特許 5808107 細胞特異的能動集積性を有する光線力学療法剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5808107

(24)【登録日】2015年9月18日

(45)【発行日】2015年11月10日

(54)【発明の名称】細胞特異的能動集積性を有する光線力学療法剤

(51)【国際特許分類】

   C08F 8/00 20060101AFI20151021BHJP

   C08F 230/02 20060101ALI20151021BHJP

   A61K 31/409 20060101ALI20151021BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20151021BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20151021BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20151021BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20151021BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20151021BHJP

【ＦＩ】

   C08F8/00

   C08F230/02

   A61K31/409

   A61K45/00

   A61K47/48

   A61P35/00

   A61K39/395 C

   A61K39/395 L

   A61K9/127

【請求項の数】12

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2010-543031(P2010-543031)

(86)(22)【出願日】2009年12月17日

(86)【国際出願番号】JP2009071517

(87)【国際公開番号】WO2010071230

(87)【国際公開日】20100624

【審査請求日】2012年12月14日

(31)【優先権主張番号】特願2008-321500(P2008-321500)

(32)【優先日】2008年12月17日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】上田 政和

(72)【発明者】

【氏名】荒井 恒憲

(72)【発明者】

【氏名】松田 祐子

(72)【発明者】

【氏名】石原 一彦

【審査官】 久保田 英樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−０９８６７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５２２７１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０５２４００（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｆ ８／００− ８／５０

Ｃ０８Ｆ １２／００− ３４／０４

Ｃ０８Ｌ １／００−１０１／１４

Ａ６１Ｋ ９／１２７

Ａ６１Ｋ ３１／４０９

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ４７／４８

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光線力学療法用光感受性物質が内包された、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体が結合した癌細胞特異的高分子ポリマー化合物を含む組成物であって、高分子ポリマーが2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）、n-ブチルメタクリレート及び活性エステル基を含有するモノマー化合物を共重合し製造したMPCポリマーである組成物。

【請求項2】

高分子ポリマーがリポソーム又はリポソーム様の高分子会合体である請求項１記載の組成物。

【請求項3】

活性エステル基を含有するモノマー化合物がp-ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗EGFR抗体、抗EpCAM抗体及び抗c-erbB-2抗体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

癌細胞特異的抗原に対する抗体が活性エステル基を含有するモノマー化合物の活性エステル基を介して結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含む、光線力学療法剤。

【請求項8】

静脈注射製剤である、請求項７記載の光線力学療法剤。

【請求項9】

2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）、n-ブチルメタクリレート及び活性エステル基を含有するモノマー化合物を混合し、MPCポリマーを製造し、次いで、癌細胞特異的抗原に対する抗体と混合し、p-ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートの活性エステル基に前記抗体を結合させ、さらに、光線力学療法用光感受性物質を混合し、MPCポリマーに該光線力学療法用光感受性物質を内包させることを含む、光線力学療法剤の製造方法。

【請求項10】

活性エステル基を含有するモノマー化合物がp-ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである請求項９記載の光線力学療法剤の製造方法。

【請求項11】

癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗EGFR抗体、抗EpCAM抗体及び抗c-erbB-2抗体からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の光線力学療法剤の製造方法。

【請求項12】

光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の光線力学療法剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光線力学的治療に関し、光感受性物質を含み、表面に細胞特異的抗原に対する抗体を有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣと略記）に基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体からなる光線力学療法剤に関する。

