5768230 エストロゲン様作用剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5768230

(24)【登録日】2015年7月3日

(45)【発行日】2015年8月26日

(54)【発明の名称】エストロゲン様作用剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/07 20060101AFI20150806BHJP

   A61K 31/5575 20060101ALI20150806BHJP

   A61K 36/00 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 5/30 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20150806BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20150806BHJP

   C07D 313/00 20060101ALI20150806BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/84 A

   A61K31/5575

   A61K35/78 X

   A61P5/30

   A61P3/06

   A61P9/10 101

   C07D313/00

【請求項の数】2

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2010-84218(P2010-84218)

(22)【出願日】2010年3月31日

(65)【公開番号】特開2010-275294(P2010-275294A)

(43)【公開日】2010年12月9日

【審査請求日】2013年3月26日

(31)【優先権主張番号】特願2009-108504(P2009-108504)

(32)【優先日】2009年4月27日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 平成２０年１１月６日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｅｃｈ．ｎｉｋｋｅｉｂｐ．ｃｏ．ｊｐ／ｂｉｏｎｅｗｓｎ／ｄｅｔａｉｌ．ｊｓｐ？ｉｄ＝２００５７３８６＆ｎｅｗｓｉｄ＝ＳＰＣ２００８１１０．．．」に発表

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】591173198

【氏名又は名称】学校法人東京女子医科大学

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100093230

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 利夫

(72)【発明者】

【氏名】松岡 瑠美子

(72)【発明者】

【氏名】木山 亮一

(72)【発明者】

【氏名】董 四君

(72)【発明者】

【氏名】古谷 喜幸

(72)【発明者】

【氏名】古谷 道子

(72)【発明者】

【氏名】真崎 知生

(72)【発明者】

【氏名】田中 建志

【審査官】 渡邊 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００１−３２２９４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−０６５２０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３３１６０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３５９６４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本食品化学学会誌, Vol.11 No.1 p.1-6 (2004)

【文献】 Biochim Biophys Acta., Vol.1631 No.2 p.147-152 (2003)

【文献】 Foods & Food Ingred J Jpn., Vol.214 No.1 p.48-55 (2009.01.01)

【文献】 治療学, Vol.33 No.10 p.1085-1087 (1999)

【文献】 Lipid, Vol.8 No.5 p.445-455 (1997)

【文献】 J Agric Food Chem., Vol.61 p.128-136 (2013)

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００

Ａ６１Ｋ ３１／５５７５

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）エストロゲンの欠乏にともなう障害または疾患を治療または予防するための薬剤であって、下記式（ＩＩ）で表される精製されたブレフェルディンＡを含有する薬剤、

【化1】

または、
（２）動脈硬化または高脂血症を治療または予防するための薬剤であって、下記式（ＩＩ）で表される精製されたブレフェルディンＡを含有する薬剤

【化2】

の製造方法であって、
ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物を溶媒抽出して溶媒抽出液を得る工程、および
前記溶媒抽出液から、クロマトグラフィーを利用して前記ブレフェルディンＡを精製する工程、
を含むことを特徴とする薬剤の製造方法。

【請求項2】

以下の工程、
ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物を溶媒抽出して溶媒抽出液を得る工程、および
前記溶媒抽出液から、クロマトグラフィーを利用して下記式（ＩＩ）で表されるブレフェルディンＡを精製する工程、
を含むことを特徴とするブレフェルディンＡの製造方法。

【化3】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エストロゲンの欠乏にともなう障害、疾患を治療または予防するための薬剤、また、エストロゲンの不足を補うための健康補助食品に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒメマツタケは、ブラジルに自生するキノコであり、学名を「アガリクス・ブラゼイ・ムリルAgaricus blazei Murrill」、和漢薬名を「カワリハラタケ」といい、一般には「アガリスク」という名称で広く知られている。ヒメマツタケは、現地では古く から“神のキノコ”と呼ばれており、ヒメマツタケに癌、感染症、糖尿病等に対する予防・改善効果を有することが知られてきており、生または乾燥した子実体、あるいは子実体・菌子体の抽出エキスが健康食品として食されている。ところで、その効果は、一般的には、ヒメマツタケの子実体に含有される高分子多糖類であるβ−Ｄ−グルカン等や、菌糸体に含まれるグルコマンナンタンパク多糖体（ATOM）、マンナンタンパク質複合体（AB-FP）の作用によるものと考えられている。しかし、レクチンやポリフェノール酸化酵素などが有効であるという報告や、ステロイドのアポトーシス誘導作用の報告など様々な有効成分が複合的に働いている可能性が示唆されている。（例えば、特許文献１−６）
また、ヒメマツタケの子実体及び子実体から抽出される水溶性の複合成分中に、抗動脈硬化作用があることが報告されており、この作用は抽出物の蛋白多糖体複合成分によるものであるとあると示唆されている。（特許文献７）
このように、ヒメマツタケの抽出物には様々な薬理作用があることが知られており、癌や成人病などの疾患の治療へ利用することについても大きな可能性を有しているが、活性作用の本体は明らかにされていない。ヒメマツタケを健康食品ではなくて、医薬品として利用するためには、その薬理作用を物質レベルで解明することが必要である。

【0003】

ところで、従来から、エストロゲンの欠乏によって、女性の更年期障害や様々な疾患が引き起こされることが知られている。具体的には、例えば、萎縮性膣炎などの泌尿生殖器障害、前立腺癌、前立腺肥大症、骨粗鬆症、動脈硬化、記憶障害、アルツハイマー病、血栓性疾患などが挙げられる。

【0004】

中でも、動脈硬化は心疾患や脳血管疾患の大きな原因のひとつであり、動脈硬化の進行は個人の体質や食生活を含めた生活習慣などさまざまな要因が関与するため、正確な診断や治療には関係する遺伝子レベルでの機能メカニズムの解明が必要である。また、女性は、閉経前はLDL（低比重リポタンパク質）コレステロールレベルが低いが、閉経後はLDLコレステロールレベルが上昇するとともに動脈硬化が進むことが知られており、エストロゲンの欠乏がこれの主要な原因であることがわかっている。

【0005】

しかし、例えば、女性の閉経後の動脈硬化の改善のために、エストロゲン治療を行うと、子宮内膜癌のリスクが増大するなどの副作用が知られており、直接エストロゲンを投与することはむしろ危険であるとの指摘がなされている。このような背景から、近年、エストロゲンを直接治療に用いることに代えて、大豆イソフラボンなどの植物由来のエストロゲン様物質を用いた動脈硬化の治療方法が注目されている。このように、食品中の有用物質についての関心が高まっており、副作用のなく、安心して摂取することのできる健康食品が注目されている。特に高齢者や妊産婦、幼児、子供などについては副作用のない食品由来成分などによる治療法や予防法が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開平１ − ６ ７ １ ９ ４ 号公報

【特許文献2】特開平１ − ６ ７ １ ９ ５ 号公報

【特許文献3】特開平２ − ７ ８ ６ ３ ０ 号公報

【特許文献4】特開平２ − １ ２ ４ ８ ２ ９ 号公報

【特許文献5】特開平６ − １ ２ ８ １ ６ ４ 号公報

【特許文献6】特開平７ − ２ ５ ８ １ ０ ７ 号公報

【特許文献7】特開２００４ − ３５９６４５ 号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、ヒメマツタケの菌糸体又はその処理物から抽出される物質を有効成分として、エストロゲンの欠乏を原因とする障害、疾患の治療薬を提供すること、また、エストロゲンの不足を補うための健康補助食品を提供することを課題としている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、ヒメマツタケに関する研究の中で、ヒメマツタケ菌糸体抽出物についてその作用を検討したところ、詳しくは実施例で後述するように、インビボにおいて、血清中の酸化LDLレベルの抑制効果や、アテローム性動脈硬化を改善する効果があることを見出した。

【0009】

また、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現レベルを検討したところ、ヒメマツタケ菌糸体抽出物にはエストロゲン様作用があることが判明したので、上記の効果と、エストロゲン様作用との関連について検討した結果、ヒメマツタケ菌糸体抽出物の投与による急激に誘発されるエストロゲン様作用は、酸化LDLレベルの抑制やアテローム性動脈硬化の改善に重要な働きをすることが知られているErk1/2とAktの活性化によるものであることを見出した。これにより、ヒメマツタケ菌糸体抽出物が示した、上記の効果はエストロゲン様作用によるものであることが明らかとなった。
また、そのエストロゲン様作用について、物質レベルで検討した結果、ブレフェルディンＡを多く含む複合成分分画が、特に強いエストロゲン様作用を顕著に示したことから、ブレフェルディンＡを有効成分とする薬剤等に関する本発明を完成するに至った。

