特許 5804420 植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与する遺伝子ならびにその利用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5804420

(24)【登録日】2015年9月11日

(45)【発行日】2015年11月4日

(54)【発明の名称】植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与する遺伝子ならびにその利用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20151015BHJP

   A01H 5/00 20060101ALI20151015BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20151015BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20151015BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20151015BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A01H5/00 A

   C12N5/00 103

   C12Q1/68 A

   C12Q1/02

【請求項の数】5

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2011-546121(P2011-546121)

(86)(22)【出願日】2010年12月13日

(86)【国際出願番号】JP2010072413

(87)【国際公開番号】WO2011074553

(87)【国際公開日】20110623

【審査請求日】2013年12月12日

(31)【優先権主張番号】特願2009-288518(P2009-288518)

(32)【優先日】2009年12月18日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100138955

【弁理士】

【氏名又は名称】末次 渉

(74)【代理人】

【識別番号】100109449

【弁理士】

【氏名又は名称】毛受 隆典

(72)【発明者】

【氏名】高橋 美佐

(72)【発明者】

【氏名】森川 弘道

(72)【発明者】

【氏名】江面 浩

【審査官】 菅原 洋平

(56)【参考文献】

【文献】 KIM C J et al.，Arabidopsis thaliana At1g30250 gene, complete cds.，GenBank Accession BT015635，２００９年１２月 １日，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/51972059?sat=NCBI&satkey=35652806，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/51972059?sat=NCBI&satkey=35652806

【文献】 CHEUK R et al.，Arabidopsis thaliana At1g30250, complete cds.，GenBank Accession BT015325，２００９年１２月 １日，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/51536419?sat=NCBI&satkey=35650394，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/51536419?sat=NCBI&satkey=35650394

【文献】 TAKAHASHI M et al.，Genes involved in the plant vitalization by atmospheric nitrogen oxides on Arabidopsis thaliana.，Plant Cell Physiol.，２００９年 ３月１７日，vol. 50, suppl.，p. 97 (Abstract 1pI14(233)) [online]

【文献】 高橋 美佐、他，大気中窒素酸化物の植物バイタリゼーション効果（１），第27回日本植物細胞分子生物学会（藤沢）大会・シンポジウム要旨集，２００９年 ７月２９日，p. 182

【文献】 AMASINO R et al.，Germplasm: WISCDSLOX445D11 /Stock: CS856223，Arabidopsis Biological Resource Center，２００９年１１月 ３日，http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=germplasm&id=1008049261，ＵＲＬ，http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=germplasm&id=1008049261

【文献】 TAKAHASHI M et al.，Genes responsible for plant vitalization by atmospheric nitrogen dioxide in Arabidopsis thaliana.，Plant Cell Physiol.，２０１０年 ３月１２日，vol. 51, suppl.，p. 116 (Abstract 3pF12(328)) [online]

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物体の生育を促進し、かつ植物体のバイオマス量を増加させる機能を有するタンパク質をコードする、以下の（ａ）ないし（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡを含む特定の遺伝子の発現が増強された形質転換植物体であって、
内在性の該特定の遺伝子とは別に１コピー以上の該特定の遺伝子を導入すること、および／または、該特定の遺伝子を含むベクターを導入することにより、該特定の遺伝子の発現が増強され、
植物体の生育が促進し、かつ植物体のバイオマス量が増加したことを特徴とする、形質転換植物体。
（ａ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項2】

前記形質転換植物体は、キク科植物、ナス科植物、アカザ科植物、イネ科植物、アブラナ科植物、マツ科植物、スギ科植物、トウヒ科植物、ヒノキ科植物、フトモモ科植物、ヤナギ科植物、ウリ科植物またはアオイ科植物のいずれかの植物に由来することを特徴とする、請求項１に記載の形質転換植物体。

【請求項3】

請求項１に記載の形質転換植物体の子孫またはクローン。

【請求項4】

植物体の生育を促進し、かつ植物体のバイオマス量を増加させる機能を有するタンパク質をコードする、以下の（ａ）ないし（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡを含む、植物細胞中の特定の遺伝子の発現を増強する工程であって、植物細胞に、内在性の該特定の遺伝子とは別に１コピー以上の該特定の遺伝子を導入すること、および／または、該特定の遺伝子を含むベクターを導入することにより、該特定の遺伝子の発現を増強する工程と、
該植物細胞から植物体を再生または育成する工程と、
を含むことを特徴とする、植物体の生育促進およびバイオマス量増加方法。
（ａ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項5】

植物体の生育を促進し、かつ植物体のバイオマス量を増加させる機能を有するタンパク質をコードする、以下の（ａ）ないし（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡを含む、植物体の一部における特定の遺伝子の発現量を検出する工程を含む生育促進植物体のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与する遺伝子、ならびに該遺伝子を利用した形質転換体、特に形質転換植物体、形質転換植物体の作出方法、および、生育促進植物体のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

農作物および園芸作物等の収穫量を増加させるために、植物の生育を促進させる多くの試みが行なわれている。例えば、シュードモナス・フルオレッセンスＳＣ−２９株を植物に供給することにより、植物の栽培期間の短縮化及び収穫量の増大を行いうることが報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、植物が植えられている土地の気候および土質が本株に適しているとは限らず、適用対象の土壌に生育する微生物との生存競争により、生存し続けることができない場合がある。このように、この方法では、本株が安定に作用し、生存し続けることができないと欠点があり、さらに散布に労力を要するという欠点がある。

【0003】

また、磁力又は電気による周期的な刺激を植物に付与することにより、植物中のリン濃度や植物の生育量を増大させうることが報告されている。（特許文献２参照）。しかしながら、広大な土地に適用する場合の装置のコストが高く、土中のイオン量、水分量、土質自体に依存して磁力又は電気の条件は異なるため条件設定が難しく、実用性に乏しいという欠点がある。

【0004】

ヨウ素−シクロデキストリン包接化物を植物に供給することにより、発芽後の植物を良好に生育させうることが報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、このヨウ素−シクロデキストリン包接化物を用いた場合、種子の発芽が抑制されるという欠点があり、また、散布に労力を要するという欠点がある。

【0005】

本発明者らは、窒素酸化物（ＮＯｘ）が植物の生育に関連するシグナルとして働き、植物の生育を促進することを報告している（特許文献４参照）。特許文献４には、植物の生育環境を、ＮＯｘ濃度５〜２００ｐｐｂの環境に調整することによって、植物の生育を促進し、且つバイオマス収量を増加させることができると記載されている。具体的には、ＮＯｘ濃度５〜２００ｐｐｂの環境下で生育させることにより、ニコチアナ・プランバジニフォーリア（Nicotiana plumbaginifolia）及びシロイヌナズナＣ２４（Arabidopsis thaliana C24）の生育が促進され、それらの作物の収量を増加させることができることが記載されている。

【0006】

また、レタス（Lactuca sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キュウリ（Cucumis sativus）、及びカボチャ（Cucurbita moschata）を、ＮＯｘ濃度５〜２００ｐｐｂの環境下で生育させることにより、生育が促進され、作物の収量が増加することが報告されている（非特許文献１）。

【0007】

さらに、ケナフ（Hibiscus cannabinus）をＮＯｘ濃度５〜２００ｐｐｂの環境下で生育させることにより、生育が促進され、バイオマス収量が増加することも報告されている（非特許文献２）。

【0008】

大気中のＮＯｘの主な発生源は自動車の排気ガスであるが、現在の実際の大気中の平均ＮＯｘ濃度は２０ｐｐｂ程度と考えられる。また、ＮＯｘ（ＮＯ_２、ＮＯ等）は、光化学スモッグや酸性雨などを引き起こす大気汚染原因物質であるため、特に毒性の高い二酸化窒素（ＮＯ_２）は、大気汚染防止法によって環境基準が定められている。そのため、ＮＯｘの濃度を最も好ましい１００〜２００ｐｐｂの範囲にするためには、ＮＯｘボンベ、燃焼させる灯油およびエンジン等によるＮＯｘ発生装置と、ＮＯｘの除去手段と、これらを制御することにより所定のＮＯｘ濃度に調整する制御装置とが必要となってくる。このため引用文献４に記載の方法では、莫大なコストがかかるという欠点がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２００３−２１２７０８号公報

【特許文献2】特開２００３−３１００５７号公報

【特許文献3】特開２００３−２２６６０６号公報

【特許文献4】特開２００５−２７００９８号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Adam, S.E.H. et al., “Atmospheric nitrogen dioxide at ambient levels stimulates growth and development of horticultural plants”, Botany 86: 213-217 (2008)