【背景技術】

【0002】

光線力学的治療法（ＰＤＴ）とは、癌に集積性を示す光感受性物質とレーザー光照射による光化学反応を利用し、機能温存を考慮に入れた侵襲の少ない治療法で、安全にかつ有効に施行できる。また、放射線等に比して繰り返し施行可能であること、抗癌剤のように毒性もないという利点があり、新しい低侵襲治療として期待されている。
分子学的には、レーザー光線を癌部に照射すると、集積した腫瘍親和性光感受性物質は基底状態の一重項状態から分子内のエネルギーレベルが上昇し、励起状態の三重項状態に変換される。この状態に達すると、光感受性物質は光活性化され、直接的な活性フリーラジカルの生成、あるいは間接的な分子内エネルギー変換によって基底状態の三重項酸素（^３Ｏ_２）を高活性の一重項酸素（^１Ｏ_２）へ変換させる。これら２つの光活性化反応は同時に起こり、どちらの生成体とも直接細胞を傷害する作用を示す。
現在日本では、光線力学的治療剤として、フォトフリンとレザフィリンという２つの薬が認可されており、どちらの薬も腫瘍組織には正常組織のおよそ４倍取り込まれることが知られている。フォトフリンを用いた場合は投与の約４８時間後、レザフィリンを用いた場合は投与の約４時間後にレーザー照射を行う。正常組織は癌組織と比べて早い時間に薬が排泄されるので、この時間差を利用して腫瘍を選択的に治療する。フォトフリンを使用したＰＤＴは微少浸潤気管支内非小細胞性肺癌、部分的または完全閉塞の食道癌、他の肺腫瘍、中皮腫、バレット食道の早期食道癌、皮膚癌、乳癌、結腸直腸癌、婦人科悪性腫瘍等に応用されている。しかし、合併症として日光過敏症があり、このためフォトフリンで投与後２〜３週間、レザフィリンで約１週間は直射日光を避けるなど、遮光が必要である。
また、体内の構成成分では、水の吸収が２００ｎｍ付近までと７００ｎｍ付近より長波長にある。酸化ヘモグロビンの吸収は、４００ｎｍ、６００ｎｍ付近に二峰性のピークがある。もっとも生体由来の組織の影響が少ないのは６５０〜７００ｎｍ近辺であり、より深部病変の治療を目指し、長波長領域での吸収端を有する光感受性物質の開発が望まれている。フォトフリンの吸収は６３０ｎｍ、レザフィリンは６６４ｎｍである。一方、ベルテポルフィンは吸収が６９０ｎｍにあり、より適していると言える（特許文献１〜３を参照）。ベルテポルフィンも光感受性物質であり商品名ビスダイン（登録商標）（ＮＯＶＡＲＴＩＳ）として加齢黄斑変性症の治療に利用されているが、癌への応用は現在のところ認可されていない。しかし、ビスダインではヒトの血液を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、１０μｇ／ｍｌの濃度で軽度〜中等度の補体活性が認められ、１００μｇ／ｍｌ以上の濃度で有意な補体活性化が認められている。補体活性化によるアナフィラキシー反応発現の危険性を排除できない為、大量投与はできない。
光線力学的治療法において、光線力学的治療剤のための光感受性物質をリポソームに内包させて投与することが報告されていた（特許文献４及び５を参照）。しかしながら、現在までに、これらのリポソーム製剤を実際に静脈投与により生体に投与し、アクティブターゲッティングにより細胞特異的に癌組織に到達し、癌の光線力学的治療に成功したという報告はない。
一方、生体適合性の高いポリマーとして、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体である水溶性ポリマーが開発されている（特許文献６及び７を参照）。該ポリマーは、現在では発明以降すでに１０年以上経過し、医療用材（人工膵臓、人工腎臓、人工心臓など）の構成医療材料として広く利用されており、安全性や安定性などは証明されている。このポリマーは、疎水性と親水性のユニットを有する。