【0010】

以上の知見から、本発明は、以下のことを特徴とするヒメマツタケ菌子体抽出物、薬剤およびその製造方法、健康補助食品、ブレフェルディンＡ類の製造方法を提供する。
＜１＞ヒメマツタケ菌子体および／またはその処理物からの溶媒抽出物であって、エストロゲン様作用を有するヒメマツタケ菌子体抽出物。
＜２＞エストロゲン様作用が抗動脈硬化作用である前記第１のヒメマツタケ菌子体抽出物。
＜３＞溶媒が、水、熱水または有機溶媒である前記第１または２のヒメマツタケ菌子体抽出物。
＜４＞抽出物には、下記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類が含有されている前記第１から３のいずれかのヒメマツタケ菌子体抽出物。

【0011】

【化1】

【0012】

＜５＞ブレフェルディンＡ類が下記式（ＩＩ）で表されるブレフェルディンＡである前記第４のヒメマツタケ菌子体抽出物。

【0013】

【化2】

【0014】

＜６＞エストロゲンの欠乏にともなう障害または疾患を治療または予防するための薬剤であって、前記第１から５のいずれかの抽出物を有効成分として含有する薬剤。
＜７＞動脈硬化または高脂血症を治療または予防するための薬剤であって、前記第１から５のいずれかの抽出物を有効成分として含有する薬剤。
＜８＞エストロゲンの不足を補うための健康補助食品であって、前記第１から５のいずれかの抽出物を有効成分として含有する健康補助食品。
＜９＞酸化ＬＤＬ値を低下させるための健康補助食品であって、前記第１から５のいずれかの抽出物を有効成分として含有する健康補助食品。
＜１０＞エストロゲンの欠乏にともなう障害または疾患を治療または予防するための薬剤であって、上記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類を含有する薬剤。
＜１１＞動脈硬化または高脂血症を治療または予防するための薬剤であって、上記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類を含有する薬剤。
＜１２＞ブレフェルディンＡ類が上記式（ＩＩ）で表されるブレフェルディンＡである前記第１０または１１の薬剤。
＜１３＞ブレフェルディンＡ類が、ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物から溶媒抽出して得られる前記第１０または１１の薬剤。
＜１４＞エストロゲンの不足を補うための健康補助食品であって、上記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類を含有する健康補助食品。
＜１５＞酸化ＬＤＬ値を低下させるための健康補助食品であって、上記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類を含有する健康補助食品。
＜１６＞ブレフェルディンＡ類が上記式（ＩＩ）で表されるブレフェルディンＡである前記第１４または１５の健康補助食品。
＜１７＞ブレフェルディンＡ類が、ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物から溶媒抽出して得られる前記第１４または１５の健康補助食品。
＜１８＞前記第１０または１１の薬剤の製造方法であって、少なくとも、ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物から、上記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類を溶媒抽出する工程を含む薬剤の製造方法。
＜１９＞ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物から溶媒抽出することを特徴とする上記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類の製造方法。
＜２０＞ブレフェルディンＡ類が、上記式（ＩＩ）で表されるブレフェルディンＡである前記第１９のブレフェルディンＡ類の製造方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明のヒメマツタケの菌糸体抽出物は、エストロゲン様作用を有することから、例えば、抗動脈硬化剤、血中酸化LDL抑制剤、ホルモン補充療法などにおけるエストロゲン様作用剤として、また、エストロゲンを補充するための健康補助食品・サプリメントとして利用することができる。しかも、ヒメマツタケは食用キノコであるため、上記のような利用に際し、副作用の恐れのない。

【0016】

また、ヒメマツタケの菌糸体抽出物に含まれるブレフェルディンＡ類を有効成分とすることで、さらに効果的な利用が可能となる。

【0017】

さらに、ヒメマツタケ菌糸体の抽出液は、抽出液に含まれる蛋白多糖体複合成分等によって、有効成分であるブレフェルディンＡが包摂された状態であるため製剤化が容易である。

【0018】

また、ブレフェルディンＡをヒメマツタケ菌糸体から抽出し得るという新規な知見により、ブレフェルディンＡを抗生物質や制癌剤などとして利用する場合にも、放線菌などから抽出する場合に比べて安全な薬剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ヒメマツタケ粉薬による心筋虚血に対する効果を示す図である。（A）と（B）は、それぞれ、ヒメマツタケ粉薬の投与前、後におけるテクネチウムの蓄積を表している。

【図2】ヒメマツタケ粉薬の摂取による血清酸化LDLレベルに対する影響を示す図である。データは全LDLに対する酸化LDLの重量比（ng酸化LDL/μgLDL）として算出し、平均と準偏差を示している。*P < 0.05、**P < 0.01。

【図3】LDLの試験管内過酸化アッセイを示す図である。それぞれの分画は、ヒメマツタケ抽出物から調製されたもので、エタノール抽出分画（Fraction I）、沸湯水抽出分画（Fraction II）、及び、塩可溶性分画（Fraction III）を示している。

【図4】冠状動脈の免疫学的な解析結果を示している。ヒメマツタケ粉薬を与えないウサギ（グループI：A-C）について中隔冠状動脈における動脈硬化性障害を検討し、ヒメマツタケ粉薬を与えたウサギ（グループII：D-F）及び対照群（グループIII：図G-I）については左の冠状動脈の障害を検討した。それぞれの図は、マッソントリクローム染色（A,D,G）、RAM11による免疫染色（B,E,H）、及び、平滑筋αアクチンに対する抗体による染色（C,F,I）した結果を示す。また、それぞれの図は×100倍拡大像を示している。

【図5】大動脈を免疫組織化学染色した図である。A〜Jは、グループIウサギ、K〜Tは、グループIIウサギの大動脈100倍拡大像である。詳しくは、大動脈をRAM11（A、K）、平滑筋αアクチン（B、L）、タイプIコラーゲン（C、M）、タイプIIIコラーゲン（D、N）、タイプIVコラーゲン（E、O）、Ki67（F、P）、BAX（G、Q）、LOX-1（H、R）及びCD36（I、S）の抗体を用いて解析を行った。アポトーシスはTUNEL法によって染色した（J、T）。

【図6】ヒメマツタケ抽出物あるいはヒメマツタケ菌糸体培養液によるMCF-7細胞増殖活性を示す。それぞれのヒメマツタケ抽出物（ABE）の濃度、あるいは、純水及び10nM E2を用いた場合の結果を示している。実験は少なくとも３回行い、得られた490nm吸光度の対照実験で得られた490nm吸光度に対する比（Proliferation Index；%）を計算し、平均と標準偏差を示した。

【図7】ヒメマツタケ抽出物あるいはE2でMCF-7細胞を刺激したときの203のエストロゲン応答遺伝子の発現プロファイルの比較を示す図である。2μg/mLのヒメマツタケ抽出物溶液を用いて得られた遺伝子発現プロファイルとE2を用いて得られた遺伝子発現プロファイル（それぞれ3回の実験結果の平均値）を比較し、散布図として示した。

【図8】DNAマイクロアレイ解析によりヒメマツタケ抽出物とE2刺激による異なる遺伝子発現を示した遺伝子（表1）について、リアルタイムRT-PCRによって確認した結果を示す図である。グラフはE2（灰色のグラフ）あるいはヒメマツタケ抽出物（白色のグラフ）の結果をlog₂変換した値の平均と標準偏差を示した。*P < 0.05、**P < 0.01。

【図9】HUVEC及びTIB-67細胞におけるヒメマツタケ抽出物（ABE）によるErk1/2とAktの迅速な活性化を示す図である。

【図10】HUVEC及びTIB-67細胞にけるヒメマツタケ抽出物による、酸化LDL（OxLDL）刺激によるErk1/2、Aktとp38MAPキナーゼの活性化の阻害を示す図である。タンパク質はSDSサンプル緩衝液を用いて抽出し、ウエスタンブロッティングにより解析している。

【図11】リアルタイムRT-PCRによるHUVEC細胞におけるGPX3、LOX-1、及びeNOSのmRNAの解析結果を示す図である。それぞれのmRNA量はβアクチンの量で標準化した。データは3回の実験の結果の平均を示す。**P < 0.01。

【図12】HUVEC細胞におけるGPX3、及びeNOSタンパク質のウエスタンブロッティング解析についての結果を示す図である。

【図13】血管内皮細胞におけるヒメマツタケ抽出物の与える影響を示す模式図である。

【図14】（Ａ）酢酸エチル分画のHPLCによるクロマトを示す。10分画ごとにそれぞれ溶出物を混合しErk1/2リン酸化活性を検討した。（Ｂ）Erk1/2リン酸化活性の見られた分画51-60について、再クロマトを行った分画についての、Erk1/2 リン酸化活性を示す。