【非特許文献2】Takahashi, M. et al., “Nitrogen dioxide at an ambient level improves the capability of Kenaf (Hibiscus cannabinus) to decontaminate cadmium”, International Journal of Phytoremediation, 10: 73-76 (2008)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、および該遺伝子の利用方法を提供することを目的とする。詳しくは、生育が促進しバイオマス量が増加した形質転換体、生育が促進しバイオマス量が増加した形質転換植物体の作出方法、および、生育促進植物体のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、植物の生育促進および植物のバイオマス量の増加に関与する遺伝子を単離することができ、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１１）の発明を含むものである。

【0013】

（１）植物の生育を促進し、かつ植物のバイオマス量を増加させる機能を有するタンパク質をコードする、以下の（ａ）ないし（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。

【0014】

（２）（１）に記載の遺伝子を含むベクター。

【0015】

（３）（１）に記載の遺伝子の発現が増強された形質転換体。

【0016】

（４）（１）に記載の遺伝子、又は（２）に記載のベクターを導入することにより、該遺伝子の発現が増強された、（３）に記載の形質転換体。

【0017】

（５）植物細胞、カルス、植物器官または植物組織である（４）に記載の形質転換体。

【0018】

（６）形質転換植物体である（４）に記載の形質転換体。

【0019】

（７）キク科植物、ナス科植物、アカザ科植物、イネ科植物、アブラナ科植物、マツ科植物、スギ科植物、トウヒ科植物、ヒノキ科植物、フトモモ科植物、ヤナギ科植物、ウリ科植物またはアオイ科植物のいずれかの植物に由来する（３）ないし（６）のいずれかに記載の形質転換体。

【0020】

（８）（３）ないし（６）のいずれかに記載の形質転換体の子孫またはクローン。

【0021】

（９）植物細胞中の、（１）に記載の遺伝子の発現を増強する工程と、該植物細胞から植物体を再生する工程と、を含むことを特徴とする形質転換植物体の作出方法。

【0022】

（１０）（１）に記載の遺伝子、又は（２）に記載のベクターを植物細胞に導入することにより、該遺伝子の発現を増強する、（９）に記載の形質転換植物体の作出方法。

【0023】

（１１）植物体の一部における（１）に記載の遺伝子の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする生育促進植物体のスクリーニング方法。

【発明の効果】

【0024】

本発明により、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が提供された。本発明に係る形質転換体によれば、該遺伝子の発現が増強されているので、細胞の分裂・拡大および組織の分けつを促進することができる。また、本発明に係る形質転換植物体によれば、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加することができる。本発明に係る形質転換植物体の作出方法によれば、効率よく生育し、かつバイオマス量が増加するように形質転換された植物体を作出することができる。本発明に係る生育促進植物体のスクリーニング方法によれば、効率よく生育し、かつバイオマス量が増加する植物株を選別することができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】実施例１に係るＮＯ_２濃度とＶｉｔａ１遺伝子の発現量との関係のデータを示す図である。

【図2】実施例２に係るＶｉｔａ１変異株のＮＯ_２に対する応答性の結果を示す図である。

【図3】実施例３および４に係る組み換えベクターの構造を示す模式図である。

【図4】実施例３に係るシロイヌナズナのＶｉｔａ１遺伝子過剰発現体の生育を示す図である。

【図5】実施例３に係るシロイヌナズナのＶｉｔａ１遺伝子過剰発現体のシュートバイオマスを示す図である。

【図6】参考例１および２に係る各種植物のＮＯ_２に対する応答性の結果を示す図である。

【図7】実施例４に係るＶｉｔａ１遺伝子組み換えトマトの花の数を示す図である。

【図8】実施例４に係るＶｉｔａ１遺伝子組み換えトマトの果実数を示す図である。

【図9】実施例４に係るＶｉｔａ１遺伝子組み換えトマトの果実重量を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明者らが鋭意研究した結果、植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与する遺伝子を解明した（後述する実施例１および実施例２参照）。また、該遺伝子を過剰発現した形質転換植物体では、生育が促進され、かつバイオマス量が増加することが観察された（後述する実施例３参照）。さらに該植物体が果実野菜等の場合、作物の収量が向上することも確認できた（後述する実施例４参照）。

【0027】

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本発明は実施の形態に限定されることはなく、本発明の範囲内で種々の実施形態が可能である。本明細書において「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。

【0028】

（Ｖｉｔａ１遺伝子）
本発明に係る遺伝子は、植物の生育を促進し、かつ植物のバイオマス量を増加させる機能を有するタンパク質をコードする。好ましくは、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子をいう。配列番号１に記載の塩基配列は、シロイヌナズナＣ２４（Arabidopsis thaliana C24）に由来する該遺伝子（以下、Ｖｉｔａ１遺伝子とも言う）のタンパク質コード配列（ＣＤＳ）の全塩基配列である。配列番号２に記載の塩基配列は、Ｖｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの全塩基配列である。

【0029】

なお、Ｖｉｔａ１遺伝子は本発明者らが付けた名称である。当該遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列は公知であるが、当該タンパク質の機能は未知であり、遺伝子名ＡＴ１Ｇ３０２５０．１としてその遺伝子座、ｃＤＮＡの全塩基配列およびＣＤＳの全塩基配列はThe Arabidopsis Information Resource（ｔａｉｒ）に登録されている（http://www.arabidopsis.org/参照）。すなわち、本発明者らは当該遺伝子が植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させる機能を有することを発見したのであり、本発明はＶｉｔａ１遺伝子の機能を利用するものである。

【0030】

本発明に係る遺伝子は、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子でも構わない。

【0031】

ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸が形成される条件、すなわち配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と、９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列の相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。

【0032】

具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃であり、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常は、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。

【0033】

当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY（1989））等を参照することにより、このようなホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、上記の塩基配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により当業者にとって容易に決定することができる。

【0034】

本発明に係る遺伝子は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子でも構わない。配列番号３に記載の配列は、配列番号１に記載のＶｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列を翻訳した、Ｖｉｔａ１遺伝子に係るタンパク質のアミノ酸配列である。

【0035】

または、本発明に係る遺伝子は、配列番号３に示すアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されまたはこれらの組合せにより配列に変異が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子でも構わない。

【0036】

欠失、置換、付加もしくは挿入されてもよいアミノ酸の数としては、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により、欠失、置換、付加もしくは挿入できる程度の数をいう。具体的には、好ましくは、１個から数個である。例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失されてもよい。また、配列番号３に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加されてもよい。あるいは、配列番号３に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてもよい。また、ここでの変異は、主には公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。

【0037】

人為的に導入されたアミノ酸配列の変異は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法を用いて改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法またはＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等により行うことができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Ｍｕｔａｎ−Ｋ（タカラバイオ株式会社）、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社））等を用いても行うことができる。

【0038】

または、本発明に係る遺伝子は、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子でも構わない。上記８０％以上の同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性をいう。アミノ酸配列の同一性は、塩基配列と同様に、ＦＡＳＴＡ検索またはＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。

【0039】

さらに、本発明に係る遺伝子は、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子だけでなく、翻訳された場合のタンパク質が有する当該活性が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する当該活性と実質的に同等であるＤＮＡを含む遺伝子（ホモログ遺伝子等）も包含する。そこで、本明細書においては、上述した本発明に係る遺伝子を全て含め、「Ｖｉｔａ１遺伝子」として交換可能に使用する。

【0040】

本明細書において、「植物のバイオマス量を増加させる」とは、植物の質量を増加させることであり、植物体の質量を増加させることを含む。具体的には、植物体のシュートバイオマス収量、根バイオマス収量、作物の収量、葉の数、果実数、および果実重量等を増加させることを含み得るが、これに限定されるものではない。

【0041】

（Ｖｉｔａ１遺伝子を含むベクター）
以下、本発明に係るＶｉｔａ１遺伝子を含むベクター、プラスミド等の詳細について説明する。

【0042】

本発明に係るベクターは、Ｖｉｔａ１遺伝子（以下、目的遺伝子とも言う）を、当該技術分野において公知であるベクターに導入することにより構築することができる。例えば、アグロバクテリウムを介して植物（植物細胞）に目的遺伝子を導入する場合（アグロバクテリウム法）では、ベクターとしては、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系またはｐＳＭＡ系のベクター等を用いることができる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３もしくはｐＢＩＧ２１１３等）、または、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３ＮｅｏもしくはｐＮＣＡＴ等）のベクターが好ましい。

