番から１３００番を拡大表示したものであり、図１７も図１６と同一の領域を図示したものである。図１６と図１７とを比べると、丸で囲んだ部分、つまり、この部分は、常染色体部分であるので、ゼロに近づくほどノイズが小さく性能の高い核酸マイクロアレイであることを示しており、図１６と比較して、図１７の方がよりＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値がＸ軸から離れたスポット対が減っており、以上の結果は、本実施例の方法によって、バラツキが低減され、より精度の高い核酸マイクロアレイの結果が得られることを示している。
【0129】
［実施例３］ 同一のプローブをスポットしたスポットで、すべてのスポットが異常スポットと判断された場合、少なくとも一つのスポットを残しておく場合
＜未精製標識試料核酸の調製＞
比較例１の＜未精製標識試料核酸の調製＞と同様の方法で、Ｃｙ３−Ｓａｍｐｌｅ ＡとＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ
Ｂとを調製した。なお、ＳａｍｐｌｅＡは、性別は女で７番染色体に欠失を持つ患者検体を不死化して培養した細胞から採取したＤＮＡ、ＳａｍｐｌｅＢは、性別は女で遺伝子変異のない人の血液から採取したＤＮＡである。
【0130】
＜未精製標識異常検出核酸（標識補正核酸）の調製＞
比較例１の＜未精製標識異常検出（補正）核酸の調製＞と同様の方法で、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。なお、核酸マイクロアレイ１、２にハイブリダイゼーションする標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡはすべて同一の調製ロットから小分けしたものを使用した。
【0131】
＜標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
比較例１の＜標識異常検出核酸（標識補正核酸）Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞と同様の方法で調製した。
【0132】
＜標識試料核酸、標識異常検出（補正）核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
比較例１の＜標識試料核酸、標識異常検出（補正）核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞と同様の方法で調製した。
【0133】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で前処理を行った。なお、ここでは、６３２種のＢＡＣプローブＤＮＡを３個ずつスポットした核酸マイクロアレイを２枚用いた。
【0134】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
【0135】
＜データ取り込み＞
比較例１の＜データ取り込み＞と同様の方法でデータの取り込みを行った。
【0136】
＜データ処理及び結果＞
核酸マイクロアレイ１のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ａ由来の蛍光値をＦ１、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ１、核酸マイクロアレイ２のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ由来の蛍光値をＦ２、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ２とし、以下の式を用いて、補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂの蛍光値を得た。
補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂの蛍光値（Ｆ２’）＝Ｆ２×Ｆｃ１／Ｆｃ２
この数式を用いて、核酸マイクロアレイ１と核酸マイクロアレイ２との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるすべてのスポット対間について、補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂの蛍光値を得た。
【0137】
次に、上記計算によって得た補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂの蛍光値を用いて、核酸マイクロアレイ上のすべてのスポット対間の比較値、すなわち、以下の数式を用いて、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）を得た。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）＝Ｌｏｇ２（Ｆ１／Ｆ２’）
【0138】
次に、計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）の平均値を計算し、その平均値がゼロとなるように、すべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値を補正した。
次に核酸マイクロアレイ１と２との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるスポット対間で下記の式を用いて、核酸マイクロアレイ１と２間でアレイ上の全スポット対に対して、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を計算した。
核酸マイクロアレイ１と２の間に対するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ１／Ｆｃ２）
このＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値が０．６以上のものを異常スポットとした。
【0139】
次に、削除対象とするスポット対の一例を図１８に示した。染色体ＩＤが８３４から８３６番（０番からはじまっている数字）は同一のプローブ核酸をスポットしたスポット対であるが、そのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値は、すべて０．６以上であり、すべてが削除対象の異常スポットであった。