【図15】SRB試験によるブレフェルディンＡの細胞増殖活性評価を示す図である。

【図16】ブレフェルディンＡによるErk1/2タンパク質の活性化を示す図である。

【図17】レポーター遺伝子試験によるブレフェルディンＡのエストロゲン活性評価（１）を示す図である。

【図18】レポーター遺伝子試験によるヒメマツタケ菌糸体抽出物のエストロゲン活性評価を示す図である。

【図19】レポーター遺伝子試験によるブレフェルディンＡのエストロゲン活性評価（２）を示す図である。

【図20】菌子体と子実体の活性の比較を示す図である。

【図21】様々な溶媒によるブレフェルディンＡの抽出を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明は、上記の通り、ヒメマツタケ菌糸体抽出物がエストロゲン様作用を有しているという新規な知見に基づいている。

【0021】

ここで、「エストロゲン様作用」とは、エストロゲンと同様の作用を意味し、例えば、抗動脈硬化作用などをいう。すなわち、本発明は、エストロゲンの持つ良い作用を有している。なお、エストロゲン作用による悪影響として、発癌リスク、血栓リスクなどがあることが知られているが、本発明においては、このようなエストロゲンの持つ欠点を改善している。

【0022】

「エストロゲン様作用」についてさらに詳しく説明すると、同様の例として、大豆イソフラボンのエストロゲン様作用が知られている。大豆イソフラボンが健康食品の有効成分として認められている理由の一つは、エストロゲンと同様の作用を示すだけではなく、エストロゲンが示す強い発癌（癌細胞の増殖を含む）リスクは持たないからである。例えば、厚労省の食品安全委員会報告「大豆イソフラボンを含む特定保健用食品の安全性評価の基本的な考え方」（２００６年５月：添付ファイル参照）には、「4.2.3.1 癌などのリスクに関する報告等」項で「なお、in vitro試験において大豆イソフラボンの摂取は、乳癌の発症に対しては抗エストロゲン作用を示すとの報告もある。」（35ページ）と記述がある。

【0023】

このように、本発明の薬剤は、大豆イソフラボンの場合と同様に、エストロゲン様作用を有するとともに、エストロゲンの持つ欠点を有していないことから、副作用の恐れがなく、エストロゲンの欠乏にともなう障害、疾患の治療または予防に有効である。

【0024】

ここで、「エストロゲンの欠乏にともなう障害」とは、例えば、更年期障害が挙げられ、本発明の薬剤によれば、更年期障害による、自律神経失調症状（顔面紅潮、発汗、冷え性、睡眠障害、動悸、頭痛など）、精神症状（抑うつ、精神不安定、記憶力減退など）、その他の症状（肩こり、関節痛、腹痛、食欲不振、易疲労性など）（坂元正一他監修：プリンシプル産科婦人科学１．改訂版、メディカルビュー社、2001）を改善することができる。また、「エストロゲンの欠乏にともなう疾患」には、例えば、萎縮性膣炎などの泌尿生殖器障害、前立腺癌、前立腺肥大症、骨粗鬆症、動脈硬化、記憶障害、アルツハイマー病、血栓性疾患などが含まれる。

【0025】

また、本発明の健康補助食品は、皮膚のシミ、シワなどの改善や、豊胸などの美容目的にも有用である。

【0026】

そして、具体的には、本発明の薬剤、健康補助食品は、下記式（Ｉ）で表されるブレフェルディンＡ類を有効成分として含有している。

【0027】

【化3】

【0028】

ブレフェルディンＡ類は、６個の不斉炭素（１位、４位、５位、７位、９位及び１５位の炭素原子）を有しており、いくつかの異性体が存在している。例えば、下記式（ＩＩ）で表される立体配置を有するブレフェルディンＡ及びそのエピーマーである７−epi−ブレフェルディンＡ、４，７−epi−ブレフェルディンＡ等が知られている（J.Chem.Soc.,1, 2387 (1982); Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 23, 145 (1984)）。これらの立体異性体の中で、下記式（ＩＩ）で表されるブレフェルディンＡが最も好ましい。

【0029】

【化4】

【0030】

ブレフェルディンＡ類については、放線菌（Eupenicillium brefeldianum）などから抽出され、抗生物質（例えば、特開昭 ４６−１９５４２号公報）として、また制癌剤（例えば、ＤＥ ４３０５２４９号公報、ＡＵ ９３４６３３８公報）などとして使用できることが知られているが、本発明者らは、ブレフェルディンＡが、担子菌であるヒメマツタケの菌糸体に含まれていることをはじめて見出し、さらに、ブレフェルディンＡが抗動脈硬化作用などのエストロゲン様作用を示すことを見出した。

【0031】

本発明に含有されるブレフェルディンＡ類は、上記の如く放線菌から抽出し、これを精製したものを用いても良いが、市販品（例えばMOL社製造、フナコシ(株)販売）も入手することができるので、これを用いても良い。また、ブレフェルディンＡ類は、ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物からの溶媒抽出した後、単離したものを使用することもできる。

【0032】

以下、ヒメマツタケの菌糸体および／またはその処理物からブレフェルディンＡ類を取得する方法について説明する。上記の通り、従来は、ヒメマツタケの菌糸体にブレフェルディンＡ類が含有されていることは全く知られていなかったため、以下に説明する方法は、新規なブレフェルディンＡ類の製造方法ともなる。

【0033】

本発明における活性成分であるブレフェルディンＡ類は、ヒメマツタケ（アガリスクブレゼイ、Agaricus Blazei）の菌糸体及び／ 又はその処理物から抽出、単離することができる。

【0034】

「菌糸体」とは、菌糸の集合体であり、ここでは、ヒメマツタケの栄養体をいい、いわゆる、キノコと呼ばれる「子実体」とは区別される。そして、菌糸体の処理物には、ヒメマツタケの菌糸体の破砕物、磨砕物、組織破壊物、乾燥物、乾燥粉砕物等が含まれる。本発明で使用するヒメマツタケ菌糸体は、その由来については特に制限はなく、自生したもの、人工培養物のいずれでもよいが、生産性を考慮すれば、人工培養物が好ましい。

【0035】

また、突然変異株（自然発生または人為誘発性）も、本発明に使用することができ、さらに、ヒメマツタケ菌株の形質接合体や遺伝子組換え体であってもブレフェルディンＡ類を産生する能力を有するものは、すべて本発明の方法に使用することができる。

【0036】

ヒメマツタケの採取時期、生育年数、培養方法、培養期間などについても特に制限はない。ヒメマツタケ菌糸体は培地成分の異なる生産方法により、活性の異なるものが得られるが、本発明においては、その中のいずれを用いてもよい。これは単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。活性が高いヒメマツタケを組み合わせて使用すれば、より高い活性の発現が期待できる。

【0037】

培養方法について例示すると、例えば、ヒメマツタケの菌糸体は、担子菌の培養に通常用いられる固体培養法又は液体培養法で培養することができる。なお、固体培養では、培養時間が長く、また抽出工程が複雑となるため、操作の簡便性を考慮すれば、液体培養法で得るのが好ましく、液体培地としては、例えば、グルコール、サッカロース、マルトース、水アメ、デキストリン、シュクロース、デンプン、糖密等の炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等の窒素源、麦芽エキス、酵母エキス、コーンステイプリカ等の天然複合栄養源、リン酸塩、アグネシウム塩、カリウム塩等の無機塩及びその他の微量元素からなるｐＨ６．０前後に調整した通常の殺菌済みの液体培地を用いることができる。また菌の生育を助けブレフェルディンＡ類の産生を促進するような有機および無機物を培地に添加することもできる。該培地に、ヒメマツタケの種菌を接種し、温度３０℃前後で１５〜２５日間程度、雑菌汚染を防止しつつ好気条件下に振とう培養又は通気撹拌培養すると、菌糸体が生育するので、この段階で培養系を遠心分離又は濾過することによりヒメマツタケ菌糸体を得ることができる。ヒメマツタケ菌糸体によるブレフェルディンＡ類の生産は、培地や培養条件により異なるが、フラスコ内の固体培養法である寒天培地表面培養法では、通常７〜２１日の間にその蓄積が最高に達する。したがって、菌糸体中のブレフェルディンＡ類の蓄積量が最高になった時に培養を停止するのが好ましい。そして、得られた菌糸体は、例えば、凍結乾燥することで粉末状にすることもできる。

【0038】

このようにして得られたヒメマツタケの菌糸体及び／又はその処理物から溶媒抽出物を得る。この溶媒抽出物には、ブレフェルディンＡ類が含まれる。溶媒は、水、熱水又は含水有機溶媒によって行うことができる。この場合、例えば、熱水としては40℃以上のもの、好ましくは60℃以上のものが挙げられ、含水有機溶媒としては、20〜60重量％程度の低級アルコール、好ましくはエチルアルコールを含有する水溶液が挙げられる。

【0039】

ブレフェルディンＡ類は、脂溶性物質であるので、菌糸体中から単離精製するにあたっては、この特性を利用して行うことができる。すなわち、例えば酢酸エチル、クロロホルム、酢酸エチル、エーテル、エチルアルコール等による溶媒抽出法；シリカゲル、アルミナ、ODS、ダイヤイオンHP-20 (三菱化学（株）製)等の合成吸着剤や、HW40 (東ソー社製)等のゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィー；さらにシリカゲル等を担体とした分取薄層クロマトグラフィー等が有効である。