【0043】

バイナリーベクターとは、大腸菌（Escherichia coli）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターである。バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物（植物細胞）に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを、植物の核内ＤＮＡに組み込むことができる。

【0044】

バイナリーベクターを用いたアグロバクテリウム法においては、まず、バイナリーベクターのボーダー配列（ＬＢ配列およびＲＢ配列）間に目的遺伝子を挿入し、大腸菌中でこのベクターを増幅する。次に、増幅したベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１もしくはＥＨＡ１０５、または、アグロバクテリウム・リゾゲネスＬＢＡ１３３４等に、凍結融解法またはエレクトロポレーション法等により導入する。その後、ベクターが導入されたアグロバクテリウムを、植物（植物細胞）の形質転換に使用する。

【0045】

上記の方法以外にも、三者接合法（Bevan, J., Nucleic Acids Research, 12：8711（1984））によって、目的遺伝子を含む植物感染用アグロバクテリウムを調製することもできる。具体的には、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えば、ｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、および、アグロバクテリウムを混合培養する。次いで、リファンピシリンおよびカナマイシンなどの所定の抗生物質を含む培地上で培養することにより、植物感染用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。

【0046】

一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物細胞に遺伝子を直接導入することができる。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９またはｐＵＣ９等のベクターが挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。

【0047】

なお、ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断する。次いで、切断したＤＮＡを、ベクターの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用できる。

【0048】

精製されたＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡ等のいずれでもよい。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡ等の調製は、当業者にとって公知の手段を利用して行うことが可能である。

【0049】

例えば、配列番号１または配列番号２の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡ配列ライブラリー等由来のＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行うことにより、ＤＮＡ断片を得ることができる。また、上記ライブラリー等由来のＤＮＡを鋳型とし、その塩基配列の一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡ断片を得ることができる。または、市販の自動化ＤＮＡ配列合成装置等を用いてもＤＮＡ断片を得ることができる。

【0050】

また、目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そのため、ベクターには、目的遺伝子の上流、内部または下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（またはＲｉプラスミド由来の複製開始点など）、または、選択マーカー遺伝子等を連結する。

【0051】

「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡ配列であれば、植物由来のものでなくてもよい。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーターまたはタバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。

【0052】

「エンハンサー」としては、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられるものが好ましく、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、転写エンハンサーＥ１２またはオメガ配列等が挙げられる。

【0053】

「ターミネーター」としては、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーターまたはＣａＭＶ３５ＳＲＮＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。

【0054】

「選択マーカー遺伝子」としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子またはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げられる。また、選択マーカー遺伝子は、目的遺伝子とともに同一のベクターに連結させてもよいが、選択マーカー遺伝子を連結して得られるベクターと目的遺伝子を連結して得られるベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。

【0055】

（形質転換体）
本発明に係る形質転換体は、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現が増強されている。なお、本明細書において「形質転換体」は、後に詳細に述べるが、主に植物細胞、カルスまたは植物体等の、植物に係る形質転換体を指す。

【0056】

本明細書において、「Ｖｉｔａ１遺伝子の発現が増強された形質転換体」とは、宿主の野生株と比較してＶｉｔａ１遺伝子の発現量が増加している形質転換体をいう。すなわち、宿主の野生株と比較して、該遺伝子がコードするタンパク質が有意に多く発現している（好ましくは過剰発現している）形質転換体を示す。なお、宿主の野生株は、その遺伝子を元々ゲノムＤＮＡ上に有していてもよいし、有さなくてもよい。
本発明に係る形質転換体は、該遺伝子の発現が増強されたことによって、植物の生育が促進され、かつそのバイオマス量が増加する。

【0057】

「Ｖｉｔａ１遺伝子の発現を増強する」とは、該遺伝子を宿主のゲノムＤＮＡ上に、内在性の該遺伝子とは別に１コピー以上の該遺伝子を導入すること、および／または該遺伝子を含む発現ベクター（プラスミド）を導入し保有させることによって該遺伝子の発現を増強することを含む。ゲノムＤＮＡ上又は発現ベクター上の外来性の該遺伝子のプロモーター等の発現調節配列は強力な発現調節配列であることが好ましい。

【0058】

また、「Ｖｉｔａ１遺伝子の発現を増強する」とは、内在性の該遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力な発現調節配列に置換することを含み得る。内在性の該遺伝子のプロモーター等の発現調節配列の強力な発現調節配列への置換は、相同組み換え法を用いることができる。植物に関する相同組み換え法は、例えば、Iida, S. and Terada, R., Plant Molecular Biology (2005) 59: 205-219、Terada, R., Nature Biotechnology (2002) 20: 1030-1034、Yamauchi, T., The Plant Journal (2009) 60: 386-396、および国際公開第２００８／０５９７１１号を参照することができる。

【0059】

Ｖｉｔａ１遺伝子のプロモーター領域を強力なプロモーター配列に置換するためには、例えば、ボーダー配列であるＲＢ配列、ネガティブ選択マーカー、第１の相同組み換え領域、ポジティブ選択マーカー、強力なプロモーター配列、第２の相同組み換え領域、ネガティブ選択マーカー、およびボーダー配列であるＬＢ配列が順に連結された、相同組み換え用ベクターを用いることができる。第１の相同組み換え領域は、例えば、Ｖｉｔａ１遺伝子の転写開始点または翻訳開始点の上流６００ｂｐ〜６０００ｂｐの配列からなる。第２の相同組み換え領域は、例えば、Ｖｉｔａ１遺伝子の転写開始点または翻訳開始点の下流６００ｂｐ〜６０００ｂｐの配列からなる。また、ネガティブ選択マーカーとしてジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）遺伝子等を用いることができる。ポジティブ選択マーカーとしては、ハイグロマイシン遺伝子等を用いることができる。強力なプロモーター配列としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーターまたはタバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
このような相同組み換え用ベクターを用いて、植物細胞を形質転換し、ポジティブ・ネガティブ選択によって目的の形質転換体を得ることができる。

【0060】

以下、本発明に係る、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現が増強された形質転換植物体の詳細について説明する。

【0061】

本発明に係る形質転換植物体は、Ｖｉｔａ１遺伝子またはＶｉｔａ１遺伝子を含むベクターを、宿主である植物細胞等に導入することによって作出することができる。また、本発明に係る形質転換植物体は、ゲノム上の内在性のＶｉｔａ１遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を目的遺伝子の強力な発現をもたらす発現調節配列に置換することによっても作出することができる。目的遺伝子の強力な発現をもたらす発現調節配列として、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーターおよびタバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。本明細書において「遺伝子の導入」（「遺伝子が導入された」）とは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、Ｖｉｔａ1遺伝子を宿主である植物細胞内に発現可能な形で「導入する」（「導入された」）ことを意味する。ここで導入された遺伝子は、宿主である植物細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。

【0062】

Ｖｉｔａ１遺伝子またはＶｉｔａ１遺伝子を含むベクターを植物細胞等内に導入する方法としては、当該分野公知技術の種々の方法を適宜利用することができる。例えば、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法またはマイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法では、プロトプラストを用いる場合と、組織片を用いる場合と、種子または植物体そのものを用いる場合（ｉｎ ｐｌａｎｔａ法）とがある。

【0063】

プロトプラストを用いる場合は、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドをもつアグロバクテリウム（それぞれAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes）と共存培養する方法、または、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）等により行うことができる。組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法、または、カルス（未分化培養細胞）に感染させる方法等により行うことができる。

【0064】

種子または植物体を用いるｉｎ ｐｌａｎｔａ法の場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない場合においては、吸水種子、幼植物（苗）または鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等により行うことができる。植物の形質転換法の詳細については、「島本功、岡田清孝監修、新版 モデル植物の実験プロトコール 遺伝学的手法からゲノム解析まで（２００１）、秀潤社」を参照されたい。

【0065】

Ｖｉｔａ１遺伝子が植物細胞等に組み込まれたか否かは、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法またはウェスタンブロット法等により確認することができる。例えば、形質転換体の一部からＤＮＡを調製し、Ｖｉｔａ１遺伝子に特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行う。次に、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、Ｖｉｔａ１遺伝子が植物細胞等に組み込まれたことを確認することができる。

【0066】

また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認する方法でも構わない。さらに、その植物細胞からタンパク質を抽出し、２次元電気泳動を行って分画し、Ｖｉｔａ１遺伝子がコードするタンパク質のスポットを検出することにより、植物細胞に導入されたＶｉｔａ１遺伝子が発現されていること、すなわちその植物が形質転換されていることを確認してもよい。続いて、検出されたタンパク質についてエドマン分解等によりアミノ酸配列を決定し、配列番号３のアミノ酸配列と一致するかどうかを確認することにより、その植物細胞の形質転換を確実に実証することができる。