これらの中で、少なくとも一つのスポット対を残す方法の一例として、本実施例では、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値の最も小さな値を残すことを行っており、上記の例では、染色体ＩＤが８３４番を本実施例では残している。
これらのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値を持つＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値は、染色体ＩＤの若いもの順に０．０５８、０．２０１、０．１６９となり、本染色体番号に対する部位は欠失も増幅もない部分、すなわちＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値がゼロに近ければ近いほど正解に近いことを示しており、本実施列で選択した８３４番は、３つの中でＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値が最も小さな値を示しており、本実施例で行った最も低いＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値を持つＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値のみ残し、それ以外の異常スポットと判定されたスポット対を削除する方法が好ましいことをこれらの結果は示している。
以下、ＩＤ番号が、１５３６から１５３８番、１７０４から１７０６番、１８６３から１８６５番も同様に、最も中間値に近いＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値を残すことで、そのプローブ核酸に由来する情報が消失してしまうことを防いでいる。
【0140】
［実施例４］ 同一アレイ内及び異なるアレイ間で異常スポットを削除した場合の解析結果
＜未精製標識試料核酸の調製＞
比較例１の＜未精製標識試料核酸の調製＞と同様の方法で、Ｃｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ａ ＤＮＡとＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡとを調製した。なお、Ｓａｍｐｌｅ Ａ ＤＮＡは、欠失部位を持つ患者検体から採取したもの、Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡは、正常人から採取した検体を用いた。
【0141】
＜未精製標識異常検出（補正）核酸の調製＞
比較例１の＜未精製標識異常検出（補正）核酸の調製＞と同様の方法で、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを調製した。なお、核酸マイクロアレイ１、２にハイブリダイゼーションする標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡはすべて同一の調製ロットから小分けしたものを使用した。
【0142】
＜標識異常検出（補正）核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
比較例１の＜標識異常検出核酸（標識補正核酸）Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞と同様の方法で調製した。
【0143】
＜標識試料核酸、標識異常検出（補正）核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
比較例１の＜標識試料核酸、標識異常検出（補正）核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞と同様の方法で調製した。
【0144】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で前処理を行った。なお、ここでは、６６２種のＢＡＣプローブＤＮＡを３個ずつスポットした核酸マイクロアレイを２枚用いた。
【0145】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法でハイブリダイゼーションを行った。
【0146】
＜データ取り込み＞
比較例１の＜データ取り込み＞と同様の方法でデータの取り込みを行った。
【0147】
＜データ処理及び結果＞
一枚目の核酸マイクロアレイに対して、同一プローブ核酸をスポットしたスポット間で考えられる組み合わせから構成されたスポット対間で、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡに由来する蛍光値を用いて、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を計算した。例えば、本実施例の場合は同一プローブ核酸をスポットしたスポットの数が３個であるので、スポットＡ，Ｂ，Ｃとすると、下記の式を用いてＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を計算した。なお、蛍光値はバックグラウンド蛍光値を差し引いたものを用いた。
スポットＡとＢ間 Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１ Ａ／Ｃｏｔ−１ Ｂ）
スポットＡとＣ間 Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１ Ａ／Ｃｏｔ−１ Ｃ）
スポットＢとＣ間 Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１ Ｂ／Ｃｏｔ−１ Ｃ）
【0148】
次に、核酸マイクロアレイ上に存在するすべてのスポット対間に対して、上記の式によってＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値を計算し、次にその平均値がゼロになるようにすべての計算値を補正し、更にそれらの値の絶対値を計算した。
【0149】