【0040】

ブレフェルディンＡ類を薬剤として用いるに当たり、通常の製造担体とともに投与経路に応じた製剤とする事ができる。本発明に用いるブレフェルディンＡ類を例えば、経口投与では錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等の形態に調剤される。経口投与用固形製剤を調製するに当たり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、その他着色剤、崩壊剤等を用いることができる。

【0041】

賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が挙げられ、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、白糖等が挙げられ、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が挙げられる。その他、着色剤、崩壊剤も通常公知のものを用いることができる。

【0042】

尚、錠剤は周知の方法によりコーティングしてもよい。また液状製剤は、水性または油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤、その他であってもよく、通常用いられる方法にて調製される。注射剤を調製する場合はジデプシドにｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を製造することができる。また、坐剤を製造する際の基剤としては、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコー ル、ラノリン、脂肪酸トリグリセライド、ウイテプゾール（ダイナマイトノーベル社の登録商標）等の油脂性基剤を用いることができる。

【0043】

また、ヒメマツタケ菌糸体から、ブレフェルディンＡ類を単離・精製処理を行わず、例えば、ヒメマツタケ菌糸体から熱水抽出物をそのまま薬剤とすることもできる。放線菌等を培養して、その菌体を熱抽出して、ブレフェルディンＡ類を含む抽出物をそのまま経口投与に用いることは安全性等の面での問題がある場合があるが、ヒメマツタケは食用のキノコの一種であり、菌糸体や子実体を熱水抽出したものを、サプリメント等として食することが、長い間習慣的に行われてきた。したがって、安全性の面で、ヒメマツタケ菌糸体から熱水抽出物をそのまま薬剤とすることに問題はなく、この場合にも、抽出物中に含まれているブレフェルディンＡ類を有効かつ安全に経口摂取することができる。

【0044】

ヒメマツタケ菌糸体の抽出物を経口から摂取する場合も、その剤形は特に限定されないが、通常経口摂取に用いられる剤形である、錠剤、丸剤、粉剤、トローチ剤、分包包装、オブラート剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル剤（固体または液体媒体としての）、および無菌包装粉剤などの形をとることができる。

【0045】

また、ヒメマツタケ菌糸体の抽出物を、添加剤と混合するか、添加剤で希釈するか、カプセル、分包包装、紙、などの容器に封入することができる。添加剤が希釈剤の役目をするときは、生理活性成分のための基剤、増量剤、媒体として機能する固体、半固体、液体物質であってもよい。添加剤としては、例えば、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、およびメチルセルロースなどを例示することができる。更にタルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油のような滑沢剤； 湿潤剤； 乳化剤か分散剤； メチル− およびプロピルヒドロキシ安息香酸のような保存剤； 甘味剤； および芳香剤を加えることができる。また、この分野でよく知られている方法を採用して、患者に投与した後、活性成分の放出が速く、持続して、または遅くなるように製剤化することもできる。さらに、本発明で用いるブレフェルディンＡ類以外のエストロゲン様作用剤や抗動脈硬化作用剤などを併用することもできる。

【0046】

ここで、ブレフェルディンＡ自体は水に対して難溶である性質を有するが、菌糸体抽出物に含まれるα−グルカン、β−グルカン、β−ガラクトグルカン、キシログルカンや、蛋白多糖体複合成分によって、ブレフェルディンＡは、包摂された状態となっている。したがって、ヒメマツタケ菌糸体から抽出物を薬剤とする場合には、上記に例示した経口投与用固形製剤、賦形剤、錠剤等の使用を省略することもできる。

【0047】

なお、投与量としては、患者の症状、体重、年齢等によって異なり、一様に服用することは出来ないが、ブレフェルディンＡ類の量として、通常成分１日当たり約１０〜３０００ｍｇの範囲が好ましく、これを通常１日１〜４回に分けて投与するのが望ましい。

【0048】

以上の通り、ヒメマツタケ菌糸体抽出物または、これに含まれるブレフェルディンＡ類を有効成分とする本発明の薬剤は、エストロゲン様作用を発揮するため、例えば、更年期障害の改善、萎縮性膣炎などの泌尿生殖器障害、前立腺癌、前立腺肥大症、骨粗鬆症、動脈硬化、記憶障害、アルツハイマー病、血栓性疾患などの疾患の予防、治療に対して顕著な効果を発揮する。

【実施例】

【0049】

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明がこれらに実施例に限定されるものではない。

【0050】

＜実施例１＞ヒメマツタケ菌糸体の培養及び抽出方法
ヒメマツタケの種菌を株式会社モナより入手した。そして、担子菌用滅菌済みの液体培地にヒメマツタケの種菌を接種し、雑菌汚染を防止しつつ好気条件下に30℃で14日間振とう培養して菌糸体を生育させた。培養系を遠心分離して得た菌糸体を、グルカナーゼ処理後、凍結乾燥した。これを加工した粉末（以下、「ヒメマツタケ粉薬」という）を投与実験に用いた。また、ヒメマツタケ粉薬を１０倍重量の90℃ 以上の熱水で10分間抽出し、その熱水抽出物を遠心分離して、上澄み液を得た。この上澄み液（以下、「ヒメマツタケ抽出物」といい、図面中では、「ＡＢＥ」と示す）を以下の活性の評価などに供した。

【0051】

＜実施例２＞血液サンプルの調製方法
末梢血液サンプルは、ヒメマツタケ粉薬（250mg/日）を一年間連日投与の前後について、8人の高脂血症患者から採取した。投与を中断して４か月後に、投与を再開し3ヵ月間、ヒメマツタケ粉薬を投与し、血液サンプルを定期的に採取した。また、対照とする血液サンプルは6人の健常人から自発的に提供されたものを用いた。なお、全ての血液サンプルは東京女子医科大学の倫理委員会の認可のもと、個人の了解を得たものである。

【0052】

＜実施例３＞ヒメマツタケ粉薬の投与による血清中の酸化LDLレベルの抑制効果
（１）酸化LDLレベルの測定
最初に、家族性高脂血症、狭心症、心筋虚血と穏やかな非インシュリン依存性糖尿病を併発した56才の男性患者にヒメマツタケ粉薬（250mg/日）を与えた。投与前の、患者の心筋血流は左心室の前側部において、テクネチウムの蓄積が低くなっていたが（図１Ａ）、ヒメマツタケ粉薬の経口摂取後4ヵ月後に正常レベルのテクネチウムの蓄積が見られるように改善され（図１Ｂ）、そして、酸化LDLの量は11ヵ月後に5μgのLDLタンパク質につき1.5ngから0.1ngに減少した。

【0053】

この知見から、我々はヒメマツタケ粉薬が酸化LDLレベルを減らす化学物質を含有すると仮定した。そして、それによって脈管損害の回復を促進するとともに、動脈硬化の予防と改善が可能になると考えた。

【0054】

次に、我々は、高脂肪血症患者に対して、血清中の酸化LDLレベルに関して、ヒメマツタケ粉薬の連日投与の影響を検討した。ヒメマツタケ粉薬を1年間摂取した高脂血症患者（n=8）、及び健常人（n=6）から血液を採取し、血清酸化LDLレベルを測定した。その後、高脂血症患者は４ヶ月間摂取を中断した後、再び３ヶ月間摂取を再開した。ヒメマツタケ粉薬（250mg/日）を1年間連日投与する前と後について、血液を採取し、血清中の酸化LDLレベルをサンドイッチELISAにより測定した。血清中の酸化LDL分画は超遠心分離によって種々の血液成分から分離され、タンパク質濃度はBCA試薬（バイオラッド社；米国カリフォルニア州ヘラクレス）を使って決定された。希釈したLDL（50μg/ml）分画100μlを、抗・酸化フォスファチジルコリンモノクローナル抗体（DLH3; 0.5μg/well）でプレコートされたマイクロタイターウェルに加え反応させた後、ウェルを十分に洗浄し、ウェルに結合した酸化LDLを抗アポBタンパク質ポリクローナル抗体を１次抗体として、さらにアルカリホスファターゼを結合した２次抗体を用いて検出した。最終的に、ウェルはパラニトロフェニルリン酸（1mg/ml、1Mのトリエタノールアミン緩衝液（pH 9.8）に溶解したもの）とともに、10〜30分間、37℃でインキュベートした。酸化LDL量はマイクロプレートリーダーを用いて405nmの吸光度として測定し、銅を用いて作成した酸化LDLを標準物質として定量を行った。

【0055】

（２）結果
図２に示すように、対照群（健常人群）において、血清中の酸化LDLレベルは、１年を通して不変であった。これとは逆に、患者グループについては、注目に値する酸化LDLレベルの改善を見いだした。これらの結果は、ヒメマツタケ粉薬が高脂血症患者の血清中の酸化LDLレベルを低下させたことを示唆する。