【特許文献1】特表２００６−５０７３０７号公報

【特許文献2】特表２００７−５２２１３７号公報

【特許文献3】特表２００８−５０１７２７号公報

【特許文献4】特開２００６−５６８０７号公報

【特許文献5】特開２００７−２７７２１８号公報

【特許文献6】特開２００３−１３７８１６号公報

【特許文献7】特開２００４−１７５７５２号公報

【発明の開示】

【0003】

本発明は日光過敏症等の光線力学療法に伴う合併症を起こしにくいアクティブターゲッティングにより低濃度で癌組織に到達し得る光線力学的療法剤の提供を目的とする。
本発明者らは、光線力学的療法（ＰＤＴ）において生じる合併症である日光過敏症、及び光感受性物質としてベルテポルフィンを用いた場合の合併症であるアナフィラキシー反応発現を低減させる方法について鋭意検討を行った。本発明者らは、その結果、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体であるポリマーに光感受性物質を内包させ、表面に癌細胞に特異的に発現する抗原に対する抗体を結合させたものを光線力学的療法に用いてみた。
具体的には、親水性のＭＰＣ、疎水性のｎ−ブチルメタクリレート（ＭＢＡ）及び活性エステルを持つｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）とで構成されているポリマーを使用した。本発明においては、該ポリマーをＰＭＢＮ（ｐｏｌｙ［２−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＭＰＣ）−ｃｏ−ｎ−ｂｕｔｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ＢＭＡ）−ｃｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ＭＥＯＮＰ）］）あるいはＭＰＣポリマーという。該ポリマーは活性エステルを持ち、タンパク質と結合させることができる。タンパク質が結合し、ベルテポルフィンを内包したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）は静脈内投与され、抗原抗体反応又はリガンドレセプター反応により癌部に集積する。そのことにより、より少ない投与量での最大の効果が期待できる為、日光過敏症の軽減又は短縮に効果があると思われる。また、ベルテポルフィンは吸収波長が６９０ｎｍと長いため、進行胃癌、進行大腸癌、進行肺癌、脳腫瘍などより深部にある癌や進行した癌にも応用が期待できる。さらに、癌抗原に特異的な抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）は、選択的に癌部に到達するため、投与量も少なくて済み、アナフィラキシー反応の発現も抑えられる。
タンパク質結合ベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を使ったＰＤＴは、治療後の組織機能の低下や侵襲が少なく、また治療後の副作用に対する処置も短くて済むため、患者のＱＯＬを高くする治療法として期待できる。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 光線力学療法用光感受性物質を含み、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体が結合した癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［２］ 高分子ポリマーがＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体である［１］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［３］ 高分子ポリマーがＭＰＣとｎ−ブチルメタクリレートの共重合体である［２］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［４］ 高分子ポリマーがリポソーム又はリポソーム様の高分子会合体である［１］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［５］ さらに、活性エステル基を含有するモノマー化合物を含む［１］〜［４］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［６］ 活性エステル基を含有するモノマー化合物がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである［５］の癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［７］ 癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体からなる群から選択される、［１］〜［６］のいずれかの癌細特異的高分子ポリマー化合物。
［８］ 癌細胞特異的抗原に対する抗体が活性エステル基を含有するモノマー化合物の活性エステル基を介して結合している、［１］〜［７］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［９］ 光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである［１］〜［８］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物。
［１０］ ［１］〜［９］のいずれかの癌細胞特異的高分子ポリマー化合物を含む、光線力学療法剤。
［１１］ 静脈注射製剤である、［１０］の光線力学療法剤。
［１２］ ＭＰＣ、ｎ−ブチルメタクリレート及び活性エステル基を含有するモノマー化合物を混合し、ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を製造し、次いで、癌細胞特異的抗原に対する抗体と混合し、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートの活性エステル基に前記抗体を結合させ、さらに、光線力学療法用光感受性物質を混合し、ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）に該光線力学療法用光感受性物質を内包させることを含む、光線力学療法剤の製造方法。
［１３］ 活性エステル基を含有するモノマー化合物がｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレートである［１２］の光線力学療法剤の製造方法。
［１４］ 癌細胞特異的抗原に対する抗体が抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体からなる群から選択される、［１２］又は［１３］の光線力学療法剤の製造方法。
［１５］ 光線力学療法用光感受性物質がベルテポルフィンである［１２］〜［１４］のいずれかの光線力学療法剤の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−３２１５００号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0004】

図１は、類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）組織内分布の検討の結果を示す図である。図１Ａは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の結果を示し、図１Ｂは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーの結果を示す。
図２は、ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討の結果を示す図である。
図３は、培養細胞を用いたベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の取込み試験の結果を示す図である。
図４は、ヒト大腸癌モデルを用いた抗体を結合したか又はしないベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いたレーザー治療の結果を示す図である。
図５は、ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討の結果（マウス生存率）を示す図である。
図６は、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体なし）（Ａｂ（−）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）およびベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）の１時間後の皮膚への取り込みを示す図である。
図７は、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）の腫瘍への集積を示す図である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0005】