上記計算式によって計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）の値が０．６以上のものを削除対象スポット（本実施例では、核酸マイクロアレイ内での異常スポット削除と、核酸マイクロアレイ間での異常スポット削除とが混同しないように、あえて前者を削除対象スポットと呼んだ。）とした。例えば、スポットＡとＢの間のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１ Ａ／Ｃｏｔ−１ Ｂ）の値、スポットＡとＣとの間のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１ Ａ／Ｃｏｔ−１ Ｃ）の値の両方ともが０．６以上の場合には、スポットＡを削除対象スポットとした。また、スポットＡとＢとの間のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１ Ａ／Ｃｏｔ−１ Ｂ）の値のみが０．６以上の場合には、残る組み合わせの中で最も大きなＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）の値をとるスポット間とを考慮して、削除対象スポットを決定した。例えば、スポットＡとＣとの間のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１ Ａ／Ｃｏｔ−１ Ｂ）の値が次に大きな値であった場合には、スポットＡを削除対象スポットとした。また、すべての考えられるスポット間の組み合わせのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値が０．６以上の場合には、全スポットを削除対象スポットとした。さらに、削除対象スポットに由来するＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ側の蛍光値を削除した。
【0150】
もう一枚の核酸マイクロアレイに対しても同様の工程によって、削除対象スポットを決定し、削除した。
次に、核酸マイクロアレイ１のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ａ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦ１、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ１、核酸マイクロアレイ２のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦ２、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ２とし、以下の式を用いて、補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡの蛍光値を得た。
補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡの蛍光値（Ｆ２’）＝Ｆ２×Ｆｃ１／Ｆｃ２
この数式を用いて、核酸マイクロアレイ１と核酸マイクロアレイ２との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるすべてのスポット対間について、補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡの蛍光値を得た。
【0151】
次に、上記計算によって得た補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡの蛍光値を用いて、核酸マイクロアレイ上のすべてのスポット対間の比較値、すなわち、以下の数式を用いて、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）を得た。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）＝Ｌｏｇ２（Ｆ１／Ｆ２’）
【0152】
次に、計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）の平均値を計算し、その平均値がゼロとなるように、すべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値を補正した。
Ｘ軸に染色体番号を、Ｙ軸に上記式によって計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値をプロットしたのが、図１９である。なお、図１９は、同種のプローブがスポットされた３スポットにおける比較値の平均値をプロットしたものを示している。また、○が常染色体、●がＸ染色体に相当する部分を示している（以下の図でも同様。）。
【0153】
次に、核酸マイクロアレイ１と２との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるスポット対間で下記の式を用いて、核酸マイクロアレイ１と２間でアレイ上の全スポット対に対して、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を計算した。
核酸マイクロアレイ１と２の間に対するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ１／Ｆｃ２）
【0154】
次に、上記計算結果から得たＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）の平均値を計算し、その平均値がゼロとなるように、すべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値を補正した。この値が０．６を超えるスポット対を異常スポットとした。また、削除対象スポットをどちらかの核酸マイクロアレイ若しくはその両方に持つスポットに由来するスポット対も異常スポットとした。
次に、これらの異常スポットに由来するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値を削除した。
【0155】
Ｘ軸に染色体番号を、Ｙ軸に方法によって異常スポットを削除したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値をプロットしたのが、図２０である。
図１９は図２０と比較して、○でプロットした常染色体部分（この部分はゼロに近づくほど良い）のバラツキが多いように見える。
また、図１９の分散度（ＳＴＤＥＶ）の値が０．１３４に対して、図２０の分散度が０．１２６となり、明らかに、異常スポットを削除することによって、データのバラツキが減少している。