【0056】

また、我々は、ヒト由来のLDL（0.2mg/mL）を、ヒメマツタケ抽出物（2、20、200μg/mL）、アセチルシステイン（AcCys：20μg/mL）あるいはブチルヒドロキシトルエン（BHT：2μg/mL）の存在下、5μM硫酸銅により37℃で3時間酸化反応を行い、反応後、TBARS（thiobarbituric acid-reactive substance）の量を測定した。その結果、図３に示すように、ヒメマツタケ粉薬がインビトロでは、LDLの脂質過酸化反応を促進しないことを明らかにした。

【0057】

したがって、ヒメマツタケ粉薬の投与による血清中の酸化LDLレベルの抑制効果は、特定の細胞による血清からの酸化LDLの除去によるものであることが示唆された。

【0058】

＜実施例４＞冠状動脈におけるヒメマツタケ粉薬の影響の免疫組織化学的な分析
（１）試験方法
高脂肪血の近交系日本白ウサギの2つの群（グループIおよびII）を用い、動脈硬化に関する、ヒメマツタケ粉薬の影響を調べた。

【0059】

約2.5kgの近交系白ウサギ１６匹を、以下の３つのグループにランダムに分けた。
・グループI：ヒメマツタケ粉薬投与無し（n=8）
・グループII：ヒメマツタケ粉薬投与有り（n=6）
・コントロール：無処理群（n=2）
最初にグループIおよびIIのウサギの大動脈を、バルーンチップカテーテルを使って損傷した。その後、すべてのウサギは別々に飼育し、それぞれのウサギは食物（100g/日）と水を自由摂取できるようにした。グループIおよびIIのウサギ群に、12週の間、高コレステロール含有飼料［0.5%のコレステロールを、CLEA Rabbit Diet CR-3（クリア社）に加えたもの］を与えた。次の23週間は、グループIIのウサギ群には0.01%のヒメマツタケ粉薬（3.3mg/kg：人間の摂取量と同じ換算比率にしたもの）を含むCR-3飼料を与えたが、グループIのウサギ群には通常のCR-3飼料を与えた。コントロールのウサギ群には、35週間にわたりCR-3飼料のみを与えた。この実験期間の終わりには、グループIとグループのIIのウサギの重量は、ともに約3.5kgになっていた。第12週と第35週の終わりに、ウサギの眼部内膜の厚みと、下行腹部大動脈の眼部内膜の厚みを超音波エコーを使って測定した。投与期間終了後（35週後）のウサギはネンブタール（50mg/kg）で麻酔し、解剖してその後の実験に用いた。

【0060】

さらに、すべてのウサギの組織切片と下行大動脈は、ヘマトキシリンエオジン（HE）、マソントリクロームおよびビクトリアブルーによる従来の方法を使用して染色した。免疫化学的な分析は、すべてのウサギに対して、抗ウサギマクロファージ11（RAM11）モノクローナル抗体、抗ヒト酸化LDLレセプター（LOX-1）モノクローナル抗体、Ki67（MIB-1）タンパク質に対するマウス抗体、平滑筋性アクチン（αSMA）に対する抗体、Bcl2系タンパク質検出のためのマウス抗BAXタンパク質モノクローナル抗体、酸化LDLレセプター検出のための抗CD36タンパク質抗体とヒトコラーゲンタイプI、IIIとVIに対するマウス抗体を使って行った。アポトーシスは、TUNEL法により評価した。

【0061】

（２）結果
高コレステロール飼料を23週間にわたって与えている間、グループIの4匹のウサギ（50%）は心筋梗塞で死亡したが、グループIIのウサギが早世することはなかった。グループＩおよびIIウサギの間では、脳、下垂体、骨格の筋肉、腎臓、尿管、大動脈、すい臓、精巣、直腸、肺、肝臓、脾臓、胸腺、胃、小腸と副腎については、相違点は見いだされなかった。しかし、冠状動脈だけは、組織学的な相違点が見いだされた。

【0062】

泡沫化マクロファージの浸潤による内膜増殖は、グループIウサギにおいて心房の冠状動脈と両心室において観測されたが、特に心室中隔において顕著であり、内膜アテローム硬化性障害（図４A）の存在が示された。RAM 11の免疫染色（図４B）によって明らかな泡沫化マクロファージと平滑筋αアクチンによって免疫染色（図４C）される平滑筋細胞を伴う顕著な隆起性色素増殖は、グループIウサギの冠状病巣で観察された。グループIIウサギ群（図４D-F）は、コントロールウサギ群（図４G-I）と明確な差異を示さず、冠状動脈に対する障害はほとんど見られなかった。

【0063】

これらの結果から、グループIウサギの冠状動脈ではアテローム性動脈硬化の症状が見られたが、グループIIウサギまたはコントロール群においては見られなかったことが明らかとなり、ヒメマツタケ粉薬を投与することによって、アテローム性動脈硬化が改善されることが示された。

【0064】

さらに、下行大動脈の内膜厚みを心エコー検査法によって測定することにより次の知見が得られた。

【0065】

高脂肪含有の飼料を与えた12週の間に、グループIおよびIIのすべてのウサギに対して、同様に内膜厚みの増大（I：0.63 ± 0.17 μm；II：0.67 ± 0.10 μm）が観察されたが、高脂肪の飼料の投与を停止した23週間後に、正常レベル（I：0.38 ± 0.04 μm；II：0.41 ± 0.08 μm）に戻った。対照群は、投与期間を通して、一貫して同じ内膜の厚み（0.40 ± 0 μm）を示した。この知見はヒメマツタケ粉薬が下行大動脈内膜の厚みを全体として変化させるものではなく、動脈硬化部位に直接作用することを示唆するものである。このことは、組織学的データによっても無処置の動物（図５）との顕著な違いとして明らかになった。

【0066】

大動脈の組織病理学では、繊維の増殖とマクロファージ浸潤で内膜が厚くなることが明らかになっている。RAM 11による免疫組織化学的な染色では、グループIIウサギ（図５K）に比較して、グループIウサギ（図５A）の顕著なマクロファージ増殖を示した。α-平滑筋アクチン、タイプI、III、IVコラーゲン、Ki67（MIB-1）、BAX、LOX-1とCD36について、内膜についての免疫染色は良好であったが、グループI（図５B-I）とグループIIウサギ（図５L-S）の違いは見いだせなかった。大動脈の内膜のTUNEL分析では、グループIウサギ（図５J）ではアポトーシスを示す細胞がグループIIウサギ（図５T）に比べて多いことが判明した。このことは動脈硬化に伴う細胞へのダメージがグループIウサギではより顕著であったことを示す。

【0067】

＜実施例５＞ヒメマツタケ菌糸体抽出物のエストロゲン様作用
我々は、ヒメマツタケ菌糸体抽出物による脈管損害を改善するメカニズムがエストロゲン様作用によるものではないかと考え、乳癌由来のMCF-7細胞の増殖に対するヒメマツタケ抽出物の影響を検討した。
（１）Sulforhodamine B（SRB）比色分析評価
ヒト乳癌由来MCF-7細胞は、JCRB Cell Bank（国立医薬品食品衛生研究所、東京）から入手し、RPMI 1640培地（インビトロジェン；米国カリフォルニア州カールスバッド）で、5%の二酸化炭素の存在下、10%の胎児のウシ血清（FBS）を補充して継代培養した。17βエストラジオール（以下、E2という）またはヒメマツタケ抽出物による細胞の処理のために、培地を10%のデキストランコートチャーコール処理をしたFBS（DCC-FBS）とフェノールレッドを含まないRPMI 1640培地と交換した。SRB分析評価は、ポーウェルズらによる報告（2003年）にしたがって行った。
(２) 分析結果
図６に示すように、抽出物濃度が4μg/mlで細胞増殖阻害率が50%になり、6 及び8μg/mlでは80%に至ったことから、ヒメマツタケ抽出物は細胞増殖抑制に対して量的依存性を示すことが明らかになった。

【0068】

このように、ヒメマツタケ菌子体の抽出物は、実施例４で確認された脈管損害の改善作用を有するものの、エストロゲンの持つ癌細胞増殖活性は有していないことが確認された。本実施例の結果は、ヒメマツタケ菌子体の抽出物を投与することの安全性を示すものである。