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はリポソーム又はリポソーム様の会合体を形成するポリマーを用いることができる。
リポソームは、通常、膜状に集合したリン脂質、糖脂質等の脂質層を有する閉鎖小胞を意味する。本発明のリポソームとしては公知のリポソームを用いることができる。本発明のリポソームが構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、フォスファチジルグリセロール類、コレステロール類等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が挙げられ、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が挙げられ、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が挙げられ、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１ａ、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が挙げられ、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が挙げられ、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が挙げられる。このうち、フォスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、コレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有する。リポソームは、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等の公知の方法により製造することができるが、このうち、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明のリポソームの平均粒径は３０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは７０〜１５０ｎｍである。
上記のように、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する高分子ポリマーをＰＭＢＮまたはＭＰＣポリマーという。該ポリマーは、疎水性のユニット及び親水性のユニットを有し、疎水性のユニットでベルテポルフィン等の疎水性物質と結合しつつ、親水性のユニットにより水溶性を維持できるという特徴を有する。ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）は、ＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有し、ＭＰＣと疎水性単量体との構成モル比が２０／８０〜９５／５であり、好ましくは３０／７０〜８０／２０であ。ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）については、特開２００４−１７５７５２号公報に記載されており、該公報の記載に基づいて製造することができる。
ＭＰＣは、下記の式（１）で示される。

【化1】

ＭＰＣと共重合させる疎水性単量体としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート等の各種モノアルキル（メタ）アクリレート；グリシジル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメトキシシラン等の反応性官能基含有（メタ）アクリレート；２−（メタ）アクリロイルオキシエチルブチルウレタン、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルベンジルウレタン、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフェニルウレタン等のウレタン変性（メタ）アクリレートジエチルフマレート、アクリロニトリル等が挙げられる。この中でも疎水性単量体としては、式（２）で表されるアルキル（メタ）アクリレートが好ましく、さらに、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）が好ましい。

【化2】

［式中、Ｒ^１はＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^２はＨまたは炭素数１から１８のアルキル基である。］
また、本発明に用いる疎水性単量体としては前記の疎水性単量体の２種以上を混合して用いてもよい。
共重合体としては、ランダム共重合体、ブロック共重合体のいずれの形態でもよく、ランダム共重合体が好ましい。
本発明に用いる共重合体において、ＭＰＣと疎水性単量体との構成モル比が２０／８０〜９５／５であり、好ましくは３０／７０〜８０／２０である。ＭＰＣが２０モル％未満では得られる共重合体の水への溶解性が低くなり、９５モル％を超えるとＭＰＣポリマーを含む組成物の再溶解性が悪くなるので好ましくない。
本発明に用いる共重合体の重量平均分子量は、好ましくは１０００〜５００００００、より好ましくは１００００〜５０００００である。
前記共重合体は、前記単量体を、公知の溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合等の方法を用いて、必要に応じて重合系を不活性ガス、例えば、窒素、アルゴンで置換し、通常重合温度１０〜１００℃、重合時間１０分間〜４８時間の条件でラジカル重合させる方法等により調製することができる。重合にあたっては重合開始剤を用いることができ、重合開始剤としては、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビスイソブチルアミド二水和物、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート（商品名「パーブチルＮＤ」、日油（株）製）又はこれらの混合物等を用いることができる。前記重合開始剤には各種レドックス系の促進剤を用いてもよい。重合開始剤の使用量は、単量体組成物１００重量部に対して０．０１〜２０重量部が好ましい。生成した共重合体、再沈澱法、透析法、限外濾過法など一般的な精製法により精製することができる。
さらに、本発明の高分子ポリマーは、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体を結合させるための官能基を有している必要がある。官能基としては、例えば活性エステル基が挙げられる。「活性エステル基」とは、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有しており求核反応に対して活性化されたエステル基をいう。活性エステル基としては、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられる。この中でも、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、特にｐ−ニトロフェニル活性エステル基が好ましい。本発明の高分子ポリマーを製造する際に、重合反応の際に活性エステル基を含有するモノマー化合物を混合し、共重合すればよい。
活性エステル基を含有する化合物としては、例えば、下記式（３）：