【0067】

さらには、種々のレポーター遺伝子、例えば、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を用いてもよい。すなわち、これらのレポーター遺伝子をＶｉｔａ１遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、アグロバクテリウムにそのベクターを導入する。そのアグロバクテリウムを用いて植物細胞等を形質転換し、そのレポーター遺伝子の発現を測定することによって、形質転換を確認することもできる。

【0068】

内在性Ｖｉｔａ１遺伝子のプロモーターが強力な発現プロモーターに置換されたか否かは、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法またはウェスタンブロット法等により確認することができる。

【0069】

本発明において、形質転換に用いられる植物細胞等としては、単子葉植物または双子葉植物のいずれに由来するものであってもよい。例えば、キク科植物、ナス科植物、アカザ科植物、イネ科植物、アブラナ科植物、マツ科植物、スギ科植物、トウヒ科植物、ヒノキ科植物、フトモモ科植物、ヤナギ科植物、ウリ科植物またはアオイ科植物のいずれかに由来するものが好ましいが、これらに限定されるものではない。

【0070】

また、後述する実施例に記載するように、５０〜２００ｐｐｂのＮＯｘ濃度環境下で生育させると生育が促進し、バイオマス量が増加するような植物体であれば、植物体におけるＶｉｔａ１遺伝子の発現を増強することによって、環境中のＮＯｘ濃度に関わらず、その植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させることができるものと考えられる。このような植物体としては、例えば、後述する参考例に記載されたニコチアナ・プランバジニフォーリア（Nicotiana plumbaginifolia）、シロイヌナズナＣ２４（Arabidopsis thaliana C24）、レタス（Lactuca sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キュウリ（Cucumis sativus）、カボチャ（Cucurbita moschata）、およびケナフ（Hibiscus cannabinus）が挙げられる。さらに、後述する実施例に記載されたシロイヌナズナ コロンビア（Arabidopsis thaliana Columbia）およびトマト（Solanum lycopersicum）が挙げられる。

【0071】

本発明においては、形質転換の対象は、植物材料であればよい。すなわち、本発明に係る形質転換体には、具体的には、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、穀実もしくは種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部もしくは維管束等）、未分化のカルス、または、植物細胞（プロトプラストも含む）のいずれもが含まれる。

【0072】

（形質転換植物体の作出方法）
本発明に係る、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現が強化された形質転換植物体の作出方法について、以下詳細に説明する。本発明に係る形質転換植物体の作出方法は、特に、形質転換された植物体（植物体全体）の作出方法であり、植物細胞中のＶｉｔａ１遺伝子の発現を増強し、該植物細胞から植物体を再生する形質転換植物体の作出方法に関する。

【0073】

植物細胞におけるＶｉｔａ１遺伝子の発現を増強する方法については、上記の形質転換体において詳説した通りであるが、Ｖｉｔａ１遺伝子を含む組み換えベクターを用いて植物細胞にＶｉｔａ１遺伝子を導入する方法が好ましい。該植物細胞から植物体を再生する方法については、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に行うことができる。例えば、以下のように行うことができる。

【0074】

形質転換の対象とする植物材料として植物組織または植物細胞等のプロトプラストを用いた場合、これらをカルス形成用培地中で培養する。カルス形成用培地は、無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレンまたはブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を含有し、滅菌されている。培養後には、不定形に増殖する脱分化したカルスが形成される（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスを、オーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移し変え、さらに増殖（継代培養）させる。

【0075】

カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより、器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光および温度等を適切に設定することにより行うことができる。このような再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽および不定茎葉等が形成され、さらに完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えば、カプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞または組織等）において貯蔵等を行っても構わない。

【0076】

このように植物体の染色体内にＶｉｔａ１遺伝子が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。例えば、形質転換植物体から植物種子を得るには、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育し花を形成させ、最終的に種子を形成させる。種子から子孫である植物体を生育するには、例えば、まず、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで単離し、水を含んだ土に播種する。これを一定温度下および照度下で生育させることにより、子孫である植物体を得ることができる。このようにして育種された子孫である植物体は、導入されたＶｉｔａ１遺伝子を発現しているため、野生株の植物よりも生育が促進した植物となる。

【0077】

作出された形質転換植物体のクローンも、導入されたＶｉｔａ１遺伝子を発現している。そのため、その形質転換植物体、その子孫またはクローンから種子またはプロトプラスト等の繁殖材料を得て、それらをもとに形質転換植物体を量産することもできる。

【0078】

なお、本発明に係る形質転換体には、上述したように再生された完全な形質転換植物体だけでなく、当該形質転換植物体が再生され、さらに量産される過程において発生および使用する中間生成物および繁殖材料等も全て含むものとする。すなわち、形質転換された植物細胞、カルス、該形質転換植物体のクローンの植物体、該形質転換植物体により得られる子孫の植物体、および、そのクローンまたは子孫の植物体の組織や器官等の一部（種子またはプロトプラスト等）も全て包むものとする。

【0079】

上記にて詳細に説明した形質転換体（形質転換植物体も含む）では、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現により、野生株と比較すると、細胞の分裂・拡大および組織の分けつが促進している。特に、形質転換植物体では、植物の生育が促進し、植物のバイオマス量が増加する。当該植物が、例えば、トマト（ナス科植物）等の果実野菜、イネ（イネ科植物）等の穀類、または、レタス（キク科植物）等の葉菜である場合、その作物の収量を向上させることができる。

【0080】

（生育促進植物体のスクリーニング方法）
本発明に係る、生育促進植物体のスクリーニング方法について以下詳細に説明する。本発明に係る、生育促進植物体のスクリーニング方法は、植物体の一部におけるＶｉｔａ１遺伝子の発現量を検出する工程を含む。

【0081】

本発明において「植物体の一部」とは、例えば、葉、花弁、茎、根、穀実もしくは種子等の植物器官、表皮、師部、柔組織、木部もしくは維管束等の植物組織、未分化のカルス、または、植物細胞（プロトプラストも含む）のいずれであってもよい。これら植物体の一部を、当業者によって公知の技術を用い、遺伝子の発現量を検出できる状態に調整する。本発明に係る生育促進植物体のスクリーニング方法において、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現量の検出は、Ｖｉｔａ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量、該ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの量または該ｍＲＮＡによって翻訳されたタンパク質の量等によって測定・検出することができる。

【0082】

ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量の測定・検出は、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法またはＤＮＡマクロアレイ法等により行うことができる。タンパク質の量の測定・検出は、例えば、ウェスタンブロット法、２次元電気泳動法、２重収束質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＡＳＳ法またはこれらの組み合わせ等により行うことができる。

【0083】

上述したように、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現を増強した形質転換体は、細胞の分裂・拡大および組織の分けつが促進する。特に、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現を増強した形質転換植物体によれば、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加することができる。すなわち、同種類または同品種の植物体の一部における、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現量を検出・測定し比較することによって、同種類または同品種でも、いずれの植物株が効率よく生育するのかを選別することができる。

【0084】

さらに、選別された植物株の子孫またはクローンの植物体を利用することで、効率よく植物の生育を促進することができる。また、当該植物が、例えば、トマト（ナス科植物）等の果実野菜、イネ（イネ科植物）等の穀類、または、レタス（キク科植物）等の葉菜である場合、その作物の収量を向上させることができる植物株を選別することができる。

【0085】

なお、本発明に係る生育促進植物体のスクリーニング方法においては、形質転換された生育促進植物体をスクリーニングする場合も含まれる。すなわち、野生株の植物体同士のＶｉｔａ１遺伝子の発現量を比較する場合、野生株の植物体と形質転換植物体とのＶｉｔａ１遺伝子の発現量を比較する場合、または、形質転換植物体同士のＶｉｔａ１遺伝子の発現量を比較する場合等に利用することができる。

【0086】

さらに、本発明に係る生育促進植物体のスクリーニング方法に関連し、Ｖｉｔａ１遺伝子のタンパク質と特異的に結合する抗体、または、Ｖｉｔａ１遺伝子のｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブもしくはプライマー等を含む生育促進植物体のスクリーニングキットという他の実施の形態として、本発明を利用することもできる。この場合には、ハイブリダイゼーション等の実施に必要な一以上の試薬（例えば、緩衝液またはｐＨ調製用試薬等）、または、器具等をさらに含んでもよい。好ましくは、さらに使用説明書も含む。