【0069】

＜実施例６＞遺伝子発現レベルでの考察１
ヒメマツタケ抽出物を用いて、遺伝子発現レベルでエストロゲン様作用を示すかどうかを、DNAマイクロアレイを用いて調べた。

【0070】

（１）cDNAマイクロアレイアッセイ
cDNAマイクロアレイは、エストロゲンに応答する172の遺伝子を含む全部で203の遺伝子のcDNA断片（500bp〜1.5kb）をガラス基板上に機械的にスポットしたものであり、インフォジーンズ社（筑波）によって製造されたもの（商品名EstrArray）を用いた。EstrArray分析評価のために、MCF-7細胞を、10%のDCC-FBSを含み、フェノールレッドを含まないRPMI 1640培地で3日間培養し、10nMのE2、2μg/mlのヒメマツタケ抽出物、または溶媒のみ（DMSOまたは無菌のミリＱ水をコントロールとしたもの）で72時間処理した。全RNAはISOGEN（和光純薬社；東京）を用いて、製品の指示書に従って単離した。アンチセンスRNA（aRNA）は、RiboAmp RNA Amplificationキット（タカラバイオ；日本）を使用して、5 mgの全RNAから精製した。EstrArray分析評価は、別々の培養細胞を用いた3回の独立した実験結果をもとに行った。

【0071】

得られたデータの処理は、それぞれの遺伝子について、Cy3及びCy5のシグナル値が３０かそれ以上、あるいは、対応するシグナルエリアが50かそれ以上の場合にのみ行ない、発現比率の計算はMicrosoft Excelを使用して行なった。２つのスポットから得られたCy3あるいはCy5のシグナル値の平均をそれぞれ求め、Cy5値に対するCy3値の比率を各々の遺伝子について計算した。得られたデータを標準化するために、28のコントロール遺伝子について、まずCy3とCy5のシグナルエリアが100未満の遺伝子を除去し、次に、残りの遺伝子のCy3とCy5のシグナル強度の比の平均を求めた。そして最後に、28のコントロール遺伝子について求めた平均のCy3/Cy5値を用いて、すべての遺伝子について標準値を計算した。標準化したCy3/Cy5値はさらにlog₂変換してそれ以降の統計分析に用いた。

【0072】

相関解析とｔ検定は、SPSS 12.0Jソフトウェアを使用して実行した（SPSS Japan；東京）。120の遺伝子のUniGene名は、Entrez Geneデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）登録名を用いた。また、これらの120の遺伝子は、再現性の極めて高いエストロゲンに応答する遺伝子として選択されたものである。

【0073】

（２）結果
図７に示すように、10nM E2と2μg/mlの抽出物で処理した細胞の間で類似した遺伝子発現プロファイルが得られた（相関係数またはR = 0.63）ことから、抽出物にエストロゲン様の作用を示す物質が存在している可能性が示された。

【0074】

＜実施例７＞遺伝子発現レベルでの考察２
抽出物とE2の間で遺伝子発現プロファイルの相違を見つけるために、合計172のエストロゲン応答遺伝子について、ANOVA検定とｔ検定を行なった。表1に、10 nM E2とヒメマツタケ抽出物処理による遺伝子発現の変化度（3回のEstrArray 解析によって得られた値をlog₂変換した値の平均の比）の間で統計的に有意な変化を示した遺伝子を示す。アクセッション番号はEntrez Geneデータベース登録のそれぞれの遺伝子の番号を示す。大部分の遺伝子が類似した応答を示したが、6つの遺伝子（CEBPB、RBBP8、IER3、DHCR24、ARHGDIAとIGFBP5）はこの処理に対して、かなり異なる応答（P<0.05）を示した。

【0075】

【表1】

【0076】

（１）リアルタイム定量RT- PCR
これらの違いを確かめるために、リアルタイム定量RT-PCRを行った。
リアルタイム定量逆転写（RT）-PCRは、SYBRグリーンキット（インビトロジェン社；米国カリフォルニア州カールスバッド）で２段階qRT-PCR法を使って実行した。PCRは、表２に記載したプライマーを用いて、それぞれの遺伝子について3回行った。PCRサイクルは、LightCycler（ロシュ社；ドイツ国マンハイム）を用いて、まず、3分間95℃で変性し、そして、95℃で5秒間と60℃で30秒間のサイクルを50サイクル行った。β-アクチンを内部標準として用いた。

【0077】

【表2】

【0078】

（２）結果
表１、図８に示すように、選んだ遺伝子の中で、DHCR24以外の全ての遺伝子は統計学的に有意な遺伝子発現の違いを示した。したがって、E2とヒメマツタケ抽出物の細胞に対する影響を比較すると、一部の遺伝子については明確な差異を示すが、多くの遺伝子については遺伝子発現レベルでは区別できないくらいよく似た効果を与えることが明らかになった。

【0079】

＜実施例８＞ヒメマツタケ抽出物によって誘発されるErk1/2、Aktとp38の活性化
（１）試験方法
ヒメマツタケ抽出物によって急激に誘発される細胞内シグナル伝達を調べるために、ヒトの臍静脈内皮細胞（HUVEC細胞）とマクロファージ細胞由来のTIB-67細胞を用いた。

【0080】

HUVEC細胞（Cambrex社；米国ニュージャージー州イーストルサフォード）は、10%（v/v）のデキストランコートしたチャーコールで処理した子牛血清（DCC-FBS）を補充・添加したフェノールレッドを含まないダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）（インビトロジェン社；米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、95%の空気、5％の二酸化炭素のもと湿った環境で培養した。

【0081】

マクロファージ由来のTIB-67細胞はATCC（米国バージニア州マナサス）から入手し、10%のFBSを含むRPMI 1640培地を用いて、5%の二酸化炭素の存在下、37℃で継代培養した。

【0082】

血清の枯渇処理を施した細胞にヒメマツタケ抽出物（100μg/mL）、E2（10 nM）あるいは溶媒のみを与えて刺激し、表示の時間の後に細胞を溶解してタンパク質を精製し、SDS緩衝液に溶解した。タンパク質は5-20％ゲル勾配のSDSポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブランに転写後、それぞれのリン酸化抗体を用いて検出した。全タンパク量はそれぞれ全タンパク質を検出する抗体を用いて検出した。エストロゲン応答の阻害実験のために、細胞を1μM ICI 182,780（ICI）で15分間処理した。

【0083】

（２）結果
HUVEC細胞をヒメマツタケ抽出物で処理した際には、急激に誘発されるエストロゲン様作用がErk1/2とAktの活性化によるものであることが明らかになったが、TIB-67細胞ではそのような活性化は見られなかった（図９）。ヒメマツタケ抽出物によるErk1/2とAktの迅速な活性化は、エストロゲンアンタゴニストICI 182,780（ICI）の処理では抑制されないことが観察されたことから、ERαやERβとは異なったシグナル経路が抽出物による応答経路には存在することが推測された。Erk1/2とAktの活性化状態は30分以内に元のレベルに戻ったことは注目に値する。

【0084】

本実施例では、エストロゲンアンタゴニストICI 182,780がエストロゲン（E₂）とは異なり、Erk1/2及びAktのリン酸化を阻害しなかったが、この結果はヒメマツタケ抽出物がエストロゲン様作用を持たないことを示すのではなく、ヒメマツタケ抽出物の示すエストロゲン様作用がエストロゲンとは異なるシグナル伝達経路を持つことによるものである。実際に、エストロゲン様作用を持つ化学物質がエストロゲンとは異なるシグナル伝達経路を示す例としては、エストロゲン様作用を持つ化学物質の代表例として知られているビスフェノールＡがGPR30受容体やエストロゲン関連受容体γ（ERRγ）を介して作用を示す例が報告されている（Filardoら、Mol. Endocrinol.誌、１６巻、７０〜８４ページ、２００２年；Okadaら、Envirn. Health Perspect.誌、１１６巻、３２〜３８ページ、２００８年）。また、エストロゲン様作用を持つ化学物質がエストロゲンとは異なるシグナル伝達経路を示すことは、エストロゲンの持つ発癌リスク・血栓リスクや組織に対する特異性の低さなど、エストロゲンの持つ欠点を改善する根拠になるものである。

【0085】

＜実施例９＞酸化LDLによるシグナルに対する抑制効果
（１）試験方法
酸化LDL（OxLDL）刺激によるErk1/2、Aktおよびp38MAPキナーゼの活性化に対するヒメマツタケ抽出物の効果について検討した。

【0086】

HUVEC及びTIB-67細胞をヒメマツタケ抽出物（100μg/mL）、LDL（50μg/mL）、酸化LDL（50μg/mL）あるいは溶媒のみで6時間処理し、酸化LDLシグナルの阻害作用を調べるために、ヒメマツタケ抽出物（100μg/mL）あるいは抗LOX-1抗体（Ab：5μg/mL）を酸化LDLを加える1時間前に細胞に加えた。タンパク質はSDSサンプル緩衝液を用いて抽出し、ウエスタンブロッティングにより解析した。

【0087】

全タンパク質はSDS緩衝液で抽出し、氷上で30秒間超音波処理した。SDS-PAGE用サンプル調製用緩衝液を加えて95℃で5分間インキュベーションした後、タンパク質サンプル（20mg）は5-20%勾配ゲル法によるSDS-PAGEによって分離し、セミドライトランスファーセル（BIO-RAD社；米国カリフォルニア州ヘラクレス）を用いて、1mA/cm²で１時間の条件で、ニトロセルロースメンブラン（ミリポア社；米国マサチューセッツ州ビルリカ）へ転写した。