【化3】

［式中、ｄは０．０１〜０．３０（好ましくは０．０１〜０．２０）であり、ｐは１〜１０の整数を表す。］
で表される構成単位（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルオキシエチレンメタクリレート（ＭＥＯＮＰ））由来のポリマーが挙げられる。本発明の高分子ポリマーを製造する際に、上記式（１）又は（２）の共重合体に、さらに上記式（３）のモノマー構成単位を含有するよう重合させて共重合体を製造すればよい。上記式中、ｄの値は、共重合体を構成する全モノマー構成単位数に対する上記式（３）の構成単位数の比を示す。
癌細胞特異的抗原が発現する癌の種類は限定されず、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。
癌細胞の表面に発現する腫瘍細胞に特異的な抗原としては、例えば、ＥＧＦＲ（上皮細胞増殖因子）、ＥｐＣＡＭ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、βｈＣＧ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＣＲ８、ＴＮＦ−α前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、ＣＤ６３等が挙げられる。この中でもＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ及びｃ−ｅｒｂＢ−２が好ましい。ＥＧＦＲは扁平上皮癌細胞に発現し、ＥｐＣＡＭは広く癌細胞に発現し、ｃ−ｅｒｂＢ−２は腺癌に発現する。
本発明の高分子ポリマーは、これらの癌細胞特異的抗原に対する抗体が表面に結合しており、アクティブターゲティングにより癌細胞を指向する。すなわち、細胞特異的能動集積性を有する。
抗体は、公知の方法で作製することができ、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体は、高分子ポリマーの活性エステル基と抗体を構成するアミノ酸のアミノ基を共有結合によりＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）に結合させればよい。抗体の高分子ポリマーへの結合は、リン酸緩衝液等の緩衝液中で、高分子ポリマーと抗体を混合させればよい。反応は、例えば３〜３７℃で１時間〜２４時間行えばよい。高分子ポリマーと抗体との混合比は限定されないが、例えば、高分子ポリマー１０ｍｇに対して、抗体を０．１〜５ｍｇ混合すればよい。結合した抗体量は以下のようにして決定することができる。抗体結合の際に、抗体のアミノ基との反応により、リリースされるｐ−ニトロフェノールは紫外線４００ｎｍに吸収を持ち、これを測定すればおおよその結合量を数値化することができる。また、透析等によって未反応の抗体を分離した後に、抗体を直接定量することで結合量を求めることができる。さらに、未反応の抗体も含めた状態で、液体クロマトグラフィーによって分離することでおおよその結合量を求めることができる。
さらに、本発明の高分子ポリマーは、脂溶性（疎水性）のＰＤＴ治療用光感受性物質を含む。脂溶性の光感受性物質は、高分子ポリマーの疎水性部分と結合する。脂溶性の光感受性物質が高分子ポリマーの疎水性部分に結合することにより、高分子ポリマーは脂溶性の光感受性物質を内包した粒子状物質となる。
脂溶性のＰＤＴ治療用光感受性物質としては、プロトポルフィリン、ベンゾポルフィリン等のポルフィリン類、ベルテポルフィン等が挙げられる。また、これらの薬剤を混合して用いてもよい。この中でも、ベルテポルフィンが好ましい。本発明において、ベルテポルフィンを含み、抗体が表面に結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を，
例えばＡｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）と呼ぶ。
本発明は、光線力学的治療用光感受性物質を含み、表面に癌細胞特異的抗原に対する抗体が結合した腫瘍細胞特異的高分子ポリマー化合物であって、高分子ポリマーがＭＰＣに基づく構成単位及び疎水性単量体に基づく構成単位を有する共重合体である癌細胞特異的高分子ポリマー化合物を含む光線力学療法剤である癌治療用医薬組成物を含む。該医薬組成物は、生理食塩水、リン酸緩衝塩溶液等の適当な緩衝液に溶解させ、必要に応じて医薬的に許容できる添加物を添加する。添加物としては、有機溶媒等の溶解補助剤、酸、塩基等のｐＨ調整剤、アスコルビン酸等の安定剤、グルコース等の賦形剤、塩化ナトリウム等の等張化剤などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、あらかじめ静脈注射により治療を受けようとする被験体に全身投与すればよいが、特定の癌組織部位に局所投与してもよい。医薬組成物の投与量は限定されず、例えば光線力学的治療用光感受性物質量で数μｇ／ｍｌ〜数ｍｇ／ｍｌに調製した医薬組成物を数μｌ〜数ｍｌ投与するか、又は直接標的部位に注入等により投与すればよい。投与方法は、限定されず、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与等により投与すればよい。この中でも静脈注射が好ましい。本発明の光線力学療法剤は、静脈注射した場合でも、アクティブターゲティングにより癌組織に到達し、癌の治療効果を発揮し得る。すなわち、本発明の光線力学療法剤は、好ましくは静脈注射製剤である。
本発明の医薬組成物を投与すると、高分子ポリマーの癌細胞特異的抗原に対する抗体が癌細胞を指向し、癌細胞に結合し、ある場合は癌細胞中に取り込まれ、癌細胞中で光感受性物質を放出し、光感受性物質が癌細胞内に集積する。また、ある場合は癌細胞の周囲で光感受性物質を放出し、光感受性物質が癌細胞の周囲に集積する。
医薬組成物の投与後、０．５時間〜７２時間後に被験体に光を照射し、光線力学的治療を行う。照射する光は、用いた光感受性物質に応じて適宜決定することができる。すなわち、光感受性物質の吸収波長の波長を有する光を照射すればよい。例えば、光感受性物質がベルテポルフィンの場合、６９０ｎｍの波長の光を、フォトフリンの場合、６３０ｎｍの波長の光を投与すればよい。投与する光としては、例えば半導体レーザー、色素レーザー等が発する光が挙げられる。具体的には、Ｎｄ−ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット）レーザー、ＣＯ_２レーザー、アルゴン・ダイ・レーザー、エキシマ・レーザー等を用いることができる。被験体の全身に光を照射してもよいし、光ファイバーを含むカテーテルを血管等を通じて体内に挿入し、光ファイバーを通じて、腫瘍患部に局所的に光を照射してもよい。
本発明の光線力学療法剤は、例えば、内視鏡手術により粘膜の癌部を切除した粘膜の初期癌において、粘膜下に癌が残っている症例、すなわち、粘膜切除術断端陽性例に対する追加療法として有用である。
さらに、本発明の医薬組成物を投与した後に、光を照射する代わりに、超音波を照射してもよい。ベルテポルフィン等の光感受性物質に超音波を照射することにより、フリーラジカルが発生し、癌細胞の増殖を抑えることができる。超音波は体内の深部に到達するので、深部の癌の治療に有用である。例えば、本発明の医薬組成物を生体に投与した後、腫瘍患部に向け超音波を照射すればよい。限定されないが、超音波の強さは０．１〜１０Ｗ／ｃｍ^２、好ましくは１〜５Ｗ／ｃｍ^２であり、超音波の照射時間は数秒から数百秒である。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【実施例1】