【0087】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。

【実施例】

【0088】

本発明者らは、ＮＯｘに応答して植物の生育を促進し、バイオマス量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を同定するために、モデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の種々の遺伝子において、ＮＯｘに応答した植物の生育促進に関与している遺伝子を解析した。その結果、ＡＴ１Ｇ３０２５０．１遺伝子（Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ｔａｉｒ）：http://www.arabidopsis.org/参照）が、ＮＯｘに応答した植物の生育促進に関与していることを発見した。ＡＴ１Ｇ３０２５０．１遺伝子は、その遺伝子座、ｃＤＮＡの全塩基配列およびＣＤＳの全塩基配列は公知であるが、その機能については不明であり、本発明者らは該遺伝子をＶｉｔａ１遺伝子と名付けた。

【0089】

（実施例１）
本実施例１では、ＮＯ_２濃度とＶｉｔａ１遺伝子の発現量との関係について説明する。

【0090】

本発明者らは、周囲環境のＮＯ_２濃度によるシロイヌナズナの野生株（Arabidopsis thaliana C24）のＶｉｔａ１遺伝子の発現量の変化について調べた。

【0091】

まず、２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌したシロイヌナズナＣ２４の野生株の種子を、滅菌水により３〜５回洗った。次に、該種子を冷蔵庫（４℃）において一晩吸水させ、その後、パーライトおよびバーミキュライトを等体積割合で入れた容器において播種、栽培した。栽培中は、１／２Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地（Murashige and Skoog, Physiol Plant 15(3): 473-497, 1962）を、１週間に２回与えた。なお、栽培は、ＮＯｘ暴露チャンバー（ＥＲ-２０−Ａ、日本医化器械製作所）に移して行い、＋ＮＯ_２区と−ＮＯ_２区とに分け栽培した。＋ＮＯ_２区においては、ＮＯ_２濃度を２００±２０ｐｐｂに制御して、ＮＯ_２を多く含む空気環境で栽培を行なった。−ＮＯ_２区においては、ＮＯ_２濃度を５ｐｐｂ未満に制御して、ＮＯ_２をほとんど含まない空気環境で栽培を行なった。

【0092】

栽培条件は、温度２２±０．３℃、相対湿度７０±４％、ＣＯ_２濃度３８０±４０ｐｐｍ、自然光下とした。両環境下（＋ＮＯ_２区および−ＮＯ_２区）の植物において、それぞれ、栽培開始４日、７日および１４日後に植物のシュートを採集し、液体窒素で凍結させた後、ＲＮＡを抽出するまで−８０℃で保存した。以下の作業は６種類のシュートを用いて行った。

【0093】

−８０℃で保存していたシュートを乳鉢と乳棒を用いてすりつぶし、すりつぶしたサンプルは、予め液体窒素で冷やしておいたファルコンチューブに移した。この後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、そのプロトコールに従いＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度を、分光光度計（ＮＤ−１０００，NanoDrop Technologies Inc.）を用いて測定した。なお、ＲＮＡを抽出した後、変性ゲルを用いた電気泳動を行い、ＲＮＡが分解していないことを確認した。

【0094】

抽出したＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡの合成を行った。全ＲＮＡ溶液（１μｇ）を、６５℃で１０分間処理し、氷上で冷却した。その後、該全ＲＮＡ溶液に、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２０プライマーを１．０μＬ（終濃度１０ｐｍｏｌ／μＬ）、５×バッファー（Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅに添付の緩衝液、東洋紡株式会社製）を４μＬ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）を４μＬ、および、１００Ｕ／μＬの逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ，東洋紡株式会社製）を１μＬ添加し、水で総量１０μＬとした。得られた混合物を、４２℃で５５分間反応させ、ｃＤＮＡを得た。

【0095】

得られたｃＤＮＡ（４μＬ）を鋳型として用い、反応溶液２０μＬ中において、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行なった。反応溶液の組成は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｎｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）が１０μＬ、３６７Ｓプライマーが０．４μＬ（終濃度０．２μＭ）、３６７ＡＳプライマーが０．４μＬ（終濃度０．２μＭ）であり、残部は水である。なお、リアルタイムＰＣＲ解析には、フォワードプライマーとして３６７Ｓプライマー（配列番号４：5'-tctcacctcaaccacggactc-3'）、リバースプライマーとして３６７ＡＳプライマー（配列番号５：5'-ggcactgtcgtatggctgtag-3'）を用いた。このリアルタイムＰＣＲの結果得られたＣｔ値をもとに、比較Ｃｔ法（２^{−ΔΔＣｔ}）でＶｉｔａ1遺伝子の発現量の相対値を求めた。

【0096】

図１は、実施例１に係るＮＯ_２濃度とＶｉｔａ１遺伝子の発現量との関係を示す図である。すなわち、各栽培期間（日）の植物において、−ＮＯ_２区で栽培した場合のＶｉｔａ１遺伝子の発現量を１としたときの、＋ＮＯ_２区で栽培した場合の該遺伝子の発現量の相対値を示している。図１に示すように、いずれの栽培期間においても＋ＮＯ_２区のＶｉｔａ１遺伝子の発現量の相対値が１より大きく、２８日においては３倍近くにもなっていた。

【0097】

この結果から、野生株の植物において、周囲環境のＮＯｘ（ＮＯ_２）濃度を２００±２０ｐｐｂ程度に増加することによって、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現量が増加することがわかった。すなわち、Ｖｉｔａ１遺伝子に係るタンパク質が、ＮＯｘ（ＮＯ_２）濃度増加に伴う植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与しているということが示唆された。

【0098】

（実施例２）
本実施例２では、Ｖｉｔａ１遺伝子とＮＯｘに応答した植物の生育促進およびバイオマス量の増加との関連に係る実施例について説明する。

【0099】

本発明者らは、Ｖｉｔａ１遺伝子とＮＯｘに応答した植物の生育促進およびバイオマス量の増加との関連性を実証するため、シロイヌナズナの野生株（Arabidopsis thaliana Columbia）と該シロイヌナズナのＶｉｔａ１遺伝子のノックアウト株（以下、Ｖｉｔａ１変異株）とを用い、ＮＯ_２存在下または非存在下での個体のシュートバイオマス比率について調べた。なお、Ｖｉｔａ１遺伝子のノックアウト株は、Ｗｏｏｄｙらの方法（Woody ST, et. Al., J Plant Res. 2006; 120(1):157-165.）に従って作出されたＶｉｔａ１コーディング領域にＴ−ＤＮＡが挿入されたシロイヌナズナ遺伝子ノックアウト変異体であり、アラビドプシスバイオロジカルリソースセンター（ＡＢＲＣ）から入手した。

【0100】

まず、野生株およびＶｉｔａ１変異株のそれぞれの種子を、２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌を行った後、滅菌水で５回洗った。次いで、冷蔵庫（４℃、暗所）で一晩吸水させた後、播種した。播種は、パーライトおよびバーミキュライトを等体積割合で入れた容器において、滅菌洗浄した当該吸水させた各種子を、等間隔に並べて行った。

【0101】

播種後すぐに、ＮＯｘ暴露チャンバー（株式会社日本医化器械製作所ＮＯｘ-１１３０−ＳＣII）に移し、栽培した。栽培条件は、温度２２℃、照度４０μＥｍ^−２ｓ^−１（１６ｈ明所／８ｈ暗所）、相対湿度７０％、ＣＯ_２濃度３８０±４０ｐｐｍ、ＮＯ_２濃度５ｐｐｂ未満とした。栽培中は、１／２Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地を、１週間に２回与えた。栽培開始1週間後、野生株およびＶｉｔａ１変異株のそれぞれの株について、＋ＮＯ_２区と−ＮＯ_２区とに分けさらに栽培した。＋ＮＯ_２区においては、ＮＯ_２濃度を５０±１０ｐｐｂに制御して、ＮＯ_２を含む空気環境で栽培を行なった。−ＮＯ_２区においては、ＮＯ_２濃度を５ｐｐｂ未満にて栽培を続けた。

【0102】

播種後２８日間栽培した各株および各区のシロイヌナズナ植物体をシュートと根とに切り分けた後、凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥させたシュートの乾燥重量を、電子天秤で測定した。この測定したシュートの乾燥重量の値（個体のシュートバイオマス）から、野生株およびＶｉｔａ１変異株における＋ＮＯ_２区と−ＮＯ_２区との比率を算出した。