【0088】

リン酸化Erk1/2（P-Erk1/2）、リン酸化Akt（P-Akt）、及びリン酸化p38（P-p38）は、0.1%のTween-20と5%のBSAを含んでいるトリス緩衝液（TBST-BSA）の中で事前にブロックしたメンブランに対して用いた。メンブランは、Erk1/2、P-Erk1/2、Akt、P-Akt、p38、P-p38に対する抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社；米国カリフォルニア州サンタクルーズ）を十分（1:200から1:1000）に希釈した後に、TBST-BSA中で、終夜、4℃の条件で反応させた。反応後、ウサギまたはマウスの抗原抗体複合体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合したウサギまたはマウスIgG（セルシグナリングテクノロジー社）に対するヤギ抗体をTBST-BSAで3,000倍に希釈したものを用いて検出した。そして、各タンパク質のバンドはECL-Plusウエスタンブロット検出法（アマシャムファルマシアバイオテック社；米国イリノイ州アーリントンハイツ）を用いることで視覚化した。

【0089】

（２）結果
酸化LDLによって誘発されるErk1/2、 Aktあるいはp38の迅速な活性化反応が抗LOX-1（酸化LDLレセプター）抗体（Ab）と同様にヒメマツタケ抽出物によっても抑制された（図１０）。すなわち、ヒメマツタケ抽出物が、酸化LDL応答をターゲットとするアテローム性動脈硬化症治療と同じように利用できることを示唆している。

【0090】

＜実施例１０＞遺伝子発現レベルでの解析
次に、ヒメマツタケ抽出物の血管内皮細胞に対する作用を遺伝子発現レベルで解析を行った。リアルタイムRT-PCRを用いて、HUVEC細胞におけるGPX3、LOX-1、及びeNOSのmRNA蓄積レベルの解析をした。HUVEC細胞をヒメマツタケ抽出物（100μg/mL）、酸化LDL（50μg/mL）あるいは溶媒のみで24時間処理した後に全RNAを調製した。

【0091】

その結果を図１１に示す。ヒメマツタケ抽出物は活性酸素種（reactive oxygen species）の減少に関与する２つの遺伝子、グルタチオンペルオキシダーゼ3（GPX3）とαシンヌクレイン（SNCA）、の発現を上昇させた。エストロゲンはエストロゲン受容体経路とは別にGPX3とSNCA遺伝子の発現を上昇させることがわかっており、この結果は、ヒメマツタケ抽出物によって誘発された抗酸化作用が血清酸化LDLレベルの低下（図１）に貢献していることを示すと考えられる。さらに、ヒメマツタケ抽出物は、一酸化窒素合成酵素遺伝子（eNOS）の発現を上昇させる。酸化LDLによると、eNOS遺伝子の発現減少が誘発されるが、これに、ヒメマツタケ抽出物を添加すると、eNOS遺伝子の発現が上昇した（図１１）。ヒメマツタケ抽出物で処理した細胞では、MCP-1（monocyte chemotactic protein-1）遺伝子の発現を減少させ、酸化LDLに応答するMCP-1の遺伝子発現を阻害する。したがって、これらの結果は、eNOS遺伝子の結果をよく説明できる。

【0092】

さらに、ヒメマツタケ抽出物のGPX3やeNOS遺伝子に対する影響はタンパク質レベルでも確認するためにHUVEC細胞におけるGPX3、及びeNOSタンパク質のウエスタンブロッティング解析を行った（図１２）。

【0093】

結果を図１２に示す。図１２に示すように、ヒメマツタケ抽出物は、eNOS、GPX3遺伝子の発現を上昇させることが分かる。

【0094】

したがって、実施例９、１０の結果から、図１３の模式図に示すように、ヒメマツタケ抽出物は、Akt及びErkタンパク質の活性化を通じてeNOS、GPX3、及びSNCA遺伝子の発現を上昇させることが分かった。GPX3及びSNCA遺伝子はミトコンドリアにおける活性酸素種（ROS）の発生を減少させる。一方で、eNOSタンパク質はMCP-1遺伝子発現を低下させ、一酸化窒素（NO）濃度を上昇させることによりバランスの取れた血管機能を維持する役割を果たしていることが分かった。

【0095】

＜実施例１１＞ブレフェルディンＡの単離
実施例１で得られた培養菌糸体の乾燥体100gに、2リッターの酢酸エチルを加えて2時間撹拌する。撹拌後の溶液を、濾過し、上澄み液を、40℃以下で減圧乾固した。得られた濃縮物を80％メタノールに溶解し、HPLC（条件：5mg/50mlを逆相カラム5C18-200に吸着し、水でカラムを洗浄後、0-60%のアセトニトリル勾配で1ml/minの速度で溶出した）で210nmで検出して、分画を得た。

【0096】

得られたそれぞれの分画について、Erk1/2リン酸化活性（実施例９で示したリン酸化Erk1/2及び全Erk1/2の定量によって得られるErk1/2リン酸化活性）を測定した結果、図１４Ａに示すように、50-60％アセトニトリル溶出分画である、分画番号51-60のみに強いErk1/2リン酸活性が示された。
したがって、同分画をさらにHPLCにより同じ条件で精製して、リン酸化活性を示した分画番号58（図１４Ｂ）を、再クロマトグラフィーを行い、単一成分として100gの培養菌糸体の乾燥体から148mgのErkリン酸活性成分を得た。

【0097】

このようにして得られた活性成分は、マクロラクトン型の化学構造と考えられ以下の物性を示した。以下の値は (+)-ブレフェルディンＡの文献値（Tetrahedron Letters, Volume 47, Issue 37, 11, 6527-6530）と、すべて一致し、(+)-ブレフェルディンＡであると同定された。なお、比較実験には和光純薬社製の標品を用いた。

【0098】

（測定によって得られたデータ）
１）比旋光度（メタノール中）：[a]²⁵_D = +92.09。方法：（19.6 mg/5mLメタノール）。

【0099】

２）NMRデータ：¹H NMR (CD₃OD, 75 MHz) δ 7.46 (dd, 1H), 5.82 (ddd, 1H), 5.76 (ddd, 1H), 5.27 (dd, 1H), 4.84 (qdd, 1H), 4.22 (m, 1H), 4.05 (td, 1H), 2.44-0.87 (m, 12H), 1.25 (d, 3H); ¹³C NMR (CD₃OD, 75 MHz) δ 167.2, 153.9, 136.9, 130.2, 116.5, 75.4, 72.0, 71.8, 52.0, 44.2, 42.9, 40.6, 33.8, 31.8, 26.8, 19.9。

【0100】

３）FT-IRデータ： 3366, 2927, 1712, 1644, 1449, 1257 cm^-1。方法：試料1.06mgを秤量し、KBr 200.8mgと均一に混合後、FTS-135装置（Bio-Rad Laboratories社製）で2 cm^-1で32回測定した。

【0101】

上記の実験で示されたように、ブレフェルディンＡはヒメマツタケ菌糸体に対して、乾燥重量換算で約0.15％含有されている。この含量は、菌類の基本構成物を除く、二次代謝物の含量としてはかなりの高濃度であり、ブレフェルディンＡは、菌糸体の生産する量的にも主要な化学成分の一つであると考えられる。

【0102】

そして、上記の実験でブレフェルディンＡを含む分画のみが、Erk1/2リン酸活性を示していることを考慮すると、菌糸体抽出物のエストロゲン様作用や動脈硬化などに対する治療効果に、ブレフェルディンＡが重要な役割を果たしていることが示される。

【0103】

＜実施例１２＞SRB試験によるブレフェルディンＡの細胞増殖活性評価
（１）解析法
ヒト乳癌由来MCF-7細胞を、5%の二酸化炭素の存在下で培養し、24ウェル培養プレートで10⁴細胞/ウェルまで増やし、10 nM のE₂、あるいは、10 pM〜1μMのブレフェルディンＡ（BFA）を添加し、3日間培養した。その後、4℃の10％トリクロロ酢酸で固定し、SRB試験により細胞増殖活性の評価を行った。結果は対照実験の値を100％として表示した。それぞれの試験は6回行い、標準偏差（SD）を算出した。
（２）結果
結果を図１５に示す。いずれの濃度においてもブレフェルディンＡは細胞増殖活性を示さなかった。一方で、1μMでは細胞増殖阻害作用を示した。この結果は、「＜実施例５＞ヒメマツタケ菌糸体抽出物のエストロゲン様作用」で得られた結果と一致する。