【0006】

ベルテポルフィン封入ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の作製
ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成
０．０１ｍｏｌのエチレングリコールモノメタクリレートを２０ｍＬのクロロホルムに溶解させ、−３０℃まで冷却した。溶液を−３０℃に保ち、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート及び０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン及びクロロホルム２０ｍＬの均一溶液を滴下した。−３０℃にて１時間反応させ、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。次いで、反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。
ＭＰＣポリマーの作製
ＭＰＣ、疎水性のｎ−ブチルメタクリレート（ＭＢＡ）及び活性エステルを持つｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をモル比６０／２０／２０で混合し、さらに重合開始剤としてＡＩＢＮを用い、エタノールで希釈し、反応系をアルゴンで置換した後、６０℃にて５時間反応させ、共重合体を作製した。ポリマーの精製には、再沈殿法と膜透析法を用いた。
得られたポリマー１０ｍｇを１ｍｇの抗ＥＧＦＲ抗体（５２８、ＡＴＣＣ登録番号：ＨＢ８５０９））を加えたＰＢＳでｆｉｎａｌ ５ｍｌになるように溶解し、４℃一晩反応させた。その後、２０ｍｇ／ｍｌベルテポルフィン１００μｌを加え、ベルテポルフィンが内包され、表面に抗ＥＧＦＲ抗体が結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を得た。