【0103】

図２は、実施例２に係るＶｉｔａ１変異株のＮＯ_２に対する応答性を示す図である。すなわち、図２は、シロイヌナズナの野生株およびＶｉｔａ１変異株の、＋ＮＯ_２区と−ＮＯ_２区とでの個体のシュートバイオマス比率を示している。図２に示すように、野生株では該シュートバイオマス比率は約１．５程度であり、やはり、ＮＯｘ（ＮＯ_２）が植物の生育に関連するシグナルとして働き、植物の生育を促進していることが確認された（特許文献４参照）。一方、Ｖｉｔａ１変異株においては、該シュートバイオマス比率は野生株よりも低く、より１に近い値となっていた。

【0104】

本実施例２の結果から、Ｖｉｔａ１遺伝子をノックアウトするとＮＯ_２に応答した植物生育促進およびバイオマス量の増加効果がほとんど認められなくなることがわかった。すなわち、やはり、Ｖｉｔａ１遺伝子に係るタンパク質が、ＮＯｘ（ＮＯ_２）濃度増加に伴う植物の生育の促進およびバイオマス量の増加に関与しているということが実証された。

【0105】

（実施例３）
本実施例３では、Ｖｉｔａ１遺伝子過剰発現シロイヌナズナに係る実施例について説明する。

【0106】

本発明者らは、実施例１および実施例２に示したように、Ｖｉｔａ１遺伝子がＮＯｘに応答した植物の生育促進及びバイオマス量の増加に関与していることを発見した。そこで、シロイヌナズナの野生株（Arabidopsis thaliana Columbia）とシロイヌナズナのＶｉｔａ１遺伝子過剰発現体の生育について比較した。

【0107】

（Ｖｉｔａ１遺伝子過剰発現体作製のためのベクターの構築）
まず、Ｖｉｔａ１遺伝子のクローニング、および該遺伝子を用いたアグロバクテリウムの形質転換について説明する。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana ecotype Ｃ２４）の全ＲＮＡ溶液（２５０ｎｇ／μＬ）４μＬを、６５℃で１０分間処理し、氷上で冷却した。その後、この全ＲＮＡ溶液に、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２０プライマーを１．０μＬ（終濃度０．５μＭ）、５×バッファー（商品名：Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅに添付の緩衝液、東洋紡株式会社製）を４μＬ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）を４μＬ、１００Ｕ／μＬの逆転写酵素（商品名：Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ、東洋紡株式会社製）を１μＬ添加した。得られた混合物を、４２℃で４５分間反応させ、ｃＤＮＡを得た。

【0108】

得られたｃＤＮＡ（１μＬ）を鋳型として用い、反応溶液５０μＬ中においてＰＣＲにより、Ｖｉｔａ１遺伝子のタンパク質のコーディング領域（配列番号１）およびｃＤＮＡ断片（配列番号２）を増幅した。該反応溶液の組成は、１０×ＰＣＲバッファー（プロメガ株式会社製、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液）が１μＬ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）が４．０μＬ、フォワードプライマーが５μＬ（終濃度１μＭ）、リバースプライマーが５μＬ（終濃度１μＭ）、３Ｕ／μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ株式会社製）が１μＬ、残部は水である。

【0109】

なお、Ｖｉｔａ１遺伝子のタンパク質のコーディング領域増幅用のフォワードプライマーとして、Ｖｉｔａ１ ｆ１Ａプライマー（配列番号６：5'-ccctctagaatggttgatatccaaagcac-3'）、リバースプライマーとして、Ｖｉｔａ１ ｒ１Ａプライマー（配列番号７：5'-aaagagctcctagaaacaagaggtcaccg-3'）を用いた。Ｖｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡ断片増幅用のフォワードプライマーとして、Ｖｉｔａ１ ｆ１Ｂプライマー（配列番号８：5'-ccctctagatttgataaaaatggttgatatccaaagc-3'）、リバースプライマーとして、Ｖｉｔａ１ ｒ１Ｂプライマー（配列番号９：5'-aaagagctcaacagaagtaaattcttattaattcaac-3'）を用いた。

【0110】

また、ＰＣＲは、９５℃で５分のインキュベーション後、変性を９５℃で３０秒、アニーリングを６０℃ で１分、伸長を７２℃で１分を１サイクルとする反応サイクルを、３５回繰り返し、最後に７２℃で７分のインキュベーションする条件で行った。

【0111】

得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで電気泳動し、目的の約０．３ｋｂまたは０．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ精製にはＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＭｏｎｏＦａｓ ＤＮＡ精製キットＩを用いた。精製した各ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）に連結した。その後、得られた産物を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。次いで、菌体を１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．５ｍＭ Ｘ−ｇａｌ、および、８０ｍｇ／Ｌ ＩＰＴＧを含有したＬＢ寒天培地上で、３７℃で培養することにより形質転換体を選抜した。

【0112】

ＬＢ寒天培地の組成は、０．０１重量％トリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）、０．００５重量％酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）、０．００５重量％ＮａＣｌ、および、１．５重量％ 寒天（和光純薬工業株式会社製）であり、ｐＨ７．０である。得られた各コロニーよりプラスミドを回収し、該プラスミド中に含まれるＰＣＲ産物の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を保持しているものを選別した。

【0113】

得られたプラスミドを、制限酵素ＸｂａIとＳａｃIとにより切断して、配列番号１のＶｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列、または、配列番号２のＶｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を含む断片を得た。また、組み換えベクターｐＩＧＨｍ１２１をＸｂａIとＳａｃIとにより切断して、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーター等を含有するベクター由来の断片を得た。その後、前述したＶｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列、または、Ｖｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を含む断片と、ベクター由来断片とをそれぞれ連結した。

【0114】

図３は、実施例３および後述する実施例４に係る組み換えベクターの構造を示す模式図である。すなわち、前述したように各断片を連結させた、プラスミドベクター（組み換えベクター）の構造図を示す。図３において、ＮＯＳ-ｐｒｏはＮＯＳプロモーター、ＮＰＴIIはカナマイシン耐性遺伝子、ＮＯＳ-ｔｅｒはＮＯＳターミネーター、Ｐ３５ＳはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＰＴはハイグロマイシン耐性遺伝子、ＯＲＦはＶｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列またはＶｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を含む断片である。このようなプラスミドベクターを用いて植物細胞を形質転換する場合、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを、植物核内ＤＮＡに組み込むことができる。

【0115】

これらのプラスミドベクターを用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。次いで、当該菌体を、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とを含有したＬＢ寒天培地上で３７℃ で培養することにより、形質転換体を選抜した。得られた各コロニーからプラスミドを回収し、制限酵素ＸｂａIとＳａｃIとで処理することにより、それぞれのＶｉｔａ１遺伝子の塩基配列の存在を確認した。なお、以下、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列（配列番号１）を含むプラスミドベクターをｐＶｉｔａ１Ａ、Ｖｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２）を含むプラスミドベクターをｐＶｉｔａ１Ｂとする。

【0116】

プラスミドベクターｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂ各１μｇＤＮＡを、アグロバクテリウムＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）コンピテント細胞１００μＬに加えた。氷上で５分間静置した後、５分間ヒートショック処理（３７℃）を行った。その後、ＬＢ培地１ｍＬを加え、２時間〜４時間、１５０ｒｐｍ、室温で振とう培養した。９，５００×ｇで１分間遠心して集菌した。上清１ｍＬを捨て、残りの培養液１００μＬに沈殿したアグロバクテリウムを再懸濁した。この形質転換したアグロバクテリウムＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）（ｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂが導入されているもの）は、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌおよびハイグロマシン５０ｍｇ／Ｌおよびリファアンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地で培養して維持した。この形質転換したアグロバクテリウムＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）（ｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂが導入されているもの）をシロイヌナズナの形質転換に用いた。

【0117】

（Ｖｉｔａ１遺伝子過剰発現シロイヌナズナの作出）
まず、それぞれの植物体の調製を行った。バーミキュライトおよびパーライトを等体積割合で入れた混合土５０ｇをポットに入れ、さらに、該混合土に、１０００倍希釈したハイポネックス（（株）ハイポネックスジャパン社製）５０ｍＬを添加した。シロイヌナズナの野生株（Arabidopsis thaliana ecotype columbia）の種子を４℃で一晩吸水させたものを、１ポットあたり、５〜６粒ずつ蒔いた。その後、１ポットずつラップで覆い、温度２２℃、光条件１６ｈ明所／８ｈ暗所のインキュベーターで維持し、発芽させた。徐々にラップを外していき、１０日目までに完全に外した。また、週に２度、１０００倍希釈したハイポネックス５０ｍＬを供給した。