【0104】

＜実施例１３＞ブレフェルディンＡによるErk1/2タンパク質の活性化
（１）解析法
「＜実施例８＞ヒメマツタケ抽出物によって誘発されるErk1/2、Aktとp38の活性化」で用いた方法により、ブレフェルディンＡによるErk1/2タンパク質の活性化の評価を行った。
（２）結果
結果を図１６に示す。ブレフェルディンＡはErk1/2タンパク質のリン酸化を促進することがわかった。この反応はエストロゲンアンタゴニストのICI 182,780（ICI）では阻害されなかった。この結果は、「＜実施例８＞ヒメマツタケ抽出物によって誘発されるErk1/2、Aktとp38の活性化」で示したヒメマツタケ菌糸体抽出物の結果と一致する。

【0105】

＜実施例１４＞レポーター遺伝子試験によるブレフェルディンＡのエストロゲン活性評価１
（１）解析法
ヒトのエストロゲン受容体α遺伝子のエストロゲン応答配列（ERE）をルシフェラーゼ遺伝子上流に導入したレポーター遺伝子試験用のプラスミドT3(A+B)-pTK-Lucを用いてエストロゲン活性の評価を行った。試験法とプラスミドは文献（Li et al., 2002：Gene 294, 279-290）に従った。以下に簡単に説明する。10⁵細胞あたり2.0μgのレポーター遺伝子DNAをβガラクトシダーゼ遺伝子DNAと混ぜて、Lipofectin (Gibco-BRL社)によりMCF-7 細胞にトランスフェクションを行った。24時間培養した後に、E₂（10 nM）、ブレフェルディンＡ（BFA：0.01 nM、1 nM、100 nM）、あるいは、それぞれの濃度のヒメマツタケ菌糸体抽出物（ABE）を添加後、さらに24時間培養した。ルシフェラーゼ活性はキットを用いて測定し、結果はβガラクトシダーゼ遺伝子の発現量で補正し、対照実験の値を100％として表示した。それぞれの試験は4回行い、標準偏差（SD）を算出した。
（２）結果
結果を図１７に示す。ブレフェルディンＡ及びヒメマツタケ菌糸体抽出物のいずれにも有意なエストロゲン応答配列依存のルシフェラーゼ活性が見られた。これは、ブレフェルディンＡがエストロゲン応答配列依存的にプロモーターを活性化することを意味しており、すなわち、ブレフェルディンＡにエストロゲン活性があることを示す。

【0106】

＜実施例１５＞レポーター遺伝子試験によるヒメマツタケ菌糸体抽出物のエストロゲン活性評価
（１）解析法
エストロゲン応答配列（ERE）を有するヒトのエストロゲン受容体α遺伝子のプロモーターＡとＢをルシフェラーゼ遺伝子上流に導入したレポーター遺伝子試験用のプラスミドpG-ERα-ABを用いてエストロゲン活性の評価を行った。試験法とプラスミドは文献（Inoue et al., 2002：J. Pharmacol. Toxicol. Methods 47, 129-135.）に従った。以下に簡単に説明する。10⁵細胞あたり2.0μgのレポーター遺伝子DNAを、Lipofectin (Gibco-BRL社)を用いてMCF-7 細胞にトランスフェクションを行った。24時間培養した後に、E₂（10 nM）、ヒメマツタケ菌糸体抽出物（ABE：0.01〜8μg/ml）、あるいは、それぞれの濃度のヒメマツタケ菌糸体抽出物に1μMのICI 182,780（ICI）を加えた試料を添加後、さらに24時間培養した。ルシフェラーゼ活性はキットを用いて測定し、対照実験の値を100％として表示した。それぞれの試験は4回行ない、標準偏差（SD）を算出した。**印は、危険率（p値）が0.01未満であることを示す。
（２）結果
結果を図１８に示す。ヒメマツタケ菌糸体抽出物には有意なエストロゲン応答配列依存のルシフェラーゼ活性が見られた。これは、ヒメマツタケ菌糸体抽出物にエストロゲン活性があることを示す。この活性は、エストロゲンと同様に、アンタゴニストであるICI 182,780によって阻害を受けた。

【0107】

＜実施例１６＞レポーター遺伝子試験によるブレフェルディンＡのエストロゲン活性評価２
（１）解析法
試験は、「レポーター遺伝子試験によるブレフェルディンＡのエストロゲン活性評価（その１）」で示した方法で行った。E₂（10 nM）、あるいは、ブレフェルディンＡ（0.01 nMあるいは1 nM BFA）を添加し、2群に分け、1群には1μMのICI 182,780（ICI）を添加し、もう1群には添加しなかった。
（２）結果
結果を図１９に示す。ブレフェルディンＡの示すエストロゲン応答配列依存のルシフェラーゼ活性はICI 182,780によって阻害を受けた。また、この結果は、「＜実施例１３＞ブレフェルディンＡによるErk1/2タンパク質の活性化」で得られたICI 182,780非依存的Erk1/2活性化の結果と異なるが、＜実施例１５＞で示したヒメマツタケ菌糸体抽出物の結果と一致している。MCF-7細胞の増殖活性を示さない現象と合わせて、ブレフェルディンＡに特徴的な現象と考えられる。

【0108】

＜比較例１＞子実体との活性の比較
本実施例で用いた培養菌糸体の乾燥体得られるブレフェルディンＡによる効果は、子実体を用いた場合は期待できないことが以下の比較例により明らかになった。

【0109】

（１）子実体試料の由来と抽出方法
子実体試料は次の３つの市販品を用いた。１つは乾燥子実体（Ａ社）であり、残りの２つは子実体の抽出物（エキス）を加工したものである。

【0110】

Ｉ社：株式会社大愛
（製品名）乾燥「神仙茸」：子実体Ａとする
（調製法）5 gの乾燥アガリクス茸を細かく砕き、40 mlの沸騰水で20分間抽出。

【0111】

II社：株式会社Ｓ・Ｓ・Ｉ SFB：子実体Ｂとする
（製品名）協和のアガリクス茸仙生露顆粒SSG-PLUS35
（調製法）2袋（4.0 g）を水40 mlに溶解。

【0112】

III社：有限会社吉田コーゲイYN：子実体Ｃとする
（製品名）スーパーゴールドアガリクスエキス顆粒2800（1包中に乾燥アガリクス茸2800 mg相当のエキス顆粒を含む。これは生のアガリクス茸28 gに相当する）。

【0113】

（調製法）2包（5.6 g）を水40 mlに溶解。

【0114】

（２） 抽出後の処理
水（あるいは沸湯水）で抽出後はMILEX社の0.45 μmフィルターでろ過し、3ml乾燥して重量を測定した。さらに、濃度を5.0 mg/mlに調整して 、HPLC分析（和光純薬社・逆相カラム5C18-200を用いてメタノールで溶出、210nm吸収波長で検出）を行った。全分画に対するブレフェルディンＡ溶出分画のパターンを比較した。水抽出物の乾燥重量は菌糸体抽出物も含めていずれも1〜5 g程度であり、子実体抽出物が特に高い抽出効率を示すということはなかった。

【0115】

（３） 結果
結果を図２０に示す。本実施例で用いたアガリクス（ヒメマツタケ）菌糸体標品（図２０Ａ）とアガリクス子実体標品３点を比較した（図２０Ｂ、Ｃ、Ｄ）。いずれの子実体標品についても、ブレフェルディンＡが溶出されるHPLCの保持時間では、顕著なピークを示されなかったが、本実施例で用いたヒメマツタケ菌糸体標品では顕著なピークを示し、その量比はその積分値からの換算では、少なくとも150倍であることが明らかになった。このことにより、ブレフェルディンＡは子実体にはほとんど存在しなく、子実体を治療に用いても、ブレフェルディンＡに由来する効果はほとんど期待できないことが示された。このことからも、ヒメマツタケ菌糸体標品に見られた効果は、ヒメマツタケ菌糸体に特有のものであり、子実体における効果と異質のものであることが判明した。

【0116】

＜比較例２＞様々な溶媒によるブレフェルディンＡの抽出効率
（１） 解析方法
ヒメマツタケ培養菌糸体乾燥物2.5 gから、Ａ：水抽出、Ｂ：エタノール抽出、Ｃ：メタノール抽出、Ｄ：酢酸エチル抽出を行い、MILEX社の0.45 μmフィルターでろ過後、一部乾燥して重量を測定した。さらに、濃度を5.0 mg/mlに調整して 、HPLC分析（和光純薬社・逆相カラム5C18-200を用いてメタノールで溶出、210nm吸収波長で検出）を行い、ブレフェルディンＡ溶出パターンを比較した（図にピーク位置を示した）。

【0117】

（２） 結果
ヒメマツタケ菌糸体標品を様々な溶媒を用いて抽出を行い、得られた分画におけるブレフェルディンＡの重量を定量した。結果（BFA分画の重量％）は、図２１に示すように、0.015％（水抽出）、0.036％（エタノール抽出）、0.029％（メタノール抽出）及び0.012％（酢酸エチル抽出）であり、いずれの溶媒を用いてもブレフェルディンＡは抽出されることが判明した。

【図7】

【図13】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]