【実施例2】

【0007】

類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）組織内分布の検討
１×１０^７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与した。皮下腫瘍が直径５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィンを含むＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射し、組織を採取した。採取した組織を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。凍結乾燥組織にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え組織をホモジナイズし、ベルテポルフィンを溶出させた後ＯＤ６８６ｎｍで吸光度を測定、取り込み量を算出した。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーと抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いた。
結果を図１に示す。図１Ａは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の結果を示し、図１Ｂは抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の結果を示す。図１に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーは腫瘍組織にはほとんど取り込まれなかったが、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーは腫瘍組織に大量に取り込まれた。

【実施例3】

【0008】

ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討
１ｘ１０^７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与した。皮下腫瘍が５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射した。静脈注射１時間後に６４０ｎｍＦｉｂｅｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ ＬＤ ｍｏｄｅｌ（ＳＯＮＹ）にて７５Ｊ／ｃｍ^２のレーザー照射を行い、その後腫瘍径を測定した。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーと抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーを用いた。
図２に結果を示す。図２中、コントロールは、ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与しなかったヌードマウスを示す。図２に示すように、コントロールでは腫瘍容積は経時的に増殖した。抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与した場合には、コントロールに比較すると腫瘍容積の増加は少なかったが、ある程度の増加が認められた。抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーを投与した場合は、腫瘍容積の増加はほとんど認められなかった。
ベルテポルフィンの取込みの観察
培養用２４ｗｅｌｌ ｄｉｓｈにＡ４３１をまき、接着するまで約２４時間おいた。
１ｍｌの培地中に抗体あり、あるいはなしのベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）１００μｌを加え、１０分、２０分及び３０分後にＰＢＳで３回洗浄し、新しい培地を加えたのち１時間後に共焦点レーザー顕微鏡Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＳＰ５を用い、励起４８８ｎｍ、蛍光６５０−７００ｎｍにて観察した。
図３に蛍光観察像を示す。図３中、「Ａｂ（＋）」は、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーを投与した場合の結果、「Ａｂ（−）］は、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーを投与した場合の結果を示す。それぞれ、１０分、２０分及び３０分間Ａ４３１細胞とベルテポルフィンＭＰＣポリマーを接触させた場合の細胞像を示す。図３に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いた場合に、蛍光が強く染色され、ベルテポルフィンが大量に取り込まれた。
比較例１ ヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを用いたベルテポルフィンＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討
ＥＧＦＲ低発現の株であるヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを用いて検討を行った。
１ｘ１０^７個のヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に打った。
皮下腫瘍が５ｍｍ程度になった際に実施例１で作製したベルテポルフィンＭＰＣポリマー３００μｌを静脈注射した。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）と抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＭＰＣポリマーを用いた。
静脈注射１時間後に６４０ｎｍＦｉｂｅｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ ＬＤ ｍｏｄｅｌ（ＳＯＮＹ）にて７５Ｊ／ｃｍ^２のレーザー照射を行い、腫瘍径を測定した。
図４に抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたか、又は結合させないＭＰＣポリマーを投与した場合の結果を示す。
図４に示すように、ＥＧＦＲ低発現株である、ヒト大腸癌細胞ＷｉＤｒを用いた場合は、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーの治療効果は認められなかった。

【実施例4】

【0009】

ヒト類上皮癌モデルを用いたベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）・レーザー治療の検討（生存率の検討）
１ｘ１０^７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与した。皮下腫瘍が５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィン−ＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射した。静脈注射１時間後に６４０ｎｍＦｉｂｅｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ ＬＤ ｍｏｄｅｌ（ＳＯＮＹ）にて７５Ｊ／ｃｍ^２のレーザー照射を行い、その後マウスの生存率を経時的にモニタした。この際、抗ＥＧＦＲ抗体を結合させたＭＰＣポリマーと抗ＥＧＦＲ抗体を結合させないＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を用いた。
図５にマウスの生存率の結果を示す。図５中「Ａｂ（＋）」及び「Ａｂ（−）」は、それぞれ、抗ＥＧＦＲ抗体を結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）及び抗ＥＧＦＲ抗体を結合しないポリマーの結果を示す。また、ＮＣはＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与しないコントロールを示す。図５に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体を結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）を投与したマウスで生存率が改善された。