【0118】

小さい個体を間引き、１ポット当たり３個体にした。花茎が伸びてきたら、花茎の付け根から数えて１枚目の葉を残し、花茎を切り取り、脇芽を誘導させた。蕾がつき始めた個体を、アグロバクテリウムの感染に用いた。

【0119】

次に、減圧浸潤法により、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列（配列番号１）を含むプラスミドベクターｐＶｉｔａ１Ａを有するアグロバクテリウムをシロイヌナズナに感染させた。具体的には、リファンピシン（１００μｇ／ｍＬ）とゲンタマイシン（２５μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とを含有したＬＢ液体培地３ｍＬにアグロバクテリウムを播種し、３０℃で１〜２日間培養した。得られた培養物を、リファンピシン（１００μｇ／ｍＬ）とゲンタマイシン（２５μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とを含有したＬＢ液体培地２５０ｍＬに移し、ＯＤ６００＝１．２〜１．６になるまで培養した。得られた培養物を、遠心管（アシスト社製）に移し、該遠心管を、４℃、５０００ｒｐｍにおいて１５分の遠心分離に供し、菌体を回収した。

【0120】

得られた菌体を、Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（組成：１／２希釈ＭＳ ｓａｌｔｓ（Murashige, T., et al., Physiol.Plant.,15: 473 (1962)）、ｐＨ５．６、和光純薬工業株式会社製、商品名：ムラシゲ・スクーブ培地用混合塩類）、５０μｇ／ｍＬミオイノシトール、５μｇ／ｍＬチアミン−ＨＣｌ、０．５μｇ／ｍＬニコチン酸、０．５μｇ／ｍＬピリドキシン−ＨＣｌ、５重量％シュークロース、１０ｎｇ／ｍＬベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．００００４重量％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７（商標）（日本ユニカー株式会社製）、０．０５重量％ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ５．７））に、ＯＤ６００＝０．６となるように懸濁し、得られた懸濁物を５００ｍＬ容ビーカーに移した。

【0121】

シロイヌナズナのポットを逆さまにして、前記ビーカー中のアグロバクテリウムと接触させ、減圧装置中で、５０．６６２５Ｐａに減圧し、１０分間維持し、シロイヌナズナにアグロバクテリウムを感染させた。なお、減圧装置は、シバタ株式会社製のデシケーターに中村理化工業株式会社製の真空ポンプを連結させたものである。

【0122】

感染させたシロイヌナズナのポットを、キムタオル（登録商標）を敷いたバット上に横向けに静置させ、ラップで覆い、インキュベーターに移した。その後、ラップをはずしてポットを起こし、温度２２℃、光条件１６ｈ明所／８ｈ暗所の栽培条件で生育させた。なお、感染後、１週間は水を供給せず、根が腐らないようにした。その後、１週間に２度、１０００倍希釈したハイポネックス５０ｍＬを供給した。

【0123】

次に、形質転換体の選抜を行った。種子を採取し、２週間以上乾燥させた。得られた種子約３０００粒ずつを、１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブ（グライナー社製）に入れ、該種子を２．５体積％次亜塩素酸ナトリウムで滅菌した。

【0124】

クリーンベンチにおいて、０．２重量％滅菌済液状ＬＯ３（タカラバイオ社製）を１ｍＬ取り、試験管に移し、前記種子を滅菌水１ｍＬと共に該試験管に入れ、よく混合した。次いで、上記種子を、９ｃｍディッシュ中、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とを含む選抜培地（組成：ビタミン類を含有しないＭＳ基本培地（Murashige,T., et al., Physiol.Plant., 15: 473 (1962)）、ｐＨ５．６、０．８重量％寒天）上に播種した。前記選抜培地の表面が乾燥した後、前記ディッシュをパラフィルムで覆い、温度２２℃、光条件１６ｈ明所／８ｈ暗所で目的の植物体を選抜した。

【0125】

３〜４週間後、上記選抜により、生存していた植物体を、アグリポットに入れたＭＳ培地（組成：ＭＳ基本培地、ｐＨ５．６、１重量％シュークロース、０．８重量％寒天）、または、バーミキュライトおよびパーライトを等体積割合で入れた混合土に移し、５ｐｐｂ未満のＮＯｘ濃度環境下で生育させた。なお、得られた植物体をＴ０世代とする。得られた植物体はＰＣＲで解析した。

【0126】

生育させた野生株またはＶｉｔａ１遺伝子過剰発現体のシロイヌナズナ植物体を、シュートと根に切り分けた後、凍結乾燥した。凍結乾燥させたシュートの乾燥重量は、実施例２と同様、電子天秤で測定した。また、各植物体の葉数についても測定した。

【0127】

図４は、実施例３に係るシロイヌナズナのＶｉｔａ１遺伝子過剰発現体の生育を示す図である。すなわち、シロイヌナズナの野生株（Ｃｏｌ ＷＴ）とシロイヌナズナのＶｉｔａ１遺伝子過剰発現体（Ｖｉｔａ１Ｂ−３）とにおける、両植物体の生育の比較を示す。なお、図４において、ｎは個体数を示す。両植物体の比較は、シュートバイオマス（ｍｇ）および葉数（枚）において行っている。図４に示すように、Ｃｏｌ ＷＴと比較するとＶｉｔａ１Ｂ-３の方が、シュートバイオマスについては重く、かつ葉数についても多かった。

【0128】

当該結果および実施例１ならびに実施例２の結果から、Ｖｉｔａ１遺伝子に係るタンパク質は、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させる機能を有することがわかった。さらに、Ｖｉｔａ1遺伝子を過剰発現させると、植物の生育が促進し、その収量も増加することが明らかとなった。

【0129】

次に、野生株およびＶｉｔａ１遺伝子を過剰発現したシロイヌナズナ植物体を５０ｐｐｂのＮＯｘ濃度下で生育させて、上記と同様に両者のシュートバイオマスを比較した。この比較は、シロイヌナズナの野生株（Arabidopsis thaliana Ｃ２４）とそのＶｉｔａ１遺伝子過剰発現株とを用いて行った。なお、Ｖｉｔａ１遺伝子過剰発現株の作製は、上記のArabidopsis thaliana Columbiaと同様の方法で行った。また、栽培条件も上記のArabidopsis thaliana Columbiaと同様である。
その結果、図５に示すように、Ｖｉｔａ１遺伝子を過剰発現した植物体では、野生株に比べてシュートバイオマスが増加することが分かった。
これらの結果から、環境中のＮＯｘ濃度に関わらず、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現が増強された植物体は、野生株と比べて生育が促進され、そのバイオマス量が増加することが明らかとなった。

【0130】

（参考例１）
トマト（Solanum lycopersicum）の野生株のＮＯｘ応答性について検討した。
トマト（Solanum lycopersicum）の野生株がＮＯｘに応答して、そのバイオマス量が増加することを確認するために、トマト（品種：Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ、Solanum lycopersicum）の野生株を５０ｐｐｂ±１０ｐｐｂのＮＯｘ濃度環境下および５ｐｐｂ未満のＮＯｘ濃度環境下で栽培した。栽培条件は、実施例２と同様である。
その結果、図６に示すように、トマト（Solanum lycopersicum）を５０ｐｐｂ±１０ｐｐｂのＮＯｘ濃度環境下で９６日間栽培すると、５ｐｐｂ未満のＮＯｘ濃度環境下で栽培した場合に比べて、果実収量（個体あたりの総果実数）が約１．４倍に増加した。これにより、トマト（Solanum lycopersicum）についてもＮＯｘに応答して、そのバイオマス量が増加することが確認された。
また、詳述したように、ＮＯｘによる植物の生育促進およびバイオマス量の増加には、Ｖｉｔａ１遺伝子が関与していることから、ＮＯｘに応答してバイオマス量が増加するトマトについても、Ｖｉｔａ１遺伝子を導入することにより、バイオマス量を増加させるものと推測される。

【0131】

（参考例２）
次に、レタス（Lactuca sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キュウリ（Cucumis sativus）、カボチャ（Cucurbita moschata）、ニコチアナ・プランバジニフォーリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ケナフ（Hibiscus cannabinus）およびシロイヌナズナＣ２４（Arabidopsis thaliana C24）の野生株それぞれについて、ＮＯｘ応答性を検討した。