以上の結果は、本実施例の方法によって、バラツキが低減され、より精度の高い核酸マイクロアレイの結果が得られることを示している。
【0156】
［実施例５］ 標識異常検出核酸として正常細胞由来の核酸を使用した場合の解析結果
＜ＤＮＡの制限酵素による切断＞
１．５μｇの試料核酸（正常であることが既知の正常試料核酸（ｆｅｍａｌｅ））を１．５ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）に入れ、制限酵素ＤｐｎＩＩ用バッファーを５μＬ、制限酵素ＤｐｎＩＩを１．５μＬ（２０Ｕ）加え、更に水を添加することで全量を５０μＬにした。このマイクロチューブを３７℃に設定したブロックインキュベータＢＩ−５３５Ａ（株式会社アステック）に入れ、２時間酵素反応を行った。２時間後、ブロックインキュベータからマイクロチューブを取り出した。
【0157】
＜制限酵素処理したＤＮＡの精製＞
精製は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（日本ジェネティクス株式会社）を用いて行った。制限酵素により断片化したＤＮＡの全量５０μＬに対して、１００μＬのＮＴバッファーを添加し、混合後、軽くスピンダウンを行った。この溶液をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎのカートリッジに全量添加し、微量高速冷却遠心機ＭＸ−３００（株式会社トミー精工）に入れ、１１０００ｒｐｍで１分間遠心を行った。通過液を捨て、カートリッジに洗浄液ＮＴ−３バッファーを６００μＬ添加し、再び、ＭＸ−３００を用いて１１０００ｒｐｍで１分間遠心処理を行った。通過液を捨て、もう一度、ＭＸ−３００を用いて１１０００ｒｐｍで２分間、カラム中に残留している溶液を完全に除去するために遠心を行った。カートリッジを遠心機から取り出し、水を４６μＬカートリッジに添加し、１分間のインキュベーションを行った後、１１０００ｒｐｍで１分間遠心を行った。
【0158】
＜標識化ＤＮＡの調製＞
標識は、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。制限酵素処理をし、精製を行ったＤＮＡ ２１μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにいれ、そこへ、ＢｉｏＰｒｉｍｅキットに付属の１０ｘｄＣＴＰ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘを２０μＬ入れ、９５℃に加熱したブロックインキュベータ上で５分間過熱した。５分後、マイクロチューブをブロックインキュベータから取り出し、氷上にて急冷した。１０分間急冷した後、ＢｉｏＰｒｉｍｅキット付属の１０ｘｄＣＴＰ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘを５μＬ、１ｍＭＣｙ ｄＣＴＰ （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅキット付属のＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗを１μＬ添加し、軽く攪拌、スピンダウンを行った後、３７℃に加熱したブロックインキュベータ上で２時間標識化反応を行った。
【0159】
＜標識化ＤＮＡの精製＞
精製は、制限酵素処理したＤＮＡの精製と同様の方法で行った。ただし、ＤＮＡの脱着溶液として、水６０μＬを使用した。
上記工程は、試料核酸を２種（検体試料と正常試料、即ちＳａｍｐｌｅ ＡとＢ）及び補正核酸に対して行った。ただし、試料核酸に対しては、Ｃｙ３で標識し、異常検出（補正）核酸に対しては、Ｃｙ５で標識した。なお、本実施例では、試料核酸（Ｓａｍｐｌｅ ＡとＢ）を標識した試料が標識試料核酸、正常試料核酸（ｆｅｍａｌｅ）を標識した試料が標識異常検出（補正）核酸に相当する。
【0160】
＜精製標識化ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞
試料核酸及び異常検出（補正）核酸由来の精製した標識化ＤＮＡをそれぞれ２８μＬずつ１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、そこへ、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡを６５μＬ、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を１２μＬ、−２０℃のエタノールを３１０μＬ添加し、軽く攪拌した後、−８０℃で１０分間静置し、ＭＸ−３００を用いて、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心を行った。遠心後、マイクロチューブを取り出し、沈殿物をとらない様に上清を捨てた後、マイクロチューブ及び沈殿物中のエタノールを蒸発させるために１０分間マイクロチューブのフタを空けたまま、暗所に置いた。次に、マイクロチューブに、ハイブリバッファーＭＭ＃１を６３μＬ、１００ｍｇ／μＬの酵母ｔＲＮＡを９μＬ、２０％ ＳＤＳを１８μＬ添加し、３０分間暗所で静置した。３０分後、沈殿物が完全に溶けるまで攪拌を行った。
この様にすることで、検体試料由来の標識試料核酸と異常検出（補正）核酸由来の標識異常検出核酸（標識補正核酸）との混合物、正常試料由来の標識試料核酸と異常検出（補正）核酸由来の標識異常検出（補正）核酸との混合物の２種の精製標識化ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液を得た。
【0161】
＜核酸マイクロアレイの前処理＞
核酸マイクロアレイの前処理は、比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。なお、核酸マイクロアレイとしては、ＢＡＣクローンから調製したプローブＤＮＡを日本ガイシ株式会社にてスポットした、６６２種のプローブＤＮＡを３スポットずつスポットした、合計１９８６個のスポット数を持つ、核酸マイクロアレイを用いた。
【0162】
＜プレハイブリダイゼーション＞
精製標識化ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液を７５℃で８分間加熱し、４２℃で３０分間加熱することでプレハイブリダイゼーションを行った。