【実施例5】

【0010】

抗体を結合したＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）とビスダインとの効果の比較
以下の方法でＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）の組織内分布を検討した。
１×１０^７個のヒト類上皮癌細胞Ａ４３１を６週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に投与し、皮下腫瘍が直径５ｍｍ程度まで増殖した時点で実施例１で作製したベルテポルフィンを含むＰＭＢＮ（ＭＰＣポリマー）３００μｌを静脈注射し、組織を採取した。採取した組織の重量を測定した後凍結乾燥し、組織にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え組織をホモジナイズし、ベルテポルフィンを溶出させた後ＯＤ６８６ｎｍで吸光度を測定、取り込み量を算出した。
用いた薬剤は、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体なし）（Ａｂ（−）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）であり、これらの正常組織（皮膚・筋肉）への取り込み及び腫瘍への集積を調べた。ビスダインは加齢黄斑変性症に対する治療薬で成分・含量１バイアル中ベルテポルフィン１５ｍｇ、添加物として乳糖６９０ｍｇ、エッグホスファチジルグリセロール４８．７５ｍｇ、ジミリストイルホスファチジルコリン７０．５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビン酸０．１５ｍｇ、ジブチルヒドロキシトルエン０．０１５ｍｇを加えて疎水性のベルテポルフィンを可溶化したものである。なお、ビスダイン、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体なし）（Ａｂ（−）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）、ベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）の効果の比較実験においては、ベルテポルフィンの使用量を合わせた。
結果を図６および７に示す、図６は、１時間後の皮膚への取り込みを、図７は経時的な腫瘍への集積を示す。
図６に示すように、同量のベルテポルフィンを投与した場合、ベルテポルフィンを含むポリマーを用いることにより、抗体の有る無しに拘らず、皮膚への取り込みがビスダインと比較して半分に抑えられている。この結果、光過敏症が起こりにくくなると考えられる。これは、ビスダインと比べた場合の粒径が、抗体なしで４０〜６０ｎｍ、抗体ありで１００〜１２０ｎｍと大きくなっているためだと考えられる。
また、図７に示す腫瘍への集積の結果からわかるように、ＥＧＦＲ高発現のＡ４３１細胞に対する取り込みはビスダインとベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）で高く、一方、ＥＧＦＲ陰性のＨ６９細胞ではベルテポルフィンを含むポリマー（抗体あり）（Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮ）は、ほとんど取り込まれていなかった。この結果は、腫瘍への取り込み、集積はＥｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ；特定のサイズを持った粒子が血管壁の隙間を通過し、腫瘍に蓄積すること）効果ではなく、抗体によるものであることを示す。
腫瘍（Ａ４３１）への取り込みと正常組織への取り込みの比を計算すると、腫瘍への取り込み／皮膚への取り込みの比は、ビスダインを用いた場合には３０分後で４．２４であるのに対し、Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮを用いた場合は３０分後で５０．００、１時間後ではビスダインを用いた場合が５．９６であるのに対し、Ａｂ（＋）ベルテポルフィン−ＰＭＢＮを用いた場合は７．２６と高くなっていた。

【産業上の利用可能性】

【0011】

本発明の光線力学療法剤は、光感受性物質を内包し、表面に、癌細胞の表面に特異的に発現する抗原に特異的な抗体が結合している。そのため、光線力学療法剤を静脈注射により全身投与する場合でも、アクティブターゲティングにより少ない投与量で効率的に癌組織に光感受性物質を到達させることができる。本発明の光線力学療法剤を癌の治療に用いた場合、日光感受性の合併症が起こりにくくなる。また、光感受性物質としてベルテポルフィンを用いた場合、投与量を少なくすることができ、体内濃度も低く維持できるため、アナフィラキシー反応を誘発するおそれも少なくなる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

【図1】

【図2】

【図4】

【図6】

【図7】

【図3】

【図5】