【0132】

これら植物の野生株がＮＯｘに応答して、そのバイオマス量が増加することを確認するために、これら植物の野生株を５０ｐｐｂ±１０ｐｐｂ〜２００ｐｐｂ±５０ｐｐｂのＮＯｘ濃度環境下（＋ＮＯｘ）および対照として５ｐｐｂ未満のＮＯｘ濃度環境下（−ＮＯｘ）で５〜１０週間、栽培した。
具体的には、レタス（Lactuca sativa）およびシロイヌナズナＣ２４（Arabidopsis thaliana C24）の野生株は、５０ｐｐｂ±１０ｐｐｂのＮＯ_２濃度環境下で栽培した。キュウリ（Cucumis sativus）およびケナフ（Hibiscus cannabinus）の野生株は、１００ｐｐｂ±５０ｐｐｂのＮＯ_２濃度環境下で栽培した。ニコチアナ・プランバジニフォーリア（Nicotiana plumbaginifolia）の野生株は、１５０ｐｐｂ±５０ｐｐｂのＮＯ_２濃度環境下で栽培した。ヒマワリ（Helianthus annuus）およびカボチャ（Cucurbita moschata）の野生株は、２００ｐｐｂ±５０ｐｐｂのＮＯ_２濃度環境下で栽培した。

【0133】

それぞれの培養条件は、キュウリ（Cucumis sativus）には１ｍＭ硝酸カリウムを含む１／２Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ培地を、１週間に２回与え、ニコチアナ・プランバジニフォーリア（Nicotiana plumbaginifolia）には、栽培中、１０ｎｍ硝酸カリウムを含むＣｏｉｃ ａｎｄ Ｌｅｓａｉｎｔ培地を、４日に１回与えた点を除いて、実施例２と同様である。

【0134】

図６には、各植物を栽培した期間と、−ＮＯｘ下で栽培した植物のバイオマス量に対する＋ＮＯｘ下で栽培したときのバイオマス量の増加率を示す。その結果、評価した全ての植物において、５０〜２００ｐｐｂのＮＯｘ濃度環境下で栽培することによって、バイオマス量が１．６倍〜２．４倍に増加することが確認された。
以上の結果から、レタス（Lactuca sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、キュウリ（Cucumis sativus）、カボチャ（Cucurbita moschata）、ニコチアナ・プランバジニフォーリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ケナフ（Hibiscus cannabinus）およびシロイヌナズナＣ２４（Arabidopsis thaliana C24）といった、トマト以外の野菜等の植物でも、Ｖｉｔａ１遺伝子を導入することにより、そのバイオマス量および作物の収量を増加するものと推測される。

【0135】

（実施例４）
本実施例４では、Ｖｉｔａ１遺伝子組み換えトマト（Solanum lycopersicum）に係る実施例について説明する。上記の実施例３で作製した、ｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂを保持するアグロバクテリウムＧＶ２２６０を用いたＶｉｔａ１遺伝子組み換えトマト（形質転換植物体）の作出について説明する。

【0136】

プラスミドベクターｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂを用いて、アグロバクテリウムＧＶ２２６０をエレクトロポーレーション法により形質転換した。この形質転換したアグロバクテリウムＧＶ２２６０（ｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂが導入されているもの）は、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地で培養してｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂを維持した。

【0137】

ｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂを保持するアグロバクテリウムＧＶ２２６０を用い、リーフディスク法により、トマト（品種：Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ、Solanum lycopersicum）にＶｉｔａ１遺伝子を導入した。具体的には、ｐＶｉｔａ１ＡまたはｐＶｉｔａ１Ｂを保持するアグロバクテリウムを、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含んだＬＢ培地中で一晩振とう培養し、遠心洗浄を行った。次いで、アセトシリンゴン２００μＭとメルカプトエタノール１０μＭとを含むＭＳ液体培地に、ＯＤ６００が０．１になるようにアグロバクテリウムを懸濁した。このアグロバクテリウム菌液に、播種後７日目の無菌のトマト子葉切片を浸漬させた。

【0138】

アグロバクテリウムを感染させたトマト子葉切片は、１．５ｍｇ／Ｌのゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）を含むＭＳ培地で３日間共存培養した。その後、１ｍｇ／Ｌのゼアチン、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む選抜ＭＳ培地に移し、２週間ごとに培地を交換しながら培養した。培養により伸びたシュートを、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む発根ＭＳ培地に移した。この培地で根を形成した個体から形質転換個体を選抜した。発根ＭＳ培地で根を形成した形質転換個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ解析を行い、Ｖｉｔａ１遺伝子（Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列、または、Ｖｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列）が導入されていることを確かめた。

【0139】

図７は、実施例４に係るＶｉｔａ１遺伝子組み換えトマトの花の数を示す図である。すなわち、前述した形質転換個体の花の数を示している。図７に示すように、野生株（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較すると、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列が導入されている個体（ｐＶｉｔａ１Ａ）およびＶｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列が導入されている個体（ｐＶｉｔａ１Ｂ）はいずれも花の数が多くなった。すなわち、これは収穫されるトマトの数が多くなるということを意味する。

【0140】

上記の結果から、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列またはＶｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のいずれを導入しても、トマトの花の数が増加することが分かった。そこで、以下の検証では、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳ配列を導入した個体について評価した。

【0141】

図８は、実施例４に係るＶｉｔａ１遺伝子組み換えトマト（ｐＶｉｔａ１Ａ）の果実の数を示す図である。すなわち、前述した形質転換個体の果実の数を示している。図８に示すように、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列が導入されている個体（ｐＶｉｔａ１Ａ）では、赤色果実の数および赤色以外の果実も含めた全ての果実の数（総果実数）ともに、野生株と比較して多くなっていることが明らかとなった。

【0142】

図９は、実施例４に係るＶｉｔａ１遺伝子組み換えトマト（ｐＶｉｔａ１Ａ）の果実の重量を示す図である。すなわち、前述した形質転換個体の果実の重量を示している。図９に示すように、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列が導入されている個体（ｐＶｉｔａ１Ａ）では、赤色果実の重量、及び赤色以外の果実も含めた全ての果実の重量（総果実重量）ともに、野生株と比較して増加することが明らかとなった。
このように、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現を増強することによって、トマトの果実の数及び重量ともに増加し、トマトの収量が増加することが明らかとなった。

【0143】

本実施例４に係る結果から、トマトにおいてもＶｉｔａ１遺伝子の発現を増強することで、植物の生育が促進し、かつトマトの収量が向上することがわかった。さらに、導入するＶｉｔａ１遺伝子のＤＮＡ配列は、Ｖｉｔａ１遺伝子のＣＤＳの塩基配列またはＶｉｔａ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のいずれでも構わないこともわかった。

【0144】

以上の結果から、ＮＯｘ応答による植物の生育促進およびバイオマス量の増加効果は、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現が増加することによってもたらされるものであることが分かった。また、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現を増強することにより、環境中のＮＯｘ濃度に関わらず、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させることができることが明らかとなった。
さらに、ＮＯｘに応答して植物体の生育が促進されかつ収量が増加するシロイヌナズナおよびトマトはともに、Ｖｉｔａ１遺伝子の発現を増強することによって植物の生育が促進され、かつバイオマス量が増加したことから、ＮＯｘに応答して植物の生育が促進される他の植物においても同様にＶｉｔａ１遺伝子の発現を増強することによって植物の生育が促進され、かつバイオマス量が増加するものと推察される。

【産業上の利用可能性】

【0145】

本発明のＶｉｔａ１遺伝子の発現を増強させた形質転換体によれば、細胞の分裂・拡大および組織の分けつを促進させることができる。特に、形質転換植物体によれば、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させることができる。従って、該植物体が、例えばトマト（ナス科植物）等の果実野菜、イネ（イネ科植物）等の穀類、または、レタス（キク科植物）等の葉菜である場合、その作物の収量を向上させることができる。さらに、植物のＶｉｔａ１遺伝子の発現を増強することによって、植物の生育を促進し、かつバイオマス量を増加させることができるので、従来の生育促進方法とは異なり、簡便にかつ効率よく植物の生育を促進し、バイオマス量を増加させることができる。

【0146】

本発明は、上記発明の実施の形態、実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

【0147】

本明細書の中で明示した文献および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

【0148】

本出願は、２００９年１２月１８日に出願された日本国特許出願２００９−２８８５１８号に基づく。本明細書中に、その明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照して取り込むものとする。

【配列表フリーテキスト】

【0149】

配列番号４：Designed oligonucleotide primer for PCR
配列番号５：Designed oligonucleotide primer for PCR
配列番号６：Designed oligonucleotide primer for PCR
配列番号７：Designed oligonucleotide primer for PCR
配列番号８：Designed oligonucleotide primer for PCR
配列番号９：Designed oligonucleotide primer for PCR

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]