【0163】
＜ハイブリダイザーを用いたハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイザーは、ＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００（アロカ株式会社）を用いた。ハイブリダイザーに核酸マイクロアレイを設置後、プレハイブリダイゼーションした溶液を核酸マイクロアレイ上に塗布した。ハイブリダイゼーション温度は、４２℃、ハイブリダイゼーション時間は、４８時間行った。ハイブリダイゼーションの間、ローラーで攪拌するように設定した。Ｃｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ａ ＤＮＡとＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用溶液を、それぞれの核酸マイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイザーのスタートボタンを押した。洗浄条件は、（１）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、３０秒間、（２）５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、１５分間、（３）２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、３０分間、（４）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、５分間に設定し、洗浄中は、ローラーを用いて攪拌するように設定した。ハイブリダイザーによるハイブリダイゼーションを行い、スピンドライヤー−Ｍｉｎｉ
Ｍｏｄｅｌ２３５０で１分間の遠心を行うことで核酸マイクロアレイを乾燥させた。
【0164】
＜データ取り込み＞
比較例１の＜データ取り込み＞と同様の方法でデータの取り込みを行った。
【0165】
＜データ処理及び結果＞
核酸マイクロアレイ１のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ａ由来の蛍光値と核酸マイクロアレイ２のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ由来の蛍光値との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるスポット対間で下記の式を用いて、核酸マイクロアレイ１と２の間でアレイ上の全スポット対に対して、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）を計算した。Ｘ軸に染色体番号を、Ｙ軸にこのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値をプロットしたのが、図２１である。
すなわち、いかなる補正も行っていない場合の結果を示した。
核酸マイクロアレイ１のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ａ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦ１、Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ１、核酸マイクロアレイ２のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦ２、Ｃｙ５−Ｆｅｍａｌｅ ＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ２とし、以下の式を用いて、補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡの蛍光値を得た。
補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡの蛍光値（Ｆ２’）＝Ｆ２×Ｆｃ１／Ｆｃ２
この数式を用いて、核酸マイクロアレイ１と核酸マイクロアレイ２との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるすべてのスポット対間について、補正後のＣｙ３−Ｓａｍｐｌｅ Ｂ ＤＮＡの蛍光値を得た。
【0166】
次に、上記計算によって得た補正後のＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値を用いて、核酸マイクロアレイ上のすべてのスポット対間の比較値、すなわち、以下の数式を用いて、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）を得た。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）＝Ｌｏｇ２（Ｆ１／Ｆ２’）
次に、計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）の平均値を計算し、その平均値がゼロとなるように、すべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値を補正した。
Ｘ軸に染色体番号を、Ｙ軸に同一プローブ核酸をスポットしたスポット対間で平均値を計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値をプロットしたのが図２２である。
次に核酸マイクロアレイ１と２との間で、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒから構成されるスポット対間で下記の式を用いて、核酸マイクロアレイ１と２間でアレイ上の全スポット対に対して、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）を計算した。
核酸マイクロアレイ１と２の間に対するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ１／Ｆｃ２）
次に、上記計算結果から得たＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）の平均値を計算し、その平均値がゼロとなるように、すべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（ｆｅｍａｌｅ／ｆｅｍａｌｅ）値を補正した。
上記結果から得た補正Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）値が０．６を超える補正Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（ｆｅｍａｌｅ／ｆｅｍａｌｅ）値を持つスポット対から構成されたＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ／Ｓａｍｐｌｅ Ｂ）値を異常スポットとし、図２２のグラフ上から削除した結果が図２３である。
図２１と図２２とを比較すると、標識異常検出（補正）核酸を用いた標識値の補正により、データのバラツキが大幅に減少していることがわかる。
さらに、図２２と図２３とを比較すると、標識異常検出（補正）核酸を用いた異常スポットの削除法により、更にデータのバラツキが低減していることがわかる。
以上の結果は、本実施例の方法によって、バラツキが低減され、より精度の高い核酸マイクロアレイの結果が得られることを示している。
【0167】
［実施例６］ 標識異常検出核酸としてベクター由来の核酸を用いた場合の解析結果
＜未精製標識試料核酸の調整＞
比較例１の＜未精製標識試料核酸の調整＞と同様の方法で行った。
【0168】
＜異常検出核酸の調整＞
ＲＰＣＩ‐１１ ｖｅｃｔｏｒより１クローンを選択し、ＬＢ培地に１００ｍｇ／ｍＬになるようにクロラムフェニコールを添加し、ＢＥ−４３ＦＬ（タイテック社製培養器）を用いて、３７℃で一晩培養した。これをＱＩＡｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてＢＡＣを抽出した。抽出したＢＡＣをニッポンジーン社の制限酵素ＮｏｔＩ用いて消化し、アガロース電気泳動に供した。７ｋｂ付近の断片を切り出し、ＭＮ社のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラムを用いてアガロース中から精製した。これをインビトロジェン社Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて、４℃で一晩ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し、ｐＢＡＣ１０Ｌを取得した。
ｐＢＡＣ１０Ｌをインビトロジェン社ＤＨ−１０Ｂケミカルコンピテントセルに加え、氷上で３０分静置後、４２℃で３０秒加湿し、再度氷上に２分静置した。これにＳＯＣ培地６００μＬ添加し、１００ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りＬＢ培地に植菌した。これを３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてＢＡＣ ＤＮＡを抽出しベクター由来の異常検出核酸を取得した。
【0169】
＜未精製標識異常検出核酸の調整＞
１．７ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ、ビーエム機器株式会社）に、＜異常検出核酸の調整＞で調整したベクター由来の異常検出核酸を６μｇ（６μＬ）、水を５μＬ、２．５ｘＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ入れ、ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、９５℃で５分間熱処理を行った。５分後、マイクロチューブを取り出し、３７℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａの中に入れ、１５分間静置した。１０ｘｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを５μＬ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を３μＬ、Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μＬ添加し、３７℃で２時間ＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａにて、標識化反応と共に増幅反応を行った。２時間後、マイクロチューブをインキュベータから取り出し、６５℃に設定したＢＬＯＣＫ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＢＩ−５３５Ａ上にて、１５分間加熱処理を行い、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【0170】
＜標識異常検出核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調整＞
上記＜未精製標識異常検出核酸の調整＞で調整した未精製標識異常検出核酸Ｃｙ５−ベクターＤＮＡを２０μＬ、未標識Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ ６２μＬ（６２μｇ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．７ｍＬマイクロチューブに入れ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を８μＬ、−２０℃のエタノールを３６０μＬ添加し、混合後、１０分間−８０℃で放置した。その後、ＴＯＭＹ製遠心機ＭＸ−３００を用いて、１５０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心を行った。遠心後、沈殿物が遠心チューブの底にたまるので、その沈殿物を吸い込まないように注意しながら、上清を除去した。次に、遠心チューブのフタを開けたまま１０分間放置し、残存するエタノールを除去した。１０分後、ホルムアミドを４０％、ＳＳＣ、デキストラン硫酸を０．０７５ｍｇ／μＬに調製したハイブリダイゼーション調製溶液を５２μＬ、１０％ＳＤＳを８μＬ添加し、３０分間静置した。３０分後、攪拌することで沈殿物を溶解し、その後、十分に攪拌した。
【0171】
＜標識試料核酸、標識異常検出核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調整＞
上記＜未精製標識試料核酸の調製＞で調製したＦｅｍａｌｅ ＤＮＡの未精製標識試料核酸を２０μＬ、＜標識異常検出核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製＞で調製した溶液を６０μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。また同様に、＜未精製標識試料核酸の調製＞で調製したＭａｌｅ ＤＮＡの未精製標識試料核酸を２０μＬ、上記＜標識異常検出核酸Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション調製溶液の調製＞で調製した溶液を６０μＬ、１．７ｍＬマイクロチューブの中に入れ、十分にＶｏｒｔｅｘ処理を行うことで、攪拌を行った。
【0172】
＜ＣＧＨアレイの前処理＞
ＣＧＨアレイの前処理は、比較例１の＜核酸マイクロアレイの前処理＞と同様の方法で行った。なお、ＣＧＨアレイとしては、ＢＡＣクローンから調製したプローブＤＮＡを日本ガイシ株式会社にてスポットした、７１２種のプローブＤＮＡを各３セット、合計２１３６個のスポットを持つ、核酸マイクロアレイを用いた。
【0173】
＜ハイブリダイゼーション＞
比較例１の＜ハイブリダイゼーション＞と同様の方法で行った。
＜データ取り込み＞
比較例１の＜データ取り込み＞と同様の方法で行った。
【0174】
＜データ処理及び結果＞
ＣＧＨアレイ１のＣｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値とＣＧＨアレイ２のＣｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値とに基づき、ＣＧＨアレイ１と２上の全スポット対について、Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）を計算した。
具体的には、以下の数式を用いた。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）＝Ｌｏｇ２［（Ｃｙ３−Ｆｅｍａｌｅ由来の蛍光値）／（Ｃｙ３−ｍａｌｅ由来の蛍光値）］
各スポット対は、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒを有する、ＣＧＨアレイ１上のスポット及びＣＧＨアレイ２上のスポットである。
Ｘ軸に染色体番号を、Ｙ軸にこのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットしたのが、図２４である。すなわち、いかなる補正も行っていない場合の結果を示した。
ＣＧＨアレイ１のＣｙ３−Ｍａｌｅ由来の蛍光値をＦ１、Ｃｙ５−ベクターＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ１、ＣＧＨアレイ２のＣｙ３−ＦｅｍａｌｅＤＮＡ由来の蛍光値をＦ２、Ｃｙ５−ベクターＤＮＡ由来の蛍光値をＦｃ２とし、以下の式を用いて、補正後のＣｙ３−ＦｅｍａｌｅＤＮＡの蛍光値を得た。
補正後のＣｙ３−ＦｅｍａｌｅＤＮＡの蛍光値（Ｆ２’）＝Ｆ２×Ｆｃ１÷Ｆｃ２
この数式を用いて、ＣＧＨアレイ１とＣＧＨアレイ２上のすべてのスポット対間について、補正後のＣｙ３−ＦｅｍａｌｅＤＮＡの蛍光値を得た。
次に、ＣＧＨアレイ上のすべてのスポット対間の比較値、すなわち、上記計算によって得た補正後のＣｙ３−Ｍａｌｅ ＤＮＡの蛍光値を用いて、以下の数式からＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）を得た。
Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）＝Ｌｏｇ２（Ｆ１÷Ｆ２’）
次に、計算したＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）の平均値を計算し、その平均値がゼロとなるように、すべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値を補正した。
Ｘ軸に染色体番号を、Ｙ軸に補正後のＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値をプロットしたのが図２５である。
次にＣＧＨアレイ１と２間でアレイ上の全スポット対に対して、下式を用いてＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（ベクターＤＮＡ／ベクターＤＮＡ）を計算した。各スポット対は、同一Ｂｌｏｃｋ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｃｏｌｕｍｎ Ｎｕｍｂｅｒ、同一Ｒｏｗ Ｎｕｍｂｅｒを有する、ＣＧＨアレイ１上のスポット及びＣＧＨアレイ２上のスポットである。
ＣＧＨアレイ１と２の間に対するＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（ベクターＤＮＡ／ベクターＤＮＡ）＝Ｌｏｇ２（Ｆｃ１÷Ｆｃ２）
次に、上記計算結果から得たＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｃｏｔ−１／Ｃｏｔ−１）の平均値を計算し、その平均値がゼロとなるように、すべてのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（ベクターＤＮＡ／ベクターＤＮＡ）値を補正した。
上記結果から得た補正Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ（ベクターＤＮＡ／ベクターＤＮＡ）値が０．６を超えるスポット対を異常スポットとし、該異常スポットのＬｏｇ Ｒａｔｉｏ（Ｆｅｍａｌｅ／Ｍａｌｅ）値を図２５のグラフ上から削除した結果が図２６である。
【0175】
図２４と図２５とを比較すると、標識異常検出核酸を用いた標識値の補正により、データのバラツキが大幅に減少していることがわかる。
さらに、図２５と図２６とを比較すると、標識異常検出（補正）核酸を用いた異常スポットの削除法により、更にデータのバラツキが低減していることがわかる。
以上の結果は、本実施例の方法によって、バラツキが低減され、より精度の高いＣＧＨアレイの結果が得られることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
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